Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура 3'-концевой области РНК М вируса картофеля и возможные механизмы экспрессии генома вируса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура 3'-концевой области РНК М вируса картофеля и возможные механизмы экспрессии генома вируса"

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ни. В.И.ЛЕШШЛ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.323.4:578.851.1 КАНЮКА Константин Валерьевич

СТРУКТУРА з'-КОНЦЕВОЙ ОБЛАСТИ ГНК М ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ II ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА ВИРУСА.

<03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учеяон стептан кандидата бполопггсехнх наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии)! ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Научные руководители: доктор биологических наук

Заврнев С.К.

кандидат биологических наук 1'упасов В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Шемякин М.Ф. кандидат биологических наук Добрав E.H.

Ведущая организация - Институт микробиологии АН СССР.

Защита диссертации состоится " " _1991 г.'

в__час. на заседании Специализированного Совета Д.020.40.01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ по адресу: 127253, г.Москва, улПсковская, д. 12, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнол9Гии ВАСХНИЛ.

Автореферат разослан " "_1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Меликова

CA.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ц последние пять-восемь лет в мире интенсивно ведутся работы по изучению структуры геномов ' фитопирусоп. Развитие этих работ обусловлен о как фундамеи'.лльным, так и прикладным интересом.

Значительный экономический урон, наносимый фитовирусами, требует создания новых, все более эффективных способов защиты растг ний. В нас гоящее время наиболее перспективным» методами борьбы с вирусными заболеваниями растений становятся методы, основанные на знании молекулярной биологии вирусов и процессов их взаимодействия с растениями-хозяевами и переносчиками. Получение первых трансгенных растении, устойчивых к тем или иным вирусам - хорошее тому свидетельство.

Одной из наиболее важных сельскохозяйственных культур является картофель. Сегодня идентифицировано около двадцати наиболее патогенных вирусов, поражающих картофель. Одним из них является М вирус картофеля (МВК), являющийся типичным представителем карлавирусов - довольно слабо изученной с точки зрения молекулярной биологии группы фитэвирусов. Ареал распространения карлавирусов довольно широк. Например, в СССР МВК и БВК (Б вирус картофеля) заражены почти повсеместно все районированные сорта картофеля, часто в комплексе с X и У вирусами картофеля. В результате такой инфекции происходит снижение урожая на 30—50%, а в некоторых случаях на 80%.

Настоящее исследование посвящено изучению структуры и экспрессии генома МВК.

. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности протяженной 3-кон-цевой области РНК МВК. Были поставлены следующие задачи:

— получение библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК МВК;

— отбор клоноэ, содержащих кДНК-вставкя соответствующие 3-концевой области вирусной РНК;

— определение нуклеотидных последовательностей кДНК— вставок в отобранных клонах;

— анализ кодирующего потенциала, аминокислотных

последовательностей белков, кодируемых протяженными открытыми рамками считывания (ОРС) и возможных регуляторных последовательностей РНК МВК;

- исследование механизмов экспрессии генома М вируса картофеля.

Научная новизна работы. В работе впервые опреде— лена нуклеотидная последовательность протяженной З-концевой области генома карлавируса - М вируса картофеля. Установлено сходство структурной организации геномов карла-' и потексвирусов и высокая степень гомологии белков, кодируемых соответствующими ОРС. Изучены возможные механизмы экспрессии 3~концевых цисгронов генома МВК.

Практическая ценность работы. Получена плазмида рСК15, содержащая ген белка оболочки МВК. Эту плазмиду предполагается использовать для создания трансгенных растений картофеля, экспрессирукицих белок оболочки МВК, что должно придать растениям устойчивость к этому вирусу. Возможность создания таких растений подтверждается экспериментами МасКеме & Тгешате (1990), получившими трансгенные растения, эхспрессирующие капсидиый белок 5 вируса картофеля. При заражении этих растений как интактным вирусом, так и вирусной РНК не происходит развития симптомов инфекции и накопления вируса ни в инокулированных, ни в молодых верхних листьях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Конференциях молодых ученых и специалистов ВНИИСБ в 1988-1990 гт, на Конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии" (Братислава, январь 1989Х на V Научном Симпозиуме Социалистических Стран по Биотехнологии (Будапешт, сентябрь 1989), на VIII Международном Вирусологическом Конгрессе (Берлин, август 1990) и на школе РЕВБ "Геном вирусов растений: структура и экспрессия" (Рига, апрель-май 1991).

Публикации.'Основные результаты диссертации отражены в семи печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 185 библиографических ссылок. Работа изложена на 106 страницах машинописного

текста, включая 8 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В paSoTe использована РНК, выделенная из препаратов очищенных знрионов русского штамма МВК по методу Proli et al. (1981).

Первую цепь ДНК, комплементарную РНК МВК синтезировали РНК -зависимой ДНК-полимеразой вируса мнелобластоза птиц с использованием в качестве затравки в одном случае олиго (dT)1218, а в другом - статистического гетерополимера pd(N)6 (Кристин и Джексон,1988). Вторую цепь кДНК достраивали, используя ДНК-полимеразу f E.coli и РНКазу Н по методу Gubler & Hoffman,(1983). Выступающие концы полученной двунитевой кДНК затупляли ДНК-полимеразой фага Т4.

кДНК, полученную с помощью праймера олиго (dT)121g встраивали по Smal-caftTy в полилннкер плазмиды pUC19. К концам кДНК, полученной с помощью рассеянной затраьки присоединяли BamHI-линкеры, обрабатывали рестриктазой BamHI и встраивали по этому сайту в полилинкер плазмиды pTZ19. Трансформацию компетентных клеток E.coli, штамм XL-lBlue проводили по методу описанному Ханааном (1988). Отбор клонов, содержащих в плазмидах pUC19 и pTZ19 последовательности РНК МВК, осуществляли методом гибридизации ДНК колоний на нитроцеллюлозных фильтрах с меченой^Р-ДИК (Grunstein & Hogness, 1975). Нуклеотидную последовательность кДНК-вставок отобранных плазмид определяли химическим методом (Махаш & Gilbert,1980) и методом Сэнгера (Sanger et аЦ1977). Во втором случае использовали либо фрагмент Кпенова ДНК-поля-меразы I E.coli, либо модифицированную ДНК-полимеразу фага Т7 ("Sequenase").

In vitro транскрипцию проводили по методу Melton еЫ.(1984). Бесклеточную трансляцию РНК проводили в лизате кроличьих ретикулоцитов обработанных микрококховой нуклеазой и в экстракте из зародышей пшеницы по Pelham & Jackson (1976). Иммунопреципитацию продуктов трансляции РНК проводили по методу Robinson et-al. (1983). Образцы продуктов трансляции и иммунопреиипитации анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, используя буферную систему Laemmli (1970) или Schagger & von

Jagov (1987).

Рассчет степени гомологии белковых последовательностей проводился с помощью программы GENEPRO (Riverside Scientific Enterprises).

' РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Структурная организация 3-кониевой области РНК МВК.

М.Гтратегия определения нуклеотидной последовательности.

Из очищенного препарата МВК выделяли РНК методом фенолыюй дспрогеинизации (Proll ei al,1979). В агарозном геле РНК МВК мигрирует в виде одной четкой зоны соответствующей приблизительно 8500нт.

Синте) и клонирование ДНК комплементарной РНК МВК, а тэкже отбор клонов проводили способами описанным» в Материалах и методах. В результате было отобрано дш наиболее сильно гибридизующпхся клона (рМЗ и рМ5), имеющих в плазмидах кДНК-встаики, соответствующие 290 и 682 3-концевым нуклеотидам РНК МВК и содержащих примыкающую к З'-концу поли(А)-последовательность длиной 120—150 остатков. Этот результат является прямым подтверждением данных Тавантзиса (Tavantzis, 1984) о полиадснилировании 3-конца РНК МВК.

Поиск остальных клонов, содержащих неизвестные

кЦНК-последопательности РНК МВК проводили аналогичным методом,

последовательно гибридизуя колонии с высокомечеными 32

Р—фрагментами кДНК из плазмнд, содержащих удаленные от 3-конца РНК МВК последовательности. В результате было выделено и охарактеризовано 19 рекомбинантных илазмид, содержащих взаимно перекрывающиеся фрагменты кДНК, соответствующие 2640 3-концевым нуклеотидам геномной РНК МВК (рис.1).

Последовательность 3-концезого участка РНК МВК длиной 2640 нуклеотидов представлена на рис.2. 97Х этой поеледовтельности было просиквенировано в обоих направлениях, при этом, около 50% было прочитано с помощью двух или трех независимых клонов.

12. Кодирующие районы.

Компьютерным анализом установленной последо- вательности нуклеотидов РНК МВК было выявлено пять протяженных ОРС, схематически представленных на рис.1.

ж

25К

—Г"

500

7К

1000

зчк

12.гк

-Г

2000

Е N ' В Ыс

1 I I_Ь-

■лАА/

2500 ПОЛИ(А) К,Б

карта "рестрикции

Е

Рисунок 1. Схематическое изображение протяженных ОРС, выявленных в нуклеотидной последовательности 3'-концевого района геномной РНК МВК. Протяженные ОРС представлены прямоугольниками, внутри которых указаны мол.массы соответствующих белков. В середине: карта сайтов узнавания рестряктазами кДНК, соответствующей представленной области; В-ВалШ, Е=ЕсоШ, К-Крп1, Н-Кги1, Не = Нсо1, 5-5аП. Внизу: стратегия секвинировлния — стрелками обозначены направления и размер просиквенированных клонов.

GCGGCGTTCTACAACTGCGTGAGAATCATAGTGCGAAACAAACACCTCATTCGCTCTGAT 60

GTGAAACAAGTATTTGAAGTGCTTTAATTAGTGTAGCTTAGGTATTGCTATTGTATTGAÁ 120

MDVIVDLLYKYKFERLSMK TATTTATGGATGTGATTGTAGATrTGTTGTATAAATACAAGTTTGAGCGTTTAAGTAATA lßO

LVC-P IVVHCVPGAGKSSL î R AGTTAGTGTGCCCTATAGTTGTTCACTCTGTGCCTGGGGCTGGCAAGAGTAGCTTAATTC 240

ELIELDSRFCAYTAGVEDQP GCGAGTÏGT1AGAATTAGATAGTCGCTTCTGTGCAÏACACAGCTGGTGTAGAGGACCAAC 300

RLSGNWIRKWSGQQPEGKFV CAAGGTTGAGCGGGAATTGGATCAGGAAGTGGAGCGGGCAACAACCGGAAGGCAAATTTG 360

VLDEYTLLTEVPPVFALFGD TGGTTCTGGACGAGTACACÏCTGTTGACTGAAGTGCCTCCGGTATTTGCATTGTTCGGTG 420

PIÇSNTSAVQRADFVCSVSR ACCCCATACAATCGAACACAAGCGCCGT1CAGCGTGCTGACTTTGTGTGCTCAGTGAGTA 480

RFGSATCGLLRELGUNVRSE GAAGATTCGGCAGTGCCACGTGCGGGCTGTTACGGGAGTTGGGCTGGAACGTTCGAAGTG 540

KADLVQVSDIYTKDPLGKVV AAAAGGCTGACCTGGTGCAAGTATCTGATA ÍATACACAAAAGACCCCCTGGGCAAAGTTG 600

FSEEEVGCLLRSHGVEAISL TGTTCTCAGAGGAGGAAGTGGGTTGCTTGCTGAGATCACACGGGGTGGAAGCATTGASCT 660

QEITGQTFEVVTFVTSENSP TGCAGGAAATAACAGGCCAAACTTTCGAGGTGGTAACGTTCGTCACTTCAGAGAATTCK 720

VINRAAAYQCMTRHRTALHI CAGTGATCAATCGAGCGGCTGCCWCAGTGCATGACAAGGCATCGAACGGCTCTGCACA 780

L С P D A T Y T A A *

MPLTPPPPFTKVYLSA TCTÎGTGTCCTGATGCCACTTACACCGCCGCCTGACTTCACAAAGGTATACCTTTCTGCT 840

ALGVSLALVVKLLIRSTL-PV GCACTCGGGGTGTCGCTTGCTCTAGTTGiTTGGCTGCTTATAAGCAGTACACTACCTGTG 90C

VGDRDHNLPHGGWYRDGTKS GTGGGGGATAGAGATCACAAGTTGCCACACGGAGGTTGGTACAGGGACGGGACCAAATCA 960 VFYNSPGRLHSIEARKAPLL GTGTTTTACAACAGCCCCGGCCGGCTCAACTCAATAGAGGCTAGAAAAGCTCCGCTACTT 1020 GQPWAIVVLLVILIWASHKL GGTCAACCTTGGGCTATCGTCGTCCTGC1AGTACTGCTTATCTGCGCGAGTCACAAGCTA 1030 GRPNCRACAGSHT*

H I V Y V L V G GGAAGGCC7AACTGTAGAGCCTGTGCGGGCTCACACACATGATAGIGTATG7ACTTGTAG 1140

LSAFCIVLVLI SQGQSOCVV GACTGAGCGCCTTCTGCATTGTGCrGTATTTGATCTCTCAGGGACAGTCTGAGTGCGTGG 1200

11TGESVRVQGCRI0GEFGS ÎGCTAATCACCGGCGAATCAGTGCGCGTGCAAGGGTGCCGAATTGACGGTGAGTTCGGAA 1260

VLSKLKPFGCGSFRS*' GTGTGCTATCAAAATTGAAGCCGTTTGGGTGTGGnCCTTTAGGTCATAAGGTGAATCTG 1320

MGDSTK KAETAKDEGTS AAATAGTGAGTATGGGAGATTCAACGAAGAAAGCTGAAACTGCCAAAGATGAGGGCACTT 1380

QERREARPLPTAADFEGKDT CGCAAGAAAGGAGAGAAGCGCGACCACTGCCGACTGCTGCTGACTTTGAGGGGAAGGACA 1440

5ЕИТ06КААОАОБЕМ51_Е!*К ;АТССЕАСААСДСТСАТСЕСССТССТССЛСАТССТСАТССАйДААТСТСАТТСС ^ССССЛ 1500

ЕЯНБА! ЙУТНР ЗССТТСАСАСССТССЗАСААТТССТЕССАСАКСССАЕССССССААТТССАСТСАСАААСС 1560

ОиЕТСРРК101АЕММРРОРТ :АСССТТАЕЛСАСТСССАССССААСКТТаСАССТАССТЕААААТАТССЕСССТСАТСССА ' 1620

МРУЯЯР5!ЕА15Р!1КР1А15 :СААТСССТ- ' ААСАСССССТССАТАиАЛаСТСТСАЕССССЛТСЛАСССААТССССАТСГ 1630

НММАТ5Е0ММР, 1У7М1ЕБ1_Б »АААСААТАТС&ССАСАТСТСАССАТАТСАТССССАТАТАТйТСААССТССАСЕйССТАЗ 1740

7РТЕНУд0УУ1дАУ1РскоА ЗССТЕСССАСТСАБ''ЛССТССАССАС5ТАЕТЕАТТСЛСССТ5ТССТАТТТТССААС5АС2 1800

5 3 5 V . 1,ОРКО$РЕИРВ6А1Т ОААЕиАССТССЗТАТТССТЕСА.ТСССССАСССТСЕТТСЕАСТССССААСАССТССТАТЛА 1860

А0А71АУ1КК0АЕТ1.НПУСК ЛССАСАТССССТСТТСбСТСТССТЙААЙААЗСАТССАСАААСАСТСССААСЕСТСТСТА 1920

1.УАРГТКННМ1.ТНМАРРА0» ЗССТ5ТАТаСССССЕТЕАСАТаСААТСАТАТЗСТСЛСССАСААСЕС2ССТСССССССАТГ 1930

ЛАМСРЧУЕОКРААРОСгОУУ !55ССТЕССАТЕ5ББтСАСТАТ2ЛЕьАТСССТТСССТ5СТТТССАСТЁС7ТТБАТТАСБ 2040

ЕМТАА\'()Р1ЕС!.1К1!РТР^Е ГТСАаЛАТАСТЕСТЕСАСТССААССССТАСАЕЕСАТТЕАТСАССССАССТАССССААССЗ 2100

К V А Н Н Т Н К Э I А V « 5 А Н К N О V ААААСаТАЕСТСАСААТАСЕСЛСАААЙАСАТСССАСТЕСЕТСЕАЕСАААТСеСААТСАСа 2160

FSSI.NAEVTGGMNGPEl.TRD ТаТТСАеСТСТСТСААТСССбАЕаТСАСТСаТССТАТСААТССТССаСАЕСТСАСТАЕАЙ -2220 УУКЗМЙК*

НК0УТКУА111АН АТТАТСТМАБТСТААТЛЕААААТСААБЕАСйТААССААОСТСЕСТТТАСТТАТАССОАС 2280 АНСА55СТГУРЕ1АР51ТЕУ !\ЕСТАТЕТСТСССТСТТСАЕСТАССГГТаТСТТТСААСТАССТТТТАСТАТТАСТСАЕТА 2340

ТАСаЕ5ТСЕАССАСТТСССССТССБАЕАТССААеТАСССАС5ТССТАСАССТЕСТАТТАа 2400 1АЙСНЙСУР1КРРТУГТТРС ТАТАЁСТАСбТСТСАСАССТбСТАТСЕССТСТСЕСССССААСТбТбТТТАСТАСТАйСТв 2460 ОНКНСУРС15УНУКУА0Р 10 ТаАТААТАЛАСАТТЕТСТЕССТЕЕТАТСТСТТАСААТСТЕССССТСЕСССААТГТАТТСА 2520 ЕвУТЕУ1Р5У1МКйЕ*

ТБААСЕАБТААССБАБЕТЕАТАССТТСАБТСАТСААСААбСБАЕАБГЛБССАТТАААТСС 2580 ТАТТТЛАТАТАТААССТБТССТЛСТАТАААТААААТТТБОТТТТТААСТАТТТТТАБССАа 2640

Рисунок Z Нуклеотидная последовательность 3 -концевой области геномной РНК МВК. Над нуклеотидной последовательностью дана последовательность аминокислот соответствующих ОРС.

?

Первая с 5-конца РНК ОРС кодирует потенциальный полипептид с мол. массой 25438 (25К белок). Эта рамка начинается с АиС-кодона в положении 126 и заканчивается терминирующим кодоном в положении 812 (рис.2). Вторая ОРС начинается с инициаторного кодона в положении 793, заканчивается в положении 1119 и кодирует потенциальный полипептид с мол. массой 11906 (12К белок). Третья ОРС начинается АиО-кодоном в положении 1119, заканчивается терминатором в положении 1307, и кодирует потенциальный белок с мол. массой 6746 (7К белок). Четвертая ОРС кодирует' потенциальный полипептид размером 304 аминокислоты и мол. массой 33929 (34К белок). Эта ОРС начинается с АиО-кодона в положении 1332 и заканчивается терминирующим кодоном в положении 2243. Область РНК МВК между геном 34К белка и поли(А^последовательностью содержит еще одну ОРС (положения 2243-2566), которая кодирует потенциальный белок с мол. массой 12183 (12.2К белок).

13. Анализ нуклеотидной последовательности минус-цепи РНК МВК.

Нами был проведен компьютерный анализ и последовательности минус-цепи просиквенирванной области геномной РНК МВК. В результате, с помощью алгоритма Трифонова (ТпТог.оу, 1987), который позволяет отличать потенциально транслируемые ОРС от случайных, была выявлена только одна протяженная ОРС начинающаяся с АЬС-кодона и кодирующая потенциальный 19К белок. Локализация этой рамки соответствует 1717-1181 нуклеотидам плюс-цепи РНК МВК.

Сходные по локализации ОРС обнаруженные при анализе минус-цепей РНК трех других карлавирусов: в вируса картофеля (5ЕК), Б вируса хелениума (БВХ) и Б вируса хризантем (БВХ). Данные ОРС локализованы в районах РНК комплементарных генам белков оболочек указанных вирусов. Потенциальные белки, кодируемые этими ОРС, обладают довольно высокой степенью гомологии. Функциональная значимость этих ОРС не ясна.

Следует отметить, что в минус цепях только двух потексвирусов — вируса мозаики белого клевера (ВМБК) и вируса мозаики папайи (ВМП) - также имеются протяженные ОРС, близкие по длине и локализации с таковыми МВК и БВК.

1.4. Сравнение аминокислотных последовательностей потен-

циальных белков МВК с белками других фитовирусов.

1.4.1. 341С белок.

Ряд косвенных данных указывает на то, что ген 34К белка кодирует белок оболочки МВК.

Во-г 'рвых, мол. масса белка оболочки МВК вычисленная по его электр (юретической подвижности в полиакриламидном геле -35,7К (Tavantzis, 1984), близка мол. массе продукта гена 34К белка.

Во-вторы при сравнении аминокислотной последовательности 34К белка МВК с аминокислотными последовательностями белков оболочек . потексвирусов, обнаружено значительное сходство. При этом наиболее высокий уровень гомологии отмечается между С—концевыми участками белков оболочки потексвирусов и 34К белка .МВК (рисЗ).

Для подтверждения того, что 34К белок является белком оболочки МВК, нами была сконструирована пдазмида pGKlS, содержащая полную кДНК-копию гена 34К белка МВК

I

фланкированного с 5—конца промотором ДНК—зависимой РНК-полимеразы фага Т7. In vitro трансляцией РНК, синтезированной с плазмиды pGK15, установлено что продукт геяа 34К комигрирует в геле с белком оболочки МВК, выделенном из препарата вирусных частиц, и что этот белок осаждается антителами к МВК (рис.4). Очевидно, что эти результаты доказывают, что ген 34К белка МВК кодирует белок оболочки вируса.

1.4.2. 12^К белок.

Потенциальный продукт гена 12.2К белка содержит значительное количество положительно заряженных аминокислотных остатков — 18 Arg и Lis а также 5 Cys и 2 His остатка, хлаетеризоааных в С-хонцевом районе. Четыре остатка цистенна расположены в соответствия с консенсусом (CysX2CysX17-CysX4Cys), установленным для связывающего ион цинка центра белков - регуляторов транскрипции у эукариот (Strahl, 19S9).

Недавно показано, что 12.2К белок МВК in vitro может связывать нуклеиновые кислоты (Gramstat et а!,1990). Предполагается участие этого белка з процессе репликации РНК МВК.

Установлена гомология 12.2К белка МВК с аналогичными белками других карлавирусов. Наибольшей степенью гомологии

1 [TT

2 tili

R GifilN R N - Q VT|S FQAAAEDNNF

К I T К

1*4

А L

R A Q S N D

N|A E V TIS N[EjP E L[TjR D

SN S А STlD А

Afv T

SRERLQEGTSITT V[AT]L N К

HRDAKPTWHKRCQLC*

ARQRYRMETSFPPWLKS*

Q I S G S T P T I R I T G T TQ]A E H L[E]G Y N N l P

1 УЩК S N R К *

2 Q F L P P P Q *

3 A[TjV T L P P P *

4 A L И А P P S *

297 205 230 242 190 279

304 212 233 249

А

РисЗ. Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевых областей 34К белка МВК и белков оболочек (БО)ВМП, ХВК, BMA, ВМБК и ВМН. Идентичные аминокислоты обведены. Цифры указывают положение аминокислот от N-конца молекулы. Пробелы (-) введены для достижения максимальной картины сходства.

обладают участки, включащие основный А^-богатый район и область, содержащую цинк-связывающий мотив (см.Рпс-5).

1.43. 25К, 12К и 7К белки.

При сравнении аминокислотных последовательностей • потенциал<..1ых продуктов экспрессии генов 25К, 12К и 7К. белков с аминокислотными последовательностями белков ряда других фитовирусов установлено высокое сходство с некоторыми неструктурными белками потеке-, гордеи- и фуровирусов. Ранее было показано, что потеке-, гордеи— и фуровирусы содержат консервативный блок, состоящий из трех генов (Могояоу м а1, 1957; 1989). Наиболее четкая гомология установлена между 12-14К белками всех трех перечисленных выше групп вирусов. В ^ту картину идеально "вписывается" и 12К белок МВК, имеющий 40% гомологии с 12К белком ХВК (рис.б).

Установлено, также, что 25К белки МВК и ХВК обладают 25% гомологии. Кроме того, более низкий уровень гомологии установлен между 25К белком МВК, 58К белком вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и 42К белком вируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС). Есе вышеназванные белки содержат присущий КТР-зависимым ДНК-хеликазам консенсус, включающий домен СХСКБ/Т, который, 'как предполагается (ОогЬа!епуа е! а!., 1988), входит в состав фосфат-связывающего центра. Предполагается, что вирусные белки, содержащие ШТ-связывающий мотив, могут являться субъединицами РНК-хеликаз и участвовать в процессе репликации вирусный РНК.

Высокий уровень гомологии имеет мссто и между потенциальным продуктом гена 7К белка РНК МВК и 7-8К белками погексвирусов. Кроме того слабая гомология была обнаружена между 7К белком МВК и частью 25К белка ВНПЖС.

С целью выяснения возможной функциональной роли белков, кодируемых тройным блоком генов МВК нами была проанализирована гидрофобность этих белков методом, описанным Эйзенбергом с созвт. (Е!5епЬе^ е! а1, 1984). В основе этого метода лежит определение уровня гидрофобности белковых сегментов длиной в 21 аминокислотный остаток. Уровень гидрофобности белковых сегментов выражается с помощью среднего гидрофобного момента (СГМ) отдельных составляющих его аминокислот. Для того, чтобы индивидуальный сегмент белка проявлял мембрано-связывающие свойства, уровень его гидрофобности должен быть не менее 0.68.

БВХ итНКИПТЯлПЩ7!ФСРТН1С7ШК1{АРРШНКСЯ23У[ШШ.тт БШ ыкАтшшспйт.г?птр-тс1К11ВУА0757С1----окзтгесшчАкгхсн

основный район

ОЕКсхвгардагк-йсгокйтсррсхБУНшххрш'етхкуш/кгжр*

I г г г

I_I

потев свяаивапцаго цантра

Рисунок Б. Гомология карлавирусяых белков, содержащих, мотив цишс-связшзаицего центра. Аналогичные аминокислота выделены ,юфыш шрифтом. Стрелочками С) указано ' положение консврвативнш. цистеиновых остатков.

а

1 ивк

2 ВМ6К

12К 13К

■ИТТТТТТ М Р I. Т Р Р Р

о г т

N Р ч

3 ХВК 12К Н Ь А 1} 0 N 5 Е

ГТТЦ. 5 О А

0 I А I

1 V I б

КЩУ К V У

в V А I С 5 Г А

этл

23

V 23

V 28

тпгппппг

н n i ре б 6 1 №111115

МГТТППГТХТ, 55 Е ущй С т к 5) 56 а у я о е т к [а 61

Е л я к и I а о р и(ТТ

1 б к т 1.щк 5 н n т т - -ЯУ51ННЕК«ААР -ГА

ТЦЧ

Р I &

ГТ]уЕ ва 1|7\ в В6

к1]т0 91

и а[Пггг

V Т I. У в 2

ЧЕК

в Й Р -

Н У Г N I 5 Ч И

тс и

-ггпсрт

В V в э

и тспгп-

о]м n

С V I о N К Н * 5 Б Н *

109 116 114

Рис.б. Сравнение аминокислотных последовательностей участков 12К белка МВК, 13К белка ВМБК, 14К белка ХВК и »К белка ВМН. Аналогичные аминокислоты обведены. Цифры справа указывают положение аминокислот от Н-конца молекулы. Пробелы (-) введены для достижения максимальной картины сходства.

I

/зз

Для двух же сегментов одного белка критерием его потенциальной способности связываться с мембранами является суммарная величина СГМ не менее 1.1.

Используя эти критерии было установлено, что 12К и 7К белки МВК, содержат гидрофобные сегменты с высоким уровнем гидрофобное™, который характерен для мембрано-связывающих белков экспериментально выявленных у ряда вирусов млекопитающих, таких как вирус гриппа А (ВГ-А), обезьяний вирус 5 (OB 5) и вирус желтой лихорадки (ВЖЛ) (Lamb е! al, 1985; Hiebert et al, 1988; Rice et al, 1985), и, таким образом, также могут обладать способностью связываться с клеточными мембранами. Анализом гидрофобное/и белков ряда других фетовирусов выявлены мембрано—связывающие свойства у аналогов 12К и 7К белков МВК, кодируемых тройным блохом генов потеке- , гордеи- , и фуровирусов (таблица 1). Совсем недавно, Морозовым и др. (1990, 1991) опубликованы результаты экспериментов, подтверждающие сделанные выше выводы о потенциальной способности 12К и 7К белков карла- и потексвирусов связываться с мембранами.

2.Анализ нуклеотидной последовательности РНК МВК.

2.1. Анализ субгеномных РНК МВК.

Как было показано выше, структура и локализация гомологичных генов в 3-концевых областях геномных РНК МВК, SBK, SBX, БСВЛ и потексвирусов очень схожи. Это сходство дает основание предположить, что 3-дистальные цистроны карла-вирусных РНК должны экспрессироваться с соответствующих субгеномных РНК аналогично потексвирусам.

Действительно, вирус-специфические субгеномные РНК (сг-РНК) были найдены в препаратах, полученных из растений, зараженных рядом потексвирусов (Dolja et al, 1987; Guilford & Forster, 1986; Bendena et al, 1987; Mackie et al, 1988), в препаратах вирионной РНК S вируса хелениума и протопластах, зараженных SBK (Афонина, 1987; Foster et al, 1990).

Показано, что последовательность 5-конца основной сг-РНК

ХВК (GAAA-блок) локализована пятью нуклеотидами выше

инициаторного кодона гена белка оболочки (Морозов CJO,

/

неопубликованные данные). В то же время 5-конец более крупной субгеномной РНК ХВК (GAAUA-блок) на основании сходства нуклеотидных последовательностей, предшествующих инициаторым

Вирус Белок Положение Последовательность СГН Сумма СГН

от Н-конца аминокислот 21-мера одного двух __ __сегмента сегментов

0В5 5Н( 5 К) 19

(парамиксовирус)

ВГ-А М2( 11К) 22

(ортомиксовирус)

№Л1СР1.Р1РР1.РУТРПРТ[. 0,92 50Р1А1Ш1Ш1.Н1Л1.Ш1. 0,69

ВЖЛ N31 352 СЕ1НАУРРЕ1.У$ММ1АМЕ7У1. 0,60

(флавивирус) N31 380 (ЗЮСЗУУИСАЮСЧУТН. 0,66

п$2а 45 |ЖТ1С«ШЕ 1А1ССУШЦ. 0,70

П52Ь 102 А1.\/ЕАА1НРРА1.1.1.\/1АС111Р 0,79

} 1.26

ВШМЯ 17К 60 АИ-АЗиПАШНУИ!^! 0,81

(гордеивирус) 14К 12 УИРтбШУСиАУИРЕМ 0,72 14К 73 55РСМиРАМ1ЛПСП$УЫ 0,64

} 1,36

внпжс

(фуровирус) ВМА

(потексвирус)

15К 12 . тУтотУ5М!.У5РРЕ5 0,71

13К 12 КУРтСУШАРРУНАРШ} 0,75

13К 82 5ШЗД|.тА№У1.Ши 0,63

8К 7 аШМСАУииАииРШН 0,60

} 1.33

ВНБК 7К 3 РТТЩ ШУУПУР 1УУРАК1 0,81

(потексвирус) 13К 12 ТУ01АИ.А1Х1УИ.АРУи$0 0,59 1зк 77 тприисшинстр о,64

) 1.23

ХВК 8К 7 1.Ш1тШ1Ш1$Т$17 0,79

(потексвирус) 12К 14 $ЕКШУ1й15РА1Л/51ГРи. 0,58 12К 80 НААРААУШПИУеБКУИ 0,53

} 1.П

МВК 7К 1 М1т1.Уа|.5АРШ1.У1.15() 0,72

(карлавирус) 12К 17 А1_СУ51.А1.УУи1.Ш$Т1.РУ\Г 0,56 12К 73 АРИ.С5РИАШИЛ/и1иА5 0,69

} 1,25

Таблица 1. Анализ гидрофобности сегментов белков ряда фитовирусов по методу Зйзенберга и др. (ЕНепЬегд е1 а1. (1984)) (см. текст).

кодонам генов белков оболочки и генов 25-26К белков у нескольких потексеирусов (Förster et al, 1988; Skryabin et al, 1988a;1988b) , был локализован семью нуклеотндами выше AUG-кидона гена 25К белка.

Как и в случае с потексвирусами, сравнение нуклеотидных последватедьностей, расположенных выше иницнаторных кодонов гена 25К белка МВК и гена белка оболочки МВК, выявило район хорошо выраженной гомологии (рис.7). Весьма существенно, что тетрануклеотидные блоки, аналогичные GAAA- и GAAUA-блокам ХВК, обнаружены в 12 и 8 нуклеотидах к 5-концу от гена белка оболочки МВК и гена 25К белка МВК, соответственно. По аналогии с потексвирусами, можно предположить, что эти бл ки являются 5-концевыми в субгеномных РНК МВК. Последовательности, выявленные перед генами 2SK белка и белка оболочки МВК, не обнаруживаются перед генами 12К, 7К и 12,2К белков МВК.

Эти данные свидетельствуют в пользу того, что белок оболочки и гены тройного блока МВК, по-видимому, экспрессируются с соответствующих вирусных субгеномных РНК. Для проверки этой гипотезы мы выделили тотальную нуклеиновую кислоту из листьев картофеля, зараженных МВК н проанализировали ее методом блот-гибридпзации. РНК разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с 32Р-РНК-зондом, соответствующим минус цепи гена белка оболочки МВК. _

На рис.8 представлены результаты блот-габридазацни. Видно, что зонд габридизуется с тремя зонами, содержащимися в тотальной РНК, выделенной из зараженных растений картофеля: высокомолекулярной РНК,.соответствующей по размеру геномной РНК МВК и с двумя низкомолекулярными РНК размером около 2500 и 1500 нуклеотндов. Мы полагаем, что эти низкомолекупярные РНК являются субгеномными вирусспецифи— ческими РНК, которые синтезируются в зараженных тканях. Вероятно, с более тяжелой сг-РНК экспрессируются белки тройного блока генов, а с более легкой - белок оболочки и 12.2К белок. В препаратах вирионной РНК зон, соответствующих субгеномным РНК не выявлено.

22. Нуклеотидные последовательности, возможно важные для экспрессии РНК МВК.

Следует отметить, что с помощью компьютерного анализа последовательности нуклеотндов РНК МВК нами выявлена

16 Т(>С!5ТСАСААТСАТАЕТСССАААСАААСАССТСАТТС6СТСТСАТйТСААА-САА6ТАТТТ6АА6 **** * * * * **** ** **** **** * *** * ******

1222 ТбсеСбТССА—АбОаТОССОААПОАСбвТВАбТТСбВААЙ—ТвТССТАТСАА—ААТТвААб

ТБСТ7ТААТТА076ШС—ТТАбаТАТТвСТАПбТАТТБАА-ТАТТТАТв - 25К ген *** * *** * ****** * * **** *+

СССТТТЕ65Т-6Т6СТТССТТТАССТСАТААССТШТСТеАМТАЙТаАСТАТй - 34К ген

Рисунок 7. Консервативные районы РНК МВК, предшествующие А1Ш-кодонам генов 34К и 25К белков. Звездочками отмечены положения идентичных нухлеотидов. Цифры слева указывают позиции нухлеотидов в соответствии с Рисунком 2.

последовательность UGNNMNACAA-GNNNN-GAACNGC(N J AUG (консег eye) которая четко прослеживается в областях, предшествующих инициаторным кодонам генов 25К-, 12К- и 7К-белкоп и слабо выражена (если не отсутствует вовсе) в случае генов белков 34К и 12.2К. Можно предположить, что эта последовательность играет важную роль в трансляции белков тройственного блока МВК (белков 25К, 12К и 7К), являясь сигналом либо для реинициации трансляции, либо для независимой инициации трансляции.

Нуклеотгодкые последовательности на границе генов 12К к 7К белков (ЛГСА), а также генов белка оболочки и 12ДК белка (S05A), аналогичны тем, которые используются при реинициации трансляции в процессе экспрессии генов каулпмовнд/соз (Hull ct al, 19S6). Возможно, что таким путем экспрессируются только те в:грусные гены, продукты которых при развитии инфекции требуются в небольших количествах. Исходя из этого, можно предположить, что продукты генов, кодирующих 7К и 12.2К белки необходимы и количествах, меньших, чем продукты генов 25К белка к белка оболочки. Учитывая, что белок оболочки в зараженных клетках требуется в больших количествах, последнее предположение кажется весьма вероятным.

3. Изучение механизмов трансляции тройного блока генов МВК,

С целью изучения возможных механизмов трансляции генов тройного блока МВК нами была сконструирована плазмида pTBGM, содержащая этот блок генов, фланкированный промотором для ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7. Кроме того, на основе pTBGM создан ряд плазмид, содержащих точечные мутации в разных участках геноз 25К и 12К.белков.

Все точечные мутации были получены с помощью цепной полимеразной реакции (ЦПР) с участием синтетических олигонуклеотидов и плазмады pTBGM по методу Higuchi et al. (1988) с небольшими модификациям». In vitro трансляцией синтетических РНК, полученных с помощью РНК-полимеразы фага Т7 на основе клона pTBGM и кДНК-клонов, содержащих точечные мутации в генах 25К и 12К белков, в лизате кроличьих ретикулощлов и в экстракте из зародышей пшеницы показано, что:

1) РНК-транскрипты, содержащие тройной блок генов МВК, как в лизате кроличьих ретикулоцитов, так и в экстракте из

1S

12 3 4 5 6 7 3

12 3 4 5

25К- fcO

9.5К-

5K-

Ci" •

о.-'

25K- .ÇTK^

9.5K-I; J

5K- -t

cr>

ГУ)

v - • v

<n о

Рисунок 8. Трансляция РНК-траискриитов, содержащих тройной блок генов МВК ш vitra.

А. Дорожки 2 и 6 - отсутствие матрицы (отрицательный контроль); дорожки 1 и 8 — продукты трансляции копированных PIIK—траискриитов; дорожки 2и 7 - продукты трансляции неюшфопашшх РНК-траискриптои; дорожка 3- продукты трансляции некэлированных РПК-транскрмптоп в присутствии RNAsin (Promega); дорожка 5 -^С-меченные Rainbow™ маркерные белки (Amersliam). Дорожки 1-4 - трансляция в экстракте из зародышей пшеницы; дорожки 6-8 - трансляция в лизате ретикулоцитов кролика.

Б. Дорожки 1-4 — продукты трансляции кэнированных РНК—транскриптов в экстракте из зародышей пшеницы, синтезированных в течение 60, 40, 20 и 10 минут инкубации, соответствеено; дорожка 5 - 14С-меченные Rainbow™ маркерные белки (Amersliam).

Рисунок 9. Трансляция кэпированных РНК-транскриптов, содержащих точечные мутации в отдельных генах тройного блока МВК в экстракте из зародышей пшеницы.

Дорожка 7 - отсутствие матрицы (отрицательный контроль); дорожки 1, 2' и 3 - продукты трансляции РНК-транскриптов, полученных с плазмид pTBGMut3EcoRI, pTBGMut2SacI м pTBGMul2SacI, соответственно (см. текст); дорожки 4 и 5 - продукты трансляции РНК-транскриптов, синтезированных с плазмиды pTBGM, обработанной рестриктазой StuI (сайт узнавания расположен р концевом участке гена 12К белка) п EcoRI (сайт узнавания расположен в концевом участке гена 25К белка), соответственно; дорожка 8 — С—меченные Rainbow™ маркерные белки (Amersham).

га

зародышей пшеницы, направляют синтез всех трех кодируемых белков (рис.8). Этот результат свидетельствует о том, что РНК-транскрипт, содержащий тройной блок генов МВК, представляет собой, видимо, полицнстронную матрицу. Необходимо оплетать, что данная ситуация является дополыю необычной для эукариот, поскольку, как правило, эукариотическне м-РНК являются моноцистронными матрицами, т.е направляют синтез только одного полипептида, кодируемого первым 5-концевым цистроном.

2) Начало синтеза всех трех белков тройного блока совпадает по времени (рис.8). Этот результат является косвенным свидетельством того, что экспрессия генов тройного блока МВК осуществляется с помощью механизма независимой внутренней инициации трансляции.

3) РНК-транскрипт, содержащий стоп-мутацию в 3-концевой области гена 25К белка, направляет синтез как укороченного 25К белка, так и 12К и 7К белков (рис.9); РНК-транскрипт, содержащий мутацию сдвига рамки, приводящую к продлеванию рамки трансляции 25К белка а рамку трансляции 12К белка, направляет синтез как полипептида размером приблизительно 35К (что соответствует мол. массе 25К 4- 12К белков), так и 12К и 7К белков (рис.9); РНК-транскрипт, содержащий мутацию сдвига рамки, приводящую к продлеванию рамки трансляции 12К белка в рамку трансляции 7К белка, направляет синтез как полипептидов размером 25К, так и 14.5К (что соответствует мол. массе 12К + 7К белков), так и 7К белка (рис.9). Эти результаты являются прямым подтверждением, того, что трансляция 25К, 12К и 7К белков МВК осуществляется с помощью механизма независимой внутренней инициации.

ВЫВОДЫ.

1. Получен банк клонов, содержащих в плазмидах риС19 и рТ£19 ДНК-копии РНК. М вируса картофеля.

2. Определена последовательность 2640 куклеотидоа 3 -концевой области геномной РНК МВК. Выявлено пять ОРС, кодирующих потенциальные белки с мол. массами 25К, 12К, 7К, 34К и 122К. В минус-цепи РНК обнаружена только одна протяженная ОРС, кодирующая потенциальный белок с мол. массой

19К,

3. Установлено сходство структурных организаций геномов карла- и потексвирусов и высокая степень гомологии белкор, кодируемых соответствующими ОРС.

4. В отличие от потексвирусов на Э-конце генома карлавирусов имеется "дополнительная" ОРС, кодирующая основный белок, содержащий мотив гп^-связывающего центра.

5. Сконструирована плазмида, содержащая ген 34К белка МВК. Доказано, что этот ген кодирует белок оболочки вируса.

6. Проклонирован тройной блок генов МВК (гены 25К, 12К и 7К белков). Получены кДНК-клоны, содержащее точечные мутации приводящие к преждевременной терминации ОРС 25К ч^лка, слиянию ОРС 25 и 12К белков и 12 и Ж белков. Опыты по in vitro трансляции РНК, синтезированных с этих плазмид позволяют предположить, что экспрессия этих генов осуществляется с помощью механизма независимой внутренней инициации трансляции.

7. Методом блот-гибридизации РНК, выделенной из растений, зараженных МВК, продемонстрировано наличие двух субгеномных РНК.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работа:

1 Рупасов В.В., Морозов СМ., Канюка К.В., Журшш В.Ю., Лухашева Л.Н. и Заврнсв С.К. Нуклеотидная последовательность и структурная организация 3 -концевой области геномной РНК М-вируса картофеля. // Молекулярная биология • 1990. • Т.24, Й2 - С.448-459.

2. Kupasov V.V.,Morozov S.Yu., Kanyuka K.Y. & Zavriev S.K.

Partial nucleotide sequence. of potato virus M RNA shows similarities to potexvimses in gene arrangement and tlie encoded amino acid sequences. // Journal of General Virology -1989 - V.70 - P.1861-1869.

3. Zavriev S.K., Kanyiika K.V. & Levay K.E. The complete nucleotide sequence and gene organisation of potato virus M genomic RNA. // Abstracts of the VHIth International Congress of Virology • Berlin. Germany, 26-31.08.1990 ■ P.375.

4. Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Leva; K.E. The genome organization of potato virus M RNA. // Journal of General Virology - 1991 ■ V.72 ■ P.9-14.

5. Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Levay K.E. The genome

structure of cailavimse*. // Abstracts of the FEBS Advanced Count: "The Plant Virus Genome: Structure and Expression "■ -Riga. USSR. 29M-S.0S.l99l - P. 19.

6. Baulcombe D., СЬьршап S., Kavenagh Т., SanU-Cruz S., Goulden M., Davles C., Kanyuka K. & Etessami P. The triple block and coat protein genes of potato virus X. // Abstracts of FEBS Advanced Course: "The Plant Virus Genome: Structure and Expression". - Riga, USSR. 29.04.-5.05.1991 ■ Я.16.

7. Заврвсв O.K., Канюка К.В. ■ Левой К.Э. Полная нухлеотидная последовательность геномной РНК М-вируса картофеля. // Молекулярная биология • 1991. - Т.25, В.З. -

С761-769.

Подписано в печать 7.II.9I. Заказ 621 Формат 60x90/16 Тирах 100

Мооюэа. Типография ВАСЛПИ