Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности протеолитического процессинга и субъединичной структуры адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности протеолитического процессинга и субъединичной структуры адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

на правах рукописи

Серова Оксана Викторовна

ОСОБЕННОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССИНГА И СУБЪЕДИНИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АДГЕЗИОННОГО Й-БЕЛОКСОПРЯЖЕННОГО РЕЦЕПТОРА ШІ.

специальность - 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2012

005009932

005009932

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии рецепторов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова Российской академии наук [ИБХ РАН}

Научные руководители: доктор химических наук,

Петренко Александр Георгиевич

кандидат физ.-мат. наук,

Деев Игорь Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

Румш Лев Давыдович

кандидат биологических наук, доцент, Воротников Александр Вячеславович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии им. ВА Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «14» марта 2012 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Автореферат разослан « » февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного советаГ доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. G-белоксопряженные рецепторы (G proteincoupled receptors, GPCRs) представляют один из самых больших и наиболее разнообразных классов трансмембранных белков, кодируемых геномом многоклеточных животных. Так, у человека обнаружено более 800 различных генов, кодирующих G-белоксопряженные рецепторы, среди которых выделяют пять семейств (глутаматные, родопсиновые, адгезионные, Frizzled/taste2 и секретиновые). GPCRs опосредуют большое количество физиологических процессов в эукариотических организмах, нарушение работы этих рецепторов приводит к возникновению различных заболеваний. Около 40 % фармацевтических препаратов, выпускаемых на рынке, используют в качестве мишеней G-белоксопряженные рецепторы. При этом терапевтическими мишенями являются чуть меньше пятидесяти различных GPCRs, что составляет всего около 5 % от всех известных белков этого семейства. Функция около 120 рецепторов, обнаруженных в геноме человека, остаётся невыясненной, такие рецепторы называют сиротскими или орфановыми. При этом сиротскими являются практически все адгезионные GPCRs. Таким образом, исследование структуры и функций этих белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Нейрональный рецептор CIRL1 (the calcium-independent receptor of a-latrotoxin 1) является высокоаффинным рецептором природного нейротоксина - а-латротоксина, благодаря чему он и был открыт. Ранее проведенные исследования и пресинаптическая локализация рецептора указывают на его роль в регуляции нейросекреции. Этим определяется интерес к рецептору и интенсивные исследования, направленные на его структурнофункциональную характеристику. CIRL1 принадлежит к семейству адгезионных G-белоксопряженных рецепторов. Для рецепторов данного семейства характерно наличие двухсубъединичной структуры, которая является результатом эндогенного протеолиза молекулы-предшественника. Образующиеся в результате протеолиза субъединицы рецептора, как предполагают, образуют нековалентно связанный комплекс на поверхности клетки. Однако для CIRL1 недавно была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц на клеточной мембране. Согласно этой гипотезе субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембрано-связанными. Таким образом, на данный момент актуальным является исследование особенностей субъединичной структуры CIRL1, а также поиск белков, взаимодействующих с рецептором.

і

Нели и запачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей структурной организации адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL1, а также поиск белков, взаимодействующих с рецептором. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1. Исследовать механизм диссоциации субъединиц рецептора CIRL1; 2. Определить образуют ли субъединицы рецептора нековалентный комплекс на плазматической мембране; 3. Выделить белковые комплексы, содержащие рецептор CIRL1 и идентифицировать компоненты, входящие в состав комплексов.

Научная новизна и практическая иенность работы. Показано, что на клеточной мембране рецептор CIRL1 присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85. Впервые установлено, что часть субъединиц рецептора CIRL1 диссоциирует при физиологических условиях, в результате чего р120 секретируется во внеклеточную среду. Определен механизм диссоциации: диссоциация р120 субъединицы происходит при участии мембрано-ассоциированной протеазы, которая отщепляет N-концевой пептид р85 субъединицы в непосредственной близости от мембраны. В результате протеолиза р120 субъединица секретирует во внеклеточную среду в комплексе с коротким пептидным фрагментом р85.

Проведен поиск белков, способных взаимодействовать с рецептором CIRL1. Идентифицирован ряд белков, в числе которых структурные, внутриклеточные сигнальные белки, а также белки, участвующие в эндоцитозе и транспорте синаптических везикул.

В целом, результаты работы способствуют расширению представлений о структурной организации и функциональных свойствах адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL1.

Апробаиия работы. Результаты настоящего исследования доложены на ряде российских и международных симпозиумов: на 12-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, (Пущино, 2008), на IV и V Российских симпозиумах "Белки и пептиды", [Казань, 2009; Петрозаводск, 2011), на четвертой международной конференции молодых ученых "Молекулярная биология: проблемы и перспективы", (Киев, Украина, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссеотаиии. Диссертация изложена на Ю1-страницах, содержит 21 рисунок и 1 таблицу, состоит из введения, обзора

2

литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 433 название.

Содержание работы

1. Особенности субъединичной структуры рецептора С1ШЛ

СШЫ принадлежит к семейству адгезионных С-белоксопряженных рецепторов. Данные рецепторы являются природными гибридами двух классов белков - сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. Подобно другим членам семейства СПИЛ состоит из двух субъединиц -внеклеточной гидрофильной субъединицы р120, содержащей модули клеточной адгезии, и трансмембранной субъединицы р85, участвующей в передаче сигнала (рис. 1).

CIRL1

внешняя и внутренняя

пм

Рис. 1. Схематичное изображение белка CIRL1. Здесь и далее ПМ - плазматическая мембрана.

Двухсубъединичная структура является результатом протеолитического расщепления молекулы предшественника. Установлено, что сайт протеолиза располагается внутри консервативного домена, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента. Этот домен получил название GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site) и был обнаружен у всех гомологичных адгезионных G-белоксопряженных рецепторов, за исключением GPR123. Сайт протеолиза является высоко консервативным: в положении Р-2 остаток His, в положении Р'1 остаток Leu, в положении Рп - либо Ser, либо Thr. Кроме этого GPS-домен содержит четыре консервативных остатка Cys и два Тгр. На данный момент не идентифицирована протеаза, осуществляющая гидролиз в GPS-домене. GPS-протеолиз отличается от обычного посттрансляционного протеолитического процессинга фуриновыми протеазами тем, что проходит на ранних стадиях биосинтеза, в эндоплазматическом ретикулуме, до гликозилирования рецептора.

Большинство данных свидетельствует о том, что две субъединицы адгезионных G-белоксопряженных рецепторов образуют прочный нековалентный комплекс на поверхности клетки. Одним из доказательств этому является то, что внеклеточная гидрофильная субъединица обнаруживается в мембранной фракции, тогда как при экспрессии этой субъединицы как отдельного белка, она является растворимым секретируемым белком. Кроме того, обе субъединицы эффективно копреципитируются специфичными антителами после солюбилизации клеток детергентом.

Однако анализ экспрессии и внутриклеточного транспорта рецептора CIRL1 с использованием антител, специфичных к отдельным субъединицам, указывает на то, то фрагменты CIRL1 не полностью колокализованы на поверхности клетки. В связи с этим была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц CIRL1 на клеточной мембране. Согласно этой гипотезе субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембраносвязанными и ведут себя как независимые мембранные белки. Вместе с тем природа независимого расположения гидрофильной субъединицы р120 на плазматической мембране остается непонятной.

Для того чтобы согласовать выше изложенные противоположные наблюдения, мы исследовали возможность диссоциации двухсубъединичного комплекса CIRL1 при физиологических условиях.

1.1. Диссоциация субъединиц рецептора CIRL1

В случае если происходит диссоциации субъединиц CIRL1, гидрофильная субъединица р120 должна секретироваться во внеклеточную среду. Для проверки возможности существования растворимой формы CIRL1 in vivo, водные экстракты мозга крыс были подвергнуты хроматографии на а-латротоксин-агарозе. Сорбированные белки элюировали и анализировали с использованием Вестерн-блоттинга с последующей окраской антителами к р120-субъединице. В качестве отрицательного контроля была использована хроматография на BSA-агарозе. Этот белок, подобно а-латротоксину, имеет гидрофобные домены и близкое значение pl. Значительное количество р120 было обнаружено только в элюатах с а-латротоксин-агарозы [рис. 2).

Затем была проанализирована экспрессия растворимой и мембранной форм CIRL1 и мутанта CIRL1 Т/Р в трансфецированных COS-клетках. CIRL1 Т/Р содержит точечную замену Т838 на Р в GPS-домене рецептора, которая препятствует протеолитическому расщеплению молекулы предшественника. Ранее было показано, что эта мутация полностью блокирует протеолиз в GPS-домене рецептора, при этом полноразмерная мутантная форма рецептора на

поверхности клетки отсутствует. В случае диссоциации субъединиц, р120-субъединица мутантного рецептора не должна обнаруживаться во внеклеточной среде.

Рис. 2. Вестерн-блоттинг белков, выделенных из растворимого экстракта мозга крысы (LTx - на латротоксин-агарозе, BSA - на BSA-агарозе). Окрашивание антителами к р120-субъединице CIRL1. Слева указано положение белковых маркеров в геле.

Для преципитации внеклеточных белков среду, на которой росли трансфецированные клетки, отбирали и подвергали хроматографии на а-латротоксин-агарозе. Сорбированные белки анализировали с использованием Вестерн-блоттинга с последующей окраской антителами к р120-субъединице CIRL1. Значительное количество растворимого р120 было обнаружено в среде клеток, экспрессирующих рецептор дикого типа. Однако даже большее количество р120 присутствовало в среде клеток, экспрессирующих мутантную форму рецептора (рис. 3, левая панель], что контрастировало с данными об отсутствии полноразмерной мутантной формы CIRL1 Т/Р на поверхности клетки.

170 —

130 —

95 — 72 —

Рис. 3. Вестерн-блоттинг лизатов клеток (средняя и правая панель) и белков, преципитированных из внеклеточной среды (левая панель). К - нетрансфецированные клетки, Ш - клетки, экспрессирующие СЖ1Л, Т/Р - клетки, экспрессирующие спид Т/Р. Снизу указаны антитела, которыми окрашены соответствующие блоты. Слева указано положение белковых маркеров в геле.

К Т/Р WT К Т/Р WT К Т/Р WT

— ** * ш

anti-p120 CIRL1 anti-p120 CIRL1 anti-p85 CIRL1

anti-p120 C1RL1

Дополнительно был проанализирован трафик растворимых делеционных мутантов CIRL1. Был экспрессирован белок ecCIRL, который представляет собой растворимый эктодомен рецептора CIRL1, состоящий из р120-субъединицы и небольшого N-концевого фрагмента р85, и содержит на С-конце Мус- и 6xHis-Tarn (рис. 4А). Кроме того была получена похожая конструкция, содержащая точечную замену Т838 на Р в GPS-домене белка (ecCIRL Т/Р). При экспрессии в COS-клетках оба белка секретировались во внеклеточную среду. Белки из внеклеточной среды сорбировали на WGA-агарозе (Wheat germ agglutinin). Данный сорбент используется для очистки гликозилированных белков. Связавшиеся белки элюировали буфером, содержащим 0.5 М Ы-ацетил-В-глюкозамин и анализировали с использованием Вестерн-блоттинга. Белок ecCIRL успешно подвергался протеолизу в GPS-домене, тогда как ecCIRL Т/Р не расщеплялся совсем так же, как и полноразмерный белок, содержащий аналогичную мутацию в GPS-домене (рис. 4Б). Следовательно, внутриклеточный протеолиз не является необходимым условием для секреции растворимой формы CIRL1.

А

ecCIRL

ecCIRL Т/Р

Рис. 4. А. Схематичное изображение

делеционных конструкций есСЖЬ и

есСЖЬ Т/Р.

Б. Вестерн-блоттинг белков, сорбированных из внеклеточной среды на \МСА-агарозе, окрашенных антителами к р120-субъединице СЖЬ1 и к Мус-тагу.

Самым простым объяснением присутствия растворимой формы CIRL1 во внеклеточной среде могла бы быть диссоциация р120- и р85-субъединиц. Однако это не согласуется с обнаружением растворимой формы

ecCIRL ecCIRL -1D, ecCIRL Т/Р

—

а-р120 CIRL а-Мус

непротеолизируемого мутантного рецептора (рис. 3, левая панель). В связи с этим было выдвинуто предположение, что CIRL1 может дополнительно подвергаться протеолизу, приводящему к диссоциации р120/р85 комплекса. Наиболее вероятным казалось предположение, что сайты первичного и вторичного протеолиза отличаются. И в том случае, если сайт вторичного протеолиза находится между сайтом первичного протеолиза и первым трансмембранным сегментом, мы должны детектировать отщепленный пептидный фрагмент, связанный с р120. Удалось обнаружить этот фрагмент, связанный с растворимой р120-субъединицей. Из внеклеточной среды COS-клеток, экспрессирующих CIRL1, на а-латротоксин-агарозе была выделена р120-субъединица, а затем полученный образец был проанализирован масс-спектрометрией. Был обнаружен пептид с m/z 1750.9 (рис. 5), что соответствует рассчитанной массе протонированного 15-ти членного пептида TNFAVLMAHREIYQG (1751.0), который мог образовываться в результате двухступенчатого протеолиза в GPS-домене, по связям L837-T838 и Ge52-R853.

Для того чтобы подтвердить физиологическую значимость наблюдаемого явления масс-спектрометрией был проанализирован растворимый фрагмент CIRL1, выделенный из водного экстракта крысиного мозга. Был обнаружен пептид такой же массы, его последовательность была далее подтверждена MS/MS анализом (рис. 6).

Таким образом, было установлено, что часть субъединиц рецептора CIRL1 диссоциирует при физиологических условиях, в результате чего р120 секретируется во внеклеточную среду. Диссоциация происходит при участии мембрано-ассоциированной протеазы, которая отщепляет N-концевой пептид р85-субъединицы в непосредственной близости от мембраны. В результате этого протеолиза р120-субъединица диссоциирует с поверхности клетки в комплексе с коротким пептидным фрагментом р85.

Свидетельством в пользу предложенного механизма диссоциации субъединиц CIRL1 являются также эксперименты по экспрессии в эукариотических клетках полноразмерной и мутантной форм рецептора. Ранее было показано, что мутация Т838Р в GPS-домене CIRL1 приводит к полной устойчивости рецептора к внутриклеточному протеолизу. При этом не удавалось детектировать р120-субъединицу на поверхности клеток. Присутствие р120 во внеклеточной среде клеток, экспрессирующих непротеолизируемую форму CIRL1, нельзя объяснить обычной диссоциацией субъединиц. Данное наблюдение свидетельствует в пользу предложенной гипотезы о расщеплении рецептора второй протеазой.

Relative Intensity

50-

2752.3

Рис. 5. MALDI-TOF спектр пептида, выделенного совместно с р120-субъединицей из внеклеточной среды COS- клеток, экспрессирующих CIRL1. В качестве внутренних стандартов были использованы ангиотензин (standart I, М + Н* 1297.5) и синтетический пептид (standart II, М + Н* 2752.3).

Ыого — 216.10 363.17 434.20 533.27 646.36 777.40 848.43 985.49 1141.59 1270.64 1383.72 1546.78 1674.84

Н - Т N РАХ/ЬМАНРЕ I УОЭ -ОН

уюпэ — 1648.83 1534,78 1387.72 1316.68 1217.61 1104.53 973.49 902.45 765.39 609.29 480.25 367.16 204.10 76.04

М22*

692.27

уб

765.53

875 4409 (МНгг*) 875.9418

3?5 С 375« £?5В 8775

М42*

838.07 у8

973.52

у9

1104.70

уЗ Ь5

ьи2*-

25 ЬЗ 36733 533.38 63б10 ;

363.11

У7 Ь9

902 32 985 40

уЮ

1217.58 ь12

138332

У11

[!|ШШ

: {

300 400 500 600 700 800 800 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Рис. 6.[/Щ-ОгЬ^гар ЬС-МБ/МБ спектр пептида, выделенного совместно с р120-субъединицей из растворимого экстракта мозга крысы. На спектре отмечены массы Ь и у ионов, образующихся в результате расщепления пептида ТЫРАУЬМАНРиЛУС^С. В правом верхнем углу МБ-спектр иона пептида-предшественника, несущего двойной заряд с т/г 875.4407.

Непосредственным доказательством вторичного протеолиза является обнаружение пептидного фрагмента, ассоциированного с р120-субъединицей рецептора. Причем один и тот же пептидный фрагмент был обнаружен как в водных экстрактах мозга, так и в среде клеток, экспрессирующих СШЬ1. Сайт вторичного расщепления не является характерным для каких-либо известных протеиназ. Выравнивание аминокислотных последовательностей различных адгезионных СРСЯя не выявило существенной гомологии в этой области (рис.

п

С1Ы.1_га1 (01:2239297) ........САСЗНЬТЫГАУЬМА-----НКЕ1-У0СЯ1Ы—

CIRI,2_rat (01:3766205) .......САСЗНЬТИРМЬМА------НЕЕ1УУК00УН—

С1КЬЗ_га1 (01:3882981) ........СЭСЫНЬТЫГАУЬМА-----НУЕУКНЗОАУН--

СРК56_тоизе (01:31982718) ........СЬСЫНЬТУГАУШУЗЗТЕУЕАТНКНУЬТ—

0Р1156_Ьитап (01:19923768) .......СГСЫНЬТУРАУШУЗЗУЕУОАУНКНУЬБ —

ЕТЬ_гаЪ (01:11560111) .........СКСЗНЬТНРА1ЬМ5РЗТ31ЕУКПУЫ1ЬТК-

СВ97_Ьитап (01:6226566) .......С(2СЗН1,ЗЗГТ1ША----НУОУЕОИКЬТ-----

ЕМЯ4_тоизе (01:15528829) .........СКСГНЬЗЗГАУЬМА-----ЬРНЕЕОСУЬ---

1С-НЕРТА_гаЪ (01:5525078) ........СКСМНЬТЗГЗИЖ-------РПЗРОРОЗЫ,К1

НЕ-6_Ьитап (01:5031733) .......... СТСЗНЬТЭГОУЬЬО----ЬЗИТЗУЬ-----

ВА11_Ьитап (01:10719900) .........С1,С0К1,ЗТРА1ЪА01,-—ЗАОАШЕКА-Т--

ВА13_Ьитап (И:12643618) ..........СЬСОКЬЗТГА1ЬА00--РКЕ11МЕЗЗОТР-

ВА12_1ттап (01:10719903) .........СОСОНЬЗТГАУЬАОР—РКПЬТЬЕЬАОЗ-

* * • * • ★ • *

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей некоторых адгезионных С-белоксопряженных рецепторов в области СРБ-домена. Черной стрелкой указан сайт первого протеолиза, серой стрелкой указан сайт второго протеолиза в СПИЛ. В скобках указан номер доступа аминокислотной последовательности в базе данных СепВапк.

1.2 Комплекс субъединиц р120/р85 СШЫ на поверхности клеточной мембраны

Установлено, что часть субъединиц рецептора СШЫ диссоциирует при физиологических условиях. Диссоциация происходит при участии мембраноассоциированной протеазы. Однако оставалось неясным, образуют ли субъединицы рецептора нековалентный комплекс на плазматической мембране или они локализованы независимо. Согласно гипотезе о независимом расположении субъединиц СШЫ субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембрано-связанными. Они ведут себя как

независимые мембранные белки, но при этом способны заново ассоциировать при взаимодействии р120 с агонистом, а также при солюбилизации в растворах, содержащих Triton Х-100.

Одним из доводов в пользу независимого расположения субъединиц рецептора на мембране была различная солюбилизация белков перфтороктановой кислотой (PFO). При низких концентрациях (0.1-0.6%) PFO в растворе обнаруживался только р120, тогда как весь р85 оставался в клеточном осадке. Это объяснялось частичной солюбилизацией плазматической мембраны, а не разрушением комплекса между субъединицами рецептора. Для того чтобы исключить такую возможность был проделан эксперимент, в котором обработке PFO подвергались очищенные белки ecCIRL и ecCIRL Т/Р (рис. 4А]. Данные белки представляют собой растворимый эктодомен рецептора CIRL1, содержат на С-конце Мус- и 6xHis-таги и экспрессируются во внеклеточную среду.

Эукариотические клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими ecCIRL и ecCIRL Т/Р. На третий день после трансфекции среду отбирали и инкубировали ее с WGA-агарозой. Связавшиеся белки элюировали буфером, содержащим 0.5 М М-ацетил-В-глюкозамин. Для того чтобы проверить, не разрушаются ли рецепторные комплексы под воздействием перфтороктановой кислоты очищенные белки ecCIRL и ecCIRL Т/Р наносили на Ni-агарозу в присутствии и в отсутствие 0.5% PFO. В отсутствие PFO р120-субъединица ecCIRL успешно преципитировалась на Ni-агарозе за счет взаимодействия с N-концевым фрагментом р85, тогда как присутствие в буфере PFO препятствовало преципитации р120 (рис. 8]. Таким образом PFO разрушает комплекс между р120- и р85-субъединицами, не влияя на связывание белков с Ni-агарозой, что было показано в контрольном эксперименте с непротеолизируемой формой ecCIRL. Белок ecCIRL Т/Р успешно сорбировался на Ni-агарозе как в присутствии, так и в отсутствие PFO.

Рис 8. Обработка эктодоменов СШЫ перфтороктановой кислотой. Вестерн-блоттинг белковых

фракций, после преципитации на №-агарозе в присутствии (+) и в отсутствие (-) РРО, окрашенных антителами к р120-субъединице СШЫ и к Мус-тагу.

ecCIRL ecCIRL Т/Р ecCIRL ecCIRL Т/Р

- + - + - + ■ +

шщ&р шищф

anti-p120 CIRL1 anti-Myc

Для прояснения данных об ассоциации независимых субъединиц р120 и р85 при солюбилизации детергентом, были получены несколько конструкций СШЫ с субъединицами разного размера (рис. 9). Конструкция НА-СЖЫ представляет собой полноразмерный рецептор с НА-тагом на Ы-конце р120-субъединицы, НА-СІШЛ-СРР отличается от предыдущей наличием зеленого флуоресцентного белка (ЄРР] на С-конце р85-субъединицы, а 7-6 СІЯІЛ-СРР имеет укороченную р120-субъединицу. Данный подход позволяет различать эти субъединицы на одном блоте и определять количество каждой формы после иммунопреципитации.

HA-CIRL1 Ж

7-6 CIRL1-GFP

HA-CIRL1-GFP [Ж

внешняя '—1 внутренняя

ПМ

Рис. 9. Схематичное изображение химерных белков HA-CIRL1, 7-6 CIRL1-GFP, HA-C1RL1-GFP.

Эукариотические клетки трансфецировали отдельно плазмидами, кодирующими белки HA-CIRL1, 7-6 CIRL1-GFP, HA-CIRL1-GFP, а также совместно плазмидами, кодирующими HA-CIRL1 и 7-6 CIRL1-GFP. Все гибридные белки эффективно экспрессировались в COS-клетках (рис. 10А, Б).

Для детекции только поверхностных белков неразрушенные клетки обрабатывали биотином, а затем инкубировали с антителами к НА-тагу. Далее клетки лизировали в буфере, содержащем Triton Х-100. Белки, связавшиеся с антителами, преципитировали на белок А-сефарозе.

лизаты клеток К 1 2 3 2+3 лизаты клеток К 1 2 3 2+3

100 — 72 — •в и р» 170 — р85-СРР 130 — —р85 95 — -4— р120 7-6-р120

апй-р85 ап!(-р120

!Р: апИ-НА 1Р: апИ-НА

1 2 3 2+3 1 2 3 2+3

100 — 100 — -4—р85-СРР щ ^ — р85-СРР

72 — 72 — — р85

апИ-р85 апй-вРР

Д

. р120 ■ 7-6-р120

1 -НА-С^И-СРР

2 -7-6-С1РИ-СРР

3 -НА-С^И

Рис. 10. Иммунопреципитация химерных конструкций СНУ,. (А, Б) Вестерн-блоттинг лизатов трансфецированных СОБ-клеток; (В-Д) Вестерн-блоттинг белков, иммунопреципитированных на антителах к НА-тагу (1Р: апй-НА). Сверху цифрами указаны конструкции, которыми трансфецировали или ко-трансфецировали СОБ-клетки: К -контроль, нетрансфецированные клетки; 1 - клетки, экспрессирующие НА-С1ШЛ-СРР; 2-76 СШИ-СИР; 3 - НА-СШЫ. Снизу указаны антитела, которыми окрашивали вестерн-блоты; слева - положение белковых маркеров в геле. Стрелками обозначены соответствующие субъединицы рецепторов.

Если бы р120-субъединица С1ШЛ была независимым мембранным белком, и солюбилизация клеток детергентом сопровождалась ассоциацией

13

комплементарных субъединиц, то с равной вероятностью можно было бы обнаружить в клетках, коэкспрессирующих НА-СЖЫ и 7-6 СШИ-СИР, комплексы р120/р85 и р120/р85-СРР. И действительно антитела к НА-тагу преципитировали не только р85-субъединицу, но и р85-СРР (рис. 10В, Г], однако с очень низкой эффективностью. Если принять количество преципитированного белка р85 за 100 %, то количество преципитированного р85-СРР составит только 8%. Возможным объяснением наблюдаемому явлению копреципитации может быть олигомеризация белков НА-СЖЫ и 76 С1КЫ-СРР на клеточной мембране. В этом случае в соответствующем преципитате должно обнаруживаться также равное количество 7-6 р120-субъединицы. Биотинилирование клеток и последующее окрашивание иммунопреципитированных белков стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (кй'-НЯР] позволило обнаружить субъединицу 7-6р120 (рис. 10Д). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что рецептор СШЫ существует на плазматической мембране в виде нековалентного комплекса р120 и р85-субъединиц.

Для того чтобы непосредственно детектировать существование рецепторных комплексов на плазматической мембране была получена генноинженерная конструкция, кодирующая полноразмерный рецептор СЖЫ, в который ввели сайт расщепления тромбином (Й1Г-С1ШЛ). Сайт протеолиза был введен во внеклеточную часть р85-субъединицы между СРЭ-доменом и первым трансмембранным сегментом (рис. 11).

Рис. 11. Схематичное изображение химерного белка Лг-СШЫ, содержащего сайт расщепления тромбином.

В том случае, если рецептор образует гетеродимерный комплекс на поверхности клетки, обработка тромбином эукариотических клеток, экспрессирующих Шг-СЖЫ, должна приводить к высвобождению р120-субъединицы во внеклеточную среду.

«н-сши

пм

Клетки, экспрессирующие Лг-СШИ и СШИ, инкубировали в буфере, содержащем тромбин, в контрольном эксперименте клетки инкубировали в буфере без добавления тромбина. Затем для преципитации р120-субъединицы внеклеточную среду инкубировали с а-латротоксин-агарозой, а клетки

лизировали непосредственно в буфере для нанесения на электрофорез. Далее клеточные лизаты и элюаты с а-латротоксин-агарозы подвергали Вестерн-блоттингу с последующим окрашиванием антителами к р120-субъединице СШЫ. Химерный белок Й1Г-С1ЯЬ1 при экспрессии в СОЗ-клетках подвергался эндогенному протеолизу подобно рецептору дикого типа (рис. 12, верхняя панель). Только в случае клеток, экспрессирующих Лг-СШЫ и обработанных тромбином, удалось выделить р120 из внеклеточной среды. Эти данные свидетельствуют о существовании гетеродимерного комплекса на

плазматической мембране (рис. 12, нижняя панель).

Рис. 12. Вестерн-блоттинг лизатов СОБ-клеток, экспрессирующих СНЯЛ и Й1Г-СШ1Л (верхняя панель) и белков, преципитированных из внеклеточной среды (нижняя панель). К - контроль, нетрансфецированные СОБ-клетки. Окрашивание антителами к р120-субъединиде С1Л1Л. Слева указано положение белковых маркеров в геле.

Таким образом, в экспериментах с использованием различных химерных форм СПИЛ получено подтверждение того, что на мембране рецептор присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85.

1.3 Модель биосинтеза СШЫ

Полученные результаты позволяют выдвинуть следующую модель биосинтеза СІИІЛ, включающую две стадии протеолитического процессинга (рис. 13). На первой стадии СІМЛ расщепляется с высокой эффективностью в эндоплазматическом ретикулуме неидентифицированной протеиназой. Сайт этого расщепления расположен в СРБ-домене, находящемся во внеклеточной части и непосредственно примыкающим к первому трансмембранному сегменту рецептора. Продукты расщепления, гидрофильная субъединица р120 с модулями клеточной адгезии и трансмембранная субъединица р85, образуют

170 — 130 —

95 —

72 —

170 —

130 —

95 — 72 —

СІР!1-1 «іг-СІІ*и К

апіі-р120С1^1

устойчивый нековалентно связанный комплекс. Далее гетеродимерный комплекс транспортируется на поверхность клетки через аппарат Гольджи, где происходит присоединение сложных углеводных цепей. На поверхности цитоплазматической мембраны другая мембрано-связанная протеиназа осуществляет дополнительное расщепление С1ЯЬ1 во внеклеточной части р85 в непосредственной близости от мембраны. Данному расщеплению подвергается лишь малая часть рецепторов. В результате вторичного протеолиза, р120 отделяется от мембраны в виде комплекса с небольшим пептидным фрагментом р85 (рис. 13, левая часть]. Во внеклеточной среде данные растворимые комплексы могут независимо взаимодействовать с другими белками клеточной адгезии или мембранными рецепторами.

ЭПР

\

С1т_1

Рис. 13. Модель биосинтеза СЛИЛ. Серой толстой линией обозначена р120-субъединица СШЫ, черной линией - р85-субъединица. ЭПР - эндоплазматический ретикулум.

Доказательством двойного специфичного расщепления СШЫ является масс-спектрометрическая идентификация пептидного фрагмента, соответствующего по массе продукту двойного расщепления рецептора.

16

Поскольку данный пептид был выделен на а-латротоксин-агарозе, то очевидно он образует устойчивый комплекс с р120-субъединицей. Таким образом, наличие растворимой формы С№Ы может быть объяснено не диссоциацией р120 и р85, а отщеплением того короткого фрагмента р85, который отвечает за взаимодействие с р120. Обнаружение пептида одинаковой массы как в среде трансфецированных С05-клеток, так и в водном экстракте мозга крысы свидетельствует о физиологической значимости наблюдаемого явления.

Проведенный ранее анализ экспрессии СІЯІЛ дикого типа и его Т/Р-мутанта, устойчивого к внутриклеточному протеолизу, показал, что полноразмерная мембранная форма мутантного рецептора практически отсутствует на поверхности клетки. В то же время удалось обнаружить растворимую форму мутантного рецептора во внеклеточной среде в более высокой концентрации, чем растворимую форму рецептора дикого типа. Эти данные в совокупности с данными об отсутствии мембранной формы рецептора на поверхности клетки свидетельствуют о полном расщеплении мутанта внеклеточной протеазой (рис. 13, правая часть).

Таким образом, СШЫ дикого типа расщепляется с высокой эффективностью внутриклеточной протеазой и в незначительной степени второй, внеклеточной протеазой. СІЯ1,1 Т/Р мутант не расщепляется первой протеазой совсем, но при этом весьма эффективно расщепляется второй внеклеточной протеазой. Можно предположить, что внеклеточный протеолиз является регулируемым процессом, и при этом существует функциональная связь между первичным и вторичным протеолизом.

Эксперименты с растворимыми делеционными мутантами С1ЯЫ на основе его Ы-концевого эктодомена служат подтверждением предлагаемой модели процессинга СІШЛ. Они также предоставили дополнительную информацию о локализации двух протеаз, расщепляющих СШЫ. Так же как и полноразмерный СІМА, его эктодомен, соединенный с шус-зпитопом, расщепляется первой внутриклеточной протеазой, в то время как растворимый Т/Р мутант не расщепляется совсем (рис. 4). В то же время Т/Р растворимый мутант не расщепляется и второй, внеклеточной протеазой. Можно заключить, что первая внутриклеточная протеаза расщепляет эффективно и мембранную и растворимую формы СШІЛ, в то время как вторая внеклеточная протеаза расщепляет только мембранные белки. Характеристики второго расщепления позволяют предположить, что внеклеточная протеаза может быть одной из так называемых шеддаз, отщепляющих эктодомены трансмембранных белков. Шеддазы выполняют различные функции. Они активируют некоторые рецепторы, высвобождают

агонист, связавшийся с рецептором, что позволяет агонисту стимулировать рецепторы на поверхности других клеток. Шеддазы участвуют в секреции гормонов, образующихся из мембрано-связанных предшественников, а также в регуляции поверхностной экспрессии многих интегральных мембранных белков.

Можно предположить, что двухступенчатый протеолитический процессинг представляет собой регуляторный механизм, помогающий контролировать поверхностную экспрессию рецептора С1МЛ.

3, Идентификация белков в составе комплексов с рецептором С1ШЛ

Функция рецептора С1ШД неизвестна. В связи с этим на данный момент является актуальным поиск белков, взаимодействующих с рецептором. В качестве инструмента исследования был выбран а-латротоксин. Латротоксин, выделяемый из яда паука каракурта, является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиаторов путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул. Действие латротоксина определяется наличием специфических белков на поверхности клетки, с которыми токсин связывается с высокой аффинностью в наномолярном диапазоне. Известны три мишени а-латротоксина в нервных тканях: нейрексин или

кальцийзависимый рецептор, кальцийнезависимый рецептор С1МЛ и рецепторподобная тирозинфосфатаза а (РТРа). Данные белки не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам интегральных мембранных рецепторов. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембранным сегментом, С1КЫ принадлежит семейству С-белоксопряженных рецепторов. РТРа является мембранной тирозинфосфатазой, состоящей из двух субъединиц р80 и р70. Все три рецептора имеют большие внеклеточные домены со структурными мотивами, характерными для белков клеточной адгезии, что и предполагает их роль в активации внутриклеточного сигнального каскада за счет прямых межклеточных контактов.

В данной работе было осуществлено выделение белковых комплексов из мозга крыс аффинной хроматографией на ос-латротоксине и антителах к цитоплазматической части р85-субъединицы СШЫ.

Грубую фракцию мембран мозга крысы солюбилизировали неионным детергентом тритоном Х-100 и хроматографировали на сорбенте с иммобилизованным а-латротоксином согласно двум ранее разработанным методикам. Методики различаются присутствием/отсутствием кальция в буферах для хроматографии, что позволяет выделять отдельно белковые комплексы кальцийзависимого рецептора (нейрексина) и

18

кальцийнезависимого рецептора (СШЫ). Были использованы оба подхода, так как взаимодействие СПИЛ с внеклеточными белками мозга может быть кальцийзависимым.

Согласно первой методике, хроматографию проводили в присутствии СаСЬ. Элюцию белков осуществляли в три стадии буфером, содержащим: 1) 0.5 М КС1 и 2 мМ СаСЬ; 2] 1 М КС1 и 2 мМ СаСЬ; 3} 1 М КС1 и 10 мМ ЕОТА. При использовании этой методики выделяются белковые комплексы как с кальцийзависимым нейрексином, так и с СШЬ. При этом нейрексин элюируется с колонки при введении в буфер ЕБТА, тогда как СШЬ и ассоциированные с ним белки распределены по всем фракциям элюции (рис. 14А].

М, кДа

116 — 66 —

45 — 35 —

25 —

Рис. 14. Анализ белкового состава фракций с помощью SDS-электрофореза в 10% ПААГ после хроматографии экстракта мембран крысиных мозгов на а-латротоксин-сефарозе (А) в присутствии ионов кальция: 1 - элюция 0.5 М КС1 в присутствии 2 мМ СаСЬ, 2 - 1 М КС1 в присутствии 2 мМ СаСЬ, 3 - IM КС1 и 10 мМ EDTA, 4 - контрольная хроматография на BSA-сефарозе; (Б) в отсутствии ионов кальция: 1 - элюция 0.5 М КС1, 2 - элюция 1 М КС1, 3 -контрольная хроматография на BSA-сефарозе. Стрелками показаны идентифицированные белки. Цифры рядом со стрелками соответствуют нумерации белков в таблице. Буквами обозначены: С - р120-субъединица CIRL1, Н - нейрексин; слева указано положение белковых маркеров в геле.

Вторая методика была использована для выделения белковых комплексов только кальцийнезависимого рецептора. Хроматографию проводили в буферах, не содержащих ионы кальция, связавшиеся белки элюировали 0.5 и 1 М КС1 в отсутствие Са2+ (рис. 14Б). В качестве отрицательного контроля для обнаружения белков, неспецифически связывающихся с сорбентом за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий была использована сефароза с иммобилизованным BSA. Для того чтобы отдельно выделить белковые комплексы CIRL1, были получены также антитела, специфичные к р85-субъединице CIRL1, которые использовались в качестве лигандов. Аффинную хроматографию мембранных экстрактов на анти-р85-сефарозе проводили в отсутствие ионов кальция. Контролем служили преиммунные антитела, иммобилизованные на сефарозе (рис. 15).

Рис. 15. Анализ белкового состава фракций с помощью SDS-электрофореза в 10% ПААГ после иммунноаффинной хроматографии экстракта мембран крысиных мозгов, а -контрольная хроматография на преиммунных антителах, 6 -хроматография на антителах к р85-субъединице CIRL1. Элюцию белков проводили 0.1 М раствором глицина (pH 2.8].

Фракции на каждой стадии элюции объединяли, высаживали смесью метанол-хлороформа и анализировали с использованием SDS-гель-электрофореза. Для дальнейшей идентификации выбирали те белковые полосы, которые присутствовали только в элюатах после аффинной хроматографии на специфических лигандах и не наблюдались в элюатах после контрольной хроматографии. Идентификацию белков проводили согласно протеомному протоколу, который включает протеолитическое расщепление белка в геле трипсином, а затем составление его пептидной карты с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения.

Полученные результаты представлены в таблице. Были идентифицированы 8 белков, среди которых присутствуют структурные белки (актин и основной белок миелина), белки, участвующие во внутриклеточной передаче сигналов (а-субъединица казеинкиназы 2, а-субъединица С„-белка),

1 2

ни

34 —

!

белки, участвующие в эндоцитозе (адаптерный белковый комплекс 2, ЯаЫО), а также белок №рБпар1.

Актин присутствует во всех клетках эукариот [10-15% по массе от всех белков]. Наличие актина и основного белка миелина во фракциях, полученных в результате аффинной хроматографии на иммобилизованном токсине, может быть обусловлено, прежде всего, неспецифичным взаимодействием этих белков с а-латротоксин-сефарозой.

Таблица. Белки крысиного мозга, идентифицированные в составе белковых комплексов с рецепторами а-латротоксина.

N Название белка Масса, кДа Номер доступа в базе данных SwissProt Условия выделения

1 СТР-связывающий белок С0, субъединица а 39 Р59215 Хроматография на а-латротоксин-сефарозе; элюция 1 М КС1 и 10 мМ EDTA

2 Актин 42 Р60711 Хроматография на а-латротоксин-сефарозе; элюция 1МКС1

3 ИаЫО 23 Р35281

4 №рБпар1 33.5 055125

5 Казеинкиназа 2, субъединица а 45 Р19139 Хроматография на а-латротоксин-сефарозе; элюция 0.5 М КС1

6 Основной белок миелина [МБР] 22 Р02688

7 АР2-комплекс, субъединица р-1 104.5 Р62944 1. Хроматография на а-латротоксин-сефарозе; элюция 0.5 М КС] 2. Хроматография на анти-р85-сефарозе

8 АР2-комплекс, субъединица ос-2 104 Р18484 Хроматография на анти-р85-сефарозе

Известно, что активация С-белоксопряженных рецепторов стимулирует их эндоцитоз, что приводит к снижению чувствительности клеток к агонистам

рецепторов. В данный процесс вовлечены внутриклеточные сигнальные и адаптерные белки, такие как аррестины, протеинкиназы и клатрин. Идентификация в составе рецепторного комплекса а- и [5-субъединиц адаптерного белкового комплекса 2 (АР2), а также белка RablO

свидетельствует в пользу выдвинутого ранее предположения о вовлечении CIRL в процессы эндоцитоза.

Белки семейства Rab, принадлежащие к суперсемейству Ras малых GTP-аз, являются регуляторами внутриклеточного транспорта. Внутри семейства Rab наблюдается высокая консервативность аминокислотных последовательностей, причем, основные различия локализованы в С-концевой части, которая служит сигнальной областью для специфичного взаимодействия с внутриклеточными мембранами-мишенями. Белок RablO, идентифицированный в составе белковых комплексов, принадлежит к семейству Rab, включающему Rab8 и Rabl3. Предполагается, что RablO участвует во внутриклеточном транспорте. Например, в поляризованных эпителиальных клетках MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) RablO регулирует везикулярный транспорт от базолатеральных сортирующих эндосом к обычным эндосомам. Существуют также данные о том, что в клетках Caenorhabditis elegans RablO циркулирует между ранними эндосомами и синаптической мембраной.

Адаптерный белковый комплекс 2 (АР2), как было показано, вовлечен в формирование клатринпокрытых везикул, участвуя таким образом в клатринзависимом эндоцитозе. Идентификация субъединиц адаптерного белкового комплекса 2 во фракциях, полученных в ходе хроматографии на а-латротоксин-сефарозе в отсутствие ионов кальция, а также в результате хроматографии на антителах к р85-субъединице CIRL1, свидетельствует в пользу того, что с АР2 взаимодействует именно CIRL1, а не другие рецепторы а-латротоксина.

Идентификация а-субъединицы Go-белка в составе кальцийзависимых белковых комплексов подтверждает опубликованные ранее данные о взаимодействии CIRL1 с этим G-белком, причем, необходимым условием этого взаимодействия было наличие ионов магния. Показано, что Go-белок, экспрессирующийся, в основном, в мозге, участвует в регуляции кальциевых каналов и может образовывать с ними в присутствии синтаксина 1 тройной комплекс, функционирующий в пресинаптических окончаниях, предположительно, в местах выброса нейромедиаторов.

Фосфорилирование белков играет важную роль во многих клеточных процессах, в том числе и в передаче сигнала в клетке. Известно, что казеинкиназа 2, идентифицированная в комплексе с кальцийнезависимым

рецептором, может влиять на синаптическую активность, вероятно, посредством фосфорилирования пре- или постсинаптических субстратов. Так, при длительной потенциации синапсов наблюдается увеличение активности казеинкиназы 2. Эти данные, наряду с данными о фосфорилировании синаптотагмина, синтаксина, VAMP2 - белков, играющих ключевую роль в экзоцитозе, казеинкиназой 2, подтверждают участие этого фермента в передаче внутриклеточного сигнала от рецепторов а-латротоксина.

Предполагается, что белок NipSnapl (4-nitrophenylphosphatase domain and non-neuronal SNAP25-like protein homologl), обнаруженный во фракциях, полученных в результате аффинной хроматографии на а-латротоксин-сефарозе в отсутствие ионов кальция, вовлечен в транспорт везикул. NipSnapl был обнаружен в постсинаптических уплотнениях, причем его количество зависело от синаптической активности. В связи с этим было выдвинуто предположение о том, что NipSnapl играет важную роль в передаче сигналов или регуляции цитоскелета в постсинаптических уплотнениях.

Таким образом, в дополнение к ранее известным партнерам рецепторов а-латротоксина, нами обнаружено 8 белков. Их анализ в совокупности позволяет предположить участие рецепторов а-латротоксина в процессах эндоцитоза и передачи внутриклеточных сигналов.

Выводы

1. Показано, что на клеточной мембране рецептор CIRL1 присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85.

2. Обнаружено, что малая часть комплексов рецептора CIRL1 диссоциирует с поверхности клетки с образованием растворимого эктодомена рецептора, который представляет собой комплекс р120-субъединицы и короткого внеклеточного фрагмента р85-субъединицы

3. Показано, что диссоциация субъединиц рецептора является результатом вторичного протеолиза в GPS-домене рецептора по связи, локализованной в области между сайтом первичного протеолиза и первым трансмембранным сегментом.

4. Проведен поиск белков, способных взаимодействовать с рецептором CIRL1. Идентифицирован ряд белков, в числе которых структурные белки, внутриклеточные сигнальные белки, а также белки, участвующие в эндоцитозе и транспорте синаптических везикул. Выдвинуто предположение об участии рецептора CIRL1 в процессах эндоцитоза и передачи внутриклеточных сигналов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Serova 0. V., Popova N. V., Petrenko A. G., Deyev I. E. "Association of the subunits of the calcium-independent receptor of a-latrotoxin" Biochem Biophys Res Commun., 2010, 402(4), 658-662.

2. Krasnoperov V., Deyev I.E., Serova O.V., Xu C., Lu Yun, Buryanovsky L„ Gabibov A.G., Neubert T.A., and Petrenko A.G. "Dissociation of the Subunits of the Calcium-Independent Receptor of a-Latrotoxin as a Result of Two-Step Proteolysis", Biochemistry, 2009, 48(14), 3230-3238.

3. Серова O.B., Попова H.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. "Идентификация белков в составе комплексов с рецепторами альфа-латротоксина", Биоорганическая химия, 2008,34(6), 747-753.

Тезисы докладов на конференциях

1. Serova Q.V.. Popova N.V., Deyev I.E., Petrenko A.G. "Dissociation of the subunits

of the adgesion G-protein coupled receptor CIRL1”, The 4th international IMBG conference for young scientists "Molecular biology: advances and

perspectives", Kyiv, Ukraine, 2011, September, 14-17.

2. Серова O.B., Попова H.B., Деев И.Е., Петренко А.Г. "Особенности субъединичной структуры адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL1", V Российский симпозиум "Белки и пептиды", Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.

3. Серова О.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. "GPS-содержащие G-белоксопряженные рецепторы из Monosiga brevicollis", IV Российский симпозиум "Белки и пептиды", Казань, 23-27 июня 2009

4. Серова О.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. "Функциональное исследование гибридного G-белоксопряженного рецептора" 12-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 10-14 ноября 2008

Заказ № 6597 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Серова, Оксана Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

на правах рукописи

61 12-2/357

Серова Оксана Викторовна

ОСОБЕННОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССИНГА И СУБЪЕДИНИЧНОЙ СТРУКТУРЫ АДГЕЗИОННОГО С-БЕЛОКСОПРЯЖЕННОГО РЕЦЕПТОРА СЖЬ

специальность - 03.01.04 - биохимия ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., зав.лаб. А.Г. Петренко

к.физ-мат.н., с.н.с. И.Е. Деев

Москва 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................8

1. Общая характеристика адгезионных G-белоксопряженных рецепторов...............................................................................................................8

1.1. Рецепторы иммунной системы..................................................................13

1.2. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL.........................15

1.3. Рецепторы CELSR/Flamingo........................................................................19

1.4. Рецепторы BAI...............................................................................................20

1.5 Другие адгезионные рецепторы................................................................25

2. Особенности субъединичной структуры адгезионных GPCR.............30

2.1. Протеолитический процессинг адгезионных GPCR в GPS-домене.....30

2.2. Дополнительный протеолитический процессинг адгезионных GPCR, растворимые фрагменты рецепторов.........................................................................32

2.3. GPS-подобные домены в других рецепторах..........................................33

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.........................................35

1. Особенности субъединичной структуры рецептора CIRL1.................35

1.1. Диссоциация субъединиц рецептора CIRL1............................................37

1.2 Комплекс субъединиц р120/р85 CIRL1 на поверхности клеточной мембраны......................................................................................................................44

1.3 Модель биосинтеза CIRL1...........................................................................50

2. Идентификация белков в составе комплексов с рецептором CIRL1 ..54

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............................................................................66

1. Материалы...................................................................................................66

1.1. Реактивы........................................................................................................66

1.2 Штаммы Е. coli...............................................................................................67

1.3. Плазмидные конструкции..........................................................................67

1.4. Антитела.........................................................................................................67

1.5. Растворы.........................................................................................................68

1.6. Культуральные среды.................................................................................69

2. Методы..........................................................................................................69

2.1. Процедуры, использованные при работе с бактериальными клетками

..........................................................................................................................69

2.2 Методы, использованные при работе с ДНК...........................................70

2.3. Общие процедуры, использованные при работе с белками................72

2.4. Процедуры, использованные при работе с эукариотическими клетками........................................................................................................................74

2.5. Получение антител к р85-субъединице CIRL1 и приготовление иммуноаффинного сорбента.....................................................................................79

2.6. Аффинная хроматография..........................................................................82

3. Оборудование..............................................................................................84

ВЫВОДЫ..................................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................87

ВВЕДЕНИЕ

Передача сигнала в клетке - это часть сложной системы коммуникации, которая управляет основными клеточными процессами и координирует действия клетки. Возможность клеток корректно отвечать на изменения окружающей их среды является основой развития, репарации тканей, иммунитета и системы поддержания гомеостаза в целом. Способность клеток воспринимать внешние сигналы определяется специальным классом белковых молекул - рецепторами. Большое разнообразие типов и подтипов рецепторов обеспечивает широкий динамический диапазон физиологических ответов и высокую информационную емкость путей, передающих сигналы.

G-белоксопряженные рецепторы (G protein-coupled receptors, GPCRs) представляют одно из самых больших и наиболее разнообразных семейств трансмембранных белков, кодируемых геномом многоклеточных животных. Так у человека обнаружено более 800 различных генов, кодирующих G-белоксопряженные рецепторы, среди которых выделяют пять семейств (глутаматные, родопсиновые, адгезионные, Frizzled/taste2 и секретиновые). GPCRs участвуют в передаче сигналов внутрь клетки в ответ на воздействие разнообразных внеклеточных стимулов, включающих физические стимулы (свет, запахи, тепло), химические сигналы в виде ионов (Са2+, Н+), нейромедиаторов (дофамин, норадреналин, адреналин, ацетилхолин, нуклеотиды), пептидов и белковых гормонов (хемокины или опиаты), липидов и эйкозаноидов (сфинголипиды или лейкотриены).

GPCRs опосредуют большое количество физиологических процессов в

эукариотических организмах, нарушение работы этих рецепторов приводит к

возникновению множества различных заболеваний. Около 40 %

фармацевтических препаратов, выпускаемых на рынке, использует в качестве

4

мишеней G-белоксопряженные рецепторы. При этом терапевтическими мишенями являются чуть меньше пятидесяти различных GPCRs, что составляет всего около 5 % от всех известных G-белоксопряженных рецепторов.

В геномах млекопитающих, насекомых и червей было обнаружено около тридцати адгезионных G-белоксопряженных рецепторов, которые содержат GPS-домен [1]. В настоящее время функция большинства адгезионных G-белоксопряженных рецепторов остается невыясненной. Вышесказанное позволяет заключить, что исследование структуры и функций этих белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы являлось исследование особенностей субъединичной структуры и протеолитического процессинга рецептора CIRL1. Нейрональный рецептор CIRL1 (the calcium-independent receptor of a-latrotoxin 1) является высокоаффинным рецептором природного нейротоксина - а-латротоксина, благодаря чему он и был открыт. Ранее проведенные исследования и пресинаптическая локализация рецептора указывают на его роль в регуляции нейросекреции. Этим определяется интерес к рецептору и интенсивные исследования, направленные на его структурно-функциональную характеристику.

CIRL1 принадлежит к семейству адгезионных G-белоксопряженных рецепторов. Для рецепторов данного семейства характерно наличие двухсубъединичной структуры, которая является результатом эндогенного протеолиза молекулы-предшественника. Образующиеся в результате протеолиза субъединицы рецептора, как предполагают, образуют нековалентно связанный комплекс на поверхности клетки. Однако для CIRL1 недавно была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц на

клеточной мембране. Согласно этой гипотезе субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембраносвязанными. Таким образом, на данный момент актуальным является исследование особенностей субъединичной структуры CIRL1, а также поиск белков, взаимодействующих с рецептором.

В данной работе было показано, что на клеточной мембране рецептор CIRL1 присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85. Было установлено, что часть субъединиц рецептора CIRL1 диссоциирует при физиологических условиях, в результате чего р120 секретируется во внеклеточную среду. Данная диссоциация происходит при участии мембрано-связанной протеазы, которая отщепляет N-концевой пептид р85-субъединицы в непосредственной близости от мембраны. В результате протеолиза р120-субъединица секретирует во внеклеточную среду в комплексе с коротким пептидным фрагментом р85. На физиологическую значимость данного явления указывает обнаружение растворимой формы рецептора CIRL1 как in vitro, так и in vivo.

Одним из подходов в изучении физиологической важности рецепторов является поиск их белковых партнеров в клетке. В данной работе был проведен детальный анализ белков, способных взаимодействовать с рецептором CIRL1. Для выделения белковых компонентов рецепторных комплексов была использована аффинная хроматография экстракта мембран мозга крыс на иммобилизованных а-латротоксине и антителах к цитоплазматической части рецептора CIRL1 с последующим масс-спектрометрическим анализом полученных препаратов. В дополнение к ранее известным партнерам рецепторов а-латротоксина был идентифицирован ряд белков, в числе которых структурные белки, внутриклеточные сигнальные белки, а также белки, участвующие в эндоцитозе и транспорте синаптических везикул. Их

анализ в совокупности позволяет предположить участие рецептора СШЫ в процессах эндоцитоза и передачи внутриклеточных сигналов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика адгезионных G-белоксопряженных рецепторов

G-белоксопряженные рецепторы (G protein-coupled receptors, GPCRs) представляют один из самых больших и наиболее разнообразных классов трансмембранных белков, кодируемых геномом многоклеточных животных. Первые представители данного класса были открыты благодаря способности регулировать активность G-белков - внутриклеточных трехсубъединичных ГТФаз. В результате активации рецепторов образуются их комплексы с G-белками, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ и диссоциация G-белков на а-субъединицу со связанным ГТФ и комплекс из Р- и у-субъединиц. В настоящее время доказано, что как а-субъединица, так и комплекс [Зу служат передатчиками сигналов, активируя или ингибируя ферменты и ионные каналы. После взаимодействия с эффектором происходит гидролиз связанного ГТФ и воссоединение а с |3у в трехсубъединичный комплекс со связанным ГДФ, способный вновь связываться с активированными рецепторами.

Одна молекула активированного рецептора способна в свою очередь активировать тысячи молекул G-белка, которые в свою очередь активируют ферменты или ионные каналы. Таким образом, сигнальный каскад, включающий G-белки, обладает уникальным свойством во много раз усиливать полученный клеткой сигнал. Поэтому не удивительно, что G-белоксопряженные рецепторы осуществляют ключевую функцию во многих внутриклеточных процессах. Данные рецепторы вовлечены в гормональную регуляцию клеточной активности: механической подвижности, секреции, скорости метаболизма.

Оказалось, что различные G-белоксопряженные рецепторы имеют существенную гомологию в последовательностях их семи трансмембранных сегментов. На основании множественного выравнивания этих структур в настоящее время выделены пять классов внутри данного суперсемейства (глутаматные, родопсиновые, адгезионные, Frizzled/taste2 и секретиновые) [2]. Лишь для небольшой доли известных G-белоксопряженных рецепторов напрямую доказано их взаимодействие с G-белками.

В конце прошлого века были открыты рецепторы с необычной структурой [3-5]. Они оказались существенно длиннее ранее известных G-белоксопряженных рецепторов, в основном за счет их протяженной N-концевой внеклеточной части. Уникальным примером является, в частности, так наываемый VLGR1 (very large G protein-coupled receptor - очень большой G-белоксопряженный рецептор). Наибольшая из его трех изоформ состоит из 6300 аминокислотных остатков, что составляет около 700 кДа [6]. На данные момент такие рецепторы выделены в отдельный класс G-белоксопряженных рецепторов, так называемые адгезионные G-белоксопряженные рецепторы [7].

Систематический анализ последовательностей белков, кодируемых человеческим геномом, выявил наличие по крайней мере тридцати адгезионных G-белоксопряженных рецепторов с высокой гомологией последовательностей их трансмембранных сегментов (рис. 1). Филогенетический анализ трансмембранных последовательностей данных рецепторов показал, что они образуют шесть кластеров [8]. В состав отдельных кластеров входят минисемейства высокогомологичных белков, сходных не только по трансмембранным сегментам, но и по доменной структуре их протяженной N-концевой внеклеточной части. Примерами таких

минисемейств являются рецепторы CIRL1-3 (обозначены на схеме как LEC1, LEC2 и LEC3), рецепторы BAI1-3, EMR1-4 и CELSR1-3.

Рис. 1. Филогенетический анализ адгезионных G белоксопряженных рецепторов человека по их трансмембранным сегментам [8].

Помимо серии и треонин-богатых доменов, присутствующих во внеклеточной части всех рецепторов, на схеме указаны внеклеточные домены характерные для отдельных рецепторов: GPS (GPCR proteolysis site), EGF (эпидермальный фактор роста), HBD (гормон-связывающий домен), Ig (иммуноглобулиновый), SEA (мотив белка спермы, энтерокиназы и агрина), РТХ (пентраксин), TS (тромбоспондин), Olf (олфактомедин), GBL (галактозо-связывающий лектин), Cad (кадгерин), Lam (ламинин), и LRR (лейцин-богатый повтор).

Анализ аминокислотных последовательностей адгезионных в-белоксопряженных рецепторов выявил наличие в их Ы-концевой внеклеточной части разнообразных структурных доменов, характерных для белков клеточной адгезии (рис. 2).

Рис. 2. Семейство адгезионных вРСЯ - доменная структура [2].

Таким образом, данные рецепторы представляют собой природные гибриды двух классов беков - сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. В связи с этим, логично предположить, что физиологическая роль данных рецепторов заключается в активации внутриклеточного сигнального каскада прямыми межклеточными контактами. Известно, что сходную роль

имеют рецептор-подобные тирозинкиназы и тирозинфосфатазы, регулирующие в частности подвижность и пролиферацию клеток в зависимости от их окружения. В отличие от них, гибридные G-белоксопряженные рецепторы, могли бы выполнять более тонкую регуляторную функцию, поскольку они имеют большую чувствительность к сигналам и вызывают очень быстрый клеточный ответ.

Примечательно, что адгезионные GPCR имеют восьмой сегмент гомологии. Этот цистеин-богатый мотив, получивший название GPS, находится в их N-концевой внеклеточной части, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента. В результате исследований установлено, что наличие GPS-домена определяет эндогенный протеолитический процессинг адгезионных GPCR. Вследствие протеолиза в GPS-домене, рецептор расщепляется на две субъединицы, образующие прочный нековалентный комплекс на поверхности клетки.

В отличие от млекопитающих (рис. 1), в геноме дрозофилы и нематоды присутствует всего лишь два гена, кодирующие длинные гибридные рецепторы с GPS-доменом. Интересно, что наличие одного GPS-содержащего рецептора обнаружено в геноме Monosiga brevicollis, одноклеточного организма, принадлежащего к классу хуанофлагеллят [9]. В расшифрованных геномах бактерий и дрожжей генов GPS-содержащих рецепторов обнаружено не было.

Предметом настоящего обзора является подробное рассмотрение структуры и функции охарактеризованных гибридных рецепторов с GPS-доменом, а также обсуждение имеющихся в настоящее время данных о протеолитическом процессинге GPS-содержащих рецепторов.

1.1. Рецепторы иммунной системы

Первыми обнаруженными представителями семейства адгезионных G-белоксопряженных рецепторов были рецепторы EGF-TM7 [3-5,10]. В настоящее время к этому подсемейству можно отнести пять охарактеризованных рецепторов: CD97, EMRl(F4/80), EMR2, EMR3 и EMR4. Отличительной характеристикой данных рецепторов является наличие в их N-концевой внеклеточной части EGF-доменов (epidermal growth factor; доменов, подобных эпидермальному фактору роста), характерных для рецепторов клеточной поверхности, участвующих в различных физиологических процессах, включающих коагуляцию крови, фибринолиз и клеточную адгезию.

Анализ экспрессии в различных тканях показал, что данные рецепторы экспрессируются главным образом клетками иммунной системы [11]. CD97 экспрессируется в широком спектре кровяных клеток, включая активированные лейкоциты, гранулоциты, моноциты, макрофаги и дендритные клетки [12-14]. Данный рецептор также присутствует в гладких мышцах и злокачественных клетках различных эпителиальных опухолей [1418], в то время как экспрессия EMR рецепторов ограничена клетками костного мозга [19].

Для CD97, EMR1 и EMR2 рецепторов характерно наличие различных изоформ, отличающихся количеством EGF-повторов, что является результатом альтернативного сплайсинга [4, 20, 21]. CD97 и EMR2 экспрессируются в виде трех изоформ, содержащих три (1-2-5), четыре (1-2-3-5) или пять (1-2-3-4-5) EGF-доменов. Внеклеточная часть этих рецепторов содержит сайты связывания клеточных лигандов. Так было показано, что EGF-домены 1 и 2 CD97 связываются с антигеном CD55, также именуемым DAF (decay acceleration factor) - фактором ускорения распада комплемента [22]. Причем самой высокой

аффинностью к CD55 обладает изоформа CD97(l-2-5), а самой низкой - CD97(1-

2-3-4-5) [23, 24]. Интересно, что EMR2 не связывает CD55, хотя первые два EGF-домена этого рецептора отличаются от первых двух EGF-доменов CD97 всего тремя а�