Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация и функциональная роль белка CD97 в скелетных мышцах

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Локализация и функциональная роль белка CD97 в скелетных мышцах"

Зырянова Татьяна Юрьевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ БЕЛКА С097 В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ

03.03.01 — «Физиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

ПИШИ .................

005543652

Санкт-Петербург 2013

Работа выполнена на кафедре обшей физиологии биолого-почвенного факультета ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор

Марков Александр Георгиевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Федин Анатолий Николаевич, ИЭФБ РАН

доктор биологических наук, профессор, Кокряков Владимир Николаевич, ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (г. Санкт-Петербург).

Защита состоится «26» декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.232.10 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. Горького ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» (г. Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9).

Автореферат разослан «Д^» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор JJ ^ Е.Е. Ляксо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Изучение механизмов регуляции сокращения и расслабления скелетных мышц является важной и актуальной задачей современной физиологии. Эффективностьсокращения скелетных мышц обусловлена в первую очередь сократительной реакцией актомиозинового комплекса, а также фенотипом мышечных волокон, составляющих мышцу. Фенотип мышечных волокон определяется на основе нескольких параметров. Исторически первыми были выделены анатомические и гистологические критерии. Было показано, что скорость сокращения скелетных мышц коррелирует с диаметром отдельных волокон и целой мышцы, а также ее цветом (Ranvier, 1874). Затем для определения фенотипа мышц стали включать другие критерии. Была разработана система классификации мышечных волокон на основе скорости сокращения и развития утомления. Мышечные волокна впервые разделили на быстрые и медленные (Burke et al., 1973). Было установлено, что морфологические и физиологические критерии коррелируют с преобладанием окислительного или гликолитического типов обмена в этих мышцах, определяемых по активности ключевых ферментов этих процессов (Olson, Swett, 1971; Close, 1972).

В настоящее время быстрые и медленные волокна определяют с помощью антител к быстрой и медленной формам тяжелой цепи миозина, а также по степени активности ферментов окислительного и гликолитического типов обмена.

Исследование механизмов, определяющих развитие фенотипа мышечных волокон, остается малоизученной областью. В исследованиях на клеточных линиях поперечнополосатых мышечных волокон показано, что для их специализации необходимо присутствие рецептора к эпидермальному фактору роста (Olwin, Hauschka, 1988). Было установлено, что рецепторы к эпидермальным факторам роста (ЭФР) экспрессируются в нативных мышцах (Aust, 2006; Nechiporuk et al., 2001; Shiratsuchietal., 1997). Вчастности, в скелетных мышцах было установлено наличие белковой молекулы CD97, в состав внеклеточного участка которой входят специфичные ЭФР-подобные домены для связывания с эпидермальными факторами роста (Kwakkenbos et al., 2004; Hona et al., 2008). Было обнаружено, что экспрессия данного белка локализована в мембране саркоплазматического ретикулюма скелетных мышц. Однако вопрос о локализации CD97 в быстрых или медленных волокнах скелетных мышц не изучен. Была показана колокализация данной молекулы с белками на мембране саркоплазматического ретикулюма, вовлеченными в регуляцию внутриклеточной кальциевой динамики, а именно, с рианодиновыми рецепторами и Са-АТФазой-2 (Schneider et al., 2007). В скелетных мышечных волокнах С097-нокаутных мышей было обнаружено увеличение объема цистерн саркоплазматического ретикулюма (Schneider et al., 2007).

Таким образом, полученные ранее данные позволили сформулировать рабочую гипотезу о том, что белок CD97, располагаясь на мембране саркоплазматического ретикулюма, вероятно, участвует в регуляции активности работы кальциевых каналов, следовательно, регуляции кальциевой динамики.

Целью данного исследования являлось изучение локализации и функциональной роли белка CD97 в скелетных мышцах.

Задачи исследования:

1. Изучить локализацию и интенсивность экспрессии CD97 в быстрых и медленных волокнах человека т. spinalis и т. vastus medialis.

2. Определить динамику изменения концентрации ионов кальция на изолированных одиночных мышечных волокнах мышцы т. flexor digitorum brevis мышей дикого типа и нокаутных по CD97 при воздействии кофеина и хлорида калия.

3. Сравнить анатомические, гистологические, биохимические критерии фенотипа волокон скелетных мышц т. soleus и т. extensor digitorum longus мышей дикого типа и нокаутных по CD97.

Научная новизна. Впервые на основе гистологических, биохимических и физиологических методов проведено комплексное исследование фенотипа волокон и кальциевой динамики в скелетных мышцах CD97-нокаутных мышей. Впервые установлено, что CD97 экспрессируется интенсивнее в медленных волокнах человека т. spinalis и т. vastus medialis. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у мышей нокаутных по CD97 происходит снижение объема кальция, высвобождающегося через рианодиновые рецепторы, при воздействии кофеина. Впервые показано, что у нокаутных по CD97 мышей возрастает активность сукцинатдегидрогеназы, маркера окислительного обмена.

Научная и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены данные, которые позволяют расширить теоретическое представление о функциональной роли рецепторов эпидермальных факторов роста, к которым относится CD97, в регуляции сокращения и расслабления мышц, а также фенотипа волокон составляющих скелетные мышцы. Данная работа имеет значение для области мышечной физиологии. Результаты диссертации используются в курсах лекций «Общая физиология», читаемых для студентов второго курса обучения на кафедре общей физиологии биолого-почвенного факультета ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Область практического применения результатов данного исследования связана с растущим числом заболеваний, в основе которых лежит нарушение механизмов регуляции фенотипа скелетных мышечных волокон. Полученные данные могут служить теоретическим подходом в разработке стратегии лечения больных с различными видами миопатий.

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Белковая молекула CD97 представлена в быстрых и медленных мышечных волокнах человека разных скелетных мышц. CD97 преимущественно локализована в медленных мышечных волокнах.

2. Белок CD97 включен в процесс кальциевого сигналинга при активации рианодиновых рецепторов саркоплазматического ретикулюма скелетных мышечных волокон мышей.

3. Поддержание метаболического профиля скелетных мышечных волокон у мышей связано с наличием белковой молекулы CD97.

Апробация и реализация результатов исследования. Результаты исследования доложены и обсуждены на 6-й международной конференции, посвященной адгезионному классу рецепторов, сопряженных с G-белками (Вюрцбург, Германия, 2012); на 16-й и 17-й международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012-2013); на международной конференции, посвященной фундаментальным и прикладным аспектам миофизиологии (Пущино, 2012); на XI Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012), на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию профессора A.A. Чумакова «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, и шесть тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 150 источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками.

Работа поддержана персональными грантами: международным фантом научно-исследовательских стипендий для аспирантов и молодых ученых немецкой службы академических обменов (DAAD) А/10 / 76169; грантом для студентов, аспирантов и молодых ученых вузов Санкт-Петербурга (2.6 / 26 — 06 / 24А); медицинским факультетом Университета Лейпцига (Германия).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования. Для изучения локализации и интенсивности экспрессии CD97 в быстрых и медленных скелетных мышечных волокнах человека был исследован биопсийный материал спинной мышцы т. spinalis на уровне первого позвонка поясничного отдела позвоночника (LI, lumbar spine) и т. vastus medialis. Критерием выбора данных мышц послужил такой параметр, как разная функциональная активность, которая определяется процентным соотношением быстрых и медленных волокон. Спинная мышца т. spinalis практически полностью состоит из медленных волокон (Hesse et al., 2010). Медиальная широкая мышца бедра (т. vastus medialis) человека в своем составе содержит больше половины быстрых волокон (Edgerton et al., 1975).

Мышечная ткань т. spinalis (п=6) и т. vastus medialis (п=2) была получена от пациентов в результате реконструктивных операций в отделении хирургии и травматологии университетской клиники Лейпцига (Германия). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом медицинского факультета университета Лейпцига и проведено с личного согласия пациентов.

Для сравнения характеристик фенотипа волокон скелетных мышц была использована линия С097-нокаутных мышей, созданная в лаборатории профессора J. Hamman (университет Амстердама, Нидерланды) (Veninga et al., 2008) и любезно предоставленная нам для исследования. Эксперименты были проведены на самцах мышей дикого типа C57BL / 6J (контрольная группа, п=10) и нокаутных по гену CD97 (опытная группа, n=l 1) возрастом 10 недель, массой 18 - 27 г. Животные содержались на стандартном рационе вивария, в отдельных клетках со свободным доступом к пище и воде.

Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены медицинским экспериментальным центром университета Лейпцига (Германия).

Для исследования фенотипа мышечных волокон были взяты скелетные мышцы т. soleus и т. extensor digitorum longus, различающиеся соотношением быстрых и медленных волокон. Известно, что т. extensor digitorum longus крысы состоит практически только из быстрых волокон (Pette et al., 1999; Jürgens, 2002; Close, 1967). В отличие от нее, в т. soleusy мышей почти половину массы составляют медленные волокна (Augusto et al., 2004; James et al., 1995).

Для определения динамики концентрации ионов кальция внутри миоплазмы использовали биопсийный материал т. flexor digitorum brevis мышей дикого типа и нокаутных по CD97.

Локализацию CD97 в быстрых и медленных волокнах определяли с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Для получения более достоверных данных интенсивность экспрессии CD97 в быстрых и медленных волокнах определяли параллельно с помощью

иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Иммуногистохимический анализ использовали, как качественный подход, иммунофлуоресцентный — как количественный.

Иммуногистохимическое окрашивание поперечных срезов скелетных мышц человека и мышей проводили по описанной ранее методике (Veningaet al., 2008). Замороженные срезы (6 мкм) фиксировали (10 мин, 20-25 °С) в охлажденном ацетоне (Aldrich, Германия). Для уменьшения внутренней активности пероксидазы на образцы наносили (30 мин, 22 °С) 0,03 % Н202(Sigma, Германия). Для блокирования неспецифического связывания используемых антител с другими антигенами на срезы ткани наносили (60 мин, 22 °С) 2,5 % сыворотку лошади (ImmPRESS™ Detection system, США).

Для визуализации окраски срезов ткани использовали 3,3-диаминобензидин (ДАБ) (Vector Laboratories, США), являющийся субстратом для пероксидазы. Для окраски ядер клеток использовали гематоксилин согласно стандартной методике (Меркулов, 1969).

Все этапы отмывания ткани осуществляли с помощью фосфатного буфера (PBS) с Са2+ и Mg2+ (РАА Laboratories GmbH, Германия).

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили по стандартной методике (Aust et al., 2006; Steinert et al., 2002). В течение ночи (4 °С) срезы инкубировали с раствором первичных моноклональных мышиных антител. Раствор вторичных антител наносили на 60 минут.

Используемые антитела. Для выделения быстрых и медленных мышечных волокон на срезы наносили (20 ч, 4°С) раствор первичных моноклональных мышиных антител к быстрой (клон WB-MHC fast, 1:40, 17 мкг / мл) и медленной (клон WB-MHC slow, 1:80,25 мкг/мл) формам тяжелой цепи миозина (Vector Laboratories, США). Для визуализации первичных антител наносили (30 мин, 22 °С) вторичные моноклональные антитела, использовали анти-мышиный иммуноглобулин G, коньюгированный с пероксидазой хрена (ImmPRESS™ Detection system, США) (иммуногистохимический подход). Для определения локализации CD97 в быстрых и медленных мышечных волокнах использовали первичные моноклональные мышиные антитела (иммуноглобулин Gl) к стеблевой части -цепи CD97 клона MEM-180 и (V. Horesti, ExBio, Hiss Diagnostics, Чехия) (Hamann et al., 1997) и CLB-CD97 / 3 (3D7) (Kwakkenbos et al., 2002), любезно предоставленные профессором J. Hamman (университет Амстердама, Нидерланды). В качестве вторичных антител использовали моноклональные антитела (Molecular Probes, Германия): Alexa Fluor 546 СуЗ козий анти-мышиный иммуноглобулин G и Alexa Fluor™488 куриный анти-мышиный иммуноглобулин G (иммунофлуоресцентный подход).

Препараты изучали и фотографировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM5 Pascal (Carl Zeiss Jena, Германия). Данные по конфокальной микроскопии обрабатывали с

помощью программного обеспечения AxioVision 4.8, (Carl Zeiss Imaging Systems, Германия).

Для определения критериев фенотипа скелетных мышечных волокон мышей дикого типа и нокаутных по CD97 для всех исследуемых мышечных волокон определяли середину их мышц. Далее в центральной части мышц делали семь последовательных поперечных срезов (6 мкм) мышц tn. soleus и т. extensor digitorum longus на криостате (-20 °С) модель CM1850UV (Leica Microsystems, Австрия). Затем срезы монтировали на предметные стекла. Подсчет гистологических величин (площадь поперечного сечения мышц и мышечных волокон) производили на 1-ом срезе. Для контроля определения данных гистологических величин использовали 7-й срез, подтверждающий неизменность протяженности структуры мышечного волокна на выбранном участке. Срезы № 2 и 3 использовали для определения количества быстрых и медленных волокон каждой мышцы по экспрессии быстрой или медленной форм тяжелой цепи миозина. Срезы № 4, 5, 6 использовали для определения активности ферментов окислительного и гликолитического типов обмена и миофибриллярной АТФазы, соответственно.

Далее срезы окрашивали в соответствии с указанными ниже методами. Полученные препараты анализировали с помощью светового микроскопаMDI3000 (Leica, Германия), оснащенного цветной цифровой видеокамерой DFC 492 (Leica, Германия) и программного обеспечения AxioVision 4.8 (Carl Zeiss Imaging Systems, Германия).

Ферментативная иммуногистохимия. Окрашивание на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и а—глицерофосфатдегидрогеназы ( -ГФДГ) проводили согласно модифицированному тетразолиевому методу по технике Nashlas (Lojda et al., 1976), модифицированному профессором К. Punkt (Punkt et al., 2002). Окрашивание на активность миофибриллярного аденозинтрифосфата (АТФ) проводили согласно стандартному методу (Brooke, Kaiser, 1974).

Регистрация динамики концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток. Выделение одиночных мышечных волокон т. flexor digitorum brevis проводили согласно описанной ранее методике (Shefer, Yablonka-Reuveni, 2004), адаптированной нами для данных экспериментов. Для регистрации изменений концентрации свободного кальция в цитоплазме клеток применяли флуоресцентный ратиометрический кальций чувствительный зонд Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2, AM) (Life Technologies GmbH, Германия). Измерение концентрации ионов кальция проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе ЕХ-71 (Olympus, США), оборудованном камерой TILL IMAGO-QE (TillPhotonics GmbH, Германия). Для обработки полученных снимков использовали программное обеспечение Tillvision v. 4.5 (UllPhotonics GmbH, Германия). Для регистрации изменения баланса ионов кальция в работе использовали вещества, оказывающие влияние на кальциевые каналы саркоплазматического ретикулюма, в следующих

Кроме того, в т. spinalis было обнаружено 81,5 ± 8,6 % 3D7 сильно иммуноположительных медленных волокон и 16,5 ± 8,1% 3D7 сильно иммуноположительных быстрых волокон. Процент 3D7 сильно иммуноположительных волокон промежуточного типа был равен 1,8 ± 0,4 %. В мышцах т. vastus medialis процент 3D7 сильно иммуноположительных медленных волокон был равен 78,0 ± 2,0 %, а процент 3D7 сильно иммуноположительных быстрых волокон составил 22,0 ± 2,0 %. Субпопуляции 3D7 сильно иммуноположительных волокон промежуточного типа в данном случае обнаружено не было (рисунок 1 и 2).

Можно предположить, что более интенсивная экспрессия CD97 в медленных волокнах связана с тем, что в скелетных мышцах существуют разные изоформы данной молекулы (Gray et al., 1996; Hamann et al., 2000). Использованные в работе антитела могут связываться, например, преимущественно с изоформами, характерными для медленных волокон

А

100

50

J±L

О со

а»

100 -I

50 -

медлен, быстр, промежут.

медлен. быстр, промежут.

В

100 п

50 ■

A

медлен. быстр, промежут.

100 п

50 -

п.

медлен. быстр, промежут.

A— m. spinalis; клон антител МЕМ-180, п = 1267; Б — m. vastus medialis; клон антител МЕМ-180, п =415; В — m. spinalis; клон антител 3D7, п = 1267; Г - m. vastus medialis; клон антител 3D7, п = 377. По оси абсцисс: разные типы волокон: быстрые медленные, промежуточные. По оси ординат: процент CD97 сильноиммуноположительных волокон; п — количество проанализированных волокон; * р < 0,05 дано по сравнению с процентом быстрых волокон

Рисунок 1 — Количество CD97 сильно иммуноположительных волокон медленного, быстрого и промежуточного типов в скелетных мышцах человека

Было показано, что анатомические (масса тела и мышц) и гистологические критерии (диаметр мышц и отдельных волокон, соотношение быстрых и медленных волокон) в т. extensor digitorum longus (быстрая мышца) и т. soleus (медленная мышца) у мышей дикого типа и нокаутных по CD97 достоверно не различались (рисунок 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что нокаут гена изучаемого белка не ведет к структурным аномалиям.

А — масса тела (п = 10), Б — масса мышц (п = 10), В — диаметр мышц (п=10), Г — диаметр волокон (п=150), Д — количество быстрых и медленных волокон в m. soleus (n=375), Е — количество быстрых и медленных волокон в m. extensor

digitorum longus (n=375); n — количество волокон Рисунок 3 — Анатомические и гистологические критерии скелетных мышц т. soleus и m. extensor digitorum longus мышей дикого типа и нокаутных по CD97

Результаты исследования показали, что при реакции на кофеин в течение первых 30 с эксперимента объем кальция, выходящего через рианодиновые рецепторы, у мышей нокаутных по CD97 достоверно снижается по сравнению с диким типом. Об этом свидетельствует площадь под кривой на данном временном интервале. Следовательно, у нокаутных мышей замедляется процесс высвобождения кальция через рианодиновые каналы. Период полуспада флуоресценции у мышей дикого типа и нокаутных по CD97 достоверно не различается, что свидетельствует о том, что удаление ионов кальция по средством работы Са-АТФазы из миоплазмы волокон не меняется (рисунок 4).

Са-АТФаза

-дикии тип

-ноксут СС>97

* I I I I 1=4

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 время (С)

=г

о ф

сх о

£ ■е-

15 -10 -5 -

0

60-90 60-100

время от начета эксперимент а (с)

А - динамика изменения флуоресценции кальций чувствительного зонда. По оси абсцисс: время, с. По оси ординат: флуоресценция, условные единицы. Б — площадь под кривой. По оси абсцисс: разные промежутки времени на которых измеряли площадь. По оси ординат: площадь под кривой, условные единицы флуоресценции в секунду. В - время полуспада флуоресценции. По оси абсцисс: время, с. По оси ординат: средние значения времени полуспада. Значком «зеленая стрелка» обозначен временной интервал действия вещества; *р < 0,05 дано по сравнению с диким типом Рисунок 4 — Объем кальция в миоплазме волокон у мышей дикого типа и нокаутных по СБ 97 после воздействия 30 мМ кофеина

В реакции на хлорид калия в фазе роста реакции интенсивности флуоресценции площадь под кривой у мышей исследованных групп достоверно не различалась, следовательно, разницы в динамике высвобождения ионов кальция через рианодиновые рецепторы не наблюдалось. Период полуспада флуоресценции также достоверно не различался, что говорит о неизменности работы Са-АТФазы у исследованных групп мышей при воздействии данного агента (рисунок 5).

Дикий Нокаут

А - иммуноположительные волокна к быстрой форме тяжелой цепи миозина (быстрые волокна); Б —иммуноположительные волокна к медленной форме тяжелой цепи миозина (медленные волокна); В —волокна с разной активностью сукцинатдегидрогеназы; Г — волокна с разной активностью а —глицерофосфатдегидрогеназы. Дикий тип: волокна № 5, 8, 10, 12, 16, 19, 20 - медленный окислительный тип. Волокна 1-4, 6, 7, 9, 11, 13-15, 17, 18 — быстрый тип. Метаболические типы быстрых волокон: 2, 9, 11, 13, 17 = окислительный; 3, 4, 15 = окислительно-гликолитический I; 1, 6, 7, 14, 18 = окислительно-гликолитический II. Нокаут С097: волокна № 2,4,5,11-13, 20 — медленный окислительный. Волокна 1, 3, 6-10, 14-19 — быстрый тип. Метаболические типы быстрых волокон: 1, 3,9, 10, 14, 16 = окислительный; 15, 18, 19 = окислительно-гликолитический I; 6-8, 17= окислительно-

гликолитический II. Рисунок 7 — Биохимический профиль т. 5о1еиз у мышей дикого типа и нокаутных по СТ)91

выводы

1. Количество белка CD97 в т. spinalis (медленная мышца) и т. vastus medialis (быстрая мышца) человека увеличивается в девять раз в медленных волокнах, чем в быстрых.

2. При воздействии кофеина объем ионов кальция, выделившихся в миоплазму т. flexor digitorum brevis (быстрая мышца) из саркоплазматического ретикулюма, у мышей нокаутных по CD97 снижается по сравнению с диким типом, что указывает на возможную функциональную связь CD97 и рианодиновых рецепторов.

3. Динамика спада флуоресценции кальций чувствительного зонда у С097-нокаутных мышей по сравнению с диким типом не различается, что свидетельствует против существования функциональной связи между CD97 и Са-АТФазой.

4. Диаметр мышц и отдельных волокон, количество быстрых и медленных волокон в т. extensor digitorum longus и т. soleus у мышей дикого типа и С097-нокаутных не различались.

5. У СЮ97-нокаутных мышей в т. extensor digitorum longus (быстрая мышца) происходит увеличение активности фермента сукцинатдегидрогеназы. У С097-нокаутных мышей в т. soleus (медленная мышца) сходных изменений не наблюдается, что свидетельствует о сдвиге фенотипа в быстрых мышцах при нокауте CD97 в сторону фенотипа, характерного для медленных мышечных волокон.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, В КОТОРЫХ ОПУБЛИКОВАНЫ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК

1. Зырянова Т.Ю., Марков А. Г. Сравнение характеристик мышечных волокон скелетных мышц мышей линии C57BL/6J и нокаутных по гену CD97// Вестник Санкт-Петербургского университета, сер. 11, вып. 2. -2013. 201-210.

2. Зырянова Т.Ю., Марков А.Г. Экспрессия CD97 в скелетных мышечных волокнах человека// Вестник Санкт-Петербургского университета, сер. 3, вып. 2. - 2012. С. 70-76.

Тезисы конференций

1. Zyryanova T.Y., Sittig D., Schneider R., Adams V., Aust G. CD97 in skeletal muscle//6th International Adhesion-GPCR Workshop Wuerzbure Germany. -2012. С. 33-34.

2. Zyryanova T.Y, Aust G. Localization and expression ofCD97 in human

slow and fast muscle fibers// thesis of international conference «Biological Motility: Fundamental and Applied Science», Pushino. - 2012. C. 269-271.

3. Зырянова Т.Ю. Интенсивность экспрессии CD97 в скелетных мышечных волокнах человека// тезисы 16-й международной Путинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН «Биология - наука XXI века» Пущино. - 2012. С. 416-417.

4. Зырянова Т.Ю. Гистологические и биохимические критерии фенотипа скелетных мышц мышей дикого типа и нокаутных по CD97// тезисы 17-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2013. С. 414-415.

5. Зырянова ТЮ. CD97 в быстрых и медленных волокнах т. spinalis и т. vastus medialis человека// тезисы XI Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике», Сыктывкар. - 2012. С. 88-92.

6. Зырянова Т. Ю. Изучение влияния CD97 на морфофункциональные параметры и количество быстрых и медленных волокон т. soleus у мышей// тезисы всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию профессора A.A. Чумакова «Актуальные вопросы медицинской науки». Ярославль. -2012. 247.

Подписано в печать 11.11.2013. Печать офсетная. Усл. печ. л. 0,85. Формат 60x84 '/16- Тираж 100 экз. Заказ № 60 Отпечатано в типографии СЗИ11 СПГУТД 191180, Санкт-Петербург, пер. Джамбула, я. 13

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зырянова, Татьяна Юрьевна, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «СПбГУ»)

На правах рукописи

0420Н52306

Зырянова Татьяна Юрьевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ БЕЖА СБ97 В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ

03.03.01 - «Физиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Марков Александр Георгиевич

Санкт-Петербург 2013

Содержание

Список сокращений...............................................................................................4

Введение.................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................9

1.1. Фенотип скелетных мышечных волокон.....................................................9

1.2. Влияние различных белковых факторов на фенотип скелетных мышечных волокон...............................................................................................13

1.3. Молекулярное строение и функциональная активность CD97.................19

1.4. Молекулярные механизмы сокращения и расслабления скелетных мышц.......................................................................................................................23

1.5. Изучение молекулярных механизмов регуляции фенотипа скелетных мышечных волокон у млекопитающих, страдающих различными видами миопатий.................................................................................................................30

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................33

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................55

3.1. Локализация и интенсивность экспрессии CD97 в быстрых и медленных волокнах т. spinalis и т. vastus medialis человека........................55

3.1.1. Локализация CD97 в быстрых и медленных волокнах т. spinalis

и т. vastus medialis человека...............................................................................55

3.1.2. Сравнительный анализ интенсивности экспрессии CD97 в

быстрых и медленных волокнах т. spinalis и т. vastus medialis человека.....56

3.2. Динамика концентрации ионов кальция в миоплазме изолированных интактных одиночных поперечнополосатых мышечных волокнах т. flexor digitorum brevis мышей дикого типа и нокаутных по CD97 при воздействии кофеина и хлорида калия.....................63

3.3. Критерии фенотипа скелетных мышечных волокон т. soleus и

т. extensor digitorum longus у мышей дикого и нокаутных по CD97...............84

3.3.1. Анатомические и гистологические критерии скелетных мышц

т. soleus и т. extensor digitorum longus мышей дикого типа и нокаутных по CD97...................................................................................................................84

3.3.2. Распределение волокон в соответствии с активностью ферментов окислительного и гликолитического типов обмена, миофибриллярной аденозинтрифосфатазы в т. soleus и т. extensor digitorum longus у мышей

дикого и нокаутных по CD97...............................................................................85

4. ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................................90

Заключение.............................................................................................................96

Выводы...................................................................................................................98

Список использованных источников...................................................................99

Список сокращений АТФаза - аденозинтрифосфатаза

BAI - рецепторный белок, специфический ингибитор ангиогенеза мозга

CV - коэффициент вариации

DHPR - дигидропиридиновые рецепторы

ETL - латрофилин

Fura-2, AM - ратиометрический кальций чувствительный зонд

ш. EDL - m. extensor digitorum longus

m. FDB - m. flexor digitorum brevis

MG29 - митсугунин 29

МНС — тяжелая цепь миозина

RyR - рианодиновый рецептор

а - ГФДГ - а —глицерофосфатдегидрогеназы

ИФР - инсулиноподобный фактора роста

MEM - среда для поддержания культуры клеток

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

НСТ - нитросиний тетразолий

Са-АТФаза - аденозинтрифосфатаза - кальцевая аденозинтрифосфатаза

СДГ - сукцинатдегрогеназа

CP - саркоплазматический ретикулюм

у.е. - условная единица измерения

ЭПР - эндоплазматический ретикулюм

ЭФР - эпидермальный фактор роста

Введение

Актуальность темы исследования. Изучение механизмов регуляции сокращения и расслабления скелетных мышц является важной и актуальной задачей современной физиологии. Эффективность сокращения скелетных мышц обусловлена в первую очередь сократительной реакцией актомиозинового комплекса, а также фенотипом мышечных волокон, составляющих мышцу. Фенотип мышечных волокон определяется на основе нескольких параметров. Исторически первыми были выделены анатомические и гистологические критерии. Было показано, что скорость сокращения скелетных мышц коррелирует с диаметром отдельных волокон и целой мышцы, а также ее цветом (Ranvier, 1874). Затем для определения фенотипа мышц стали включать другие критерии. Была разработана система классификации мышечных волокон на основе скорости сокращения и развития утомления. Мышечные волокна впервые разделили на быстрые и медленные (Burke et al., 1973). Было установлено, что морфологические и физиологические критерии коррелируют с преобладанием окислительного или гликолитического типов обмена в этих мышцах, определяемых по активности ключевых ферментов этих процессов (Olson, Swett, 1971; Close, 1972).

В настоящее время быстрые и медленные волокна определяют с помощью антител к быстрой и медленной формам тяжелой цепи миозина, а также по степени активности ферментов окислительного и гликолитического типов обмена.

Исследование механизмов, определяющих развитие фенотипа мышечных волокон, остается малоизученной областью. В исследованиях на клеточных линиях поперечнополосатых мышечных волокон показано, что для их специализации необходимо присутствие рецептора к эпидермальному фактору роста (Olwin, Hauschka, 1988). Было установлено, что рецепторы к эпидермальным факторам роста (ЭФР) экспрессируются в нативных мышцах (Aust, 2006; Nechiporuk et al., 2001; Shiratsuchi et al., 1997). В частности, в

скелетных мышцах было установлено наличие белковой молекулы CD97, в состав внеклеточного участка которой входят специфичные ЭФР-подобные домены для связывания с эпидермальными факторами роста (Kwakkenbos et al., 2004; Hona et al., 2008). Было обнаружено, что экспрессия данного белка локализована в мембране саркоплазматического ретикулюма скелетных мышц. Однако вопрос о локализации CD97 в быстрых или медленных волокнах скелетных мышц не изучен. Была показана колокализация данной молекулы с белками на мембране саркоплазматического ретикулюма, вовлеченными в регуляцию внутриклеточной кальциевой динамики, а именно, с рианодиновыми рецепторами и Са-АТФазой-2 (Schneider et al., 2007). В скелетных мышечных волокнах CD97-HOKayTHbix мышей было обнаружено увеличение объема цистерн саркоплазматического ретикулюма (Schneider et al., 2007).

Таким образом, полученные ранее данные позволили сформулировать рабочую гипотезу о том, что белок CD97, располагаясь на мембране саркоплазматического ретикулюма, вероятно, участвует в регуляции активности работы кальциевых каналов, следовательно, регуляции кальциевой динамики.

Целью данного исследования являлось изучение локализации и функциональной роли белка CD97 в скелетных мышцах. Задачи исследования:

1. Изучить локализацию и интенсивность экспрессии CD97 в быстрых и медленных волокнах человека т. spinalis и т. vastus medialis.

2. Определить динамику изменения концентрации ионов кальция на изолированных одиночных мышечных волокнах мышцы т. flexor digitorum brevis мышей дикого типа и нокаутных по CD97 при воздействии кофеина и хлорида калия.

3. Сравнить анатомические, гистологические, биохимические критерии фенотипа волокон скелетных мышц т. soleus и т. extensor digitorum longus мышей дикого типа и нокаутных по CD97.

Научная новизна. Впервые на основе гистологических, биохимических и физиологических методов проведено комплексное исследование фенотипа волокон и кальциевой динамики в скелетных мышцах С097-нокаутных мышей. Впервые установлено, что CD97 экспрессируется интенсивнее в медленных волокнах человека т. spinalis и т. vastus medialis. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у мышей нокаутных по CD97 происходит снижение объема кальция, высвобождающегося через рианодиновые рецепторы, при воздействии кофеина. Впервые показано, что у нокаутных по CD97 мышей возрастает активность сукцинатдегидрогеназы, маркера окислительного обмена.

Научная и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены данные, которые позволяют расширить теоретическое представление о функциональной роли рецепторов эпидермальных факторов роста, к которым относится CD97, в регуляции сокращения и расслабления мышц, а также фенотипа волокон составляющих скелетные мышцы. Данная работа имеет значение для области мышечной физиологии. Результаты диссертации используются в курсах лекций «Общая физиология», читаемых для студентов второго курса обучения на кафедре общей физиологии биолого-почвенного факультета ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Область практического применения результатов данного исследования связана с растущим числом заболеваний, в основе которых лежит нарушение механизмов регуляции фенотипа скелетных мышечных волокон. Полученные данные могут служить теоретическим подходом в разработке стратегии лечения больных с различными видами миопатий.

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Белковая молекула CD97 представлена в быстрых и медленных мышечных волокнах человека разных скелетных мышц. CD97 преимущественно локализована в медленных мышечных волокнах.

2. Белок CD97 включен в процесс кальциевого сигналинга при активации рианодиновых рецепторов саркоплазматического ретикулюма скелетных мышечных волокон мышей.

3. Поддержание метаболического профиля скелетных мышечных волокон у мышей связано с наличием белковой молекулы CD97.

Апробация и реализация результатов исследования. Результаты исследования доложены и обсуждены на 6-й международной конференции, посвященной адгезионному классу рецепторов, сопряженных с G-белками (Вюрцбург, Германия, 2012); на 16-й и 17-й международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012-2013); на международной конференции, посвященной фундаментальным и прикладным аспектам миофизиологии (Пущино, 2012); на XI Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012), на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию профессора A.A. Чумакова «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, и шесть тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 150 источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками.

Работа поддержана персональными грантами: международным грантом научно-исследовательских стипендий для аспирантов и молодых ученых немецкой службы академических обменов (DAAD) А / 10/76169; грантом для студентов, аспирантов и молодых ученых вузов Санкт-Петербурга (2.6 /2606 / 24А); медицинским факультетом Университета Лейпцига (Германия).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фенотип скелетных мышечных волокон

Эффективность сокращения скелетных мышц обусловлена в первую очередь сократительной реакцией актомиозинового комплекса и фенотипом мышечных волокон, составляющих мышцу (Ноздрачев, 2011). Данная проблема также связана с фундаментальными аспектами изучения нервно-мышечных механизмов (Орбели, 1949; Сеченов, 1952; Введенский, 1953; Введенский, 1956). В понятие фенотипа мышечных волокон входит несколько критериев.

Исторически первыми были выделены анатомические и гистологические критерии. Авторы впервые предположили, что цвет всей мышцы и отдельные гистологические характеристики мышечных волокон сопоставимы со скоростью и силой сокращения скелетных мышц (Ranvier, 1874). Было показано, что морфологические и гистохимические характеристики отдельных мышечных волокон совпадают с физиологическими свойствами этих же волокон (Olson, Swett, 1971; Close, 1972). Одной из работ, изучающих морфологические критерии, явилось исследование поднижнечелюстной мышцы десяти различных видов амфибий. Были изучены следующие параметры: диаметр отдельных мышечных волокон, количество митохондрий, организация саркомера (морфология Z- и М-линий) в данных волокнах. На основании полученных данных авторы выявили четыре типа скелетных мышечных волокон, которые были сопоставимы с изученными позднее физиологическими типами волокон. Также авторы обнаружили корреляцию между количеством определенного типа волокон и массой тела. Было показано, что волокна определенного типа имеют зональность расположения (Kordylewski, 1979). Ряд авторов изучили сократительную способность, морфологические и гистохимические параметры скелетных мышц лягушки (Lannergren, Smith, 1966). После амфибий ученые стали исследовать данные критерии на млекопитающих. Так был проведен ряд экспериментов по

изучению характеристик фазических сокращений и утомления т. tibialis anterior крысы. Используя метод продолжительной ритмической электростимуляции, авторы идентифицировали мотонейрон, называемый двигательной единицей (Burke, 1967), который иннервирует мышечные волокна. Более того, авторы показали корреляцию между относительной устойчивостью к утомлению и активностью ферментов окислительного обмена одних и тех же мышечных волокон (Edstroem, Kugelberg, 1968). Данная работа явилась связующим звеном между физиологическими и биохимическими критериями фенотипа скелетных мышечных волокон.

Затем понятие фенотипа стало расширяться. Была разработана система классификации мышечных волокон. На основании скорости и времени сокращения мышечные волокна впервые разделили на быстрые и медленные. В зависимости от развития утомления быстрые волокна, в свою очередь, были подразделены на два подтипа: быстро утомляемые и устойчивые к утомлению. Была изучена активность сукцинатдегидрогеназы, маркера окислительного обмена, никотинамиддинуклеотиддегидрогеназы, акцептора оксидоредуктазы, миофибриллярной аденозинтрифосфатазы, показателя сократительной активности, мышечных волокон т. gastrocnemius кошки. В результате, авторы подтвердили, что биохимические критерии отдельных мышечных волокон также коррелируют с физиологическими характеристиками скелетных мышц (Burke et al., 1973, Kordylewski, 1979).

Среди работ, изучающих физиологическими характеристиками скелетных мышечных волокон, стоит отметить исследование, основанное на изучении взаимоотношения внутриклеточной концентрации ионов кальция и силы мышечного сокращения в ответ на деполяризацию плазматической мембраны или влияние кофеина одиночных мышечных волокон т. ilioßbularis лягушки т. extensor digitorum longus крысы. Было показано, что при обоих способах воздействия, эндогенный уровень ионов кальция снижается в быстрых и медленных типах мышечных волокнах. Данный факт свидетельствует о том, что основная часть ионов кальция запасается во внутриклеточной структуре -

саркоплазматическом ретикулюме. Следовательно, при деполяризации наружной мембраны, максимальная сила мышечного сокращения волокон т. iliofibularis и т. extensor digitorum longus снижается (Owen et al., 1997). Данная работа является одной из ключевых, так как показывает взаимосвязь внутриклеточных молекулярных механизмов регуляции баланса ионов кальция и мышечного сокращения. На сегодняшний момент такой подход широко используется в литературе (Louch et al., 2012).

В настоящее время определение фенотипа скелетных мышечных волокон включает в себя разделение волокон на быстрые и медленные с помощью антител к быстрой и медленной формам тяжелой цепи миозина, определение их метаболического на основе активности ферментов окислительного и гликолитического обменов, миофибриллярной аденозинтрифосфатазы, соответственно (Punkt, 2002; Punkt et al, 2005; Punkt et al., 2011). В основе физиологического критерия фенотипа мышечных волокон лежит определение динамики изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция в ответ на воздействие активаторами или блокаторами кальциевых каналов саркоплазматического ретикулюма (Liu et al., 1997; Zhao et al., 2010; Tjondrokoesoemo et al., 2011; Blaauw et al., 2012).

Необходимо подчеркнуть, что взаимосвязь критериев фенотипа была показана авторами не только на протяжении исторического становления данного факта, но и подтверждается современными исследователями (Berlov et al., 2007). Например, в одной из работ было показано, что физическая нагрузка оказывает влияние на уровень экспрессии белков, вовлеченных в регуляцию внутриклеточного баланса ионов кальция, а также активность миофибриллярной АТФазы, цитрат-синтазы и окисленного глутатиона. В частности, авторы обнаружили, что физическая нагрузка у мышей приводит к увеличению активности цитрат-синтазы, окисленн�