Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-микроскопическое исследование сократительных нитей и их отдельных белков в скелетных и сердечных мышцах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электронно-микроскопическое исследование сократительных нитей и их отдельных белков в скелетных и сердечных мышцах"

САНКТ-ПЕТЕРБУЕГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШПАГИНА МИЛА ДМИТШЕВНА

ЭЛЕКТРОННО-МИКРО СКОПИЧЕСКОЕ ИССВДОВАНИЕ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ НИТЕЙ И ИХ ОТДЕЛЬНЫХ'ВЕНКОВ В СКЕЛЕТНЫХ И СЕРДЕЧНЫХ МЫШЦАХ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1991

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Академии наук СССР

Научный руководитель:

доктор биологических наук З.А.Подлубная

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Г.А.Наследов доктор биологических наук

С.А.Кроленко

Ведущее предприятие - Институт биофизики клетки АН СССР

Защита состоится " ¿¿ё^^с/лЛ- 199/г.

в /о[ час. 00 мин, на заседании Специализированного совета Д 063.57.50 по защите диссертации на соискание ученсШ степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9, биолого-почвенный факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук.

З.И.Крутецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБСШ

Актуальность теш. Исполнительный аппарат поперечно-полосатой мышцы уже более полувека является предметом интенсивных исследований. Основной результат этих исследований - создание модели сокращения, так называемой модели скользящих нитей (H.Huxley, Hanson, 1954; A.Huxley, JJiedergerke , 1954) ж мостиковой модели генерации силы (H.Huxley, 1969; A.Hwtley, Simmons, I9?I). Несмотря на огромный прогресс в познании структурных основ мышечного сокращения многие вопросы остаются до сих пор открытыми, что существенно., затрудняет выяснение молекулярных механизмов генерации силы мышцей, его регуляции и энергообеспечения.Поэтому изучение структуры сократительного аппарата мышцы продолжает оставаться одним из актуальных направлений проблемы мышечного сокращения. Структура толстых, или миозин-содеряащих и тонких, или актин-со-держащих нитей, взаимодействие которых лежит в основе мышечного сокращения, является предметом наиболее интенсивных исследований.

Электронная микроскопия является эффективным методом исследования структуры, хотя имеет дело с фиксированным тем или иным способом препаратом. В отличие от электронной микроскопии метод дифракции рентгеновских лучей обеспечивает возможность исследования живого объекта. Однако интерпретация данных, полученных этим методом, часто затруднена или невозможна из-за многокомпонентнос-ти" сократительных нитей и тем более мышечных саркомеров. В этих случаях использование метода электронной микроскопии в совокупности с оптической дифракцией позволяет юлучать информацию о структуре отдельных участков нитей и понять происхождение рефлексов, наблюдаемых на рентгенограшах, а в ряде случаев и причины их изменений при сокращении мышцы. Безусловно, что плодотворность метода электронной микроскопии базируется на отлаженное™ методов препаративной биохимии, позволяющих сохранять нативную структуру объекта в процессе его приготовления. Во многом сохранению реальной структуры способствует использование таких перспективных методов подготовки мышечных объектов для электронной микроскопии, как замораживание-высушивание, замораживание-травление-скалывание, замораживание-замещение и т.п.

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению структуры сократительных нитей поперечно-полосатых мышц позвоночных и их отдельных белков методами электронной микроскопии и оптической дифракции с использованием для подготовки объекта негативного контрастирования, кругового напыления, срезов, реплик и криометодик.

В работе решались следующие конкретные задачи: I. Изучить внутреннюю организацию толстых нитей скелетных мышц:

упаковку легкого меромиозина (ЛММ) внутри нити и наличие в ней стержневой структуры.

2. Определить периода локализации минорных белков в разных зонах вдоль толстой нити скелетных и сердечных мышц.

3. Изучить характер структурных изменений в толстых нитях при переходе скелетной мышцы из состояния покоя в состояния ритора и контрактуры.

4. Изучить связывание F-белка (фосфофруктокиназы) с актин- и миозин-содержащими нитями скелетных мышц.

5. Изучить связывание альдолазы с актин-содержащими нитями в составе 1-дисков скелетных мышц.

Научная новизна работы. В работе получен ряд новых данных о структурно-функциональных свойствах сократительных нитей поперечно-полосатых мышц. Обнаружена полая.стержневая структура внутри толстых нитей скелетных мышц. Определена упаковка молекул вдоль паракристаллических нитей ЛММ, основного белка ствола толстых нитей. Разработан метод получения изолированных миофибрилл из сердечных"мышц кролика, обеспечивающий сохранность структуры А-диска. Использование этого метода позволило впервые сохранить и выявить электронно-микроскопически весь набор полос минорных белков в А-дисках миофибрилл сердечных мышц.Установлено, что периоды локализации минорных белков в разных участках вдоль толстых нитей как скелетных, так и сердечных мышц отличаются на 1-2нм. Этот факт был объяснен небольшими различиями в периодах упаковки ЛММ--частей миозина в стволе нити. Показано, что осевые координаты основных "миозиновых" меридиональных рефлексов на картинах оптической дифракции от разных зон А-дисков скелетных мышц практически не меняются при переходе мышцы из состояния покоя в состояния ритора и контрактуры. Это свидетельствует об отсутствии значительных изменений в структуре стволов толстых нитей при изменении состояния мышцы. Обнаружено Са^+-зависимое связывание фермента гликолиза альдолазы о тонкими нитями в составе изолированных ■J-дисков. Выявлена способность фосфофруктокиназы связываться in vitro с миозиновыми и актиновыми нитями. Определена ее локадаза-ция в А-диске скелетной мышцы "кролика.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о структуре и функциональной роли сократительных нитей поперечно-полосатых мышц и стимулируют дальнейшие исследования в этом направлении.

Разработанный метод получения миофибрилл из сердечных мышц кролика, обеспечивающий сохранность их структуры, открывает возможности для дальнейших структурно-функциональных исследований 2

сократительных нитей разных мышц в норме и патологии.

Новые данные о струмуре толстых нитей помогли объяснить природу ряда меридиональных рефлексов на рентгенограммах скелетных мышц и были успешно использованы в теоретических расчетах картин рентгеновской дифракции при построении моделей толстых нитей.

Полученные данные об обратимом Са^+-зависимом связывании ферментов гликолиза с сократительными нитями важны для понимания механизма регуляции'гликолиза, для диагностики и лечения некоторых энзимопатий.

Апробация шботы. Основные результаты были доложены на Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышц (Тбилиси, 1974; 1983; 1987); П-ом Международном .симпозиуме "Механизмы мышечного сокращения" (Румыния, Бухарест, 1989); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Всесоюзных симпозиумах "Криогенные метода в электронной микроскопии" (Путцино, 1975, 1990); Международном симпозиуме по замораживании-скалыванию (ГДР, Йена, 1979); Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Петрозаводск, 1976; Сумы, 1982; Москва, 1988).

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (НО наименований). Работа изложена на-108 стр., включает 34- рис. и 3 таблицы.

Г. ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРЕННЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТОЛСТЫХ НИТЕЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ: УПАКОВКА ЛЕГКОГО МЕРОМИОЗИНА ВНУТШ НИТИ И НАЛИЧИЕ СТЕНШЕВОЙ СТРУКТУРЫ

Трудности изучения внутренней организации толстых нитей объясняются сложностью их строения и ограниченными возможностями методов исследования. Пластиковые срезы мышц не дают высокого разрешения. Наблюдение таких срезов часто приводит к оптическим артефактам, затрудняя интерпретации данных. Использование в этой методике химической фиксации и заливок может исказить ст^эуктуру объекта. Методика негативного контрастирования при электронно-микроскопических исследованиях изолированных нативных нитей позволяет достигнуть высокого разрешения. Однако эти изучения дают ограниченную информацию о внутренней организации толстых нитей из-за большого количества головок миозина на их поверхности. Более плодотворными оказались исследования агрегатов спиральных фрагментов миозина, лишенных головок.

Проведенный нами анализ картин поперечной исчерченности в негативно окрашенных паракристаллах спирального фрагмента миозина - легкого меромиозина, позволил сделать вывод о способах упаковки в наблюдаемых структурах.

При ионной силе 0."К25-0.2 наблюдалось образование двух типов паракристаллов с осевым периодом 43нм: с узкими темными разделительными линиями шириной ** Знм и с широкими разделительными полосами ^ 14.5нм, окаймленными двумя темными линиями шириной около Знм. При снижении ионной силы до 0.15-0^ на микроснимках кроме отмеченных типов паракристаллов наблюдаются также паракрис-таллы с осевой периодичностью~14.5нм. Если учесть, что длина молекулы ЛММ равна 86нм, а наблюдаемые осевые периоды в паракрис-таллах равны ~ 43нм и 14.5нм, можно предположить, что они возникают в результате упаковки молекул, не агрегированных конец к концу, а имеющих зоны перекрытия. Можно представить себе, что период 43нм возникает в результате агрегации молекул ЛММ, уложенных рядами вдоль паракристалла. Период вдоль-ряда равен 86нм, и соседние ряды сдвинуты друт относительно друга на 43нм. Молекулы в ряду уложены с небольшими промежутками ^ Знм, и имеются области перекрытия «-> 40нм между концами молекул в соседних рядах. Появление периода 43нм с разделительной полосой 14.5нм можно объяснить наложением двух периодичностей 43нм_, смещенных на 14.5нм. Период 14.5нм в паракристаллах ЛММ является результатом упаковки молекул ЛММ рядами со сдвигом 14.5нм, или результатом наложения трех или более 43нм-периодичностей, смещенных по оси паракристалла на 14.5нм. Круговое напыление металлом подтверждает наше заключение о способах' упаковки ЛММ в наблюдаемых паракристаллах. Оно выявляет в них только осевую периодичность ~ 43нм, хотя при негативном контрастировании в этих же условиях обнаруживаются 'все три типа паракристаллов. Это легко объяснить, если учесть, что при просмотре негативно окрашенного образца в просвечивающем электронном микроскопе осевая периодичность представляет собой, суммарную картину наложенных друг на друга плоскостей с периодом 43нм, сдвинутых друг относительно друга 'на 14.5нм. В случае пара-кристалла, оттененного металлом видна картина только его верхней, напыленной плоскости с осевой периодичностью 43нм. Более того, при оттенении металлом выявляется боковая неровность паракристалла, точнее, наличие широких периодических (период 43нм) выступов и узких впадин. Паракристалл имеет.вид гофрированной трубки. Выступы - области перекрытия концов молекул, впадины - промежутки между концами молекул.

Высказано предположение, что некоторые из наблюдаемых 1п

vitro упаковок, вероятно, реализуются и в природных ансамблях миозина. Иначе говоря, ЛММ-части миозиновых молекул упаковываются внутри нити в мышце, организуясь в субнити с периодом 43нм. Сдвиг их на 14.5нм создает периодичность 14.5нм. Расположение головок миозина на поверхности толстой нити определяется упаковкой ЛММ внутри нее.

Другим подходом к изучению внутренней организации толстых нитей является использование методики замораживания-скалываяия--травления. Известно, что толстые нити в скелетных мышцах имеют постоянную длину (^1.61001), тогда как реконструированные нити миозина очень гетерогенны по длине. Высказывались разные предположения относительно факторов, лимитирующих длину толстых нитей. Одно из них - наличие стержня, сформированного белком немиозино-вой природа (Josephs, Harrington , 1966; Squire, I97I). В поисках такой структуры нами было проведено исследование продольных и поперечных сколов реконструированных нитей миозина, изолированных толстых нитей и нитей в составе скелетных мышц кролика с помощью метода замораживания-окалывания-травления. Криофиксация объекта в этом методе позволяет сохранить его первоначальную структуру, круговое оттенение криосколов выявляет большее число структурных деталей объекта, чем оттенение в одном направлении. Применение наш обращенных реплик наряду с прямыми позволило. более точно определить структуру нитей.

При сравнении трех разных вариантов реплик с поперечных сколов толстых нитей было обнаружено, что они имеют своеобразное внутреннее строение. На поперечных сколах, оттененных под утлом без вращения, нить имеет выступающий на ЗОнм стержень, почти не покрытый металлом (светлое пятно5нм в диаметре). Вероятно, это цилиндр, образуемый ЛММ-частями миозиновых молекул. Вокруг него есть небольшое углубление, заполненное металлом. Оно, очевидно, соответствует поверхностным головкам миозина. Общий диаметр нити - 15-17нм. На микрофотографиях поперечных сколов с "круговым отте-нением толстая нить имеет вид круга, состоящего из разных по толщине и окраске темных и светлых колец. Центральный светлый крут имеет диаметр 5-7нм, диаметр внешнего круга (углубления)ы 16нм. На картинах обращенных реплик толстая нить, наоборот, представляет собой выпуклость. Ее диаметр увеличивается до 20нм из-за толщины напыленного слоя металла. Центральное белое пятно по-прежнему имеет диаметр 5-7нм. На основании этих, данных сделан вывод, что истинный диаметр толстой нити составляет 16нм, а диаметр.стержневой структуры — 5-7нм, Неизменность диаметра стержневой цилиндрической структуры с размерами стенок 2нм на кар-

тинах прямых и обращенных реплик позволяет заключить, что она не заполнена белком.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРИОДОВ ЛОКАЛИЗАЦИИ МИНОРНЫХ БЕЛКОВ.В ТОЛСТЫХ НИТЯХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ Известно, что толстые нити скелетных мышц содержат' помимо миозина ряд минорных немиозиновых компонентов. На электронных снимках А-дасков с каждой стороны от М-зоны видны одиннадцать поперечных полос, отражающих места локализации разных минорных белков (Bennett et al., 1986). 7-8 крайних полос из II в каждой из половин толстой нити отражают локализацию С-белка. (С-зона). В центральной зоне толстых нитей (М-зона + проксимальная (Р) зона), заключенной между двумя С-зонама, локализован ряд других минорных белков. Вопрос о периодах локализации С-белка и других минорных белков в толстых нитях оставался открытым. Для его решения мы провели сравнительное электронно-микроскопическое и оптико-дифракционное изучение структуры отдельных зон негативно окрашенных А-дисков, изолированных из поясничной мышцы кролика, и разных зон А-дисков на продольных срезах скелетных мышц кролика и лягушки, зафиксированных в состоянии покоя, ригора и ацетилхо-линовой контрактуры. Непосредственные измерения на наиболее качественных микрофотографиях изолированных А-дисков и продольных срезов скелетных мышц показали, что среднее расстояние между ярусами локализации минорных белков в центральной зоне А-дисков превышает период локализации С-белка в С-зоне примерно на 1-2нм. На большинстве микрофотографий изолированных А-дисков минорные белки центральной зоны формируют одномерную решетку со средним периодом^ 44.5нм (при измерениях период повторения в С-зоне принимался равным 43нм). Результаты прямых измерений подтверждаются данными оптической дифракции (ОД). На картинах оптической •дифракции, полученных от С-зон изолированных А-дисков и А-дисков на продольных срезах, присутствуют меридиональные рефлексы 43; 21.5; 14.3нм - первые три порядка отражений от решетки С-белка с периодом 43нм. В то же время на картинах ОД от центральных зон изолированных А-дасков наблюдаются рефлексы 44.4; 22.3; 14.7нм, которые можно рассматривать как первые три порядка отражений от решетки с периодом 44.4нм. На большинстве микрофотографий продольных срезов портняжной мышцы лягушки и иногда на микрофотографиях изолированных А-дисков распределение поперечных полос в области центральной зоны представляет собой\§дномерную решетку, а биполярную структуру. В этом случае на картинах ОД," полученных от центральных зон, наблюдаются сильные рефлексы 48.3;.23.4; 15.3нм,

положения которых определяются особенностями дифракций на биполярных структурах и не отражают истинной периодичности минорных белков. При этом непосредственные измерения показывают, что полосы центральной зоны по-прежнему разделены периодом 44-45нм.

Таким образом, результаты измерений периодов локализации минорных белков на микрофотографиях изолированных А-дисков скелетной мышцы кролика и продольных срезов саркомеров скелетной мышцы лягушки, а также данные ОД от центральной и С-зон свидетельствуют о том, что средний период локализации шнорных белков в центральной зоне толстых нитей составляет 44-45нм, т.е. отличается от периода локализации С-белка в С-зоне (43нм). Изучение локализации полос минорных белков в А-дисках на продольных срезах скелетных мышц в состоянии ригора и ацетилхолиновой контрактуры обнаружило такие же различия в периодах локализации шнорных белков в центральной и С-зонах. Если локализация минорных белков в толстой нити определяется упаковкой миозина, .то можно сделать вывод о различии периодов упаковки миозиновых молекул в Р- и . С-зонах.Недавно небольшие различия в периодах упаковки ЛММ в па-ракристаллах были продемонстрированы в работе (РоЦиЪпауа et а1., 1990). Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что дифракция на решетке минорных белков, локализованных в центральной зоне, наряду с дифракцией на решетке С-белка должна давать вклад в интенсивность меридионального рефлекса 44.2нм, наблюдаемого на рентгенограммах скелетных мышц. Действительно, как показано в работе (Леднев и др., 1983), учет дифракции на решетке минорных белков в центральной зоне А-дисков дает хорошее совпадение теоретически рассчитанных и 'экспериментально наблюдаемых меридиональных картин дифракции.

Период локализации С-белка, равный 43нм, вероятнее всего, определяется упаковкой миозина з нити, или точнее, упаковкой ЛММ-частей миозина в стволе нити. Результаты, полученные нами на уровне мышцы, подтверждаются наблюдением ЛММ-ларакристаллов, декорированных С-белком. С-белок связывается с разными типами негативно-окрашенных или оттененных металлом ЛММ-паракристаллов, локализуясь на разделительных периодических полосах. Таким образом, С-белок связывается с паракри'сталлическими нитями ЛММ и с толстыми нитями в мышце с периодом, свойственным этим нитям, т.е. с периодом равным 43нм.

3. ВЫЯВЛЕНИЕ ЯРУСОВ ЛОКАЛИЗАЦИИ МИНОРНЫХ БЕЛКОВ В ТОЛСТЫХ НИТЯХ

СЕРДЕЧНЫХ МЫШЦ

Известно, что С-белок является минорным компонентом миофиб-

рилл не только.скелетных, но и сердечных мышц позвоночных (Hart-zeii.îitus » 1982; Yaraamoto, 1987). Флюоресцирующие антитела указывают на его присутствие примерно в середине каждой половины А--диска в миофибриллах, выделенных из сердечных мышц. Установление точной локализации С- и других минорных белков в сердечной мышце на электронно-микроскопическом уровне оказалось невозможным в связи с неуспешными попытками увидеть соответствующие полосы в А-диске на продольных срезах и в изолированных миофибриллах сердечных мышц. Это можно объяснить частичной или полной потерей минорных белков во время препаративных процедур.

Мы разработали простой и надежный метод изоляции миофибрилл из сердечной'мышцы кролика, позволяющий сохранять исходную структуру А-дисков. Впервые электронно-микроскопически в А-дисках сердечных миофибрилл был выявлен полный набор поперечных полос, которые в скелетных мышцах отражают ярусы локализации разных минорных белков. Их положение соответствует положению полос в А-диске скелетной мышцы. Это свидетельствует об одинаковой локализации С-белка и других минорных белков в толстых нитях сердечной и скелетной мышц кролика. Разница в структуре "сердечных" и "скелетных" А-дисков была обнаружена в концевых участках нитей и в М--зоне. В М-зоне сердечных мшвц обнаружено 5 поперечных полос,тогда как в скелетной мышце кролика только три. Эти три полосы шириной 4-6нм, расположенные с интервалами 22нм, соответствуют,как известно, местам локализации креатинкиназы, (Waliimann, Ерреп -berger, 1985). У каждого края "сердечных" А-дисков видна одна светлая краевая полоса шириной 19-25нм, в то время как в А-дисках миофибрилл поясничной мышцы кролика имеются две такие полосы. В каждой краевой полосе "скелетного" А-диска локализуется фермент АМФ-дезаминаза (Cooper,TrinloJt , 1984). Возможно, что отсутствие .этой полосы в А-дисках сердечной мышцы кролика указывает на иную локализацию фермента в миофибриллах этой мышцы, которую предстоит выяснить.

Следует отметить, что кроме С-белка и трех белков М-линии креатинкиназы, М-белка и миомезина) в А-дасках сердечных мышц до сих пор не найдено других'минорных компонентов (wallimam et al., 1985; Yamamoto, 1987; Grove et al.,1985). Обнаружение на микроснимках "сердечных" А-дисков полного набора полос, характерного для "скелетных" А-дисков указывает на возможное присутствие других минорных белков в толстых нитях сердечных мышц.

4. ИЗУЧЕНИЕ СВЯЭДВАНИЯ F-БЕШ. С Ш03ИН0ВЫШ НИТЯМИ И ЕГО ЛОКАЛИЗАЦИИ В СКЕЛЕТНОЙ ШШЦЕ

Р-белок, как и С-белок, является постоянной примесью препа-

ратов миозина. Правомерно было предположить, что F-белок также является компонентом миозин-содержащих нитей. Однако вопрос о его принадлежности к толстым нитям оставался открытым. Изучение F-белка затруднено более низким содержанием его в скелетных мышцах по сравнению с С-белком (0.4$ Р-белка, Ь% С-белка от веса миозина). К началу наших исследований не было сведений о природе этого белка.

Электронномикроскопически с использованием негативного контрастирования и оттенения металлом нами было показано, что частицы Г-белка имеют вид глобул с размерами 4-9нм. Выявлена способность Р-белка создавать упорядоченные линейные агрегаты длиной До 1мкм.

С помощью электронной микроскопии и оптической дифракции выявлена способность Р-белка связываться с реконструированными мио-зиновымя нитями и агрегатами стержневых частей миозина (но не с ЛШ-паракристаллами). Период 14.3нм, едва различимый в миозино-вых нитях, становится четко выраженным при связывании с ними F--белка. На картинах ОД, полученных от миозиновых нитей в отсутствие и в присутствии F-белка, меридиональный рефлекс 14.3нм всегда различим. Однако в присутствии F-белка интенсивность его значительно возрастает. Нитевидные агрегаты стержневых частей миозина имеют гладкую поверхность и едва различимую осевую периодичность 14.3нм. На картинах ОД от них видны слабые меридиональные рефлексы 14.3нм и 7.2нм. Добавление F-белка к стержневым частям миозина приводит к появлению нитей, очень похожих на миозиновые с регулярными "выступами" на поверхности с периодом 14.3нм. При этом на картинах ОД наблюдается значительное увеличение интенсивности меридионального рефлекса 14.3нм. Сравнение картин ОД, полученных от агрегатов миозина и его стержневых частей в отсутствие и в присутствии F-белка, не обнаруживает различий в наборе меридиональных рефлексов, что указывает на отсутствие существенной разницы в структуре агрегатов без и с F-белком.

Таким образом, данные электронной микроскопии и ОД свидетельствуют о том, что F-белок связывается с нитевидными агрегатами миозина и стержневых частей миозина, не изменяя их структуру, а лишь декорируя с поверхности с периодом, обусловленным их внутренней организацией. Поскольку F-белок связывается с миозином и его стержневой частью и, не связывается с ЛММ, было высказано предположение, что участки связывания F-белка расположены на субфраг-менте-2 миозиновой молекулы. Доказательства для этого предположения были получены в нашей лаборатории также методом седиментации и скоростного ультрацентрифугирования.

Изложенные данные свидетельствуют в пользу возможной локализации F-белка на толстых нитях в мышце. Исследования,проведенные наш с помощью • иммунной электронной микроскопии, подтвердили это предположение. Поликлональные антитела к F-белку были обнаружены в А-дасках миофибрилл с каждой стороны от М-лияии в области двух первых полос из одиннадцати, наблюдаемых на микроснимках. До этого две первые полосы в А-диске скелетных мышц были неиден-тифицированными. Недавно наши результаты по локализации Г-белка в А-диске были подтверждены (Offer et al., 1988).

В настоящее время уже установлена природа F-белка. Он является ключевым ферментом гликолиза фосфофруктокиназойчНЖ (Мауг, I9S4). Предполагается, что многие ферменты гликолиза, включая ФФК, присутствуют' в мышечной клетке в свободной и связанной формах ( Wilson, 1978; Clarke et al ., 1985). По всей вероятности, F-белок представляет собой фракцию ФФК, связанную с толстыми нитями в мышце. Локализация ФФК вблизи АТФазы миозина, креатинкина-зы и АМФ-дезаминазы, по-видимому, обеспечивает бблыную чувствительность ФФК к состоянию АТФ-потребляющей и АТФ-производящих систем.

5. ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ F-EEJIKA С Ф-А1ШН0М И

РЕКОНСТРУИРОВАННЫМИ ТОНКИ,М ШТ5Ш

Наш данные о локализации F-белка в скелетной мышце отличаются от ранних литературных данных, полученных на' уровне световой микроскопии методами гистохимии и флюоресценщш(31ее1, Pette 1969; Dolken et al., 1975). Расхождение данных можно объяснить разницей в состоянии мышцы. Присутствие F-белка в А-диске было обнаружено нами в ригорной мышце кролика, тогда как антитела к ФФК были найдены в I-дисках покоящейся мышцы. Возможно, что связь ФФК с теми или иными нитями зависит от состояния мышечной клетки. Однако нельзя исключить и /ряд артефактов при использовании метода флв^эесцирующих антител. В связи с этим необходимо было провести исследование in vitro взаимодействия фракции ФФК, выделяемой нами в виде F-белка и обладающей сильным сродством к миозину, с Ф-актином и реконструированными тонкими нитями (РТН).

Электронно-микроскопические наблюдения показали, что F-белок способен связываться как с Ф-актином, так и с РТН с образованием упорядоченных пучков. При малых добавках F-белка видно регулярное, (период 36-38нм) его распределение между актиновыми нитями в пучках в виде узких (4~6нм) поперечных мостиков и широких (200--ЗООнм) мостичных структур. При повышении концентрации F-белка до эквимолярной и выше по отношению к актину наблюдаются комплексы, в которых F-белок заполняет все пространство между актиновыми 10

нитями создавая жесткие пучки, в которых видна косая исчерчен-ность с периодогл бнм. Наши данные были подтверждены другими авторами ( Eoberta; Somero , 1987; 1989).

Картины ОД, полученные от пучков Ф-актина и ИН с F-белком, подтверждают данные электронной микроскопии,свидетельствуя о посадке Р-белка на актиновых нитях с интервалом 36-38нм.

Результаты электронно-микроскопических и оптико-дифракционных исследований были подтверждены в нашей лаборатории также ме- • тодом седиментации. Показано, что Р-белок связывается с актином с довольно высоким сродством. Константы связывания сопоставимы с константами связывания F-белка с миозином и составляют 10^-10%"^ (Фрейдина и др., 1987).

Таким образом, из проведенных исследований нельзя сделать заключения о преимущественное™ связывания ФФК с толстыми, или с тонкими нитями in vivo . Однако можно полагать, что в мышце на связывание ФФК с сократительными нитями будут по-разному влиять многие факторы: рН, Са2+, - эффекторы ФЕС, степень ее фосфорилиро-вания, другие ферменты и т.п.. Проверка этого предположения (Pod-lubnaya et al., 1989), показала, что количество Р-белка, связанного in vitro с актиковыми и с миозиновыми нитями одинаково зависит от значения рЯ и уровня Са^+. Для окончательного вывода необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

6. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АЛЬДОЛАЗЦ С ТОНКИМИ НИТЯМИ 3 СОСТАВЕ "Z -ЩЕТОК"

3 этой главе приведены результаты электронно-микроскопического и оптико-дифракционного исследования взаимодействия другого глшюлитического фермента-альдолазы с нативными нитями в составе "ъ -щеток" (изолированных I-дисков) в присутствии и в отсутствие Са^+. Несмотря на то, что связыванию альдолазы с актин-содержащи-ш нитями посвящено большое количество работ, вопрос о ее локализации в саркомере при разных состояниях мышцы по-прежнему остается открытым. Антитела к альдолазе были обнаружены в I-дисках покоящихся скелетных мышц (Slgel.Pette , I969;Dollcen et al.,1975). Последующие работы по связыванию этого фермента были проведены на нитях актина и РТН. Использование для этой цели таких упорядочении х структур, как "z -щетки" открывает новые возможности для оптико-дифракционных исследований и более точных измерений посадки фермента.

Электронно-микроскопическое исследование суспензии 1-дисков показало, что модифицированный нами метод дает возможность получать I-диски с хорошо' сохраненной структурой. Визуальный анализ микроснимков I-дисков выявил в них поперечные светлые полосы

с периодом o-"38hm. На лучших снимках можно было различить до 26 таких полос, отражающих места локализации тропонин-тропомиозино-вого комплекса на тонких нитях. Ширина полос составляла 5-6нм.В области z -лин« наблюдались 3 поперечные, полосы на расстоянии 20-24нм друг от друга. Это позволило с достаточной точностью измерить положение полос локализации тропонияа. Первая полоса находилась на расстоянии 76-78нм от центра z-линии.

Оптико-дифракционный анализ микроснимков контрольных 1-дис-ков обнаружил меридиональные рефлексы 38.5; 19.2; 12.8нм, соответствующие трем первым порядкам отражения от решетки с периодом • 38.5нм. Этот набор рефлексов соответствует меридиональным-рефлексам, наблюдаемым на рентгенограммах скелетных мышц в состоянии ритора (Леднев и др., 1981). После обработки I-дисков альдолазой в присутствии или отсутствие ЭГТА на микроснимках негативно окрашенных I-дисков. наблюдалось увеличение ширины периодических -светлых полос от 5-6нм до 25-28нм, обусловленное связыванием альдолазы с тонкими нитями вблизи участков реализации тропонина. Период посадки альдолазы в 1-дасках был равен периоду локализации тропонина, т.е. около 38нм. На микроснимках I-дисков, декорированных альдолазой поперечные полосы в области z -линии становились более отчетливыми. Это позволило точно определить располоае-ние полос посадки альдолазы. Оказалось, что центры связывания альдолазы смещены относительно центров связывания тропонина при-' мерно на 10-12нм, считая от центра z-линии. На картинах ОД, полученных от I-дисков, обработанных альдолазой в присутствий Са^+, наблюдался сильный меридиональный рефлекс 38,5ш, а рефлексы 19.2 и 12.8нм, как правило, отсутствовали. В присутствии Са + картины ОД чаще содержали три указанных рефлекса. Такое резкое уменьшение интенсивности рефлексов при значениях I/z « 25нм можно объяснить изменением формфактора тропонина при связывании рядом с ним альдолазы. Известно, что на рентгенограммах покоящихся мышечных волокон по сравнению с сокращающимися отмечается практически полное исчезновение меридиональных рефлексов 19.2 и 12.8нм (Hasei-grove, 1975). Причина этого феномена неясна. Вполне возможно,что исчезновение указанных рефлексов является результатом присоединения некоторых гликолитических ферментов к тонким нитям при низких уровнях Са - (10"%). С другой стороны, не объясненное до сих.пор появление указанных рефлексов на рентгенограммах ригоризованных мышечных волокон и в том числе растянутых до исчезновения перекрытия между тонкими и толстыми нитями, можно, по-видимому,рассматривать как указание на десорбцию фермента с тонких нитей. Заметим, что in vitro эксперименты по связыванию альдолазы с РТН

также свидетельствуют об уменьшении количества связанной альдо-лазы при увеличении уровня Са2+ (Walsh et al., 1980).

К настоящему времени накоплено большое количество данных об обратимом связывании некоторых ферментов гликолиза с актин-содер-жащими нитями in vitro. Показано, что связывание приводит к изменению их энзиматических свойств. Обнаружены также обратимые изменения степени связывания ферментов с миофибриллами скелетных и сердечных мышц при изменении состояния мышцы (Clarke et al.,1985). На основании этих данных высказано предположение о значении обратимого связывания ферментов гликолиза о тонкими нитями в синхронном запуске и согласованной работе сократительной и энергетической систем мышцы. Данные, изложенные в этой работе, свидетельствуют о том, что толстые нити также могут играть важную роль в компартментализации ферментов, контролирующих энергетический статус мышечной клетки, и в регуляции их активности.

ВЫВОДЫ.

С помощью методов электронной микроскопии и оптической дифракции при использовании методик срезов, негативного контрастирования, оттенения металлом и замораживания-скалывания-травления получен ряд новых данных о структурно-функциональных свойствах сократительных нитей поперечно-полосатых мышц позвоночных и их отдельных белков.

1. Определена упаковка молекул вдоль паракристаллов ЛШ-. основного белка ствола толстых нитей. Обнаружена полая стержневая структура внутри толстых нитей скелетных мышц,образуемая ЛММ.

2. Обнаружено,что периоды локализации минорных белков в разных зонах толстых нитей отличаются на 1-2нм. Это объяснено небольшой разницей периодов упаковки 1ММ-частей миозина вдоль толстых нитей.

3. Впервые выявлены все полосы минорных белков в А-дисках миофибрилл -сердечных мышц. Показано, что положение ярусов минорных белков в толстых нитях сердечной мышцы кролика не отличается от такового в скелетной мышце. Предсказано присутствие в толстых, нитях сердечной мышцы кролика помимо С-белка'и белков М-линии других; неизвестных еще минорных компонентов.

4. Показано, что осевые координаты основных миозиновнх меридиональных рефлексов на картинах оптической дифракции от разных зон саркомеров скелетных мышц практически не меняются при переходе мышцы из состояния покоя в состояния ритора и контрактуры.Это свидетельствует об отсутствии значительных изменений в структуре стволов толстых нитей при изменении состояния мышцы.

5. Определены размены и форма Г-белка. Показана его способ-

ность связываться не только с актин-содержащими, но -и с миозин-содержашими нитяш in vitro. Выявлена локализация ФФК на толстых нитях в поясничной мышце кролика.

6. Обнаружено зависимое связывание альдолазы с тонкими нитями в составе изолированных 1^-дисков.

7. Анализ собственных и литературных данных позволяет рассматривать толстую нить как внутриклбточный компартмент для ряда ферментов - креатинкиназы, фосфофруктокиназы, АМФ-дезаминазы. Их -комплекс с АТФазой миозина, вероятно, необходим для синхронного . запуска и согласованного функционирования сократительной и энергетических систем мышцы. "

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аллахвердов Б.Л., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Изучение структурных элементов саркомера скелетной мышцы методом ireeze-etching //Материалы Всесоюз.симп."Криогенные методы

- в электронной микроскопии", 1974, Путцино, с.42-49.

2. Аллахвердов Б.Л., Шпагина М.Д. Изучение ультраструктурной организации мышцы методом freeze-etching //в кн.: Биофизика и биохимия мышечного сокращения, М.,"Наука", 1976, с.194-205.

3. Шпагина М.Д., Городецкая С.Л., Аллахвердов Б.Л., Подлубная З.А. Изучение структуры изолированных миозиновых нитей и толстых нитей в мышце методом замораживания-скалывания. //Материалы Всесоюз.симп."Методы подготовки сложных объектов и анализ электронно-микроскопических изображений", Петрозаводск, 1976, с.17 5-177.

4. Подлубная З.А., Фрейдана H.A., Шпагина М.Д., Орлова A.A. Исследование молекулярных взаимодействий в структуре толстых и тонких нитей мышцы. //В сб."Молекулярная и клеточная биофизика". М., "Наука", 1977, с.124-152.

5. Фрейдана H.A., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. Электронно-микроскопическое изучение формы и размеров Г-белка. //Биофизика, 1981," т.26, №4, с.761-764.

6. Лацабидзе И.Л., Шпагина М.Д.., Сребницкая Л.К. .Подлубная З.А., Леднев В.В. Структура центральной и С-зон саркощеров на продольных срезах скелетных мышц в состоянии покоя, ригора и контрактуры. //Тез.докл. I Всесоюз.съезда, М., 1982, т.2, '

с.49, №983.

7» Шпагина М.Д., Орлова А.А., Лацабддзе И.Л., Подлубная З.А., Леднев В.В. Исследование ^структуры толстых нитей в изолированных А-дисках и продольных срезах скелетных мышц методом дифракции. //Биофизика, 1983, т.28, с.306-310.

8. Шлагина М.Д., Лацабидзе И.Л., Орлова'А.А., Подлубная З.А., Леднев В.В. Изучение периодичности локализации минорных белков в миозиновых нитях методом оптической дифракции. //Тез. докл. 12 Всесоюз.. конф. по электронной микроскопии, Сумы, 1982, с.286.

9. Фрейдина Н.А., Шпагина М.Д., Удальцов С.Н., Подлубная З.А. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия Г-белка (ФФК) с актин-содержащими нитями. //Биофизика, 1985, т.30, с.922-924.

10. Фрейдина Н.А., Шпагина М.Д., Подлубная'З.А. Определение количественных параметров связывания Г-белка (фосфофруктоки-назы) с миозином и локализация участков связывания на мио-зиновой молекуле. //Биохимия, 1986, т.51, с.1718-1725.

11. Подлубная З.А., Шпагина М.Д., Цховребова Л.А., Леднев В.В. Связывание ферментов гликолиза сактиновыми нитями в I-дисках. //Тез.докл. 13 Всесоюз. конф. по электронной микроскопии, Москва, 1988, с.190.

12. Подлубная З.А., Цховребова Л.А., Шпагина М.Д., Сукоян Г.В., Леднев В.В. Взаимодействие альдолазы с тонкими нитями в составе I-дисков, изолированных из скелетных мышц. //Цитология, 1989, т.31, №4, с.460-464.

13. Шпагина id.Д., Хуцян С.С., Аллахвердов Б.Л., Подлубная З.А. Применение криометодов для исследования ультраструктуры саркомеров скелетной мышцы кролика. //Цитология, 1990, т.32, И1, с.1073-1077.

14. Allakhverdov B.L., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Study on structural elements of sarcomere: structure of thick filaments in muscle and after isolation. // Acta histochemica, Suppl-Band XXIII, 1981, p.83-87.

15. Freydina H.A., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Interaction of F-protein with myosin and its proteolytic fragments:location of F-protein binding sites on the myosin molecule. //J.Muscle Res. & Cell Motil., 1984, v.5, p.209.

16. Freydina N.A., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Localization oi binding sites of F-protein (phosphofructokinase) on myosin molecule. //J.Muscle Res. & Cell Motil., 1986, v.7, p.481-490.

17« Freydina H.A., Shpagina M.D., Podlubnaya Z.A. Localization of binding sites of P-protein on myosin molecule. //Cambridge Scient.Biochem. Abstracts., 19B7, v.16, iss.8, part.3i N 376S, L16, p.39.

18. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Lednev V.V. Electron microscopic and biochemical approaches for the study on the location of minor protein in thick filaments of cardiac muscles. //Proc.Intern.Symp. "Molecular organization of biological structures", Moscow, 1989, v.2, F-10, p.199.

19. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Lednev V.V. Manifestation of the Stripes of Minor Proteins Location in A-bands of rabbit Cardiac Myofibrils, //J.Mol.Biol., 1989, v.210, p.655-658,

20. Podlubnaya Z.A., Shpagina M.D., Lednev V.V. Stripes of minor protein location in A-bands of rabbit cardiac myofibrils. //Proc. 2d Intern. Symp. on Muscle contraction mechanism., Bucharest, Romania, 1989, p.33-35.

2I.XI.9I г. Эак. 37I6P Тир. 125 экэ. Уч.-изд.л. I.О Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ АН СССР