Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитоскелета инфицированной клетки в репликации ВИЧ-1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитоскелета инфицированной клетки в репликации ВИЧ-1"

На правах рукописи

РГБ ОД

1 о т 2ооо

Хахулина Татьяна Валерьевна

Роль цитоскелета инфицированной клетки в репликации ВИЧ-1

Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1999

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Заведующий лабораторией д.м.н. А.Г.Букринская.

Научный руководитель

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН А.Г.Букринская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гараеэ М М. кандидат биологических наук Миллер Г. Г.

Ведущая организация:

НИИ вирусных препаратов РАМН.

Защита диссертации состоится " " а2000 г. в " часов на заседании специализированого диссертационного совета Д001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН по адресу; г.Москва, 123098, ул.Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан" 5 "

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Н.П.Косякова.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), эпидемия которого охватила в настоящее время практически все страны земного шара. Несмотря на широкомасштабное изучение ВИЧ-инфекции в течение более чем пятнадцати лет (с момента открытия возбудителя СПИДа в 1983 году), многие аспекты взаимодействия вируса с клеткой-мишенью остаются нераскрытыми. Это относится, в частности, как к морфогенезу вирусных частиц, так и к роли отдельных вирусных и клеточных белков в формировании вирионов.

В последние годы появилось множество сообщений о том, что в процессы почкования вирусов вовлечен цитоскелет инфицированной клетки. Показано, что почкование некоторых вирусов, в том числе ВИЧ и вируса кори может происходить с одного полюса клетки или с участков мембраны, формирующих филоподии, в которых сконцентрированы актиновые микрофиламенты (Bohn et al., 1986; Pearce-Pratt et al., 1994). Кроме того, для процесса почкования оболочечных вирусов необходимо, чтобы все структурные компоненты будущих вирусных частиц транспортировались (индивидуально или в составе субвирусных комплексов) к сайту сборки на плазматической мембране. Показана ассоциация с микрофиламентами структурных белков вируса гриппа (Avalos et al., 1997) и ВИЧ-1 (Rey et al., 1996), что может свидетельствовать о том, что эти вирусы используют цитоскелет для направленного движения своих структурных компонентов к месту сборки, однако механизмы взаимодействия вирусных белков с компонентами цитоскелета остаются неисследованными.

Важным аспектом патофизиологии ВИЧ является его способность инфицировать неделящиеся клетки, такие как дифференцированные макрофаги, покоящиеся Т-лимфоциты и клетки микроглии. Это свойство обусловлено существованием механизмов активного транспорта вирусного преинтеграционного комплекса через нуклеопоры. Одним из компонентов преинтеграционного комплекса, направляющим транспорт вирусного генетического материала в ядро, является матриксный белок р17 Gag, несущий сигнал ядерной локализации (Von Schwedler et al., 1994; Bukrinsky et al., 1993). В то же время, матриксный белок содержит

сигнал связывания с мембранами, который определяет транспорт Gag-полипротеина р55 к плазматической мембране - Mecty сборки вирионов на поздних этапах инфекции (Gofflinger et at., 1989; Yuan et al., 1993). Это позволяет рассматривать p17 не только как структурный, но и как транспортный белок, обеспечивающий специфическую внутриклеточную локализацию вирусных компонентоа на разных этапах инфекции, однако механизмы внутриклеточного транспорта матриксного белка остаются неисследованными.

Изучение механизмов, ответственных за внутриклеточный транспорт вирус-спкцифических комплексов, а также роли отдельных белков ВИЧ-1 и их взаимодействия с клеточными структурами в процессе сборки вирионов, представляет большой интерес для понимания морфогенеза лентивирусов и может дать новый импульс в поиске эффективной стратегии против ВИЧ-инфекции. Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение внутриклеточной локализации Gag-белков в ходе морфогенеза и возможной роли цитоскелета инфицированной клетки в транспорте вирусных белков к плазматической мембране - месту сборки вирионов. В задачи исследования входило:

1. изучение внутриклеточной локализации зрелого матриксного белка;

2. изучение его взаимодействия с геномной вирусной РНК;

3. определение внутриклеточной локализации матриксного белка, мутантного по сайту связывания с мембранами;

4. исследование влияния препаратов, нарушающих целостность цитоскелета, на репликацию ВИЧ-1;

5. изучение ассоциации Gag-предшественника и зрелых Gag-белков с белками цитоскелета - актином микрофиламентов и виментином промежуточных филаментов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что матриксный белок и Gag-предшественники ВИЧ-1 ассоциированы с виментиновыми промежуточными филаментами в процессе морфогенеза. Исследовано влияние цитохалазина D и демекольцина на эффективность почкования вирионов. Полученные данные позволяют предположить, что цитоскелет инфицированной клетки, в частности, сеть промежуточных филаментов, представляет

собой путь внутриклеточного транспорта вирус-специфических белковых комплексов к плазматической мембране. Это предположение может служить базисом для дальнейших научных исследований. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Зрелый матриксный белок ВИЧ-1 на стадии сборки вирионов локализуется преимущественно в мембранах инфицированной клетки. При введении мутаций, нарушающих способность матриксного белка к связыванию с мембранами, мутантный белок накапливается в цитоскелете и ядрах инфицированной клетки.

2. Gag-предшественник р55 и матриксный белок р17 взаимодействуют с белками цитоскелета в ходе репликации ВИЧ-1. Выявлена способность Gag-белков к ассоциации с мономерным актином и виментиновыми промежуточными филаментами в процессе морфогенеза.

3. Препараты, нарушающие структуру цитоскелета, оказывают влияние на репликацию ВИЧ-1. Изучение влияние цитохалазина D и демекольцина на разные этапы ВИЧ-инфекции позволяет заключить, что актиновые микрофиламенты задействованы на ранних стадиях инфекции, в то время как промежуточные филаменты вовлечены в поздние этапы репликации ВИЧ-1, очевидно, обеспечивая транспорт Сад-предшественника и матриксного белка к плазматической мембране в ходе морфогенеза.

Апробация работы. Заседание Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, на котором была рассмотрена настоящая диссертационная работа, состоялось 19 октября 1999г. (протокол №78). По материалам диссертационной работы опубликовано шесть работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация содержит 119 страниц, 20 рисунков и библиографический список из 138 названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клетки и вирусы. В работе использовали перевиваемые линии человеческих лимфобластоидных клеток МТ-4, человеческих клеток печени 293Т, клеток Magi - производных линии HeLa (CD4\ LTR/JVgal).

Клетки МТ-4 и Magi инфицировали штаммами ВИЧ-1 ELI, MVP; трансфекцию клеток 2ЭЗТ проводили плазмидными конструкциями, кодирующими провирус инфекционного клона НХВ2 и провирус мутантного клона НХВ2-М4. Плазмиды были любезно предоставлены доктором S. Dupont.

Фракционирование клеток, анализ белков внутриклеточных фракций. Клетки 293Т фракционировали через 24 часа после трансфекции по методу Niederman с соавт. (1993). Анализ ВИЧ-специфических белков в выделенных фракциях проводили после разделения белков электрофорезом в 15% полиакриламидном геле с 0,1% SDS методом иммуноблоттинга (Laemmli et al., 1970). Иымунопреципитация. Безъядерный клеточный лизат или субклеточные фракции, растворенные в буфере RIPA (0.05 M HEPES рН 6.9, 0.01 M ЭДТА, 1% тритон Х-100,1 мМ PMSF) инкубировали с 30 мкл белка A/G с агарозой и моноклональными антителами к актину (разведение 1:200) или к матриксному белку (разведение 1:300) ночь при 4°С при медленном перемешивании. Иммунопреципитаты отмывали 5 раз в буфере RIPA. Для последующей ПЦР отмытые иммунопреципитаты растворяли в буфере PBS и проводили выделение РНК.

Полимеразная цепная реакция. Препараты РНК обрабатывали раствором ДНКазы для удаления примесей плазмидной ДНК, использованной для трансфекции. Полимеразную цепную реакцию проводили после реакции обратной транскрипции (RT-ПЦР) на приборе Perkin-Elmer с использованием 30 или 35 циклов амплификации. Использовали праймеры к области LTR генома ВИЧ-1: L1 5'-g^ggagctctctggctaact-S', L2 5'-g931gattaactgcgaatcgttc-3'. Определение числа жизнеспособных клеток проводили с помощью МТТ-теста (Mosmann, 1983).

Анализ инфекционности в одном цикле репликации в клетках Magi. Клетки Magi (HeLa-CD4-L.TR/p-gal) высевали в лунки 96-луночной плашки в концентрации 0.5 млн./мл и инкубировали в течение 24 часов. В среде DMEM готовили серию двукратных разведений культуральной жидкости, полученной от вирус-продуцирующих клеток МТ-4. Ростовую среду клеток Magi удаляли и вносили серию двукратных разведений вирус-содержащей культуральной жидкости. Клетки инкубировали 48

часов, после чего количество инфицированных клеток оценивали по уровню активации интегрированной р-галактозидазы в цветной реакции гидролиза ONPG (О-нитрофенил-р-О-галактопиранозид). Оптическую плотность определяли при длине волны 420 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Внутриклеточная локализация матриксного белка дикого типа и мутанта М4 и их взаимодействие с геномной РНК ВИЧ-1 в процессе морфогенеза.

1.1. Внутриклеточная локализация зрелого матриксного белка.

В последние годы появился ряд данных о том, что часть молекул Gag-предшественника р55 нарезается на зрелые белки до включения в вирионы (Букринская с соавт., 1993; Lee et al., 1998). В этом случае функции зрелых Gag-белков и механизмы их регуляции в процессе морфогенеза остаются неизученными.

Нашей задачей было исследование внутриклеточной локализации зрелого матриксного белка после трансфекции клеток 293Т ДНК инфекционного вирусного клона НХВ2. Использованные в данной работе клетки 293Т способны эффективно продуцировать вирионы ВИЧ-1, но не несут СР4-рецепторы и не поддерживают репликацию ВИЧ-1, что позволяет изучать стадии морфогенеза вирионов, исключив возможность реинфекции.

Клетки 293Т фракционировали через 24 часа после трансфекции ДНК НХВ2 с получением фракции ядер, мембран, цитозоля и цитоскелета. Белки клеточных фракций анализировали с помощью электрофореза и иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител к р17 ВИЧ-1.

Результаты иммуноблоттинга представлены на Рис 1. При трансфекции клеток ДНК вируса дикого типа матриксный белок локализуется преимущественно во фракции мембран. В меньшем количестве МА выявляется во фракциях ядер и цитоскелета. Незначительное количество р17 присутствует также во фракции цитозоля. Использованные моноклональные антитела были высоко специфичны к зрелому белку р17 и не проявляли заметного связывания с матриксным доменом в составе Gag-предшественников (Рис. 1).

Выявление р17 дикого типа преимущественно во фракции мембран свидетельствует о том, что в составе зрелого матриксного

белка функционирует сигнал связывания с мембранами. Незначительная ядерная локализация зрелого р17 предполагает, что на поздних стадиях инфекции сигнал связывания с мембранами доминирует над сигналом ядерной локализации независимо от того, действует ли этот сигнал в составе Gag-полипротеинэ или в зрелом белке. Эти данные не поддерживают т.н. модель миристилового переключения, согласно которой регуляция двух противоположных сигналов р17 осуществляется за счет разницы конформаций N-концевого района в составе предшественника и в зрелом белке (Spearman et al„ 1997). Полученные результаты можно интерпретировать с точки зрения модели, согласно которой регуляция двух противоположных сигналов матриксного белка осуществляется фосфорилированием (Gallay et al„ 1995; Bukrinskaya et al„ 1996).

1.2. Ассоциация матриксного белка с геномной РНК ВИЧ-1.

О роли того или иного пула молекул р17 в морфогенезе может косвенно свидетельствовать ассоциация р17 в различных клеточных фракциях с геномной вирусной РНК. Ранее было показано, что матриксный белок способен взаимодействовать с РНК ВИЧ-1, и высказывалось предположение, что р17 осуществляет транспортную функцию для переноса РНК-генома ВИЧ-1 из ядра к плазматической мембране (Bukrinskaya et а!., 1992).

Для изучения возможной связи МА с геномной РНК ВИЧ-1 в различных внутриклеточных компартментах мы подвергали клеточные фракции иммунопреципитации антителами к матриксному белку ВИЧ-1 и определяли наличие вирусной РНК в иммунопреципитатах. Клетки 293Т через 24 часа после трансфекции фракционировали с получением фракций цитозоля, мембран и ядер, и матриксный белок в полученных фракциях преципитировали моноклональными антителами. Из иммунных комплексов проводили выделение РНК и анализировали ее методом RT-ПЦР. Данным методом мы не анализировали фракцию цитоскелета, поскольку метод иммунопреципитации используется преимущественно для растворимых белковых комплексов, а филаментозные компоненты цитоскелета плохо подвергаются растворению.

На Рис. 2, А представлены результаты ПЦР с использованием праймеров LTR-U5-gag к геномной РНК ВИЧ-1. При трансфекции клеток

12 3 4

46кДа-

14 к-Да-

Рис.1. Внутриклеточная локализация матриксного белка при трансфекции клеток 2ЭЗТ ДНК вируса НХВ2. Иммуноблоттинг с моноклональными антителами к р17 ВИЧ-1. 1- фракция ядер, 2 -фракция цитоскелета, 3 - фракция мембран, 4 - фракция цитозоля.

3

4 5 6

А

Б

Рис. 2. Ассоциация матриксного белка с геномной РНК ВИЧ-1 при трансфекции клеток 293Т ДНК вируса НХВ2 дикого типа (А) и НХВ2-М4 (Б). 1, 4 -фракция ядер; 2, 5 - фракция цитозоля; 3, 6 - фракция мембран; 1-3 - ПЦР с предварительной реакцией обратной транскрипции, 4-6 -ПЦР без реакции обратной транскрипции.

ДНК вируса дикого типа вирусная РНК была выявлена в иммунных комплексах, полученных из мембранной фракции (Рис.2, А, дорожка 3). Во фракциях цитозоля и ядер при трансфекции вирусом дикого типа вирус-специфическая РНК, ассоциированная с белком р17, не была обнаружена (Рис. 2, А, дорожки 1, 2). Выявление вирус-специфической РНК в иммунопреципитатах из разных субклеточных фракций хорошо согласуется с содержанием матриксного белка в этих фракциях, проанализированного с помощью иммуноблоттинга (Рис.1). 1.3. Внутриклеточная локализация мутантного матриксного белка

Как видно из Рис. 1 и 2, зрелый матриксный белок, ассоциируясь с геномной РНК, взаимодействует с мембранами инфицированной клетки -очевидно, благодаря наличию сигнала связывания с мембранами на Ы-конце. Представляло интерес провести исследование внутриклеточной локализации матриксного белка, несущего мутации в участке связывания с мембранами. Преимущественное накопление мутантного белка в определенной фракции при блокировании взаимодействия с мембранами могло дать указание на путь внутриклеточного транспорта матриксного белка к плазматической мембране. В работе использовали мутантный клон НХВ2-М4, полученный в Отделе молекулярной медицины университета штата Массачусеттс (США). Мутант НХВ2-М4 содержал две аминокислотные замены в Ы-концевом районе матриксного белка: в положении 18 лизин был заменен на аланин, а в положении 22 аргинин был заменен на глицин.

Для исследования внутриклеточной локализации мутантного матриксного белка клетки 293Т трансфицировали ДНК мутантного клона НХВ2-М4 и через 24 часа после трансфекции получали фракции ядер, мембран, цитозоля и цитоскелета. В качестве контроля использовали клетки, трансфицированные ДНК вируса НХВ2 дикого типа. Как следует из результатов иммуноблоттинга (Рис. 3), мутантный матриксный белок клона НХВ2-М4 имел нарушенную способность к взаимодействию с клеточными мембранами по сравнению с белком дикого типа (Рис. 3, дорожки 5, 6). Локализация мутантного матриксного белка в ядрах (дорожка 2) свидетельствует о том, что р17 несет детерминанты ядерной локализации, функции которых не нарушаются введением мутаций в положениях 18 и 22. При подавлении способности к связыванию с

мембранами мутантный р17 выявляется преимущественно во фракции ядер (дорожка 2) и значительно возрастает его ассоциация с цитоскелетными компонентами клетки по сравнению с белком дикого типа (дорожки 3, 4). Этот факт может свидетельствовать о том, что цитоскелет является путем внутриклеточного транспорта матриксного белка, курсирующего между ядром и плазматической мембраной.

Рис. 3. Внутриклеточная локализация матриксного белка при трансфекции клеток 293Т ДНК вируса НХВ2 дикого типа (1, 3, 5, 7) и мутанта НХВ2-М4 {2, 4, 6, 8). Иммуноблоттинг с моноклональными антителами к матриксному белку ВИЧ-1. 1,2-фракция ядер; 3, 4 - фракция цитоскелета; 5, 6 - фракция мембран; 7,8- фракция цитозоля.

Роль зрелых Сад-белков в процессе морфогенеза остается неизвестной. Способность матриксного белка взаимодействовать с геномной вирусной РНК на стадии сборки вирионов может

12 3 4 5 6 7 8

свидетельствовать о том, что зрелый р17 наряду с вад-полипротеином участвует в морфогенезе. Поскольку часть матриксного белка в ходе морфогенеза выявляется в ядре, и при нарушении сигнала связывания с мембранами мутантный р17 выявляется преимущественно в ядре, можно предполагать, что ядерная локализация р17 важна для связывания с геномной РНК и транспорта ее к плазматической мембране для включения в вирионы. Гипотеза о подобной функции матриксного белка была впервые высказана в работе Викппэкауа с соавт. (1992). Для подтверждения гипотезы о взаимодействии матриксного белка с геномной РНК или РНК-содержащими комплексами в ядре инфицированной клетки мы анализировали способность мутантного р17, локализующегося в ядрах, к ассоциации с РНК ВИЧ-1. 1.4. Ассоциация мутантного матриксного белка с РНК ВИЧ-1.

Субклеточные фракции, полученные после трансфекции клеток 293Т ДНК вируса дикого типа НХВ2 и мутантного клона НХВ2-М4, подвергали иммунопреципитации с моноклональной анти-матриксной сывороткой. Наличие вирус-специфической РНК в иммунных комплексах выявляли методом ЯТ-ПЦР, как описано в п.1.2. Результаты ПЦР представлены на Рис.2, Б. При трансфекции клеток ДНК мутантного вируса геномная РНК была выявлена преимущественно в иммунных комплексах, полученных из ядер, и незначительное количество - в преципитатах из мембран. Во фракции цитозоля сигнал РНК выявлен не был, как и при трансфекции ДНК вируса дикого типа (Рис.2, А, Б).

Для подтверждения количественных различий в содержании РНК в иммунных комплексах, полученных при трансфекции клеток ДНК вируса дикого типа и мутанта М4, была проведена амплификация с разведением матрицы (данные не показаны). Этот подход позволил подтвердить существование количественных различий в содержании геномной вирусной РНК в иммунных комплексах, полученных из субклеточных фракций после трансфекции ДНК вируса дикого типа и мутанта М4.

Из изложенных выше данных следует, что моноклональные антитела к матриксному белку осаждают вирус-специфическую геномную РНК, т. е. можно предположить, что и матриксный белок дикого типа, и мутантный белок ассоциируются с РНК ВИЧ-1 на стадии сборки вирионов. Мутации в области полиосновного домена р17, нарушающие

транспорт матриксного белка к плазматической мембране, не влияют на способность р17 ассоциироваться с РНК ВИЧ-1.

Выявление мутантного матриксного белка не только в ядрах, но и в цитоскелете свидетельствует о том, что мутантный белок накапливается в цитоскелете, представляющем собой, очевидно, путь транспорта матриксного белка между ядром и плазматической мембраной. Ассоциация матриксного белка с геномной РНК ВИЧ-1 может свидетельствовать о роли зрелого белка р17 в процессе морфогенеза и о том, что проведение РНК-содержащих, вирус-специфических комплексов к месту сборки вирионов осуществляется с помощью матриксного белка по цитоскелету.

2. Ассоциация Gag-белков ВИЧ-1 с белками цитоскелета инфицированной клетки.

Как можно заключить из данных, представленных в предыдущем разделе, цитоскелет является структурой, обеспечивающей внутриклеточный транспорт матриксного белка, курсирующего между ядром и плазматической мембраной. Для идентификации компонента цитоскелета, выполняющего эту функцию, мы исследовали способность Gag-белков ВИЧ-1 к взаимодействию с отдельными белками цитоскелета - виментином и актином.

2.1. Взаимодействие Gag-белков с виментиновыми промежуточными филаментами.

В клетках мезодермального происхождения, а также во многих трансформированных клеточных линиях, основным структурным белком промежуточных филаментов является виментин (Fuhs, Veber, 1994). Для выделения виментиновых промежуточных филаментов из инфицированных клеток мы использовали метод деполимеризации-реполимеризации in vitro, описанный ранее для фибробластов (Steinert, 1982; Skalli et al„ 1992), с некоторыми модификациями для культуры клеток МТ-4. Данный метод впервые был использован для выделения виментиновых филаментов из инфицированных Т-клеток с целью изучения взаимодействия вирусных белков с виментином.

Способ низкосолевой деполимеризации промежуточных волокон, является сравнительно щадящей обработкой, при которой с виментиновыми протофиламетами остаются связанными белки,

участвующие в поддержании структуры филаментов и их регуляции - так называемые виментин-ассоциированные белки (БкаШ е1 а1., 1992).

Промежуточные виментиновые филаменты выделяли из ВИЧ-инфицированных клеток МТ-4 на разных сроках после инфекции и анализировали вирус-специфические белки в препаратах виментина с использованием сывороток к матриксному белку, капсидному белку и сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов. Как видно из Рис. 4, А, через 24 часа после инфекции в препарате виментина с помощью сывороток к р24 и р17 выявляется незначительное количество Сад-предшественника р55.

12 3 12 3 1 7

'•«Г

46кДа-ЗОкДа-

21 кДа-

14кДа-

4(жДа-ЗОкДа-

21кДа-14кДа-

46кДа-ЗОкДа-

21 кДа-14кДа-

Л Б В

Рис. 4. Ассоциация Сад-белков ВИЧ-1 с виментиновыми филаментами на разных сроках после инфекции. А - 24 часа после инфекции. Б - 48 часов после инфекции. В -72 часа после инфекции. 1 - цельный лизат инфицированных клеток, иммуноблоттинг с сывороткой ВИЧ-инфицированных пациентов. 2 - препарат виментиновых филаментов, иммуноблоттинг с кроличьей сывороткой к матриксному белку ВИЧ-1. 3 - препарат виментиновых филаментов, иммуноблоттинг с кроличьей сывороткой к капсидному белку ВИЧ-1.

Через 48 часов после инфекции в препарате виментина можно видеть не только Gag-предшественник р55, но и промежуточные продукты его процессинга р49 и р41, а также незначительное количество зрелого матриксного белка р17 (Рис.4, Б, дорожка 2).

Использованная в данной работе кроличья сыворотка к р17 выявляет также в положении около 34 кДа неизвестный вирус-специфический белок, идентификация которого не входила в задачи исследования. Сыворотка к капсидному белку ВИЧ-1 также выявляет Gag-предшественники и не выявляет заметного количества зрелого белка р24 (Рис.4, Б, дорожка 3). При анализе препарата виментиновых филаментов, полученного через 72 часа после инфекции, с помощью анти-матриксной сыворотки выявляются преимущественно промежуточный предшественник р41 и матриксный белок р17. Сыворотка к р24 выявляет также преимущественно Gag-предшественник р41 и не проявляет заметного количества р24. (Рис.4, В, дорожка 3).

Таким образом, с клеточным виментином в цикле его деполимеризации-реполимеризации in vitro остаются связаны Gag-предшественники и зрелый матриксный белок р17, что может свидетельствовать о тесной ассоциации этих белков с молекулами виментиновых протофиламентов. Можно предположить, что в процессе вирусного морфогенеза полипротеин р55 ассоциируется с виментиновыми филаментами и процесс его протеолитического созревания сопряжен с сетью промежуточных волокон, как следует из динамики накопления продуктов процессинга в препаратах виментина на разных сроках после инфекции. По-видимому, образующийся в результате процессинга зрелый матриксный белок остается связанным с промежуточными филаментами, в то время как зрелый р24 высвобождается из сети цитоскелета. 2.2. Взаимодействие Gag-белков с актином.

Ранее сообщалось о взаимодействии непроцессированного Gag-предшественника р55 с актином in vitro: полученный в результате экспрессии в бактериальных клетках Gag-полипротеин ассоциировался с полимеризованным in vitro кроличьим ретикулоцитарным актином (Rey et al., 1997). В ходе изучения ранних событий ВИЧ-инфекции было показано, что после проникновения вируса в клетку матриксный белок в составе преинтеграционного комплекса ассоциируется с цитоскелетом;

методом ко-иммунопреципитации была продемонстрирована ассоциация матриксного белка с актином (Bukrinskaya et al„ 1998). Способность к взаимодействию с актином зрелых Gag-белков на поздних этапах морфогенеза ВИЧ-1 не изучалась.

Актин присутствует в клетках в формах мономерного (глобулярного, G-) и филаментозного (F-) актина, между которыми существует динамическое равновесие. Метод иммунопреципитации применим преимущественно к растворимым белковым комплексам и выявляет в основном мономерный актин, представляющий собой запасной пул молекул для образования микрофиламентов.

Мы исследовали ассоциацию с актином Gag-белков ВИЧ-1, в том числе зрелых белков р17 и р24, на стадии морфогенеза методом коиммунопреципитации. Безъядерные клеточные экстракты получали из клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1, через 48 часов после инфекции. В качестве контроля использовали неинфицированные клетки. К клеточным экстрактам добавляли NaCI в двух концентрациях -150 и 500 мМ, и проводили иммунопреципитацию моноклональной анти-актиновой сывороткой. Белки полученных преципитатов разделяли с помощью электрофореза и анализировали методом иммуноблоттинга.

На Рис. 5 представлены результаты иммуноблоттинга с кроличьими сыворотками к матриксному (Рис.5, А) и капсидному (Рис.5, Б) белкам ВИЧ-1. Антитела к р17 выявляли в иммунных комплексах, образованных при 150 мМ NaCI, полипротеин-предшественник р55, промежуточные предшественники и зрелый матриксный белок (Рис.5, А, дорожка 1). При повышенной концентрации NaCI - 500 мМ - в иммунных комплексах был выявлен преимущественно зрелый матриксный белок, количество Gag-предшественников было снижено по сравнению с соседней дорожкой (Рис.5, А, дорожка 2). Антитела к р24 не выявляли заметного количества зрелого капсидного белка в иммунных комплексах, но также выявляли Gag-предшественники - в большем количестве при использовании 150 мМ NaCI, чем при использовании 500 мМ NaCI (Рис. 5, Б, дорожки 1, 2).

Из полученных результатов можно заключить, что в физиологических условиях (концентрация NaCI 150 мМ) Gag-предшественники и матриксный белок способны к формированию белковых комплексов с актином. Капсидный белок не был выявлен в

иммунопреципитах, что может свидетельствовать о том, что зрелый р24 не способен к взаимодействию с актином. Это согласуется с данными экспериментов in vitro I (Liu et al., 1999), в которых очищенный рекомбинантный р24 не образовывал комплексов с полимерным актином.

46кДа-ЗОкДа-

4

I

1

л

4

.....

21 кДа-14кДа-

Л

Рис. 5. Взаимодействие Gag-белков ВИЧ-1 с актином in vivo. 1,2- инфицированные клетки 3, 4 - неинфицированные клетки

Иммунопреципитация моноклональными антителами к актину в условиях 150 мМ NaCI (1, 3) и 500 мМ NaCI (2, 4). Иммуноблоттинг с антителами к матриксному белку (А) и капсидному белку (Б).

Сравнение результатов иммунопреципитации при 150 и 500 мМ NaCI позволяет заключить, что матриксный белок способен к более стабильным взаимодействиям с актином, чем Gag-предшественники. Можно предположить, что матриксный белок несет детерминанты специфического взаимодействия с G-актином и является тем доменом, который обеспечивает способность полипротеина р55 взаимодействовать с молекулами актина.

3. Влияние агентов, нарушающих структуру цитоскелета, на репликацию ВИЧ-1

При изучении строения цитоскелета широко используются различные соединения, нарушающие структуру и целостность внутриклеточных филаментов. Цитохалазины - класс грибных метаболитов, ингибирующих широкий спектр клеточных движений за счет подазления полимеризации актиновых микрофиламентов. В работе мы использовали цитохалазин D - соединение, наиболее часто используемое в исследованиях роли актина в репликации различных вирусов. Известно, что структуру промежуточных филаментов нарушают колхицин и его производные - кольцемид, демекольцин. В клетках HeLa демекольцин в концентрации 0.1 мкМ приводит к структурной реорганизации виментиновых филаментов с образованием плотных кольцевых пучков, сконцентрированных вокруг ядер (Karczewsky, Strebel, 1996).

Мы исследовали цитотоксичность агентов, нарушающих структуру актиновых и промежуточных филаментов, в культуре клеток Magi методом подсчета живых клеток с помощью МТТ-теста. На Рис. 6 представлены результаты подсчета количества живых клеток в присутствии различных концентраций цитохалазина D, демекольцина и колхицина через 24 часа после внесения агентов.

^ - W -------------

■цитохалазин

-демекольцин

•колхицин

0,5

8 10

Рис.6. Цитотоксичность препаратов, нарушающих структуру цитоскелета. По оси абсцисс - концентрации препаратов в микромолях, по оси ординат - количество живых клеток в процентах по отношению к контролю.

3.1. Влияние цитохалазина О и демекольцина на ранние стадии инфекции.

Влияние агентов, нарушающих структуру цитоскелета, на ранние события в ходе ВИЧ-инфекции, включающие стадии от узнавания вирусом специфических рецепторов и до интеграции вирусного генома в геном клетки-хозяина, исследовались в одноцикловом анализе инфекционности в культуре индикаторных клеток Magi (производные линии HeLa, несущие рецептор CD4 и ген р-галакгозидазы под контролем LTR ВИЧ-1) (Kimpton etal., 1992).

Цитохалазин D вносили в культуру клеток Magi за один час до внесения вируса и через один час после внесения вируса в концентрациях 0.5, 1 и 5 мкМ. Через 24 часа производили замену среды и инкубировали клетки еще 24 часа, затем измеряли активность р-галактозидазы. Подавление инфекционности ВИЧ-1 происходило при предварительном внесении цитохалазина за 1 час до инфекции (Рис. 7, А). При внесении препарата через 1 час после инфекции заметного снижения уровня продукции р-галактозидазы не происходило даже в присутствии максимальной исследованной концентрации цитохалазина -5 мкМ (Рис. 7, Б). В отличие от цитохалазина, обработка клеток демекольцином не приводила к снижению инфекционости вируса (Рис. 8).

Анализ инфекционности в клетках Magi включает стадии от узнавания вирусом клеточных рецепторов и проникновения в клетку до интеграции кДНК вируса в геном клетки. Из приведенных выше данных можно заключить, что нарушение организации промежуточных филаментов в клетках Magi не оказывает влияния на проникновение вируса в клетку и транспорт преинтеграционного комплекса в ядро. Можно предположить, что транспорт преинтеграционного комплекса в ядро не зависит от целостности промежуточных филаментов и осуществляется при участии других клеточных структур.

А

□ 5 мкМ Ш мкМ 00.5 мкМ Иконтроль

Б

□ контроль 0 0,5 мкМ

□ 1 мкМ И 5 мкМ

Рис.7. Действие цитохалазина О на инфекционность ВИЧ-1 (А -при добавлении за 1 час до инфекции, Б - при добавлении через 1 час после инфекции). По оси абсцисс - последовательные двукратные разведения вирусного инокулята, по оси ординат -оптическая плотность при длине волны 420 нм.

0,8

0,6

0,4

0,2

0

5 6

□ контре

□ 1 мкм

□ контроль

□ 0.5 мкМ ■ 5 мкМ

Рис. 8. Действие демекольцина на инфекционность ВИЧ-1 при добавлении за 1 час до инфекции. По оси абсцисс -последовательные двукратные разведения вирусного инокулята, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 420 нм.

Подавление цитохалазином уровня экспрессии р-галактозидазы в анализе инфекционное™ (Рис. 7), напротив, свидетельствует о том, что целостность актиновых микрофиламентов необходима для ранних этапов репликационного цикла ВИЧ-1. Специфическое снижение инфекционности вируса происходило при предварительной обработке клеток цитохалазином D в течение 1 часа перед внесением вирусного инокулята. Внесение цитохалазина после вирус-содержащей среды не оказывало влияния на репликацию ВИЧ. Эти результаты свидетельствуют о том, что актиновые микрофиламенты вовлечены в самые начальные этапы инфекционного процесса ВИЧ-1 и могут быть интерпретированы в свете данных Iyengar с соавт. (1998), согласно которым актиновые филаменты необходимы для концентрации корецепторов на поверхности плазматической мембраны в присутствии гликопротеина др120. В работе этих авторов было показано, что деполимеризация актиновых филаментов в присутствии цитохалазина приводила к тому, что не происходила ко-локализация на поверхности плазматической мембраны рецепторов CD4 и CXCR4, необходимая для эффективного проникновения вируса иммунодефицита в клетку-мишень.

Другое объяснение полученных результатов может заключаться в том, что, как свидетельствуют данные Викппвкауа с соавт. (1998), сеть актиновых микрофиламентов обеспечивает путь транспорта вирусного преинтеграционного комплекса в ядро инфицированной клетки, и процесс обратной транскрипции инициируется во фракции цитоскелета. Внесение цитохалазина через 1 час после инфекции не оказывало выраженного влияния на инфекционность вируса, так как, согласно данным Викппвку с соавт. (1992), через один час преинтеграционные комплексы уже попадают в ядро.

Отсутствие выраженного эффекта демекольцина при тех же условиях экспериментов не позволяет говорить о существенной роли промежуточных филаментов в процессе проникновения вируса или в транспорте преинтеграционных комплексов в ядро инфицированной клетки.

3.2. Влияние цитохалазина О и демекольцина на продукцию еирионов.

Стадии сборки и почкования изучали в культуре клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1. Через 24 часа после инфекции производили замену ростовой среды и добавляли цитохалазин и демекольцин в трех концентрациях. Анализ культуральной среды на содержание р24 проводили через 24 часа после внесения препаратов методом твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали культуральную жидкость инфицированных клеток МТ-4, не обработанных препаратами.

Добавление к вирус-продуцирующим клеткам цитохалазина О в концентрации 1 мкМ приводило к незначительному снижению концентрации белка р24 в культуральной жидкости - приблизительно на 20% по сравнению с контрольными клетками. При обработке вирус-продуцирующих клеток 2 мкМ цитохалазина концентрация р24 в культуральной жидкости быпа снижена приблизительно на 37%, при обработке 5 мкМ цитохалазина - примерно на 44% (Рис. 9, А). Влияние демекольцина на накопление белка р24 в культуральной жидкости инфицированных клеток показано на Рис. 9, Б. При добавлении демекольцина в концентрации 2.5 мкМ происходило незначительное снижение количества р24 в культуральной жидкости; обработка инфицированных клеток 5 и 12 мкМ демекольцина приводила к

снижению концентрации р24 в культуральной жидкости инфицированных клеток на 63 и 67% по сравнению с контрольными клетками, соответственно.

□ контроль п1м<М □ 2мкМ ц5мкМ 0котрогъ □ 2.5мкМ □ 5мкМ о 12мкМ

А Б

Рис. 9. Действие цитохалазина Э (А) и демекольцина (Б) на почкование вирионов. По оси абсцисс- концентрации препаратов, по оси ординат - концентрация белка р24 в культуральной жидкости.

Демекольцин, как следует из данных, представленных на Рис. 6, не вызывал снижения количества жизнеспособных клеток при внесении на 24 часа. Таким образом, эффект снижения концентрации р24 в присутствии этого препарата нельзя отнести за счет цитотоксического действия.

Добавление демекольцина к культуре вирус-продуцирующих клеток МТ-4 приводило к снижению содержания белка р24 в культуральной среде и, следовательно, подавляло продукцию вирусных частиц. Ингибирующий эффект демекольцина на почкование вирионов является косвенным свидетельством того, что интактная структура промежуточных волокон необходима для эффективной сборки и продукции вирусных частиц. Добавление демекольцина не приводило к полному подавлению продукции вирионов, что может объясняться тем, что демекольцин не разрушает полностью промежуточные филаменты, а приводит к их структурной реорганизации внутри клетки (Кагсгеу/эку, Б^еЬе!, 1996).

В отличие от демекольцина, ингибирующий эффект цитохалазина можно считать незначительным, учитывая 20%-ное снижение количества жизнеспособных клеток через 24 часа в присутствии указанных концентраций препарата (Рис.6). Аналогичные результаты были получены другими исследователями с использованием ВИЧ-инфицированных культур клеток Н9 и U937 (Sasaki et al., 1995). Другие авторы сообщали об отсутствии ингибирующего действия цитохалазина на накопление р24 в культуральной жидкости ВИЧ-инфицированных мононуклеаров периферической крови (Iyengar et al., 1998). Согласно данным Sasaki с соавт. (1995), динамика полимеризации-деполимеризации актина сравнительно не существенна для почкования ВИЧ-1, однако большую роль в почковании играют актин-миозиновые взаимодействия.

При изучении действия демекольцина и цитохалазина D на рание этапы в ходе ВИЧ-инфекции, напротив, было показано, что цитохалазин D подавляет инфекционность вируса при добавлении в культуру клеток Magi за 1 час до инфекции, а демекольцин не проявлял выраженного эффекта на ранние стадии репликативного цикла ВИЧ. Результаты исследований влияния цитохалазина и демекольцина на инфекционность ВИЧ в культуре Magi и на почкование вирионов позволяют заключить, что актиновые микрофиламенты принимают участие в ранних этапах репликативного цикла ВИЧ-1 и не оказывают существенного влияния на продукцию вирионов, в то время как промежуточные филаменты инфицированной клетки существенны на стадии сборки и продукции вирусных частиц и не являются необходимым компонентом цитоскелета на стадии проникновения вируса и интеграции его генома.

Выводы

1. Матриксный белок р17 на стадии сборки вирионов локализуется преимущественно в мембранах инфицированных клеток в ассоциации с геномной вирусной РНК.

2. Замены положительно заряженных аминокислот лизина и аргинина в положении 18 и 22 на нейтральные аланин и глицин нарушают способность матриксного белка к взаимодействию с мембранами, в результате мутантный белок локализуется преимущественно в ядре и цитоскелете инфицированной клетки. При этом функция связывания белка р17 с геномной вирусной РНК не нарушается.

3. Gag-предшественник р55 и матриксный белок р17 обнаружены в ассоциации с виментиновыми протофиламентами при очистке промежуточных филаментов методом деполимеризации-реполимеризации ¡n vitro.

4. Gag-предшественник р55 и матриксный белок р17 способны к взаимодействию с актином in vivo, при этом взаимодействие матриксного белка с актином более стабильно, чем Gag-предшественника.

5. Влияние препаратов, нарушающих структуру цитоскелета, на репликацию ВИЧ-1 подтверждает роль цитоскелета в репродукции вируса. Цитохапазин D, ингибитор полимеризации актина, подавляет ранние этапы репликативного цикла ВИЧ-1. Демекольцин, нарушающий организацию промежуточных филаметов, не оказывает влияния на ранние стадии инфекции, но подавляет продукцию вирионов инфицированными клетками.

6. Актиновые микрофиламенты задействованы на ранних стадиях ВИЧ-инфекции, в то время как промежуточные филаменты вовлечены в поздние этапы репликации ВИЧ-1, очевидно, обеспечивая транспорт Gag-предшественникэ и матриксного белка к плазматической мембране в ходе морфогенеза.

Список публикаций по теме диссертации

1. Хахулина Т.В., Воркунова Г.К., Манухина Е.Е., Букринская А.Г. Виментиновые промежуточные филаменты вовлечены в репликацию ВИЧ-1. Доклады Академии наук, 1999, т. 368, №5, с.706-708.

2. Bukrinskaya A.G., Vorkunova G.K., Tentsov Yu.Yu., Khakhulina T.V. HIV-1 Gag precursor p55 and dimers of matrix protein are associated with cytoskeleton. 2-nd European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31- 3 June 1997.

3. Хахулина T.B., Бурштейн M.E., Манухина E.E., Воркунова Г.К., Букринская А.Г. Влияние цитохалазина D на ранние стадии репликативного цикла ВИЧ-1. Шестая Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", 18-22 мая 1998 г. Санкт-Петербург, Россия.

4. Khakhulina T.V., Burstein М.Е., Vorkunova G.K., Bukrinskaya A.G. Inhibitory effects of cytochalasin D and demecolcine on HIV-1 replication in vitro. 12th International Conference on Antiviral Research, March 21-26 1999. Jerusalem, Israel.

5. Khakhulina Т., Burstein M., Manukhina E. Bukrinskaya A. Intermediate filaments are involved into HIV-1 replication. 11th International Congress of Virology. 9-13 August, 1999. Sydney, Australia.

6. Bukrinskaya A.G., Khakhulina T.V., Vorkunova G.K., Stevenson M. HIV-1 protease cleaves Gag precursor in the cytoskeleton of infected cells. 17th European Conference on Clinical Aspects and Treatment of HIV-lnfection. October 23-27, 1999. Lisbon, Portugal.

Участок множительной техники ОНИ им. Н. Н. Блохина РАМН_

Заказ 120 Тираж 100 экз.