Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый тип протеолетического процессинга урокиназы: возможный механизм регуляции эндоцитоза и взаимодействия с новым участком связывания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый тип протеолетического процессинга урокиназы: возможный механизм регуляции эндоцитоза и взаимодействия с новым участком связывания"

На правах рукописи

РГБ ОД

*8 ы т

Поляков Алексей Алексеевич

НОВЫЙ ТИП ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССИНГА УРОКИНАЗЫ: ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ЭНДОЦИТОЗА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С НОВЫМ УЧАСТКОМ СВЯЗЫВАНИЯ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

Москва 2000

>

Работа выполнена в лабораторшш Молекулярной эндокринологии Института Экспериментальной Кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель: Научный консультант:

кандидат биологических наук В.В. Степанова

член-корреспондент РАН профессор В.А. Ткачук

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор А.В. Максименко

кандидат химических наук Т.В. Ротанова

Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 27 декабря 2000 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д074.22.02. в РК НПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Автореферат разослан 27 ноября 2000 года

Ученый секретарь Диссератционного совета, кандидат биологических наук

Г

о

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Урокиназа представляет собой внеклеточную протеазу с узкой субстратной специфичностью, принимающую участие в активации плазмюгогена, регуляции процессов перестройки внеклеточного матрикса и морфогенеза тканей (Andreasen et al., 2000; Tkachuk et al., 1996). Наличие в структуре урокиназы «ростового» домена обеспечивает ее высокоаффшшое взаимодействие с урокиназным рецептором на поверхности клеток (Appella et al., 1987). Связывание урокиназы с рецептором приводит не только к локализации внеклеточного протеолиза на поверхности клетки, но и активирует внутриклеточную сигнализацию, стимулирует миграцию и пролиферацию клеток (Chapman, 1997). В настоящее время молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции урокиназой данных процессов, не выяснены.

Урокиназа состоит из трех доменов: «ростового» домена, гомологичного по структуре эпидермальному фактору роста, крингл-домена и протеолитического домена. До сих пор считалось, что сигнальные эффекты урокиназы обеспечиваются при связывании урокиназы с клетками благодаря высокоаффинному взаимодействию ее «ростового» домена с урокиназным рецептором. Урокиназный рецептор не имеет трансмембранного и цитоплазматического доменов, а закреплен в мембране с помощью гликозил-фосфатидилинозитолыюго (ГФИ) якоря (Ploug et al., 1991). Данная особенность не позволяет ему непосредственно передавать сигнал от урокиназы внутрь клетки. Поэтому в последние годы ведется поиск других возможных белков-партнеров урокиназы, способных напрямую активировать сигнальные системы клетки. При этом ГФИ-заякоренный урокиназный рецептор может выполнять роль своеобразной «ловушки» урокиназы, связывающей и правильно ориентирующей ее на поверхности клетки (Duraler et al., 1999).

В настоящее время появились данные о возможном участии эндоцитирующих рецепторов из семейства ЛНП-рецептора в опосредовании сигнальных эффектов урокиназы (Goretzki and Mueller, 1998). Предполагается, что они могут регулировать активность урокиназы не только путем ее удаления с клеточной поверхности, но и активируя сигнальные пути, специфичные для данной группы белков. Такое предположение кажется весьма вероятным, поскольку в последние два года появились убедительные доказательства в пользу сигнальной функции эндоцитирующих рецепторов, а также их участия в регуляции процессов миргации клеток и морфогенеза тканей (Cooper and Howell, 1999; Gliemann, 1998; Gotthardt et al., 2000).

Недавно в нашей лаборатории с помощью набора рекомбинантных форм урокиназы, экспрессированных в Е. coli, было показано существование на клетках нового участка связывания урокиназы, взаимодействие с которым не зависит от наличия в ее структуре «ростового» домена. Более того, рекомбинантная форма урокиназы, лишенная «ростового» домена, не только связывается с клетками, но и стимулирует миграцию гладкомышечных клеток сосудов человека (Mukhina et al., 2000; Poliakov et al., 1999). Нами было высказано предположение, что найденный участок связывания может быть вовлечен не только в регуляцию хемотактической активности урокиназы, но и принимать участие в регуляции ее эндоцитоза. Таким образом, идентификация, выделение и характеристика белка, представляющего собой данный участок связывания, является одним из приоритетных направлений в области изучения сигнальных и миграционных эффектов урокиназы.

В связи с этим, цель нашей работы состояла в изучении свойств нового участка связывания урокиназы, отличного от известного урокиназного рецептора. Для этого мы поставили перед собой следующие экспериментальные задачи:

1. Определить возможность образования in vivo и in vitro формы урокиназы, лишенной «ростового» домена и неспособной связываться с рецептором урокиназы;

2. Провести сравнительный анализ связывания, эндоцитоза и деградации клетками полноразмерной урокиназы и формы урокиназы, лишенной «ростового» домена;

3. Выделить и идентифицировать белок, представляющий собой новый участок связывания урокиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые продемонстрирован новый тип прогесшитического процессинга урокиназы под действием плазмина, приводящий к расщеплению связи Lys46-Ser47 в участке, соединяющем ее «ростовой» и крингл- домены. Показано, что форма урокиназы, лишенная «ростового» домена, может образовываться на поверхности клеток. Установлено, что в результате отщепления «ростового» домена урокиназа становится неспособной взаимодействовать с урокиназным рецептором и, в отличие ог полноразмерной формы, подвергается быстрому эндоцитозу и внутриклеточной деградации. Показано, что интернализация урокиназы, лишенной «ростового» домена, опосредуется белками из семейства ЛНП-рецептора. Получены результаты, свидетельствующие об ингибировании образования урокиназы, лишенной «ростового» домена, под действием плазмина в присутствии урокиназного рецептора. Высказано предположение, что данное свойство урокиназного рецептора может лежать в основе его способности замедлять тггерналнзацию полноразмерной урокиназы и экспонировать ее длительное время на поверхности клетки. С помощью аффинной хроматографии и лигандного блотганга проведен поиск белков, способных взаимодействовать с формой урокиназы, лишенной «ростового» домена. Данным методом в лизатах клеток линии U937 и гладкомышечных клетках сосудов человека выявлен белок с кажущейся мол. массой 210 кДа, участок связывания с которым находится в протеолитическом домене урокиназы. Установлено, что этот белок локализуется в плазматических мембранах и состоит из нескольких субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. Методом масс-спекгроскопии показано, что в структуре 210-кДа белка находятся иммуноглобулиновые повторы С2 типа, что может объяснять его способность взаимодействовать с различными антителами к иммуноглобулинам. Высказано предположение, что 210-кДа белок может обеспечивать связывание урокиназы без «ростового» домена с поверхностью клеток, а также принимать участие в регуляции ее эндоцитоза и хемотакгической активности.

Результаты данной работы могут способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов функционирования урокиназы, а также вносят определенный вклад в изучение фундаментальной проблемы роли внеклеточных протеаз в регуляции функционального состояния клетки.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях 8th Swiss Workshop of Methodology in Receptor Research (Мочах, Швейцария, 1998), The VIIth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation (Лес Диаблеретс, Швейцария, 1999), XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Хамамацу, Япония, 2000), на межлабораторном семинаре Института эксперименатальной кардиологии РК НПК МЗ РФ (24 ноября 2000 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, 1 принята к печати.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунками. Список литературы включает 210 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используемые в работе белки.

Рекомбинантные Формы урокиназы. В работе были использованы следующие рекомбинантные формы урокиназы, экспрессируемые в Е. colt 1) урокиназа дикого типа (УК); 2) форма урокиназы без «ростового» домена (УКДРД); 3) аминоконцевой фрагмент урокиназы (АКФ), состоящий из «ростового» и крингл-домена; 4) протеолитический домен урокиназы (ПД), 5) крингл-домен урокиназы (КД) и 6) модифицированная форма урокиназы с заменой 24 N-концевых аминокислот на 13 случайных (УКмод). Клоны бактерий, экспрессирующие формы урокиназы, были любезно предоставлены к.б.н. Р.Ш. Бибилашвшш (ИЭК РК НГТК МЗ РФ). Экспрессию и очистку форм урокиназы проводили, как описано (Mukhina et al., 2000; Poliakov et al., 1999). Для этого использовали металло-хелатную и аффинную хроматографию на основе иммобилизованных моноклональных антителах к крингл- и протсолитичес кому доменам урокиназы человека, любезно предосгавленых к.б.н. С.П. Домогатским (ИЭК РК НИК МЗ РФ). Степень очистки полученных белков анализировали методом ДСН-элекгрофореза в ПААГ и с помощью иммуноблотгинга. Каталитическую активность полученных форм урокиназы определяли с помощью хромогенного субстрата S-2241.

Белок RAP. Штамм Е. coli DH5a со встроенной плазмидой pGEX, кодирующей конструкт (глутатион S-тpанcфepаза)-RAP (TT-RAP), был любезно предоставлен доктором Т. Willnow (Гумбольдский университет, Берлин, Герамния). Экспрессию и очистку конструкции ГТ-RAP проводили, как описано (Willnow et al., 1992). Для получения RAP, конструкцию RAP-ГТ инкубировали с тромбином (3 ед на 5 мг RAP-ГТ) в объеме 2 мл в течении 15 ч при 37°С. Культивирование клеток.

В работе использовали клетки линии U937, первичную культуру ГМК трахеи человека, клетки линии НЕК293 и НЕК293-УКР, трансфецированных геном урокиназного рецептора человека (Mukhina et al., 2000). Клетки культивировали в средах RPMT1640 (для линии U937) и DMEM (для ГМК и клеток линии НЕК293), содержащих 10 % фетальную бычью сыворотку, 100 Е/мл пенициллин и 100 мг/мл стрептомицин, при 5 % С02 и 37°С. Мечение белков.

Йодирование. Формы урокиназы йодировали с помощью

Ка125т

используя

реактив IODO-GEN (Pierce, США). Удельная радиоактивность полученных препаратов белков составляла 0,3-0,4 cpm/пмоль. Качество меченых белков тестировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ и последующей авторадиографии.

Биотанилирование белков в растворе. Биопшинилирование белков проводили с помощью сулъфо-№18-ЪС-бисгпша (Pierce, США). Качество меченых белков тестировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ и последующего блотпшга с

нейтралидином, коньюгированным с полипероксидазой хрена (Pierce, США).

Биотинилирование поверхностных белков клетки. Клетки охлаждали во льду, промывали 4 раза ФСБ, рН 8,0, затем суспендировали в концентрации 2,5х107 клеток/мл в этом же буфере, содержащем 0,5 мг/мл сульфо-МШ-ЬС-биотин (Pierce, США). Реакцию проводили в течение 30 мин при 25°С, после чего клетки промывали этим же буфером и лизировали.

Измерение интернализации и внутриклеточной деградации урокиназы.

Клетки промывали буфером для связывания (раствор Хэнкса, рН 7,4, 1 мг/мл БСА) при 0°С и суспендировали в этом же буфере в концентрации 5x106 клеток/мл. К клеткам добавляли 1251-мечешше формы урокинзы (5 нМ) и инкубировали 90 мин при 0°С, после чего клетки промывали буфером для связывания при 0°С и переносили на 37°С. В течение инкубации (60-120 мин) отбирали аликвсггы клеточной суспензии и осаждали клетки центрифугированием. К суиернатанту (инкубационная среда) добавляли ТХУ до конечной концентрации 10%. Выпавший в осадок белок осаждали центрифугированием, а супернагант использовали в дальнейшем как фракцию продуктов внутриклеточной деградации белков. К осадку клеток добавляли глициновый буфер (50 мМ глицин, рН 3,0, 0,15 М NaCl) для диссоциации лигандов, связанных с клеточной поверхностью. Затем суспензию центрифугировали для осаждения клеток. Радиоактивность во фракциях супернатанта после обработки 10% ТХУ (деградированная фракция), супернатанта после обработки клеток глициновым буфером (поверхностно-связанная фракция) и в клеточном осадке (интернализованная фракция) определяли с помощью гамма-счетчика. Неспецифические связывание, интернализацию и деградацию форм урокиназы определяли в присутствии 200-кратного избытка немеченных белков.

Получение клеточных лизатов.

Получение общего клеточного лизата К промытым клеткам добавляли лизис-буфер (100 мМ трис/HCl, рН 8,1,1 % Тритон Х-114, 5 мМ CHAPS, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ, 10 мкг/мл лейпеппш, 10 мкг/мл пепстатин А, 100 Е/мл апротинин) и инкубировали 15 мин. Для удаления нерастворимых компонентов полученный лизат центрифугировали 30 мин при 30000 g.

Получение мембранной и цитозольной фракций клеточных белков методом разделения фаз. К промытым клеткам добавляли лизис-буфер (см. выше) не содержащий CHAPS. После удаления нерастворимых компонентов клеточный лизат инкубировали 5 мин при 37 °С. Образовавшуюся фазу детергента (фракцию мембранных белков) отделяли от водной фазы (фракцию цитозольных белков) центрифугированием. Верхнюю (водную) фазу отбирали, а к нижней (фазе детергента) добавляли 100 мМ трис/HCl, рН 8,1 до начального объема. Процедуру разделения фаз повторяли несколько раз, после чего к полученной фазе детергента добавляли 100 мМ трис/HCl, рН 8,1 и CHAPS до 5 мМ (с целью предотвращения дальнейшего расслоения лизата).

Аффинная хроматография белков, связывающихся с различными формами урокиназы.

Иммобилизация Форм урокиназы на активированной бромцианом Сефарозе. Активацию Сефарозы и иммобилизацию белков осуществляли по методу (Duzhenkova et al., 1986). Степень активации Сефарозы составляла 10 мг BrCN на 1 мл геля. Определение концентрации иммобилизованного белка проводили, используя

модифицированный метод Брэдфорд (Asryants et al., 1985). В обычном эксперименте она составляла 0,4-0,8 мг/мл.

Аффинная хроматография. Свежеприготовленные клеточные лизаты инкубировали с иммобилизованными формами урокиназы в течение ночи при 4°С. Затем сорбенты промывали последовательно раствором А (ФСБ, 2 мМ CHAPS), раствором А, содержащим 0,85 М NaCl, раствором А и затем 50 мМ трнс/HCl, pH 6,8, содержащим 2 мМ CHAPS. Связавшиеся с сорбентом белки элю провали 1% ДСН, 10 мМ трис/HCl, pH 7,0. Анализ белков, связавшихся с аффинными сорбентами, проводили с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ, лигандного и иммуноблоттинга.

Иммунопреципитация.

К клеточным лизатам добавляли антитела (10 мкг/мл) и инкубировали 1 ч. Затем к раствору добавляли иммобилизованный на Сефарозе белок-G и продолжали инкубацию в течение 1 ч. Промывку сорбента и элюцию связавшихся белков проводили, как описано в разделе "Аффинная хроматография".

Электрофорез, иммуно- и лигандный блоттинг.

Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Электроперенос осуществляли на ПВДФ-мембрану в буфере 48 мМ трис, 39 мМ глицин (рН«9,5), 15% метанол, 0,0375% ДСН при напряжении 100 В (30-60 мин). После переноса мембрану окрашивали раствором Amido Black 10В для детекции перенесенных белков. Затем мембрану инкубировали в блокирующем буфере (ФСБ, 0,05% Твин-20, содержащем 1% казеина (при иммуноблоттинге) или 0,5% желатина (при лигандном блоттинге)) в течение ночи при 4°С. Инкубации с антителами проводили в блокирующем буфере в течение 1 ч при 25°С. Мембрану отмывали сначала ФСБ, содержащем 0,05% Твин-20, а затем ФСБ. Детекцию белков осуществляли с помощью хемилюминисценгаого субстрата (SuperSignal West pico, Pierce, США).

При проведении лигандного блотганга мембрану после блокирования инкубировали с биотинипированными формами урокиназы (5 нМ) в блокирующем буфере 2 ч при 25°С. После промывки от несвязавшихся белков мембрану инкубировали с раствором нейтравидина, коныогированного с пероксидазой хрена (Pierce, США) в блокирующем буфере 1 ч при 25°С. Промывку мембраны и детекцию белков проводили, как описано выше. N-концевое секвенирование белков.

Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ и осуществляли элекгроперенос на ПВДФ-мембрану в течение 2 ч при 15°С и 400 мА в 25 мМ NaHC03, pH 9,0, 20% метанол, 0,1% ДСН. Аминокислотное секвенирование окрашенных с помощью Amido Black 10В белковых полос осуществляли с помощью жидкофазного белок/пептидного секвенатора Applied Biosystems Model 477А (США). РТН-производные аминокислот идентифицировали с помощью РТН-анализатора Applied Biosystems Model 120А(США).

Идентификация белков методом масс-спектроскопии.

После проведения ДСН-электрофореза в ПААГ, белки окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250. Полосу белка вырезали, обрабатывали трипсином и проводили определение молекулярных масс получившихся пептидов с помощью масс-спектрометра.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Протеолитический процессинг урокиназы под действием плазмина.

1.1 Процессинг урокиназы in vitro.

До настоящего времени была известна следующая схема протеолитического процессинга урокиназы (рис. 1). После секреции одноцепочечная неактивная форма урокиназы (оц-УК) подвергается расщеплению плазмином между Lysl57-Ilel57 и превращается в активную двухцепочечную форму (дц-УК), состоящую из А- и Б-цепей. Дц-УК может подвергаться дальнейшему расщеплению плазмином, приводящему к разделению ее цепей. В результате образуется две формы урокиназы: аминоконцевой фрагмент урокиназы (АКФ), состоящий из «ростового» и крингл-домена, и низкомолекулярная форма (нм-УК), содержащая протеолитический домен урокиназы.

1 46 134 411

pry Крингп | Протеолитический домен □ ОЦ-УК

плазмин

1 46 134 pS-S-j 411

( "Я I Крингп I J I Протаоготгмссии доамн ДЦ-УК

158 159 I II I

А-цепь Б-цепь

плазиин

1 46 134 135 pS-S-j__411

"' АКФ L] I Прдгмшилтевсийвоцан "] НМ-УК

158 159

Рис. 1. Схема протеолитического процессинга урокиназы под действием плазмина.

Урокиназа секретируется клетками в виде неактивного одноцепочечного профермента (оц-УК). После связывания с клеточной поверхностью оц-УК подвергается протеолитическому расщеплению под действием плазмина, в результате которого образуется активная двухцепочечная урокиназа (дц-УК). Дц-УК состоит из А- и Б-цепей, соединенных дисульфидной связью. Последующий протеолиз урокиназы плазмином приводит к разделению цепей урокиназы и образованию аминоконцевого фрагмента (АКФ), состоящего из "ростового " (РД) и крингл-домена, и низкомолекулярной формы урокиназы (нм-УК), включающей протеолитический домен.

При анализе продуктов протеолитического расщепления рекомбинантной урокиназы на электрофорезе в присутствии восстанавливающих агентов нам удалось обнаружить, что в первые минуты инкубации с плазмином происходит образование дц-УК, состоящей из А- и Б-цепей (рис. 2А, полосы 1 и 2, соответственно). С течением времени интенсивность полосы, соответствующей протеолитическому домену (Б-цепи) не изменялась, в то же время полоса, соответствующая A-цепи, исчезала и наблюдалось образование полосы с меньшей молекулярной массой (полоса 3), по-видимому, представляющей собой крингл-домен урокиназы. При анализе продуктов

протеолиза урокиназы под действием плазмина in vitro одним из продуктов реакции является форма урокиназы, лишенная «ростового» домена (УКДРД). Интересно, что скорость протеолиза по связи Lys46-Ser47, приводящего к образованию данной формы, много выше, чем по известному участку Lysl35-Lysl36, в результате которого образуется АКФ и низкомолекулярная форма урокиназы (им-УК).

1.2. Нротеолиз урокиназы на поверхности клеток.

С целью выяснить, образуется ли данная форма урокиназы на клетках, мы проинкубировали биогннилированную полноразмерную урокиназу с клетками линии U937 и затем провели анализ продуктов ее расщепления. Как видно из рис. ЗА, после инкубации урокиназы с клетками происходит образование фрагмента с каж. мол. массой 38-40 кДа, положение которого соответствует положению рекомбинантной биотинилированной урокиназы лишенной «ростового» домена. Формирование данной полосы не наблюдалось в присутствии ингибитора плазмина апротинина, что свидетельствовало о плазмин-зависимом характере расщепления.

Время, мин

А 1 2 3 4 Б 0 10 30

+ апротинин

Рис. 3. Протеолитический процесса нг биотинилированной полноразмерной урокиназы (УК-6) на поверхности клетоклинии 1/937. Панель А -Клетки промывши и ресуспендировали в буфере для связывания (Материалы и методы, стр. 4), содержащем 5 нМ УК-б. Инкубацию проводили в отсутствие (дорожка 2) и в присутствии (дорожка 3) апротинина (100Е/мл) при 4°С в течение 2 ч. Затем клетки промывали и лизировали. Продукты протеолитической деградации УК-б иммунопреципитировали с помощью политональных антител к урокиназе, разделяли методом ДСН-электрофореза в ПААГ (Т=12,5%), переносили на ПВДФ-мембрану и детектировали с помощью нейтравидина, коньюгированного с полипероксидахой хрена. На дорожке I представлена УК-б до инкубации с клетками (полоса 1). На дорожке 4 показана рекомбинантная биотинилированная урокиназа без «ростового» домена (УКАРД-б) (полоса 2). Панель Б - Клетки инкубировали с УК-б в отсутствие апротинина, как описано в А, и затем переносили на 37°С. В процессе инкубации отбирали аликвоты из клеточной суспензии, клетки промывали, лизировали, проводили иммунопреципитацию и детектировали ассоциированную с клетками УК-б, как описано выше. Стрелками показано положение полноразмерной УК (1) и УКАРД (2).

Таким образом, нами установлен новый тип протеолитического процессинга урокиназы, происходящий in vitro и на культивируемых клетках, в результате которого образуется форма урокиназы, лишенная «ростового» домена.

Эксперименты по изучению протеолиза урокиназы на клетках проводили при 0°С с целью предотвратить возможную шггернализащпо продуктов ее расщепления. Для того, чтобы исследовать поведение расщепленной формы урокиназы при физиологических условиях, после прединкубации с урокиназой клетки перенесли в среду с температурой 37°С. На рис. ЗБ видно, что полоса, соответствующая форме без «ростового» домена, при инкубации в данных условиях быстро исчезает. В то же время, интенсивность полосы, соответствующей полноразмерной урокиназе, изменяется очень слабо. Мы предположили, что исчезновение формы урокиназы без «ростового» домена может происходить в результате ее быстрой интернализации.

2. Изучение интернализации и внутриклеточной деградации формы урокиназы без «ростового» домена.

2.1. Сравненительный анализ интернализации и внутриклеточной деградации полноразмерной урокиназы и формы лишенной «ростового» домена.

Для изучения интернализации и внутриклеточной деградации использовали 1251-меченные рекомбинантные формы белков: полноразмерную урокиназу и

урокиназу без "ростового" домена (1251-УКДРД). Клетки линии U937 инкубировали с мечеными формами урокиназы при 0°С для насыщения участков связывания. Затем клетки отмывали от несвязавшихся лигандов, суспендировали в буфере для интернализации и переносили на 37°С. Затем из суспензии клеток через определенные промежутки времени отбирали аликвопгы и определяли относительное количество поверхностно-связанного, интернализованного и деградировавшего лиганда (см. «Материалы и методы», стр. 4). За 100 % процентов принимали количество лиганда, связанного с клетками в начальный период времени. Как видно на рис. 4, около 50 % поверхностно-связанной 1251-УК остается на клетке после 60 мин инкубации. Фракция деградировавшего лиганда за данный промежуток времени составляет 10 %. В то же время 1251-УКДРД быстро исчезает с клеточной поверхности и около 80 % ее деградирует в течение 30 мин инкубации при 37°С. Таким образом, после связывания с клеточной поверхностью ,251-УК и 1251-УКДРД ингернализуются и деградируют внутри клеток с различной скоростью.

2.2. Возможный механизм ингибирования эндоцитоза полноразмерной урокиназы при связывании с урокиназным рецептором.

Мы предположили, что различия в интернализации двух форм урокиназы может объясняться способностью полноразмерной формы взаимодействовать с урокиназным рецептором на поверхности клеток. Поскольку найденный участок расщепления урокиназы, расположен близко от участка связывания урокиназного рецептора (Appella et al., 1987), мы предположили, что комплекс урокиназа-урокиназный рецептор будет менее подвержен протеолизу, приводящему к образованию формы лишенной «ростового» домена, которая характеризуется высокой скоростью интернализации. Действительно, как видно на рис. 5А, в присутствии растворимого урокиназного рецептора образование формы без «ростового» домена под действием плазмина замедлялось. Для проверки способности урокиназного рецептора защищать полноразмерную урокиназу от интернализации, мы использовали два типа клеток

линии НЕК293: дикий тип, не экспрессирующий в норме урокиназный рецептор и клетки этой же линии, трансфецированные геном урокиназного рецептора. На рис. 5Б видно, что экспрессия урокиназного рецептора приводит к уменьшению фракции деградировавшего лиганда и увеличению количества поверхностно-связанной урокиназы после перенесения клеток на 37°С. Следовательно, одним из возможных объяснений относительной стабильности полноразмерной урокиназы на клетках может являться ее способность связываться с урокиназным рецептором, который ингибирует отщепление рецептор-связывающего «ростового» домена и тем самым препятствует ее интернализации.

о-

10 20 30 40 60

Время, мин

10 20 30 40 60

Время, мин

Рис. 4. Интернализация и внутриклеточная деградация 125[-УК (А) и а51-УК&РД (Б) клетками линии 11937. Клетки инкубировали с 1-меченными формами урокиназы 90 мин при 0°С. Затем промывали для удаления несвязавшихся лигандов и переносили на 37°С. В процессе инкубации отбирали аликвоты из клеточной суспензии, охлаждали их во льду и центрифугировали для осаждения клеток. В супернатант (среда инкубации) добавляли ТХУ до 10 % и инкубировали 20 мин во льду. Затем раствор центрифугировали и определяли радиоактивность в супернатанте (фракция, содержащая продукты внутриклеточной деградации) и осадке. К осадку клеток добавляли глициновый буфер (50 мМ глицин, рН 3,0, 100 мМ ИаС1) для диссоциации поверхностно-связанных лигандов. После этого клетки осаждали центрифугированием и определяли радиоактивность в супернатанте (фракция, содержащая поверхностно-связанный лиганд) и в осадке (фракция интернализованного лиганда). На рисунках представлен репрезентативный эксперимент, в котором радиоактивность в поверхностно-связанной фракции (О), интернализованной фракции (•) и деградировавшей фракции (©) выражена в % от общей радиоактивности, ассоциированной с клетками в начальный момент времени.

;S100-

80

>; бо-

40-

20-

0 10 20 30 40 50 60 Время, мин

> 20

0"С

37°С

О'С

37 "С

НЕК293-УКР

НЕК293

Рис. 5. Панель А - Протеолиз урокиназы в присутствии растворимого урокиназного рецептора (рУКР). Полноразмерную рекомбинантную урокиназу (10 мкМ) инкубировали с плазмином (5 Е/мл) в присутствии (•) и в отсутствие (О) рУКР (30 мкМ) в ФСБ при 37X1. В процессе инкубации отбирали аликвоты и останавливали в них реакцию добавлением апротинина (100 Е/мл). Состав проб анализировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ (Т=12,5 %) в невосстанавливающих условиях. Полосы, соответствующие продуктам протеолитической деградации урокиназы, денситометрировали с помощью цифровой видеокамеры Kodak и определяли их интенсивность, используя программу PCBAS 2.08. Количество нерасщепленной полноразмерной урокиназы на графиках выражено в % от ее начального содержания до добавления плазмина. Панель Б - Связывание и внутриклеточная деградация 125I-УК клетками линии НЕК293 и клетками НЕК293-УКР, трансфецированными геном урокиназного рецептора. К суспензии клеток добавляли 1 нМ 1251-УК и инкубировали 90 мин. Затем клетки промывали для удаления несвязавшихся лигандов и продолжали инкубацию при 0°С или 37°С в течение 60 мин. Затем пробы охлаждали во льду и осаждали клетки центрифугированием. В супернатант (среда инкубации) добавляли ТХУ до 10 %, затем центрифугировали и определяли радиоактивность в супернатанте (фракция, содержащая продукты внутриклеточной деградаци) и осадке. К осадку клеток добавляли глициновый буфер (50 мМ глицин, рН 3,0, 100 мМ NaCl) для диссоциации поверхностно-связанных лигандов. После этого клетки осаждали центрифугированием и определяли радиоактивность в супернатанте (фракция, содержащая поверхностно-связанный лиганд). На диаграмме показаны относительные количества 1251-УК в поверхностно-связанной фракции (черные столбцы) и в деградировавшей фракции (белые столбцы), выраженные в % от радиоактивности в поверхностно-связанной фракции при 0°С.

2.3. Ингибирование интернализация 1-УК и 1-УКАРД с помощью рецепгор-ассоциированного белка (ЯАР).

Для определения пути эндоцитоза и деградации урокиназы без «ростового» домена, мы использовали универсальный ингибитор рецепторов семейства ЛНП-рецептора (белка КАР), способный блокировать эндоцитоз лигандов, связывающихся с

данным типом рецепторов. Известно, что белки этого семейства принимают участие в эндоцитозе полноразмерной урокиназы и ее комплекса с ингибиторами. ИАР не является физиологическим лигандом белков семейства ЛНП-рецептора на поверхности клетки, но принимает участие в процессе правильного их сворачивания в эндоплазматическом ретикулуме и сопровождает эндоцитирующие рецепторы во время транспорта на поверхность клетки, т.е. выполняет функцию шаперона данных белков (Ш1по*г<Ла1., 1992).

Как видно на рис. 6, возрастание концентрации Ю\Р приводит к ингибировшппо интернализации формы уроюшазы без «ростового» домена, что свидетельствует о том, что, как и полноразмерная урокиназа, форма без «ростового» домена интернализуется клетками с помощью белков семейства ЛНП-рецептора.

Рис. 6.

Ингибирование интерната

§ е « £

150-

100-

О ^

§ (О

5. ь

О т-

К

X

0,2 0,4 0,6 RAP, мкМ

лизации т1-УК (О) и "Ч-УКДРД (•) клетками U937 с помощью рецептор-ассоциированнного белка (RAP). Клетки промывали буфером для связывания и инкубировали 30 мин в присутствии различных концентраций RAP при 0°С. Затем к клеткам добавляли 1251-УК и 1251-УКАРД до конечной концентрации 10 нМ и продолжали инкубацию в течение 60мин при 0Х!. После этого клетки переносили на 37 °С и инкубировали 30 мин. По окончании инкубации клетки промывали 2 раза ФСБ, обрабатывали глициновым буфером (50 мМ глицин, рН 3,0, 100 мМ NaCl) для диссоциации поверхностно-связанных лигандов. Затем клетки промывали ФСБ и определяли в них радиоактивность.

3. Поиск белка, связывающего урокиназу без «ростового» домена.

3.1. Форма урокиназы без «ростового» домена специфически связывает белок с

кажущейся мол, массой 210 кДа из лизатов клеток линии Ц937 и ГМК трахеи человека.

Мы предприняли попытку выявить и очистить белок, специфически связывающий форму урокиназы без «ростового» домена на поверхности клеток. Для этого был использован метод аффинной хроматографии на основе иммобилизованных форм урокиназы на ВгСЫ-акгивированной Сефарозе. Детекцию связавшихся белков проводили методом лигандного блоттинга, используя различные формы урокиназы, меченные с помощью биотина. На рис. 7А видно, что с полноразмерной урокиназой из клеточных лизатов связываются два белка с кажущимися мол. массами 45-50 и 210 кДа. Полоса с мол. массой 45-50 кДа представляет собой урокиназный рецептор, который окрашивается на лигандном блотпшге всеми формами урокиназы, имеющими в своем составе «ростовой» домен. При этом, полоса с мол. массой 210 кДа окрашивается формами урокиназы, содержащими протеолитический домен. При использовании

«Да

200976843200-

1 23456789

< 210-кДа

В

1 2

>УКР

<1 210-кДа

< 210-кДа

976843-

рд + + + _ * _ +

кд + + + + + + +

пд + - + + - + +

Рис. 7. Лигандный блоттинг белков, связывающихся с УК и УКАРД, иммобилизованных на Сефарозе (УК-Сефарозе и УКАРД-Сефарозе). Лизаты клеток линии 11937 инкубировали с УК- (панель А) и УКйРД-Сефарозой (панель Б). Сорбировавшиеся белки элюировали буфером, содержащим 2% ДСН, и разделяли методом ДСН-электрофореза в ПААГ (Т=7,5%). Затем белки переносили на ПВДФ-мембрану. Мембрану инкубировали с биотиншированнъши формами урокиназы (5 нМ): рекомбинантной полноразмерной урокиназой (дорожка 1, 8), гликозилированной урокиназой (дорожка 2), аминоконцевым фрагментом урокиназы (дорожка 3), урокиназой без «ростового домена (дорожка 4), урокиназой с заменой в «ростовом» домене 24 N-концевых аминокислот на 13 случайных (дорожка 5), крингл-доменом (дорожка 6), протеолитическим доменом (7). На дорожке 8 представлен лигандный блоттинг белков, связавшихся с контрольной Сефарозой. Белки на мембране детектировали с помощью нейтравидина, коньюгированного с полипероксидазой хрена (дорожки 1-9). Черной стрелкой показан урокиназный рецептор (УКР), красная стрелка указывает положение 210-кДа белка. Панель В - Лизаты ГМК трахеи человека (дорожка 1) и клеток линии 11937 инкубировали с иммобилизованной УКАРД. Затем сорбент тщательно промывали и элюировали специфически связавшиеся белки, добавляя к Сефарозе равный объем буфера, содержащего 2 %ДСН. Образцы разделяли методом ДСН-электрофореза (Т=8%), переносили на ПВДФ-мембрану и инкубировали с 5 нМ УКАРД-б. Связавшиеся с мембраной белки выявляли, как описано выше. Стрелкой показано положение 210-кДа белка.

иммобилизованной урокиназы, лишенной «ростового» домена, видно, что в элюате с данного сорбента урокиназный рецептор не обнаруживается (рис. 7Б). В то же время наблюдается интенсивно окрашенная полоса с кажущейся мол. массой 210 кДа, окрашиваемая, как и в случае полноразмерной урокиназы всеми формами фермента, содержащими протеолитический домен. Нами было показано также, что моноклоналыше антитела к прогеолитическому домену урокиназы человека, в отличие от моноклональных антител к крингл-домену, блокировали связывание УКАРД с данным белком на лигандном блотганге. Таким образом, можно заключить, что УКАРД специфически связывает из клеточных лизатов белок с кажущейся мол. массой 210 кДа, а участок связывания находится в протеолигическом домене урокиназы.

Поскольку участок связывания урокиназы без «ростового» домена был впервые обнаружен на гладкомышечных клетках (ГМК) сосудов человека (МикЫпа й а1., 2000), было целесообразным проанализировать его наличие в данном типе клеток. Как видно из рис. 7В, этот белок был обнаружен не только в клетках линии Ш37, но и в первичной культуре ГМК трахеи человека.

3.2. Мембранная локализация 210-кДа белка.

Обнаруженный нами белок с массой 210-кДа локализуется в плазматических мембранах клеток. На рис. 8А видно, что после разделения фаз лизата клеток Ш37, полученного с помощью Тритона Х-114, 210-кДа белок соосождается с фазой детергена, т.е. фракцией мембранных белков, и не обнаруживается во фракции цигозольных белков. Иммунопреципитация из лизатов клеток, поверхностные белки которых были мечены биотином, показала, что антитела к урокиназному рецептору преципитируют только урокиназный рецептор (рис. 8Б, дорожки 1 и 2, полоса 2). В то же время антитела к уроюшазе урокиназе помимо низкомолекулярной урокиназы, полноразмерной урокиназы, комлекса урокиназы с ингибитором сопреципитирую полосу с молекулярной массой 210-кДа (рис. 8Б, полосы 1, 3, 4 и 5, соответственно). Эти данные позволяют заключить, что белок с массой 210-кДа является мембранным, экспрессирован на поверхности клетки и потенциально способен обеспечивать связывание урокиназы, лишенной «ростового» домена, с клетками.

3.3. Характеристика белка, связывающего форму урокиназы без «ростового» домена.

С целью выяснить субъединичную структуру 210-кДа был проведен ДСН-элекгрофорез элюата с УКДРД-Сефарозы в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. На рис. 9 видно, что в присутствии р-меркаптоэтанола полоса с мол. массой 210 кДа исчезает и появляется полоса такой же интенсивности с кажущейся мол. массой 90 кДа. Таким образом, можно предположить, что 210-кДа не является мономером, и состоит как минимум из двух субъединиц с кажущейся мол. массой 90 кДа, соединенных дисульфидными связями.

Для дальнейшей характеристики 210-кДа применяли метод масс-спекгроскопии. Полосу с мол. массой 210-кДа вырезали из геля (рис. 9), обрабатывали трипсином и использовали для определения молекулярных масс полученных пептидов. В результате были определены молекулярные массы для 6 пептидов - 1243,46 Да, 1210,58 Да, 1100,52 Да, 1534,48 Да, 1634,50 Да и 1028,46 Да. Эти массы вводили в масс-спектроскопическую базу данных и пытались определить гомологию с уже известными белками. В результате не удалось найти белок, массы фрагментов которого точно соответствовали бы массам определенных нами пептидов. При этом все 6 пептидов имели высокую степень гомологии с фрагментами иммуноглобулиновых повторов С2-

типа из различных белков. Таким образом, мы предположили, что 210-кДа белок, по-видимому содержит в свом составе иммуноглобулин-подобные домены, что позволяет объяснить его способность связывать на иммуноблотгинге антителами к иммууноглобулинам.

1 2 3

210-кДа

5

<4- 4

3

<■ 2

Рис. 8. Субклеточная локализация 210-кДа белка. Панель А - Клетки U937 лизировали буфером, содержащим 1 % Тритон Х-114, и проводили разделение фазы детергента и водной фазы, как описано выше (см. Материалы и методы, стр. 4). Клеточный лизат до разделения фаз (дорожка 1), фазу детергента (дорожка 2) и водную фазу (дорожка 3) инкубировали с УКЛРД-Сефарозой. Затем образцы промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим 1% ДСН. Пробы разделяли методом ДСН-электрофореза в ПААГ (Т= 7,5%), переносили на ПВДФ-мембрану и инкубировали ее с 5 нМ УКАРД-б. Стрелкой показано положение 210-кДа белка. Панель Б - Клетки U937 промывали и биотинилировали поверхностные белки (см. Материалы и методы, стр. 3). Затем клетки лизировали и проводили иммунопреципитацию белков моноклоналъными антителами к рецептору урокиназы 3937 (American Diagnostica, США) (дорожка 1), R-3-01 (Monozyme, Дания) (дорожка 2), политональными антителами из козы курокиназе человека (дорожка 3), моноклоналъными антителами к крингл-домену урокиназы челоквк (дорожка 4), неспецифическими иммуноглобулинами козы (дорожка 5) и мыши (дорожка б). Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ (Т=10%), переносили на мембрану и детектирвали с помощью нейтравидина, коныогированного с полипероксидазой хрена.

Таким образом, мы предполагаем, что обнаруженный методом аффинной хроматографии и лигандного блотпшга белок, взаимодействующий с урокиназой лишенной «ростового» домена, может представлять собой новый участок связывания урокиназы на клетках и принимать участие в регуляции ее эндоцитоза и хемотактической активности.

1 2

кДа -г— - 1

200 И' 210-кДа

97

•4- ЭО-кДа

68

43 тЧр

+ р-мэ

Рис. 9. ДСП-электрофорез 210-кДа белка. Элюат с УКАРД-Сефарозы разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ (1=7,5%) в присутствии (дорожка 1) и в отсутствие (дорожка 2) /3-мерксттоэтанола ф-МЭ). Белки окрашивали с помощью Кумасси бриллиантового синего 11-250. Стрелками показано положение 210-кДа белка и полосы с кажущейся мол. массой 90 кДа.

Подводя итог нашим исследованиям, можно заключить, что новый тип протеолитического процессинга урокиназы, приводящий к образованию формы, лишенной «ростового» домена и характеризующейся высокой скорость интернализации, может представлять собой не только механизм инактивации урокиназы под действием плазмина по принципу отрицательной обратной связи, но и способ регуляции ее взаимодействия с различными рецепторными системами клетки. Полученные нами данные согласуются с современной концепцией о молекулярном транспорте белков на поверхности клетки, где одним из движущих механизмов является регулируемый протеолиз лигандов и рецепторов.

выводы

1. Впервые продемонстрирован новый тип протеолитического процессинга урокиназы под действием плазмина in vitro и in vivo, приводящий к образованию формы урокиназы, лишенной «ростового» домена.

2. С помощью рекомбинантных форм урокиназы показано, что отсутствие в структуре урокиназы «ростового» домена приводит к ее быстрой шггернализации и внутриклеточной деградации. В то же время, полноразмерная урокиназа остается связанной с клеточной поверхностью в течение длительного времени. Установлено, что интернализация урокиназы без «ростового» домена опосредуется эндоцитирующими рецепторами семейства ЛНП-рецептора.

3. Урокиназный рецептор ингибирует образование формы урокиназы без «ростового» домена под действием плазмина и препятствует шггернализации полноразмерной урокиназы клетками.

4. Методом аффинной хроматографии и лигандного блоггинга показано, что урокиназа, лишенная «ростового» домена, специфически взаимодействует с белком с кажущейся молекулярной массой 210 кДа, участок связывания с которым находится в протеолитичеком домене урокиназы.

5. Белок с кажущейся молекулярной массой 210 кДа локализуется в плазматических мембранах клеток, состоит из нескольких субъединиц, связанных дисульфидной связью, и взаимодействует с антителами к иммуноглобулинам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арефьева Т.И., С.А. Мухина, А.А. Поляков, В.В. Степанова, М.М. Минашкин, Я.Г. Гурский, С.П. Домогатский, Т.Л. Красникова (1998) Урокиназа вызывает адгезию моноцитарных клеток на фибриноген. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 84,1432-37.

2. Poliakov А.А., S.A. Mukhina, D.O. Traktouev, R.Sh. Bibilashvily, Y.G. Gursky, M.M. Minashkin, V.V. Stepanova, V.A. Tkachuk (1999) Chemotactic effect of urokinase plasminogen activator: a major role for mechanisms independent of its proteolytic or growth factor domains. J Recept Signal Transduct Res 19, 939-51.

3. Mukhina S., V. Stepanova, D. Traktouev, A. Poliakov, R. Beabealashvilly, Y. Gursky, M. Minashkin, A. Shevelev, V. Tkachuk (2000) The chemotactic action of urokinase on smooth muscle cells is dependent on its kringle domain. Characteriaztion of interactions and contribution of chemotaxis. J Biol Chem 275, 16450-58.

4. Poliakov A., V. Tkachuk, T. Ovchinnikova, N. Potapenko, V. Stepanova (2001) Plasmin-dependent elimination of the growth factor-like domain in urokinase causes its rapid cellular uptake and degradation. Biochem J (in press).

5. Polyakov A.A., Stepanova V.V., and Tkachuk V.A., «Role of the GPI-anchored urokinase receptor in smooth muscle cell migration and intracellular signalling», 8th Swiss Workshop of Methodology in Receptor Research, Morschach, Forum Axenfels, 37 мая 1998 г., Швейцария.

6. Поляков А.А., Мухина С.А., Тракту с в Д.О., Минаппсин М.М., Гурский Я.Г., Степанова В.В., «Крингл-домен урокиназы взаимодействует с новым детергент-устойчивым мембранным комплексом и стимулирует миграцию клеток», Ц Съезд Биофизиков России, Москва, 23-27 августа 1999 г.

7. Mukhina S., Stepanova V., Traktuev D., Polyakov A., Gursky Ya., Minashkin M., Bibilashvily R., Tkachuk V., «Kringle domain of urokinase is essential for its Chemotactic effect: mechanism distinct from proteolytic activity and binding to uPAR via growth factor-like domain», The VIIth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation, Les Diablerets, 4-9 сентября 1999 г., Швейцария.

8. Arefieva T.I., Krasnikova T.L., Mukhina S.A., Polyakov A.A., Stepanova V.V., «Urokinase effects on monocytic adhesion to fibrinogen and vitronectin», The Ninth European Meeting on Hypertension, Milan, 11-15 июня 1999 г., Италия.

9. Poliakov А., V. Stepanova, I. Beloglazova, S. Ragozin, S. Mukhina, D. Traktouev, V. Tkachuk «Cell-associated proteolytic cleavage of urokinase between growth factor-like and kringle domains commits it for rapid internalisation by LRP/CD91 -dependent mechanism», XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, 25-29 июня 2000 г., Япония.

Работа выполнена при (Ьинансовой поддержке РФФИ (гранты 99-04-48663 и 00-0448699) и РФФИ-ННИО (грант 98-04-04139).

Список используемых сокращений:

АКФ - аминоконцевой фрагмент урокиназы; БСА - бычий сывороточный альбумин; ГМК - гладкомышечные клепш; ГТ - глутатион-8-трансфераза; ДСН - додецилсульфат натрия; КД - крингл-домен; ЛНП-Р - рецептор липопротеинов низкой плотности; (3-МЭ - Р-меркаптоэтанол; ПААГ - полиакриламидный гель; ПД - протеолитический домен; РД - «ростовой» домен; ТХУ - трихлоруксусная кислота; УК - активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа); дц-УК - двухцепочечная урокиназа; оц-УК -одноцепочечная урокиназа; про-УК - про-форма урокиназы; нм-УК низкомолекулярная форма урокиназы; УКДРД - урокиназа без «ростового» домена; УК-б - биотинилированная УК; УКДРД-б - биотинилированная УКДРД; УКР -урокиназный рецептор; рУКР - растворимый урокиназный рецептор; ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид; ФСБ - фосфатно-солевой буфер; ЭДТА этилендиаминтетраацетат; LRP - (low density lipoprotein receptor related protein), белок гомологичный ЛНП-Р; RAP - (receptor-associated protein), рецептор-ассоциированный белок.