Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы

Капустин, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы"

На правах рукописи

Капустин Александр Николаевич

Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Росздрава и на кафедре медицинской и биологической химии Факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.В. Степанова

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, профессор В.А. Ткачук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор А.В. Мазуров

Ведущая организация:

доктор биологических наук О. Д. Лопина

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 30 ноября в 11 часов на заседании диссертационного совета К208.073.02. в ФГУ РК НПК Росздрава по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Росздрава

Автореферат разослан 28 октября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

1W4 нъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа) играет важную роль в регуляции таких биологических процессов, как ангиогенез [Rabbani et al., 2001] ранозаживление [Berta et al., 1990], воспаление [Busso et al., 1998], атеросклероз [Okada et al., 1998], образование аневризмы [Carmeliet et al., 1997] и метастазирования опухолей [Ossowski et al., 1991]. Урокиназа специфически расщепляет плазминоген и обеспечивает протеолиз фибриновых сгустков [Vassalli et al., 1991], а также стимулирует клеточную адгезию и миграцию [Chapman et al., 1997]. Удаление гена урокиназы у мышей приводит к увеличению количества спонтанных тромбозов и отложению фибрина в кишечнике, синусоидных капиллярах печени [Carmeliet Р et al, 1994]. Для мышей, лишенных гена урокиназы, характерна меньшая выживаемость при микроэмболии легких [Bdeir et al., 2000] и усиление процессов тромбообразования в ответ на воздействие эндотоксинами [Carmeliet et al., 1994] или гипоксией [Pinsky et al., 1998]. С другой стороны, у этих мышей наблюдалось значительно менее выраженное образование неоинтимы в ответ на повреждение сосуда [Carmeliet et al., 1997].

Урокиназа является протеазой серинового типа и состоит из 3 доменов: N-концевого домена, гомологичного эпидермальному фактору роста (GFD, аминокислоты 1-43), крингл домена (KD, аминокислоты 44-135) я протеолитического домена (LMW, аминокислоты 136-411) [Степанова и Ткачук, 2002]. Через «ростовой» домен урокиназа связывается с высокоаффинным рецептором uPAR/CD87 [Appella et al., 1987; Ploug et al 1998]. Протеазный домен урокиназы содержит активный центр фермента и опосредует активацию плазминогена. Активность урокиназы контролируется ее физиологическими ингибиторам, одни из важнейших которых является представитель из семейства серпиновых ингибиторов PAI-1, образующий ковалентную связь с серином в активном центре [Loskutoffet al., 1989]. Крингл-домен урокиназы принимает участие в связывании интегринов [Pluskota et al., 2003], а также стабилизирует связывание урокиназы с uPAR [Bdeir et al., 2003]. В нашей лаборатории было показано, что криигл домен опосредует хемотактический эффект урокиназы [Mukhina et al., 2000].

Секретируемая клетками одноцепочечная форма урокиназы проявляет низкую пептидазную активность в отношении синтетических субстратов [Pannell et al., 1987]. При активации плазмином происходит расщепление связи Lys158-Ile159, и образуется двухцепочечная форма урокиназы, которая состоит из двух полипептидных цепей, связаных между собой дисульфидной связью Cys148-Cys279 [Kasai et al., 1985]. Активная двухцепочечная форма урокиназы обладает пептидазной активностью по отношению к синтетическим субстратам и плазминогену [Lijnen et al., 1990]. Двухцепочечная урокиназа быстро и необратимо инактивируется PAI-1, присутствующим в плазме в большом молярном избытке. Более того, при образовании тромба концентрация PAI-1 значительно увеличивается в гм-чут.тят»» ттррпиы PAI-1 тромбоцитами и сосудистыми клетками [Fujii et al., 1992; Schafer вязанный ковалентный

комплекс урокиназы с РАН взаимодействует с рецептором из семейства LRP и интернализуется через окаймленные ямки. Урокиназа и PAI-1 подвергаются деградации в лизосомах, в то время как uPAR/CD87 возвращается на поверхность клетки [Nykjaer et al., 1994; Czekay et al., 2001]. Урокиназа, связанная с uPAR, менее подвержена ингибированию под действием PAI-1, чем свободная форма фермента [Ellis et al., 1990]. Молекулярные механизмы сохранения протеолитической активности двухцепочечной урокиназы в условиях избытка PAI-l в процессах лизиса тромба, клеточной миграции и ремоделирования сосудов не выяснены.

Недавно в нашей лаборатории было показано существование на клетках дополнительных участков связывания для урокиназы, один из которых взаимодействует с урокиназой через ее протеолитический домен [Poliakov et al., 2001], тогда как другой проявлял способность связывать крингл-домен. Взаимодействие со вторым участком не зависело от присутствия в структуре урокиназы «ростового» домена и приводило к стимуляции урокиназой миграции клеток [Mukhina et al., 2000]. Также было установлено, что на поверхности клеток может происходить образовывание формы урокиназы, лишенной «ростового» домена, которая не способна связываться с uPAR. Урокиназа без «ростового» домена подвергалась при этом быстрому LRP-зависимому эндоцитозу и внутриклеточной деградации [Poliakov et al., 2001]. Поскольку было показано, что LRP опосредует активацию миграции и пролиферации клеток, а также вовлечен в регуляцию проницаемости сосудистой стенки [Ullis et al., 2005], нами было высказано предположение, что новая мишень совместно с LRP может обеспечивать связывание урокиназы без «ростового» домена с поверхностью клеток, а также принимать участие в регуляции ее ферментативной и хемотактической активности.

В связи с этим, целью нашей работы было выделение, идентификация и характеристика новой мишени связывания урокиназы, отличной от известного рецептора UPAR/CD87. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать белок, представляющий собой новый участок связывания урокиназы без «ростового» домена.

2. Охарактеризовать аффинность и доменную специфичность взаимодействия урокиназы с новой мишенью

3. Изучить влияние нового партнера урокиназы на ее функциональные свойсгва-протеолитическую активность, взаимодействие с физиологическим ингибиторами, а также хемотакгические свойства.

Научная новизна и практическая значимость работы. С помощью аффинной хроматографии был проведен поиск белков, способных взаимодействовать с урокиназой, лишенной «ростового» домена. Данным методом в лизатах гладкомышечных клеток аорты человека был выявлен белок с мол. массой 65 кДа. С помощью метода масс-спекгрометрии было установлено, что данный белок представляет собой интегрин-связывающий белок внеклеточного матрикса фибулин-5. Прямое

специфическое связывание урокиназы и фибулина-5 было подтверждено с помощью методов лигандного блота, ко-иммунопреципитации и твердофазного анализа связывания. Показано, что фибулин-5 через С-глобулярный домен связывается с протеолитическим доменом урокиназы с Kd ~ 82 нМ. Продемонстрирована ко-локализация урокиназы, ее высокоаффинного рецептора uPAR/CD87 и фибулина-5 в ламеллоподиях эндотелиальных клеток сосудов.

Установлено, что фибулин-5 не влияет на амидолитическую активность урокиназы. Выключение функции гена фибулина-5 у мышей не влияет на уровень экспрессии uPA, uPAR, PAI-1 в эмбриональных фибробластах и легочной ткани. Однако, связывание фибулина-5 с урокиназой замедляет ее инактивацию ингибитором PAI-1. Также было показано, что в осутствие гена фибулина-5 в эмбриональных фибробластах мышей урокиназа преимущественно представлена в виде комплекса с PAI-1, тогда как в таких же клетках, выделенных из эмбрионов мышей дикого типа урокиназа находится преимущественно в свободном состоянии. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что в присутствии фибулина урокиназа менее подвержена инактивации ее ингибитором PAI-1, так как лизаты эмбриональных фибробластов и экстракт легочной ткани мышей дикого типа обладают более выраженной фибринолитической активностью по сравнению с клетками и тканями мышей, лишенных гена фибулина. Полученные данные позволяют предположить, что на лидирующем крае мигрирующей клетки формируется комплекс, включающий урокиназу и фибулин-5, а также uPAR, латерально ассоциированный с интегринами. Формирование такого комплекса может приводить к пролонгированию присутствия активной урокиназы на лидирующем крае клетки, что, в свою очередь, будет способствовать более эффекивной деградации внеклеточного матрикса в направлении миграции клетки.

В работе также показано, что урокиназа стимулирует миграцию клеток HEK-uPAR, но не вызывает миграцию клеток HEK-uPAR, гиперэкспрессирующих фибулин-5, причем данный эффект не зависит от способности фибулина-5 связываться с интегриновыми рецепторами. Также нами установлено, что гиперэкспрессия фибулина-5 оказывает ингибиторное влияние на подвижность клеток.

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию молекулярных механизмов регуляции протеолитических и сигнальных свойств системы активаторов плазминогена, а также роли матриксных белков в регуляции функционального состояния клетки. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на III съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002), V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, Россия, 2002); 29ой конгрессе FEBS (Варшава, Польша, 2004); Xth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activator (Вашингтон, США, 2005), на межлабораторном семинаре Института эксперименатальной кардиологии PK НПК МЗ РФ (18 февраля 2005 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура работы. Диссертация изложена на 134 страницах состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками. Список литературы включает 225 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рекомбинанатные белки.

Рекомбинантная уоокиназа. Экспрессию рекомбинантных форм урокиназы в E.Coli и их очистку с помощью метапл-хелатной хроматографии и аффинной хроматографии на основе иммобилизованных моноклональных антител проводили, как описано [Poliakov et al., 1999, Mukhina et al., 2000]. Клоны бактерий, экспрессирующие формы урокиназы, были любезно предоставлены Р.Ш. Бибилашвили (ИЭК ФГУ РК НПК Росздрава). Иммобилизованные монокпональные антитела к крингл- и протеолитическому домену урокиназы были любезно предоставлены С.П. Домогатским (ИЭК ФГУ РК НПК Росздрава). Экспрессию гликозилированных форм урокиназы, а также uPAR, в S2 системе и их очистку проводили по ранее описанному методу [Bdeir К, 2003].

Рекомбинантный фибтин-5. Полноразмерную копию кДНК человеческого фибулина-5 клонировали в векторы pCMV и рСЕР4 (Invitrogen). Очистку фибулина-5 проводили из сред клеток, стабильно трансфицированных вектором pCMV-FBLN-5 или pCEP-FBLN-5. Очистку фибулина-5, коньюгироваиного с С-концевым MYC эпитопом (pCMV-FBLN-5) проводили с помощью коньюгированных антител против MYC эпигона (Sigma). Для очистки фибулина-5, коньюгироваиного с С-концевым V5-6xHis эпитопом (pCEP-FBLN-5) использовали металло-хелатную хроматографию (Qiagen). Такая схема выделения позволяла получить 1 мг рекомбинантного белка из 1 л культуры. Полученные белки были гомогенными по данным электрофореза в ПААГ в присутствии ДС-Na [Laemmli, 1970]. Иммобилизация белков на BrCN-активиро ванной еефарозу.

Иммобилизацию белков на CNBr-активированную еефарозу проводили в соответствии с протоколом изготовителя (Amersham Biosciences). Определение концентрации иммобилизованного белка проводили по методу Брэдфорда [Asryants et al., 1985]. В обычном эксперименте она составляла 0,2 - 0,4 мг/мл. Аффинная хроматография белков, связывающихся с урокиназой не содержащей «ростового» домена.

Приготовление лизата мембранной фракции белков аорты медиального слоя проводили так, как описано [Matlib, 1984]. Предварительно удалив эндотелий, интиму и адвентицию, измельчали

медию с помощью блендера в буфере для выделения, содержащем 250 мМ сахарозу, 20 мМ MOPS (рН 7,4 при 4°С) и 2 мМ PMSF, гомогенизировали ткань гомогенизатором «Политрон», добавляли буфер до 100 мл на 20 г ткани и центрифугировали 10 мин при 3000 g. Супернатант центрифугировали последовательно 10 минут при 10000g и 1 час при 200 000 g. Осадок суспендировали в 20 мл лизирующего буфера (ОДМ Трис/HCl, рН 8,1, содержащий 1 % Тритон X-114, 5мМ CHAPS, 100 ед/мл апротинин, 0,5 мМ PMSF). К лизату добавляли сорбент с иммобилизованной урокиназой без «ростового» домена (uPAAGFD) или сорбент с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином (БСА) и инкубировали при перемешивании 2 часа при 4°С. Сорбент промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 2 мМ CHAPS, затем этим же раствором, содержавшим дополнительно 0,85 М NaCl, затем снова ФСБ, содержащим 2мМ CHAPS. В заключение сорбент промывали 20 мМ Трис/НС1, рН 7,6, содержащим 2 мМ CHAPS. Связавшийся с сорбентом белок элюировали 2 кратным буфером для электрофореза [Laemmli, 1970] и нагревали 5 мин при 60°С. Элюат анализировали с помощью ДС-Na электрофореза в ПААГ. Секвенированне белков.

Полосу геля, содержащую белок с мол. массой 65 кДа, вырезали из геля, обрабатывали трипсином и подвергали масс-спектромегрическому анализу. Сайт-направленный мутагенез.

Внесение мутации в ген фибулина-5 в векторе pCMV-FBLN-5 производили с помощью набора QuickChange по протоколу производителя (Stratagene). Культивирование и трансфекцня культуры клеток.

Культуры клеток карциномы яичника китайского хомячка (СНО) и человеческие эмбриональные клетки почки (НЕК293) культивировали на DMEM среде, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки, пенициллин и стрептомицин (100 IU/мл и 100 мкг/мл) и 2мМ L-глутамин. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека получали и культивировали так, как описано [Капустин и сотр., 2005]. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF), лишенные гена фибулина-5, были выделены и охарактеризованы ранее [Yanagisawa et al., 2002]. Клетки линии MEF, лишенные гена фибулина-5 и клетки линии MEF едикого» типа иммортализовали по протоколу NIH ЗТЗ [Wadhwa et al, 1993].

Клетки линии СНО или НЕК293 трансфецировали плазмидными векторами pCMV-FBLN-5, pCMV-FBLN/RGA, pCMV-GFP или pCEP-FBLN-5 с помощью реагента Липофекгамин2000 (Invitrogen), в соответствии с протоколом изготовителя.

Для получения клеток стабильно-трансфецированных клеток линии НЕК293 после проведения трансфекции вектором pCMV-FBLN-5 отбирали клоны клеток, устойчивых к антибиотику Генетицину, а после трансфекции вектором pCEP-FBLN-5 отбирали клоны клеток, устойчивых к антибиотику Гигромицину В.

Аффинная хроматография фибулина-5 из кондиционных сред.

Сорбенты с иммобилизованными формами урокиназы (иРА) инкубировали с кондиционной средой стабильно-трансфецированных клеток НЕК293 в течении 1 часа при 25°С. Далее сорбенты промывали 20-объемами раствора А (ФСБ, 2 мМ CHAPS), 40-обьемами раствора А, содержащим О, 85 М NaCl, 20 объемами раствора А. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали 2 кратным буфером для электрофореза [Laemmli, 1970]. Анализ белков, связавшихся с аффинными сорбентами, проводили с помощью ДС-Ыа-элеетрофореза, лигандного и иммуноблоттинга. Иммунопрецнпнтацня фибулнна-5 из кондиционных сред.

Белок G, коньюгированный с агарозой, инкубировали 1 час с антитепами против последовательности MYC в ФСБ и блокировали полученный сорбент 3% раствором БСА в ФСБ в течении 1 часа, при 25°С. Сорбенты инкубировали с кондиционной средой клеток HEK, стабильно трансфицированных вектором pCMV-FBLN-5, содержащей фибулин-5 и биотинилированную урокиназу (6 нМ) в течении 1 часа при 25°С. Далее проводили отмывку 40 объемами карбонатного буфера (0,1 М NaHCCh, 0,5М NaCl, pH 8.5) и элюировали связавшиеся белки с помощью 2 кратного буфера для электрофореза. Анализ связавшихся белков проводили с помощью иммуноблоттинга. Иммуноцнтохимическое окрашивание клеток

Фибулин-5 окрашивали с помощью кроличьих поликлональных антител, распознающих аминокислотную последовательность YRGPYSNPYSTPYSGPYPAAAPP (а.0. 76-98), вторичных биотинилированных антикроличьих антител и Тирамида, коньюгированного с флуорофором А1еха488 по протоколу производителя (Invitrogen). Урокиназу и рецептор урокиназы окрашивали с помощью монклональных мышиных антител и вторичных антител, коньюгироваиных с коньюгированных флуорофором А1еха54б. Конфокальную микроскопию проводили с помощью микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss). Мечение белков.

Биотинилирование урокиназы проводили с помощью сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо)гексаноата (Pierce). Йодирование урокиназы проводили с помощью Na12SI, используя реактив IODO-GEN (Pierce), как описано [Stepanova et al., 1997]. ДС-Ш-электрофорез.

ДС-Иа-электрофорез в ПААГ проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970] с помощью прибора Mini Protean II (BioRad). Иммуноблоттинг.

Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ и окрашивали с помощью специфических антител так, как описано [Towbin, 1985]. Детекцию белков осуществляли с помощью хемилюминисцентного субстрата SuperSignal West pico (Pierce). Полученное на пленке

изображение сканировали с помощью сканера Epson (Япония) или цифровой камеры Kodak Digital Camera (США) Лигандный блоттинг.

Мембрану блокировали в 0,5 % желатина в буфере ФСБ, содержащим 0,05 % Твин-20, и инкубировали с биотинилированной проурокиназой (12 нМ) в блокирующем буфере в течение 2 ч при 25°С После отмывки от несвязавшихся лигандов мембрану инкубировали с раствором нейтравидина, коньюгированного с пероксидазой хрена (Pierce), в течение 1 ч при при 25°С Отмывку мембраны и детекцию белков осуществляли так же, как при иммуноблоттинге Получение общего клеточного лизата.

Клетки лизировали в 0,1М Трис/IICl буфере, содержащем 0,3 М NaCI, 1% тритон Х-100, коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США) Объем лизирующего буфера рассчитывали, исходя из соотношения 20 мкл лизис-буфера на 1 млн клеток Измерение активности урокиназы

Рекомбинантную урокиназу (15нМ) инкубировали в ФСБ в присутствии фибулина-5 (300 нМ) или uPAR (ЗООнМ) 30 минут при 37°С. Далее добавляли в пробы PAI-1 в различном молярном соотношении с иРА (от 0,1 до 5) и инкубировали 10 минут при 37°С. Амидолитическую активность урокиназы определяли по изменению оптической плотности раствора (405 нм) после добавления 0,5 мМ SpectozymeUK (American Diagnostica Inc.). Обработку данных проводили в программе SigmaPlot 8.0.

Зимография урокиназы в клетках линии МЕР и легких мышей, лишенных гена фибулина-5.

Клетки линии MEF растили до состояния конфлуента и лизировали, как описано выше Белки разделяли с помощью ДС-Na-TTAAr в невосстанавливающих условиях в 7.5% разделяющем геле, содержащем 1% молоко и 20 мкг/мл плазминоген. Гель последовательно инкубировали в буфере для ренатурации (Invitrogen) 60 мин при +25°С и в проявляющем буфере (Invitrogen) 24 часа, при +37°С. Для подавления активности металлопротеиназ в ренатурирующий и проявляющий буферы добавляли 5 шМ ЭДТА. Гель окрашивали с помощью красителя GelCode Blue (Pierce).

Твердофазный анализ связывания белков.

Рекомбинантный фибулин-5 или БСА (5 мкг/мл) инкубировали в ФСБ, содержащем 10тМ СаС12 и 5 mM MgCl2 в 96-и луночной планшете 24 часа при +25°С. Неспецифические участки связывания блокировали 1% БСА в ФСБ, содержащим 10тМ СаСЬ, 5 mM MgCb и 0,05% tween-20. Далее инкубировали плашки с урокиназой, лишенной «ростового» домена (125I-uPAAGFD) в блокирующем буфере, содержащим 0,1% БСА 1 час при 25°С и отмывали несвязавшийся лиганд. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 100 кратного избытка немеченного лиганда. Константу диссоциации рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism 4.0 (США).

Количественный метод обратной транскрипции-полимеразиой цепной реакции в реальном времени.

Тотальную РНК выделяли из клеток МЕР и тканей легкого мышей с помощью набора RNeasy Mini Kit по протоколу изготовителя (QIAGEN). Количество мРНК uPA, uPAR и PAI-1 определяли методом количественной обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции, с помощью набора реактивов «LightCycler RNA Master SYBR Green kit I» и прибора LightCycler (Roche Applied Bioscience), используя в качестве внутреннего стандарта отношение количества мРНК гена uPA, uPAR и PAI-1 к количеству мРНК актина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Взаимодействие урокиназы с интегрин-связывающими белком фибулином-5.

1.1 Выделение и иденти&икаиия белков, связывающих урокиназу без «ростового» домена.

Известны три рецептора урокиназы, такие как uPAR [Apella et al., 1987], интегрин Mac-1 [Pluskota et al., 2003] и белок внеклеточного матрикса витронектин [Moser et al., 1995], которые связывают урокиназу через ее аминотерминальный фрагмент. Протеолитический домен урокиназы содержит субстратный центр, связывающий плазминоген и основной физиологический ингибитор урокиназы - PAI-1 [Andreasen et al., 1986], а также LRP, gp330 и VLDLR, которые интернализуют урокиназу с поверхности клетки [Herz et al., 1992). Миграция сосудистых клеток под действием урокиназы активируется при связывании крингл-домена урокиназы с неидентифицированной мишенью [Mukhina et al., 2000; Poliakov et al., 1999; Goncharova et al, 2002]. Кроме того, в нашей лаборатории было показано образование на поверхности сосудистых клеток урокиназы, лишенной «ростового» домена, которая связывалась с клетками и быстро подвергалась эндоцитозу и деградации [Poliakov et al, 2001].

Мы использовали рекомбинантую форму урокиназы, лишенную ростового домена' для выделения новой мишени связывания урокиназы из гладкомышечных клеток медиального слоя аорты человека с помощью метода аффинной хроматографии. На рис. 1 видно, что из лизата медии аорты человека с урокиназой, лишенной «ростового» домена, связывается белок с кажущимся молекулярным весом 65 кДа (Рис 1, дорожка 3). Методом масс-спектрометрии нами были определены молекулярные веса и аминокислотный состав 4-х пептидов, содержащихся в белке р65: (R)DQPFT ILYR(D), (R) YPGAYYIFQI(S), (K)CIDPIRCEEPYLR(I), (R)SVPADIFQMQATTRYPGAYY IFQIK(S). С помощью базы данных Mascot мы обнаружили, что массы и аминокислотный состав пептидов белка р65 соответствуют фрагментам фибулина-5.

Юа 220 170

116 76

Рис. 1. Выделение белков из медии аорты человека, связывающихся с урокииазой, лишенной «ростового» домена.

Кумасси бриллиантовым синем Я-250 окрашивали ПЛАТ после эпектрофоретического разделения элюатов с БСА-сефарозы (дорожка 2) и иРАЛвРО—сефарозы (дорожка 3).

Более того, при сравнении состава полученных пептидов с аминокислотной последовательностью фибулина-5 была выявлена 100% гомология пептидов из белка рб5 с фрагментами фибулина-5. Таким образом, методом масс-спектрометрии мы определили, что белок с кажущейся молекулярной массой 65 кДа представляет собой фибулин-5.

1.2 Прямое взаимодействие урокиназы и белка внеклеточного матрикса <Ьибулина-5.

Фибулин-5 - это представитель семейства внеклеточных матриксных белков. Фибулины играют важную роль в регуляции роста и развития сосудов, в эмбриогенезе и процессах ремоделирования тканей во взрослом организме [Midwood et al., 2002; Nakamura et al., 1999]. Фибулины стабилизируют внеклеточный матрикс и участвуют в его развитии и организации в ходе эмбриогенеза, образуя гетеромерные комплексы с межклеточными белками. Полученный в последнее время ряд экпериментальных данных указывает на важную роль этих белков в коммуникации между клетками и матриксом [Timpl, 2003].

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что связывание фибулина-5 и урокиназы может играть ключевое значение в регуляции адгезии и миграции сосудистых клеток. Во-первых, фибулин-5 является регулятором роста, развития и ремоделирования сосудов. Так, фибулин-5 опосредует адгезию эндотелиальных клеток [Nakamura et al., 1999], связывает интегриновые рецепторы [Nakamura et al., 2002] и принимает участие в регуляции пролиферации и миграции фибробластов и эндотелиальных клеток [Albig et al., 2004; Schiemann et al., 2002]. Во-вторых, экспрессия фибулина-5 совпадает по времени и месту с экспрессией урокиназы в процессах ранозаживления. Как и урокиназа, фибулин-5 экспрессируется в стенке сосуда после повреждения [Kowal etal., 1999; Парфенова и сотр., 2004]. Показано, что экспрессия как фибулина-5, так и урокиназы, значительно возрастает в ходе активной миграции и пролиферации ГМК, фибробластов и эндотелиальных клеток [Kowal et al., 1999; Plekhanova et al., 2001]. В третьих, согласно нашим данным, миграция сосудистых гладкомышечных клеток под действием урокиназы зависит от активности р38 MAP киназы и ERK1/ERK2 (р42/44 MAP киназ), в то время как фибулин-5 модулирует активацию митоген-акгивируемых протеин киназ р38 МАРК and ERK1/ERK2 [Albig et al., 2004; Goncharova et al., 2002]. Поэтому мы предположили, что фибулин-

5, взаимодействуя с урокиназой, может принимать участие в регуляции протеолитических и сигнальных свойств урокиназы.

Для дальнейшего изучения взаимодействия урокиназы и фибулина-5 нами было проведено клонирование кДНК человеческого фибушна-5 человека. Так как фибулин-5 был открыт недавно и в настоящее время не доступны коммерческие антитела для фибулина-5, то мы включили С-концевую МУС-последовательность в кДНК фибулина-5. Клетки линии СНО, трансфицированные вектором рСМУ-РВ1ЛЧ5, кодирующим фибулин-5, секретировали в среду фибулин-5 с мол. массой 65 кДА, что соответсвует литературным данным [Ко\уа1 е1 а1., 1999].

Для того, чтобы установить, происходит ли связывание урокиназы с фибулином-5 в нативных условиях, мы исследовали связывание фибулина-5 из сред культивирования клеток линии СНО, трансфицированных плазмидой рСМУ-РВЬЫ5 с иммобилизованной урокиназой в отсутствие детергентов. Фибулин-5 специфически связывался с иммобилизованной урокиназой (Рис. 2А, дорожка 4), но не с иммобилизованным БСА (Рис. 2А, дорожка 3), что свидетельствует в пользу специфического связывания изучаемых нами белков.

Для доказательства прямого взаимодействия урокиназы и фибулина-5 мы использовали метод лигандного блота. Фибулин-5, иммобилизованный на ПВДФ окрашивался биотинилированной формой урокиназы. (Рис. 2Б). Положение полученной полосы соответствовало фибулину-5, выявленному с помощью специфических антител против МУС-последовательности (Рис 2Б). Специфичность данного взаимодействия также была подтверждена с помощью со-преципэтации фибупииа-5 и урокиназы из сред культивирования клеток. Урокиназа со-преципитировалась с помощью антител против МУС-последовательности, входящей в структуру фибулина-5 (Рис 2В), но не с помощью неспецифических иммуноглобулинов кролика.

Таким образом, нам удалось установить, что урокиназа способна непосредственно взаимодействовать с фибулином-5.

Для определения аффинности взаимодействия урокиназы и фибулина-5 мы использовали метод твердофазного анализа связывания белков. Для этого мы иммобилизовали рекомбинантный человеческий фибулин-5 и инкубировали с гликозилированной человеческой урокиназой (1251-иРАДСГО). Как видно из рисунка 2Г, мы наблюдали специфическое связывание урокиназы с иммобилизованнм фибулином-5, при этом величина К<1 составила 82±15 нМ.

1.3 Доменная спеиифичность взаимодействия урокиназы и фибулина-5.

Поскольку урокиназа представляет собой мультидоменный белок, было необходимо установить, с каким доменом урокиназы взаимодействует фибулин-5. Для установления доменной специфичности взаимодействия урокиназы и фибулина-5 нами был использован метод аффинной хроматографии на основе иммобилизованных рекомбинантных форм урокиназы (Рис. ЗА). Фибулин-5 связывался с иммобилизованными рекомбинантными формами урокиназы, содержащими в своей структуре протеолитический домен (Рис. ЗБ). Контрольный сорбент, а

также иммобилизованый аминотерминальный фрагмент урокиназы, содержащий только крингл- и «ростовой» домен, не связывали фибулин-5. Таким образом, нами было установлено, что фибулин-5 взаимодействует с протеолитическим доменом урокиназы.

ВЕКТОР:

рСМУ-вРР рСМУ-гаии

ИММОБИЛИЗОВАН -НЫЙ БЕЛОК: ^

ФИБУЛИИ

НИ

ИП: ИБ:

ВЕКТОР: ФИБУЛИН-5 -ДЕТЕКЦИЯ: ЦРА-Ыа№| АипкчпуеАТ

са а» заа «о

"Ч-иРАДОРО, пМ

Рис. 2. Прямое связывание фибулина-5 и урокиназы

А - Анализ связывания белков из сред культивирования клеток СНО, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок вИР (рСМУСБР) или фибулин-5 ( рСМУ-РВЬГО), с БСА-сефарозой и иРА-сефарозой, с помощью иммуноблоттинга с антителами против МУС-эпитопа. Б - Лигандный блоттинг белков, связавшихся с УК-сефарозой.

Белки из сред культивирования клеток линии СНО, трансфиуированных вектором рСМУ-РЫЛ или рСМУ-связавшиеся с иРА-сефарозой, были выявлены с помощью окрашивания мембраны ПВДФ биотинилированной урокинаэой (иРА-ЫоНп) или антитеп против МУС-тследовательности (Анти-с-тус АТ).

В - Ко-иммунопрецилитация урокиназы и фибулина-5 из клеточных сред.

Иммунопреципитацюо фибулина-5 проводили с помощью антител против МУС -последовательности (Анти-с-тус) или неспецифических иммуноглобулинов кролика (1%0). Связавшиеся белки выявляли с помощью иммуноблоттинга с антителами против МТС-последовательности (ИП) или нейтравидина, коньюгированного с пероксидазой хрена против биотинилированной урокиназы (ИБ). Г - Связывание урокиназы с иммобилизованным рекомбинантным человеческим фибулином-5 Рекомбинантый фибулин-5 или БСА иммобилизовали на 96-и купонную плашку и инкубировали с рекомбинантной гликозилированной формой урокиназы, '"/-иРААСРй в диапазоне концетраций 0.5-400 пМ. Вставка: Детекция иммобилизованного на 96-и луночную плашку фибулина-5 с помощью иммуноферментного анализа.

Фибулин-5 содержит интегрип-связывающий 1КГО-мотив, 6 Са-связывающих доменов, подобных эпидермальному ростовому фактору (ЕС!7) и глобулярный С-концевой домен [Ыакатига е1 а!., 1999; Ко\уа1 et а1., 1999]. Первый домен сЬ-ЕОР-подобный домен содержит 1КЮ последовательность, связывающуюся с интегринами [Ко\уа1 е1 а1, 1999]. Показано, что С-

глобулярный домен также вовлечен в образование комплексов с рядом внеклеточных белков, таких как как тропоэластин [Yanagisawa et al., 2002], аполипопротеин (a) [Kapetanopoulos ert al., 2002], внеклеточная супероксиддисмутаза [Nguyen et al, 2004], а также белок, подобный лизил-оксидазе 1 (LOXL-1) [Liu etaL, 2004].

upa-wt upaaofo

+ У л J9J

f f Г f

12 12 12 12

-шз-ежжшшэ

леии дст дет« wt

51 —I

> 4EFG1

39-

Рис. 3. Доменная специфичность связывания урокииазы и фибулнна-5.

А - Рекомбинантиые формы урокиназы. вРО - домен, гомологичный «ростовом» фактору, КО -крингл-домен, Рй - протеазный домен

Б - Связывание фибуляна-5 с рекомбинантными формами урокиназы. Аффинные матржсы, содержащие эквимолярное количество иммобилизованных форм урокиназы (1 - агароза с иммобилизованными антителами против ШС-последовательности, 2 - контрольная сефароза, 3 - ЬМ№-сефароза, 4 - А7Т - сефароза, 5 - иРАДСРП - сефароза 6 - иРА-лЧ - сефароза) инкубировали с средами культивирования клеток, содержащими фибулин-5. Анализ связавшихся белков проводили с помощью иммуноблоттинга с антителами против МУС-эпитопа.

В - Мутантные формы фибулина-5, экспресированные в клетках линии НЕК. ЕвП-б - Са3*-связывающие домены, подобные зпидермальному ростовому фактору, ЯСгО - интегрин-связывающая последовательность; АСТ48 - фибулин-5, лишенный 48 С-концевых аминокислот (ао 400-448), АСТ -фибулин-5, лишенный С-терминального глобулярного домена (ао 342-448), АЕвР1 - фибулин-5, лишенный интегрин-связывающего, Ы-кощевого первого Се/*- связывающего домена, подобного зпидермальному ростовому фактору (ао 41-68).

Г - Связывание мутантных форм фибулина-5 с иммобилизованной урокиназой. Клетки линии НЕК293 трансфщировали плазмидами, содержащими мутантные формы фибулина-5 и через 48 часов визировали клетки. Сверху - 100 мкг лизата клеток инкубировали с БСА-сефарозой (1) или УК-сефарозой (2), и анализировали связавшиеся белки с помощью метода иммуноблоттинга. Внизу - анализ экспрессии мутантных форм фибулина-5 в лизатах трансфецированных клеток НЕК293 методом иммуноблоттинга.

Для определения домена фибулина-5, вовлеченного в связывание урокиназы, мы

использовали экспрессиониые векторы, содержащие мутантные формы фибулина-5, лишенные интегрин-связывающего или глобулярного доменов (Рис ЗВ) Анализ связывания мугантных форм фибулина-5 с иммобилизованной формой урокиназы показал, что урокиназа связывается с формами фибулина-5, содержащими С-глобулярный домен, и не связывается с фибулином-5, лишенным С-глобулярного домена (Рис ЗГ, верхняя панель). Таким образом, участок связывания с урокиназой находится с С-глобулярном домене фибулина-5 (аминокислотные остатки 320 - 448).

1.4 Взаимодействие <Ьибулина-5 с урокиназой на клеточной поверхности

Ранее было показано, что фибулин-5 опосредует интегрин-зависимую адгезию эндотелиальных сосудистых клеток человека, а также участвует в регуляции формирования сосудистых капилляров [Nakamura et al., 1999; Albig et al., 2004]. Мы предположили, что формирование комплекса, включающего урокиназу, ее рецептор и фибулин-5 на поверхности эндотелиальных клеток отвечает за сигнальные свойства урокиназы и фибулина-5. Нами было проведено иммуноцитохимическое исследование распределения эндогенной урокиназы, ее рецептора uPAR и фибулина-5 на поверхности эндотелиальных сосудистых клеток вены пуповины человека. В результате этого мы обнаружили крупные (~200 Цт) агрегаты фибулина-5 в ламеллоподиях эндотелиальных клеток (Рис 4, квадраты А, Е). Урокиназа локализуется также в ламеллоподиях клетки (Рис. 4, квадрат В). При сравнении распределения урокиназы и фибулина-5, видно, что урокиназа и фибулин-5 ко-локализуются в ламеллоподиях (Рис. 4, квадрат D). Отметим, что рецептор урокиназы, uPAR, окрашивался главным образом в ламеллоподиях клетки (рис. 4, квадрат Б), что соответствует литературным данным [Andreasen et al., 1997]. При этом, в данной области клетки наблюдается значительная колокализация урокиназы и фибулина-5 (Рис 4, квадрат Н). Таким образом, нами было установлено, что фибулин-5 и урокиназа ко-локализуются на клеточной поверности. Ко-локализация урокиназы, ее высокоаффинного рецептора uPAR и фибулина-5 наблюдается в ламеллоподиях эндотелиальных сосудистых клеток пупочной вены человека.

2. Влияние фибулина-5 на протеолитнческую активность урокиназы.

3.1 Влияние фибулина-5 на активность урокиназы.

Урокиназа является протеазой узкой специфичности, которая осуществляет активацию плазмина. До настоящего времени были описаны только эффекты uPAR на протеолитнческую активность урокиназы. Связывание урокиназы с рецептором приводит к значительному увеличению скорости активации плазминогена, а увеличение скорости образования плазмина по принципу обратной связи приводит к значительному увеличению скорости активации проурокиназы [Ellis, 1989]. Ранее также было показано, что такие матриксные белки, как коллаген 1-го и 4-го типов, фибронектин, ламинин и витронектин [Moser TL, 1995], а также тромбоспондин [Silverstein et al., 1990] не оказывают влияния на каталитическую активность УК .

Рис 4 Локализация урокиназы, ее рецептора и фибулина-5 на поверхности эндотелиальных сосудистых клеток пупочной вены человека.

Урокиназу, рецептор uPAR и фибулин-5 выявляли с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания эндотелиальных сосудистых клеток вены пуповины человека в непермеабилизующих условиях Урокиназа (квадрат В) и ее рецептор (квадрат F) показаны красным цветом, фибулин-5 - зеленым (квадраты А, Е), желтый цвет соответствует колокализации урокиназы и фибулина-5 (квадрат D) и колокализации рецептора урокиназы uPAR и фибулина-5 (квадрат Н) Ядра клеток окрашивали DAPI (синее окрашивание, квадраты С и G).

Мы предположили, что фибулин-5, взаимодействуя с протеолитическим доменом урокиназы, может, во-первых, влиять на конформацию ее активного центра, и, во-вторых, создавать стерические затруднения для связывания субстрата, изменяя таким образом эффективность активации ллазминогена урокиназой Для того, чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали влияние фибулина-5 на амидолитическую активность урокиназы Как оказалось, фибулин-5 не оказывал влияния на активность урокиназы в отношении синтетического субстрата.

Для того, чтобы выяснить, влияет ли фибулин-5 на активность урокиназы in vivo, мы исследовали, как отсутствие гена фибулина-5 влияет на активность урокиназы. Мы измерили активность урокиназы методом зимографии в эмбриональных фибробластах мыши, а также лизатах тканей легкого мышей, лишенных гена фибулина-5. Как видно из рис. 5А, удаление гена фибулина-5 приводит к снижению активности урокиназы как в лизатах клеток линии MEF, так и лизатах легкого мыши Так как фибулин-5 не оказывал влияния на протеолитическую активность урокиназы, то мы предположили, что фибулин-5 стимулирует экспрессию урокиназы, ее рецептора uPAR, или снижает уровень экспрессии ингибитора РА1-1.Так, ранее было показано влияние фибулина-5 на экспрессию ангиогенных факторов, таких как VEGF и тромбосповдин [Albig et al., 2004]. Мы сравнили уровень экспрессии урокиназы, ее высокоаффинного рецептора и основного физиологического ингибитора, PAI-1, в клетках MEF и легких мышей, <<дикого» типа и лишенных гена фибулина-5, с помощью метода обратной транскрипции - полимеразной цепной

реакции в реальном времени. Как видно из рис. 5Б, отсутствие гена фибулина-5 не влияло на уровень экспрессии урокиназы, ее высокоаффинного рецептора UPAR/CD87, а также основного физиологического ингибитора урокиназы PAI-1.

Анализ полученных данных позволяет сделать заключение, что фибулин-5 увеличивает активность урокиназы in vivo, не влияя на уровень ее экспрессии.

lililí 3

uRA uPAR PAI uPA UPAR PAI

MEF Легкие

Рис. 5. Влияние фибулина-5 на активность и экспрессию урокиназы.

А - Зимографический анализ активности урокиназы в клетках MEF «дикого типа» (WT) и лишенных гена фибулина-S (КО).

Б - Анализ экспрессии uPA, uPAR и PAI-1 в клетках MEF и легких мышей «дикого типа» (WT) и лишенных гена фибулина-5 (КО) с помощью метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени.

3.2 Влияние фибулина-5 на подавление активности урокиназы под действием PAI-1.

Околоклеточная активность урокиназы контролируется ее физиологическими ингибиторам, одни из важнейших которых является РАМ, который образует эквимолярный ковалентный комплекс с активным центром урокиназы, полностью ингибируя ее активность [Loskutoff et al., 1989]. Формирование данного комплекса приводит к быстрому эндоцитозу комплекса uPA-PAI-1 с клеточной поверхности и деградации урокиназы [Nykjaer et al., 1994]. Мы предположили, что фибулин-5, связываясь с каталитическим доменом, может препятствовать формированию комплекса урокиназы с PAI-1. Для того чтобы проверить эту гипотезу, мы измерили скорость инактивации урокиназы под действием PAI-1 в присутствии фибулина-5. Как видно на рис. 6, в присутствии 20 кратного молярного избытка фибулина-5 при молярном соотношении uPA:PAI

равном 1:2,5, остаточная активность урокиназы составляет =«40% и не изменяется при увеличении молярного соотношения иРА:РА1 до значения 1:5. Таким образом, фибулин-5, связываясь с протеолитическим доменом частично защищает урокиназу от подавления ее активности физиологическим ингибитором РА1-1.

Для того, чтобы определить, влияет ли фибулин-5 на формирование комплекса иРА-РА1-1, мы исследовали распределение эндогенной урокиназы в клетках линии МЕР едикого» типа и клеток линии МЕР, не экспрессирующих фибулин-5. При окрашивании данных клеток с помощью иммуноблота мы обнаружили, что содержание свободной урокиназы (-45 кДа) составляет ~ 62%, а - 38% урокиназы связано с РА1-1 (Рис. 7 А, Б). В клетках линии МЕР, не экпрессирующих фибулин-5, мы наблюдали снижение содержания урокиназы в свободном виде до - 20% и увеличенное, до ~ 80%, содержание комплекса иРА-РА1-1 (Рис. 7 АД>). Отметим, что РАН

экспрессировапся обоими линиями клеток в избытке (Рис. 7, Б). £

РА1-"ИсиРА

Рис. 6. Подавление активности ^иРА под действием РА1-1 в присутствии фибулииа-5 (•) или иРАН ( ▲ ).

иРА (15 нМ) инкубировали в присутствии 300 нМфибулина-5 или 300 нМ иРАЯ и добавляли к гробам РА1-1 Активность >сиРА измеряли по скорости расщепления амидолити ческого субстрата Зрес&огутеиК. За 100% принимали активность урокиназы в отсутствии РА1-1. Вставка - амидолитическая активность урокиназы в присутствии 5 кратного молярного избытка РА1-1

3. Влияние фибулииа-5 на хемотактические свойства урокиназы.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что урокиназа является ключевым регулятором роста и ремоделирования Кровеносных сосудов [МикЫпа е1 а1., 2000]. Связывание

фибулина-5 с урокиназой могло влиять на интегрин-зависимую миграцию клеток, стимулированных урокиназой. Поэтому мы исследовали влияние фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы. Для изучения влияния фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы нами были получены клоны клеток линии НЕК, стабильно гиперэкспрессирующие фибулин-5, фибулин-5 с заменой 1КЮ/1ША или вРР. Как видно из рис. 8Б, урокиназа стимулировала миграцию контрольных клеток линии СЕР в «1,5 раза, а факторы роста стимулировали миграцию клеток в •= 2,5 раза. Урокиназа не стимулировала миграцию клеток НЕК, экспрессирующих фибулин-5 дикого типа, а также фибулин-5/1ША (Рис 8Б).

КО ОТ

100

Фибулин-5

иРА-РАМ УРА

1иРА |

шт-РАи] црая

РАМ

Актин

Рис 7. Относительное содержание иРА и комплекса иРА-РАЫ в клетках линии МЕР содержащих (WT) и ие содержащих фибулия-5 (КО).

А - Среднее содеражние иРА и комплекса иРА-РА1-1 в клетках линии МЕР.

Клетки линии МЕР «дикого типа» (ТУТ) и клетки линии МЕР, не содержащих гена фибулина-5 (КО) растили до состояния конфлуента и анализировали содержание иРА, иРА-РА1-1, иРАЯ и РА1-1 методом иммуноблоттинга.

Б - Содержание фибулина-5, иРА, иРА- иРАЯ, РА1-1 и актина в клетках МЕР «дикого типа» (\УТ) и лишенных гена фибулина-5 (КО).

В то же время, степень стимуляции клеток, экспрессирующих фибулин-5 или фибулин-5 (1ЮА), а также контрольных клеток под действием факторов роста была одинакова. При сравнении подвижности различных клонов клеток, стимулированных факторами роста, было показано, что клетки, экспрессирующие фибулин-5 дикого типа или мутантный фибулин-5, обладают значительно меньшей подвижностью, чем контрольная линия клеток (Рис 8Б). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что фибулин-5 подавляет хемотактический эффект

урокиназы и клеточную подвижность. Это свойство фнбулина-5 не зависит от его взаимодействия с интегринами, так как мутация интегрин-связывающего участка не приводит к изменению его влияния на хемотактические свойства урокиназы.

Ш ФИБТЛМН-5 «ВИШН-ЯНИ

* и>

ми

Рис. 8. Подавление подвижности клеток и хемоаттрактивных свойств урокиназы под действием фнбулина-5.

А - Влияние гиперэкспрессии фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы. Миграцию клонов клеток НЕК, гиперэкспресирующих GFP, фибулин-5, или мутантный фибулин-5 (фибулин-5/RGA) стимулировали добавлением среды культивирования, не содержащей сыворотки (светлые столбцы), содержащей 100 нМ рекомбинантную урокиназу человека дикого типа (заштрихованные столбцы) или содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотки (черные столбцы), и измеряли с помощью камеры Бойдена.

В - Влияние гиперэкспрессии фибулина-5 на подвижность клеток НЕК, стимулированных ростовыми факторами.

Миграцию клонов клеток НЕК, гиперэкспресирующих GFP, фибулин-5, или мутантный фибулин-5 (фибулин-5/RGA) стимулировали добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки.

Таким образом, связывание фибулина-5 и урокиназы может играть ключевое значение в регуляции адгезии и миграции сосудистых клеток in vivo. Недавно были получены первые свидетельства функциональной значимости формирования комплекса урокиназа-фибулин-5 in

vivo. Мыши, лишенные гена фибулина-5, демонстрировали увеличение числа и степени тромбозов при лигировании сонной артерии [Spencer et al., 2005]. Мы предполагаем, что данный эффект связан с тем, что удаление гена фибулина-5 приводит к увеличению степени ингибирования урокиназы PAI-1. Данные о влиянии фибулина-5 на связывание урокиназы с PAI-l, наблюдаемые нами как in vitro, так и в легких мышей подгвеждают эту гипотезу.

ВЫВОДЫ

1. Методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизированной урокиназой был выделен белок с мол. массой 65 кДа и определена его структура методом масс-спектрометрии.

2. Установлено, что фибулин-5 через С-глобулярный домен связывается с протеолитическим доменом урокиназы с Kd ~ 82 ± 15 нМ. Показано, что фибулин-5, урокиназа и ее рецептор колокализуются в ламеллоподиях эндотелиальных клеток вены пуповины человека.

3. Установлено, что лизаты эмбриональных фибробластов и экстракт легочной ткани мышей дикого типа обладают более выраженной фибринолитической активностью по сравнению с клетками и тканями мышей, лишенных гена фибулина. Следовательно, фибулин-5 способен защищать урокиназу от инактивации ингибитором РАМ.

4. Сверхэкспрессия фибулина-5 в клетках линии НЕК приводит к подавлению клеточной подвижности, а также ингибированию хемотактического действия урокиназы на эти клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Капустин АН., Е.П. Тищенко, H.A. Торосян, О.Б. Панина, З.И. Цоколаева, Е.И. Ратнер, Г.М. Савельева, Е.В. Парфенова (2005) Влияние гипоксии на урокиназную и аденилатциклазную системы в культуре эндотелиальных клеток вены пуповины человека. Росс. Физиол. Журнал им. ИМ. Сеченова; 91(6): 686-96.

2. Капустин АН., H.A. Торосян, Г.Н. Рыжаков, Е.И. Ратнер, В.В. Степанова, Е.В. Парфенова, В.А. Ткачук (2005) Взаимодействие фибулина-5 с урокиназой. Технологии живых систем-, 2 (3), 7-16

3. Капустин А.Н., Поляков A.A., Торосян H.A., Степанова В.В. (2002) Выделение и изучение свойств нового рецептора урокиназы. Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества, Саикг-Пеггербург, Россия.

4. Поляков A.A., Капустин А.Н., Белоглазова И.Б., Торосян H.A., Степанова В.В. (2002) Протеолитический процессинг урокиназы на поверхности клетки: новый механизм регуляции ее эндоцитоза». V Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва, Россия.

5. Поляков A.A., Капустин А.Н., Белоглазова И.Б., Торосян H.A., Степанова В.В. (2002) Новый тип

протеолитического процессинга урокиназы. Тезисы научных докладов Ш съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия.

6. Капустин А.Н., Рыжаков Т.Н., Борисова М.Ю., Степанова В.В. Выделение и идентификация нового сигнального белка - адаптера урокиназы. Материалы X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2003», Москва, Россия.

7. Kapustm A. N., N.A. Torosyan, G.N. Rizgakov., V.V. Stepanova, V.A. Tkachuk (2004) Interaction of fibulin-5 and urokinase on the cell surface: possible role in regulation of cell motility. European Journal of Biochemistry, 271, suppl. 1., 143.

8. Kapustin AN, Stepanova V, Parfyonova Y, Cines DB, Tkachuk VA (2005) Interaction of urokinase with the matrix protein fibulin-5 protects it from inactivation by PAI-1. Xth international Workshop on molecular and cellular biology of plasminogen activator; Thromb Haemost, 93, A20.

Работа выполнена при Финансовой поддержке РФФИ (гранты 04-04-49481-а и 05-04-49278-а) и гранта Президента РФ НШ-1903.2003.4.

I »

i i

»?0 2l j

РНБ Русский фонд

2006-4 18936

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Капустин, Александр Николаевич

СПИСОК СОКР АЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Структура и функции урокиназы.

Структура урокиназы.

Функции урокиназы.

Глава II. Регуляция активности урокиназы.

Регуляция экспрессии урокиназы.

Посттрансляционные модификации урокиназы.

Белки-регуляторы протеолитической и сигнальной функции урокиназы.

Глава Ш Фибулин-5 - новый регулятор ремоделирования сосудов и тканей.

Структурная организация семейства фибулинов.

Структура и функции фибулина-5.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Химические реактивы.

Культуральные среды и пластик.

Антитела.

Рекомбинантная урокиназа.

Рекомбинантный фибулин-5.

Определение концентрации белка в пробах.

Иммобилизация белков.

Аффинная хроматография белков, связывающихся. с урокиназой без «ростового» домена.

Секвенирование белков.

Приготовление вектора pCMV-FBLN5.

Сайт-направленный мутагенез.

Получение химически компетентных клеток E.coli.

Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

Культивирование и трансфекция культуры клеток.

Аффинная хроматография и иммунопреципитация фибулина-5 из кондиционных сред трансфецированных клеток линии СНО и НЕК293.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток.

Биотинилирование урокиназы.

ДСН-электрофорез.

Иммуноблотгинг.

Лигандный блоттинг.

Получение общего клеточного лизата.

Измерение активности урокиназы.

Зимография урокиназы.

Твердофазный анализ связывания белков.

Количественный метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Выделение и идентификация белков, связывающих урокиназу.

1-1. Поиск белка, связывающего урокиназу без «ростового» домена.

1-2. Идентификация белка с кажущейся молекулярной массой 65 кДа методом масс-спектрометрии.

2. Взаимодействие урокиназы и белка внеклеточного матрикса фибулина-5.

2.1. Клонирование кДНК фибулина-5 и его экспрессия в клетках СНО.

2.2 Прямое взаимодействие урокиназы и фибулина-5.

2.3 Взаимодействие фибулина-5 с урокиназой на клеточной поверхности.

2.4. Доменная специфичность взаимодействия урокиназы и фибулина-5.

2.6 Фибулин-5 как возможный протеолитический субстрат урокиназы.

3. Влияние фибулина-5 на протеолитическую активность урокиназы.

3.1 Влияние фибулина-5 на амидолитическую активность урокиназы и скорость активации плазминогена.

3.2 Влияние фибулина-5 на активность урокиназы в клетках и тканях легкого.

3.4. Влияние фибулина-5 на подавление активности урокиназы под действием РА1-1.

4. Влияние фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Взаимодействие урокиназы с интегрин-связывающими белком фибулином-5.

2. Фибулин-5 участвует в регуляции протеолитической активности урокиназы.

3. Фибулин-5 является ингибитором хемотактических свойств урокиназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы"

Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа) играет важную роль в регуляции таких биологических процессов, как ангиогенез (Rabbani et al., 2001) ранозаживление (Berta et al., 1990), воспаление (Busso et al., 1998), атеросклероз (Okada et al., 1998), образование аневризмы (Carmeliet et al, 1997) и метастазирование опухолей (Ossowski et al., 1991). Урокиназа специфически расщепляет плазминоген и обеспечивает протеолиз фибриновых сгустков (Vassalli et al., 1991), а также стимулирует клеточную адгезию и миграцию (Chapman et al., 1997). Удаление гена урокиназы у мышей приводит к увеличению количества спонтанных тромбозов и отложению фибрина в кишечнике, синусоидных капиллярах печени (Carmeliet et al, 1994). Для мышей, лишенных гена урокиназы, характерна меньшая выживаемость при микроэмболии легких (Bdeir et al., 2000) и усиление процессов тромбообразования в ответ на воздействие эндотоксинами (Carmeliet et al., 1994) или гипоксией (Pinsky et al., 1998). С другой стороны, у этих мышей наблюдалось значительно менее выраженное образование неоинтимы в ответ на повреждение сосуда (Carmeliet et al., 1997).

Урокиназа является протеазой серинового типа и состоит из 3 доменов: N-концевого домена, гомологичного эпидермальному фактору роста (GFD, аминокислоты 1-43), крингл домена (KD, аминокислоты 44-135) и протеолитического домена (LMW, аминокислоты 136411) (Степанова и Ткачук, 2002). Через «ростовой» домен урокиназа связывается с высокоаффинным рецептором uPAR (Appella et al., 1987; Ploug et al 1998). Протеазный домен урокиназы содержит активный центр фермента и опосредует активацию плазминогена. Активность урокиназы контролируется ее физиологическими ингибиторам, важнейшим из которых является представитель из семейства серпиновых ингибиторов PAI-1, образующий ковалентную связь с серином в активном центре (Loskutoff et al., 1989). Крингл-домен урокиназы принимает участие в связывании интегринов (Pluskota et al., 2004), а также стабилизирует связывание урокиназы с uPAR (Bdeir et al., 2003). В нашей лаборатории было показано, что крингл домен опосредует хемотактический эффект урокиназы (Mulchina et al., 2000).

Секретируемая клетками одноцепочечная форма урокиназы проявляет низкую пептидазную активность в отношении синтетических субстратов (Pannell et al., 1987). При активации плазмином происходит расщепление связи Lys158-Ile159, и образуется двухцепочечная форма урокиназы, которая состоит из двух полипептидных цепей,

148 279 связанных между собой дисульфидной связью Cys -Cys (Kasai et al., 1985). Активная двухцепочечная форма урокиназы обладает пептидазной активностью по отношению к синтетическим субстратам и плазминогену (Lijnen et al., 1990). Двухцепочечная урокиназа быстро и необратимо инактивируется PAI-1, присутствующим в плазме в большом молярном избытке. Более того, при образовании тромба концентрация PAI-1 значительно увеличивается в результате секреции PAI-1 тромбоцитами и сосудистыми клетками (Fujii et al., 1992; Schafer et al., 2003). uPAR-связанный ковалентный комплекс урокиназы с PAI-1 взаимодействует с рецептором из семейства LRP и интернализуется через окаймленные ямки. Урокиназа и PAI-1 подвергаются деградации в лизосомах, в то время как uPAR возвращается на поверхность клетки (Nylcjaer et al., 1994; Czekay et al., 2001). Урокиназа, связанная с uPAR, менее подвержена ингибированию под действием PAI-1, чем свободная форма фермента (Ellis et al., 1990). Молекулярные механизмы сохранения протеолитической активности двухцепочечной урокиназы в условиях избытка PAI-1 в процессах лизиса тромба, клеточной миграции и ремоделирования сосудов не выяснены.

Недавно в нашей лаборатории было показано существование на клетках дополнительных участков связывания для урокиназы, один из которых взаимодействует с урокиназой через ее протеолитический домен (Poliakov et al., 2001), тогда как другой проявлял способность связывать крингл-домен. Взаимодействие со вторым участком не зависело от присутствия в структуре урокиназы «ростового» домена и приводило к стимуляции урокиназой миграции клеток (Mukhina et al., 2000). Также было установлено, что на поверхности клеток может происходить образование формы урокиназы, лишенной «ростового» домена, которая не способна связываться с uPAR. Урокиназа без «ростового» домена подвергалась при этом быстрому LRP-зависимому эндоцитозу и внутриклеточной деградации (Poliakov et al., 2001). Поскольку было показано, что LRP опосредует активацию миграции и пролиферации клеток, а также вовлечен в регуляцию проницаемости сосудистой стенки (Lillis et al., 2005), нами было высказано предположение, что новая мишень, совместно с LRP, может обеспечивать связывание урокиназы без «ростового» домена с поверхностью клеток, а также принимать участие в регуляции ее ферментативной и хемотактической активности.

В связи с этим, целью нашей работы было выделение, идентификация и характеристика новой мишени связывашет урокиназы, отличной от известного рецептора иРАК/СВ87. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:

2. Охарактеризовать аффинность и доменную специфичность взаимодействия урокиназы с новой мишенью.

3. Изучить влияние нового партнера урокиназы на ее функциональные свойства-протеолитическую активность, взаимодействие с физиологическим ингибиторами, а также хемотактические свойства.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Гпава I. Структура и функции урокиназы.

Активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа или uPA) (ЕС 3.4.21.3.1) это внеклеточная сериновая протеаза с узкой субстратной специфичностью, принимающая участие в превращении плазминогена в плазмин. В организме человека урокиназа секретируется различными типами клеток - моноцитами/макрофагами (Saksela et al, 1985), опухолевыми клетками (Stump et al, 1986), фибробластами (Eaton et al. 1984), гладкомышечными клетками (Clowes et al., 1990) и эндотелиальными клетками (Pepper et al., 1987). Среднее содержание урокиназы в плазме человека составляет 5-10 мкг/л (Wun et al., 1982).

СтруЕоура урокиназы.

Урокиназа секретируется клетками в виде гликозилированного одноцепочечного белка, проурокиназы, с молекулярной массой 54 000 Да, состоящего из 411 аминокислотных остатков (Salerno et al, 1984; Gunzler et al., 1982). В структуре урокиназы выделяют три домена - N-концевой, «ростовой» домен, аналогичный по структуре эпидермальному фактору роста (аминокислотные остатки 9-45), крингл-домен (аминокислотные остатки 45134) и С-концевой каталитический домен (аминокислотные остатки 144-411) (рис. 1). "Ростовой" домен урокиназы обеспечивает ее взаимодействие с высокоаффинным рецептором uPAR/CD87 на поверхности клеток (Appella et al., 1987). Протеолитический домен содержит активный центр урокиназы и осуществляет активацию плазминогена и ряда факторов роста. Крингл-домен содержит участки связывания с PAI-1 (Mimuro et al., 1992), интегринами (Pluskota et al., 2004; Kwak et al., 2005), а также стабилизирует связывание проурокиназы с uPAR (Bdeir et al., 2003). Каждый из доменов урокиназы имеет жесткую структуру, поддерживаемую внутренними дисульфидными связями, из которых три находятся в «ростовом» домене, три - в крингл-домене и шесть - в протеиназном домене (Kobayashi et al„ 1985).

Крингл домен

Протеиназный домен

Рисунок 1 Структура урокиназы. Активный центр образуют аминокислотные остатки -His204, Asp255 и Ser356, отмеченные желтым цветом.

С помощью рентгеноструктурного анализа и ЯМР было показано, что индивидуальные домены белка обладают значительной степенью свободы и большой подвижностью относительно друг друга (Oswald et al., 1989).

Одноцепочечная урокиназа не способна проявлять пептидазную активность в отношении синтетических субстратов, поэтому такую форму фермента называют проурокиназой или одноцепочечной урокиназой (sc-uPA). Плазмин, а также ряд других протеаз, способны расщеплять пептидную связь Lys158-Ile159 в проурокиназе и переводят ее в активную двухцепочечную форму (см. ниже).

Урокиназа принимает участие в таких физиологических и патологических процессах, как ангиогенез (Эмегсг ег а!., 1999; СагтеНе^ 2000), ремоделирование сосудов (ТкасЬик ег а1., 1996; Carmeliet е1 а1., 1997; Р1екЬапоуа е! а1., 2001), воспаление (Оуе1ко et а1., 1996; Веек

Функции урокиназы. et al., 1999), рост и метастазирование злокачественных опухолей (Mohanam et al., 1999). Ключевое значение урокиназы в регуляции миграции и пролиферации сосудистых клеток подтверждено многочисленными данными in vivo. Так, на модели балонирования сонной артерии крысы было показано, что после удаления эндотелия, экспрессия урокиназы гладкомышечными клетками значительно увеличивается уже через 16-24 ч после повреждения и происходит во время периода интенсивной миграции и пролиферации ГМК (Clowes et al., 1990). Через б недель после заживления повреждения сосуда, экспрессия урокиназы значительно снижается (Reidy et al., 1996). Периадвентициальное нанесение урокиназы приводит к стимуляции миграции ГМК и формированию неоинтимы, причем данный эффект обуславливает как протеолитическая, так и сигнальная активности урокиназы (Plekhanova et al., 2000).

Протеолитическая активность урокиназы.

Активаторы плазминогена урокиназного (иРА или урокиназа) и тканевого (tPA) типов являются ключевыми компонентами системы фибринолиза, поскольку они специфически расщепляют плазминоген и превращают его в плазмин (Ossowski et al., 2000). uPA и tPA гидролизуют пептидную связь Arg560-Val561 плазминогена, неактивного профермента, и превращают его в плазмин - протеазу с широким спектром специфичности. При образовании внутрисосудистых тромбов, основу которых составляет полимерный фибрин, для восстановления кровотока включается система активаторов плазминогена, и образовавшийся плазмин непосредственно расщепляет фибрин, что приводит к растворению тромба

Добровольский и Титаев, 2002). Плазмин также участвует в расщеплении белков внеклеточного матрикса и базальной мембраны, таких как фибриноген, ламинин, коллаген.

Кроме того, плазмин опосредует активацию матриксных металлопротеиназ - коллагеназы

ММП-1), стромелизина (ММП-3) и желатиназы В (ММП-9) (Lijnen et al., 2002).

Тканевой активатор пламиногена вовлечен в процесс лизиса сосудистого тромба, а урокиназа играет роль в активации плазминогена на поверхности клеток. (Ellis et al., 1989).

Совместное действие комплекса активаторов плазминогена, плазмина и металлопротеиназ на плазматической мембране обеспечивает векторное передвижение клеток, как за счет разрушения межклеточных контактов и матрикса, так и благодаря активации или высвобождению латентных или связанных с матриксом факторов роста, обладающих хемотактическими свойствами (Степанова и Ткачук, 2002).

Урокиназа принимает участие в активации и высвобождении ряда факторов роста, связанных с межклеточным матриксом. Так, было показано участие урокиназы в активации HGF, который секретируется стромальными фибробластами в виде одноцепочечного биологически неактивного предшественника и накапливается в межклеточном матриксе. При расщеплении урокиназой происходит образование активного гетеродимера HGF (Naldini et al., 1992). Кроме того, урокиназа принимает участие в активации VEGF-189 (Plouet et al., 1997), и, плазмин-зависимым образом, в активации TGF-(3 (Sato and Rifkin, 1989) и Cyról (Pendurthi et al., 2005).

Сигнальная активность урокиназы»

Адгезия, миграция и пролиферация клеток лежат в основе ремоделирования тканей.

Урокиназа вовлечена в регуляцию этих процессов как фермент, активирующий протеолиз на клеточной поверхности, а также, независимо от своей протеолитической активности, через активацию различных сигнальных систем клетки. Так, было показано, что стимуляция урокиназой миграции гладкомышечных клеток in vivo связана с генерацией плазмина (Oleada et al., 1996; Plekhanova et al., 2001). Благодаря способности урокиназы локализоваться на лидирующем крае мигрирующих клеток за счет связывания с uPAR, активация внеклеточного протеолиза происходит локально, тем самым клетка освобождает себе путь (Andreasen et al., 1997; Andreasen et al., 2000; Chapman, 1997). В то же время, урокиназа способна стимулировать миграцию гладкомышечных клеток (Oleada et al., 1996; Kusch et al, 2002), эндотелиальных клеток (Odelcon et al., 1992), эпителиальных клеток (Busso et al., 1994) и моноцитов (Resnati et al., 1996) независимо от ее протеолитической активности.

Ключевое значение в активации сигнальных систем играет аминотерминальный домен урокиназы, включающий ростовой и крингл-домены. Модификации урокиназы, ингибирующие ее способность связываться с рецептором uPAR, блокировали ее хемотактические эффекты (Stepanova et al, 1997). При связывании урокиназы через «ростовой» домен с uPAR наблюдается активация ряда внутриклеточных сигнальных каскадов сигнальных систем клетки, приводящая к стимуляции клеточной миграции, адгезии и пролиферации. При связывании урокиназы с uPAR на гладкомышечных и эндотелиальных клетках происходит активация Jak/Stat сигнального пути. Janus киназы, Jakl и Тук2, образуют комплекс с uPA-uPAR на лидирующем крае клетки, что, в свою очередь, приводит к транслокации факторов Statl, Stat2 и Stat4 в ядро клетки (Dumler et al., 1998; 1999). Методом коиммунопреципитации показано связывание uPAR с нерецепторными Src тирозиновыми киназами: p59fyn, p53/56lyn, p53/59hsk, p55fgr (Dumler et al., 1998). Связывание урокиназы с ее рецептором на клетках аденокарциномы простаты вызывает образование комплексов с (31-интегриновыми рецепторами и приводит к активации интегриновых сигнальных путей - тирозиновому фосфорилированию киназы FAK и сгк-ассоциированного субстрата pl30Cas (Yebra et al., 1999). В серии работ показана активация серин-треониновых киназ, таких, как киназы ERK/MAPK, под действием урокиназы (Resnati et al, 1996; Bohuslav et al. 1995; Aguirre-Ghiso, et al., 1999; Wei et al., 2001). Показано, что активация ERIC может быть опосредована образованием комплекса uPAR с EGFR (Jo et al., 2003). При стимуляции урокиназой клеток фибросаркомы человека наблюдали МЕК-зависимое фосфорилирование MLCK, что сопровождалось увеличением серинового фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина II (Nguyen et al., 1999). Установлено, что урокиназа стимулирует реоганизацию цитоскелета клетки и активацию киназ Нск и ERK/MAPK 14 через активацию G-белков (Resnati et al., 1996; Degryse et al., 2001, Fazioli et al., 1997). Кроме того, урокиназа вызывает мембранную транслокацию белков Raf, Src, FAK, и Rac (Degiyse et al., 1999; 2001; Nguyen et al., 2000; Kjoeller and Hall, 2001).

Экспериментальные данные указывают на участие в стимуляции урокиназой миграции и пролиферации клеток таких регуляторных белков, как Ras (Nguyen et al., 2000), Raf (Degryse et al., 2001), PKC (Busso et al., 1994) фосфатидил-инозитол-3-киназа (P13K) (Kusch et al., 2000). Связывание урокиназы с мембранными рецепторами вызывает активацию Rh о семейства ГТФ-аз, в частности Rae, активация которой необходима для клеточной миграции и реорганизации цитоскелета (Kjoller and Hall, 2001). Взаимодействие урокиназы с uPAR приводит к активации внеклеточных протеинкиназ, таких как казеинкиназа 2, которая специфически фосфорилирует витронектин (Stepanova et al., 2002), и протеинкиназа С - е, которая, в свою очередь, фосфорилирует цитокератины 8 и 18 (Busso et al., 1994).

Сигнальные эффекты урокиназы определяются не только ее связыванием с uPAR, но и взаимодействием с другими мембранными рецепторами. Установлено, что протеолитический и крингл-домены урокиназы содержат детерминанты, отвечающие за сигнальные эффекты урокиназы. Так, было показано, что урокиназа может стимулировать синтез ДНК и пролиферацию ГМК сосудов независимо от протеолитической активности и взаимодействия с uPAR (Koopman et al., 1998; Kanse et al., 1997). Недавно были получены данные о важной роли регуляторной роли эндоцитирующих рецепторов из семейства белков, родственных рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP). Было показано, что связывание урокиназы с LRP приводит к повышению уровня внутриклеточного цАМР и последующей активации протеинкиназы A (Goretzky and Muller, 1998). Установлено, что рецептор LRP через цитоплазматическую последовательность NpxY взаимодействует с рядом адаптерных цитоплазматических белков, содержащих фосфотирозин-связывающие домены (РТВ), такими, как Dab-1, адаптерный белок FE65 и нерецепторная тирозиновая киназа She, белок, связывающий киназу Jun (Gotthardt et asl, 2000; Barnes et al., 2001). Более того, блокирование функций LRP с помощью антител приводит к ингибированию миграции гладкомышечных клеток (Okada et al., 1996).

В нашей лаборатории было установлено, что крингл-домен урокиназы опосредует ее хемотактические эффекты на гладкомышечных клетках (Mukhina et al, 2000). Предполагается, что мембранная мишень, связывающая урокиназу через крингл-домен, способна осуществлять сопряжение с системами внутриклеточной сигнализации и активировать миграцию. Наши данные свидетельствуют о том, что миграция ГМК, опосредованная крингл-доменом, сопровождается специфической активацией р38 МАР-киназного каскада. Более того, при ингибировании данного пути, урокиназа, или ее крингл-домен, не способны активировать миграцию (Goncharova et al., 2002). В зависимости от типа клеток, крингл-домен урокиназы оказывает как про- так и антихемотактические эффекты. Так, было показано ингибирование миграции эндотелиальных клеток, стимулированных факторами bFGF, VEGF и EGF, под действием рекомбинантного крингл-домена урокиназы

К 45 Т 135\

Asp -Lys ), сопровождаемое интернализациеи крингл-домена и его транспортом в ядро клетки. (Kim et al., 2003).

Таким образом, накоплен ряд экспериментальных данных, свидетельствующих об участии в сигнальных эффектах урокиназы белков-адаптеров, взаимодействующих с урокиназой или ее рецептором uPAR, например интегринов (см. ниже). Однако, несмотря на большое число проведенных исследований, касающихся сигнальных эффектов урокиназы, точные механизмы передачи сигнала от плазматической мембраны к «исполнительным» системам клетки не выяснены.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Капустин, Александр Николаевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованной урокиназой был выделен белок с мол. массой 65 кДа и определена его структура методом масс-спектрометрии.

2. Установлено, что фибулин-5 через С-глобулярный домен связывается с протеолитическим доменом урокиназы с КсЬ» 82±15 нМ. Показано, что фибулин-5, урокиназа и ее рецептор колокализуются в ламеллоподиях эндотелиальных клеток вены пуповины человека.

3. Установлено, что лизаты эмбриональных фибробластов и экстракт легочной ткани мышей дикого типа обладают более выраженной фибринолитической активностью по сравнению с клетками и тканями мышц, лишенных гена фибулина-5. Следовательно, фибулин-5 способен защищать урокиназу от инактивации ингибитором РА1-1.

4. Сверхэкспрессия фибулина-5 в клетках линии НЕК приводит к подавлению клеточной подвижности, а также ингибированию хематактического действия урокиназы на эти клетки.

1. Adams DS, Griffin LA, Nachajkо WR, Reddy VB, Wei CM. A synthetic DNA encoding a

modified human urokinase resistant to inhibition by serum plasminogen activator inhibitor. J Biol Cheryl. 1991;266(13):8476-82.

2. Aertgeerts K, De Bondt EL, De Ranter CJ, Declerck PJ. Mechanisms contributing to the

conformational and functional flexibility of plasminogen activator inhibit or-1. Nat Struct Biol. 1995;2(10):891-7.

3. Aguirre Ghiso JA, ICovalsld K, Ossowski L. Tumor dormancy induced by downregulation of

uroldnase receptor in human carcinoma involves integrin and МАРК signaling. J Cell Biol. 1999; 4;147(1):89-104.

4. Albig A.R., Schiemann W.P. Fibulin-5 antagonizes vascular endothelial growth factor

(VEGF) signalling and angiogenic sprouting by endothelial cells. DNA and Cell Biology, 2004;.23. 6, 367-379

5. Allan EH, Zeheb R, Gelehrter TD, Heaton JH, Fukumoto S, Yee J A, Martin TJ.

Transforming growth factor beta inhibits plasminogen activator (PA) activity and stimulates production of urokinase-type PA, PA inhibitor-1 mRNA, and protein in rat osteoblast-like cells. J Cell Physiol. 1991;149(l):34-43.

6. Altus MS, Nagamine Y. Protein synthesis inhibition stabilizes urokinase-type plasminogen

activator mRNA. Studies in vivo and in cell-free decay reactions. J Biol Chem. 1991;266(31):21190-6.

7. Andersen OM, Petersen HH, Jacobsen C, Moestrup SK, Etzerodt M, Andreasen PA,

Thogersen HC. Analysis of a two-domain binding site for the urokinase-type plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor-1 complex in low-density-lipoprotein-receptor-related protein. BiochemJ. 2001;357(Pt l):289-96.

8. Andrade-Gordon F, Strickland S. Interaction of heparin with plasminogen activators and

plasminogen: effects on the activation of plasminogen. Biochemistry. 1986;25(14):4033-40.

9. Andreasen PA, Kjoller L, Christensen L, DuSy MJ. The urokinase-type plasminogen

activator system in cancer metastasis: a review. Int J Cancer. 1997;72(l):l-22.

10. Andreasen, P.A., R. Egelund, and H.H. Petersen. The plasminogen activation system in tumor

growth, invasion, and metastasis. Cell Mol Life Sei 2000; 57:25-40.

11. Apella, E, Robinson, EA, Ullrich, SJ. The receptor-binding sequence of urokinase: a

biological function for the growth factor module of proteases J Biol Chem 1987 262:4437-4440.

^ 12. Bajou K, Masson V, Gerard RD, Schmitt PM, Albert V, Praus M, Lund LR, Frandsen TL,

Brunner N, Dano K, Fusenig NE, Weidle U, Carmeliet G, LoskutoffD, Collen D, Carmeliet P, Foidart JM, Noel A. The plasminogen activator inhibitor PAI-1 controls in vivo tumor vascularization by interaction with proteases, not vitronectin. Implications for antiangiogenic strategies. J Cell Biol. 2001;152(4):777-84.

13. Baker MS, Blealdey P, Woodrow GC, Doe WF. Inhibition of cancer cell urokinase

plasminogen activator by its specific inhibitor PAI-2 and subsequent effects on extracellular matrix degradation. Cancer Res. 1990 Aug l;50(15):4676-84.

14. Barnathan ES, Kuo A, ICariko IC, Rosenfeld L, Murray SC, Behrendt N, Rönne E, Weiner D,

Henkin J, Cines DB. Characterization of human endothelial cell urokinase-type plasminogen activator receptor protein and messenger RNA. Blood. 1990;76(9):1795-806.

15. Barnes H, Larsen B, Tyers M, van Der Geer P. Tyrosine-phosphorylated low density

lipoprotein receptor-related protein 1 (Lrpl) associates with the adaptor protein SHC in

SRC-transformed cells. J Biol Chem. 2001; 276(22): 19119-25.

16. Bar-Shavit R, Eldor A, Vlodavsky I. Binding of thrombin to subendothelial extracellular

matrix. Protection and expression of functional properties.J Clin Invest. 1989;84:1096-104.

17. Bdeir K, Kuo A, Sachais BS, Rux AH, Bdeir Y, Mazar A, Higazi AA, Cines DB. The kringle

stabilizes urokinase binding to the urokinase receptor. Blood. 2003; 102(10):3600-8.

18. Bdeir K, Murciano JC, Tomaszewski J, Koniaris L, Martinez J, Cines DB, Muzykantov VR,

Higazi AA. Urokinase mediates fibrinolysis in the pulmonary microvasculature. Blood. 2000; 96(5): 1820-6.

19. Beck JM, Preston AM, Gyetko MR. Urokinase-type plasminogen activator in inflammatory

cell recruitment and host defense against Pneumocystis carinii in mice. Infect Immun. 1999; 67(2):879-84.

20. Behrendt N, Dano IC. Effect of purified, soluble urokinase receptor on the plasminogen-

prourolcinase activation system. FEBSLett. 1996;393(l):31-6.

21. Behrendt N, Jensen ON, Engelholm LH, Mortz E, Mann M, Dano IC. A urokinase receptor-

associated protein with specific collagen binding properties. J Biol Chem. 2000;275(3): 1993-2002.

22. Behrendt N, Ploug M, Patthy L, Houen G, Blasi F, Dano IC. The ligand-binding domain of

the cell surface receptor for urokinase-type plasminogen activator. J Biol Chem. 1991;266(12):7842-7.

23. Behrendt N, Ronne E, Dano IC. Domain interplay in the urokinase receptor. Requirement for

the third domain in high affinity ligand binding and demonstration of ligand contact sites in distinct receptor domains. J Biol Chem. 1996; 271(37):22885-94.

24. Bergwerff, A.A., J. Van Oostrum, J.P. Kamerling, and J.F. Vliegenthart. The major N-linked

carbohydrate chains from human urokinase. The occurrence of 4-Q-sulfated, (alpha 2-6)-sialylated or (alpha l-3)-fucosylated N-acetylgalactosamine(beta l-4)-N-acetylglucosamine elements. EurJBiochem 1995;228:1009-1019.

25. Bergwerff, A.A., J.E. Thomas-Gates, J. van Oostrum, J.P. Kamerling, and J.F. Vliegenthart.

Human urokinase contains GalNAc beta (l-4)[Fuc alpha (l-3)]GlcNAc beta (1-2) as a novel terminal element inN-linked carbohydrate chains. FEBSLett., 1992; 314:389394.

26. Berta A, Tozser J, Holly FJ. Determination of plasminogen activator activities in normal and

pathological human tears. The significance of tear plasminogen activators in the inflammatory and traumatic lesions of the cornea and the conjunctiva. Acta Ophthalmol. (Copenh). 1990; 68:508-14.

27. Besser D, Presta M, Nagamine Y. Elucidation of a signaling pathway induced by FGF-2

leading to uPA gene expression inNIH 3T3 fibroblasts. Cell Growth Differ. 1995 ;6(8): 1009-17.

28. Blasi F, Carmeliet P. uPAR: a versatile signalling orchestrator Nat Rev Mol Cell

Biol.;3(12):932-43, 2002

29. Bochaton-Piallat ML, Gabbiani G, Pepper MS. Plasminogen activator expression in rat

arterial smooth muscle cells depends on their phenotype and is modulated by cytokines. CircRes. 1998;82( 10): 1086-93.

30. Bohuslav, J., V. Horejsi, C. Hansmann, J. Stockl, U.H. Weidle, O. Majdic, I. Bartke, W.

Knapp, and H. Stockinger. Urokinase plasminogen activator receptor, beta 2-integrins, and Src-kinases within a single receptor complex of human monocytes. J Exp Med 1995; 181:1381-1390.

31. Botteri FM, Ballmer-Hofer K, Rajput B, Nagamine Y. Disruption of cytoskeletal structures

results in the induction of the urokinase-type plasminogen activator gene expression. J BiolChem. 1990;265(22): 13327-34.

32. Boucher P, Liu P, Gotthardt M, Hiesberger T, Anderson RG, Herz J. Platelet-derived growth

factor mediates tyrosine phosphorylation of the cytoplasmic domain of the low Density lipoprotein receptor-related protein in caveolae. J BiolChem. 2002;277(18): 15507-13

33. Buko, A.M., E.J. Kentzer, A. Petros, G. Menon, E.R. Zuiderweg, and V.K. Sarin.

Characterization of a posttranslational fucosylation in the growth factor domain of urinary plasminogen activator. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:3992-3996.

34. Busso N, Peclat V, Van Ness K, Kolodziesczyk E, Degen J, Bugge T, So A. Exacerbation of

antigen-induced arthritis in urokinase-deficient mice. J Clin Invest. 1998; 102:41-50.

35. Busso, N., S.K. Masur, D. Lazega, S. Waxman, and L. Ossowski. Induction of cell migration

by pro-urokinase binding to its receptor: possible mechanism for signal transduction in human epithelial cells. J Cell Biol 1994; 126:259-270.

36. Cannio R, Rennie PS, Blasi F. A cell-type specific and enhancer-dependent silencer in the

regulation of the expression of the human urokinase plasminogen activator gene. Nucleic Acids Res. 1991;19(9):2303-8.

37. Cao D, Mizukami IF, Garni-Wagner BA, Kindzelskii AL, Todd RF 3rd, Boxer LA, Petty HR.

Human urokinase-type plasminogen activator primes neutrophils for superoxide anion release. Possible roles of complement receptor type 3 and calcium J Immunol. 1995; 154(4):1817-29.

38. Carmeliet P, Moons L, Dewerchin M, Rosenberg S, Herbert JM, Lupu F, Collen D. Receptor-

independent role of urokinase-type plasminogen activator in pericellular plasmin and matrix metalloproteinase proteolysis during vascular wound healing in mice. J Cell Biol. 1998;140(l):233-45.

39. Carmeliet P, Moons L, Hebert J-M, Crawley J, Lupu F, Lijnen R, Collen R. Urokinase but not

tissue plasminogen activator mediates arterial neointima formation in mice. Circulation Research. 1997; 81:829-839.

40. Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den

Oord JJ, Collen D, Mulligan RC. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature. 1994;368(6470):419-24.

41. Carmeliet P, Stassen JM, de Mol M, Bouche A, Collen D. Arterial neointimal formation after

trauma in mice with inactivation of the t-PA, u-PA, or PAI-1 genes. Circulation. 1994; 90:1-14.

42. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 2000; 6(4):389-95.

43. Chang AW, Kuo A, Barnathan ES, Okada SS. Urokinase receptor-dependent upregulation of

smooth muscle cell adhesion to vitronectin by urokinase. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998; 18(12): 1855-60.

44. Chapman HA, Wei Y. Protease crosstalk with integrins: the urokinase receptor

paradigm.Thromb Haemost. 2001 ;86(1): 124-9.

45. Chapman, H.A. Plasminogen activators, integrins, and the coordinated regulation of cell

adhesion and migration. Curr Opin Cell Biol; 1997;9:714-724.

46. Clowes AW, Clowes MM, Au YP, Reidy MA, Belin D. Smooth muscle cells express

urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery. CircRes. 1990;67(l):61-7.

47. Collart MA, Belin D, Vassalli JD, de Kossodo S, Vassalli P. Gamma interferon enhances

macrophage transcription of the tumor necrosis factor/cachectin, interleukin 1, and urokinase genes, which are controlled by short-lived repressors. J Exp Med. 1986 ;164(6):2113-8.

48. Conese M, Olson D, Blasi F. Protease nexin-1-urokinase complexes are internalized and

degraded through a mechanism that requires both urokinase receptor and alpha 2-macroglobulin receptor. J Biol Chem. 1994;269(27): 17886-92.

49. Cubellis MV, Andreasen P, Ragno P, Mayer M, Dano K, Blasi F. Accessibility of receptor-

bound urokinase to type-1 plasminogen activator inhibitor. Proc Natl Acad. Sci USA. 1989 ;86(13):4828-32.

50. Cubellis MV, Nolli ML, Cassani G, Blasi F. Binding of single-chain prourokinase to the

urokinase receptor of human U937 cells. J Biol Chem. 1986;261(34): 15819-22.

51. Cubellis MV, Wun TC, Blasi F. Receptor-mediated internalization and degradation of

urokinase is caused by its specific inhibitor PAI-1. EMBOJ. 1990;9(4): 1079-85.

52. Czekay RP, Aertgeerts K, Curriden SA, Loskutoff DJ. Plasminogen activator inhibitor-1

detaches cells from extracellular matrices by inactivating integrins. J Cell Biol. 2003;160(5):781-91.

53. Czekay RP, Kuemmel TA, Orlando RA, Farquhar MG. Direct binding of occupied urokinase

receptor (uPAR) to LDL receptor-related protein is required for endocytosis of uPAR and regulation of cell surface urokinase activity. Mol Biol Cell. 2001;12(5): 1467-79.

54. Dayer JM, Vassalli JD, Bobbitt JL, Hull RN, Reich E, Krane SM. Calcitonin stimulates

plasminogen activator in porcine renal tubular cells: LLC-PK1. J Cell Biol. 1981;91(l):195-200.

55. Declerck PJ, De Mol M, Vaughan DE, Collen D. Identification of a conformationally distinct

form of plasminogen activator inhibitor-1, acting as a noninhibitory substrate for tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem. 1992;267(17):11693-6.

56. Degryse B, Orlando S, Resnati M, Rabbani SA, Blasi F. Urokinase/urokinase receptor and

vitronectin/alpha(v)beta(3) integrin induce Chemotaxis and cytoskeleton reorganization through different signaling pathways. Oncogene. 2001;20(16):2032-43.

57. Degryse B, Resnati M, Rabbani SA, Villa A, Fazioli F, Blasi F. Src-dependence and

pertussis-toxin sensitivity of urokinase receptor-dependent Chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells. Blood. 1999; 94(2):649-62.

58. Del Rosso, M., G. Fibbi, M. Pucci, G. Dini, C. Grappone, and M.L. Nolli. Modulation of

surface-associated urokinase: binding, interiorization, delivery to lysosomes, and degradation in human keratinocytes. Exp Cell Res 1991. 193:346-355.

59. Deng, G.; Royle, G.; Seiffert, D.and Loskutoff, D.J. The PAI-1 /vitronectin interaction: two

cats in a bag? Thromb Haemost 1995; 74, 66-70

60. Dumler, I., A. Kopmann, A. Weis, O.A. Mayboroda, K. Wagner, D.C. Gulba, and H. Haller.

Urokinase activates the Jak/Stat signal transduction pathway in human vascular endothelial cells. Arterioscler Thromb Vase Biol 1999; 19:290-297.

61. Dumler, I., A. Weis, O.A. Mayboroda, C. Maasch, U. Jerke, H. Haller, and D.C. Gulba. The

Jak/Stat pathway and urokinase receptor signaling in human aortic vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 1998; 273:315-321.

62. Eaton DL, Scott RW, Baker JB. Purification of human fibroblast urokinase proenzyme and

analysis of its regulation by proteases and protease nexin. J Biol Chem. 1984;259(10):6241-7.

63. Ellis V, Behrendt N, Dano K. Plasminogen activation by receptor-bound urokinase. A kinetic

study with both cell-associated and isolated receptor. J Biol Chem. 1991 ;266(19): 12752-8.

64. Ellis V. Functional analysis of the cellular receptor for urokinase in plasminogen activation.

Receptor binding has no influence on the zymogenic nature of pro-uroldnase. J Biol Chem. 1996;271(25): 14779-84.

65. Ellis, V., M.F. Scully, and V.V. Kakkar. Plasminogen activation initiated by single-chain

urokinase-type plasminogen activator. Potentiation by U937 monocytes. J Biol Chem 1989264:2185-2188.

66. Ellis, V., T.C. Wun, N. Behrendt, E. Ronne, and K. Dano. 1990. Inhibition of receptor-bound

urokinase by plasminogen-activator inhibitors. J Biol Chem 265:9904-9908.

67. Estreicher A, Muhlhauser J, Carpentier JL, Orci L, Vassalli JD. The receptor for urokinase

type plasminogen activator polarizes expression of the protease to the leading edge of migrating monocytes and promotes degradation of enzyme inhibitor complexes. J Cell Biol. 1990 ;111(2):783-92.

68. Estreicher A, Wohlwend A, Belin D, Schleuning WD, Vassalli JD. Characterization of the

cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator. J Biol Chem. 1989; 264(2): 1180-9.

69. Farrehi PM, Ozaki CK, Carmeliet P, Fay WP. Regulation of arterial thrombolysis by

plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 1998;97( 10): 1002-8.

70. Fazioli, F., M. Resnati, N. Sidenius, Y. Higashimoto, E. Appella, and F. Blasi. A urokinase-

sensitive region of the human urokinase receptor is responsible for its chemotactic activity. EMBOJ1997; 16:7279-7286.

71. Flaumenhaft R, Riflcin DB. Cell density dependent effects of TGF-beta demonstrated by a

plasminogen activator-based assay for TGF-beta. J Cell Physiol. 1992; 152(l):48-55.

72. Fletcher CM, Harrison RA, Lachmann PJ, Neuhaus D. Structure of a soluble, glycosylated

form of the human complement regulatory protein CD59. Structure. 1994 ;2(3):185-99.

73. Franco, P., C. Iaccarino, F. Chiaradonna, A. Brandazza, C. lavarone, M.R. Mastronicola, M.L.

Nolli, and M.P. Stoppelli. Phosphorylation of human pro-urokinase on Serl38/303 impairs its receptor-dependent ability to promote myelomonocytic adherence and motility. J Cell Biol 1997; 137:779-791.

74. Franco, P., O. Massa, M. Garcia-Rocha, F. Chiaradonna, C. Iaccarino, I. Correas, E. Mendez,

J. Avila, F. Blasi, and M.P. Stoppelli. Protein kinase C-dependent in vivo phosphorylation of prourokinase leads to the formation of a receptor competitive antagonist J Biol Chem 1998; 273:27734-27740.

75. Fujii S, Sawa H, Saffitz JE, Lucore CL, Sobel BE. Induction of endothelial cell expression of

the plasminogen activator inhibitor type 1 gene by thrombosis in vivo. Circulation. 1992 ;86(6):2000-10.

76. Furlan F, Orlando S, Laudanna C, Resnati M, Basso V, Blasi F, Mondino A. The soluble

D2D3 (88-274) fragment of the urokinase receptor inhibits monocyte chemotaxis and integrin-dependent cell adhesion. JCellSci. 2004 ;117(Pt 14):2909-16.

77. Geiger, M.; Huber, IC.; Wojta, J.; Stingl, L.; Espana, F.; Griffin, J.H.and Binder, B.R.

Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo. Blood 1989; 74, 722-728

78. Giltay R, Timpl R Kostka G. Sequence, recombinant expression and tissue localization of

two novel extracellular matrix proteins, fibulin-3 and libulin-4. Matrix Biol. 1999;18(5):469-80.

79. Gliemann, J. Receptors of the low density lipoprotein (LDL) receptor family in man. Multiple

functions of the large family members via interaction with complex ligands. Biol Chem 1998; 379:951-964.

80. Goldberg, G.I., S.M. Frisch, C. He, S.M. Wilhelm, R. Reich, and I.E. Collier. Secreted

proteases. Regulation of their activity and their possible role in metastasis. Ann N Y AcadSci 1990; 580:375-384.

81. Goncharova, E.A.; Vorotnikov, A.V.; Gracheva, E.G.; Wang, C.L.; Panettieri, R.A Jr.;

Stepanova, V.V.; Tkachuk, V.A. Activation of p38 MAP-kinase and caldesmon phosphorylation are essential for urokinase-induced human smooth muscle cell migration. Biol Chem 2002, 383, 115-26.

82. Goretzki, L. and B.M. Mueller. Low-density-lipoprotein-receptor-related protein (LRP)

interacts with a GTP-binding protein. Biochem J1998; 336 (Pt 2):381-386.

83. Goretzki, L. and B.M. Mueller. Receptor-mediated endocytosis of urokinase-type

plasminogen activator is regulated by cAMP-dependent protein Idnase. J Cell Sci 1997; 110(Pt 12): 1395-1402.

84. Gotthardt, M., M. Trommsdorff, M.F. Nevitt, J. Shelton, J.A. Richardson, W. Stockinger, J.

Nimpf, and J. Herz. Interactions of the low density lipoprotein receptor gene family with cytosolic adaptor and scaffold proteins suggest diverse biological functions in cellular communication and signal transduction. J Biol Chem 2000; 275:25616-25624.

85. Gunzler, W.A., G.J. Steffens, F. Otting, S.M. Kim, E. Frankus, and L. Flohe. The primary

staicture of high molecular mass urokinase from human urine. The complete amino acid sequence of the A chain. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 1982 363:1155-1165.

86. Gyetko MR, Chen GH, McDonald RA, Goodman R, Huffnagle GB, Wilkinson CC, Fuller JA,

Toews GB. Urokinase is required for the pulmonary inflammatory response to Cryptococcus neoformans. A murine transgenic model. J Clin Invest. 1996; 97(8): 181826.

87. Gyetko MR, Sitrin RG, Fuller JA, Todd RF 3rd, Petty H, Standiford TJ. Function of the

urokinase receptor (CD87) in neutrophil Chemotaxis. JLeukocBiol. 1995;;58(5):533-8.

88. Hansen AP, Petros AM, Meadows RP, Fesik SW. Backbone dynamics of a two-domain

protein: 15N relaxation studies of the amino-terminal fragment of urokinase-type plasminogen activator. Biochemistry. 1994;33(51): 15418-24.

89. Hekman CM, Loskutoff DJ. Endothelial cells produce a latent inhibitor of plasminogen

activators that can be activated by dénaturants. J Biol Chem. 1985;260(21):11581-7.

90. Herz J, Clouthier DE, Hammer RE. LDL receptor-related protein internalizes and degrades

uPA-PAI-1 complexes and is essential for embryo implantation. Cell. 1992 ;71(3):411-21.

91. Herz J, Stricldand DK. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor. J Clin Invest.

2001 ; 108(6):779-84.

92. Herz J, Willnow TE. Functions of the LDL receptor gene family. Ann N Y Acad Sei. 1994;

93. Herz, J., U. Hamann, S. Rogne, O. Myklebost, H. Gausepohl, and K.K. Stanley. Surface

location and high affinity for calcium of a 500-kd liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological role as lipoprotein receptor. EMBO J1988; 7:4119-4127.

94. Heymans S, Luttun A, Nuyens D, Theilmeier G, Creemers E, Moons L, Dyspersin GD,

Cleutjens IP, Shipley M, Angellilo A, Levi M, Nube O, Baker A, Keshet E, Lupu F, Herbert JM, Smits JF, Shapiro SD, Baes M, Borgers M, Collen D, Daemen MJ, Carmeliet P. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure. Nat Med. 1999 ;5(10): 1135-42.

95. Higazi A, Cohen RL, Henldn J, Kniss D, Schwartz BS, Cines DB. Enhancement of the

enzymatic activity of single-chain urokinase plasminogen activator by soluble uroldnase receptor. JBiolChem. 1995;270(29): 17375-80.

96. Higazi AA, Ajawi F, Akkawi S, Hess E, Kuo A, Cines DB. Regulation of the single-chain

urokinase-urokinase receptor complex activity by plasminogen and fibrin: novel mechanism of fibrin specificity. Blood. 2005; 105(3): 1021-8.

97. Horrevoets AJ. Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1): in vitro activities and clinical

relevance. Br J Haematol. 2004;125(l):12-23.

98. Hoyer-Hansen G, Ploug M, Behrendt N, Ronne E, Dano K. Cell-surface acceleration of

urokinase-catalyzed receptor cleavage. Ear JBiochem. 1997;243(l-2):21-6.

99. Hoyer-Hansen G, Ronne E, Solberg H, Behrendt N, Ploug M, Lund LR, Ellis V, Dano K.

Uroldnase plasminogen activator cleaves its cell surface receptor releasing the ligand-binding domain. JBiolChem. 1992;267(25): 18224-9.

100. Huber K, Wojta J, Kirchheimer JC, Ermler D, Binder BR. Plasminogen activators and

plasminogen activator inhibitor in malignant and non-malignant ascitic fluid. Eur J Clin Invest. 1988;18(6):595-9.

101. Ichinose, A., K. Fujikawa, and T. Suyama. The activation of pro-uroldnase by plasma

kallikrein and its inactivation by thrombin. J Biol Chem 1986; 261:3486-3489.

102. Inoue, H.; Nojima, H.; Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with

Plasmids. Gene; 1990; 96, 23-8

103. Irigoyen JP, Munoz-Canoves P, Montero L, Koziczak M, Nagamine Y. The plasminogen

activator system: biology and regulation. CellMol Life Sci. 1999; 56(1-2) : 104-32.

104. Jean JC, Eruchalu I, Cao YX, Joyce-Brady M. DANCE in developing and injured lung. Am J

Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002; 282(l):L75-82

105. Jiang, Y.; Pannell.; R., Liu, J.-N.; Gurewich, V. Evidence for a Novel Binding Protein to

Urokinase-Type Plasminogen Activator in Platelet Membranes. Blood 1996; 87, 27752781.

106. Jo M, Thomas KS, Q'Donnell DM, Gonias SL. Epidermal growth factor receptor-dependent

and -independent cell-signaling pathways originating from the urokinase receptor. J Biol Chem. 2003; 278(3): 1642-6.

107. Kanse, S.M., O. Benzakour, C. Kanthou, C. Kost, H.R. Lijnen, and K.T. Preissner. induction

of vascular SMC proliferation by urokinase indicates a novel mechanism of action in vasoproliferative disorders. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997; 17:2848-2854.

108. Kapetanopoulos A, Fresser F, Millonig G, Shaul Y, Baier G, Utermann G. Direct interaction

of the extracellular matrix protein DANCE with apolipoprotein(a) mediated by the kringle IV-type 2 domain. Mol Genet Genomics. 2002;;267(4):440-6.

109. Kasai S, ArimuraH, Nishida M, Suyama T. Proteolytic cleavage of single-chain pro-

urokinase induces conformational change which follows activation of the zymogen and reduction of its high affinity for fibrin. J Biol Chem. 1985; 260(22):12377-81.

110. Kim ICS, Hong YK, Joe YA, Lee Y, Shin JY, Park HE, Lee IH, Lee SY, Kang DK, Chang SI,

Chung SI. Anti-angiogenic activity of the recombinant kringle domain of urokinase and its specific entry into endothelial cells. J Biol Chem. 2003; 278(13): 11449-56.

111. Kindzelskii AL, Laska ZO, Todd RF 3rd, Petty HR. Urokinase-type plasminogen activator

receptor reversibly dissociates from complement receptor type 3 (alpha M beta 2' CD1 lb/CD 18) during neutrophil polarization. J Immunol. 1996;156(l):297-309.

112. Kjoller L, Hall A. Rac mediates cytoskeletal rearrangements and increased cell motility

induced by urokinase-type plasminogen activator receptor binding to vitronectin. J Cell Biol. 2001;152(6): 1145-57.

113. Kjoller, L., S.M. Kanse, T. Kirkegaard, K.W. Rodenburg, E. Ronne, S.L. Goodman, K.T.

Preissner, L. Ossowski, and P. A. Andreasen. Plasminogen activator inhibitor-1 represses integrin- and vitronectin-mediated cell migration independently of its function as an inhibitor of plasminogen activation. Exp Cell Res 1997; 232:420-429.

114. Kobayashi H, Gotoh J, Terao T. Urinary trypsin inhibitor efficiently inhibits urokinase

production in tumor necrosis factor-stimulated cells. Eur J Cell Biol. 1996;71(4):380-6.

115. Kobayashi, Q., IC. Matsui, N. Minamiura, and T. Yamamoto. Effect of dithiothreitol on

activity and protein structure of human urine urokinase. JBiochem (Tokyo) 1985 97:3744.

116. Kohler HP, Grant PJ. Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease. N

Engl J Med. 2000 ;342(24): 1792-801.

117. Kooistra T, Sprengers ED, van Hinsbergh VW. Rapid inactivation of the plasminogen-

activator inhibitor upon secretion from cultured human endothelial cells. Biochem J. 1986 ;239(3):497-503.

118. Koopman, J.L., J. Slomp, A.C. de Bart, P.H. Quax, and J.H. Verheijen. Mitogenic effects of

urokinase on melanoma cells are independent of high affinity binding to the urokinase receptor. JBiolChem 1998; 273: 33267-33272.

119. Koshelnick Y, Ehart M, Hufhagl P, Heinrich PC, Binder BR. Urokinase receptor is associated

with the components of the JAK1/STAT1 signaling pathway and leads to activation of this pathway upon receptor clustering in the human kidney epithelial tumor cell line TCL-598. J Biol Chem. 1997;272(45):28563-7.

120. Kostka G, Giltay R, Bloch W, Addicks K, Timpl R, Fassler R, Chu ML. Perinatal lethality

and endothelial cell abnormalities in several vessel compartments of fibulin-1 -deficient mice. Mol Cell Biol. 2001;21(20):7025-34.

121. Kowal RC, Richardson J A, Miano JM, Olson EN. EVEC, a novel epidermal growth factor-

like repeat-containing protein uregulated in embryonic and diseased adult vasculature. CircRes. 1999;84(10):1166-76.

122. Kuang PP, Goldstain RH, Liu Y, Rishikof DC, Jean JC, Joyce-Brady M Coordinate

expression of fibulin-5/DANCE and elastin during lung injury repair. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003; 285(5); LI 147-52.

123. ICusch A, Tkachuk S, Haller H, Dietz R, Gulba DC, Lipp M, Dumler I. Urokinase stimulates

human vascular smooth muscle cell migration via a phosphatidylinositol 3-kinase-Tyk2 interaction. J Biol Chem. 2000;275(50):39466-73.

124. ICusch A, Tkachuk S, Lutter S, Haller H, Dietz R, Lipp M, Dumler I. Monocyte-expressed

urolcinase regulates human vascular smooth muscle cell migration in a coculture model. Biol Chem. 2002; 3S3(1):217-21.

125. Kuzmenko, Y.S., Bochkov, V.N., Philippova, M.P., Stambolsky, D.V., Buhler, F.R, and

Resink, T.J. Biochem. J. 1996; 317, 297-304.

126. ICwak SH, Mitra S, Bdeir IC, Strassheim D, Park JS, ICim JY, Idell S, Cines D, Abraham E.

The kringle domain of urokinase-type plasminogen activator potentiates LPS-induced neutrophil activation through interaction with {alpha} V{beta}3 integrins. JLeukoc Biol. 2005 ;78(4):937-45.

127. Laemmli, U. Nature, 1970; 227, 680-685

128. Laiho, M.; Saksela, O.and ICeski-Oja, J. Transforming growth factor-beta induction of type-1

plasminogen activator inhibitor. Pericellular deposition and sensitivity to exogenous urolcinase. J Biol Chem 1987; 262, 17467-17474

129. Laskowski M Jr, Kato I. Protein inhibitors of proteinases.^wzz/ Rev Biochem. 1980;49:593-

130. Lawrence DA, Berkenpas MB, Palaniappan S, Ginsburg D. Localization of vitronectin

binding domain in plasminogen activator inhibitor-1. J Biol Chem. 1994;269(21): 152238.

131. Lawrence DA, Olson ST, Muhammad S, Day DE, Kvassman JO, Ginsburg D, Shore JD.

Partitioning of serpin-proteinase reactions between stable inhibition and substrate cleavage is regulated by the rate of serpin reactive center loop insertion into beta-sheet A. J Biol Chem. 2000;275(8):5S39-44.

132. Lee MJ, Roy NIC, Mogford JE, Schiemann WP, Mustoe TA. Fibulin-5 promotes wound

healing in vivo. J Am Coll Surg. 2004;199(3):403-10.

133. Lenich, C., R. Pannell, J. Henkin, and V. Gurewich. The influence of glycosylation on the

catalytic and fibrinolytic properties of pro-urokinase. Thrömb Haemost 1992;.68:539544.

134. Li Y, ICnisely JM, Lu W, McCormick LM, Wang J, Henkin J, Schwartz AL, Bu G. Low

density lipoprotein (LDL) receptor-related protein IB impairs urokinase receptor regeneration on the cell surface and inhibits cell migration. J Biol Chem. 2002; 277(44):4236671.

135. Liang OD, Chavakis T, Linder M, Bdeir IC, Kuo A, Preissner ICT. Binding of urokinase

plasminogen activator to gp 130 via a putative urokinase-binding consensus sequence. Biol Chem. 2003;384(2):229-36.

136. Lijnen HR, Maquoi E, Hansen LB, Van HoefB, Frederix L, Collen D. Matrix

metalloproteinase inhibition impairs adipose tissue development in mice. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002; 22(3):374-9.

137. Lijnen HR, Van HoefB, Nelles L, Collen D. Plasminogen activation with single-chain

urokinase-type plasminogen activator (scu-PA). Studies with active site mutagenized

plasminogen (Ser740—Ala) and plasmin-resistant scu-PA (Lysl58—Glu). J Biol C.hem. 1990; 265(9):5232-6.

138. Lillis AP, Mikhailenko I, Strickland DK. Beyond endocytosis: LRP function in cell

migration, proliferation and vascular permeability. JThromb Haemost. 2005 3(8): 188493.

139. Liu X., Zhao Y., Gao J., Pawlylc B., Starcher B., Spencer JA., YanagisawaH., Zuo J., Li T.

Elastic fiber homeostasis requires lysyl oxidase-like 1 protein., Nature genetics, 2004; 36, 2, 178-182

140. Llinas P, Le Du MH, Gardsvoll H, Dano K, Ploug M, Gilquin B, Stura EA, Menez A.

Crystal structure of the human urokinase plasminogen activator receptor bound to an antagonist peptide. EMBO J. 2005 May 4;24(9): 1655-63.

141. Loeys, B.; Van Maldergem, L.; Mortier, G.; Coucke, P.; Gerniers, S.; Naeyaert, J.M.; De.

Paepe. Homozygosity for a missense mutation in fibulin-5 (FBLN5) results in a severe form of cutis laxa. Hum Mol Genet 2002; 11, 2113-8

142. Longstaff, C., R.E. Merton, P. Fabregas, and J. Felez. Characterization of cell-associated

plasminogen activation catalyzed by urokinase-type plasminogen activator, but independent of urokinase receptor (uPAR, CD87). Blood 1999; 93:3839-3846.

143. Loskutoff DJ, Sawdey M, Mimuro J. Type 1 plasminogen activator inhibitor. Prog Hemost

Thromb. 1989;9:87-115.

144. Loskutoff DJ, SchleefRR. Plasminogen activators and their inhibitors Methods Enzymol.

1988;163:293-302.

145. Lupu F, Heim DA, Bachmann F, Hurni M, Kalckar W, Kruithof EK. Plasminogen activator

expression in human atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995;15(9):1444-55.

146. Ma Z, Thomas KS, Webb DJ, Moravec R, Salicioni AM, Mars WM, Gonias SL. Regulation

of Racl activation by the low density lipoprotein receptor-related protein. J Cell Biol. 2002;159(6): 1061-70.

147. Madison EL, Goldsmith EJ, Gerard RD, Gething MJ, Sambrook IF. Serpin-resistant mutants

of human tissue-type plasminogen activator. Nature. 1989;339(6227):721-4.

148. Madison EL, Goldsmith EJ, Gething MJ, Sambrook JF, Gerard RD. Restoration of serine

protease-inhibitor interaction by protein engineering. J Biol Chem. 1990;265(35):21423-6.

149. Magdolen V, Rettenberger P, Koppitz M, Goretzki L, Kessler H, Weidle UH, Konig B, Graeff

H, Schmitt M, Wilhelm O. Systematic mutational analysis of the receptor-binding region of the human urokinase-type plasminogen activator. Eur JBiochem. 1996;237(3):743-51.

150. Manchanda, N. and B.S. Schwartz. Interaction of single-chain uroldnase and plasminogen

activator inhibitor type 1. J Biol Chem 1995; 270:20032-20035.

151. Marcotte PA, Kozan IM, Dorwin SA, Ryan JM. The matrix metalloproteinase pump-1

catalyzes formation of low molecular weight (pro)urokinase in cultures of normal human kidney cells. J Biol Chem. 1992;267(20): 13803-6.

152. Markova D, Zou Y, Ringpfeil F, Sasaki T, Kostka G, Timpl R, Uitto J, Chu ML. Genetic

Heterogeneity of Cutis Laxa: A Heterozygous Tandem Duplication within the Fibulin-5 (FBLN5) Gene. Am J Hum Genet. 2003;72: 998-1004.

153. Matlib, M.A.MethodsPharmacol. 1984; 5, 12-24

154. McGowen R, Biliran H Jr, Sager R, Sheng S. The surface of prostate carcinoma DU145 cells

mediates the inhibition of urokinase-type plasminogen activator by maspin. Cancer Res. 2000; 60(17):4771-8.

155. Midwood ICS., Schwarzbauer J.E. Elastic Fibers: building bridges between cells and their

matrix., Current Biology, 2002; 12: 279-281

156. Miles, L.A.; Dahlberg, C.M.; Levin, E.G.and Plow, E.F. Gangliosides interact directly with

plasminogen and urokinase and may mediate binding of these fibrinolytic components to cells. Biochemistry 1989; 28, 9337-9343

157. Mimuro J, Kaneko M, Murakami T, Matsuda M, Sakata Y. Reversible interactions between

plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1. Biochemica et Biophysica Acta. 1992;1160:325-334.

158. Mimuro J, LoskutofFDJ. Purification of a protein from bovine plasma that binds to type 1

plasminogen activator inhibitor and prevents its interaction with extracellular matrix. Evidence that the protein is vitronectin. J Biol Chem. 1989;264(2):936-9.

159. Moestrup SIC, Holtet TL, Etzerodt M, Thogersen HC, Nykjaer A, Andreasen PA,Rasmussen

HH, Sottrup-Jensen L, Gliemann J. Alpha 2-macroglobulin-proteinase complexes, plasminogen activator inhibitor type-1-plasminogen activator complexes, and receptor-associated protein bind to a region of the alpha 2-macroglobulin receptor containing a cluster of eight complement-type repeats. J Biol Chem. 1993;268(18):13691-6.

160. Moestrup SK. The alpha 2-macroglobulin receptor and epithelial glycoprotein-330: two giant

receptors mediating endocytosis of multiple ligands. Biochim Biophys Acta. 1994; 1197(2): 197-213.

161. Mohanam S, Go Y, Sawaya R, Venkaiah B, Mohan PM, ICouraklis GP, Gokaslan ZL, Lagos

GIC, Rao JS. Elevated levels of uroldnase-type plasminogen activator and its receptor during tumor growth in vivo. IntJ Oncol. 1999 ; 14(1): 169-74.

162. Moller LB, Pollanen J, Ronne E, Pedersen N, Blasi F. N-linked glycosylation of the ligand-

binding domain of the human uroldnase receptor contributes to the affinity for its ligand. J Biol Chem. 1993 ; 268(15):11152-9.

163. Moller, L.B., M. Ploug, and F. Blasi. Structural requirements for glycosyl-

phosphatidylinositol-anchor attachment in the cellular receptor for uroldnase plasminogen activator. EurJBiochem 1992,208:493-500.

164. Monier S, Parton RG, Vogel F, Behlke J, Henske A, Kurzchalia TV. VTP21-caveolin, a membrane protein constituent of the caveolar coat, oligomerizes in vivo and in vitro. Mol Biol Cell. 1995;6(7):911-27. 165. Montuori N, Carriero MV, Salzano S, Rossi G, Ragno P. The cleavage of the urokinase

receptor regulates its multiple functions. J Biol Chem. 2002;277(49):46932-9.

166. Moser TL, Enghild JJ, Pizzo SV, Stack MS. Specific binding of urinary-type plasminogen

activator (u-PA) to vitronectin and its role in mediating u-PA-dependent adhesion of U937 cells. Biochem J. 1995;307 (Pt 3):867-73.

167. Mottonen J, Strand A, Symersky J, Sweet RM, Danley DE, Geoghegan KF, Gerard RD,

Goldsmith EJ. Structural basis of latency in plasminogen activator inhibitor-1. Nature. jr 1992;355(6357):270-3.

168. Mukhina, S., V. Stepanova, D. Traktouev, A. Poliakov, R. Beabealashvilly, Y. Gursky, M.

Minashkin, A. Shevelev, and V. Tkachuk. The Chemotactic Action of Urokinase on Smooth Muscle Cells Is Dependent on Its ICringle Domain. CHARACTERIZATION OF INTERACTIONS AND CONTRIBUTION TO CHEMOTAXIS. J Biol Chem 2000, 275:16450-16458.

169. Myohanen, H.T., R.W. Stephens, K. Hedman, H. Tapiovaara, E. Ronne, G. Hoyer-Hansen, K.

Dano, and A. Vaheri. Distribution and lateral mobility of the uroldnase-receptor complex at the cell surface. JHistochem Cytochem 1993; 41:1291-1301.

170. Nagamine Y., Sudol M., Reich E. Hormonal regulation of plasminogen activator mRNA

production in porcine kidney cells. Cell. 1983; 32: 1181-1190.

171. Nakamura, T.; Lozano, P.R.; Ikeda, Y.; Iwanaga, Y.; Hinek, A.; Minamisawa, S.; Cheng,

C.F.; Kobuke, IC.; Dalton, N.; Takada, Y.; Tashiro, K.; Ross, Jr. J.; Honjo, T.; Chien, ICR. Fibulin-5/DANCE is essential for elastogenesis in vivo. Nature 2002; 15, 171-5

\12. Nakamura, T.; Ruiz-Lozano, P.; Lindner, V.; Yabe, D.; Taniwaki, M.; Furukawa, Y.; Kobuke, K.; Tashiro, K.; Lu, Z.; Andon, N.L.; Schaub, R.; Matsumori, A.; Sasayama, S.; Chien,

K.R.; Honjo, T. DANCE, a novel secreted RGD protein expressed in developing, atherosclerotic, and balloon-injured arteries. J Biol Chem 1999; 274, 22476-83

173. Naldini, L., L. Tamagnone, E. Vigna, M. Sachs, G. Hartmann, W. Birchmeier, Y. Daikuhara,

H. Tsubouchi, F. Blasi, and P.M. Comoglio. Extracellular proteolytic cleavage by urokinase is required for activation of hepatocyte growth factor/scatter factor. EMBO J 1992; 11:4825-4833.

174. Nanbu R, Menoud PA, Nagamine Y. Multiple instability-regulating sites in the 3'

untranslated region of the urokinase-type plasminogen activator mRNA. Mol Cell Biol. 1994;14(7):4920-8.

175. Newton CS, Loukinova E, Mikhailenlco I, Ranganathan S, Gao Y, Haudenschild C, Strickland

DK. Platelet-derived growth factor receptor-beta (PDGFR-beta) activation promotes its association with the low density lipoprotein receptor-related protein (LRP). Evidence for co-receptor fiinctioa J Biol Chem. 2005;280(30):27872-8.

176. Ngo TH, Hoylaerts MF, Knockaert I, Brouwers E, Decierck PJ. Identification of a target site

in plasminogen activator inhibitor-1 that allows neutralization of its inhibitor properties concomitant with an allosteric up-regulation of its antiadhesive properties. J Biol Chem. 2001 ;276(28):26243-8.

177. Nguyen AD, Itoh S, Jeney V, Yanagisawa H, Fujimoto M, Ushio-Fukai M, Fukai T. Fibulin-5

is a novel binding protein for extracellular superoxide dismutase. Circ Res. 2004;95:1067-74.

178. Nguyen DH, Catling AD, Webb DJ, Sankovic M, Walker LA, Somlyo AV, Weber MJ,

Gonias SL. Myosin light chain kinase functions downstream of Ras/ERIC to promote migration of urokinase-type plasminogen activator-stimulated cells in an integrin-selective manner. J Cell Biol. 1999; 12; 146(1): 149-64.

179. Nguyen DH, Webb DJ, Catling AD, Song Q, Dhakephalkar A, Weber MJ, Ravichandran KS,

Gonias SL. Urokinase-type plasminogen activator stimulates the Ras/Extracellular

signal-regulated Idnase (ERK) signaling pathway and MCF-7 cell migration by a mechanism that requires focal adhesion kinase, Src, and She. Rapid dissociation of GRB2/Sps-Shc complex is associated with the transient phosphorylation of ERK in urokinase-treated cells. J Bio! Chem. 2000;275(25): 19382-8.

180. Nielsen LS, Kellerman GM, Behrendt N, Picone R, Dano K, Blasi F. A 55,000-60,000 Mr

receptor protein for urokinase-type plasminogen activator. Identification in human tumor cell lines and partial purification. J Biol Chem. 1988; 263(5):2358-63.

181. Nolan C, Hall LS, Barlow GH, Tribby II. Plasminogen activator from human embryonic

lddney cell cultures. Evidence for a proactivator. Biochim Biophys Acta. 1977 ;496(2):384-400.

182. Nykjaer A, Kjoller L, Cohen RL, Lawrence DA, Garni-Wagner BA, Todd RF 3rd, van

Zonneveld AJ, Gliemann J, Andreasen PA. Regions involved in binding of urokinase-type-1 inhibitor complex and pro-urokinase to the endocytic alpha 2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein. Evidence that the uroldnase receptor protects pro-urokinase against binding to the endocytic receptor. J Biol Chem. 1994; 269(41):25668-76.

183. Nykjaer, A., Petersen, C. M., Moller, B., Jensen, P H., Moestrup, S.K., Holtet, T.L., Etzerodt

M., Thogersen, H.C., Munch, M., Andreasen, P.A., and Gliemann, J. Uroldnase receptor-bound uPA.PAI-1 complex is internalized following interaction with alpha 2 MR/LRP. J. Biol. Chem. 1992; 267, 14543-14546

184. Nykjaer, A.; Conese, M.; Christensen, E.I.; Olson, D.; Cremona, O.; Gliemann, J.and Blasi, F.

Recycling of the urokinase receptor upon internalization of the uPA:serpin complexes. EMBOJ; 1997; 16, 2610-2620

185. Odekon LE, Sato Y, Rifkin DB. Urokinase-type plasminogen activator mediates basic

fibroblast growth factor-induced bovine endothelial cell migration independent of its proteolytic activity. J Cell Physiol. 1992 ; 150(2):258-63.

186. Okada SS, Golden MA, Raghunath PN, Tomaszewski JE, David ML, Kuo A, Kariko K,

Barnathan ES. Native atherosclerosis and vein graft arterialization: Association with increased urokinase receptor expression in vitro and in vivo. Thrombosis and Haemostasis. 1998; 80:140-147.

187. Okada SS, Tomaszewski JE, Barnathan ES. Migrating vascular smooth muscle cells polarize

cell surface urokinase receptors after injury in vitro. Exp Cell Res. 1995 ;217(l):180-7.

188. Okada, S.S., S.R. Grobmyer, and E.S. Barnathan. Contrasting effects of plasminogen

activators, uroldnase receptor, and LDL receptor-related protein on smooth muscle cell migration and invasion. Arterioscler Thromb Vase Biol 1996;.16:1269-1276.

189. Orth K, Madison EL, Gething MJ, Sambrook JF, Herz J. Complexes of tissue-type

plasminogen activator and its serpin inhibitor plasminogen-activator inhibitor type 1 are internalized by means of the low density lipoprotein receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor. Proc Natl Acad Sei USA. 1992 ;89(16):7422-6.

190. Orth K, Willnow T, Herz J, Gething MJ, Sambrook J. Low density lipoprotein receptor-

related protein is necessary for the internalization of both tissue-type plasminogen activator-inhibitor complexes and free tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem. 1994;269(33):21117-22.

191. Ossowsld L, Aguirre-Ghiso JA. Uroldnase receptor and integrin partnership: coordination of

signaling for cell adhesion, migration and growth. Curr Opin Cell Biol. 2000;12:613-20.

192. Ossowsld L, Russo-Payne H, Wilson EL. Inhibition of urokinase-type plasminogen activator

by antibodies: The effect on dissemination of a human tumor in the nude mouse. Cancer Research. 1991; 51:274-281.

193. Oswald RE, Bogusky MJ, Bamberger M, Smith RA, Dobson CM. Dynamics of the

multidomain fibrinolytic protein uroldnase from two-dimensional NMR. Nature. 1989; 337(6207):579-82.

194. Pannell R, Gurewich V. Activation of plasminogen by single-chain urokinase or by two-chain

urokinase A demonstration that single-chain urokinase has a low catalytic activity (pro-urokinase). Blood. 1987;69:22-28.

195. Pendurthi UR, Tran TT, Post M, Rao LV. Proteolysis of CCN1 by Plasmin: Functional

Implications. Cancer Res. 2005 ;65(21):9705-11.

196. Petzelbauer, E.; Springhorn, J.P.; Tucker, A.M.and Madri, J.A. Role of plasminogen activator

inhibitor in the reciprocal regulation of bovine aortic endothelial and smooth muscle cell migration by TGF-beta 1. Am J Pathol 149, 1996; 923-931

197. Pinsky DJ, Liao H, Lawson CA, Yan S-F, Chen J, Carmeliet P, LoskutoffDJ, Stern DM.

Coordinated induction of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) and inhibition of plasminogen activator gene expression by hypoxia promotes pulmonary vascular deposition. Journal of Clinical Investigation. 1998; 102:919-928.

198. Planus E, Barlovatz-Meimon G, Rogers RA, Bonavaud S, Ingber DE, Wang N. Binding of

uroldnase to plasminogen activator inhibitor type-1 mediates cell adhesion and spreading. JCellSci. 1997;110 (Pt 9): 1091-8.

199. Plekhanova O, Parfyonova Y, Bibilashvily R, Domogatsldi S, Stepanova V, Gulba DC,

Agrotis A, Bobik A, Tkachuk V. Uroldnase plasminogen activator augments cell proliferation and neointima formation in injured arteries via proteolytic mechanisms. Atherosclerosis ;159(2):297-306. 2001

200. Plekhanova OS, Parfyonova YV, Bibilashvily RSh, Stepanova W, Erne P, Bobik A, Tkachuk

VA. Uroldnase plasminogen activator enhances neointima growth and reduces lumen size in injured carotid arteries. JHypertens. 2000 ;18(8):1065-9.

201. Ploug M, Kjalke M, Ronne E, Weidle U, Hoyer-Hansen G, Dano K. Localization of the

disulfide bonds in the NH2-terminal domain of the cellular receptor for human uroldnase-type plasminogen activator. A domain structure belonging to a novel

superfainily of glycolipid-anchored membrane proteins. J Biol Chem. 1993 ;268(23): 17539-46.

202. Ploug M, Ronne E, Behrendt N, Jensen AL, Blasi F, Dano K. Cellular receptor for urokinase

plasminogen activator. Carboxyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosyl-phosphatidylinositol. J Biol Chem. 1991;266(3):1926-33.

203. Ploug M. Identification of specific sites involved in ligand binding by photoaffinity labeling

of the receptor for the urokinase-type plasminogen activator. Residues located at equivalent positions in uPAR domains I and III participate in the assembly of a composite ligand-binding site. Biochemistry. 1998;37(47): 16494-505.

204. Ploug M. Structure-function relationships in the interaction between the urokinase-type

plasminogen activator and its receptor. CnrrPhcirm Des. 2003;9(19): 1499-528.

205. Pluskota E, Soloviev DA, Bdeir K, Cines DB, Plow EF. Integrin alphaMbeta2 orchestrates

and accelerates plasminogen activation and fibrinolysis by neutrophils. J Biol Chem. 2004 ;279(17):18063-72.

206. Pluskota E, Soloviev DA, Plow EF. Convergence of the adhesive and fibrinolytic systems:

recognition of urokinase by integrin alpha Mbeta 2 as well as by the urokinase receptor regulates cell adhesion and migration. Blood. 2003; 101 (4): 1582-90.

207. Poliakov A, Tkachuk V, Ovchinnikova T, Potapenko N, Bagryantsev S, Stepanova V.

Plasmin-dependent elimination of the growth-factor-like domain in urokinase causes its rapid cellular uptake and degradation. Biochem J. 2001;355:639-45.

208. Poliakov, A.A., S.A. Mukhina, D.O. Traktouev, R.S. Bibilashvily, Y.G. Gursky, M.M.

Minashkin, V.V. Stepanova, and V.A. Tkachuk. Chemotactic effect of urokinase plasminogen activator: a major role for mechanisms independent of its proteolytic or growth factor domains. JRecept Signal TransductRes 1999; 19:939-951.

209. Pollanen J, Hedman K, Nielsen LS, Dano K, Vaheri A. Ultrastructural localization of plasma

membrane-associated urokinase-type plasminogen activator at focal contacts. J Cell Biol. 1988; 106(l):S7-95.

210. Pollanen, J., O. Saksela, E.M. Salonen, P. Andreasen, L. Nielsen, K. Dano, and A. Vaheri.

Distinct localizations of urokinase-type plasminogen activator and its type 1 inhibitor under cultured human fibroblasts and sarcoma cells. J Cell Biol 1987; 104:1085-1096.

211. Potempa, J.; Korzus, E. and Travis, J. 0 The serpin superfamily of proteinase inhibitors:

structure, function, and regulation. JBiolChem 1994; 269, 15957-15960

212. Preissner KT, Grulich-Henn J, Ehrlich HJ, Declerck P, Justus C, Collen D, Pannekoek H,

Muller-Berghaus G. Structural requirements for the extracellular interaction of plasminogen activator inhibitor 1 with endothelial cell matrix-associated vitronectin./ Biol Chem. 1990;265(30):18490-8.

213. Preissner KT, Kanse SM, Chavakis T, May AE. The dual role of the urokinase receptor

system in pericellular proteolysis and cell adhesion: implications for cardiovascular function. Basic Res Cardiol. 1999;94(5):315-21,

214. Quax PH, Grimbergen JM, Lansinlc M, Bakker AH, Blatter MC, Belin D, van Hinsbergh VW,

Verheijen JH. Binding of human urokinase-type plasminogen activator to its receptor: residues involved in species specificity and binding. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998;18(5):693-701.

215. Rabbani SA, Mazar AP. The role of the plasminogen activator system in angiogensis and

metastasis. Surgical Oncology Clinics of North America. 2001; 10:393-415.

216. Rabbani, S.A., A.P. Mazar, S.M. Bernier, M. Haq, I. Bolivar, J. Henkin, andD. Goltzman.

Structural requirements for the growth factor activity of the amino-terminal domain of urokinase. JBiolChem 1992;267:14151-14156.

217. Ragno P, Montuori N, Covelli B, Hoyer-Hansen G, Rossi G. Differential expression of a

truncated form of the urokinase-type plasminogen-activator receptor in normal and tumor thyroid cells. Cancer Res. 1998;58(6):1315-9.

218. Reidy MA, Irvin C, Lindner V. Migration of arterial wall cells. Expression of plasminogen

activators and inhibitors in injured rat arteries. Circ Res. 1996 ;78(3):405-14.

219. Reinartz, J., B. Schaefer, MJ. Bechtel, and M.D. Kramer. Plasminogen activator inhibitor

type-2 (PAI-2) in human keratinocytes regulates pericellular urokinase-type plasminogen activator. Exp Cell Res 1996; 223:91-101.

220. Rerolle JP, Hertig A, Nguyen G, Sraer JD, Rondeau EP. Plasminogen activator inhibitor type

1 is a potential target in renal Gbrogenesis.Kidney Int. 2000;58(5):1841-50.

221. Resnati M, Pallavicini I, Wang JM, Oppenheim J, Serhan CN, Romano M, Blasi F. The

fibrinolytic receptor for urokinase activates the G protein-coupled chemotactic receptor FPRL1/LXA4R. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(3): 1359-64.

222. Resnati, M., M. Guttinger, S. Valcamonica, N. Sidenius, F. Blasi, and F. Fazioli. Proteolytic

cleavage of the uroldnase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect. EMBO J1996; 15:1572-1582.

223. Robbins KC, Summaria L, Hsieh B, Shah RJ. The peptide chains of human plasmin.

Mechanism of activation of human plasminogen to plasmia J Biol Chem. 1967;242(10):2333-42.

224. Roldan AL, Cubellis MV, Masucci MT, Behrendt N, Lund LR, Dano IC, Appella E, Blasi F.

Cloning and expression of the receptor for human uroldnase plasminogen activator, a central molecule in cell surface, plasmin dependent proteolysis. EMBO J. 1990 ;9(2):467-74.

225. Ronne E, Pappot H, Grondahl-Hansen J, Hoyer-Hansen G, Plesner T, Hansen NE, Dano K.

The receptor for uroldnase plasminogen activator is present in plasma from healthy

donors and elevated in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1995 ;89(3):576-81.

226. Saito, A., S. Pietromonaco, A.K. Loo, and M.G. Farquhar. Complete cloning and sequencing

of rat gp330 megalin, a distinctive member of the low density lipoprotein receptor gene family. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:9725-9729.

227. Saksela O, Hovi T, Vaheri A. Urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor secreted

by cultured human monocyte-macrophages. J Cell Physiol. 1985;122(l):125-32.

228. Salerno G, Verde P, Nolli ML, Corti A, Szots H, Meo T, Johnson J, Bullock S, Cassani G,

Blasi F. Monoclonal antibodies to human urokinase identify the single-chain pro-urolcinase precursor. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 ;81(1):110-4.

229. Sato Y, Rifkin DB. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle

cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. J Cell Biol. 1989 ;109(1):309-15.

230. Schafer IC, Muller K, Hecke A, Mounier E, Goebel J, Loskutoff DJ, Konstantinides S.

Enhanced thrombosis in atherosclerosis-prone mice is associated with increased arterial expression of plasminogen activator inhibitor-1. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2003 ;23(11):2097-103.

231. Schiemann WP, Blobe GC, Kalume DE, Pandey A, Lodish HF. Context-specific effects of

fibulin-5 (DANCE/EVEC) on cell proliferation, motility, and invasion. Fibulin-5 is induced by transforming growth factor-beta and affects protein kinase cascades. J Biol Chem 2002;;277(30):27367-77„

232. Scott CF, Carrell RW, Glaser CB, Lewis JH, Colman RW. Alpha 1-antitrypsin-Pittsburgh: a

potent inhibitor of human plasma factor XIa, kallikrein, and factor Xllf. Trans Assoc Am Physicians. 1985; 98:34-4-51.

mn HI. J T r\ A --- A \r —J 1----------It ' ll' 7^ rn n^r HI TT\

zjj. anerinan nvj, juawrence jl»/\, iang ai, vanuenuerg c,i, rtuein jl», uison aj snore jjl»,

Ginsburg D. Saturation mutagenesis of the plasminogen activator inhibitor-1 reactive center. J Biol Chem. 1992; 267(11):7588-95.

234. Shliom 0, Huang M, Sachais B, Kuo A, Weisel JW, Nagaswami C, Nassar T, Bdeir K, Hiss

E, Gawlak S, Harris S, Mazar A, Higazi AA. Novel interactions between urokinase and its receptor. J Biol Chem. 2000;275(32):24304-12.

235. Sier CF, Sidenius N, Mariani A, Aletti G, Agape V, Ferrari A, Casetta G, Stephens RW,

Brunner N, Blasi F. Presence of urokinase-type plasminogen activator receptor in urine of cancer patients and its possible clinical relevance. Lab Invest. 1999;79(6):717-22.

236. Silverstein RL, Nachman RL, Pannell R, Gurewich V, Harpel PC. Thrombospondin forms

complexes with single-chain and two-chain forms of urokinase. J Biol Chem. 1990;265(19): 11289-94.

237. Simon, D.I., Y. Wei, L. Zhang, N.IC. Rao, H. Xu, Z. Chen, Q. Liu, S. Rosenberg, and H.A.

Chapman. Identification of a urokinase receptor-integrin interaction site. Promiscuous regulator of integrin function. J Biol Chem 2000; 275:10228-10234,

238. Spencer JA, Hacker SL, Davis EC, Mecham RP, Knutsen RH, Li DY, Gerard RD, Richardson

JA, Olson EN, Yanagisawa H. Altered vascular remodeling in fibulin-5-deficient mice reveals a role of fibulin-5 in smooth muscle cell proliferation and migration. Proc Natl AcadSci USA. 2005;102(8):2946-51.

239. Sprengers ED, Kluft C. Plasminogen activator inhibitors. Blood. 1987 ;69(2):381-7.

240. Stahl A, Mueller BM. The urokinase-type plasminogen activator receptor, a GPI-linked

protein, is localized in caveolae. J Cell Biol. 1995;129(2):335-44.

241. Stahl N, Yancopoulos GD. The alphas, betas, and kinases of cytokine receptor complexes.

Cell. 1993;74(4):587-90.

242. Stahl A. B.M. Mueller. Melanoma cell migration on vitronectin: regulation by components of

the plasminogen activation system. Int J Cancer 1997; 71:116-122.

243. Stefansson, S. and D.A. Lawrence. The serpin PAI-1 inhibits cell migration by blocking

integrin alpha V beta 3 binding to vitronectin. Nature 1996; 383:441-443.

244. Stefansson, S.; Kounnas, M.Z.; Henkin, J.; Mallampalli, R.K.; Chappell, D.A.; Strickland,

D.K.and Argraves, W.S. gp330 on type II pneumocytes mediates endocytosis leading to degradation of pro-urokinase, plasminogen activator inhibitor-1 and urokinase-plasminogen activator inhibitor-1 complex. J Cell Sci 1995; 108 (Pt 6), 2361-2368

245. Stenflo, J., A.K. Ohlin, W.G. Owen, and W.J. Schneider. beta-Hydroxyaspartic acid or beta-

hydroxyasparagine in bovine low density lipoprotein receptor and in bovine thrombomodulin. JBiolChem 1988;263:21-24.

246. Stepanova V, Jerke U, Sagach V, Lindschau C, Dietz R, Haller H, Dumler I. Urokinase-

dependent human vascular smooth muscle cell adhesion requires selective vitronectin phosphorylation by ectoprotein kinase CK2. J Biol Chem. 2002; 277(12): 10265-72.

247. Stepanova V., Bobik A., Bibilashvily R, Belogurov A., Ryballcin I., Domogatsky S., Little

P.J., Goncharova E., Tkachuk V. Urokinase plasminogen activator induces smooth muscle cell migration: key role of growth factor-like domain. FEBSLett. 1997. 414. 417-474

248. Stephens RW, Bokman AM, Myohanen HT, Reisberg T, Tapiovaara H, Pedersen N,

Grondahl-Hansen J, Llinas M, Vaheri A. Heparin binding to the urokinase kringle domain. Biochemistry. 1992;31(33):7572-9.

249. Stoppelli MP, Corti A, Soffientini A, Cassani G, Blasi F, Assoian RK. Differentiation-

enhanced binding of the amino-terminal fragment of human urokinase plasminogen activator to a specific receptor on U937 monocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1985;82(15):4939-43.

250. Stoppelli MP, Verde P, Grimaldi G, Locatelli EK, Blasi F. Increase in urokinase plasminogen

activator mRNA synthesis in human carcinoma cells is a primary effect of the potent tumor promoter, phorbol myristate acetate. J Cell Biol 1986;102(4):1235-41.

251. Stump DC, Thienpont M, Collen D. Purification and characterization of a novel inhibitor of

urokinase from human urine. Quantitation and preliminary characterization in plasma. J Biol Chem. 1986; 261(27): 12759-66.

252. Swiercz R, Skrzypczak-Jankun E, Merrell MM, Selman SH, Jankun J. Angiostatic activity of

synthetic inhibitors of urokinase type plasminogen activator. Oncol Rep. 1999; 6(3):523-6.

253. Tacchini L, Matteucci E, De Ponti C, Desiderio MA. Hepatocyte growth factor signaling

regulates transactivation of genes belonging to the plasminogen activation system via hypoxia inducible factor-1. Exp Cell Res. 2003; 290(2):391-401.

254. Takahashi IC, ICwaan HC, Ikeo IC, Koh E. Phosphorylation of a surface receptor bound

urokinase-type plasminogen activator in a human metastatic carcinomatous cell line. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 182(3): 1466-72.

255. Takahashi, S., Y. Kawarabayasi, T. Nakai, J. Sakai, and T. Yamamoto. Rabbit very low

density lipoprotein receptor: a low density lipoprotein receptor-like protein with distinct ligand specificity. Proc Natl Acad Sci USA 1992;.89:9252-9256.

256. Tarui T, Andronicos N, Czekay RP, Mazar AP, Bdeir IC, Parry GC, Kuo A, LoskutoffDJ,

Cines DB, Talcada Y. Critical role of integrin alpha 5 beta 1 in urokinase (uPA)/uroldnase receptor (uPAR, CD87) signaling. J Biol Chem. 2003;278(32):29863-72.

257. Tarui T, Mazar AP, Cines DB, Talcada Y. Urokinase-type plasminogen activator receptor

(CD87) is a ligand for integrins and mediates cell-cell interaction. J Biol Chem. 2001;276(6):3983-90.

258. Timpl R, Sasaki T, ICostlca G, Chu ML. Fibulins;a versatile family of extracellular matrix

protein; Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4(6):479-89

259. Tkachuk, V., V. Stepanova, P. J. Little, and A. Bobik. Regulation and role of urokinase

plasminogen activator in vascular remodelling. Clin Exp Pharmacol Physiol 1996 23: 759-765.

260. Torres AM, Kini RM, Selvanayagam N, Kuchel PW. NMR structure of bucandin, a

neurotoxin from the venom of the Malayan krait (Bungarus candidus). Biochem J. 2001;360(Pt 3):539-48.

261. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide

gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(9):4350-4.

262. Treanor JJ, Goodman L, de Sauvage F, Stone DM, Poulsen KT, Beck CD, Gray C, Armanini

MP, Pollock RA, Hefti F, Phillips HS, Goddard A, Moore MW, Buj-Bello A, Davies AM, Asai N, Takahashi M, Vandlen R, Henderson CE, Rosenthal A. Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nature. 1996;382(6586):80-3.

263. Trommsdorff, M., J.P. Borg, B. Margolis, and J. Herz. Interaction of cytosolic adaptor

proteins with neuronal apolipoprotein E receptors and the amyloid precursor protein. J Biol Chem 1998;273:33556-33560.

264. Trommsdorff, M., M. Gotthardt, T. Hiesberger, J. Shelton, W. Stockinger, J. Nimpf, R.E.

Hammer, J.A. Richardson, and J. Herz. b. Reeler/Disabled-like disruption of neuronal migration in knockout mice lacking the VLDL receptor and ApoE receptor 2. Cell 1999; 97:689-701.

265. Trupp M, Raynoschek C, Belluardo N, Ibanez CF. Multiple GPI-anchored receptors control

GDNF-dependent and independent activation of the c-Ret receptor tyrosine kinase. Mol Cell Neurosci. 1998;1 l(l-2):47-63.

266. Tsuruga E, Yajima T, Kazuharu I. Induction of fibulin-5 gene is regulated by tropoelastin

gene, and correlated with tropoelastin accumulation in vivo. The International Joimal of Biochemistry& Cell Biology, 2004; 36, 395-400

267. Vassalli J-D, Sappino A-P, Belin D. The plasminogen activator/plasmin system. Journal of

Clinical Investigation. 1991; 88:1067-1072.

268. Vogel BE, Hedgecock EM. Hemicentin, a conserved extracellular member of the

immunoglobulin superfamily, organizes epithelial and other cell attachments into oriented line-shaped )unctions.Development. 2001 ; 128(6):883-94.

269. von der Ahe D, Pearson D, Nagamine Y. Macromolecular interaction on a cAMP responsive

region in the urokinase-type plasminogen activator gene: a role of protein phosphorylation. Nucleic Acids Res. 1990; 18(8): 1991 -9.

270. Wadhwa R, Kaul SC, Sugimoto Y, Mitsui Y. Spontaneous immortalization of mouse

fibroblasts involves structural changes in senescence inducing protein, mortalin. Biochem Biophys Res Commun. 1993 ;197(l):202-6.

271. Waltz DA, Nation LR, Fujita RM, Wei Y, Chapman HA. Plasmin and plasminogen activator

inhibitor type 1 promote cellular motility by regulating the interaction between the urokinase receptor and vitronectin. J Clin Invest. 1997;100(l):58-67.

272. Wang Q, Shaltiel S. Distal hinge of plasminogen activator inhibitor-1 involves its latency

transition and specificities toward serine proteases. BMC Biochem. 2003;4:5.

273. Wang YX, Martin-McNulty B, Freay AD, Sukovich DA, Halks-Miller M, Li WW, Vergona

R, Sullivan ME, Morser J, Dole WP, Deng GG. Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice. Am J Pathol. 2001;159(4):1455-64.

274. Watson JD, Oster SK, Shago M, Khosravi F, Penn L.Z. Identifying genes regulated in a Myc-

dependent manner; J Biol Chem, 2002;. 277, 40, 36921-36930.

275. Wei Y, Eble JA, Wang Z, ICreidberg JA, Chapman HA. Urokinase receptors promote betal

integrin function through interactions with integrin alpha3betal.Mol Biol Cell. 2001 ;12(10):2975-86.

276. Wei Y, Lukashev M, Simon DI, Bodary SC, Rosenberg S, Doyle MY, Chapman HA.

Regulation of integrin function by the urokinase receptor. Science. 1996 ;273(5281):1551-5.

277. Wilczynska M, Fa M, Ohlsson PI, Ny T. The inhibition mechanism of serpins. Evidence that

the mobile reactive center loop is cleaved in the native protease-inhibitor complex. J Biol Chem. 1995;270(50):29652-5.

278. Willnow TE, Goldstein JL, Orth K, Brown MS, Herz J. Low density lipoprotein receptor-

related protein and gp330 bind similarligands, including plasminogen activator-inhibitor complexes and lactoferrin, an inhibitor of chylomicron remnant clearance. J Biol Chem. 1992;267(36):26172-80.

279. Willnow, T.E., A. Nykjaer, and J. Herz. Lipoprotein receptors: new roles for ancient proteins.

Nat Cell Biol 1999; 1:157-162

280. Wiman B, Lijnen HR, Collen D. On the specific interaction between the lysine-binding sites

in plasmin and complementary sites in alpha2-antiplasmin and in fibrinogen. Biochim BiophysActa. 1979;579:142-54.

281. Wun TC, Schleuning WD, Reich E. Isolation and characterization of urokinase from human

plasma. J Biol Chem. 1982;257(6):3276-83.

282. Xue W, Mizukami I, Todd RF 3rd, Petty HR. Urokinase-type plasminogen activator

receptors associate with betal and beta3 integrins of fibrosarcoma cells: dependence on extracellular matrix components. Cancer Res. 1997;57(9): 1682-9.

283. Xue, W.; Kindzelskii, A.L.; Todd, R.F.and Petty, HR. 0 Physical association of complement

receptor type 3 and urokinase-type plasminogen activator receptor in neutrophil membranes. J Immunol:, 1994; 152, 4630-4640

284. Yanagisawa H, Davis EC, Starcher BC, Ouchi T, Yanagisawa M, Richardson JA, Olson EN.

Fibulin-5 is an elastin-binding protein essential for elastic fibre development in vivo. Nature. 2002;415(6868): 168-71.

285. Yebra M, Goretzlci L, Pfeifer M, Mueller BM. Urokinase-type plasminogen activator binding

to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction. Exp Cell Res. 1999; 10;250(l):231-40.

286. Zhang F, Tom CC, ICugler MC, Ching TT, Kreidberg JA, Wei Y, Chapman HA. Distinct

ligand binding sites in integrin alpha3betal regulate matrix adhesion and cell-cell contact. J Cell Biol. 2003;163(l):177-88.

287. Zhang JC, Sakthivel R, Kniss D, Graham CH, Striclcland DIC, McCrae KR. The low density

lipoprotein receptor-related protein/alpha2-macroglobulin receptor regulates cell surface plasminogen activator activity on human trophoblast cells. J Biol Chem. 1998; 273(48):32273-80.

288. Ziegler A, Hagmann J, ICiefer B, Nagamine Y. Ca2+ potentiates cAMP-dependent

expression of uroldnase-type plasminogen activator gene through a calmodulin- and protein kinase C-independent mechanism. J Biol Chem. 7P90;265(34):21194-201.

289. Zini JM, Murray SC, Graham CH, Lala PK, ICariko K, Barnathan ES, Mazar A, Henkin J,

Cines DB, McCrae KR. Characterization of urokinase receptor expression by human placental trophoblasts. Blood. 1992;79(11):2917-29.

290. Добровольский А.Б. Титаев E.B. Система фибринолиза: регуляция активности и

физиологические функции ее основных компонентов. Биохимия, 2002; 67 (1), 116126.

291. Парфенова Е.В., О.С. Плеханова, В.В. Степанова, М.Ю. Меньшиков, З.И. Цоколаева,

К.А.Талицкий, Т.М. Рахмат-заде, Д.О. Трактуев, Н.А. Торосян, Н.И. Рогунова, Е.И. Ратнер, В.А. Ткачук. Урокиназный активатор плазминогена: механизмы участия в ремоделировании сосудов и ангиогенезе, генно-терапевтические подходы к реваскуляризации Российский физиологический оюурнст им. И.М. Сеченова, 2004; 90; 5; 547-568.

292. Степанова В.В. Ткачук В.А. Урокиназа как мультидоменный белок и

полифункциональный регулятор клеток. Биохимия. 2002; 67 (1), стр. 127-138.

Информация о работе

Капустин, Александр Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Капустин, Александр Николаевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Капустин, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия