Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение внутриклеточного транспорта белков вирусов растений, кодируемых тройным блоком генов гордеи- и помовирусов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение внутриклеточного транспорта белков вирусов растений, кодируемых тройным блоком генов гордеи- и помовирусов"

На правах рукописи

ШЕМЯКИНА Елена Андреевна

ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ, КОДИРУЕМЫХ ТРОЙНЫМ БЛОКОМ ГЕНОВ ГОРДЕИ- И ПОМОВИРУСОВ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Москва 2011

4847744

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Соловьев Андрей Геннадьевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович

кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологин им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 17 июня 2011 года в и часов на заседании Совета Д501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан мая 20 И года

_Крашенинников И.А.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук г\ ,,

^ V*—с,

( \ ,, I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение внутриклеточного транспорта вирусов растений является одной из актуальных проблем фитовирусологпи. Понимание молекулярных механизмов внутриклеточного транспорта вирусных белков и нуклеиновых кислот позволяет лучше понимать физиологические процессы, происходящие в клетках растений, а также защитные механизмы, активирующиеся в ответ на инфекцию фитопатогенов.

Попадая в растительную клетку, вирусы используют существующие в ней клеточные структуры и транспортные пути для своего распространения и, таким образом, представляют собой удобную модель для изучения внутриклеточного транспорта. Основную роль в распространении вирусной инфекции играют вирус-специфические транспортные белки (ТБ), которые осуществляют доставку вирусного генома от сайтов репликации к плазмодесмам (ПД) - особым каналам, соединяющим растительные клетки, - и далее в соседние клетки. Геномы различных фитовирусов кодируют один или несколько ТБ, кроме того, для эффективного распространения некоторые из них нуждаются также в белке оболочки (Harries et al., 2010).

Объектами данной работы являются ТБ гордеивнрусного типа, кодируемые тройным блоком генов (ТБГ): белок ТБГ1 ВСВК (вирус скручивания верхушек картофеля, род Pomovirus) и белок ТБГЗ ПЛВМ (полулатентный вирус мятлика, род Hordeivirus). Белок ТБГ1 обладает РПК-связывающей активностью и образует вирусный рибонуклеопротенновый комплекс (вРНП-комплекс), а белок ТБГЗ участвует в доставке этого комплекса к ПД (Morozov & Solovyev, 2003, Verchot-Lubicz et al., 2010). В настоящее время известно, что белок ТБГ1 транспортируется к ПД при участии белков ТБГ2 и ТБГЗ (Morozov & Solovyev, 2003, Verchot-Lubicz et al., 2010), но детали этого процесса не изучены. Также известно, что белок ТБГЗ транспортируется к ПД, минуя классические секреторные пути (Schepetilnikov et al., 2008), однако механизмы этого транспорта также неясны. В настоящей работе предлагается модель транспорта белка ТБГ1, показывающая важность его взаимодействия с микротрубочками (МТ) для доставки в ПД, а также выявляется роль центрального гидрофильного района белка ТБГЗ и его С-концевого трансмембранного сегмента для его COPII-независимого транспорта в периферические мембранные компартменты, связанные с ПД.

Цель н задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение внутриклеточного транспорта белков ТБГ1 и ТБГЗ вирусов растений, кодируемых ТБГ гордеивнрусного типа. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Получение невирусного вектора, позволяющего экспрессировать три белка ТБГ в одной клетке одновременно в соотношении, близком к природному.

2. Изучение роли взаимодействия белка ТБГ1 с МТ клеток растений.

3. Идентификация последовательностей белка ТБГ1, ответственных за взаимодействия с МТ.

4. Изучение роли консервативного пентапептида YQDLN и С-концевого гидрофобного участка белка ТБГЗ в его транспорте в периферические мембранные тельца.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения данной работы было показано, что белок ТБГ1 ВСВК вступает во взаимодействия с МТ. Получены данные о том, что эти взаимодействия необходимы для внутриклеточного транспорта белка ТБГ1. Картированы аминокислотные последовательности, отвечающие за взаимодействие белка ТБГ1 с МТ. Полученные в ходе работы данные выявили ключевые особенности неканонического механизма внутриклеточного транспорта белка ТБГЗ ПЛВМ в периферические мембранные структуры. Показано, что COPII-независимый транспорт белка ТБГЗ требует его олигомеризации, которая определяется консервативным пентапептидом YQDLN в центральном гидрофильном домене белка, тогда как истинный сигнал транспорта белка ТБГЗ находится в его С-концевом трансмембранном домене.

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых подходов к созданию трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Материалы диссертации могут быть использованы для чтения курсов лекций по вирусологии и молекулярной биологии.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Материалы работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011».

Публикации

По материалам диссертации опубликованы три печатных работы.

Структура работы

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы».

Содержание работы

Взаимодействие белка ТБГ1 ВСВК с МТ

Ранее было показано, что при бомбардировке листьев Nicotiana benthamiana конструкцией, несущей ген белка ТБГ1 ВСВК, слитого с геном зеленого флуоресцирующего белка (green

fluorescent protein, GFP), под контролем 35S-np0M0T0pa, и последующей конфокальной микроскопии через 15-18 часов после бомбардировки, наблюдалось диффузное свечение GFP в ядре и цитоплазме (Zamyatnin el at., 2004). В некоторых случаях слабая цитоплазматическая флуоресценция наблюдалась также в ассоциации с тонкими тяжами, напоминающими МТ (неопубликованные данные).

В настоящей работе клетки, подвергнутые бомбардировке конструкцией GFP-ТБП, анализировали с помощью микроскопии по истечении 24 и более часов после бомбардировки. При этом была выявлена выраженная локализация белка GFP-ТБП на структурах, схожих с МТ (Рис. 1А, Б). При агроинфильтрации листьев табака N. benthamiana конструкцией, несущей ген белка GFP-ТБП. также была обнаружена ассоциация белка с МТ-подобными структурами (данные не показаны).

Рис. 1. Локализация белка СРР-ТБП ВСВК через 24 часа после бомбардировки листьев N. Ьепгкапиапа. Изображения получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. А и Б - локализация белка ОРР-ТБП. В - ко-локализация белка ОБР-ТБП с белком-маркером микрофиламентов УРР-Та1. Г - ко-локализация белка ОРР-ТБП с белком-маркером МТ УРР-МАР4. Для В и Г: сигнал СРР показан слева, сигнал УРР - в центре, наложение изображений - справа. Флуоресценция УРР представлена красным цветом для удобства наложения изображений. Изображения являются результатом наложения серии оптических срезов (А, В - Г) или представляют собой один оптический срез (Б). Масштабная линейка: А - 20 мкм, Б - 5 мкм, В и Г - 10 мкм.

Чтобы определить природу наблюдаемых МТ-подобных структур, белок GFP-ТБП был ко-экспрессирован с белком-маркером микрофиламентов или белком- маркером МТ с помощью бомбардировки листьев N. benthamiana. В качестве маркера микрофиламентов был использован слитый с желтым флуоресцирующим белком (yellow fluorescent protein, YFP) актин-связывающий домен талина мыши (YFP-Tal) (Kost et ai, 1998). Для визуализации МТ использовали слитый с YFP МТ-связывающий домен белка МАР4 мыши (YFP-MAP4) (Marc et al., 1998). При бомбардировке листьев векторами экспрессии, несущими гены белков GFP-ТБП

и YFP-Tal, наблюдалось полное разделение флуоресценции GFP и YFP между двумя различными типами нитевидных структур (Рис. 1В). Наоборот, при ко-экспрессии белка GFP-ТБГ1 с белком YFP-MAP4 сигналы GFP и YFP полностью ко-локализовались (Рис. 1Г). Эти данные показывают, что белок ТБП ВСВК ассоциирован с МТ. Взаимодействия с МТ описаны и для других внрусных ТБ, прежде всего тобамовируса ВТМ (вирус табачной мозаики) (Heinlein et al., 1995, Boyko et al., 2000a, 2000b, 2007, Ashby et al., 2006, Sambade et al., 2008). При вирусной инфекции ТБ ВТМ взаимодействует с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и с МТ, а также локализуется у ПД, изменяя их предельно-пропускную способность (ППС) (Taliansky et al., 2008, Epel, 2009, Heinlein & Epel, 2004). Предположительно, ВТМ транспортируется через ПД в виде вРНП-комплекса (Taliansky et al., 2008). Таким образом, белок ТБП ВСВК и ТБ ВТМ имеют по крайней мере два общих свойства: способность связывать нуклеиновые кислоты и взаимодействовать с МТ (Heinlein & Epel, 2004, Verchot-Lubicz et al., 2010). С помощью мутационного анализа были выявлены последовательности ТБ ВТМ, отвечающие за взаимодействие с МТ (Kahn et al., 1998, Boyko et al., 2000c). При сравнении аминокислотной последовательности ТБ ВТМ и тубулинов были обнаружены схожие мотивы, консервативные для обоих белков (Boyko et al., 2000b). Даже единичная аминокислотная замена в составе так называемого «тубулин-имитируюшего домена» ТБ ВТМ приводит к потере ассоциации белка с МТ, что свидетельствует в пользу того, что ТБ ВТМ вступает в прямые взаимодействия с тубулином. Также эта гипотеза поддерживается данными, полученными in vitro (McLean et al., 1995, Ashby et al., 2006, Ferralli et al., 2006, Sambade et al., 2008). С другой стороны, в последовательности белка ТБП ВСВК районов, схожих с «тубулин-имитирующим доменом», обнаружено не было. Однако предварительные данные указывают на возможность прямого взаимодействия белка ТБП ВСВК с тубулином Al in vitro (Е.А. Шемякина, неопубликованные данные).

Локализация белка ТБП ВСВК в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ

Ранее для анализа внутриклеточной локализации белка ТБП ВСВК в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ использовалась экспериментальная система, основанная на бомбардировке листьев N. benthamiana двумя векторами экспрессии, один из которых нес ген белка GFP-ТБП, а другой - гены белков ТБГ2 и ТБГЗ (Zamyatnin et al., 2004). Последний из векторов обеспечивал экспрессию перекрывающихся генов ТБГ2 и ТБГЗ с одной мРНК, имитирующей субгеномную РНК, которая является природной матрицей для трансляции белков ТБГ2 и ТБГЗ при вирусной инфекции (Zhou & Jackson, 1996). В этой экспериментальной системе белок GFP-ТБП был обнаружен во внутриклеточных точечных структурах (являющихся, предположительно, ПД) и в крупных периферических мембранных тельцах. Кроме того, белок GFP-ТБП транспортировался из тех клеток, в которых экспресснровался после бомбардировки, в соседние клетки, что свидетельствует о том, что белки ТБГ2 и ТБГЗ могут обеспечивать транспорт белка GFP-ТБП и к ПД, и через ПД в отсутствие других вирусных белков (Zamyatnin et al., 2004). Однако данная система экспрессии транспортных белков имеет ряд недостатков. Во-первых, относительные количества двух экспрессионных векторов,

(оставляемых при бомбардировке в данную клетку, могут существенно варьировать, что триводит к различным соотношениям белка ТБГ1 и белков ТБГ2/ТБГЗ в разных клетках. Во-торых, когда гены, кодирующие белок ТБГ1 и белки ТБГ2/ТБГЗ, находятся под контролем 58-промотора, они транслируются в клетках в соотношении ТБГ1:ТБГ2:ТБГЗ близком к 0:10:1, поскольку перекрывающиеся гены белков ТБГ2/ТБГЗ экспрессируются в соотношении 0:1 (Zhou & Jackson, 1996). Между тем показано, что в условиях вирусной инфекции оотношение уровня экспрессии белков ТБГ1:ТБГ2:ТБГЗ составляет 100:10:1 (Jackson et al., 009).

Для достижения соотношения экспрессируемых транспортных белков, близкого к риродному, нами был сконструирован бинарный плазмидный вектор, содержащий две кспрессиоиные кассеты. Первая из них несла ген GFP-ТБП под контролем сильного онститутивиого 355-промотора, тогда как вторая - перекрывающиеся гены, кодирующие елки ТБГ2 и ТБГЗ, под контролем промотора нопалин-синтазы, существенно более слабого в равнении с 353-промотором (Sanders et al., 1987). В этой конструкции промотор нопапин-интазы обеспечивает синтез мРНК, имитирующей природную субгеномную РНК ВСВК, лужащую, как предполагают, матрицей для трансляции и белка ТБГ2, и белка ТБГЗ (Jackson et L, 2009, Verchot-Lubicz et al., 2010). Таким образом, впервые был получен невирусный вектор, кспрессирующий одновременно все три ТБ ВСВК и названный pLH-35S:GFP-TBFl-08:ТБГ2/ТБГЗ (Рис. 2).

I °

8- « 1 и й и о й|0| 0|

¡2 a Л. о Я S

СРР ТБГ1 ТБГ2/ТБГЗ

'ис. 2. Схематическое изображение бинарного вектора рЬН-358:0РР-ТБГ1-1Ч05:ТБГ2/ТБГЗ. трелками указаны промоторы, заштрихованными прямоугольниками - терминаторы. Гены, ;одирующие белки СИР, ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ, обозначены серыми прямоугольниками.

Вектор рШ-358:0РР-ТБГ1-М08:ТБГ2/ТБГЗ доставлялся в растения N. ЬепЛатшпа с омощью агроинфильтрации. Локализацию белка ОРР-ТБГ1 детектировали с помощью онфокального лазерного сканирующего микроскопа в течение четырех дней после шфильтрации (д.п.и.).

На первый д.п.и. флуоресценция ОБР в инфильтрированных листьях не была обнаружена данные не показаны). На второй д.п.и. флуоресценция вРР наблюдалась в ядре, где аспределялась диффузно, а также в ассоциации с МТ, что соответствует фенотипу, мблюдаемому при экспрессии белка СРР-ТБП в отсутствие белков ТБГ2 и ТБГЗ (Рис. 1А, Б и А). На третий д.п.и. вБР также детектировался в ядре и на МТ. Дополнительно были бнаружены небольшие СРР-ТБГ1-содержащие гранулярные тельца размером 0,3-0,8 мкм, эасположенные вдоль МТ, а также вблизи клеточной стенки (Рис. ЗБ, В). На четвертый д.п.и. "елок СРР-ТБГ1 ВСВК по-прежнему детектировался в нуклеоплазме, большая часть белка находилась в составе гранулярных телец, локализованных вдоль клеточной стенки, также

сохранялась остаточная ассоциация белка с МТ, наблюдаемая на более низком, чем i предыдущие дни, уровне (Рис. ЗГ). Кроме того, на четвертый д.п.и. наблюдались аморфны«, включения, по размерам сопоставимые с клеточным ядром и имеющие преимуществен^ околоядерную локализацию (Рис. ЗГ). Эти включения внешне напоминали агресомы описанные ранее в клетках животных (Johnston et al., 1998) и относительно недавно - в клетках

Рис. 3. Локализация белка GFP-ТБП дикого типа, экспрессированного г составе вектора pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TEr2/TEr3, послс

агроинфильтрации листьев N1 benthamiana. Изображения получены с помощью конфокального лазерной] сканирующего микроскопа. А - 2~ д.п.и. Б и В - 3 д.п.и. Г - 4 д.п.и] Показаны наложение серии оптических срезов (А, Б, Г) il единичный оптический срез (В) Масштабная линейка: А, Б и Г - 2С мкм, В - 5 мкм.

растений (Vogel et al., 2007, Harries et al., 2009a). Предполагается, что агресомы являются местами непротеосомной деградации белков и формируются МТ-зависимым путем, а именно за счет направленного транспорта по МТ белков и белковых агрегатов, подлежащих деградацш| (Johnston et al., 1998, Harries et al., 2009a). Важно отметить, что похожие на агресомы структуры детектировались в некоторых клетках N. benthamiana, инфильтрированных вектором экспрессии pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TBr2/TBr3, уже на третий д.п.и. (данные не показаны).

Таким образом, в соответствии с данным, полученными ранее (Zamyatnin et al., 2004), белок ТБГ1, экспрессируемый в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ, доставлялся к клеточной стенке. Необходимо отметить, что в проведенных ранее экспериментах, когда белки GFP-ТБП и ТБГ2/ТБГЗ экспрессировались в результате ко-бомбардировки двумя векторами экспрессии; наблюдались два типа ТБГ1-содержащих структур, связанных с клеточной стенкой, - точечные включения в клеточной стенке, предположительно локализующиеся в ПД, и крупные мембранные структуры, расположенные вдоль клеточной стенки (Zamyatnin et al, 2004). Последние структуры не наблюдались при экспрессии белков GFP-ТБП и ТБГ2/ТБГЗ в результате агроинфильтрации двухкассетным вектором экспрессии, что указывает на то, что они могли возникать в результате гиперэкспрессии белка ТБГ2 и/или белка ТБГЗ.

Получено достаточно много данных о роли МТ в транспорте вРНП-комплексов ВТМ. Небольшие подвижные ассоциированные с МТ тельца, представляющие собой комплексы,

б

ш

состоящие из ТБ и РНК, обнаружены в листьях табака, зараженного ВТМ, несущим ген температуро-чувствительного мутанта ТБ (Boyko et al., 2007, Sambade et al., 2008). Важно отметить, что подобные частицы образуются и при временной экспрессии ТБ ВТМ, они содержат РНК и ассоциированы с МТ. Предполагается, что ассоциация с МТ важна для направленного внутриклеточного транспорта вРНП-комплексов к ПД (Sambade et al., 2008).

В случае ассоциированных с МТ гранулярных телец, содержащих белок ТБГ1 ВСВК, детектировать их движения не удалось. Тем не менее, можно предположить, что образование белок-ТБП-содержащих телец, связанных с МТ, является одной из первых стадий транспорта белка к ПД. В пользу этой гипотезы свидетельствует то, что ассоциация белка ТБГ1 с МТ и образование гранулярных телец всегда предшествовало появлению белка в других внутриклеточных структурах. Интересно, что белки Р2, РЗ и Р6 вируса мозаики цветной капусты также образуют ко-локапизующиеся с МТ тельца и, кроме того, наличие МТ необходимо для формирования этих телец (Harries et al., 2009а, Martiniere et ai, 2009). Возможно, вирусы, относящиеся к разным группам, используют одни и те же механизмы для формирования МТ-зависимых гранулярных телец и для их дальнейшего транспорта к периферии клетки.

Другая возможная функция взаимодействия ТБ с МТ - это транспорт избыточного белка к местам его деградации. Так, например, для ТБ ВТМ предполагается МТ-зависимая деградация ТБ (Curin et al., 2007), также показано, что МТ необходимы для деградации ТБ вируса скручивания листьев картофеля (Vogel et al., 2007). Предполагается, что молекулы ТБ или образуемые ими небольшие агрегаты транспортируются вдоль МТ к местам образования структур, схожих с агресомами (Vogel et al., 2007). Подобная модель также предложена для формирования агресом в животных клетках в ответ на накопление гиперэкспрессированного или неправильно свернутого белка (Garcia-Mata et al., 2002).

Белок ТБГ1 доставляется белками ТБГ2 и ТБГЗ в ПД

Чтобы подтвердить предположение о том, что внутристеночные включения, образуемые при экспрессии вектора pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TBr2/TBr3 на четвертый д.п.и., ассоциированы с ПД, было применено окрашивание анилиновым синим. Этот краситель содержит сирофлуор, который специфически окрашивает каллозу, концентрирующуюся в области шейки ПД (Ding, 1998, Kim & Zambryski, 2005, Maule, 2008, Faulkner & Maule, 2011, Tilsner et al., 2011). Было обнаружено, что гранулярные тельца в клеточной стенке, содержащие белок GFP-ТБП, ко-локализуются с окрашенными отложениями каллозы (Рис. 4А), что подтверждает локализацию белка ТБГ1 в ПД.

Было проанализировано, ассоциированы ли образуемые белком GFP-ТБП структуры с ПД периферически или локализуются внутри канала ПД. Для этого листья N. benthamiana, агроинфильтрированные вектором рЬН-355:ОРР-ТБГ1-Ж)8:ТБГ2ЯБГЗ, обрабатывали маннитолом, чтобы вызвать плазмолиз. Было обнаружено, что после плазмолиза образуемые белком GFP-ТБП включения сохраняются в клеточной стенке, а не отходят от нее вместе с

плазмалеммой (Рис. 4Б). Это свидетельствует о том, что белок ТБГ1 локализуется внутри полости ПД.

А ' ■ - ' 1 W Г . у-' i . J j ^ * j®! a; i. ч . / \ - л fx _

4 i ' } й 1 % * 3

Рис. 4. Локализация белка GFP-ТБП, экспрессированного в составе вектора pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TBr2/TEr3, в ПД эпителиальных клеток N. benthamiana на четвертый д.п.и. Изображения получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Показан единичный медиальный срез. А - ко-локализация белка GFP-ТБП с каллозой, окрашенной анилиновым синим. Сигнал GFP показан слева, сигнал каллозы - в центре, наложение изображений - справа. Флуоресценция каллозы представлена красным цветом для удобства наложения изображений. Стрелки указывают на перекрывающиеся сигналы от GFP и каллозы. Б - локализация белка GFP-ТБП после плазмолиза. Сигнал GFP показан слева, изображение в проходящем свете - в центре, наложение изображений - справа. Стрелки на изображении в центре указывают на отделившуюся от клеточной стенки плазмалемму, стрелки на правом изображении - на оставшийся в клеточной стенке белок GFP-ТБП. Масштабная линейка: 15 мкм.

Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о локализации вирусных ТБ в ПД. Впервые такая локализация была показана для ТБ ВТМ (Hofmann et al., 2007). ТБ ВТМ обеспечивает доставку вРНП-комплекса к ПД и, кроме того, способен изменять ППС ПД (Wolf et al., 1989, Hofmann et al., 2007, Waigmann & Heinlein, 2007). Изменение ППС ПД необходимо для межклеточного транспорта вируса, поскольку вРР1П-комплексы не могут свободно диффундировать через просвет микроканалов ПД (Crawford & Zambryski, 2001, Taliansky et al., 2008, Epel, 2009). Локализация в ПД показана и для ТБ гордеивирусного типа (Erhardt et al., 2000, Haupt et al., 2005, Lim et al., 2009, Tilsner et al., 2010). Считается, что белок ТБГЗ транспортирует и белок ТБГ2, и белок ТБП, связанный с вирусной РНК, к клеточной стенке, в то время как белок ТБГ2 обеспечивает прочность связи этих комплексов с ПД и, возможно, участвует в изменении ППС ПД (Morozov & Solovyev, 2003, Jackson et al., 2009).

Снижение уровня экспрессии тубулина не блокирует внутриклеточный транспорт белка ТБП ВСВК

Поскольку ассоциация белка ТБП с МТ всегда предшествовала его локализации в клеточной стенке, была предпринята попытка оценить роль МТ во внутриклеточном

транспорте белка ТБГ1 с помощью вирус-индуцированного сайленсинга (ВИС) тубулина. Для этого была получена конструкция TRV-TubAS, представляющая собой вектор экспрессии на основе вируса погремковости табака (Ratcliff et al., 2001), несущий фрагмент гена тубулина А1 N. benthamiana. Сходная конструкция была описана ранее для ВИС тубулина в растениях N. benthamiana (Gillespie et al., 2002).

Молодые растения N. benthamiana агропнфильтрировали конструкцией TRV-TubAS на стадии четырех листьев. Инфильтрированные вектором TRV-TubAS растения отличались морфологически от контрольных растений, зараженных TRV-вектором, не несущим какой-либо вставки. Растения, подвергнутые ВИС тубулина, оставались карликовыми, новые растущие листья были более жесткими, они изгибались, закручивались и оставались мелкими, на некоторых листьях появлялись некрозы (Рис. 5А).

Через 20 дней после инфильтрации растений вирусным вектором TRV-TubAS ВИС проверяли с помощью агроинфильтрации маркера МТ GFP-MAP4 и анализа его локализации с использованием конфокального микроскопа. В контрольных листьях наблюдалась характерная локализация GFP-MAP4 в ассоциации с МТ (рис. 5В). В листьях с ВИС тубулина GFP-MAP4 образовывал либо обычные, но более редкие, тяжи, либо короткие палочковидные структуры (Рис. 5В).

В растениях, подвергнутых ВИС тубулина, экспрессировали конструкцию pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TBF2/TBr3 через 20 дней после агроинфильтрации вектором TRV-TubAS и анализировали локализацию белка GFP-ТБП через три и четыре д.п.и. Было обнаружено, что белок ТБГ1 взаимодействует с остаточными МТ и локализуется в ИД (Рис. 5Г). Иммуноблот-анализ растений N. benthamiana с антителами к тубулину а, проведенный через 20 дней после агроинфильтрации вирусным вектором TRV-TubAS, показал, что в растениях с ВИС уровень тубулина существенно снижен в сравнении с контрольными растениями (Рис. 5Б). Вместе с результатами микроскопии белка GFP-MAP4 в растениях, подвергнутых ВИС, эти данные говорят о том, что в использованных экспериментальных условиях ВИС не был полным. Это соответствует данным литературы, согласно которым при использовании ВИС в большинстве случаев полного выключения генов не происходит (Caplan & Dinesh-Kumar, 2006). Так, например, использование вектора TRV для сайленсинга генов PDS, CTR1 и CTR2 томата приводило к супрессии этих генов только на 80% (Liu et al., 2002). При этом ВИС варьирует в зависимости от вида растения, его возраста, а также супрессируемого гена (Caplan & Dinesh-Kumar, 2006).

Таким образом, сайленсинг тубулина в наших экспериментах приводил к нарушению нормального развития у растений, что отражалось в их морфологической патологии. При этом, поскольку снижение уровня тубулина в клетках растений не ингибировало транспорт белка ТБГ1 к ПД, можно предполагать, что количество МТ не является лимитирующим фактором для внутриклеточного транспорта белка ТБГ1.

Рис. 5. Локализация белка-маркера МТ СРР-МАР4 и белка СРР-ТБП, экспрессированного в составе вектора рЬН-358:ОРР-ТБГ1-Ш8:ТБГ2/ТБГЗ, после 20-дневного ВИС тубулина в листьях N. Ьепг/гстпапп. А - изображение N. Ьемкштапа после

агроинфильтрации вектором ТЕУ2-ТиЬА5 (слева) и ТИУ2 без вставки (справа). Б - иммуноблот с тубулин-специфическими

антителами: дорожка 1 - экстракт из листьев,

агронфильтрированных ТЯУЗ без вставки, дорожка 2 - экстракт из листьев, агроинфильтрированиых Т1т-ТиЬАЗ. Справа указаны молекулярные массы маркерных белков. кДа. В - локализация белка-маркера МТ СРР-МАР4 в листьях, агроинфильтрированиых ТЯУ2 без вставки (слева) и ТКУ2-ТиЬАБ (справа). Г - локализация белка СРР-ТБГ1 в листьях, агроинфильтрированиых ТК"У2 без вставки (слева) и ТКУ2-ТнЬА5 (справа). В и Г: изображения получены с помощью конфокального лазерного

сканирующего микроскопа.

Показано наложение серии оптических срезов. Масштабная линейка: 10 мкм.

Обработка клеток колхицином ингибирует доставку белка ТБГ1 к ПД и образование агресом

В дальнейших экспериментах по выявлению роли МТ во внутриклеточной локализации белка "ГБГ1 ВСВК был проведен анализ транспорта белка ТБГ1 к ПД в листьях, обработанных колхицином - известным ингибитором полимеризации тубулина и формирования МТ. В качестве контроля использовались клетки, экспрессирующие белок ОРР-МАР4. Колхицин добавлялся в буфер для агроинфильтрации и вводился в листья N. Ьеш/гат/апа одновременно с рЬН-358:0РР-ТБГ1-М08:ТБГ2/ТБГЗ или рЬН-ОРР-МАР4. Микроскопия образцов проводилась на третий и четвертый д.п.и. В листьях, обработанных колхицином и экспрессирующих белок ОРР-МАР4, наблюдалась диффузная флуоресценция в цитоплазме, а также в ядре и ядрышке (Рис. 6А), что свидетельствует о разрушении МТ. В отличие от контрольных клеток, экспрессирующих белок ТБГ1 без обработки колхицином, в клетках листьев, обработанных

г

колхицином, не наблюдалось локализации белка вРР-ТЕП на МТ и в ПД, а также не образовывались агресомы. В этих клетках флуоресценция наблюдалась в цитоплазме в ассоциации со структурами, напоминающими сеть ЭПР (Рис. 6Б). Таким образом, разрушение МТ колхицином блокирует транспорт белка ТБГ1 к плазмодесмам, а также ингибирует образование агресом.

Рис. 6. Локализация белка GFP-ТБП, экспрессированного в составе вектора pLH-35S:GFP-TBr 1 -Ш5:ТБГ2/ТБГЗ, и белка-маркера МТ GFP-MAP4 после обработки клеток N. benthamiana колхицином на третий д.п.и. Изображения получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Показано наложение серии оптических срезов. А - локализация белка GFP-MAP4 в контрольных необработанных (слева) и обработанных (справа) колхицином клетках. Б - локализация белка GFP-ТБП в контрольных необработанных (слева) и обработанных (справа) колхицином клетках. Масштабная линейка: 20 мкм.

1

Поскольку в клетках растений мембраны ЭПР находятся в тесном контакте с сетью микрофиламентов (Boevink et al., 1998), последние могут играть существенную роль в обеспечении транспорта ТБ или вРНП-комплексов к ПД. С другой стороны, тяжи, образуемые МТ и микрофиламентами, находятся в тесном контакте на периферии клетки (Barton & Overall, [ 2010), поэтому ТБ или вРНП-комплексы, первоначально локализующиеся на МТ, могут отсоединяться от МТ и включаться в ЭПР-зависимый транспортный путь (Sambade et al.. 2008). Полученные нами данные косвенно подтверждают такую модель транспорта для ВС'ВК, Разрушение МТ с помощью колхицина приводило к локализации белка GFP-ТБП в структурах, напоминающих сеть ЭПР. Поскольку в отсутствие белков ТБГ2 и ТБГЗ белок ТБГ1 ВСВК не проявляет способности связываться с ЭПР, можно предположить, что белок ТБГ1 взаимодействует с ЭПР при участии интегральных трансмембранных белков ТБГ2 и/или ТБГЗ. локализующихся в мембранах ЭПР или в производных от ЭПР компартментах (Morozov & Solovyev, 2003, Verchot-Lubicz et al., 2010).

Анализ мутантов белка ТБГ1 подтверждает взаимосвязь между ассоциацией белка с МТ и его транспортом в ПД

Для идентификации района белка ТБГ1, ответственного за взаимодействие с МТ, был использован ряд мутантов (Рис. 7). К ним относятся мутант ТБП-Mlul с делетированными

аминокислотными остатками 37-85, описанный ранее (Zamyatnin et al., 2004), и три новых делеционных мутанта, а именно мутант ТБП-dN с делецией первых 34 аминокислотных остатков, мутант ТБГ1-М1и2 с делецией остатков 37-84 и мутант ТБП-HEL с удаленными первыми 188 аминокислотными остатками (Рис. 7). Кроме того, был получен ряд точечных мутантов (Рис. 7). В аминокислотной последовательности мутанта ТБП-GKN треонин заменен на аспарагин в консервативном мотиве GSGKT первого мотива ЫТРазного/хеликазного домена белка ТБГ1. Такая мутация ведет к нарушению энзиматической и регуляторной функций белка, поскольку происходит смещение сродства ЫТРазы от АТФ/ГТФ в сторону АДФ/ГДФ, что приводит к нарушению функций белка даже в присутствии АТФ (Feig, 1999, Nagy et ai, 2009). Мутанты ТБГ1-С2 и ТБГ1-СЗ имеют аминокислотные замены в шестом консервативном домене ЫТРазного/хеликазного домена белка ТБГ1. Этот участок, предположительно, отвечает за взаимодействия белка ТБГ1 с белками ТБГ2 или ТБГЗ (Zamyatnin et al., 2004). Мутантными генами белка ТБГ1 замещали ген дикого типа в векторе pLH-35S:GFP-TBri-NOS:TBr2/TBF3, и полученные конструкции использовали для агроинфильтрации листьев N. benthaminana. Локализация белков детектировалась с помощью конфокального микроскопа в течение четырех д.п.и.

IA II III IV V vi

Mlul' GKN С2 СЗ

ЗУ_13а

Mlu2

1 186 HEL

Рис. 7. Схематическое изображение мутаций, внесенных в белок ТБГ1 ВСВК. Аминокислотная последовательность белка представлена в виде прямоугольника. Закрашенные участки обозначают положение NTP/хеликазного домена с семью консервативными мотивами I - VI. Знаком «+» обозначена положительно заряженная область белка. Горизонтальными стрелками обозначены делении, над стрелками обозначены положения удаленных аминокислотных остатков. В рамках обозначены произведенные замены аминокислотных остатков для точечных мутантов GKN, С2 и СЗ1. в верхней строке представлены аминокислотные последовательности для белка дикого типа, в нижней - для мутантных белков.

Было обнаружено, что белки с мутациями dN, Mlul, GKN, С2 и СЗ не теряли способности ассоциироваться с МТ и образовывать связанные с ними гранулярные тельца и доставляться в ПД, хотя по сравнению с белком дикого типа у некоторых мутантов эти взаимодействия были ослабленными (Табл. 1, Рис. 8). Так, в клетках, экспрессирующих мутанта ТБП-dN, на второй д.п.и. белок в основном диффузно распределялся в цитозоле, но при этом все же слабо ассоциировался с МТ (Рис. 8А). На третий д.п.и. наблюдалось по-прежнему крайне слабое взаимодействие белка с МТ, а также появлялись единичные гранулярные тельца в ассоциации с ними, на четвертый д.п.и. количество гранулярных телец возрастало, белок достигал клеточной стенки (Рис. 8А). В клетках, экспрессирующих мутантный белок ТБП-Mlul, детектировались

Рис. 8. Локализация мутантных белков СИР-ТЕП, экспрессированных с помощью

I агроинфильтрации листьев N. ЬетИштапа в составе вектора рЬН-355:СРР-ТБГ1мут-Ж)3:ТБГ2/ТБГЗ, где ТБПмут - соответствующий мутант. Изображения получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа путем наложения серии оптических срезов. Слева показана локализация белка на 2 д.п.и., в центре - на 3 д.п.и. и справа - на 4 д.п.и. А -локализация мутанта <114. Б - локализация мутанта М1и1. В - локализация мутанта М1и2. Г -локализация мутанта НЕЬ. Д - локализация мутанта вКИ. Е - локализация мутанта С2. Ж -локализация мутанта СЗ. Масштабная линейка: 10 мкм.

1 лишь единичные МТ на протяжении первых трех дней наблюдений, на четвертый д.п.и. их количество увеличивалось и белок достигал клеточной стенки (Рис. 8Б). Точечный мутант ТБП-ЙШ на второй д.п.и. локализовался на МТ, хотя и в уменьшенном количестве в сравнении с белком дикого типа; на третий д.п.и. наблюдались типичные гранулярные тельца; и

I к четвертому д.п.и. белок транспортировался в ПД (Рис. 8Д). Интересна локализация мутанта ТБГ1-С2: уже на второй д.п.и. он образовывал множество гранулярных телец на МТ, их количество возрастало к третьему д.п.и., причем практически весь находящийся в цитозоле белок вступал во взаимодействия с МТ. На четвертый д.п.и. количество белка, ассоциированного с МТ, сокращалось, частично мутантный белок ТБГ1 наблюдался распределенным диффузно по цитоплазме, однако какая-то его часть все же достигала клеточных стенок (Рис. 8Е). Мутантный белок ТБП-СЗ на второй д.п.и. практически не локализовался на МТ, а был диффузно распределен в цитоплазме. Однако уже на третий д.п.и. он по большей части был ассоциирован с МТ и, кроме того, образовывал множественные гранулярные тельца как на МТ, так и в виде агрегатов около ядра. На четвертый д.п.и. белок

ТБП-СЗ по-прежнему сохранялся в ассоциации с МТ, образуя вдоль них более крупные по сравнению с белком дикого типа гранулярные тельца. Способность мутантного белка достигать клеточные стенки не блокировалась (Рис. 8Ж).

Таблица 1. Локализация мутантных белков ТБГ1 ВСВК

Белок ТБП Ассоциация с МТ, 2 д.п.и. Образование гранулярных телец, 3 д.п.и. Локализация в ПД, 4 д.п.и.

Дикий тип +++ +++ +++

+ + +

М1и1 + + +

М1и2

НЕЕ _ _ _

вки + ++ +

С2 ++ +++ ++

СЗ + ++ +

Два из изученных мутантов - ТБГ1-М1и2 и ТБП-НЕЬ - полностью теряли способность к ассоциации с МТ, образованию гранулярных телец, а также транспорту к плазмодесмам (Табл. 1, Рис. 8В, Г). Следует отметить, что все мутантные белки, способные взаимодействовать с МТ, также образовывали похожие на агресомы структуры на четвертый д.п.и., что не наблюдалось у мутантов ТБГ1-М1и2 и ТБП-НЕЬ (данные не показаны).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что взаимодействие белка ТБГ1 с МТ предшествует его транспорту к ПД и необходимо для осуществления данного процесса. Более того, можно предположить, что во взаимодействия белка ТБГ1 с МТ вовлечены последовательности с 86 по 184 аминокислотный остаток белка ТБГ1. Эта область включает в себя С-концевую часть неструктурированного ¡Ч-концевого домена белка и часть внутреннего домена, имеющего выраженную вторичную структуру (Макагоу ег а/., 2009). Первый из этих районов имеет незначительное сходство в белках ТБГ1 различных помовирусов, тогда как второй - весьма консервативен (данные не показаны), что позволяет предположить, что именно он может участвовать во взаимодействии с МТ.

Основываясь на полученных данных, мы предлагаем следующую модель транспорта белка ТБГ1 ВСВК. На ранней стадии инфекции белок ТБП вступает в латеральные взаимодействия с МТ и формирует на них гранулярные тельца. Затем белок ТБГ2, накапливающийся в мембранах ЭПР, вступает во взаимодействие с белком ТБП и транспортирует гранулярные тельца в места своей локализации; таким образом структуры, образуемые белком ТБП, оказываются в тесном контакте и с ЭПР, и с МТ. Возможно, формируемые белком ТБП гранулярные тельца содержат также РНК, поскольку и белок ТБП, и белок ТБГ2 обладают РНК-связывающей активностью (УегсЫЛ-ЬиЫсг е! Ы„ 2010). Увеличение количества белка ТБГЗ с течением времени ведет к

быстрому транспорту комплекса белков ТБГ1 и ТБГ2, связанных с РНК, по системе ЭПР к ПД и через них в соседние клетки.

Дальнейшее увеличение в ходе инфекции количества белка ТБГ1, связанного с МТ, ведет к его транспорту в околоядерное пространство с образованием агресом и последующей деградацией. Такого рода утилизация белка может быть очень важна в особенности на последних стадиях инфекции, когда происходит формирование вирионов и обладающий РНК-связывающей активностью белок ТБГ1 может вступать в конкуренцию с белком оболочки за связывание с вирусной РНК. Таким образом, мы предполагаем, что МТ клеток растений необходимы как для формирования вРНП-комплексов ВСВК на ранних стадиях инфекции, так и для деградации избыточного количества белка ТБГ1 на поздних этапах инфекции.

Важно отметить, что в период, когда представленные в настоящей работе данные по ассоциации белка ТБГ1 ВСВК с МТ были приняты к печати, было опубликовано исследование внутриклеточной локализации белка GFP-ТБП ВСВК, экспрессируемого в составе вирусного генома (Wright et al., 2010). В этой работе была показана ассоциация белка ТБГ1 с МТ в процессе вирусной инфекции, что соответствует результатам, полученным в данной работе в безвирусной системе экспрессии. Было также показано, что район, участвующий во взаимодействии с МТ, расположен в N-концевой области белка ТБГ1, что согласуется с данными, представленными в настоящей работе, однако по результатам Wright et al. (2010) этот район расположен ближе к N-концу белка, чем картированный нами. Такое разногласие может объясняться использованием разных делеционных мутантов и несхожих систем экспрессии для анализа фенотипов мутантов. Кроме того, показано, что в контексте вирусной инфекции разрушение МТ колхицином не блокирует межклеточный транспорт вируса (Wright et al., 2010). Однако эти результаты могут требовать независимого подтверждения, поскольку в использованной постановке эксперимента обработка колхицином проводилась для листьев, где уже развилась вирусная инфекция (Wright et al., 2010), поэтому увеличение локусов инфекции после обработки колхицином может объясняться не межклеточным транспортом вируса в этих условиях, а его накоплением в предзараженных клетках.

Обнаружение высокомолекулярных комплексов, образуемых белком ТБГЗ ПЛВМ. в инфицированных растениях

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в трансгенных растениях, экспрессируюших природный или слитый с GFP белок ТБГЗ ПЛВМ, образуются высокомолекулярные комплексы, содержащие белок ТБГЗ (Gorshkova et al., 2003). Чтобы убедиться в том, что образование таких комплексов отражает естественные свойства белка ТБГЗ, а не является артефактом его гиперэкспрессии, в настоящей работе была предпринята попытка детектировать белок ТБГЗ ПЛВМ, экспрессируемый в контексте гордеивирусного генома. Для этого растения N. benthamiana заражали рекомбинантным гордеивирусом Р684, представляющим собой вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), в геноме которого ТБГ ВШМЯ был заменен на ТБГ ПЛВМ (Solovyev et al., 1999). Образцы отбирали с инокулированных и верхних неинокулнрованных листьев в течение 21 дня после инокуляции и анализировали

иммуноблотом с использованием моноклональных антител к белку ТБГЗ ПЛВМ (Gorshkova et al., 2003). Поскольку белок ТБГЗ экспрессируется на очень низком уровне при вирусной инфекции (Zhou & Jackson, 1996, Jackson et al., 2009) и локализуется в мембранах клетки (Gorshkova et al., 2003), анализировали обогащенную мембранами фракцию из зараженных тканей (см. Материалы и методы). Было обнаружено, что в инокулированных листьях зараженных растений белок ТБГЗ ПЛВМ выявляется только в составе высокомолекулярных комплексов (Рис. 9). В системно инфицированных листьях обнаруживались образуемые белком ТБГЗ димеры, однако большая часть белка также включалась в мультимолекулярные комплексы (Рис. 9).

Таким образом, в зараженных растениях белок ТБГЗ ПЛВМ находится преимущественно в виде высокомолекулярных комплексов. Важно отметить, что эти комплексы, аналогично наблюдаемым комплексам в трансгенных растениях (Gorshkova et al., 2003), также были устойчивы к нагреванию и обработке додецилсульфатом натрия и мочевиной, поскольку не диссоциировали при нагревании до 95°С в буфере для образцов, наносимых на гель.

Состав образуемых белком ТБГЗ комплексов неизвестен. Основываясь на данных о наличии гомологичных взаимодействий белка ТБГЗ ВСВК, обнаруженных в двугибридной дрожжевой системе Cowan et al (2002), мы предполагаем, что наблюдаемые нами комплексы включают олигомеры белка ТБГЗ ПЛВМ. В растениях, зараженных вирусом, эти комплексы также могут включать белок ТБГ2, способный вступать во взаимодействия с белком ТБГЗ (Cowan et al., 2002, Lim el al., 2008) и котранспортироваться с белком ТБГЗ к клеточной стенке (Solovyev et al., 2000, Zamyatnin et al., 2002, Tilsner et al, 2010).

Недавно образование комплексов, включающих белки ТБГ2 и ТБГЗ вируса мозаики бамбука (ВМБ), относящегося к роду потексвирусов, было изучено в клетках дрожжей. Белок ТБГЗ ВМБ был обнаружен в ассоциированных с клеточной стенкой периферических мембранных тельцах и был способен транспортировать белок ТБГ2 из ЭПР в эти тельца (Lee et al., 2010). Белки ТБГ2 и ТБГЗ, синтезирующиеся на мембранах околоядерного ЭПР клеток дрожжей, вступали во взаимодействия и образовывали гетеродимеры, которые затем олигомеризовались, образуя высокомолекулярные комплексы (Lee et al., 2010). Возможно, такие комплексы соответствуют комплексам, обнаруживаемым в зараженных гордеивирусами клетках растений (Рис. 9).

Мутация в центральном консервативном домене белка ТБГЗ ПЛВМ препятствует образованию высокомолекулярных комплексов и блокирует его транспорт в периферические мембранные тельца

Ранее было показано, что белок ТБГЗ гордеивирусов содержит два сигнала, отвечающих за транспорт этого белка к ПД: один из них расположен в центральном гидрофильном участке, расположенном между двумя трансмембранными доменами, другой - в С-концевом трансмембранном домене (Solovyev et al., 2000, Schepetilnikov et al., 2008, Tilsner et al., 2010). Мы проанализировали, участвуют ли эти сигналы в образовании высокомолекулярных комплексов, включающих белок ТБГЗ ПЛВМ. Для этого были использованы описанные ранее

мутанты ТБГЗ ПЛВМ, а именно ТБГЗ-мут71, имеющий вставку из четырех аминокислотных остатков ИЗТЭ в консервативном пентапептиде УООЬЫ центрального гидрофильного участка

Инокулированные

ЛИСТЬЯ

11еинокулированные верхние лиегья

149128-

41* 3218* 7.5"

вмк

Рис. 9. Детекция белка ТБГЗ ПЛВМ в мембранной фракции листьев N. ЬешИат'шпа, инокулированных рекомбинантным

гордеивирусом Р684. Анализ инокулированных и верхних неинокулированных листьев проводился с помощью иммуноблота с использованием моноклональных антител, специфичных к белку ТБГЗ. В качестве контролен использовались трансгенное растение N. ЬешИатюпа, экспрессирующее белок ТБГЗ ПЛВМ. и неинокулированное нетрансгенное растение. Анализировали пробы, отобранные в указанные дни после инокуляции (д.п.и.}. Слева обозначены молекулярные массы маркерных белков в кДа. «<» и ««» обозначают положение образованных белком ТБГЗ мономеров и димеров соответственно. Положение высокомолекулярных комплексов (ВМК) обозначено справа.

белка, и ТБГЗ-мут62 с полностью удаленным С-концевым трансмембранным доменом (БоЬууеу ег о/., 2000, ЗсИереШткоу ег а/., 2008) (Рис. Ю). Гены, кодирующие мутантные белки и белок дикого типа, слитые с геном вИР, экспрессировапи в листьях табака с помощью агроинфильтрации. На второй д.п.и. проводили анализ инфильтрированных листьев иммуноблотом с использованием специфических антител к белку ТБГЗ ПЛВМ (ОогйЬкоуа ег в/., 2003). Было обнаружено, что белок дикого типа детектировался в виде полосы массой выше 117 кДа (Рис. II), что соответствует высокомолекулярным комплексам, образуемым этим слитным белком в трансгенных растениях (ОогзЬкоуа а ей., 2003). Мутант ОГР-ТБГЗ-мут62 был также обнаружен в виде высокомолекулярного комплекса, в то время как мутант СРР-ТБГЗ-мут71 образовывал только мономеры (Рис. II). Таким образом, мутантный белок ОБР-ТБГЗ-мут71 теряет способность включаться в высокомолекулярные комплексы, характерные для белка дикого типа, что позволяет предположить, что высококонсервативный пентапепгид УООЦЧ центрального гидрофильного участка белка ТБГЗ ПЛВМ необходим для образования таких комплексов.

Ранее было показано, что белки ОРР-ТБГЗ-мут71 и СГР-ТБГЗ-мут62 локализуются в многочисленных гранулярных тельцах, диспергированных по цитоплазме (8сЬереп1шкоу г/ «/., 2008, Рис. 12А, Б). В настоящей работе была изучена внутриклеточная локализация этих мутантов, слитых с красным флуоресцирующим белком РзЯес! (Ма1г а/., 1999), которые экспрессировали в эпидермальных клетках листьев N. ЬепЛштапа с помощью бомбардировки. Было обнаружено, что белок 08Кес1-ТБГЗ-мутб2 образовывал большие околоядерные

структуры неизвестной природы, образующиеся, вероятно, в результате агрегации такого слитного белка (данные не показаны).

Нх3СхСх2С УСЮЫ! РхУ1х60ххРхй

ТБГЗ-мут71 квТБ

ТБГЗ ¿ЪЯИЪУЗБЪУБДЬКГУУОНЕЬЬЬЪ! 11 ПС ТБГЗ-мут62 ........?---------------------

Рис. 10. Схематическое изображение белка ТБГЗ ПЛВМ и его мутантов. Аминокислотная последовательность белка ТБГЗ представлена в виде прямоугольника. Гидрофобные участки белка ТБГЗ обозначены темно-серым цветом. Указаны аминокислотные последовательности консервативных мотивов центрального гидрофильного и Ы-концевого доменов. Для мутанта ТБГЗ-мут71 буквами ЯБТВ обозначена тетрапептидная последовательность, нарушающая консервативный мотив УС^ЬМ С-концевая аминокислотная последовательность гидрофобного участка белка ТБГЗ дикого типа и его мутанта представлены внизу. Гидрофобные участки белка подчеркнуты, положительно заряженные остатки лизина выделены жирным шрифтом. Для мутанта белка ТБГЗ-мут62 точками показана аминокислотная последовательность, оставшаяся без изменений, дефисами отмечены делетированные остатки.

ч— см

N. со

Н н

>. >,

2

СО со со

1_ |_

о ш Ш

О. н Н н

ь- I а. а а.

о и.

О О о

Рис. 11. Образование высокомолекулярных комплексов белком ТБГЗ ПЛВМ и его мутантами мут71 и мут62. Белки, слитые с ■117 срр^ экспрессировали в листьях N. ЬепЛстйапа с помощью 1 85 агроинфильтрации и анализировали иммуноблотом на 2 д.п.и. в 10%-ом Г1ААГ с использованием специфических '48 моноклональных антител к белку ТБГЗ. Контрольные листья были агроинфильтрированы вектором, не несущим вставки. . 34 Справа обозначены молекулярные массы маркерных белков в кДа.

■ 26

Белок 0$Яес1-ТБГЗ-мут71 локализовался в структурах, расположенных вдоль клеточной стенки (Рис. 12Г), схожих с периферическими мембранными тельцами, образуемыми белком ТБГЗ дикого типа, слитым с вГР или с ОвЯес! (Зо1оууеу ег а.1., 2000, 2атуа1шп е/ а!.., 2002). Ко-экспрессия белка ОйКес1-ТБГЗ-мут71 с белком-маркером ЭПР т-ОГР5-ИЖ, описанным ранее (2атуа1шп е! ей., 2002), показала, что структуры, в которых локализуется белок ОхКес1-ТБГЗ-мут71, как и периферические мембранные тельца, где локализуется белок ОьЯед-ТБГЗ

18

Рис. 12. Локализация белков GFP-ТБГЗ-мут71, GFP-TBf3MyT-62 и DsRed-ТБГЗ-мут? 1, экспрессированных в N. benthamiana с помощью бомбардировки листьев. Изображения получены с помощью конфокального лазерного

сканирующего микроскопа. Показано наложение серии оптических срезов. А - локализация белка GFP-TBr3-Myr71. Б - локализация белка GFP-ТБГЗ-мут62. В. Г, Д - ко-экспрессия DsRed-ТБГЗ-мут71 и маркера структур ЭПР m-GFP5-ER. В - локализация m-GFP5-ER. Г - локализация белка DsRed-ТБГЗ-мут71 в периферических мембранных тельцах. Д - наложение изображений В и Г. Масштабная линейка: А и Б - 20 мкм, , В. Г и Д - 5 мкм.

(Zamyatnin et al., 2002), содержат m-GFP5-ER и соединены со структурами кортикального ЭПР (Рис. 12В-Д). Эти наблюдения позволили предположить, что замена GFP на белок DsRed восстановила способность мутантного белка ТБГЗ-мут71 к транспорту в периферические мембранные тельца. Такой эффект мог быть следствием склонности белка DsRed к образованию олигомеров и мультимерных комплексов (Baird et al., 2000, Wall et al., 2000). Эта гипотеза была проверена иммуноблот-анализом белка DsRed-TBF3-MyT71, экепрессированного в листьях N. benthamiana с помощью агроинфильтрации. В случае, когда образцы для иммуноблот-анализа готовились по стандартной методике, включающей инкубацию при 95°С в течение 5 минут перед нанесением на полиакриламидный гель (ПААГ), и GFP-ТБГЗ-мут? 1, и DsRed-TBr3-MyT71 детектировались только в мономерной форме (Рис. 13). Известно, что белок DsRed мигрирует в ПААГ в виде олигомера с молекулярной массой свыше 100 кДа, если образцы перед нанесением на гель не нагревались до 95°С, и в виде мономера, если такое нагревание проводилось (Gross et al., 2000). Основываясь на этих данных, экстракты из листьев, инфильтрированных мутантами GFP-TEr3-MyT71 и DsRed-TBr3-Myr71, были дополнительно проанализированы без нагревания, предшествующего нанесению образцов на ПААГ. Такая постановка эксперимента позволила детектировать белок DsRed-TBF3-MyT71 в виде высокомолекулярного комплекса, в то время как белок GFP-TBr3-MyT71 по-прежнему обнаруживался только в виде мономера (Рис. 13). Таким образом, слитный белок DsRed-ТБГЗ-мут71, в отличие от GFP-Tfir3-MyT71, способен, подобно GFP-ТБГЗ, входить в состав высокомолекулярных комплексов и транспортируется к периферическим мембранным тельцам. Это позволяет заключить, что формирование мультимерных комплексов белком ТБГЗ ПЛВМ является необходимым условием для его транспорта в периферические структуры клеток растений. Этот вывод согласуется с данными, показывающими, что в клетках дрожжей

образование специфических комплексов, содержащих белки ТБГ2 и ТБГЗ ВМБ, предшествует их транспорту в периферические мембранные тельца (Lee et ai, 2010).

Рис. 13. Образование высокомолекулярных комплексов белками СРР-ТБГЗ-мут71 и 05Кес1-ТБГЗ-мут71. Белки эксирессировапи в листьях N. ЬемИапиапа с помощью агроинфильтрации и анализировали иммуноблотом на 2 д.п.и. в 12%-ом ПААГ с использованием специфических моноклональных антител к белку ТБГЗ. Контрольные листья были агроинфильтрированы вектором, не несущим вставки. Перед нанесением на гель образцы нагревались до 95°С (слева) или не нагревались (справа). Контрольные листья были инфильтрированы вектором, не несущим вставки. Цифрами обозначены молекулярные массы маркерных белков в кДа.

Полученные в настоящей работе данные, с одной стороны, подтверждают сделанный ранее вывод о существовании двух независимых сигналов, ответственных за транспорт белка ТБГЗ в периферические мембранные тельца (8с11ереШшкоу е1 а!., 2008, Пт ег а/., 2009, ТПвпег ег ей., 2010), а с другой - впервые выявляют функциональное значение этих сигналов. Один из них, консервативный мотив УООЬЫ центрального гидрофильного участка белка ТБГЗ, отвечает за включение этого белка в состав высокомолекулярных комплексов, что является необходимым условием внутриклеточного транспорта в периферические мембранные тельца. Другой сигнал находится на С-конце белка ТБГЗ во втором трансмембранном домене и, вероятнее всего, является истинным сигналом транспорта белка ТБГЗ к периферии клетки.

Это предположение основывается на том, что белок ТБГЗ с нарушенной функцией мотива УОРи^! все же транспортируется в периферические тельца, когда его способность образовывать олигомерные комплексы восстанавливалась с помощью белка БяКес!. Следует отметить, что у белка ТБГЗ потексвирусов за транспорт в периферические мембранные тельца также отвечает его трансмембранный домен (8сЬере1з1шкоУ е/ ей., 2005).

Поскольку периферические мембранные тельца, в которых локализован белок ТБГЗ, содержат маркер ЭПР, они, как считается, являются субдоменами кортикального ЭПР (2атуаЬгнп е/ «/., 2002; УегсЬоьЬиЫсг ег а/., 2010). Недавно проведенные исследования транспорта белка ТБГЗ ВМБ в клетках дрожжей пролили свет на молекулярно-биологическую природу периферических мембранных телец. Было обнаружено, что эти структуры представляют собой участки кортикального ЭПР, обогащенного белками Шп1 и Уор1 (Ьее ег а/., 2010). Ретикулоны (ШпЛ) и белки, относящиеся к семейству ОР1/Уор1, являются высоко консервативными интегральными белками, локализующимися в ЭПР, которые участвуют в формировании кривизны мембран в клетках дрожжей, растений и животных (УоеИг <??«/., 2006,

С нагреванием Без нагревания

ее.

(Л

Q

■ 117.

■ 85 ■

■ 34 ■

■ 26-

U3

ь

CL

ЩШЛ

Voeltz & Prinz. 2007, English et al., 2009, Nziengui & Schoefs, 2009, Shibata et al., 2009). И белок Rtnl, и белки DPI/YopI имеют в своем составе домен, характерный для ретикулонов (RHD, reticulon homology domain), необходимый и достаточный для образования белками олигомерных комплексов и их локализации в мембранах ЭПР (Shibata et al., 2008, English et al., 2009). Топология домена RHD белков Rtnl и DPl/Yopl в мембране сходна с предсказанной топологией белка ТБГЗ гордеивирусного типа. Домен RHD состоит из двух гидрофобных последовательностей, разделенных гидрофильной петлей (Nziengui & Schoefs, 2009); сходным образом белок ТБГЗ состоит из центрального гидрофильного участка, разделяющего два трансмембранных домена (Morozov & Solovyev, 2003). Можно предположить, что, по аналогии с белками Rtnl и DPl/Yopl, такая структура белка ТБГЗ важна для его внутриклеточного транспорта, закрепления в мембранах кортикального ЭПР и, возможно, стабилизации искривленных участков мембран ЭПР.

Кроме того, предполагается, что белки-ретикулоны участвуют в формировании и ' сохранении формы десмотубулы, мембрана которой обладает большой кривизной (Tilsner et al., 2011). Белок ТБГЗ также может локализоваться внутри полости ПД, предположительно в мембранах десмотубулы, что показано для белков ТБГЗ ВШМЯ и ВСВК. которые оставались в клеточной стенке после плазмолиза, а не отходили от нее вместе с плазмалеммой (Lim et al., 2009, Tilsner et al.. 2010). Таким образом, локализация белка ТБГЗ в десмотубуле и его способность транспортировать белок ТБГ1 к ПД могут обеспечивать механизм модификации ПД, основанный на изменении структуры и функций ПД (Tilsner et al., 2011).

Включение белка ТБГЗ в состав высокомолекулярных комплексов необходимо для его СОРП-независимого внутриклеточного транспорта

Транспорт новосинтезированных трансмембранных белков из ЭПР к местам их локализации обеспечивается за счет транспортных COPII-везикул (Mancias & Goldberg, 2005). Ранее было показано, что белок ТБГЗ транспортируется к клеточной стенке COPII-независимым путем: использование доминантно-негативного мутанта малой клеточной ГТФазы Sari [T34N], ингибирующего образование COPII-везикул, не блокировало транспорт белков ТБГЗ ПЛВМ и Х-вируса картофеля (ХВК) к периферии клетки (Schepetilnikov et al., 2005, 2008). В данной работе было проанализировано, влияет ли блокирование образования COPII-везикул с помощью Sai l [T34N] на внутриклеточную локализацию мутантов ТБГЗ-мут71 и ТБГЗ-мут62. В качестве контроля использовался белок ST-YFP (Schepetilnikov et al., 2005), который транспортируется из ЭПР в аппарат Гольджи (АГ) COPII-зависимым путем (Saint-Jore et al., 2002). В соответствии с ранее опубликованными данными, белок ST-YFP локализовался в виде мобильных телец, являющихся структурами АГ (Рис. 14А), в то время как ко-экспрессия белка ST-YFP с мутантом Sarl[T34N] приводила к локализации белка ST-YFP в мембранах ЭПР вследствие блокирования COPII-зависимого транспорта (Schepetilnikov et al., 2005, 2008, Рис. 14Б).

■л ¡»а»

Рис. 14. Влияние экспрессии белка Заг1 [Т34И] на локализацию белков ОРР-ТБГЗ-мут62, СРР-ТБГЗ-мут71 и ВкКес1-ТБГЗ-мут71. Белки

экспрессировали в листьях N. Ьепвгапйапа с помощью бомбардировки. Изображения

получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа путем наложения серии оптических срезов. А - локализация белка БТ-УРР. Б - локализация белка БТ-УРР, ко-экспрессированного с белком 5аг1[Т341Ч]. В - локализация белка СРР-ТБГЗ-мут62, ко-

экспрессированного с белком 8аг1[Т34ГЧ]. Г - локализация белка ОРР-ТБГЗ-мут71, ко-

экспрессированного с белком 8аг1[Т34М]. Д - локализация белка 05Кес1-ТБГЗ-мут71, ко-

экспрессированного с белком 8аг1[Т34М]. Масштабная линейка: 20 мкм.

Ранее было показано, что белки ОРР-ТБГЗ-мут71 и ОРР-"ГБГЗ-мут62 локализуются в многочисленных мелких тельцах, часто образующих в цитоплазме гранулярную сеть (8о1оууеу ег а/., 2000, всЬереМшкоУ ег а!., 2008, Рис. 12А, Б). Блокирование СОРП-зависимого везикулярного транспорта с помощью 8аг1[Т341Ч] не оказывало заметного влияния на локализацию мутанта СРР-ТБГЗ-мут62 (Рис. 14В), в то время как мутант ОРР-ТБГЗ-мут71 при ко-экспрессии с 8аг1[Т341Ч] локализовался преимущественно в сети ЭПР (Рис. 14Г). Таким образом, хотя природа маленьких телец, в которых локализуется мутантный белок ОРР-ТБГЗ-мут71. неизвестна, можно предположить, что их образование происходит СОРП-зависимым путем и, следовательно, транспорт данного мутанта отклоняется от СОРН-независимого пути, характерного для белка ТБГЗ дикого типа.

Мы предположили, что образование белком ТБГЗ высокомолекулярных комплексов необходимо для его СОРП-независимого внутриклеточного транспорта. Для проверки этой гипотезы белок 0511ес1-ТБГЗ-мут71, способный к образованию олигомерных комплексов за счет свойств белка ВвЯес!, ко-экспрессировали с 8аг1[Т34М]. Было обнаружено, что 8аг1[Т34М] не влиял на транспорт белка ВзКес1-ТБГЗ-мут71 в периферические мембранные тельца (Рис. 14Д). Таким образом, можно заключить, что образование белком ТБГЗ ПЛВМ высокомолекулярных комплексов необходимо для его транспорта СОРН-независимым путем.

Полученные в настоящей работе данные в целом согласуются с моделью внутриклеточного транспорта, согласно которой трансмембранные белки ТБГ2 и ТБГЗ образуют в мембранах ЭПР белковые «плоты», представляющие собой платформы, транспортирующие вРНП-комплекс, включающий в себя белок ТБГ1 и вирусный геном, к ПД за счет латеральной диффузии в мембранах ЭПР (Epel, 2009, Harries et я/., 2010, Tilsner et al„ 2011). Полученные нами данные показывают, что образование транспортных платформ зависит от способности белка ТБГЗ образовывать высокомолекулярные комплексы, в то время как их транспорт к периферическим компартментам клетки обеспечивается сигналом, находящимся в С-концевом трансмембранном домене белка ТБГЗ.

Выводы

1. Показано, что белок ТБГ1 ВСВК, слитый с GFP, взаимодействует с МТ в отсутствие других вирусных продуктов. С помощью мутагенеза белка ТБГ1 картирован район, участвующий во взаимодействии с МТ.

2. Изучен внутриклеточный транспорт белка ТБГ1 ВСВК в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ. Показано, что белок ТБГ1, меняя внутриклеточную локализацию, последовательно (1) взаимодействует с МТ, (2) взаимодействует с МТ и локализуется в гранулярных структурах, связанных с МТ, и (3) теряет преимущественную ассоциацию с МТ и локализуется в дискретных структурах, связанных с клеточной стенкой, и в перинуклеарных включениях, сходных с агресомами.

3. Обнаружено, что структуры в клеточной стенке, в которые транспортируется белок ТБГ1 в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ, представляют собой внутренние области плазмодесм. Доказано, что взаимодействие белка ТБГ1 с МТ необходимо для его ТБГ2ЯБГЗ-зависимого транспорта в плазмодесмы.

4. Показано, что белок ТБГЗ ПЛВМ присутствует в инфицированной вирусом ткани в форме высокомолекулярных комплексов. Включение белка ТБГЗ в состав таких комплексов зависит от консервативной последовательности YQDLN в центральном районе белка. Доказано, что образование ТБГЗ-содержащих высокомолекулярных комплексов является необходимым условием для COPII-независимого внутриклеточного транспорта белка ТБГЗ в периферические мембранные компартменты.

5. Показано, что сигнал внутриклеточного транспорта белка ТБГЗ ПЛВМ к периферическим мембранным структурам содержится в его С-концевом трансмембранном домене. Этот сигнал функционален при условии включения белка ТБГЗ в состав высокомолекулярных комплексов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Shemyakina, ЕЛ., Solovyev, A.G., Leonova, O.G., Popenko, V.I., Schiemann, J. and Morozov, S.Yu. (2011). The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato moptop virus movement protein TGBpl. The Open Virology Journal 5, 1-11.

2. Shemyakina, E.A., Erokhina, T.N., Gorshkova, E.N., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. (2011). Formation of protein complexes containing plant virus movement protein TGBp3 is necessary for its intracellular trafficking. Biochimie 93, 742-748.

3. Шемякина E.A. Роль микротрубочек в транспорте ТБГ61 вируса скручивания верхушек картофеля //XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоиосов-2011» (11-15 апреля 2011): сб. тез. - Секция биология. - М., 2011. - С. 6970.

Заказ № 16-П/05/2011 Подписано в печать 11.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mnv.cfr.ru; е-та'й:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шемякина, Елена Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Цитоскелет и мембранные структуры клеток растений.

Цитоскелет растений.

Микрофиламенты.

Микротрубочки.

Мембранные структуры клеток растений.

Эндоплазматический ретикулум.

Аппарат Гольджи.

Динамика ЭПР и АГ.

СОР II-зависимый транспорт.

СОР 1-зависимый транспорт.

Плазмодесмы.

Роль цитоскелета и мембранных структур клетки в транспорте вирусов растений.

Транспортные белки вирусов растений.

Роль цитоскелета в транспорте вирусов растений.

Роль клеточных мембранных структур в транспорте вирусов растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Взаимодействие белка ТБГ1 ВСВК с МТ.

Локализация белка ТБГ1 ВСВК в присутствии белков ТБГ2 и ТБГЗ.

Белок ТБГ1 доставляется белками ТБГ2 и ТБГЗ в ПД.

Снижение уровня экспрессии тубулина не блокирует внутриклеточный транспорт белка ТБГ1 ВСВК.

Обработка клеток колхицином ингибирует доставку белка ТБГ1 к ПД и образование агресом.

Анализ мутантов белка ТБГ1 подтверждает взаимосвязь между ассоциацией белка с МТ и его транспортом в ПД.

Обнаружение высокомолекулярных комплексов, образуемых белком ТБГЗ

ПЛВМ, в инфицированных растениях.

Мутация в центральном консервативном домене белка ТБГЗ ПЛВМ препятствует образованию высокомолекулярных комплексов и блокирует его транспорт в периферические мембранные тельца.

Включение белка ТБГЗ в состав высокомолекулярных комплексов необходимо для его COPII-независимого внутриклеточного транспорта.

ВЫВСЩЫ.