Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие С- и F-белков с сократительными нитями скелетных мышц

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие С- и F-белков с сократительными нитями скелетных мышц"

ПI ъ од

На правах рукописи УДК 577.323.2:591.473

УДАЛЬЦОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С- И Р-БЕЛКОВ С СОКРАТИТЕЛЬНЫМИ НИТЯМИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1995

с

и

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции мышечных белков Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

З.А. ПОДЛУБНАЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Э.А. БУРШТЕЙН

доктор биологических наук, профессор Н.Б. ГУСЕВ

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится "4" Мюи*} 1995 г. в -/¿час. на заседании Диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г. Пущино, Московская обл., ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук /1/1 Л П.А. НЕЛИПОВИЧ

/ Г^мШ-Счис

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Центральными проблемами мышечного сокращения являются выяснение молекулярных основ механизма генерации силы, проблема регуляции актин-миозинового взаимодействия и проблема энергообеспечения работающей мышцы. Для решения этих проблем необходимы детальные сведения о сократительных нитях и составляющих их белках.

В 70-ые годы в толстых нитях скелетных мышц был открыт ряд белковых компонентов немиозиновой природы, получивших общее название минорных белков. Изучение минорных белков является весьма актуально для выяснения структуры и функциональной роли толстой нити, однако до настоящего времени для ряда из них остаются неизвестными физико-химические свойства, способ локализации в нити и функциональное значение. Помимо теоретической значимости изучение минорных белков важно и с практической точки зрения, в частности, для выяснения молекулярной природы некоторых наследственных и приобретенных миопатий, их диагностики и лечения.

Цели и задачи исследования. Данная работа посвящена изучению взаимодействия с сократительными нитями двух миофибриллярных минорных белков скелетных мышц кролика - С-белка и F-белка (фосфофруктокиназы -ФФК) - с использованием методов препаративной и аналитической биохимии, а также электронной микроскопии (ЭМ) и оптической дифракции (ОД). Ставились следующие конкретные задачи:

1) ЭМ-исследование взаимодействия С- белка с Ф-актином, реконструированными тонкими нитями (РТН) и "Z-щетками" в зависимости от уровня С а".

2) изучение влияния С-белка на АТФазную активность реконструированного актомиозина (РАМ) при различных условиях.

3) ЭМ-исследование участия С-белка в регуляции движения миозиновых мостиков.

4) ЭМ-исследование взаимодействия F-белка с миозином и его фрагментами.

5) ЭМ-исследование взаимодействия F белка с Ф-актином и РТН.

6) изучение влияния ряда физиологически важных факторов на количественные параметры взаимодействия F-белка с миозином и Ф-актином in vitro.

Научная новизна и практическая ценность. Проведенные исследования расширяют представления о функциональной роли сократительных нитей и их отдельных белков в сокращении скелетных мышц: в механизмах генерации силы, регуляции сократительной активности и в сопряжении сократительной и энергообеспечивающей систем и открывают перспективы для дальнейших исследований.

Впервые обнаружена Саг+-чувствительность актин-активируемой АТФазной активности миозина скелетных мышц в отсутствие ТМ-ТН-комплекса и корреляция этого свойства с Саг+-зависимым движением миозиновых мостиков на поверхности миозиновых нитей. Показано влияние С-белка на АТФазу и Саг*-чувствительность РАМ и на подвижность мостиков. Влияние С-белка на АТФазу РАМ зависит от уровня Сан и фосфорилирования ЛЦ, миозина. Установлена способность С-белка связываться с актином, РТН и с изолированными 1-дисками Са^-зависимым образом. Полученные результаты свидетельствуют о возможном существовании в скелетных мышцах механизма контроля миозинового типа и об участии ЛЦ, миозина и С-белка в этом механизме.

Показана способность Р-белка связываться с миозиновыми и акти-новыми нитями. Установлена локализация участков связывания Р-белка на субфрагменте-2 миозина. Определены параметры этого связывания при изменении физиологически важных факторов - рН и уровня Са2*. Увеличение концентрации Са* (рСа8-»рСа4) и понижение рН (7.5—>6.5) приводит к увеличению степени связывания Р-белка. Предположено, что состояния мышцы, характеризующиеся повышением рСа и понижением рН, могут приводить к увеличению количества ФФК, связанной с сократительными нитями и что толстые нити наряду с тонкими нитями могут играть важную роль в компартментализации ферментов, обеспечивая тем самым синхронность запуска сократительной и энергетических систем, а также выполняя функцию регулятора некоторых процессов энергетического метаболизма и, в частности, гликолиза. Данные, полученные при изучении ключевого фермента гликолиза -ФФК - могут представлять интерес при изучении метаболизма скелетных и сердечных мышц в норме и при патологии.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); 8-ой и 9-ой Всесоюзных конференциях по биофизике и биохимии мышечного сокращения (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990); 2-ом Международном симпозиуме "Механизмы мышечного сокращения" (Бухарест, Румыния, 1989); Международной конференции стран СЭВ и СФРЮ по молекулярным механизмам и энергетике подвижности (София, Болгария, 1989); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); 19-ом Конгрессе ФЕБО (Рим, Италия, 1989); Международной НАТО/ФЕБО школе "Клеточная регуляция посредствен фосфорилирования белка" (Ла Лонд, Франция, 1990); 10-ом Международном биофизическом съезде (Ванкувер, Канада, 1990); 20-ой, 21-ой, 22-ой и 23-ей Европейских мышечных конференциях (Оксфорд, Великобритания, 1991; Билефельд, Германия, 1992; Гватт, Швейцария, 1993; Бохум, Германия, 1994); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на {41 страницах, включает рисунков и ^таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Взаимодействие С-белка с Ф-актином, РТН и "Z-щетками".

На основании данных о высоком сродстве С-белка к миозину (К» 10* М') и о локализации С-белка в мышце, полученных с помощью иммунной ЭМ, был сделан вывод, что в скелетных мышцах позвоночных С-белок связан со стволами толстых нитей и может играть структурную роль, состоящую в стабилизации толстых нитей и/или решетки толстых нитей в А-диске, а также участвовать в регуляции взаимодействия миозиновых мостиков с актином. Это подтверждают следующие факты: связывание С-белка ш vitro с субфрагментом-2 миозина, являющимся частью поперечного мостика, и легким меромиозином; влияние С-белка на АТФазу AM и акто-С1; отсутствие

его влияния на АТФазу миозина. Эти данные интерпретируются как результат модифицирующего действия С-белка на работу миозиновых мостиков при локализации его на субфрагменте-2 и/или как следствие его связывания с актином. Было показано биохимически /Moos et al., 1978/, что С-белок in vitro связывается с чистым актином со сродством примерно на порядок слабее его сродства к миозину. Мы провели ЭМ-исследование взаимодействия С-белка с Ф-актином, а также с РТН и с нативными нитями в составе "Z-щеток" (изолированных 1-дисков).

На микрофотографиях комплекс С-белка с Ф-актином в отличие от одиночных нитей чистого Ф-актина имеет вид пучков, состоящих из параллельно расположенных актиновых нитей. В отличие от более ранних данных мы обнаружили связывание С-белка с актином при ионной силе, близкой к физиологической (0.1 М KCl) и даже при ц=0.5. Вид пучков при этом не меняется, но с ростом ц уменьшается их количество. При взаимодействии с РТН С-белок образует такие же пучки, как и с Ф-актином, но прослеживается Са"-зависимость его связывания: при рСа 4 размеры и количество пучков больше, чем при рСа 8. Позднее эти данные были подтверждены в работе /Yamamoto , 1986/.

При обработке суспензии "Z-щеток" раствором С-белка непосредственно на электронно-микроскопической сеточке с последующей ее обработкой антителами к С-белку, в "Z-щетках"' наблюдается усиление интенсивности поперечных периодических полос, расположенных на расстоянии «38нм, что говорит о периодическом связывании С-белка.

Таким образом, наши эксперименты свидетельствуют о том, что С-белок способен связываться с Ф-актином, РТН и "Z-щетками". Связывание с РТН регулируется Ca2* в том же диапазоне концентраций свободного Ca", в котором регулируется АТФазная активность AM в мышце. Не исключено, что такое связывание может иметь функциональное значение, реализуясь в процессе сократительного акта. Хотя в мышце С-белок локализован на толстых нитях, размеры его гибкой молекулы достаточны, чтобы перекрыть расстояние между толстыми и тонкими нитями.

2. Влияние С-белка на АТФазную активность реконструированного АМ.

К началу наших исследований отсутствовали методы избирательной экстракции С-белка из скелетной мышцы, не нарушающие структуру толстых нитей, поэтому для решения вопроса о возможном участии С-белка в регуляции актин-миозинового взаимодействия in vivo мы исследовали его влияние на РАМ. Несомненно, что РАМ - это упрощенная модель сократительного аппарата мышцы, однако она помогает оценить вклад разных белков в функционирование сократительных нитей. Учитывая близость локализации С-белка и ЛЦ,-цепей в районе поперечного мостика, можно было предположить возможность их согласованного действия на АТФазу АМ и/или на движение мостика. (В понятие "мостик" включаются субфрагмент-1 и субфрагмент-2 миозина). В литературе имелся ряд данных о модулирующем действии С-белка и ЛЦ,-цепей на актин-мнозиновое взаимодействие, но они были противоречивы и несравнимы между собой из-за различия условий экспрнмента, что не позволяло сделать окончательный вывод об эффектах С-белка и ЛЦ, на АТФазу АМ. Мы изучили влияние С-белка на АТФазу РАМ в зависимости от р, рСа и состояния ЛЦг. Использованы миозины: Мю (исходный, содержащий около 5% С-белка), М,„ (очищенный на колонке с DEAE-сефадексом А-50 и не содержащий С-белка) и МДГ№ (колоночный миозин, лишенный примерно 50% ЛЦ,).

На рис. 1 показана зависимость АТФазы АМ^ и АМ^ от р при разных уровнях Сан. Видно, что АТФазная активность обеих систем зависит от ц с максимумом при р=0.1. Низкий уровень АТФазы при p¿0.12 обусловлен, вероятно, начинающейся диссоциацией АМ. Изменение концентрации свободного Ca2t в системе (рСа 4 и рСа 8) не влияет на форму кривой зависимости АТФазы АМ_х и АМ„, от ионной силы, однако уровень АТФазы при рСа 4 выше, чем при рСа 8. Таким образом, впервые показано, что, несмотря на отсутствие в системе белков ТМ-ТН-комплекса, АТФаза АМ в этих условиях проявляет Са"-чувствительность во всем диапазоне изученных ион-ных сил. Присутствие небольшого количества С-белка в АМ^ (5%, или 0.17 моля/моль миозина) не влияет на проявление Са!+-чувствительности,

однако добавление эквимолярных количеств С-белка к М^, приводит к исчезновению Са^-чувствитель-ности ДМ-системы.

АТФаза АМ^ ниже, чем АМШ1, из чего можно сделать вывод, что даже небольшое количество С-белка, присутствующее в исходных препаратах миозина, оказывает выраженное ингиби-рующее действие на АТФазу АМ, не влияя при этом на характер ее зависимости от ионной силы. При

добавлении С-белка к в молярном отношении 1:1 (рис. 2) возрастает его ингибирующее действие на АТФазу при ц<0.12 и меняется характер чувствительности системы к изменению ионной силы: максимум при ц=0.1 исчезает, уровень АТФазы остается почти постоянным во всем диапазоне использованных ионных сил.

100 —0—АМюл

/ \ —□—АМол

ю га 011 1 \ —Д—АМсх

0

0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 Ионная сила

Рис. 1. Влияние ионной силы на

АТФазную активность АМ^ и АМто

юо —О—АМюл —□—АМсол + с

АТФаза, % 1л О —Д—АМ(0Т№) .—X—АНОТНВ) +с

и-

аое над о.1 а 12 а 14

Иожая сила

Рис. 2. Влияние ионной силы на

АТФазную активность АМ о. "АМдпв

при добавлении С-белка в

эквимолярном отношении.

Следует отметить, что при ц^О.12 в присутствии С-белка уровень АТФазы оказывается выше, чем в его отсутствие, что говорит об активирующем действии С-белка в этих условиях.

АМДТ1)6 имеет значительно более низкий общий уровень АТФазы (рис. 2), что соответствует литературным данным о сильном влиянии ЛЦ, на взаимодействие миозина и актина. Характер зависимости АТФазы Мд максимум при (1=0.1 и в целом уровень АТФазы монотонно понижается по

от ионнои силы изменяется: исчезает

мере возрастания ионной силы. Система АМДГН6 не чувствительна к уровню Са!+ в исследуемом диапазоне. Добавление к МД1Н6 С-белка в молярном отношении 1:1 не меняет характер зависимости АТФазы от ионной силы и уровня Caw, но слегка повышает ее.

Мы исследовали влияние С-белка на АТФазу AM, реконструированного из миозина с полностью дефосфорилированными или фосфорилиро-ванными ЛЦг (М^ и М^, соответственно). Оказалось, что в обеих системах при р.=0.0б С-белок ингибирует АТФазу, причем ингибирующий эффект возрастает с количеством добавленного С-белка, что коррелирует с нашими предыдущими данными и результатами других авторов Степень ингиби-рования почти не зависит от уровня Саг+, но более высока в случае М^.

На рис. 3 показана зависимость АТФазы РАМ от добавленного С-белка при ц=0.12, близкой к физиологической. При рСа4 С-белок существенно активирует АТФазу АМ^, тогда как при рСа8 проявляется его незначительный ингибирующий эффект. В случае М^ существенных эффектов С-белка не обнаружено. Таким образом, впервые показана зависимость эффектов С-белка от уровня Саг+ и фосфорилирования. Обнаружено, что при фосфорилировании ЛЦг, как и при их удалении, ингибирующее влияние С-белка уменьшалось, а активирующее исчезало совсем, что свидетельствует о взаимосвязи в действии С-белка и ЛЦ,-цепей на АТФазную активность AM in vitro. Можно допустить, что в мышце С-белок и ЛЦ2-цепи также действуют согласованно.

Ингибирующие эффекты С-белка при низких р. можно объяснить действием на миозиновые мостики. Присутствие С-белка в районе мостиков, вероятно, вызывает изменения в их структуре и/или заряде, приводящие мостики в "заторможенное" состояние. Увеличение количества С-белка ведет к увеличению числа таких "медленно"

в 5

80

30

—0—Р&4 —Р—7рСа8

0 Q5 1

С-бепси, f-уМжшжа

Рис. 3. Влияние С-белка на АТФазную активность АМ^,, при ц=0.12 и разных уровнях Са3*

работающих мостиков, что приводит к ингибированию общей АТФазной активности. Активирующий эффект С-белка при ц^О.12 можно объяснить его "стабилизирующим" действием либо за счет "медленно" работающих мостиков, способствующих удерживанию актиновых нитей рядом с миозиновыми, либо за счет образования молекулами С-белка прямых связей между миозином и актином. Это может повышать устойчивость AM к диссоциирующему влиянию возрастающей ji.

В мышце, в отличие от in vitro системы, положение сократительных нитей фиксировано, и активирующий эффект С-белка, обусловленный in vitro увеличением числа контактов между миозиновыми головками и актиновыми субъединицами, может не проявляться, а реализуется ингибирующее влияние С-белка на мостики, и, значит, на актин-миозиновое взаимодействие. Однако нельзя исключить и возможность образования в определенных условиях "С-белковых мостиков" между сократительными нитями, что может оказаться важным фактором при активации актин-миозинового взаимодействия, если учесть Са"-зависимость связывания С-белка с актин-содержащими нитями. В этой связи интересны наши данные о Са!+-зависимом активирующем эффекте С-белка на АТФазу АМ^ и отсутствии таких эффектов в АМ^, что говорит, с одной стороны, о возможности согласованного функционирования в мышце ЛЦг миозина, способных связывать Ca2f, и С-белка, не обладающего такой способностью, а с другой стороны, о возможности проявления в мышце Са,+-зависимого активирующего влияния С-белка. Для окончательного ответа на вопрос о том, какой из наблюдаемых in vitro эффектов С-белка реализуется в мышце, необходимы дальнейшие эксперименты. 3. Влияние С-белка на движение миозиновых мостиков.

На основании биохимических данных мы высказали предположение, что присутствие С-белка на стволе миозиновых нитей может переводить мостики в "заторможенное' состояние, уменьшая их подвижность, и попытались проверить это прямыми ЭМ-наблюдениями за поведением мостиков в присутствии и отсутствие С-белка в зависимости от рСа в среде и степени фосфорилирования ЛЦ, миозина. Искалась возможная корреляция между обнаруженной Са2+-чувствительностью АТФазы РАМ в отсутствие ТМ-

ТН-комплекса и поведением мостиков на поверхности миозиновых нитей в зависимости от Са^. Оказалось, что при рСа8 и рН 7.0 филаменты, сформированные диализом из М^, имеют упорядоченное расположение головок на их поверхности с отчетливо видимым осевым периодом 14.3нм, соответствующим распределению ярусов мостиков вдоль нитей. Длина "выступов" (головок) - 15-20нм. Эта "компактная" структура, возникающая в результате регулярного расположения мостиков, прижатых к стволу миозиновой нити, типична для толстых нитей в состоянии покоя.

При рСа 4 в нитях, сформированных из М^, поперечные мостики обычно имеют неупорядоченную ориентацию, вероятно, вследствие их слабого взаимодействия со стволом нити. В таких нитях осевая периодичность 14.3нм наблюдается редко, а мостики могут отходить от ствола нити на расстояние до 50нм, что свидетельствует об отходе не только головки, но и С2 миозина. Такую структуру реконструированных нитей можно отождествить с "активированным" состоянием толстых нитей. Заметим, что препараты миозина, проявляющие Са^-чувствительность АТФазы РАМ, обнаруживали и Са2+-зависимое поведение мостиков. Таким образом, впервые выявлена корреляция ме>вду проявлением Са^-чувствительности АТФазы РАМ и Са?+-зависимой подвижностью мостиков на поверхности миозиновых нитей. Эксперименты указывают на то, что Са"-чувствительность является свойством самого миозина и не связана с присутствием других белков.

Нити из М^ имеют компактную структуру с выраженной осевой периодичностью 14.3 нм и при рСа 8, и при рСа 4, что коррелирует с нашими биохимическими данными и результатами других авторов, свидетельствующими об иигибнрующем влиянии фосфорилирования ЛЦ, на сродство ЛЦ2 к С а" in vitro и на скорость гидролиза АТФ в мышце.

Присутствие С-белка в нитях из М^ (молярное отношение 1:3) ведет к исчезновению Са!+-зависимости расположения мостиков. И при рСа8, и при рСа4 отчетливо видна осевая периодичность 14.3нм, т.е. С-белок удерживает мостики у ствола нити, ограничивая свободу их движения, даже в присутствии Са1*. Фосфорилирование ЛЦ2 не вносит видимых изменений в структурное поведение мостиков, поскольку и в отсутствие С-белка нити из М^ уже не

обнаруживают Сан-зависимости расположения мостиков. На первый взгляд, Са^-независимое структурное поведение мостиков в присутствии С-белка противоречит Са"-зависимому влиянию С-белка на АТФазу АМ^. Однако можно допустить, что присутствие актина при измерении АТФазной активности и способность С-белка к Са!+-зависимому связыванию с актином будут в присутствии Са* снимать ингибирование, производимое С-белком. Происходят ли подобные процессы в мышце, покажут дальнейшие исследования. 4. Взаинодействие Р-белка (фосфофруктокиназы) с миозином.

Р-белок был обнаружен в неочищенных препаратах миозина. К началу наших исследований вопрос о принадлежности этого белка к толстым нитям не был решен. Мы исследовали связывание Р-белка с миозином и его протеолитическими фрагментами (ЛММ и стержневой частью миозиновой молекулы) с помощью ЭМ и ОД. Обнаружено, что Р-белок не связывается с паракристаллами ЛММ, но связывается с реконструированными миозиновы-ми нитями и агрегатами стержневых частей. Высказано предположение, что участки связывания Р-белка расположены в области субфрагмента-2 миозина. ЭМ-нсследовакне показало, что период 14.3нм, едва различимый в миозиновых нитях и невидимый в агрегатах стержневых частей, становится четко выраженным при связывании с ними Р-белка. На картинах ОД в присутствии Р-белка увеличивается интенсивность меридионального рефлекса 14.3нм, но нет заметных различий в наборе меридиональных рефлексов. Р-белок не изменяет структуру агрегатов миозина и стержневых частей миозина, а лишь декорирует их с поверхности с периодом, обусловленным их внутренней организацией. Результаты свидетельствуют в пользу локализации Р-белка на толстых нитях в мышце, что подтвердилось прямыми ЭМ-наблюдениями на миофибриллах с использованием антител к Р-белку ДгвусПпа е1 а1., 1986/

К настоящему времени Р-белок идентифицирован как ключевой фермент гликолиза - ФФК. Долгое время ферменты гликолиза считались растворимыми, "цитоплазматическими" белками. Данные последних лет свидетельствуют об их двойственной природе: показано, что в мышечной клетке они могут существовать в двух формах - растворенной и связанной с

I >

субклеточными структурами. Вероятно, F-белок представляет собой фракцию ФФК, связанную с толстыми нитями в мышце. Локализация ФФК вблизи АТФазы миозина, а также вблизи других ферментов (креатинкиназы, АМФ-дезаминазы), субстраты и продукты реакций которых регулируют ее активность, может обеспечивает большую чувствительность ФФК к состоянию АТФ-потребляющей и АТФ-производящих систем. 5. Взаимодействие F-белка с Ф-актином и РТН.

Поскольку традиционно считалось, что ФФК в мышце локализована в районе I-диска, мы провели исследование in vitro связывания F-белка с Ф-актином и РТН. Оказалось, что F-белок способен связываться с чистым актином и с РТН с образованием упорядоченных пучков. При малых добавках F-белка видно регулярное (с периодом 36-38 нм) его распределение меледу актиновыми нитями в пучках в виде узких поперечных мостиков с размерами ?-10нмх4-6нм, соответствующими димерам (или тетрамерам) ФФК. При повышении концентрации F-белка до эквимолярной и выше наблюдаются два типа комплексных структур. Первый характеризуется наличием в пучках широких мостичных структур (~20-30нм), расположенных регулярно с интервалами 3б-38нм и состоящих из нескольких рядов узких поперечных мостиков шириной 4-7нм. Второй представляет собой жесткие пучки, в которых можно отметить косую исчерченность с периодом «7нм вдоль всей длины нитей. Картины ОД, полученные от пучков ФА и РТН в присутствии F-белка, подтверждают данные ЭМ, свидетельствуя о регулярном с интерва-лом 36-38 нм распределении F-белковых мостиков вдоль актиновых нитей. Нет разницы меяеду комплексными структурами F-белок-Ф-актин и F-белок-РТН. Однако в случае РТН для образования структур с периодическим распределением в них F-белка требуются более высокие его концентрации, чем для чистого Ф-актина. Полученные нами данные были позднее подтверждены в работе / Roberts & Somero, 1989/.

Методом седиментации мы определили количественные параметры связывания F-белка с актином, необходимые для оценки возможности реализации этого связывания в мышце. Рассчитанная величина константы связывания равна (7.3±1.0)-10! М"', что сопоставимо с определенной в тех же

условиях константой связывания F-белка с миозином (5.0-105 и 2.6-10s М'1 для М. и соответственно /Freydi-па et al., 1986/). Число участков связывания F-белка на актине в расче-те на мономер ФФК составило «0.43.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение о возможности связывания ФФК как с толстыми, так и с тонкими нитями in vivo. В мышце на связывание ФФК с сократительными нитями могут влиять многие физиологически важные факторы: рН, Са*, эффекторы ФФК, ее фосфорилирование, присутствие других ферментов и т.п. В связи с этим мы изучили влияние на связывание F-белка с миозином и актином таких факторов, как величина рН и уровень Са'+. 6. Влияние рН и уровня Са~ на связывание F-белка с актин-и миозин-сод ержащи ми нитями.

Нами показано, что F-белок способен связываться in vitro и с миозиновыми и с актиновыми нитями с достаточно высоким сродством, (КиЮМО' М1). рН в изученном диапазоне почти не влияет на константу связывания, но существенно меняет число мест связывания F-белка на актине и миозине (рис. 4). У миозина число мест связывания увеличивается примерно в 4 раза при изменении рН от 7.5 до 7.0 и при дальнейшем закислении до рН 6.5 практически не меняется. У актина, напротив, число мест связывания не меняется в интервале рН 7.5-7.0, но увеличивается вдвое при снижении рН до 6.5.

Влияние уровня Caí+ на связывание F-белка изучалось при двух его значениях, условно соответствующих двум состояниям мышцьг. сокращению (рСа4) и расслаблению (рСа8). Оказалось, что при переходе от рСа8 до рСа4

О рН

F, mkM

Рис. 4. Кривые связывания F-белка с актином (А) и миози-ном(Б) при различных рН.

число мест связывания F-белка на актине увеличивается в 2 раза, а на миозине - в 1.3 раза. Константа связывания при этом почти не меняется.

Результаты показывают, что количество связанного F-белка зависит от таких физиологически важных факторов, как рН и уровень Са". Возможно, что увеличение уровня Са!+ и снижение рН в цитоплазме при сокращении мышцы должно также способ-ствовать увеличению количества связанной ФФК. Известно, что состояния мышечной клетки, характеризующиеся снижением рН (ншемия, аноксия), приводят к обратимому увеличению количества связанной ФФК /Choate et al., 1985; Clarke et al., 1985/. Эти эффекты традиционно объяснялись обратимым связыванием ФФК с тонкими нитями. Наши данные свидетельствуют о том, что связывание ФФК с толстыми нитями также может реализоваться в мышце. Однако вопрос о преимущественности связывания ФФК с толстыми или тонкими нитями /л vivo, как и вопрос о физиологическом значении обратимого связывания других ферментов гликолиза требует более детального изучения.

К настоящему времени получены достаточно убедительные доказательства того, что ФФК (как и ряд других ферментов) присутствует в мышце в свободной и связанной формах, равновесие между которыми зависит от функционального состояния мышечной клетки. Высказано предположение, что изменение соотношения между свободной и связанной формами ферментов при изменении состояния мышцы может осуществляться под действием Сан, рН, субстратов, продуктов, эффекторов, а также фосфорилирования фермента и биологической подложки /Clarke et al., 1985; Подлубная, 1992/. Факты обратимого связывания ферментов с субклеточными структурами вместе с данными об изменении каталитических свойств ферментов при связывании легли в основу гипотезы об участии обратимой адсорбции ферментов в регуляции некоторых метаболических процессов in vivo /Wilson, 1978/. Каков реальный вклад обратимой адсорбции ферментов в регуляцию их активности в клетке, а также в сопряженное функционирование исполнительной и энергетических систем, помогут понять дальнейшие исследования. Помимо общих, широко обсуждаемых в литературе преимуществ адсорбции ферментов на субклеточных структурах, для ФФК

такой способ компартментализации в определенных клеточных ситуациях является очень важным. Например, состояния ишемии, аноксии и т.п. сопровождаются значительным понижением рН в мышечной клетке. Это может приводить к инактивации ФФК, ключевого фермента, регулирующего скорость и соотношение гликолиза и глюконеогенеза, за счет диссоциации активных тет-рамеров ФФК при понижении рН до неактивных димеров. Увеличение связывания ФФК с миофибриллами может оказаться "спасительным" для фермента, т.к. приводит к восстановлению тетрамеров ФФК и сохранению ее активности.

ВЫВОДЫ

1. Электронно-микроскопически покарана способность С-белка связываться с Ф-актином, РТН и с тонкими нитями в составе "г-щеток". Связывание увеличивается при повышении уровня Са!+ от рСа8 до рСа 4. Возможно, что в мышце С-белок, локализованный на поверхности толстых нитей, при определенных условиях может также связываться с тонкими нитями. Функциональное значение этого связывания еще предстоит выяснить.

2. Обнаружена Са'+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина скелетных мышц в отсутствие регуляторных белков - тропомиозина и тропонина, а также Са'*-зависимое движение миозиновых мостиков на поверхности миозиновых нитей. Установлена корреляция в проявлении этих свойств в исследуемых системах. Данные свидетельствуют о возможности существования в скелетных мышцах механизма контроля миозинового типг наряду с механизмом регуляции на уровне тонких нитей.

3. С-белок оказывает значительное влияние на АТФ-азную активность и Сан-чувствительность РАМ, а также на структурное поведение мостиков н< поверхности миозиновых нитей. Влияние С-белка зависит от уровня Саг+ » фосфорилироеания ЛЦг-цепей миозина. Сделано предположение об участи! ЛЦ; миозина и С-белка в механизме, регулирующем взаимодействие толстых I тонких нитей в процессе сокращения скелетных мышц.

4. Методами ЭМ и ОД показано, что в условиях, близких к физиологи-чески» Р-белок способен связываться с миозиновыми нитями и агрегатам!

образуемыми стержневыми частями миозина. Установлено, что участки связывания р-белка локализованы на субфрагменте-2 миозиновой молекулы.

5. Методами электронной микроскопии и оптической дифракции показано, что Р-белок связывается с Ф-актином и РТЫ с образованием пучков, число и структура которых зависит от количества добавленного Р-белка.

6. Методом седиментации определены количественные параметры взаимодействия Р-белка с Ф-актином. Показано, что Р-белок связывается с актином с довольно высоким сродством (К«105-10' М'). Константа связывания сопоставима с константой связывания Р-белка с миозином.

7. Обнаружено, что связывание Р-белка с миозиновыми и актиновыми нитями зависит от концентрации Са3* и величины рН: при переходе от рСа 8 к рСа 4 и от рН 7.5 до 6.5 константа связывания практически не изменяется, но возрастает доля связанного фермента. Можно полагать, что состояния мышцы, характеризующиеся повышенным уровнем Са}* и пониженным рН, также будут приводить к увеличению доли связанного фермента.

8. Анализ литературных данных и результатов собственных исследований дает основания полагать, что толстые нити наряду с тонкими нитями могут, по-видимому, играть важную роль в компартментализации ферментов, обеспечивая тем самым синхронность запуска сократительной и энергетических систем, и выполняя функцию регулятора некоторых процессов энергетического метаболизма, в частности, гликолиза.

Список основных работ по теме диссертации.

1. Фрейдина НА., Вишневская З.И., Удальцов С.Н., Подлубная ЗА. Влияние С-белка, ДТНБ-цепей и ионов кальция на АТФазу актомиозина при разных ионных силах //Тезисы I Всесоюз. биофиз. съезда, Москва, 1982, т.2, с.32.

2. Фрейдина Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подхубная З А. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия Р-белка (ФФК) с ф-актином и реконструированными тонкими нитями //Биофизика, 1985, т.ЗО, с.922-924.

3. Удальцов С.Н., Фрейдина НА., Подлубная ЗА. Связывание Р-белка (фосфофруктокиназы) с миозином и актином в зависимости от рН //Тезисы УШ Всесоюз. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, "Мецниереба", 1987, с.35.

4. Фрейдина НА., Удальцов С.Н., Подлубная З.А Связывание F-белка (фосфофруктокиназы) с фибриллярным актином //Биофизика, 1987, т.32, N 2, с.350-351.

5. Удальцов С.Н., Фрейдина НА., Орлова A.A., Подлубная ЗА Влияние С-белка на АТФазу актомиозина в зависимости от уровня кальция и фосфорилирования легких цепей миозина //Тезисы IX Всесоюз. Симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, 1990, с.41.

6. Freydina NA., Vishnevskaya Z.I., Udaltsov S.N., Podlubnaya ZA. Effect of C-protein and DTNB-light chains on actomyosin ATPase activity at various ionic strength and Сa!,-level //Acta Biophys. Biochim. Hung., 1986, v.21, p.247-256.

7. Podlubnaya ZA.f Udaltsov S.N., Freydina NA Binding of phosphofructokinase (F-protein) to contractile filaments //Abstr. 19"1 Meeting FEBS, Rome, Italy, 1989, TU-120.

8. Podlubnaya ZA., Udaltsov S.N., Freydina NA., Orlova A A. Enzymes in the structure of vertebrate skeletal muscle thick filaments //Abstr. 2"1 Intern. Symp. "Muscle contraction mechanism", Bucharest, Romania, 1989, p.36.

9. Udaltsov S.N., Freydina NA., Orlova A.A., Podlubnaya ZA. Effects of pH and Ca!+-level on the binding of phosphofructokinase (F-protein) to contractile filaments //Abstr. Intern. Symp. "Molecular organization of biological structures", Moscow, 1989, v.2, p.200.

10. Udaltsov S.N., Freydina N.A., Orlova AA., Podlubnaya ZA. Actomyosin ATPase: effect of C-protein, light chains phosphorylation and Ca!+-levels //Abstr. Intern. NATO/FEBS School "Cellular regulation by protein phosphorylation", La Londe Les Maures, France, 1990, p.208.

11. Orlova AA., Korchagin V.P., Udaltsov S.N., Shelud'ko N.S., Podlubnaya ZA. The effect of C-protein on superprecipitation of scallop myofibrils //Abstr. 20"' Meeting FEBS, Budapest, Hungary, 1990, p.132.

12. Udaltsov S.N., Freydina N.A., Orlova AA., Podlubnaya ZA. Effect of C-protein on actomyosin ATPase depending on phosphorylation and Ca"-levels //Abstr. 10* intern. Biophys. Congr., Vancouver, Canada, 1990, p.415.

13. Udaltsov S.N., Stepkowski P., Freydina NA., Podlubnaya ZA. CaI+-dependent effects of C-protein on the actin-activated ATPase of phosphorylated and dephosphorylated skeletal muscle myosin //Biochem. Intern., 1991, v.25, p.837-843.

14. Podlubnaya ZA., Freydina NA., Udaltsov S.N. Interaction of F-protein (phosphofructokinase) with actin- and myosin-containing filaments //J. Muscle Res. & Cell Motil., 1992, v.13, N2, p.251.

15. Podlubnaya ZA., Orlova AA., Korchagin V.P., Udaltsov S.N., Shelud'ko N.S Modificatory effect of exogenous C-protein on contractile properties of isolated myofibrils //J. Muscle Res. & Cell Motil., 1993, v.14, N2, p.271.

16. Podlubnaya ZA., Stepkowski P., Udaltsov S.N., Kakol 1. Attachment-detachment behavior of crossbridges on the surface of reconstituted myosin filaments: effect of pH, Ca-ions and myosin light chains phosphorylation //J. Muscle Res. & Cell Motil., 1994, v. 15, N2, p.203.