Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы участия лейкоцитов в метаболическом ответе скелетных мышц на физическую нагрузку

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы участия лейкоцитов в метаболическом ответе скелетных мышц на физическую нагрузку"



о*

I \\lYA САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ

' Ц 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МОРОЗОВ Владимир Игоревич

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ УЧАСТИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ В МЕТАБОЛИЧЕСКОМ ОТВЕТЕ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ НА ФИЗИЧЕСКУЮ НАГРУЗКУ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в Секторе биохимии спорта Научно-исследовательского института физической культуры

Научные консультанты:

Доктор биологических наук, профессор В.А. Рогозкин

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник В.Н. Кокряков

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Г.П. Пинаев

Доктор медицинских наук, профессор И.Г. Щербак

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник С.М. Попов

Ведущее учреждение - Физиологический институт им. И.П. Павлова РАН

на заседании Диссертационного Совета Д.063.57.19 по защите днссертаци! на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт Петербургском Государственном Университете по адресу: 199034 С'анкт Петербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького Санкг Петербургского Государственною Университета.

Автореферат разослан " " 1997 г.

Защита состоится

Ученый секретарь

Диссс|м анионного совета.

доктор биологических наук

Н.Д. Ещенко

Oilman характеристика работы

Актуальность темы. Реакция организма на физические нагрузки (ФН) -проблема, которая давно и прочно завоевала внимание исследователей. Различные ФН организм испытывает на протяжении всей жизни и практически важно знать, как же организм реагирует на них. Интерес к этой проблеме особенно возрос в последние 10-15 лет, вследствие, вероятно, ряда обстоятельств. Во-первых, выяснилось, что ФН предельной интенсивности, характерные для современного спорта высших достижений, оказывают отрицательное влияние на иммунную систему [Суркина, 1981; Левандо и соавт., 1983; Прияткин, 1985; Sharp. Kautedakis, 1992]. Во-вторых, было убедительно показано, что ФИ умеренной интеи ивности воздействуют на организм благоприятно, стимулируя его жизнедеятельность [Шубик, 1978; Шубик, Левин, 1985; Kaufman et al., 1994]. В-третьих, на нынешнем этапе своего развития как спорт высших достижений, так и повседневные чюбнгельские занятия спортом стали социально значимым явлением.

ФН вызывают многочисленные изменения в организме, которые находятся 9 связи с интенсивностью и длительностью Нагрузки [Яковлев, 1974; Меньшиков, Волков, 1986]. Прежде всего эти изменения затрагивают скелетные мышцы, :ердечно-сосудистую и респираторную системы, т. е. те ткани и органы, которые збеспечивают выполнение двигательной деятельности. Интенсивные ФН вызывают повреждения ткани скелетных мышц, что приводит к выходу белков .•келетпых мышц в кровь [Чайковский и соавт., 1987; Шаляпина и соавт., 1987; 'огозкин, 1988; Астратенкова, Чайковский, 1990; Roti et al., 1981; Iiboshi et al., 982]. Но мнению исследователей Ведущими процессами, которые определяют шрушение проницаемости или целостности мембран миоцитов при ФИ, являются |ерекисное окисление липидов мембран или физический разрыв сарколеммы Davis et al., 1982; Hagerman et al., 1983; Kanter et al., 1986]. В оснояе активации |ерекиснь1х процессов в мышечной ткани под влиянием ФН лежит, вероятно, юкальная ишемия вследствие местного ухудшения кровотока и в особенности юследующая реперфузия, связанная с восстановлением тока крови [Lindsay et al., 988; Davis, 1989; Korthnis, Granger, 1993]. Полагают, что именно реперфузия вляется событием, определяющим патогенез повреждения ткани при пиемии/реперфузии [Granger, Kortliuis, 1995]. При этом наибольшее внимание сследопагели фокусируют на роли активных форм кислорода (ДФК) и осна ппепьных лейкоцитов [Bolli et al., 1988; Granger et al.. 1988; Schedenberg et al.. 991; Kortluiis. Grmiiier, 1992]. Устранение ЛФ1С и ингибирование поступления и

ткань нейтрофипов снижают повреждение клеток. Источником АФК в очаге повреждения, наряду с нейтрофилами являются реакции, катализируемые тканевыми ферментами и, прежде всего, ксантнноксидаэой [Morris et al., 1987; Granger, 1988]. Этот фермент, как и НАДФН-оксидаза лейгрофилов, продуцирует супероксиданнон (СЪ ), который в результате дальнейших превращений дает начало другим АФК, включающим перекись водорода, гндроксильиый радикал и спнглегнын кислород [Halliwell, Gutter ¡dge, 1989; Grisliam. 1993]. Активированные нейтрофилы секретпруют миелопероксидазу (МПО) - фермент, который катализирует, используя ЩО2. образование сильных окислителей гиногалоидных кислот (НОС1. HOI, НОВт) из нонов галоидов [Ktebanoff, Clark, 1978]. I lOCI, взаимодействуя с Oí'- может давать ОН (Halliwell, Gutteridge, 1989]. Помимо АФК в роли фактора, участвующего в механизме повреждения ткани выступают прогеиназы, сскрегируемые нейтрофилами или попадающие в ткань при разрушении этих клеток [Weiss, 1989; Ward. Varani, I .90; Ward, I99la;b; Granger, Korthuis. 1995]. Радикальные соединения, продуцируемые нейтрофилами и тканевой ксантпноксндазой. секретируемые нейтрофилами прогеиназы являются главными участниками деструктивных реакций, развивающихся в очаге ишсмнп/рсперфузии и способствующих разрушению ткани. Описанное представление о важности вовлечения нейтрофилов в механизм поврежденш ткани доминирует в литературе (Granger. Korthuis, 1995].

Известно тикже. что ФН приводят к существенным изменения», содержания н функций лейкоцитов крови, рассматриваемых авторами в рол» фигурантов иммунной системы [Escola et al., 1978; Multan, Young, 1989; Nienian с al.. 1992]. В зависимости от интенсивности ФИ могут или усиливать (умеренны ФИ) или подавлять (ФН высокой интенсивности) функции лейкоцитов крови, т. с стимулировать или угнетать реакции иммунной системы opt атома [Шубин Левин, 1985; Kaufman et al., 1994]. Несмотря на значительный перечень рабо) посвященных влняншо ФН на иммунную систему, большинство нэ них hoch фра!ментарныи и описательный характер без исследования дннамик обнаруженмых изменений, а также механизмов, лежащих в основе данны изменений. Трактовка результатов ограничивается рамками влияния ФН н компоненты системы неспецифической резистентности (нентрофил и гуморальнь факторы) и ним) иную систему (лимфоциты моноциты и макрофаги). Имеете с te в лшературе сформулирована точка зрения о том. что функция iimmmihoü синем

состоит в поддержании ангнгенно-структурного гомеостаза организма [Лозовой, Шергпн, 1081; Ломакин, 1990]. Кроме того, делаются попытки рассматривать кейтрофил в связи с традиционными клетками иммунного ответа, исходя прежде всего из последних данных о том, что цейтрофил синтезирует немало различных цитокинов, влияющих на функции лимфоцитов, моноцитов и макрофагов (15]еи е| а1„ 1990; Сксо « а1„ 1990; Вагхоп! е! а1., 1991; 811»пос1а а1„ 1996].

С этих позиций реакцию системы лейкоцитов в ответ на ФИ логично рассматривать в контексте изменений, происходящих в организме. Прежде всего необходимо учитывать действие ФН на скелетные мышцы - ткань, обеспечивающую выполнение двигательной активности. С этой точки зрения описанные выше повреждения, возникающие в мышечной ткани при выполнении интенсивной ФН, вероятными участниками которых являются нейтрофилы, можно представить как часть общей реакции системы лейкоцитов на ФИ.

Таким образом, констатируя наличие литературных данных, характеризующих реакцию системы лейкоцитов на ФН, тем не менее можно заключить, что эта проблема рассмотрена фрагментарно, что не позволяет составить целостное представление о том, как реагирует система лейкоцитов на ФН, насколько продолжительна эта реакция и где она разворачивается. Практически не изучено в динамике влияние ФН на изменение содержания лейкоцитов и их типов в крови (на крысах), на процесс секреторной дегрануляции и интенсивность фагоцитарной реакции нейтрофилов. Недостаточно изучены механизмы, определяющие ту или иную реакцию лейкоцитов крови на ФН. Практически не исследовано взаимодействие' лейкоцитов С мышечной тканью после ФН. При этом отсутствуют сведения о смене типов лейкоцитов, инфильтрирующих скелетные мышцы. Нет данных о присутствии в мышечной ткани ферментов нейтрофилов, в частности МПО и нейтральных протеиназ. Неизвестен вклад нейтральных протеиназ нейтрофилов в бадане прозеолнтнческой активности цитозоля скелетных мышц. Практически не исследованы возможные функции ферментов нейтрофилов в мышечной ткани после ФН. Изучение этого круга вопросов важно с точки зрения создания целостного представления о различных параметрах реакции сиоемм лейкоцитов иаФН.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла п иаичитчнии реакции системы лейкоцитов на физическую нпгруму <Ф1 П, пключая и ¡учение

биохимических мехотпмоч вовлечения пейтрофипоч в метаболический ответ скелетных мышц.

Задачи исследования. I. Выделить и охарактеризовать миелопероксидазу и катепсии О лейкоцитов перитонеального эксудата крысы.

2. .Развить метод иммунораднометрического анализа миелопероксидазь лейкоцитов для измерения концентрации фермента в биологических образцах.

3. Развить метод радиоиммуноанализа кортнкостерона для измерен») концентрации данного гормона ч сыиорочке.кропц крыс.

4. Изучить изменение содержания неитрофилов и других типов лейкоцита! в кропи крыс в отпет на ФИ.

5. Исследовать изменение секреторной функции неитрофилов крови кры под влиянием Ф11.

• 6. Изучит!, изменение фагоцитарной функции неитрофилов крови продукции активных форм кислорода этими клетками в ответ на Ф11.

7. Исследовать I истологнческую картину инфильз рации лейкоцитам гкани скелетных мышц крыс.

8. Изучить действие ФИ на содержание миелопероксидазы лейкоцитов скелетных мышцах крыс после Ф11. а также возможное участие этого фермента метаболических реакциях мышечной ткани при ФИ.

9. Оценить участие протеина? лейкоцитов в общем пуле прогеолнтнческс активности ткани сгаегмы* мышц в нейтральной области значений рН при ФИ.

10. Изучить влияние предварительной систематической ФИ (тренировк различном напрцшимшосш на секреторную функцию неЙ1рофилов кропи инфнльграцию нентрофнлами ткани скелетных мыши крыс при выполнении ик тестирующей ФИ.

11. В модельных опытах ¡п \itio исследовать способность фермент (мнелопероксидаза и протенназы) лейкоцитов н самих лейкоцитов ионрежда мышечные фермешы. и также нарушать проницаемость мембран мышечш клеток.

Работа выполнена в течение 1985-1996 гг. по плановым темам 111 Сек гора биохимии спорта НИН физической культуры и как инншпшти исследование.

Научная иошпня выполненной работы состоит в том, что и пен вмерн систематически описана реакция системы лейкоцитов на ФИ и впервые мокша

возможность участия ферментов нейтрофилов в метаболическом ответе скелетных мышц.

Впервые выделена и охарактеризована МПО лейкоцитов перитонеального

эксудата крысы. На основе лоликлональных кроличьих антител к ферменту развит

высокочувствительный, специфичный и точный метод иммунорадиометрического

анализа МП О в биологических образцах. Оптимизирован метод измерения

активности МПО с использованием 4-аминоантипнрина н фенола. Па основе

поликлональных кроличьих антител развит и оптимизирован метод

радиоиммуноанализа кортикостерона. Оптимизирован . метод удаления 125

свободного { 1]Т4 после инкубации с белком, предполагающий последовательную обработку аликвоты смесью декстрана с активированным углем и трихлоруксусной кислотой, что позволяет уменьшить. величину неспецифического соосаждения радиоактивности с белком при определении специфического включения радиоактивности в белок. На основе поликлональной кроличьей антисыворотки . к лейкоцитам крови крыс разработан подход, позволяющий с помощью внутрибрюшинных инъекций этой антисыворотки в течение 1 сут поддерживать низкий уровень нейтрофилов крови.

Впервые в динамике (в течение 5 сут) на крысах изучена реакция системы лейкоцитов крови на однократную интенсивную ФИ. При этом исследованы количественные характеристики различных типов лейкоцитов и функциональное состояние нейтрофилов (активность секреторного и фагоцитарного процессов, способность к продукции АФК) крови.

Впервые исследована динамика (в течение 7 сут) инфильтрации мышечной ткани лейкоцитами после ФН и показана смена типов лейкоцитов в пределах периода наблюдения.

Впервые показано присутствие маркерных ферментов нейтрофилов МПО и кагепсина G в скелетных мышцах крыс после ФН.

Впервые изучено в динамике (в течение 7 сут) содержание МПО в мышечной ткани. Показано, что MITO при фракционировании мышц концентрируется во фракции мембран.

Впервые обнаружено, что часть протеолитической активности цитозоля скелетных мышц, выявляемая после ФН при pH 7,4, относится на счет леикопиюв. '•>ia акгнвнооь нарастает в течение t сут после ФН (срок наблюдения).

В опытах in vitro с использованием очищенных ферментов, изолировании* m. soleus и черничной кулыуры мнобластов цыпленка показано, чго МПО м

протеиназы лейкоцитов могут быть факторами, повреждающими активность ферментов н проницаемость мышечных клеток.

Основные положения, выносимые на защиту. К Интенсивная ФН вызывает изменения количественного и функционального статусов лейкоцитов крови. Количественные изменения включают два подъема содержания лейкоцитов, связанных соответственно с лимфоцитами (первый подьем) и нейтрофилами (второй подъем). ФН стимулирует секреторную дегрануляцию нейтрофилов, что выражается в снижении содержания МПО и лкзошша в нейтрофилах и повышении в сыворотке крови. ФН угнетает. фагоцитарную активность нейтрофилов. Исследованные показатели возвращаются, к исходному уровню в течение 3-5 сут отдыха. Кортикостерон является одним из факторов, участвующих в регуляции ста!уса лейкоцитов крови.

2. Под действием интенсивной ФН происходит инфильтрация лейкоцитами ткани скелетных мышц. Лейкоцитарные микроиифильтраты, состоящие из нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов, выявляются в мышечной ткани уже через I сут после ФИ. Микроиифильтраты охранялись но крайней мере в течение 3 сут; через 5-7 сут они практически не обнаруживались. В период наблюдения (7 сут) происходила смена типов лейкоцитов, представленных в мышечной ткани, ь сторону замещения нейтрофилов и моноцитов макрофагами.

3. В скелетных мышцах после ФН выявлены маркерные ферменть нейтрофилов - МПО н катепенн О. Содержание МПО в мышечной ткаш достигает максимума через 1 сут после ФН и остается на этом уровне еще I течение 4 сут, затем происходит его снижение. Применение мммуноблоттиша < использованием специфических антител к катепенну О нейтрофилов показали присутствие этой протеинаш в мышечной ткан И после ФН.

4. Использование крыс, у которых уровень нейтрофилов крови был снижсч с помощью внутрнбрюшинных инъекций кроличьей антисыворогкн I нептрофнлам (экспериментальная лейтропения). показало. что част протеолнтической активности цитозоля скелетных мышц, определяемая при р1 7,4 после ФН, связана, с неГпрофнльнымн протеиназами. При пнкубапи изолированной ш. $о1си$ протеолитическая активность инкубационной сред| оказалась ниже в том случае, когда т. 5о1еи$ были получены от нейцюпеннческн животных.

5. С помощью предвари тельной тренировки крыс нежно уменьшит степень инфильтрации лейкоцитами скелетных мышц в ответ на тестирующую Ф1

но сравнению с нетренированными животными. Тренировка адаптирует скелетные мышиы к ФИ, что выражается в большей устойчивости таких мышц к ФН и меньшей их повреждаемости при ее выполнении.

6. In vitro перитонеальные лейкоциты (около 70 % нейтрофилов) могут вызывать нарушения проницаемости изолированных m. soleus, а также куриных мнобластов, что приводит к изменению выхода биомолекул мышечных клеток в инкубационную среду. Лейкоциты ннгибнруют активности мышечных ферментов креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы. В механизмы нарушения проницаемости и повреждения белков вовлечены MHO и протеиназы нейтрофилов.

7. Реакция системы лейкоцитов в ответ на ФН включает две стадии. 1-я стадия развертывается в крови и может быть рассмотрена как в значительной мере неспецифическая (ответ на стрессорное воздействие), тогда как 2-я стадия является специфической в отношении скелетных мышц - ткани, подвергшейся нагрузке.

Научно-практическая значимость. Результаты работы имеют основополагающее значение для развития теории адаптации скелетных мышц к ФН с учетом роли лейкоцитов в этом процессе. С.ш важны также для понимания механизма отсроченной мышечной усталости, в котором большое значение имеет воспалительный процесс, инициируемый лейкоцитами, инфильтрирующими скелетные мышцы после ФН. Результаты работы необходимы для разработки научно-обоснованных рекомендаций, позволяющих как уменьшить повреждение ткани скелетных мышц при выполнении ФН, так и ускорить восстановление этой ткани в период отдыха.

Сделанные при проведении исследования методические разработки по

выделению МПО и катепснна G нз лейкоцитов крысы; определению концентрации

(ИРМА) и активности МПО лейкоцитов крысы; определению концентраций

125

кортикостерона (РИА) и лнзоцима человека (РИЛ); удалению свободного [ 1]Т4 после инкубации с белком; получению крыс с нейтропенией с помощью внутрнбрюшинных инъекций антисыворотки к лейкоцитам [Прйяткин и соавт., 1988; Морозов и соавт., 1988; 1990; 1991; 1997; Цыпленков и соавг., 1988; Краева и соавг.. 1992; Морозов, Петрова, 1993] могут быть применены в практике работы научно-исследовательских лабораторий. Описанная п работе система РИЛ коргикостерона используется п качестве метола анализа не только п Сек юре биохимии спорта НИИ физической культуры, но также в Опеле общей патологии

м патологическом физиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН и е лаборатории биохимической фармакологии НИИ токсикологии.

Полученные в работе данные использованы для обоснования применены; лизосомалыю-катионного теста [Питаревский, Мазинг, 1981] при оценк< неспецифической резистентности спортсменов [Рогозкин и соавт., 1985) Определение секреторной активности нентрофилов крови предложен! использовать для оценки физической подготовленности спортсменов пр| выполнении ими стандартной ФИ [Прияткин и соавт.. 1989; Прияткин и соавт. 1990; Коцогкт е! а!.. 1988]. Результаты обследований спортсменов представлены печати {Морозов и соавт., 1985; 1986; 1987а; 19876].

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 51 печатно

работе.

Апробация работы. Представленные в работе данные доложены н Всесоюзном симпозиуме, посвященном 100-летию создания И,П. Мечниковы фагоцитарной теории иммунитета (Москва, 19X3); 1-м Всесоюзном симпозиум "Препаративная хроматография фи иологнческн активных веществ" (Ленинград 1988); 4-м Международном коллоквиуме по миологии (Пена. 1989 Международном симпозиуме по биохимии спорта (Ленинград, 1989); 24-Всемнриом конгрессе ФПМС по спортивной медицине (Амоердам. 1990 Всесоюзной конференции "Комплексная диагностика и оценка функниональнь возможностей Организма, и механизмы адаптации к напряженной мышечне деятельности высококвалифицированных спортсменов" (Москва, 199( Всесоюзной конференции "Питание и физическая работоспособности (Ленинград. 1991); Российской научно-практической конференции "Фнзическ, работоспособность и питание" (Санкт-Петербург, 1993); 3-м ,Международна конгрессе "Иммунологические последствия травмы, шока и сепсиса" (Мюнхе 1994): Международной конференции "Нсйроиммунные взаимодействия окружающая среда" (Санкт-Петербург. 1995); заседании Санкт-Пекрбургско отделения Всероссийского биохимического обшеста (1995); шоговых научш конференциях НППФК (1995; 1996); заседании Кафедры биохимии С'ПбГУ (1997

Обьсм н структура днссершции. Материал диссертации изложен на 3 страницах машинописного 1екс1а и состоит из введения, обзора литератур описания чл1срналоп и методов исследования, описания и обсужден результатов собственных исследований, заключения, выводов и сит

я

{«тированных литературных источников, который включает 600 ссылок. Диссертация содержит 26 таблиц и 47 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых беспородных крысах и кроликах шиншилла из 1итомника Рапполово. В функциональных опытах использовано 750 крыс-самцов есом 200-250 г. Выделение перитонеальных лейкоцитов, для последующей золяции МПО и катепсина G проведено из 650 крыс обоего пола, штисывороткн получали иммунизацией кроликов, используя в качестве нтигенов МПО, катепсин G, перитонеальнме лейкоциты и конъюгат ортикостерон-БСА.

Животных содержали при обычном световом режиме' в условиях вободного доступа к воде и пище. По завершении 2-недельной . адаптации юрмировалй экспериментальные груп.:ы животных. Все крысы получали динаковый основной рацион (Неменова и соавт., 1968].

Модели однократной и ■ систематической ФН, а также приемы, сгюльзованные для выделения лейкоцитов и нейтрофнлов крови' и еритонеальных лейкоцитов описаны ранее (Цыпленков, 1988; Морозов и соавт, 989; 1991; Цыпленкой и соайт., 1991].

Выделение и очистку МПО из лейкоцитов перитонеального эксудата Морозов и соавт., 1997] проводили с помощью модифицированного метода !окрякова и соавт. [1982]. Определение пероксидазной активности выполняли эгласно Klebanoff (1965' 1968] в модификации Янковского и соавт. {1978], слользуя в качестве субстрата ортодианизидин. В альтернативном методе змерения активности МПО использовали субстратную смесь, содержавшую олее устойчивые л менее токсичные фе(}ол и 4-аминоантипирин [Nauseef et al., ?83]. Условия анализа нами были оптимизированы [Морозов и соавт., 1997]. ыделение катепсина G из лейкоцитов осуществляли, комбинируя описанные етоды [Краева и соавт., 1988; Björk, Ohlson, 1990].

Иммунизацию кроликов МПО, катепсином G и лизатом иейтрофилов эоводили по методу Vaitukaitis et al. [1971]. Для получения иммуногенной формы эртикостерона синтезировали 21-гемисукцинат стероида [Erlanger et al., 1957], эторый далее конъюгировали с БСА [Linder et al., 1972] и полученный коныогат >ргикостерон-БСА использовали для иммунизации [Морозов и соавт., 1988|.

Фракцию IgG выделяли по методу Жатона и . соавт.[1981]. Для .1муноаффпнного выделения антител применяли колонки MflO-сефзроза 4В или

протеки А-сефароза 4В. Приготовление иммуносорбенгов белок-сефароза 4] проводили согласно Турковой [1982].

125

Радиоактивное мечение белков проводили с помощью Na 1 (с.а. 8x10 ТБк/моль) в присутствия 1,3,4,6-тетрахлор-3а,6а-дифеиилгликоурила (иодоге! {Paus et at., 1982). Казеин, меченый флуоресцеинизотноцианатом (ФИТЦ получали по методу Twining [1984].

При выборе условий миелопероксндазной реакции для изучен» галоиднрования белков в системах, содержащих МПО-Н2О2 или лейкоцит! использовали данные, приведенные в литературе [Rlebanoff, 1967; 199!) и даннт собственных исследовании [Морозов и соавт., (997J.

Фагоцитарную реакцию проводили по методу Дугласа и Кун [198; используя как объект фагоцитоза культуру Candida albicans.

Для выделения цитоплазматическнх мембран скелетных мыши прнменя. метод Kutchai et al. [1976], Чистоту препарата мембран оценивали по активносм '-нуклеотидазы [Kutchai et al., 1976]. Концентрацию Pi определяли амидолы» методом [Doose. 1959].

Получение культуры куриных миобластов выполняли по мете

Königsberg [1963]. Метаболическое мечение миобластов проводили с пумош

3 14

[метил-" Н2]тнмидина (с.а. 1640 ГБк/моль) и D.L-[1- С[леГшина (с.а.

П>к/моль).

Содержание МПО определяли с помощью нммунорадномегрическт анализа (И 1'МА) [Цыпленков н соавт., I988J.

Активность антопрспеолиза в экстрактах скелетных мышц измеряли скорости накопления в пробах свободного тирозина [McDonald. Chen. )9f>5 помощью фтуорескамина - реагента на первичные аминогруппы [Nakai el 1974], по скорости гидролиза ФКТЦ-казенна до фрагментов, растворимых в Г [Назаров, 1990: Twining, 1984; Booth, Watson, I985J. Кроме тоги нспользоо субстрат, специфичный для эластазоподобных протеиназ /-Ala-Pro-Ala-M [Гершкопич. Кибирев. 1988]. где Z - бензнлоксикарбонил, МСА -

мешлуумирнначид.

Опреаеленне активности КК проводили по методу Метровой и Льи.чс [1985]. .' кшвпость АсАГ измеряли, используя метод Reitman & Frankel [Г модифицированный Yal/idis [19М>|.

Электрофорез белков лнзата нейтрофилов и катепсина G проводили в >адиентном ПААГ (10-20%) при pH 3,2 [Johnson et al., 1983]. Электрофорез :лков цитозолей скелетных мышц вели в градиентном ПААГ (10-20%) в елочной среде, в присутствии ДСН (Laemly, 1970].

При осуществлении иммуноблоттинга придерживались описанных >иемов {Тсанг и соавт., 1988; Johnson et al., 1983; Blisiegel, 1986]. Для выявления лепсина G нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали, используя полученные 1ми антитела к протеиназе и вторые антитела, конъюгированные с щелочной эсфатазой {Чмелев, Конарев, 1991; Тсанг и соавт., 1988].

Оценку функциональных свойств лейкоцитов проводили также, определяя ювень хемилюминесцентного ответа при стимуляции клеток зимозаном в >йсутствии люминола (Токмаков и соавт., 1991; Combell et al., 1985].

Измерение концентрации кортико.стерона в сыворотке крови крыс юводили с помощью развитого нами прямого безэкстракционного РИА 1орозов и соавт., 1988; Морозов И соавт., 1990]. Для определения содержания :лка в пробах использовали методы Lowry et al. [1951] и Bradford [1978].

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое I), стандартное отклонение (SD), ошибку среднего (SE) и уровень значимости 1зличий средних величин (р) по критерию Стьюдента t.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе проведенного исследования была изучена реакция системы :йкоцИтов в ответ на ФН в двух компартментах организма - в крови и в :елетных мышцах.

1. Реакция лейкоцитов крови крыс т физическую нагрузку

Изучены в динамике изменения количества нейтрофилов и других типов ¡йкоцитов в кровн, уровни секреторной и фагоцитарной активностей :йтрофилов, а также способность этих клеток к "дыхательному взрыву" при имуляции зимозаном. Исследовано также влияние ФН на концентрацию в .торотке крови кортикостерона как одною из возможных регуляторов )личественного и функционального статусов нейтрофмгтоо {Прияжнн и соавт., >88; Морозов и соанг., 1989: Rogozkin et al., 1990л; Rngozkin е? al.. 19906; lorozov et al., 1990; Морозов и соавт.. 1991].

ФН приводит к возникновению лейкоцитоза (рис. 1). Сразу после ФН "^солютное содержание лейкоцитов достоверно нрепьничет исходный уроречь

более, чем на 50%. Первый подъем уровня лейкоцитов связан, главным образом, увеличением в крови лимфоцитов. Через 8 ч развивается второй подъе лейкоцитов, связанный с нейтрофилами, содержание которых в этот период н 84% превышает норму. К 12 ч возрастает более чем В 2 раза как абсолютнс содержание юных палочкоядерных форм нейтрофилов но сравнению с исходны* так и доля этих клеток в общем числе нейтрофилов (11% против 6,7%).

о

I

О

8

Ьй

114 1

3 5 сут

Бремя

Рис. I. Влияние ФН на содержание п крови крыс лейкоцитов (I) и нейтрофилов п=7: *р<().«5).

ФН приводили к снижению содержания в нейтрофилах крови МПО на 5 и лнзоцнма на 26" о, наряду с увел1тчеиием концентрации этих белков в ила: крови на 67 и 51% соответственно (рис. 2). В процессе последующего отль содержание М!Ю в плазме довольно быстро (8-12 ч) нормали тует Концентрация фермента в клетках оказывается в течение примерно 8 ч недостоверно сниженном уровне, а затем достигает неходкого значения.

Усиление секреторной активности нейтрофилов крови под действием 1Нтенсивной ФН было обнаружено и в исследовании, проведенном на ;портсменах-добровольцах [Морозов и соавт., 1989]. ФН ступенчато-

В

5

5сут

124 1

Бремя

>ис. 2. Влияние ФН на содержание МПО (а, п—6-14) и лизоцима (б, п—5-7) в 1лазме (1) и нейтрофилах крови (2) (*р<0,05,** р<0,01).

юзрастающей интенсивности (бег на тредмиле) вызывала уже через 6 мин величение концентрации лизоцима в плазме крови на 41%. К моменту |рекращения бега уровень Лизоцима в плазме превышал исходный на 20%. При том на 26% снижалось. содержание лизоцима в расчете на нейтрофил. концентрацию лизоцима в этом исследовании измеряли с. помощью РИА Прияткин и соавт., 1988].

При изучении фагоцитарной функции нейтрофилов оказалось, что ФН ызывает значительное снижение показателей фагоцитоза. Так, если у онтрольных животных фагоцитарное число (ФЧ) составило 85,6 ± 0,7%, а »агоцитарный индекс (ФИ) - 1,77 ± 0,05 частиц/клетка, то сразу после ФН эти оказатели сиизуянсь на 7.1,3 и 18,'"о соответственно (п=7: р<0,05). Через I сут оспе ФН появляется тенденция к восстановлению фагоцитарной активности ентрофнжч?. однако лить через 3 су г исследованные показатели фаищнтощ

приближаются к исходным величинам: ФЧ достигает 83,0 ± 2,1%, а ФИ - 1,71 0,08 частиц/клетка. К этому сроку восстанавливается и распределена нейтрофилов по числу фагоцитированных С. albicans.

Усиление секреторной реакции нейтрофилов под действием ФН мож«

реципрокно угнетать фагоцитарную активность клеток, так как оба процесс

2+

зависят от макроэргов, Са , свободных сульфгидрильных групп [Маянски Маянский, 1989]. Другой причиной ослабления фагоцитарной функш нейтрофилов может являться выход в кровоток из костного мозга популяцт юных палочкоядерных гранулоцнтов, имеющих сниженную фагоцитарну активность (Алмазов и соавт., 1979]. Увеличение доли функционально мен активных палочкоядерных клеток в общем пуле нейтрофилов крови возможт служит одним из факторов, определяющих и уменьшение хемнлюмннесцентно; ответа нейтрофилов крови в период отдыха после ФН , хотя, вероятно, бол значимая причина заключается в снижении концентрации МПО в нейтрофнла вследствие се выброса в плазму (Morozov et al., 1991].

Учитывая данные о регулирующем влиянии глюкокортикоидов содержание и функциональную активность лейкоцитов [РагпНо, Fauci. 191 Marcolongo et al.. 1984], исследовали вовлечение кортикостерона в этот пропс при ФН. ФН вызывала быстрое повышение концентрации кортикостерона сыворотке крови почти в 4 раза (с 124 ± 9 до 464 ± 23 нг/мл: п=6-14, р<0.01). Чс[ 12 ч отдыха был выявлен второй пик концентрации гормона. При этом с уровень превышал контрольный на 69% (р<0,0|). Введение крыс кортикостерона в фармакологической дозе (1 мг на 100 г веса) вызыва устойчивое снижение на 20-30% содержания нейтрофилов п крови в течение по1 8 ч. Боле физиологическая доза (0.3 мг на 100 г веса) приводила непродолжительному снижению н последующему быстрому и значительно подьему уровня этих клеток в крови. В этом случае содержание нейтрофилов чс; 4 ч после введения кортикостерона возрастало на 63"», Причины нейтрофил могут быть связаны как с ускоренным выбросом зрелых нейтрофилов из костн< мозга, так и удлинением периода их полужшнн в крови, и сннжсш интенсивности перехода нейтрофилов из крови в ткани 1В°РВ5 et al., 1964; Dali al., 1975]. Молекулярные мехашммм. определяющие перечисленные собьи включаю! итмсмснил ад1езнпных свойств клеток [Springer, 199(1].

Регрессионны» анализ, в котором сопоставили содержание лизоцима и

ртикостерона в плазме выявил сильную зависимость (г|=0,84) между этими

-5 2

раметрами, описываемую уравнением у=10,1 + 2 10 -х (х - концентрация зоцима в мг/л, у - концентрация кортикостерона в нг/мл). Это может идетельствовать в пользу существования функциональной связи между данными :казателями.

В экспериментах in vitro с добавлением кортикостерона в фибринированную кровь крысы было обнаружено быстрое кратковременное сличение концентрации лизоцима в плазме (р<0,05). Этот факт может указывать i стимуляцию секреторной функции нейтрофилов кортйкостероном в дозе, [изкой к выявленной в крови крыс после ФН.

■ Представленные данные позволяют заключить, что интенсивная ФН тзывает существенные изменения в количественном составе и функциональном атусе лейкоцитов крови, которые в определенной мере могу г быть связаны с менениями концентрации адаптивного гормона коры надпочечников ->ртикостерона.

2. Миграция лейкоцитов в скелетные мышцы под влиянием физической нагрузки.

Доказательства и последствия Процесс миграции изучен гистологически и по появлению в скелетных зцццах крыс ферментов нейтрофилов - МПО и катепсина G [Rogozkin et al., 1989; Морозов и соавт., 1989; Морозов и соавт., 1990; Петрова, Морозов, 1992; [орозов, Петрова, 1993; Morozov, Petrova, 1994].

2.1. Гистологическое исследование скелетных мышц Гистологические исследования выполнены на срезах ш. soleus, юлированных у животных в разное время после ФН. В контроле нейтрофилы зактически отсутствовали в мышечной ткани, встречаясь только в кровеносных »судах и в интерстициальной ткани. Через 1 сут после ФН в ткани мышцы зя пились Кшкроинфильтраты, состоящие из лейкоцитов (лимфоциты, :йтрофилы, моноциты), и тканевых макрофагов. В это время количество ;йтрофилов и .макрофагов в ткани оказалось соответственно в 3-5 и в 2-3 раза лие по сравнению с исходным уровнем клеток. Через 3 сут после ФН картина ;тавалась сходной. По-прежнему встречались очаги, содержащие макрофаги, тнако моноциты при этом уже отсутствовали. Количество нейтрофилов в ткани павалось повышенным. В дальнейшем на 5-7 су) размеры инфильтратов

значительно уменьшались, снижалось и количество.нейтрофилов, хотя и через 7 сут эти клетки удавалось найти в ткани. Направленную миграцию лейкоцитов в ткани определяет градиент хемотаксических факторов ткань-»кровоток. Участки дегенерации мышечной ткани, возникающие под влиянием ФН [Pecze-Binkhorst el al., 1989],. являются, очевидно, источником хемоаттрактантов и конечной точкой маршрута миграции. Переход лейкоцитов в ткань из кровотока сопровождаете« изменением свойств этих клеток, связанных в том числе с поверхностно!1 экспрессией молекул адгезии [Springer, 1994]. При этом увеличиваете? продолжительность жизни нейтрофилов до нескольких сут вместо 6-7 ч i циркуляции, исчезает в процессе дифференцйровки в тканевые макрофаг» активность MI10 моноцитов крови [van Furth et al., 1970]. В свете данных с регуляции in 'vitro пролиферации мышечных клеток-сателлитов моноцитам! [Cantini el al., 1995], можно предположить участие моноцитов-макрофагов еще и i активации сателлигных клеток, способствующую вовлечению последних i регенерацию поврежденных участков мышечной ткани. Механизм, с помощьн которого эти события могут быть осуществлены, должен включать Цитокины продуцируемые моноцитами-макрофагами. Результаты исследований последи и лет демонстрируют, что и неитрофилы при активации становятся продуцентам! ряда иитокннов [Djeu et al.. 1990; Bazzoni et al.. 1991; Shinoda et al., 1996], которые наряду с секретируемыми компонентами гранулярного шшарага, тоже могу участвовать в процессе морфологической перестройки мышечной ткани в перио. ее регенерации.

Эти данные свидетельствуют не только об инфильтрации мышечной ткан лейкоцитами после ФН, но и о смене типов лейкоцитов в инфильтратах в процесс отдыха, характерной для острой воспалительной реакции.

2.2. Исследование мис.юпсроксиОаш нгйтрофтоп в ст-лстшк мышца \

Содержание МПО в суммарном препарате скелетных мыши задни конечностей крыс в покое было мало (1,26 ± 1.00 нг/мг белка; п_9) и не нэменялос в процессе ФН (рис. 3). В течение отдыха животных после ФН происходил постепенное увеличение содержания МПО. которое уже чере* I сут достигал максимального значения (8.93 ± 2.30 нг/мг белка; п=8) и на этом урош поддерживалось в течение следующих 4 сут (п=4-5). Затем концентрация МПО скелетных мышнах снижалась, но и через 7 сут после ФП оставалась выи

исходной. Эти данные подтверждают факт миграции нейтрофилов в скелетные. мышцы после ФН.

Степень притока нейтрофилов в мышцы в определенной степени зависела от величины нагрузки, испытываемой мышечными волокнами: через 1 сут отдыха после ФН содержание МПО в красных оксидативных волокнах m. quadriceps, которые выполняют более интенсивную работу во время плавания, было достоверно выше, чем в белых гликолитических волокнах (соответственно 29,30 ±

Время

Рис. 3. Концентрация MIIO в скелетных мышцах после ФН (*р<0,05).

Степень притока нейтрофилов в мышцы в определенной степени зависела от величины нагрузки, испытываемой мышечными волокнами: через I сут отдыха после ФН содержание МПО в красных оксидативных волокнах ш. quadriceps,, которые выполняют более интенсивную работу во время плавания; было юстоверно выше, чем в белых гликолитических волокнах (соответственно 29,30 ± ».ОХ и 5.05 ± 2.92 нг/мг белка: п=6).

Предположение о взаимосвязи обьема работы, выполняемой мышцей, и тепени ее пнфнлырапип нейтрофнлами. было проверено далее при исследовании ьтияння ФН рамнчной длительности на концентрацию МПО в скелетных мышцах >азлнчного метаболического профиля. Для этого через I сут посте ФН были итледонанм белые гликолитическне и красные оксидативные волокна т. uadiiceps, а также m. soteus. которая содержит,- главным образом, красные ■ксидатипные волокна (таСш.1).

1S

Продолжительность ФН в изученном диапазоне не оказывала достоверно выраженного влияния на содержание МПО в гликолитических волокнах ш. quadriceps, тогда как в оксидативных волокнах m. quadriceps ФН вызывала достоверное увеличение концентрации МПО. Сходной была динамика исследованного показателя в m. soleus. При этом, однако, увеличение количества заплывов до максимально возможного вызвало дальнейшее возрастание содержания МПО. Обращает внимание отсутствие четкой корреляции между

Таблица 1

Влияние ФН разной продолжительности на содержание МПО в скелетных мышцах различного метаболического профиля

Количество Содержание МПО, нг/мг белка

заплывов m. quadriceps т. soleus

Белые волокна Красные волокна

0 2,53 ± 1,03 6,81 ± 1,32 5,33 ±0,36

5 2,85+ 1,44 21,93 ±6,61* 20,82+ 1,05*

15 5,05 ±2,92 29,30 ±6,08* 22,03 + 2,00*

25 6,22 + 3,01 25,40 ± 13,72* 45,65 ± 12,75**

Примечание: л=6; *р<0,05, **р<0,01.

объемом работы (количество заплывов), выполненной животными и нарастанием содержания MIIO в мышцах, а также возрастание дисперсии, что, по-видимому, связано с различной индивидуальной выносливостью крыс.

Таким образом, использованная ФН вызывает увеличение содержания МПО в скелетных мышцах. При этом возрастание концентрации МПО в скелетных мышцах до некоторой степени зависит от продолжительности ФН (объема работы), хотя различия содержания этого фермента в гликолитических v. оксидативных волокнах имеют статистически значимый характер.

2.3. Исследование протеиназ нейтрофилов в скелетных мышцах.

Важным деструктивным фактором нейтрофилов являются протеиназь [Ward, 1991а]. Среди них выделяют катепсин G и эластазу - нейтральны! протеиназы, очевидно, вследствие известных данных об их вовлечении в патогене некоторых болезней [Янковский, Довнар, 1985; Havemann, Gramse, 1984].

Для выявления активности нейтрофил'ьных протеиназ в скелетных мышца опытным животным внутрибрюшинно инъецировали кроличью антисыворотку лейкоцитам крыс с Целью снижения притока нейтрофилов в скелетные mmliIui после ФН [Морозов, Петрова, 1993]. Две внутрибрюшишше иньекцн антисывороткн ДС60 (2x1 мл) с интервалом 12 ч позволили примерно в 4 pa i

снизить количество нейтрофнлов в крови интактных крыс в течение 24 ч. Было обнаружено, что введение красам АС60 по выбранной схеме (сразу и через 12 ч после ФН) привело к снижению уровня протеолитической активности в мышечных цитозолях. Данный факт был подтвержден при использовании различных методических подходов, хотя уровень выявляемого снижения различался в зависимости от метода анализа (табл. 2).

Таблица 2

Влияние введения антисывороткн к нентрофилам на активность нейтральных протеи паз в цнтозоле скелетных мышц крыс,

подвергнутых ФН

Метод анализа Протеолитическая активность Опыт/ контроль '' 0

Контроль (0.15М КаС1) Опыт (АС60)

По гидролизу субстрата ФИТЦ-казеин,мкг ФИТЦ/м/мг белка (п-26) 8,60 ±0,39 3,50 ± 1,22** 41

По гидролизу субстрата для эластазы ¿-А1а-Рго-А1а-МСА. мкг МСА/мин/мг белка (х 10 ) (п-17) 5,10 + 0.22 3,90 ± 0,05* 76

По количеству первичных аминогрупп, количество ЫН2-групп/ч/мг белка (х 10" )(п=17) 6,25 ± 0,04 5.33 ±0,08* 85

По освобождению эндогенного тирозина, мкг Туг/ мин/мг белка (хЮ) (п= 12) 0,38 ±0,02 0,28 ±0,02 74

Примечание: «р<0.05; **р<0,()|.

Исследование ишенення протеолитической активности (ФИТЦ-казеин, рН

7.4) скелетных мышц после ФН показало ее постепенное .нарастание в период отдыха (рис. 4а). К концу времени исследования (24 ч) она превышала исходный уровень примерно в 5 раз (п=26: р<0,05.). Введение АС60 в значительной мере предотвращало увеличение протеолитической активности в период отдыха после ФН. "Эти данные позволяют полагать, что определенная часть протеолитической активности шТтозоля скелетных мышц крыс, определяемая при рН 7,4 (субстрат ФИТЦ-казеин) после ФН, имеет лейкоцитарное, главным обраюм. нейтрофильное происхождение.

Данные, полученные с ФИТЦ-казеином, были подтверждены с субстратом для зластаюподобных протеиназ - 2-А1а-Рго-А1а-МСА (рис. 46). В этом случае иротеолитическая активность в группе опытных крыс, получивших инъекции лннкыпоротки к нейтрофнлам. оказалась на 24% миже(п=17; р<0,05).

Дополнительные доказательства присутствия нейтрофильных протеин аз в скелетных мышцах крыс, выполнявших ФН, были получены в опытах in vitro. М. soleus, извлеченные через 24 ч после ФН у животных контрольной (0,15 М NaCl) и опытной (АС60) групп, инкубировали в сбалансированном растворе Хенкса при 37°С в течение 8 ч и измеряли с ФИТЦ-казеином протеолитическую активность

*

■ «. й о

5ю

|Ъ

Рис. 4. Влияние введения АС60 на активность нейтральных протеиназ скелетных мышц крыс, подвергнутых ФН. Стрелками обозначено время введения 0,15 М ЫаС1 ( о—о ) или АС60 ( •—•'); п=4, 4, 6, 26 (а) и 4, 4, 6, 17 (б) для точек: до ФН, через 6, 12 и 24 ч после ФН; ♦р<0,05. Субстраты: ФИТЦ-каэеин (а) и ¿-А1а-Рю-А)а-МСА (б).

12 2А

Время,ч

инкубационной среды'. Если в контроле последняя составила 1,41 + 0,30, 3,10 ± 0,30 и 3,50 ±1,10, то в опыте - 0,85 ± 0,70, 1,70 ± 0,80 (р<0,05) и 2,00 ±1,00 мкг ФИТЦ/ч/мг белка соответственно для точек 3, 6 и 8 ч (п=17). Протеолитическая активность в инкубационной среде появлялась через 2-3 ч и нарастала вплоть дс завершения инкубации. Уровень этой активности в опытных пробах в течение всего инкубационного периода оставался на 40-45% ниже контрольного значения.

В процедуре иммуноблоттинга полоса, соответствующая катепсину G была обнаружена во все: образцах цитозолей m. soleus, подвергнуты) электрофорезу, л в цитозоле интактных крыс. В экстракте нейгрофило перитонеапьного эксудата эта полоса была окрашена более Интенсивно и кром нее AC7I (кроличья' антисыворотка к катепсину G нейтрофилов крыс взаимодействовала еще с двумя белковыми полосами, расположенными выше i ниже кагепсина G и, по-видимому, имевшими отношение или к предшественника! и продуктам деградации кателсина G или к таковым эластазы (препарат кагепсин (i содержал около 10 % эластазм).

На основании этих данных можно заключить, что определенная часть Протеолитической активности с,келетных мышц крыс, определяемая в нейтральной области рН после ФН, имеет лейкоцитарное, главным образом, нейтрофильное происхождение. Эти протеиназы могут играть роль в локальном протеолитическом балансе скелетной мышцы.

.1 Реакция лейкоцитов в ответ на систематическую физическую нагрузку

(тренировка)

Практическое эначенне систематических ФН побудило нас исследовать влияние такого рода нагрузок на статус лейкоцитов крови, а также их миграцию в скелетные мышцы. Были использованы две модели систематической ФН, направленные на развитие у крыс выносливости (группа I) и скоростно-силовых качеств (группа 2). Животные группы 3 (контроль), имели обычный двигательный режим. Изученные виды систематической ФН оказывали различные по эффективности тренировочные воздействия. Так, продолжительность тестирующего плавания до отказа с грузом, равным 8"о массы тела, составила в группе I * 28,9±4,3 мин, в группе 2 - 89.9+12,8 мин и в группе 3 - 23,9±5.0 мин.

Результаты определения концентрации и активности МГЮ в плазме и нейтрофн.чах крови представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Влияние тренировки различной направленности и тестирующей ФН на изменение содержания лейкоцитов в крови, концентрации МГЮ в плазме, концентрации II активности МПО в нейтрофнлах крови

Группа крыс Лейкоциты х 10"4 х л'1 МПО в плазме, мкг х мл"' МПО в нейтрофилах

содержание, пг/клетка активность ' х 109, ед/клетка

1. Покой 7.93? 1.04 0,68 ±0,08 0,8510,08 6,12+0,63

1. ФН 11.23.10,68 1.0910.17 0,5910,09 4.50+0,79

2.11 окой 9.92Ю.85 0.9810.06 0.66Ю.05 5,67+0.48

2. ФН 12.79 + 1,75 1.7710,29* 0.43+0.07* 2,66+0,58*

3. Покои 8.2310,52 0,70+0,07 0,98+0,08 6,14+0,36

3. ФН I5.49tl.24* 1.66±0,10» 0,5910,05« 3,5610.63*

Примечание. Измерение содержания лейкоцитов проведено в образцах крови, собранных после лекапнташш крыс (п=6-9; *р<0,05).

У животных, тренированных на выносливость, изученные показатели в юкое (чере) 2 сут по окончании тренировок) не отличались от контрольных.

Тестирующая ФН, продолжительность которой достоверно не различалась в группах I и 3, вызывала менее выраженное увеличение концентрации МПО в плазме крови крыс, тренированных на выносливость. Данные показатели в отличие от контрольной группы изменялись не достоверно. Реакция лейкоцитов крови в ответ на тестирующую ФН у животных группы 1 была также менее выражена (+42°о) по сравнению с контролем (+88°/о). Снижение активности и содержания МПО в нейтрофилах крови крыс группы I достоверно не отличалось от контроля (группа 3).

Систематическая ФН скоростно-снлового характера привела к изменениям исследованных показателей. В состоянии покоя у крыс группы 2 отмечалась тенденция к увеличению содержания лейкоцитов в крови и концентрации МПО i плазме, а также тенденция к снижению содержания и активности МПО i нейтрофилах крови по сравнению с контрольными животными. Тестирующая Ф1 вызывала достоверные изменения концентрации МПО в плазме (+81%) содержания и активности МПО в нейтрофилах крови (-35% и -53е/ соответственно) в группе 2. Следует отметить, что объем тестирующей ФН в это« случае существенно превосходил аналогичную ФН, которую были способ/» перенести животные групп 1 и 3, что возможно и определило значимый характе изменений.

Концентрация МПО в скелетных ■ мышцах всех исследованных труп животных В покое (спустя 2 сут по окончании тренировки) была пример« одинакова: 5,99 ± 1,95 (9), 5,03 + 2,04 (10) н 6,20 ± 0,84 (7) нг/мг белка для групп 1, и 3. Следовательно, систематическая ФН не оказывала достоверного влияния i концентрацию фермента в скелетных мышцах крыс. Тестирующая ФН обусловш не достоверное повышение концентрации МПО (+105%) в мышечной тка| тренированных крыс (группа 2) и достоверное (+140%) - в контроле (группа ; Вариативность концентрации фермента в скелетных мышцах тренированных кр! оказалась меньше в сравнении с контролем. Снижение интенсивности прито нейтрофилов в мышечную ткаиь тренированных животных п ответ тестирующую ФН свидетельствует об адаптации ткани к ФН.

4. Исследование in vitro механизмов взаимодействия нейтрофилов с т. snk'us и

миобластоми

Действие нейтрофилов и других лейкоцитов, попавших в ткань "отыскавших" очаг ншемического повреждения, направлено на разрушение .пи ми нацию этого очага. Важными лесtр>ктнвными факторами нейтрофилов >:

этом служат МПО и протенназы [Ward, Varani, 1990; Britigan et al., 1996]. С этой точки зрения в модельных опытах in vitro исследовали возможные механизмы взаимодействия нентрофилов и их белков с мышечной тканью и различными белками скелетных мышц (Петрова, Морозов, 1992; Морозов, Петрова, 1993; Morozov, Petrova, 1994; Матюшичев и соавт., 1994; Morozov et al., 1996].

В этих опытах использовали инкубационную систему, содержавшую т. soleus нитактных или подвергнутых ФН крыс и перитонеальные лейкоциты крыс (около 70" о нейтрофилов).

Степень повреждения m. soleus наблюдали, анализируя активность мышечных ферментов, креатинкиназы (КК) и аспаргатаминотрансферазы (АсАТ), выходивших в инкубационную среду в процессе инкубации. Уже через I ч в системе, содержавшей m. soleus интактных крыс, удалось обнаружить активности КК и АсАт, которые нарастали в процессе дальнейшей инкубации (рис. 5). В отсутствие m. soleus активности этих ферментов не выявились, что позволило отнести их появление в инкубационной среде на счет ni. soleus и рассматривать как маркеры повреждения m. soleus.

40

а

Рис. 5. Активности креатинкиназы (а) и аспаргигаминотраисферцзы

(б) в инкубационной среде при инкубации m. soleus (I), т, soleus с активированными зимозаном (2) И

неактивнрованными (3)

нейтрофнлами (п=2К; *р<0,05, »»р<0.01; 2 и 3 в сравнении с

зимозаном

I).

О

2

А

6 О

Время, ч

Сончеспия инкубация m. soleus н нентрофилов (рис. 5а) привела к быстрой пнакншанпн КК". причем скорость инактивации не различалась

2.4

существенно в зависимости от того, были активированы неитрофилы или нет. В отличие от КК активность АсАТ выявлялась хорошо (рис. 56), вероятно, в силу большей устойчивости этого фермента. Активность АсАТ через I ч инкубации т. soleus в присутствии активированных и неактивнрованпых нейтрофилов была выше, чем в контроле (m. soleus) на 53% (0,071 ± 0,002 МЕ/мл) и на 58% (0,077 ± 0,004 МЕ/мл) соответственно. Далее активность фермента сохранялась на достаточно высоком уровне по крайней мере в течение 3 ч инкубации, и лишь затем происходила, инактивация АсАТ. Степень этой инактивации через 3 ч в присутствии активированных нейтрофилов была выше по сравнению с неактивированными клетками (р<0,05). Как показали эксперименты в

использованной модельной системе лротеиназы (гидролиз ФИТЦ-казеина) и 125

МПО (включение I) нейтрофилов являлись реальными факторами нейтрофилов, которые могли участвовать как в изменении проницаемости ш. soleus, так и й инактивации ферментов, вышедших из скелетной мышцы в инкубационную среду.

При инкубации -m. soleus, изолированных у крыс, подвергнутых ФН, обнаружили существенно больший выход КК и АсАТ в инкубационную среду по сравнению с интактными мышцами. В зависимости от срока инкубации (1, 3, 6, £ ч) активности КК и АсАТ оказались выше в случае ФН в 65; 10,4; 3,4 и 3,2 раза и i 12,5; 2,8; 1,5 и 1,1 раза соответственно. Различия были особенно велики i начальный период инкубации, что указывает на значительные иоврежденш проницаемости мембран миоцнтов, развивающиеся под действием ФН. Инъекцт крысам после ФН антисыворотки к нейтрофилам привели к достоверном; снижению выхода обоих ферментов в инкубационную среду при инкубации m soleus. Ниже при этом оказался и выход креатина. Введение в инкубационную систему активированных нейтрофилов привело к подавлению активностей КК i АсАТ, как и в случае с интактной ш. soleus.

Использование инкубационной системы,, включающей m. soleus крыс перитонеальные лейкоциты крыс позволило показать возможность повреждени лейкоцитами мь.шечных ферментов КК и АсАТ. В механизме повреждени участвуют МПО и протеиназы лейкоцитов. Обнаружена большая устойчивост АсАТ по сравнению с КК к повреждающему действию лейкоциго! Предварительная ФН значительно увеличивает выход КК и АсАТ из m. soleus пр инкубации in vitro, что доказываег повреждение проницаемости мембра

ииоцитов под влиянием ФН. Введение крысам после ФН антисыворотки к 1ейкоцитам сопровождается снижением выхода из ш. 5о1еи5 обоих ферментов, а гакже креатина, что свидетельствует в пользу участия лейкоцитов в механизме топреждения мышечной ткани под влиянием ФН.

На основании представленных данных складывается целостная картина зеакцин системы лейкоцитов крыс на однократную ФН высокой интенсивности плавание животных с грузом до отказа). При этом 1-я стадия реакции (0-5 сут) разворачивается в кровотоке практически немедленно с начала ФН и включает пменения количественного к качественного состава лейкоцитов крови, а также функций нейтрофилов (увеличение секреторной и угнетение фагоцитарной жтивностей). 2-я стадия реакции системы лейкоцитов (!-7 сут) осуществляется в тределах ткани скелетных мышц, участвовавшей в обеспечении двигательной функции при совершении ФН. Основные фактические события, которые имеют лесто на обеих стадиях реакции системы лейкоцитов в ответ на ФН, обобщены в шде таблицы (табл. 4).

Важным на наш взгляд является сформулированное в заключительной части аблицы предположение о двояком функциональной роли лейкоцитов в мышечной канн после ФН. С одной стороны, очевидно, что они принимают участие в [еструктивных процессах, протекающих в очаге повреждения ткани, которые шправлены на скорейшее устранение вышедших из строя миоцитов. С другой тороны, лейкоциты могут также способствовать ускорению репарационных |роцессов. активируя и побуждая к пролиферации сателлнтные клетки мышечной каии. В процесс деструкции вовлечены прежде всего неитрофилы, а также юноннгы/макрофаги. Активация сателлитных клеток может быть достигнута за чет ннтокннов или других биомолекул, продуцируемых лейкоцитами. Эти же нюмолекулы могут быть участниками и/или регуляторами метаболических обыгий на локальном уровне.

Необходимо подчеркнуть и два следующих наблюдения, оставшихся за Пределами табл. 4. 1/ Интенсивность 2-й стадии реакции системы лейкоцитов в определенной мере обусловлен;! интенсивностью ФН, т.е., вероятно, связана с тепеныо повреждения мышечной ткани. 2/ Предварительная тренировка (ипотных адаптирует мышечную ткань к ФН и ведет к снижению притока ейкоцитов п скелекше мышцы, что обеспечивает уменьшение повреждения ткани ри выполнении ФН.

Таблица 4

Основные события, которые включает реакция системы лейкоцитов в ответ на

физическую нагрузку

Время после ФН Место события Фактическое содержание события Причина события и возможные последствия

0-5 су т Кровоток 1)Изменяется количественный и качественный состав крови Вследствие мобилизации маргинального и костно-мозгового резервов, что ведет к созданию в крови оптимального для последующих реакций пула лейкоцитов

2)Возрастает секреторная активность нейтрофилов Вследствие появления факторов, стимулирующих секрецию.Белки нейтрофилов,попадая • в плазму крови, могут включаться в регуляторные процессы

^Снижается фагоцитарная активность нейтрофилов' Вследствие конкуренции с секреторным процессом за макроэрги,что может вести к возрастанию чувствительности к хемотаксическому стимулу

1 -7 сут Скелетные мышцы 4)Лейкоциты мигрируют в скелетные мышцы из кровотока Вследствие появления хемотаксического градиента скелетная мышца-жровоток, что стимулирует приток лейкоцитов и ведет к их накоплению в очагах ишемического повреждения ткани

5)Воэрастает концентрация белков нейтрофилов (миело-пероксидаза, протеин азы) в мышечной ткани Вследствие дегрануляции и разрушения лейкоцитов. Белки лейкоцитов вовлекаются в метаболические процессы, протекающие в очаге ишемического повреждения. Ускоряется процесс восстановления мышечной ткани

Таким образом, данная работа демострирует тот факт, что систем лейкоцитов активно реагирует на Ф11, причем смысл этою реагирования сводигс к восстановлению целостности мышечной ткани, поврежденной в резульпп • усиленного функционирования.

Выпады

I. Выделены и • очищены два иейтрофильных белка н< лейкоцит нернтонеального эксудата крыс (70% нешрофилов) - миелопероксндаза катепшн О. Изучены некоторые физико-химические свойства выделеннм ферментов. К обоим белкам получены полнклоиальные кроличьи гнинсыворожи

2. Развит метод иммунорадиометрического анализа миелопероксидазы лейкоцитов, который позволяет измерять концентрацию фермента в биологических образцах. Метод, основанный на применении иммуносорбента сефароза-аититела к миелопероксидазе, имеет высокую специфичность, чувствительность и точность.

3. Развит прямой безэкстракционный метод радноиммуноаналнза кортикостерона, позволяющий измерять концентрацию этого гормона в сыворотке крови крыс. Метод основам на использовании полнклональных кроличьих антител к кортикостерону и ['и]кортнкостерона. Стадия экстракции исключена, благодаря применению кислого буферного раствора с рН 4,5-5,0, ингибирующего связывание кортикостерона транспортным белком крови транскортином. Исключение процедуры экстракции привело к повышению точности и воспроизводимости метода, сокращению времени анализа и объема сыворотки крови, необходимого для анализа.

4. Изучено изменение содержания в крови нейтрофилов и других типов лейкоцитов в ответ на ФН. Обнаружены существенные изменения количественного статуса лейкоцитов крови, включающие два подъема уровня лейкоцитов. 1-й подъем связан с увеличением содержания в крови лимфоцитов, 2-й • с увеличением содержания неитрофилов. Пик лимфоцитов развивается в процессе Ф11, тогда как пик нейтрофилов приходится на 6-8 ч отдыха. Нормализация содержания лейкоцитов в крови происходит в течение 3-5 сут отдыха.

5. Под влиянием ФН возрастает секреторная акт'ивность нейтрофилов срови. что сопровождается увеличением содержания ферментов нейтрофилов миелонероксидлза. лизоцим) в плазме крови и снижением их содержания в тейтрофилах. Нормализация концентрации ферментов в плазме и неитрофнлах «аступает в Течение I сут отдыха.

6. Под влиянием ФН подавляется фагоцитарная активность нейтрофилов :ровн. Снижаются такие показатели фагоцитарной реакции, как фагоцитарное тело и фаюнигарный индекс. Нормализация данных показателей фагоцитарной [ктнвности нейтрофилов происходит в течение 3 сут. ФН приводит к подавлению гатоцитарной реакции и другого типа гранулоцитов крови - эозинофилов. 'пособность нейтрофилов к продукции активных форм кислорода снижается к 6 ч тлыха после'ФН.

7. Проведены гистологические исследования m. soleus крыс, подвергнуты) ФН. Обнаружены лейкоцитарные микроинфильтраты через 1 сут после ФН состоящие из нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. Инфильтраты сохраняются i течение 1-3 сут и практически не выявляются через 5-7 сут после ФН. Обнаружен; смена типов лейкоцитов, инфильтрирующих мышечную ткань, которая состоит постепенном замещении нейтрофилов и моноцитов макрофагами.

8. Получены биохимические доказательства миграции нейтрофилов скелетные мышцы после ФН, основанные на измерении в мышечной ткан содержания маркерного фермента нейтрофилов - миелопероксидазы. Показанс что уже через 1 сут после ФН содержание этого фермента в мышечной ткан достигает максимума и на этом уровне поддерживается в течение следующих 4 су Затем следует снижение содержания миелопероксидазы, однако и через 7 с> наблюдения оно оказывается повышенным по сравнению с исходным уровнем.

Исследовано распределение миелопероксидазы по субклеточным фракция миоцигов и показано ее предпочтительное концентрирование во фракщ мембран плазмалеммы. Показана возможность модификации белков скелетнь мышц в системе миелопероксидаза-НгОг in vitro.

9. Проведено изучение протеолигической активности скелетных мьш после ФН. Использование крыс с. нейтропенией (введение антисыворотки нейтрофилам) показало, что часть протеолитической акгивност обнаруживаемой в мышцах по гидролизу ФИТЦ-казейна и специфическо субстрата эластазы нейтрофилов - Z-Ala-Pro-AIa-MCA при рН 7,4, относится счет нейтрофильных протеиназ. С помощью . Вестерн иммуноблоттин обнаружено присутствие катепсина G нейтрофилов в мышечной ткани.

10. Систематические (тренирующие) ФН приводят к изменен! реактивности нейтрофилов /рови, что выражается в снижении интенсивное процесса секреторной деграиуляции этих клеток в ответ на тестирующую Ф более выраженному в случае тренировки скоростно-силового характе Адаптация скелетных мышц к систематическим ФН закчючалась, в частности снижения интенсивности притока нейтрофилов в мышечную ткань в отпет тестирующую Ф11.

11. В модельных опытах с использованием инкубационном cuciei содержащей m. soleus крыс и перигонеальные лейкоциты (70% нейтрофилов) кр показана возможность повреждения лейкоцитами мышечных фермен кре.иинкина <ы и аспаргшамннотрамсфераш. В мечантм повреждения и<чиеч(

нзелопероксидаза и протепназы лейкоцитов. В сходных экспериментах на [ервичнои культуре куриных миобластов продемонстрирована возможность ювреждения мембраны (увеличение проницаемости) миобластов при инкубации с еикоцитами крысы. Обнаружена большая устойчивость

снартатаминотраисферазы в сравнении с креатннкиназой к повреждающему ¡ействию лейкоцитов.

12. Сформулирована концепция о двухстадийном характере реакции нстемы лейкоцитов на Ф11. Первая стадия реакции (0-5 суг) разворачивается в ровотоке и включает изменения количественного и функционального статусов ейкоцитов. Вторая стадия реакции (1-7 сут) развивается Ь скелетных мышцах и оетоит в инфильтрации мышечной ткани лейкоцитами.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Морозов В.П., Прияткин С.Л.. Сакута Г.А. Комплексная оценка неспенифической резистентности//Медип1П1СКие проблемы массовой физической культуры: Тез. докл. 1-й Всесоюзн. конф.-М.. I983.-C.49. .. Прияткин С.Л., Морозов В.И.. Сакута Г.Л., Рогожин В.Л. Ненгрофилы и

неспецифическая резистентность при физической нагрузке//Там же.- С.50. . Морозов В.П.. Прияткин С.Л., Сакута Г.Л., Федорова Г.П.. Роготкнн В.А. Опенка уровня неспецифической резистентности у спортсменов//11роблемы комплексного контроля п спорте высших достижений : Тез. докл. Всесоюзн. научно-практ. конф.-М.. 1983.-С.144. . Прияткин С.А.. Морозов В.11. Некоторые коррелятивные взаимосвязи между* факторами неспенифической резистентности и содержанием стероидных юрмонов в кропи при физической нагрузке/Юбшие механизмы деятельности висцеральные систем: Тез. докл. симпоз.-Л., 1983.-С.39-40. . Морозов ВН., Прияткин С.А.. Сакута Г.А.. Рогозкнн В.А. Функциональная активность пейтро(|1млов п гуморальные факторы неспенифической резистентности при физической нагрузке// Фагоцитоз и иммунитет: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз.-М.. I9K3.-C. 156. . Роюжин В.Д.. Ьулкин В.А.. Морозов В.И. Комплексная оценка двигательных возможностей человека//Спорт-науке, наука-спорту: Тез. докл. Всесоюзн. конф.-Новосибирск, 19К4.-Ч.З.-С.13-14. . Морозов В.П.. Федорова Г.П.. Шишина H.H., Прияткин С.А. Организация и проведение биохимического обследования спортсменов в зимних видах спорта//,Актуальные вопросы научного обеспечения подготовки спортсменов Лешпп рада: Сб. научных тр.-Л.. 1985.-С.136-141. . Морозов В.П.. Прияткин С.А., Федорова Г.П., Рогозкнн В.А. Исследование неспецифической резистентности и некоторых показателей ферростатуса у спортсменоп//Теор. практ. фнзич. культуры.-I986.-N2.-C.22-23. . Прияткин С.А.. Морозов В.П., Назаров П.Б. Секреция лнзоцнма нейтрофилами крови при физической нагрузке // Физиология спорта: Тез. докл. 18-й Всесоюзн. научно-практ. конф.-М.. 19К6.-С. 159-1ЛО. 0. Рогозкнн В.А.. Вольной H.H., Калпнкин H.A., Морозов В.Н.. Прияткин С.А., Федорова Г.П.. Шишина H.H.. Яковлев Е,Ф. Методологический подход к оценке уровня здоровья при проведении массовых обследований

С1Юртсменов//Тез. докл. Всероссийского съезда по лечебной физ-ре i спортивной медицине.-Свердловск, 1986.-С.59.

11. Рогозкин В.А., Булкин В.А., Вольнов H.H., Киселев К).Я., Морозов В.И. Фалалеев А.Г., Унифицированные методы комплексного контроля дп проведения массовых обследований спортсменов/Метод. рекомендации.-Л 1985.-47 с.

12. Морозов В.П., Приягкин С.А. Неспецифическая резистентность организма i физические на грузки//Адаптация к мышечной деятельности и гормоны: С( научных тр.-Л., I986.-C. 106-116.

13. Морозов В.П., Федорова Г.П., Прияткин С.А., Шиишна H.H., Рогозкин В.А Витаминная обеспеченность, ферростатус и состояние систем! неспеиифической резистентности у спортсменов разного возраста и ncma//Teof практ. физич. культуры.- 1987.-N8.-C.48-49.

14. Цыпленков П.В., Морозов В.И., Рогозкин В.А. Флуороиммунный анапи белков//Биоорган. химия.-I987.-T. 13, NI2.-C.605-618.

15. Абышев А.З., Васильева М.Г., Колотинская Т.М., Морозов В.И., Рогозки

B.А., Цыпленков П.В. Производные а-бензопирон-2-она как флуоресцентны маркеры белков//Актуальные вопросы получения и использовани биополимеров в биотехнологии: Сб. научных тр.-Деи. ВИНИТИ, 1987 N7033/B-87.-22 с.

16. Прияткин С.А., Назаров И.Б., Морозов В.И. Метод радиоиммунног определения лнзоцима человека и его применение для оценки функционально! состояния фагоцитов крови//Пути совершенство- вання эффективност медицинского контроля за высококвалифициро- ванными спортсменами: Те; докл. 23-й Всесоюзн. конф. по спортив- ной медицине.-М., 1987.-4.I.-C.I20-I21

17. Морозов В.И., Федорова Г.П., Прияткин С.А. Результаты клинике биохимического обследования спортсменов на соревнованиях по зимним вида спорта в 1985-86 гг.//Комплексная оценка подготовлен ности спортсменов зимних видах спорта: Сб. научных тр.-М., 1987.-С.53-69.

18. Морозов В.И., Чайковский B.C., Прияткин С.А., Рогозкин В.А. Получен! антисывороток к стероидам/УАктуальные вопросы биотехнологии: Тез. дою Всесоюзн. конф.-Л., 1987.-С.158.

19. Морозов В.И., Прияткин С.А., Рогозкин В.А., Федорова Г.П., Шишина ИТ Опыт использования комплекса клинико-биохимических методов для контро) за состоянием здоровья спортсменов в Циклических видах спорта//Развитт выносливости в циклических видах спорта: Тез. докл. Всесоюзн. научно-прак конф.-М., 1987.-С. 112-113.

20. Морозов В.П., Прияткин С.А., Исакова Т.И, Лушицкая И.А., Рогозкин В./ Метод радиоиммунного анализа эстрадиола -I7ß и влияние фнзическс нагрузки на его содержание в крови людей//Вопр. мед. химии.-1988.-Г.34, N3

C. 136-139.

21. Прияткин С.А., Назаров И.Б., Морозов В.И., Рогозкин В.А. Радиояммуниь метод анализа лизоцима человека и влияние физической натрузкп на ei содержание в крови//Вопр. мед. химии.-I988.-T.34, N4.-C.74-78.

22. Прияткин С.А. Морозов В.И,, Рогозкин В.А. Влияние физической н.ирузкн i факторы неспецифнческой резистентности и содержание стероидных гормоне в крови челоиека//Физиология человека.-1988. -Т. 14, N4.-C.606-612.

?,3. Морозов В Н., Чайковский B.C.. Прияткин С.А.. Рогозкин P.A., Савчеш О.И., Шаляпина В.Г.. Зорина А.Д.. Лушицкая H.A.. Салтыкова П Л.. Миш» В.П.. Тимофеева Л.А.. Степанов Г.С. Ридиоиммунныи анализ сн-ринло Научно-практические аснекты/Мчпнолошч. жури. С<'("P.-1чуь' -'1.74, Nf I'. in 19-1072.

1. Цмплеиков П.В., Рогозкин В.А., Кокрякон В.Н. Пммунорадномегрн- ческнн анализ миелопероксидазы кр>,1Сы//Укр. биохим. журнал,-1988.--Т.60, N6.-С.72-75. 5. Морозов В.И., Елхачева Е.В., Прпяткин С.А., Цыпленков П.В. Механизм снижения фагоцитоза неитрофилов крови при мышечной деягелыюсти//Физиологические механизмы адаптации к мышечной деятельности: Тез. докл. 19-й Всесоюзн. конф.-Волгоград, 1988.-С.243. í. Цыпленков П.В., Морозов В.И. Применение сорбентов сефароза-белок для препаративного выделения антител/Шрепаративная хроматография физиологически активных веществ: Тез. докл. 1-го Всесоюзн. симпоз,- JI.: Паука, I988.-C.21.

'. Прияткин С.А., Назаров И.Б., Морозов В.И. Секреция лизоцима нейтрофилами крови при физической нагрузке//Фиэиологич. жури. СССР.-1989.-Т.75, N3.-С.334-337. !. Морозов В.П., Прпяткин С.А., Цыпленков П.В. Участие неитрофилов в адаптации организма к мышечной деягельностн//Пиохимия питания спортсменов: Тез. докл. Всесоюзн. конф.-Л.. I989.-C.I94-I95.

Rogozkin V.A., Morozov V.l., Nazarov I.В., Tsyplenkov P.V. Investigation of neutrophil myeloperoxidase and calpain activity in the rat skeletal muscle// Abstracts оГthe 19th FEBS Meeting-Rome, 1989.-TUI42.

Морозов В.П., Цыпленков П.В., Рогозкин В.А. Выявление мнелоперо- ксидазы неитрофилов в скелетных мышцах крыс после мышечной деятельностн/УБюлл. экспер. биол. медицины.-I989.-T. 110, NI I.-C.489-49I.

. Морозов В.П.. Константинова Т.А., Зорина А.Д., Прияткин С.А., Тимофеева Л.А.. Рогозкин В.А. Прямой радиоиммунный анализ глюкокортикоидов и влияние физической нагрузки на их содержание в крови людей и крыс//Вопр. мед. химии.-Деп. ВИНИТИ, 1990.-N3164-B90.-I9 с.

. Прияткин С.А., Елхачева Е.В., Морозов В.И. Влияние физической нагрузки и введения тестостерона на содержание лизоцима в крови крыс//Гормональная регуляция обменных процессов при мышечной деятельности: Ученые записки Тартусского гос. ун-та.-ТГУ. I990.-T.XX4.-C.53-59.

. Rogozkin У.A., Morozov V.l., Tsyplenkov P.V., Pryatkin S.A. Neutrophil system reauion on muscular activity/ZAbstracts of the 24th FIMS Woild Congress orSports Medicine.-Amsterdam, 1990.-P-JI.

. Rogozkin V.A., Morozov V.l., Pryatkin S.A., Tsyplenkov P.V. Why does neutrophil phagocytosis decrease by muscular activity?//Abstracts of the 3rd European Congress on Cell Biology.-Milano, I990.-P.226.

Морозов В.П., Рогозкин В.А., Цыпленков П.В. Миелопероксидаза как маркер инфильтрации нейгрпфилами ткани скелетных мышц крыс после мышечной дея1елм!остн//(;похимия спорта: Матер, междунар. снмпоз.-Л., 1990.-С.129-142.

Прияткин С.А., Морозов В.П., Рогозкин В.А, Определение секреторной активности лейкоцитов крови при стандартной физической нагрузке для оценки работоспособности спортсменов // Комплексная диагностика и оценка функциональных возможностей организма и механизмы адаптации к напряженной мышечной деятельности высококвалифнци-роваиных спортсменов: Тез. докл. Всесоюзн. конф.-М., I990.-C.206.

Морозов В.П., Волков К.Н.. Кокряков В.Н. Влияние галогенирования на протеолигическую устойчивость белков//Г1нтание и физическая работоспособность : Матер. Всесоюзн. конф.-Л., 1991.-С. 162-164.

Моро uní В. П.. Изотова П.В.. Прияткин С.А./Цыпленков Г1.В. Влияние мышечной деятельности на систему неитрофилов крови крыс// Фнзнологич. *>рн. СССР.-1991.-Т.77, N1.-С.53-61'.

К'раева .'1.1!.. Кокряков В Н.. Позднее В.Ф., Морозов В.И., Усова A.A. '.1ире.че.чние зскр'.пнон активности сериновых протеиназ человека и животных

с использованием в качестве субстратов флюорогенпых эфиро< аминокнслет//Бюлл. экспер. биол. медитпш.-1992.-Т. I13, N6.-C.600-601.

40. Петрова Т.Н., Морозов В.И. Механизм подавления нейтрофилами активносп креатннкиназы и аспаргатаминотрансферазы скелетных мышц крыс//Бюлл эк спер. биол. медицины.-1992.-Т. 114, N 12.-С.603-605.

41. Морозов В.П., Петрова Т.Н. Выявление протеиназ нейтрофилов в скелетны мышцах крыс после мышечной деятельностн//Укр. биохим. жури.-(993.-Т.6.' N4.-C.40-44.

42. Morozov V.I., Tokmakov A.A., Volkov K.N. Blood neutrophil chemiluminescenc by intense physical performance//Abstracts of the 2nd International Congres ISNIM.-Salerno, Italy.-1993.-P.369.

43. Moro2ov V.I., Petrova T.N. Neutrophil antiserum results in proteolytic aciivi! decrease in loaded muscles of rats//Intensive Care Medicine.-1994.-Vol.20, Suppl. 1 P.S38.

44. Матюшичев В.Б., Соколов И.Н., Морозов В.П., Петрова Т.Н., Саид М.С Изменения проницаемости мембран миобластов в культуре при контакте нейтрофилами//Цитология.-1994.-Т.36, N2.-C. 169-174.

45 Morozov V.I., Volkov K.N., . Kokryakov V.N., lodination effect on protei resistence to proteolysis/ZMechanisms of regulated intracellular protein degradatioi Abstracts of ASBMB symp.-Whistler, Canada.-1994.-P.46.

46. Morozov V.I., Usenko T.N. Immunoglobulins against cathepsin G (CG) are poor 1 inhibit protease activity//FASEB J.-1995,-Vol.9, N6.-P.509.

47. Morozov V.I., Volkov fi.N., Kokryakov V.N. The efficiency of thyroxine uptake t rat neutrophils/Neuroirnrniiiio Interactions and Environment (lCONE"9f Abstracts of the intern. Conf.-St.Petersburg, Russia, 1995.-P. 154.

48. Morozov V.I. Mechanisms of leukocyte involvement in rat skeletal muse adaptation to physical loading//FASEB J.-1996.-Vol.l0. N6.-P.A1289.

49. Morozov V.I., Sokolov I.N., Said S.M., Usenko T.N. Chicken myoblasts leukocyte target for in vitro studing of muscle cell-leukocyte interactions// FASEB . I996.-Vol.l0, N6.-P.A1289.

50. Morozov, V.l. The reaction of rat leukocyte system to physical loading// The Physiologist.-1996,-Vol.39, N5.-P.A-46.

51. Морозов В.И., Цыпленков П.В., Кокряков В.Н., Волков К.Н., Виноградова Н.А. Выделение и характеристика миелопероксидазы лейкоциюв перигопеального эксудата крысы//Биохимия.-1997.-Т.62^6.-Г.729-737.

Тип. , $4Ши г1Гс<. ¿ак сw. ruf.г ioo w/r