Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие новых адамантансодержащих препаратов на репликацию вирусов иммунодефицита человека и гриппа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Действие новых адамантансодержащих препаратов на репликацию вирусов иммунодефицита человека и гриппа"

РГБ ОД

НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

1 6 П'-П Г"

На правах рукописи

А-ГЫМОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ДЕЙСТВИЕ НОВЫХ АДАМАНТАНСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ

НА РЕПЛИКАЦИЮ ВИРУСОВ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГРИППА

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинским наук

Москва 1994

Работа выполнена на кафедре вирусологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования МЗ РФ и о лаборатории биосинтеза вирусов НИИ вирусологии' им.Д.И. Ивановского РАМН.

НАУННЫН РУКОВОДИТЕЛЬ

член-корр. РАМН, академии РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

А.Г. Букримская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

л

член-корр. РАМН, академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор О.И. Ершов

доктор биологическим наук, профессор Г»А. Галегов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВНИИ чистых препаратов г. Санкт- Петербург

Зашита диссертации состоится ~30 199¿"г., в

' часов на заседании специализированного совета Д

001.20.02 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 12309В, Москва, ул. Гамалеи, 16. ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИН вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинским наук,

старший научный сотрудник А.М. Жуковский

ВВЕДЕНИЕ

----------Актуальность проблемы.— Химиотерапия - и—химчопрофклактика

Вирусных инфекций - одна иэ ведущим проблем со»р»н»нмоЛ »-<«дииимы, что обусловлено широким распространением элЯолепАниЛ вирусной атмологим и ассчма ограниченным количеством аффективных лекарственных сравств (В.И. Вотякоя, Г.А. Галего«, 1993).

До настоящего времени » клинической практике /»чвни« таким Г лов 3 Л. tili * i-S-fSJMTUl-ifl KSK СПИД М ГриГ!Г| исгнзлыучтсч томгп плииич-ныо противовирусные препарат«. Во многой »то связано с особенностями р»продукции этих вирусов.

Эа последние годи жизненный цикл во»будмтеля СГВ-(Дв и »учен •даа ли не глуб*«, чем лмбого другого вируса. Зто позволяет планомерно и целенаправленна р»храбатияатъ средства, действу«тии на опреде/ни »<wa стадии формирования вируса.

В инфекционном цикл« возбудителей СПИДа и гриппа существуют общие мишени, блокирование которых должно ингибировать инфекций. Одной из доступным миюеней для воздействии прег_»р«та яалямтся клеточные мембраны, с которыми аздимодействувт прикрепительный Seitote и белок слияния вирусов иммунодефицита человека и грипп* (gp120 и др41] ИА1 и НА2), обеспечивая проникновение вирусов в «латку. Узнавание специфических клеточных реце тгорое определяет возможность имфииироаания и клеточный тропизм вирусов. Клеточные +ембраны вовлечены а морфогенез оболочечныл вирусов, о аплартв ■"олджи происходит cospe« ание им гяикопротеидоа, с участием к легочных мембран осуществляется транспорт вирусных компонентов к ■честу сборки вирусов - плазматической мембране. Чарах гшазмати-«ескум мембрану происходит почкование вирусов. Таким обра»ом, >анние и поздние стадии инфекционного цикла тесно связаны с кла-

▼очными мембранами. Б/>о<ир сеяние рецепторных участком мембран, изменение структуры мембранным ионным каналов, модификация активных групп • мембранным структура*, взаимодействие с вирусом очи-кенным клеточных рецепторов должно привести к нарушении инфекционного цикла аируса, сушестввнно не влияя на жизнеспособность клетки-моаяина и организма.

Пембранотропные препараты иепытываится при ВИЧ-инфекции I например, в «ж сгран сульфат, модифицирующий клеточные мембраны (ftbrama D. et «1., 1989)j клеточный рецептор «СД4, полученный ре-комбинантным путем и конкурирующий с природным рецептором на поверхности Т4 лимфоцит» <Moorв 3. et al., 1991). Однако, несмотря на довольно убедительные данные опытов in vitro, клиническое применение на ВИЧ-инфицированный пациентам показало им неэффективность. На сегодняшний день практически единственным препаратом лечения СПИДа является авидотимидин (Yarchocn R. et al., 1989).

При гриппе А широко применяится такие мембранотропные препараты как анантадин и ремантадине гидромлорид. Механизм им действия на грипповнум инфекци» связан с поаргхдением ионнык каналов, формируемым минорным белком М2 в оболочке вируса (А. Hay, 1903).

При определенном положительном аффекте яти препараты имеют ряд существенных недостатков! обладают узким спектром действия, являются токсичными для организма, при длительном применении к ним развивается устойчивость.

Поэтому поиск новым эффективных мембранотропных препаратов, обладающих высокой антивирусной активностьи, низкой токсичностью и широким спектром действий - является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования» Целью-' настоящих исследований явилась изучение.действия новым адамантансодерхащих препаратов на

репликаци* вирусов иммунодефицита человек» I типа и гриппа А.

----------В соответствии с поставленной целы* в вадачи исследовании___

ВХОДИЛО!

1• Научение действия новым адамантансодерждтим препаратов на репликации вируса иммунодефицита человека I типа при остроЛ и иронической инфекциях.

2. Оценка новым адамантансодержащим препаратов, как возмож-ммм кимматврагагатмчвскми средств.

. 3. Установление «ависимости проявлении токсических и противовирусных свойств препарате« от их химическоА структуры.

4. Изучение действия новым адамантансодержащих препаратов на репродукции чувствительного и резистентного к ремантадину вариантеа вируса грипп* А.

Нау»в«ая huwwh. Впер в и» щучено деАствие новым адамантаисо-дершащих препаратов на основе малеимоаого ангидрида с фурановын циклоп на репликации ВИЧ-1 и гриппа А. Препараты различались процентным содержание« адамантанового деривата, длиной спейсерной связи, молекулярным весом.

В разделе, г»оса«ценном анализу токсикологическим характеристик адамантансодеркатим препаратов определены максимальные концентрации, не токсичны* для лимфойластоидным клчток МТ-4 на клеточном и молекулярном уровнях. Проведено сравнение с токсическим действием амантадина и ремантадина. Выявлено, что новые препараты является малотоксичными соединениями по сравнении с традиционными адамантанами (разница в ЦТ А 50 практически на lg).

В раздала работы, посвяиенном изучении действия новых ада-нантансодерхащик препаратов на репликации ВИЧ-1, определены их аффективные ингибирующме концентрации при острой инфекции ■ клетках МТ-4 (диапазон ИДдо 32-71 мкг/нл); установлено, что уяивимой ■

стадией инфекции являются ранние событии в репликативиом цикле вирус*. Показано отсутствие ингибирумщего действия препаратов на ВИЧ-I-инфекции в культуре иронически инфицировании* клеток Юркат-тат.

Установлена, что новые адамантансодврхащиа препараты обладают болев выраженной ингибируюшей актипностью н< репликацию ВИЧ-1 при острой инфекции по сравнению с традиционными адамант«нами.

В целям возможного использования новых препаратов рассчитан индекс селективности для каждого препарата (диапазон ИС 16,6 -35,9), что свидетельствует о перспективности дальнейшей работы с данным классом соединений.

Статистически выявлены особенности мимического строения новым препаратов, влияющие на проявление токсическим и противовирусным свойств. Установлено, что фактором, усиливающим анти-ВИЧ активность и токсичность адамантансодеркаших препарлтоа, япляется молекулярная масса; тогда как процент содержания аданантана в препарате и длина спейсерной связи существенно не влияли на токсичность и противовирусную активность препаратов.

В разделе работы, посвященном изучении действия ноонк ада-мантансодерхащих препаратов на чувствительный и резистентный к ремантадину варианты вируса гриппа А показано, что новыо препараты обладают менее выраженным ингибирующим действием на репродукцию чувствительного к peí тнтадину варианта вируса гриппа А по сравнению с ремантадином и не оказывают действия на резистентный вариант вируса.

Практическое значение работы. Проведенные нами исследования по изучения свойств новым адамантансодерхашим препаратов важны для лучшего понимания морфогенеза ВИЧ, возможных аналогий с гриппозной инфекцией, для поиска новых уязвимым мишеней на ранних

- Э -

стадиях репликативного цикла вируса.

Выяснение механизма дрйстеив этик препаратов на рспликвтия-ный цикл вируса иммунодефицита человека мож*т открыть путь новому поколению эффективных иипиопрофилактических и химиотерапевтичес-«енх средств борьбы с различными вирусными заболеваниями.

венозные подпиши, еыноенгме на ыевмту.

1. Новые ад*мантамсодержав)ие препараты илмтс» малото«:еич-нынм соеаим»**4«ми - с 1плмтддинон и ,

. 2- Выраженное ингибирувщее действие новых препаратов на pon— ликаш-ю БИЧ-1 проявляется на ранних стадиях острой инфекции, но отсутствует при хронической. Анти-ВИЧ эффект ноачх адамантамсо-держащих препаратов несравнимо' выше чем у ремантадина.

3. Токсические проявления и «ирусингибирукшая активность препаратов связаны с особенностями их химической структуры.

4, Ноэые адамантансодержащие препараты оказывают слабый им-гибирухкуий эффект на репродукции вирус* гриппа А по сравнению с рвмантадинон.

Агфоблция работы. Основные положения работы били представлены на 6-й международной конференции по антивирусным исследованиям (Венеция, 1993) t на 2-оА международной конферемш-в-! "AÍDS, Cancer and Human Retroviruses" (С.-Петербург, 1993)j доложены на совместной конференции кафедры вирусологии РИАПО и лаборатории биосинтеза вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 27 июня 1994 года.

Основное содержание работы отражено о 4 научных публикациях.

Объем и структур* работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы-(31

отечественных и IM зарубежных источников). Общий объем работы 120 страниц машинописного текста, вклмгчавшего 6 таблиц, 16 рисунков .

* * *

Автор пользуется случаем выразить искреи «ею благодарность своему научному руководителя член—корреспонденту РАМН, профессору Букринской А.Г.; сотрудникам НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАЖ - д.б.н. Воркуновой Г.К., к.м.н. Гиттельман А.К. и Руднеиой И.А., а также ассистенту кафедры вирусологии РМАГТО Богдан О.П. и директору НИЦ синтетических биомодулятороа объединения "Градоэко-логия", к.хим.н. Сербину А.В за оказаннум помощь в выполнении диссертационной работы, ценные советы и рекомендации.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ

Клеточные культуры.

В вкспвриментв использовались слодумщие лимфобластоидмые линии CAA* клеток! МТ-А[ хронически инфицированные клетки Мркат-тат и H9/IIIB (последние клетки в качестве линии - пролуие-нта ВИЧ-1 >. Посевная доза ЗМО5 >слеток/мл.

Куриные фибробласты (КФ>. Суспензии клеток КФ получали из лаборатории культур тканей ИИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Посевная доза клеток КФ составляла 1- 1,2 млн/мл.

Вирусы. (

В работе использовали ВИЧ-1, полученный иэ хронически инфи-

цированных H9/IIIB клеток. Инфекционну» активность вируса определяли по симцитивобраэовани« ( метод разработан в группе_инмуно---

химии НИИ оирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН). Титр инрусл, содержащегося а Суперматлнте культуральной жидкости, ойычмо составлял 1,0- 2.0 105 ТСИАэф/мл.

Чувствительный к ремантадину вариант вируса гриппа A/FPV/ Routock/34 (HTNll (Fowl plaque virual получен из музея штаммов «ИЧ 3:~yco/tiji im ин, л.И. Ио^молского. РезиСтентниЛ »c cewoimwy вариант вируса получен от Н.Л Пушкарской.

Обычно вируссодеркааая алллнтоисная жидкость имела титр 1«Э12 - Ii 1024 ГАЕ/нл.

Инфекционносtw вирусов Определяли методом редукции бляшек, формируемых вирусом под агаровым покрытием. Инфекционное тгтрм вирусов обычно были lO^'^-lO^ БОЕ/мл.

Препараты.

Новые адамамтансодержащие (АС) препараты 341, 342, 343е,с,н, 462 синтезированы в НИЦ синтетических биамодуляторов объединения Традозкология" совместно с институтом нефтехинического синтеза ин. A.B. Топчиева РАН. Препараты представляпт собой соединения из двум компонентов - водорастворимого анионогенногз полимера- носителя с молекулярным весом 3-13 кД (малеиновый ангидрид с фурано— еым циклом) и дериватов адамантана, химически связанных с носителем спейсерннми группами разной длины, конструкции и подвижности (Рис.1>.

Исследуемые АС препараты имели одинаковые полимерную основу и структуру адапантаноаого деривата (Дд), но отличались друг от друга:

- процентным содержанием Ад в цельном препарате <АС препара-

- в -

ты» 341 -35У-, 342 -21%, 343 -12'/., 462 -137.)}

- длиной и подвижность« слейсерной связи между полимерной основой и Ад (АС препарат 462))

- молекулярной массой цельного препарата (АС препарат 343, который представлен в трех вариантах« низкомолекулярном (Мп* — 3-5 кд> - АС 343н, среднемолшсулярнон (Мп - J О кД) - АС 343с и высокомолекулярном (Ип - 13 кД) - АС 34Зв.

Аля сравнения служили традиционные препараты адамантана -амантадин и ремантадина гидрохлорид.

-(^.-(СН^СН),-

л ■ г ;

Ad

Рис. 1. Общая формула новых адамантансодвржжщик препаратов.

Д - мономер, содержащий кислород; А - анионогенные группы) Z - спейсерная группа; Ад - адамантановый дериват; п - степень полимеризации; х = <1 — k — i} — степень модификации; V - молярная доля мономеров Д; 1 - молярная доля фрагментов, содержащих группы А.

Определение токсичности препаратов.

Токсичность препаратов in vitro изучали на двух уровнях» кул1»тур*л*но-кл«точном и молекулярном •

Цитотоксичность препаратов определяли через 24 час« культивирования незараженных клеток МТ-4 в присутствии различных концентраций препаратов путем подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева после окрашивании их 0,4У. раствором трипанооого си* - среднвчисловая молекулярнея масс*

него.

О влиянии препаратов на клеточный метаболизм судили по вк/м-чении радиоиэотопмых превшееткенников синтеза ДНК (^Н-тииидиил) , РНК < ^Н-уридинл) и белка < ЗЭз-метионина> в кисяотомврастворину» фракии» незараженных клеток МТ-4 после 24 члеов культивироядми* Им в присутствии различным концентраций препаратов. Радиактивная метка вносилась в культуру клеток на 1 час.

. Иауч«чш-г пр<тааз1фуо«й «антасти препаратов.

Активность вирусной репликации в присутствии и отсутствии препаратов оценивали через 72 часа культивирование зараженных клеток (множественноеты инфекции 0,1 - 0,2 ТСИДдф на клетку) по содержании о культуральчой жидкости вирусным белков методом твердофазного иммуноферментного анализа. Использовались коммерческие диагностические системы "Вектор* (г. Кольцове, Ноеосмб. об-ти) и ТЕКШКА* (Голландия! . Препараты добавлялись сразу после адсорбции вируса.

Защиту клеток АС препаратами от цитодеструктионого действия ВИЧ-1 определял»1 через 72 часа куль тиоироэдния зараженных клеток в присутствии различных концентраций препаратов путем подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева поелч окраски им 0,4Х раствором трипанового синего.

Анализ белков ВИЧ-1 проводили через 72 часа культивирования зараженных клеток с АС препаратами методом электрофореза в 10Х по ли акр и л анидном геле о стандартной трис-глмциновой системе (1_аегагаИ I). , 1970), с последующим переносом на нйтроиеллилазнум мембрану. Иммобилизованные на нитроцеллмлозной мембране белки ВИЧ-1 выявляли с использованием смеси серолозитивных сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов или моноклона ль ных антител к белку

р24. Молекулярную массу исследуемых пептидов определяли, сравнивая с положением белков натионоро вируса (ВИЧ-1) и стандартны): маркерных белков (Pharmacia, Швеция), перенесенных на нитроцвллю-лозиую мембрану и окрашенных Ponda.

Действие препаратов на репродукции вируса гриппа А определяли мгмодом редукции бляшек, формируемых вирусом под Агаровым покрытием (Portefield I., 1960). Препараты вносили сразу после адсорбции вируса (заражение клеток проводили внесением 0,2 ил •ируссодерхдмай жидкости с инфекционным титром 10?«9 - ю' БОЕ/мл).

Статист» г тек»* обработка режультатов.

Обработку полученных данных проводили, используя методики статистического анализа, принятые в биологии и медицине (Поляков И.В., 1975). Достоверность экспериментальны;« результатов оценивали с помощь» Т- критерия Стъюдента. Результаты считали достоверными при Р^ 0,03.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ТОХШСОЛОГИЧЕООС ХАРАКТЕРИСТИКИ АДАНАНТАНСОДЕРЖАЗИХ

ПРЕПАРАТОВ.

Анализ действия новых АС препаратов на незарзженньк? клетки МТ-4 выявил, что процент гибели клеток возрастал пропорционально логарифмам испытуемых концентраций препаратов, достигая VOX при концентрации 1600 мкг/мл. У амачтадима и ремантадина аналогичный уровень подавления жизнеспособности клеток отмечался при концентрации 400 мкг/мл (Рис. 2, табл. 1).

800 1200 800 1600

1600600 1200 1200 1600

50 100 400 200 Ь*2

Рис. 2. Цитотоксическсе действие АС препаратов, амантадина и

ремантадина на клетки МТ-4. По оси абсцисс - концентрация препарата е икг/мл| по оси ординат - уровень гибели клеток в X. Линии»

а). АС препараты! 1 - АС 341, 2 - АС 342, 3 - АС 343с, 4 - АС 462, 3 - АС 343н, 6 - АС 343в.

б) . 1 - амантадин, 2 - ремантадин.

Таблица 1.

Действие АС препаратов, амантадина и ремантадина на жизнеспособность клеток НТ-а .

Препарат 1 ЦТДзд (нкр/мл) 1 ЦТД90 (н«г/нл) 1

АС 341 1 1120 1 1330 I

АС 342 1 ИЗО 1 1326 1

АС 34 Зв 1 ИЗО 1 1370 1

АС 343с 1 1173 1 1370 1

АС 343н 1 1200 1 1&00 1

АС 462 1 ПВО 1 1580 1

Амантадин 1 223 1 460 1

Ремантадин 1 160 1 340 1

ЦТД

30

концентрация препарата, вызывавшая снижение жизне-

способности клеток МТ-4 на 30% И ТА 90 - концвн-1 рация препарата, вызывающая снижение жизнеспособности клеток МТ-4 на 90%

Таким овразом, представлении» данные свидетельствуют о том,' что испытуемы* АС препараты не оказывают выраженноготоксического действия на клетки МТ-4 до концентрации 1000 нкг/мл и являжтся иалотоксичными соединениями по сравнению с амантадином и ремантадином.

Действие новых АС препаратов на клеточный метаболизм изучали с помом.* радиоактивных предшественников синтеза ДНК, РНК, белка.

Анализ влияния препарате« на клеточный метаболизм выявил, что ее« АС препараты в интервал« концентраций 200 - 800 нкг/мл усиливали включение 3Н-тимидина а кислотонерастворимуи фракцию незараженных клеток МТ-4. Однако, установить какум-ливо зависимость между степень» стимуляции включения Зц-тимидина и концентрациями АС препаратов не удалось. Уровни усиления вклинения Зн-тимидина в кислотонерастворинуи фракции находились в пределах от 13 до 22SX.

Дальнейшее изучение данного феномена показало, что усиление включения ^Н-Тимидина в кислотонераствориную фракцию клеток МТ-4 не связано с усилением митотической активности клеток.

Стинулирумипий аффект был вызван цельной конструкцией АС препаратов, т.к. сами по себе ни адамантановый дериват, ни полимерная основа подобного действия не оказывали (Рис. 3) .

Было установлено, что в изучаемых АС препаратам важную роль выполняет полимерная осноЕа. Она, по-видимому, блокирует токсические свойства адамантаноаых дериватов, которые сами по себе, в концентрациях, эквивалентны : их содержанию в 800 мкг АС препаратов 342, 462, вызывали лизис клеток. Не исключено, что "блокирование" токсичности в цельных препаратах происходит за счет пространственного экранирования ^дамантановой структуры со сторона Z-групп (см. рис. 1 >.

200 150

100 - пта р, ■ Z» '

' ^ '-'Я : Ш :

■.'■■■!' '■;*■' - Ч

• ?%у * • : У*.

501—t-LJ- !,,,, I „ , ■ ;,, tV-1 , fi-fil_

632 800 6S>6 800

Рис. 3. Действие полимерной основы и АС препаратов 342, 4А2 на вкличеми* ^4-тииидимл в кислотомерастворимую фракции к лето»: НТ-4.

По оси абсцисс - концентрация препарата в икр/млj по оси ординат - уровен». вклинения Зн-тимидина в X.

1 - полимерная основа в соответствующей концентрации для АС препарата 342| 2 - цельный АС препарат 342| 3 - полимерная основа в соответствующей концентрации для АС препарата 4&2t 4 - цельный АС препарат 462.

До настоящего времени феномен стимуляции вюмчения ^Н-тини-дина в ДИК клеток МТ-4 после обработки АС препаратами не нашел своего объяснения и требует дальнейшего изучения. Однако, в литературе имеются данные о том, что некотооые препараты, такие, «сек 5-фторурацил и метотрексат нагут увеличивать включение ^Н-тими— динэ, благодаря его переносу по запасному пути, используя префор-

- 2

; j - * .'•'••> * :: -h f v

- - • >•{ » f-r 'ffî. 4

- V *•*»• Л

- 1 'г.' M k'f* ■пд л-*,' ■ т •

- V - ; Î \K j i^c * а

- W 1 ■ ' - , ( TtL-, f'v/t > «L^.i

нироааниые пиримидин» (Конки Д. и совет., 19В?).

Изучение действия амантадина и ремантадина на синтез ДНК показала, что традиционные адамантами подавляет включение ^Н-ти-ммдина в кислотонерастворимую фракцию клеток МТ-4, достигая вира-«тнага эффекта (17- 227.) при концентрацин 200 нкг/мЛ.

Дальнейшее изучение влияния препаратов на процессы клеточного метаболизма показало, что выражение* ингибирумше* действие по сравнению с амантадином и ремантадином новые АС препараты оказывают на включение 3Н-уридина в кислотонерастворимую фракцию клеток МТ-4 (табл. 2).

Таблица 2.

Действие АС препаратов, амантадина и ремантадина на синтез РНК и белка в клетках МТ-4.

Препарат 1 Расчетная концентрация препарата, подавляющая на 1

507. синтез« 1

РНК (мкг/мл) 1 белка (мкг/мл) 1

АС 341 1 134 1 1002 1

АС 342 1 200 1 >1600 1

АС 343о 1 130 1 10ТП 1

АС 343с 1 168 1 1112 • 1

АС 343н 1 174 1 12'.1'3 1

АС 462 1 <25 1 951 1

Амантадин 1 >400 1 200 1

Ремантадин1 >400 1 200 1

Нами выло отмечено отсутствие взаимосвязи между уровнем ги-— вели - клеток и показателями »ключенмя Зц_урИДИна а РНК. При концентрациях АС препаратов, подавляющих синтез РНК на 50У., лимфо-бластоидныв клетки МТ-4 при визуальном наблюдении не отличались от контрольным (не обработанным препаратом) - были прозрачны, группировались в виде кластеров и имели на поверхности характерные цитоплазматические выросты. В то же время, при кониентог.ииях •• «мвнтадича и ряп-.нтадина, подаэЛг.яаих синтез РНК на 30%, гибели клеток достигала ЧОХ (см. рис. 2).

Изучение ингибирующего действия АС препаратов на синтез белка в нвзаразсенмым клеткам МТ-4 показало, что у новым препаратов оно выражено значительно слабее, чем у амантадина и ремантадина (табл. 2) и было адекватно морфологическим изменениям клеток.

Не исключено, что при изучении клеточного метаболизма выбор изотопа в некоторой степени оказывается зависимым от класса используемого препарата (Volm М. at а!., 1979).

Возможно, чтс- о случав с новыми АС препаратами, адекватными тестами, отражающими токсические свойства, являются тест на цита-токсичность по окраске клеток трипаноаым синим » сочетании с определением скорости включения 35S -метионина в белок.

Концентрационная зависимость изменения всех метаболических процессов под действием АС препаратов показана на примере АС препарата 343м (Рис. 4). •

Суммируя данные, представленные в этом разделе, мояно заключить« позыв АС препараты являются малотоксичными соединениями по сравнению с амантадином и ремантадином! наименее токсичным для клеток МТ-4 из изучаемой группы АС препаратов является АС препарат 343н <Мп- 3-5 кД>.

Рис. 4. Действие АС препарат* 343н на включение радиоактив" ■ «

ник предшественников синтева ДНК, РНК, белка в кис-лотонерастворину* фракцию не>араженных клеток КГ"<4, По оси абсцисс - концентрация препарата в нкг/мл| по оси ординат - а), включение -*Н-тимидима в Х|' б). включение 3Н-уридина и 338-м»тионима «X.

Линии! 1 - включение Зн-тимидин«( 2 - включение 'н-уридина! 3 -включение 'Зв-метионина.

ГРОТИВГОИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ АААИАНТАНСОДЕПКАЦИХ

_____ПРЕПАРАТОВ.--------- - -----------------------

Действие иозы* ашмнпнсоАцшаяих првпяратоа на реплишоа *йруп икмуноде^читя человека X типа.

Анализ влияния данной группы соединений на релликацим ВИЧ-t при острой инфекции в лимфобластоидных клетках МТ-4 показал, что асе АС препараты оказывали выраженное ингибирулщее действие чЗО -Чи) м pwjoísywtK« 5i'p"ycMfaik ба'лкса уже в концентрации 25 'мл. Процент угнетения вирусной репликации возрастал пропорционально логарифмам испытуемых концентраций препаратов, достигая 907. подавления при концентрации 07 - JZ14 мкг/мл <Рис. 5, табл. 3).

100

?5 50

25

0

Рис. S. Ингибируищий эффект АС. препаратов на репликации!

ВИЧ-i в клетках МТ-4 при острой инфекции. По оси абсцисс - концентрация препарата в мкг/мл; па оси Ординат - подавление продукции белков ВИЧ-1 в ИФА в '/.. Линии: 1 ..-; АС 341, 2 - АС 342, 3 - АС 343с, 4 - АС 462, 5 - АС 343Hj, £-- АСл-..'.; "<■.•

200 200 200

Таблица 3.

Действие АС препаратов на ропликацию ВИЧ-1 а клетках МТ-4.

Препарат t ИДзд (мкг/мл) 1 ИДфо (мкг/мл)

АС 341 1 61 1 200

АС 342 1 35 1 161

АС 343e 1 32 1 87

AC 343с 1 за 1 106

АС 34Зн 1 41 1 214

АС 462 1 71 1 07

ИД5о - концентрация препарата, ингибируюшая репликацию ВИЧ на 50Х

ИД90 - концентрация препарата, ингибирующая репликацию ВИЧ . на 90*.

Определение химиотералевтическрго индекса (индекса селективности) для каждого исследуемого препарата показало, что данная группа соединений является перспективной для дальнейшего изучения, т.к. новые АС препараты имели довольно высокие показатели ИС (табл. 4).

Таблица 4.

Показатели индекса селективности для АС препаратов.

Препарат Г ЦТД50 (мкг/мл)1 ИД50 (мкг/мл) ИС . 1 —— и

АС 341 1 1120 1 61 18,4 1

АС 342 1 1150 1 35 ' 32, В 1

АС 343е 1 1150 1 32 35,9 1

АС 343с 1 1175 1 38 30,9 1

. - АС 343и 1 1200 1 41 29,3 »

"АС 462 1 1180 1. 71 16,6 1

ЦТД5о - концентрация препарата, вызывающая подавление

жизнеспособности клеток на 50Х ИДjo - концентрация препарата, подавляющая репликацию вируса на SОХ

ИС - индекс селективности, определяемый отношением ЦТДзо К ИДд0.

- vt -

Анели» влияния новых препаратов на репликацию ВИЧ-1 а культуре хронически инфицированных клеток Юркат-тат показал, что ни один из АС препаратов данной группы не вызывал подавления хронической инфекции.

Для дальнейшего, более детального, изучения действия АС препаратов на репликацию ВИЧ-1 при острой инфекции, нами был отобран АС препарат ЗАЗн по Следующим параметрам]

«" "" Т ~ ; 1-;—;'.S^af-yjis-.^ii-íi (Кп- ó-З <сА> , что определяло "ГО

перепсктизность для изучения 1п vivo.

оказывал наименьшее цитотокеическое действие на клетки МТ-4 по сравнению с другими АС препаратами (ЦТДзо - 1200 мкг/мл).

проявлял довольно высокую ингибирующук! активность на репликацию ВИЧ-1 <ИС 29,3).

На первом этапе работы с АС препаратом 343н было определено насколько данный препарат защищает лимфобластоидные клетки МТ-4 от цитод4?структивного некротического действия ВИЧ-1.

Анализ полученных данных показал, что АС препарат 343н в концентрации 25 мкг/мл полностью предотвращал деструкции инфицированных клеток МТ-4. Релкое снижение степени защиты клеток от вируса происходило о интервала концентраций препарата от 23 до 10 гтг/пл (Рис. 6) . ...

Нами было отмечено, что через 72 часа культивирования зараженных клеток с АС препаратам, происходит увеличение числа жизнэ-спогссЗных клеток в опыте по сравнению с инфицированным контролем с концентрации препарата 25 пкг'мл. Видимо, это является следст— вием пролиферации неинициированной популяции клеток в зараженной культуре.

Как указывалось выше, АС препараты не угнетали хроническую инфекцию а клетках Юркат-тат. Полученные данные позволили предпо-

120 100 80 60 40 20 : 0

ПГТ"

10

25

50

100

Рис, 6. Анти-ВИЧ активность АС препарата ?43н. По оси абсцисс - концентрации препарата ■ мкг/нл| по оси ординат - подавление продукции белков ВИЧ-1 я И*А и уровень зашиты клеток (X).

Линии« 1 - контрольный уровень неинфицированных клеток МТ-41 2 -

' - *

контрольный уровень инфицированных клеток НТ-4; 3 — подавление продукции белков ВИЧ-1, определяемое в ИФА.

- инфицированные живые клетки МТ-4, обработанные препаратом.

лодаггь, что новые препараты действуют на ранним стадиям инфекции, до интеграции генома ВИЧ-1 в ДНК клетки. '.

Анализ белков ВИЧ-1, проведенный'методом иммуноблота, показал, что АС препарат 34^-. эффективно реализует свое ингибирующее

действие только на ранних стадиях острой инфекции (до 4 часов

и

после адсорбции вируса). При'внесении препарата в клеточную сис-

тему черв» 4 и 20 часов после адсорбции вируса наблюдалось прогрессивное снижение антивирусного эффекта_(Рис. ^7). -----------------

г з 4 в

Рэ«

Рб7 ■.„..

Р¿1

Р30 ?1к

Рис. 7. Дойствие АС прс?пярата 343н на репликации? ВИЧ-1 в клетках МТ-4.

Концентрация препарата 200 мкг/мл. Велки ВИЧ-1 выявляли моноклональмыми антителами, полученными к белку р24. Линии — АС препарат 343Н, внесенный: 1 - за 2 часа до адсорбции вируса; 2, 3, 4 - через 0, 4, 20 часов после адсорбции вируса с.аатветстоенно( 5 - контрольные инфицированные клетки, необработанные АС препаратом. .

Параллельно с ДО препаратом было определено действие традиционного ремантадина гидрохлорида на репликации ВИЧ-1 при острой инфекции.

Было показано, что ремантадин незначительно подавлял репликацию ВИЧ-1 только при предварительной обработке клаток препаратом или внесении сразу после адсорбции вируса (Рис. 8).

I I * « I

. ( I

и

'О

(

Щт Мт

. ' \ Г

ш

Рис. в. Действие ремантадина на репликации ВИЧ-1 в клеткам

МТ-4.

Концентрация препарата 130 нкг/мл. Белки ВИЧ-1 выявляли, используя смесь серопоэитивным сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов.

*

Линии — ремантадин, внесенный: 1 — эа 2 часа до адсорбции вируса) 2, 3, 4 — через О, 4, 20 часов после адсорбции вируса соответст-вемно; 5 - контрольные инфицированные клетки, необработанные ремантадином.

По литературным данным известно, что ремантадин и амантаДин я высоких концентрациях не угнетают гриппозную инфекции (их концентрационный оптимум составляет О,1 мкМ). Мы, по аналогии с гриппозной инфекцией, анализировали действие ремантадина на репликации ВИЧ-1 при добавлении его к клеткам МТ-4 за 2 часа до адсорбции вируса в низких концентрациях (от 2 до 30 мкг/мл).

Как показали полученные данные, ремантадин и в низкич концентрациям ив оказывал ингибирующего действия на вирус <Рис. 9) .

3 *

Р 5-8 - . . —

■ . ,.Й>8 гхл«* «■»«швмтонвдм.'?.'')

Рис. 9. Действие ремантадина в низких концентрациях на репликации ВИЧ-1 в клетках Г1Т-4.

Белки выявляли, используя смесь серопоэитивных сыво-

роток ВИЧ-инфицированных пациентов.

Линии - 1, 2, 3, 4, 3 - ремантадин в концентрации: 2, 5, 10, 23, 30 мкг/мл соотватственно; 6 - контрольные инфицированные клетки, необработанные рвмантллином.

Отсутствие выраженного ингибирующего действия традиционных .кичмантлнов на ВИЧ-инфекции» по сравнению с АС препаратами, возможно обънснчется т«.'м, что полимерная основа, обладающая способ-ностьги к многоточечному кооперативному взаимодействии) с мрибраной клетки, мюрт зэаерииеать выведение препарата, обеспечивая пролонгацию ингибирующего дейстоия.

Хотя на сегодняшний день экспериментально установлено, что АС препараты действуют на ранние события репликативного цикла

в

ВИЧ-1/, да настоящего времени остается неясным механизм и что является мишенью для действия препаратов. Кроме того, наличие у АС препаратов выраженного подавления синтеза РНК, неизбежно ставит ■вопрос о том, не связан ли этот аффект опосредованно с подавлением АС препаратами ВИЧ-инфекции- Однако, отсутствие ингибирунщего действия препаратов на поздних стадиях острой и при хронической ВИЧ-инфекциях, все-таки говорят о наличии непосредственного воздействия АС препаратов на ВИЧ-1.

Статистический анализ зависимости проявления токсических свойств и антивирусной активности АС препаратов от химической структуры выявил, что процент содержания адамантанового деривата в препарате существенно не влияет на токсичность. и противовирусную активность.

Сопоставление полученных данных позволило предположить, что полимерная основа является своеобразным экранам, который со стороны г-групп (см. рис.1) блокирует проявление токсических и антивирусных свойств адамамтановой структуры. Поэтому наряду с остальными АС препаратами, исследовался АС препарат 462, у которого была удлинена спейсерная связь мезсду аданантановой структурой и

«

полимерной основой. Как показал анализ, такое изменение в конструкции п^.»парата привело к незначительному .усилении» токсических свойств, но не явилось достаточным для активизации нмгибирующего аффекта.

Анализ зависимости проявления токсических свойств и антивирусной активности АС препаратов от молекулярной массы показал, что увеличение молекулярного веса препарата приводило-наряду со значительным усиленней противовирусного аффекта к повышению токсических свойств, и наоборот. Наблмдаеные эффекты, вероятно, связаны со скоростью выведения препарата из клетки.

Полученные» данные согласуется с общепринятыми представлиниями об усилении противовирусной активности полианионов по мере роста степени их полимеризации. На именно высокая молекулчрнач масса, как известно, столчется одним из факторов роста токсичности полимерных вещестп, значительно ограничивающим круг их применения о клинике (Ottenbrite R.M., 19Э0).

Поэтому большое внимание в работе было уделено изучению свойств згрпы АС препарата 343. В экспрримоитя»

in vitro АС препарат 343н проявлял выраженную анти-ВИЧ активность и имел за счет низкой токсичности довольно высокий ИС - 29,3.

Действие новых ждапентвнеодержавих препаратов на репродукции вируса гриппа Я.

Действие АС препаратов на гриппозную инфекцию изучалось на примере- АС препарата 343н.

Бнло установлено, что по сравнению с ремантадином новый АС препарат проявляет слабое ингибирующее действие на чувствительный к ремантадину вариант вируса гриппа А и не подавляет репродукцию резистентного к ремантадину варианта вируса (Рис. 10).

Видимо, положительные моменты, заложенные при создании пре-пчр.ча и позволяющие эффективно реализовывать анти-ВИЧ активность, являются недостаточными для проявления сходного по силе с ремантадином действия при гриппозной '-.нфекции.

Однако, примечательным остается тот факт, что новые АС препараты оказьоамт ингибирующее действие при 2-х инфекция»:: ВИЧ и грипп. Это позволяет предполагать какие-то общие точки приложения, общий механизм антивирусного действия препаратов.

На основании полученных данных можно заключить, что новые АС препараты являются перспективными для дальнейших исследований с

Рис. 10. Действие АС препарата 34 Зн и* репродукцию вирус*

гриппе А.

По оси абсцисс - концентрация препарата в мкг/мл; по оси ординат - подавление бляшкообраэования в X.

Линии! 1 - АС препарат 343н, чувствительный к ремантадину вариант вируса гриппа А; 2 - АС препарат 343н, резистентный к: ремантадину» вариант вируса гриппа А» 3 - ремантадин, чувствительный к ремантадину вариант вируса гриппа А.

нескольким позиций« во-первых, общность в действии на такие обо-лочечные вирусы как ВИЧ-1 и грипп А, возможно, поможет раскрыть новые закономерности в репликатиеном цикле этих вирусов и найти новые мишени для воздействия; во-вторых, довольно гибкая структура препаратов, позволяющая вариироватъ и придавать новые качества, может быть, со временем позволит создать класс лекарственных препаратов с высокой антивирусной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Изучено действие 6 новым адамантансодержаших препаратов на репликация вируса иммунодефицита человека 1 типа в лимфо-

бластоидных клеткам. Показано, что препараты аффективно подавляют на ранних стадиям' острую инфекцию <до 4 часов после заражения •слеток),, но не угнетают хроническую. Ремантадин оказывал слабое Д-Л-Ттт::- При сстрс" ¡—'¿¡■^¿-¿л. С;килмотерд-певтнческик индексов новым препаратов (диапазон 16,6-33,9) свидетельствовало о перспективности их дальнейвего изучения.

2. Установлено, что новые адфшктансодерхацие препараты являются малотоксичными соединениями по сравнении с (иантадююи и ремантадином - разница в ЦТД30 составляла 1д. Изучение влияния новым препарате» на процессы клеточного метаболизма а незарахен— ных клетках показало, что они усиливают включение ^Н—гимндина в кислотомерастооримум фракцию, оказывают ингибирующее действие на синтез РНК и белка.

3. Изучена зависимость проявления токсических и противовирусных свойств препаратов от их химической структуры. Показана, что с увеличением мол с пуляркой гтгегтгг препарата уси^иааетс я токсичность и противовирусная активность, в то время как процент содержания адамантаноаого деривата и удлинение спейсерной связи в препарате практически не влияют на токсичность и анти-ВИЧ а*с— тияность.

4. Изучено действие новых адамантансодерхашим препаратов на репродукцию вируса гриппа А. Показана, что по сравнении! с ремантадином новые препараты проявляют слабое ингибирующее действие на чувствительный к ремантадину вариант- вируса гриппа А и не? подавляют репродукцию резистентного к ремантадину варианта вируса.

1. Bukrinskaya A.B., Serbin A.V., Sogdan O.P., Stotskaya L.L, Alimova I.V. , Kliwochkin // 1993. Amantadin analogues block early steps of HIV infection. The Sixth International Conference On Antiviral Research. Venice, April 23 - 30, Abstr., P. 32.

2. Stotekaya L.L., Sarbin A.V., MunshiK., Boadan O.P., Bukrinskay* A.B., Alimova. I.V.// 1993. Same new aspects of HIV-I inhibition by Membranotropicpplynericsubstances. 2-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses". St.-Petersburg, November 29 - December 3, Abstr., P. 38.

3. Bukrinskaya A.Q., Serbin A.Vi, Dogdan O.P., Stotskaya L.L., Alimova I.V., Klimochkin Yu.N.//1993. Inhibition of HIV-1 replication by newly developed polymeric amantadine analogue» Antiviral Chemistry and Chemotherapy.- N 4.

4. Алымова И.В. Механизм действия препаратов адамантанового ряда на репродукции вируса гриппа А// 1993. В "Указателе депонированных рукописей по медицине и зравоохракени»". Д - 23690»