Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура 3'-концевой половины генома клостеровируса желтухи свеклы

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структура 3'-концевой половины генома клостеровируса желтухи свеклы"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

БОЙКО Виталий Петрович

УДК: 578.233.44+578.857.1

СТРУКТУРА З'-КОНЦЕВОИ ПОЛОВИНЫ ГЕНОМА КЛОСТЕРОВИРУСА ЖЕЛТУХИ СВЕКЛЫ

Специальность: 03.00.06 — Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в Отделе биохимии вирусов растений Межфакультетской ПНИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук В. В. Доля.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Е. Горбале-ня; кандидат химических наук А. Б. Вартапетян.

Ведущая организация: I НИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Защита диссертации состоится « I» 1992 г. в

' часов на заседании Специализированного совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического'

1992 г.

В. Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблею. Исследование структура и особенностей выражения вирусного генома - бурно развивающееся направление ; молекулярной вирусологии: Знание первичной структуры Шрусншс геномов позволяет.построить модель организации и экспрессии генома, выдвинуть обоснованные гшотезн о функциях: кодируемых политгептидов и некодирулцих областей, и в -сочетании с широким спектром генно-инженерных подходов, проводить функциональные исследования. Изучение механизмов експресии генома вирусов растений, среди которых преобладают РНК-содержащие вирусы, . имеет большое теоретическое и практическое значение, давая сведения об 'осйциг принципах экспрессии генома и позволяя приблизиться к более глубокому пониманию молекулярных аспектов инфекции,' к созданию новых векторных систем, к разработке эффективных методов борьбы с вирусными заболеваниями растений.:

РНК-содержащие вирусы характеризуются исключительным разнообразием принципов организации и экспрессии генома.. Их разделяют на вирусы с позитивным (+) и негативным (-) однонитешм . РНК геномом, а также вирусы с двухцепочечным (дц) РНК геномом. (+)РНК-содержащие вирусы представляют - собой наиболее обширную группу. На основе различий в организации генома, морфологии частиц и биологических свойств - таких как круг хозяев, эпидемиология и характер симптомов - среди (+)РНК-содержащих вирусов выделяют ряд семейств (среди бактериофагов,-вирусов животных) или групп'(среди вирусов растений). В самое последнее время в связи с накоплением информации о. последовательностях вирусных генов детальный компьютерный ". анализ белковых последовательностей позволил сгруппировать (+)РНК-сода ржащие вирусы в пределах строго ограниченного числа так называемых "супергрупп" (Goldbaoh and Wellink, 1988). Первоначально было предложено, выделить две супергруппы - пикорна- и альфа-подобные вирусы. Проведенный недавно полный анализ . известных. в литературе аминокислотных последовательностей РНК полимераэ . (+)РНК-содержящих , вирусов позволил выделить третью супергруппу - кармо-подобнне вирусы (Koonin, 1990, 1991).

Структура геномов клостеровирусов к моменту начала выполнения настоящей работы описапа не была. Объектов исследования был выбран типовой представитель этой группы - вирус желтухи свеклы. Частицы

ВЖС состоят из белков-мономеров с мол. весом'22300 и РЛК длиной 14.5.ТЫС. Н'Г (Bar-Joseph & Hull, 1974; Carpenter et al. , 1977). РНК ВЖС лишена 3' концевой поли(А) и несет на 5'-конца кап-структуру (Karaeev et al., .1909). ПрОДУКТЫ Трансляции in uitr-o вирионной РНК ВЖС представлены мажорным полипептидом с мол. весом 250■ кДа; соответствующий ген, по-видимому, охватывает ь'-концевую половину генома ВЖС (Karaeev et al.. 1939; Dolja et al., 1990).

Цель н задачи исследования. Целью представленной работы было изучение первичной структуры и вкспрессш генома клостеров1фуса желтухи свеклы, компьютерный анализ последовательности РНК ВЖС с целью выяснения кодирующей емкости генома и предсказания возможных функций кодируемых балков, а также установление систематического положения клостеровирусов среди других (+)РНК-содержащих вирусов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые определена первичная структура з.'-концевой половины генома ВЖС, предложена общая организация генома ВЖС.

В процессе работы был получен набор pTZia-19 клонов, содержащих -последовательности нуклеотидов э'-концевой половины генома BSC. Эти клоны используются для дальнейшего изучения ВЖО методами рекомбинан'шых ДНК в Отделе биохимии вирусов растений ШШЛ vim. А.Н. Белозерского МГУ.

На основании анализа первичной структуры . РНК ВЖС впервые описана организация генома клостеровирусов. Высказаны обоснованные гипотезы о возможных функциях продуктов 0РС1, 2, 3, 5 и б. Показано, что продукт 0РС1 - гипотетическая РЖ зависимая РНК лолимераза, филогенетически близка РНК полимеразам трикорнавирусов. Продукт 0РС2 - 6.4к белок обнаруживает сходство с небольшими гидрофобными 12-14К белками потеке- и карлавирусов, которые обладают мембрано-связыващими свойствами и, по-видимому, вовлечены в транспорт вируса по растению (ttorozov et al., 1987, 1989, 1990). Уникальным свойством генома ВЖС является кодирование 65к белка -'■ прямого гомолога белков теплового шока семейства HSP70. Это первый пример кодирования белков теплового шока вирусным геномом. Обнаружено достоверное сходство продукта 0РС5 - 24К белка, с вирусным белком оболочки (продукт 0РС6). Предполагается, что ген 24К белка возник путем дупликации цистрона белка оболочки, а функция его продукта (24К) связана с транспортом вируса по растению. 24К в белок оболочки вкспрессированы под Т7 промотором и показы», что 24К б-элок транслируется о первого из двух

гипотетических AUG кадонов.

Полученные результата имеют большое значение для прикладных., исследований. Потери урожая сахарной свеклы в случае заражения В1С достигают 40%. Перспективно создание растений, устойчивых к ВЖС.

Апробация работы состоялась на семинаре каф. вирусолойвг МГУ 1 ноября 1991 года. .

Материалы исследований били доложены на VII и VIII . Международных конгрессах по вирусологии (Вена, 1987; Берлин, 1990). Содержание диссертации отражено в четырех публикациях. Объем работы. Диссертация изложена на ^ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка, цитированной литературы ( ссылок).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Анализ кДНК клопов ВЖС

В настоящей работе использовались два. типа клонов. Первый набор клонов был получен в. результате обратной транскрипции на РНК ВЖС с помощью случайной, затравки и представлен клонами г2, гз,г9, Эба и ш-7. Второй набор клонов был получен с . использованием синтетических праймеров, комплементарных двум областям в 3'-концевой области, и представлен клонами рЗб, р43 и х19 (Рис. 1).

Вирус-специфичность полученных клонов была установлена при , гибридизации с згР меченым ДНК-зондом,' полученным в реакции обратной трапскрипшш на РНК ВЖС.

Сайты рестрикции, изображенный на Рис. 1, использовались для последующего субклонирования фрагментов кДНК в pTZia и 19. ,

Анализ нуклеотидной последовательности

В результате секвенирования кДНК клонов IWC ВЖС получена последовательность длиной 6746 нуклеотидоп (нт), которая представляет 3'-концевую половину гигомя ВЖС (Рир. 2). 6536 всей последовательности . определено ' по' двум цепям кДНК и 60!? - при секвенированки независимых клоков. При сравнении независимых клонов, была обнаружена единственная . замена а нуклеотидной последовательности - G вместо А п позиции 1921 (Рис. 2). Результатом этой замэкн явилось появление ,Val вместо Не в открытой рпмке считывания 3 (ofo 3) - -в последовательности бзк белка. Это, •

II КНХЬ XhMXbS ED SA EHE BF E E HP H —J-r-U-l-1,-U-Г 1.Г II III-4_, I I ll ,_l_

i J i ^J i —г

ИЗ _36»__r9 pH »I

~TÜ¿ —гг- "^-Sr" —Vir-

il» »IV

Рис. 1. Карта кДКК клонов и стратегия секвенирования 3'-проксимальной последовательности длиной 6746 нт генома ВЖС. Цифры (от 1 до 6) обозначают длину в тыс. пар оснований с 5*-конца; буквенные символы обозначают ресТрикциоыные сайты, которые использовались при субклонировании: A, ¿aull; В, Boodfl j В, Bröl; В, £соЛ1; Н, HtndIII; К, Kpnl; Я, ЫЬо1; Б, Boll; ХЪ, Xbal; Xli, XhoX. Пербкрыващиеся кДНК клоны показаны в виде открытых прямоугольников. Жирная сплошная и деойная прерывистая линии указывают те области, последовательность которых была определена при секвешфовашш FHK BSC методом химического секвенирования и катодом терминирующих дидезокситрифосфатов, соответственно. Сплошные линии обозначают позиции и направление секвенирования субклонировавных оцДНК матриц. Прерывистые линии обозначают последовательность ДНК, установленную методом химического секвенирования. Звездочки обозначают сайты . олигонуклеотидных праймеров I и XV.

по-видимому, отражает низкую степень гетерогенности в популяции РНК исследуемого изолята BSC.

Анализ нуклвотидной последовательности с помощью программы FRÚTIUKK/GENEBEE позволил обнаружить 8 ОРО (Рис. За). Профили, изображенные на Рис. з(ь). отражают статистику отношения G/non-a в первое и второй позициях триплетов. Согласно Triíónov, 1987, для большинства акспрессируемых генов характерно высокое значение гтого отношения. Как можно заключить из Рис. 3(ь), орс 1-8 могут быть экспрессируеыыми генами.

В направлении нуклеотидная последовательность начинается

с аазавершвшюй оро 1, .которая заканчивается Uga кодовом в позиции 657 (Рис. г и Эо). В аминокислотной последовательности этой ото обнаруживается три консервативных сегмента, характерных для РНК

* TSSXéAiéctóAG&^iA^CGGGCGCTTCTAATACGTGGATTGGTAATTCCATCGAGACTC 60 ttggtattttgagcatgttctattacaccaatcgatttaaggctcttttcgtgtccgggo 12 0

acgaçtctttgattttctccgaatctcctatcagaaatxcagccgatgcgatgtgc'Acag i во

aactcggttttgagactaagtttctcactccgagcgxcccgtatttcxgctcaaagtttt 24 0

tcgttatgaccggtcacgacgttttcttcgtgcccgacccttataaacttttagtgaaat зоо

taggagcttctaaggatgaagtagacgatgagxttctgtttg aagtgtxcacctçtxttc '360 gcgatttaacgaaagatttagtcgatgaaagagtgatcgaacxctrgacgcatttggttc 420 acagtaagtácgggtacgaaagtggtgatacgtacgccgccctcxgtgctatxcattgta 400 ttcgttcaaacttttcatcgttcaagaaattgtaccctaaagttaagc-gttgggtcgttc 540

actacggtaaactgaagtttgtgctgcgcaaattcgcgaactgttttcgcgagaagtjtg 600

ACACTGCTTTCGGCGAACGTACTTTCTTACTTACGACGAAGCTTGAAACGGTGTTGTGAC 660

tcagttgctgttttgtttattígtgtgtctgtíiGtcctactttgcggttatggSctgtgt 720 actccgctcgtatttattactcgcattcggttttttgatttgcttgttccttttctgctt .780

840 900

ACCACTTTTTCAAGTGTGTGTGCCTATGTTGGAGAAGAACTGTATCTGXTCAAGCAGAGA 960 GATAGTGCTTACATACCTACTTACGTATÎTTTACATTCXGATACTCAAGAAGTGGCTTTC 1020

ggatacgacgccgaggttctttctaacgatctttcagttcgxggaggtttctatcgcgac íoaa ttaaaacgctggataggatgcgäcgaagaaaactatagagacxagcxggaaaaacttaag 114 0 ccgcactacaagacagagctgctxaaggttgctcaáagxtcgáagtccactgxgaaattg 1200

GACTGTTACTCTGGTACCGTGCCACAGAATGÇCACTTÎACCAGGTTXGATAGCGACTTTC 1260 GTCAAAGCTCTGATTTCCA'CAGCCAGCGAAGCTTXCAAATGTCAGXGCACCGGXGTTATC Í3 20 TGTTCAGTCCCÎGCCAACTACAATTGTTTôCAAAGGTCTfXTACCGAAAGTXGTGTCAAT 1380 CTGÄGTGGCTACCCCTGTGXTTACATGGTTAACGACCCGXCGGCTGCGGCGCTTTCTGCX 14 40

tgttctagaatcaaaggcgccacttcácccgtxctcgxgxacgattxcggaggtggaacg 1500

TTTGACGTTTCCGXGATTTCAGCGCTCAACAACACTTTTGXGGXCCGCGCXXCC-GGAGGT 1560 GACATGAACTTGGGTGGTCGCGACATCGACAAGGCTX rrGTTGAACAC'T'íGTACAACAAA 1620 GCTCAACTGCCCGTGAACTACAAAATTGATATTTCCXXCÎTGAAAGAGTCGCXXTCAAAG 1680 AAGGTTTCTTTCCTGAACTTCCCGGTGGTCAGTGÁf.C'AGGGCGTAAGAGXXGATGTXTTA 17 4 0 GTTAACGTCAGCGAGTTAGCTGAAGTGGCGGCCCCGT-JCGTGGRGAGAACGMAAAAAXA 1800 GTTAAAGAAGTTTACGAAAAGXACXGTAGCAGXAXGCGAXTGGAACCAAACGTTAAAGCT I8 60 AAATTGCTTATGGTGGGTGGGTCTTC'TTACXXG CCCt'Çl Ç1GCTG1 ChCGTCVITCCTCT 19 20 ATACCGTTCGTGGACGAATGCCTCGTGCTGCCCG^.CGCTCGAGCGGCGGTCr-CCGGGGCG 1980 TGCGCTTTGTACTCAGCTTGTCTTCGAAACGAT'ICTCCrViTGXTGXTGGTXGACrGCGCA 2 04 0 GCTCACAATCTCAGCAXTAGTAGCAAATATIGXGAA! CCATCGTAXGTGXTCCXGC l'GGT 2 i no TCACCrATCCCGTXTACGGGAGTTAGAA.GGGrXAACATGACCGGTTCTAACGCXTCCGCX 2160

gtctatagtgcggcgcxttttgaaggggActtcgxxaagtgtcgtcxaáacaagaggáxt 2220

ttcx'ïTGGCGAXGTCGXTTTAGGAAACGTCGGGGTGACXGGXXCCGÇ xac'í'AGGACAGTC 22 8 0

CCGCTAACACTCGA/iAXTAACGTTTCGAGCGTCGGÁACGATCTCTTTXTCXCXCarCGGA 2 310

CCGACGGGTGTTAAGAAACTAAÎAGGXGGAAACGCXGOTrACGAXXTCXCGAGXTAXCAG 24 00

CXCGGGGAGCGCGTCGICGCTGACXTGCACAAACAXAATTCTGAXAAAGTGAAACTCAXT 24 00

CATGÇTCTGACATATCAACCTXXTCAAAGGAAGAAATXC-actgacggcgacaaagct^TG 2 520

TTCTTAAAGAGACTGACTGCTGATTACCGACGXGAAGCAAGGAAGXTTAGTXCGXAT^AS 2580

GACGCGGTTCTCAACTCCAGCGAAXTACJACTGGGGAGAATTATTCCGAAGATTCTXCGG 2 64 0

GGGTCAAGÀGTGGAAAAACTTGATGTCTGAAGCTGCTTCGGXTAGXCGACCXAGGXACAG 27 00

TAGCGACTTTCGTTTTTCAGACGGTGTTATAXTAAGXCGCAAGACGTrXGGCOAATCAAC 2760

CGGCC-AGTCATTC'GTACGCGAGTTTTCCTTGTraCTGACGTTCCCAAAGACrrACGAAGT 28 20

TXGCAAATTATGCGGTGXGGCCATGGAACTAGCXCTGAA rGGTATGAAXCGTCXGTCCGA 288 0

ttataaîgtttcggagttcaacattgtcgatgtgaaaaccg'ïgggttgcaag'tttjiatat 2940 acagtccgtcactgaattcgtgaaaaagatcaacgggaatgtggccgaaccttctctcgt 3 000 cgagcactgctggtctctgtctaattcttgcggtgaattgatcaatccgaaagatacgaa 3060 gcgattcgtctctcttatctrrmagggaaagacctcgccgaaagtaçcgacgaagctat 312 0 agtttcctcttcttacttagattacctttcccattgtttgaacttatatgaaacgtgtaa ? 18 0 tctttcatctaactcggggaagaaatctttgtacgatgaattt.ctaaagcacgtgatcga 32 40

ttaccttgaaaacagcgacttagaatatcgttcaccttctgacaaccctttggttgccgg ззоо

cattctttacgatatgtgttttgagtacaacacgcttaagtcgacatacttgaaaaacat 33 60 agagtctttcgattg'ri'ttctaagtctgtatttgccgttgcttagtgaagtcttttcga'r 3 420 gaactgggaacgaccagcgcctgatgtcaggttgcttttcgaactcgacgctgctgaact 3480 tcttttaaaagttccgacgattaacatgcacgactcaactttcctatacaagaataagtt 354 0 gaggtatttggagtcctactttgaagacgactctaacgaacttataaaggtgaaagttga 3600 cîcactcttaacccgagacaatcctgaactaaaactagcccagaggtgggtgggtttcca 3660 ttgttactacggggtcttcaggaccgcccagactaggaaagtgaagagagacgcggaata 3720 caaacttcctccggctctcggtgaattcgtaataaatatgagtgggcttgaagagttct't 3780 tgaggagctacagaagaaaatgccttccatttccgttcgccqcaggttttgtggcagttt 3 84 0 atctcacgaagctttttctgttttcaaaagattcggggtgggtttccctccgatcactag 3900 gttaaatgttccagtgaí.gtactcctatctaaacgttgattattacagacatgtaaagag 3960 ggtaggtttgacgcaggacgagttgactattcttagtaacatcgaattcgatgtcgctga 4 02 0 aatgïgttgcgagagggaagtggctttacaagcccgtcgcgctcagcggcgcgaaaaacc 4 080 atttcagggttggaaaggtacaaaaaacgaaattïctccgcacgcgcgtrcttcaattcg 414 0 AGTGAAAA agaacaacgactctttactamcattt^gtggaaagatgttögcgcccgaag 4 200 ccagaggagacttaatccacttcaccgaaaacactagagatgctatggaaactttcttca 4260 acagctacgatctagctgaatattccgaagtgaatcctaacaaacttaatcggaaggaaa 4 3 20 ccgacgaactattgggcgttattcgagagaggttcaaatccgaactggtgatcacagatg 4380 aagattttgtgaagcacttagctttcgcgttgatccgcgccgctaaiatcacaactagig 4 440 tgaaagttaactacgtcggagcatacgaatatacgataggaggaaagaagttcctggtca 4 500 AGGATGCÎTGGGTTTTTCCTCTAATAAAAGAGTGTATGAAAAAGTTTAATAAACCTAATC 4560 ctgtgaggacgttttgcgccactttcgaagacgcttacatxgtgatagcïcgttcgttac 4 620 ccaaactgttcctgaatagaaccattggcaaacgcgggatcccgtcggggtacgaattcc 4 680 tcggggcagattttctgaccgcaaccagtgtgtgtttgaacgatcacgaaaaagctatcg 472 0 TATTACAAGCCTCAAGAGCTGCCATTGACAGAGÇÎGÎTTCTTCGTCGGTCGACGGGAAGA 4800 tagtcagtcttttcgaccrcggtcgtcttagttaacacagttactaaggttc^^yrtat 4860 TACAGTATTGTTTrTGTTTTAGCGTAATCGTACTTGAGTTTCGTTÍTGG0ATCÁGCTGAA 4 9.2 0 CCTATTAGTGCAATCGCGACTTÏTGaaaacgtaagtctcgcagaccAAACCTGTTTGCAC 4 ? 8 0 GGAGAAGACTGCGATAAACTTAGGAAGAACTTCGAAGAGTGTTTGAAATTAAAAGGGGTT 504 0 CCGGAAGATAACCXCGGAATCGCGTTAGGACTTTGTTTGTATTCCTGTGCTACGATAGGC 5100 ACTTCCAACAAAGTTAACGTCCAACCGACGTCTACCTTCATCAAAGCTTCGTTTGGTGGT 5160 GGGAAGGAACTGIACCTCACTCACGGTGAATTGAATTÇCTTTCTGGGGTCTCAAAAACTT 5220 TTGGAGGGAAAACCTAACAAATTGCGGTGTTTCTGCCGTACTTTTCAGAAGGACTACATA 5280 TCCTTÜCGCAAGGAATACCGAGGGAAATTACCTCCGATTGCCAGAGCTAACCGTCACGGT 534 0 CTACCCGCTGAACATCACTACTTAGCCGCTGACTTCATATCGACGTCCACGGAACTCACT 54 00 GACCTACAACAA.NGTCGTCTGCTGTTAGCGCGCGAAAACGCC ACTCACACGGAATTCT^C^ 460

TCTGAATCACCGGTAACCAGTTTGAAACAACTAGGTCGTGGTCTAGGCACCGGGAGATGA 5520 ÊTAGTTCTGTCGAACTAGCTCAGACAAAACCCCTTTTTAGAGTATTGCTATTAAAGGGCT 5580 HGTTTTTTATGTTGTTGCGXTCGAAACCGAAGAGGAATCATCGGAÁGCTGAACTTCCTr 5640 rGGTATACCTCCACGATrTCGAATTAAACATTAACAAGAGAGGGAAAATTGAAGCTTCAT 5700 ACGTCCACTTTATGTCTTGTATGACTÀGGTTAAAACCTAGTTCGGTTTCTTATACTCGAG 5760

таасттсаоааааатсттсссаасасттттстттасслссстссослааолстттссстт 582 0 СТАААСТТСТТААТССТАААаТСЛССТТТАСОТТСОААААС<ЗОАОТССААСТЛСТОТТСО 580П соатотатооастсоаасаасостссстттсттссалстасттотсотттсаллассттт 5940

тссттоососссастсссосассттаасстаттстстСааттоссааттаоасаааа^тс бооа

ОТССТСЛАТТАОАОАТТТТСАССТТТТССАААААТСААЙТТСТТСТТААААСАТССТСАА 6060 ' асттстсслоссттстстлсотстсаатссстсстасотсстйтслассаастсосалсо 6120 ааттсосаасааассоасатгтссааатосстсаассааттсллссаастоассаоттт'т 6x80 аатсасттстта(зттасаоттсаасасассолатсоатсоаасаосатссоаассастсо 624 0 ТСААААСТССвСвТТССЛТСАССААТТвСТаЛААТССТТААЛСАСАТАСасаССТТССТТ 6300. ааастасссстоотаастсстатссасааооааасссссаосзатастстааатасоттт 63 60 СТАСААОАСТАСТССССААТТАСТЗСАСТСОСТССТСААСЛСССТТТАССАСААААСАТС 64 20 аоаааастсаасастстоотастатттсатсаттссоаасттттсааоттссаастсаст 64 80 сааллсатоттсасстатасгсаас^астаааастслатстаассттсас-встаатттст 654о ТСТСАААТССТСССААТ(ЗССТАТАТАОАСААОТСЛСОСАСОСОАССТАССГАСССТОТАА 6600 ТТТААОТССТСАСАСАСТСАСААССССАССААСТаоТССТТАОТСССТАТСТАААТТАСС 6660 аастссаааааатттттстттттататтласаааатттттссаслстсстассоаастсс 6720 состассаасалаааатаассс-сссс 6746

Рис.2. Нуклеотилнея последовательность з'-концевой половины генома ВЖС (в виде последовательности ДНЮ. Инициаторш,1е Аис-кодоны и терминирующие кодоиы обозначены стрелками и звездочками, соотв.

m

^. ж. Лм JtJ. .

Рис. 3. Компьютерный анализ последовательности 3'-концевой половины геному ВЖС; (а) ОРС (ОйР) в трех рамкам считывания представленной части последовательности гэнома ВЖО. Вертикальны? линии обозначают терминирующие кодош, (ь) Анализ последовательностей ОРС пс ТгИопот, 1907 (см. текст).

полимераз (+)РНК-содержащих вирусов (Рис. 4; Kamer & Argon, 1984; Koonin et at., 1989). Этот результат позволяет предположить, что с-концевой домен 25РК бежа ВЖС, кодируемый 5'-концевым геном (Karasev et ai., 1989), представляет собой вирусную полимеразу. Сравнение последовательности этого домэна с другими РНК зависимыми РНК полимеразами позволяет сделать заключение о ближайшем родстве РНК полимвраз ВЖС и трикорнавирусов (бромо-, кукумо- и альфальфавярусов). Это сходство распространяется также за пределами высоко консервативных сегментов РНК полимераз (+)РНК-содвряащих вирусов (Рис. 4). .

- в -

II III

Bltv 518 Si'QRErGDAf'CTFGfraLVTUAULAYASDL—SDGDCAIPSGDDSLI-ISKTKPVLDTDjC CUV 567 EyQRKPODAFXypGffriVTUAEPiWOyDT—DQPDRLLFSGDDSLA-FSKLPPVGDPSKP

A1HV 583 DPQRMGDALmGNTIvmGMHVTDI^lirtmCPVVASGDDSLlGTVEELPIffiQiSIJ »* * ■ •*•

BYV ? mQRKSGASfn^lGHSlEmiII£VBra--KRmiFVSGI)DSLI-FSESPir«SAlUK

IV

BMV TSLi'NUElKVUDPSVPYVCSKPLVETEMGU----LVSVPDPIAEIQKLAKRKXL—RDEO .

CliV TTLFNtfEAKVllE?AVPi i CSKFYStMSLVT----M?OSPT-IReIQRLGTKK1PYSDNND

Aiiiv TO^mJUKP-pmctfPicsKPLiriffTTsaG^TOj'iPKPixuiRLGSKicv—-NAD ,.

BYV CTELGFETKPLlPSVPYPCSKiTVUrGHDV-—-FFVPDPYKLLVKLGASKDB—VDPB

BMV UmH^-SycDRMK-l'INQlDiXiilTTlGHFVYLKYGKB 155 CMV HiAHPtiSFVDRLK-FMDRllStiSGlDQLSIPFBLKiKKS 122 AlUV IPDiWYaSWlDIiaai'HDHHVIRcVAlMTAHRYlJffiPSL . 53

BYV PlfKmSiRDLTK—DLVDERVIXLMHLVHBKXGYB 72

Рис. 4. Сравнение гомологичных областей РНК полимераз ВЖС и трикорнавирусов. Выравнивание было выполнено программой multalin (Corpet, 1988) с использованием матрицы гомологичных замен ИШ78 (Dayhoff, 1978). Штраф за пробел был равен е. Консервативные, сегменты РНК полимераз (II-IV) вирусов с позитивным РНК геномом обозначены согласно Koonin »tai., 1989. Звездочки обозначают консервативные аминокислотные остатки, которые . сохраняются у (почти) всех полимерязах (+ )РНК-содержащих вирусов, bmv, вирус мозаики костра; cicv, вирус мозаики огурца; aimv, вирус мозаики люцерны; Byv, вирус желтуха свеклы.

оро 2 (нт 710-871) отделена от оро 1 некодирупцей областью длиной 51 нт, в которой обнаруживается высокое содержание и (51$) и низков содержание А (ЮЛ). Компьютерный анализ не выявил выраженной вторичной структур! этой мехгенной области. Инициаторный кодов ОРС 2 имеет благоприятный контекст, G в +4 и -3 позициях (Koz&k, 1986). оро г кодирует белок с мол. весом 6.4 кДа; сравнение аминокислотной последовательности 6.4Х белка о банком Данных показало его ближайшее родство о 14К белком потексвнруса мозаики нарцисса(ВМН). Выравнивание последовательности 6.4К ¿елка с 12-14К белками потвкс-и карлавирусов обнаруживает две консервативные области (Рис. 5); R-концевйн обдаоть сходства включает сильно гидрофобный сегмент. Выло предложено, а Затем экспериментально показано, что вти белки

III!!!! I

г » *

рта 12К 9 РБРТКУУ1ВААЬОУ81^Т\Т(ХХ1113ТЬРУ70ВШ)ШП»РНООЧУШ)0-ТКЗ

рух 13к -12 уизетшд1£раьус1тга£к1511рнусс1пнзьрнсоаум)0-тка

исют 1зк б ротота1л111А1яьуш^Ь18пнзркус,ршж1Ъ1>роотБО-ткз <

№7 14К 10 '«ТУЕаУтаТ^1СШ,САС1УСЬРБОТаР11У0ПГ11НЗЬРПССОТА1Ю-ТКй ВП 6.4К ВСУ1Д5ТШАРСРЫСЬ?Ц'СЬУУ------------'------уцугтд .

! I . * *

рта 12К ур-жро------гш?51ЕАККАРЫла зо

рух 13к ----ьознузшгаки—аар 32 •

«01му 13к зкурокрконзьзктьакенютхры,!!. 31

1т 14к уа-урирн-----бзтбт'ггктааьсауь 51

бут 6.4к 1ь-рнт---------та<ккелкшкту7

Рис.5. Сравнение аминокислотных (АК) последовательностей небблыпих гидрофобных белков ВЖС, Потеке- и карлавирусов. Выравнивание было выполнено с помощью программы мш/ГАЫи (Coгpet, 1988). Идентичные или функционально сходные АК выделены жирным шрифтом.. Сходные АК были сгруппированы следующим . образом« Х,,1,7,Н;Р,У,Я!8,!Г;КГН; Б.Е.Н.а. Звездочками обозначены идентичные или сходные АК во всех последовательностях! восклицательными знаками - . консервативные гидрофобные АК. Протяженный блок гидрофобных /К подчеркнут. Повтор длиной 5 АК в 6.4К белке ВЖС показан горизонтальными стрелками, рта - м-вирус картофеля (Ииравот вг <*1., 1989)! рух1 - х-вирус картофеля (Могоиот «) ш., 1987); тсежт - вирус мозаики белого клевера (Роге^ег аг., 1988); № - вирус мозаики нарцисса (2и1(1ета еЬ аI., 1989).

ассоциированы с клеточными мембранами и вовлечены . в • транспорт вируса по растении (МОГОЕОТ . в*- а.1., 1987, 1989, 1990; Веок вЧ а!., 1991). »-концевой гидрофобный сегмент, может служить сигнальным, пептидом или опосредовать мембрайо-связывапцие свойства этого белка. Любопытно, что этот сегмент в 6.4К белка ВЖС длиннее, чем у белков других вирусов, и включает 25 последовательно расположенных неполярных аминокислот. Это может быть обусловлено наличием прямого повтора длиной.5 аминокислот в атом белке (Рис, 5).

оро з находится между нт 874 и 2667 и кодирует белок с мол. весом 65156 (65х). С помощью программы сшск/ашевее 65к белок сравнивался с банком белковых последовательностей» К нашему удивлению, . 65К белок оказался прямым Гомологом белков теплового шока семейства пбр70. Было построено выравнивание 65к белка с Н8Р70 белками.(Рис. 6); детальный анализ этого выравнивания показал, что

- ю -

А В

¥ V #** * ***** *_** ***

гаикЕ з пашхттаБсУ 127 турА^та)А0к<и№вАан1А&1даш11НЕР,тАиу

МТР7ОТ0 28 УЮПМТЖОУ 124 ТСРАУРКОРОКОАТКВАатХАаШ'ГНУУНСРТААШУ

си7ен™ 29 уусгаьсктасу 131 отраук№локоатхваоиас1жмшмотам1ау.'

ЕЕ70АЕЕ 5 АУИБьСГтсУ 131 ОТТГРЫШйКОАТЮАаАЬАСХЖУЬаХШРТАААт НБ70МА1 7 АХСШЬСтБСУ 130 Т7РАУ5№330КаАТт0У1АС1ЖШ{1В11МААА1АУ Нв72ИШ 2 А1СШЬ01Т£ЗСУ 130 Ш,АУМ1)ЗЙКОА!ШЗАСНХАСЫЛ'1Д1ГШ>1,ААШУ.

65квуу 2 урий'сттрззу 135 бура1ж1с1двзр1ив0у1а£сурстш1'8ааа1аа

о х>

ф у # ф * £ V $ У ♦ ♦ V А 4 У

СНАКБ 10 ШтСССТИМИ Ю т1АТНГЛ)Т1Ш5<ММ)ЗНЬ1т 96 ЫТР70ТС 9 ХШМХОСТРМБУЬ 6 КГГСАТЖ1тШКЕи?Ш.С13ВУ1 96

ои7аним ю гаушлсиигош. б та7УАтам«кьсснз?С(зяумш 92

Ш7САЕЕ 11 УЫУСЬССС'ОТУЗГЬ 6 РтзТАСагНЬССЕВРйЧНЫУШР 92: НЭ70МА1 13 УЫРМЛСССТСУБЫ. . 6 РтАТАСитИХЛСЕПРЕИКМУШС 92

нв72ию и уыршлсо'Л'ВУЗХЬ б РЕтял^ны&ЕЛгсжшза. 92 ; б5квг7 ю 6 т^аостшэдпиш'тай 84

Е У

*** * *** * * * *.

шшиз уиусшшрыуакюмг нрбеауаюаауоооуьгоп з •

МТР70Т0 УУ1УСС!ЛР,М?КУ1ЕАУ 12 НРБЕАУА1Л0АТ1,айУ1ДЯ1) з

0И76НШ . тУСОБТйикЮОЬУ 13 КРСЕАУАУСААУОАОУ1ЙОБ 5

НБ7САЕЕ тУСаЗТКГРКУСКЪЬ 13 ^БШАУСШОШЬЗОВ 7

НБ70МА1 тУСМТМРКУССЬ- 13 №?1)ЕАУАУСААУС1АА1Ь5СЕ 6 '

ВДгЕКО тУСККТИГРКУоБХХ 13 НЕОШМСААУилАИвОВ 7

б5квет щгусйвбш'оизга, 13 оа!иауас«аиааошт г

с . и

* * * *

ШАКЕ УШЛутр--1£1д1Етмаа\тмг 56 ясиро-гот? 162' ытотс ьуш)утр—1£ЬоуьтьсаУгтн 57 киУ?а-1£Утр 160 сн78ним ЬУЫнуср~Ь!П|21тоошк 56 лаура-шт? 154 .

Н37САЕЕ ШЛЛУАР—ЬБШЕГАСОШГА 56 ИСУРа-ШТР 162 ИБ70МА1 Ш.ШТР--13Ь31.ЕТАаОУМТУ 56 ЯСУРЦ-ГГУТР 166

наголо тулуар—ьзьмерасоуитк 56 ноура-шет 170 •

65КВУУ ШХУ1)САА1Ш£1БЗКУСВ31У0У 60 ЙТУРЬТЬВЮТ 122

Рис.6. Консервативные фрагменты (от а до Н) АН последовательностей 65К Оелка ВЖС и некоторых белков теплового шока семейства нбр70, Выравнивание выполнено с помощью программы шшаыы (Согрев 1988). звездочками обозначены идентичные ак. шаке, опак белок в.оои,-МТР70ТС - НБР-ПОДОбНЫЙ белок ИЗ митохондрий Тгураповота oruг^¡ 0К78НШ1 - глюкозо-зависимый белок человека; Н37САЕЕ - Н8Р70 Са»погЫлЬ(И Не о1«вапв} НБ70МА1- НБР70 кукурузы; Ш72ГО0 - НБР70 югоеорши тв1апойав1вг. Последовательности белков семейства НБР70 получены из банка данных Б*1ББГК0Т (выпуск 12).

все восемь корсервативных сегментов, обнаруживаемых в белках семейства HSPîo (Ting & Lee, 1988), сохраняются и в последовательности 65К белка. Все эти сегмента локализуются в пределах N-концэвых 450 аминокислот 65К белка ВЖС и HSP70 белков; Это хорошо согласуется с, результатами chappel et ai., (1986), в которых сообщается, что АТФазная активность одного из белков семейства • HSP70 - АТФазы из мозга бьта, ассоциирована с этой областью белка. Кроме того, данные рентгеноструктурного анализа комплекса этого фрагмента с АДФ указывают на наличие сходства четвертичных структур белков теплового шока Й5Р70 с гексокиназами.. Более того, консервативные остатки Авр(Ю) и 01и(175) окружают р-фосфат АДФ, что указывает на вовлечение этих аминокислот в гидролиз АТФ (Flaherty et ai., 1990).. Эти два остатка, Авр(ю) и 0lu(i75), находятся в сегментах А и в и консервируются в последовательности 65к белка (Рис. 6); тем не менее, следует заметить, что значение этих, остатков в определенной мере остается не ясным вследствие замены Glu на 01у в последовательности белка МТР70ТО. Особый интерес представляет сегмент с, содержащий протяженный блок. консервативных аминокислот. Организация . этого ; сегмента - блок гидрофобных аминокислот, за которым следует петля, богатая остатками Gly, напоминает . структуру различных нтф-связываюйгах сайтов (Moller & Animons, 1985! Hanks et aî., 1988; Gorbalenya & Koonin. 1989). Было предложено, что- этот сегмент родственен консервативному АТФ-связывагадему мотиву киназ. Таким, образом, можно предположить, что 65К белок'ВЖС является АТФазой и по аналогии с НТФазами гордеи- и потексвирусов, которые имеют иное происхождение (Petty & Jaokeon, 1990; Beok et al., 1991; Oorbalenya st ai., Í988), может быть вовлечен в транспорт вирусных нуклеопротеидов по растем. Кроме "того, 65К белок ВЖС подобно белкам HSP70 теплового шока может обладать шапе рогатой активностью (Pelham, 1989; Rothman, 1989), что подкрепляет предложенную гипотезу о возможной функции б5К белка.

0РС4 (нт 2576-4234) перекрывает предыдущую орсз на 92 нт и -последующую 0РС5 на 50 нт и кодирует полипептид с мол. весом 63931 (64К) (Рис. 2 и За).

0РС5 (нт 4185-4832) потенциально кодирует бэлок с мол. весом 24260 в случае, если трансляция начинается с первого AUG кодона, который имеет на оптимальное окружение (и в +4 и. А в -3 позициях) (Kozak, 1986). Контекст второго в рамка AUG кодона представляется

Солее благоприятным (G в +4 и -э позициях) (Рис. 2 и За). Результаты экспериментов по локализации инициаторного кодона гена 24К белка описаны в раздела "Экспрессия 24К белка ...".

ОРС6 (нт 4906-5517) отделена от ороз мехгенной областью длиной 70 нт, которая отличается высоким содержанием и (47*) и низким содержанием с и с (17 и 14%, соответственно) (Рис. г и За). Продукт 0pg6 идентифицирован как белок оболочки ВЖО, так- как его мол. вес (22200) и аминокислотный состав хорошо : согласуются с предшествующими данными (Табл. и Carpenter et ai., 1977; Short et mi., 1977). Некоторые различия в аминокислотном составе, включая

Таблица 1. Аминокислотный состав балка ободочки ВЖС

Амино Число аминокислотных остатков

кислота A В p

Ala 14 17 17

Arg 11 . ia 12

Asp 17 16 22

Glu 22 22 21 •

Gly 18 . 1? 21

Hie 5 5 6

lie 8 7 9

Leu 28 • 2§ 31

Lys 14 14 17

Met 0 " ■ ? 1

Phe 9 11 12

Pro 8 § . 8

Ser 17 n 21

Ihr 15 15' 17

Сув 7 3

Trp 0 p .0

Tyr 5- 4 Э

Val 5 7

Bc«ro 203 204

А, аминокислотный росред пробита 0PQ6 согласно компьютерному

ангцизу послвдовчтеШЙОТЯ Ш Bi В, шщдодотчнй состав

очищенного капсвднргр балка BIG по Carpenter pt (1977) and Short »< at.(1977), соответственно.

отсутствие мптионина, который обнаруживался в белке оболочки ВЖО и описан в более ранних работах (Carpenter et ai.. 1987¡ Short et-ai., 1977), могут быть объяснены штаммовыми различияш. Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории (Doija et ai., 1990), подтверждают эти расхождения. Так, продукты . трансляции in vitra денатурированной решшкативной формы (РФ), соответствующей мРНК белка оболочки, включали меченые по t14о] аминокислоты и осаждались антисывороткой к ВЖС, в та время как [35з]-матионин не включался в. искомый полипептид (не показано). Таким образом, . белок ■оболочки украинского изолята ВЖС не содержит мэтионин при условии,, что Н-концевой Mat элиминируется посттранслящюнно.

Компьютерный анализ позволил установить статистически значимое сходство белка оболочки с продуктом предшествующей ОРС5 - 24К белком. Последующий скрининг по банку данных swissPROT (выпуск 18) выявил еще один'полипептид, обнаруживающий заметное сходство как о CP ■ ВЖС, так и с 24К белком. Таким шлипептвдом оказался белок оболочки еще одного клостеровируса г- вируса тристецы цитрусовых (ВТЦ). Анализ конечного 'выравнивания втих трэх белков обнаружил ■ 23 консервативных аминокислоты; .в 31 позиции рыявлэны" функционально сходные аминокислоты (Рис. 7). Полученное выравнивание (Ьценивается статистически величиной ю.2 SD. Исходя из анализа этого выравнивания можно предположить, что 24К белок, в такае CP ВЖО- и ВТЦ структурно близки и обладают некоторыми общими свойствами. Действительно, почти все аминокислоты, которые, консервируются ь белках оболочки нитевидных (+)РНК-содержащих вирусов растений \ сохраняются также в 24К балке ВЖС, CP ВЖС и ВТЦ (Рис. 7). Консервативные аминокислота являются, главным образом, гидрофобт&м и, по-видимому, связаны с правильной укладкой белковых глобул. Две из 'трех аминокислот, которые консервируются в CP нитевидных РНК-содэржащих вирусов, Arg и Авр (Рис. 7) предположительно вовлечены в образование функционально значимого солевого мостика; эти аминокислоты также консервируются в 24К белке. Представленные

В нашей лаборатории было установлено, что белки оболочки нитевидных РНК-содэржащих вирусов растений составляют эболюционр.о ■ компактное семейство. В пределах етого семейства установлено существование двух родственных субгруш, в одной из которых наряду с потеке- и карлавирусами находится ЭДС.

консенсус + + + + + + +

ККС СР ( Э-193) А1АТ-ГЕГ^Б — ОТ С---ЬНаЕОСВКШОТРЕЕОЬКЬК—О'/РЕЛГЛ,

*• * *. *«; ; * . * * * * ;

ВЖС р24 (20-216) А1ШТР1Вта1АЕУЗЕтаРтШдаСЕГСЕШЗТ1КЕНГКЗЖ,-У1Т0Ш)Р . * * : * . * . * ; * *

ВТЦ СР (38-221) ТЫТ-МИЭУК-----0-----1йТасдаААШВС11Г1.ТЬК0КНРГ1ЪРИШК

консенсус ++ ++++ + +8 ' + + +•

ВЖС ОР С1АМЬСЬУБ0АТ1СТБ1ШШУдаТ8-ТР1КА5Ра00КЕХ,У1.ТН0ЕШ8Р-1Я30КЬ, *; ***** *** ; *** ;* * * } • ,

ИКС р24 таН1^АЬ1КААМ1ТТБУКТЫУТСАУ-ЕГГ1----СаКК-РШШЛЪ'-УТРЬГКЕСМ '

.****;•*.. ** * * * ;

ВГЦ СР ПГИАГ^МЪУКиАУКБЗБЬОЗСШАТСТТУТН----ЕауШЯВШЬИТППТМЗКО!!

1.1 * гх ! Т

консенсус ++ у + у + ку гсгу

ВЖС СР 1Л?-аКРЫК1ДСРСетГСЖ1)^1БиШ!^ЙСга,РР1АЛА-Ш10ХРАЕБ1Г/1ААПР15 *** .* ****• ' ** : : ** : * : *:* :*:***:: > ВЖС р24 ККРГШ,1\ГРУНТРСАТРЕПАУ1У1А1!ЕЬР-КЬ~ИЛНТ1СКН01Р50УЯРМ!АСРК *•*.*. * ; *; * * • * . *** ** .* *****

ВТЦ СР С--1гаТНА1Л?™сга;Ж)АЬУМРСКШШ-1Л£У0аНРЬВ-А01РА0УНУЬСАВР1,Т

е

консенсус : й ++ + + +

ВЖС СР ТЗТЕ-ИгадаБВЫЛА-НШАТНТЕРБВ-ЕЗРУТБХКОЬОНОЬО * * • ;* * * .**;;** ;*** *

ВЖС р24 АТЗУС1ХгаНЫи1УЬ0АЗНАА1БаАУ55БтасК1УБ№ШЯН-ЬЕ -* * *■*. »** ; ; ; * : : •**:

ВТЦ СР оас—хт1)ьесауух0а-)се0шашаав-;га'7т1т!ц1лк-рк

Рис. 7. Сравнение 24К белка ВЖС с белками оболочки ВЖС и ВТЦ. Выравнивание выполнено с помощью программы шугают (Coгpet, 1988). , Заглавные буквы обозначают аминокислота, которые сохраняются у 24К и балках оболочки всех нитевидных РНК содержащих вирусов растений. Прописные буквы - функционально близкие . аминокислоты ' белков оболочки нитевидных РНК содержащих вирусов растений. Плюс (+) -позиции копсервйтивных аминокислот,■ которые типичны для белков . оболочки нитевидных вирусов растений. Восклицательный . знак обозначает аминокислоты, которые предположительно вовлечены в образование солевого .мостика. Звездочки расположены между идентичными аминокислотами данного выравнивания,- а двоеточия -между функционально сходными аминокислотами.

результаты позволяют предположить, что 24к белок • сохраняет третичную структуру и . некоторне. свойства ср ВЖС, такие как способность формировать специфические частицы с рнк ВЖС. С другой

стороны, имеются убедительные доказательства того, что 24К белок на является компонентом, по крайней мера мажорным, вириона. Во первых,, анализ вирионных белков в полиакриламидном геле выявил единственный : полипептид, идентичный по электрофоретической подвижности . с продуктом клонированной ОРС6 (Carpenter et at., 1977; Karasev et ai., 1989), в то время как in vitra 24K и CP ВЖС легко разделимы . (Рас. 9). Во-вторых, аминокислотный состав ср ВЖС - продукта ОРСб, но не 24К, почти . совпадает о таковым, полученным при анализе шрионного CP ВЖС (Табл. 1). В-третьих, политональная, антисыворотка осаждает экспрессируемый in vitro op ВЖС (Рис. 9). ■

Приведенные результаты не исключают: возможности наличия ' минорных количеств 24К белка в вириона. Тем не менее, при условии,, что вирусные частицы нитевидных риЗовирусов. растений, по-видимому; состоят из белков одного типа, более привлекательной представляется альтернативная гипотеза о возможной, функции 24Х белка.. Можно предположить, что 24К белок экспрессируэтся на определенных стадиях; инфекции,, связывается с! вирусной РНК, формируя частица отличные от. вирионов, и таким образом обеспечивает транспорт вируса по растению (Atabekov & Dorokhov, 1984; Hull, 1989).

Эти данные представляют собой первое указание о.' дупликации цистрона белка оболочки у нитевидных РНК- содержащих вирусов. Две группы рибовирусов с икосаэдрическим капсидом - пикорна- и комовирусы, кодируют три и две копий белков оболочки, соответственно (Palmenberg, 1989; Stauifaohër et al., 1987). Тем не менее, существуют различия между этими примерами дупликации цистронов белков оболочки. Во-первых, у икосаэдрических вирусов копии белков оболочки присутствуют в внрионе в еквимолярных количествах. Во-вторых, ' сходство копий белков оболочки у. этих 'вирусов описано, главным образом, на уровне третичной структуры, в то время как сходство первичных структур, не сравнимо о наблюдаемым■ сходством меаду 24К и CP ВЖС.

Дупликация гена белка оболочки также установлена - у двухкомпонентных ДНК-содержащих геминивирусов, у которых продукт дуплицированного гена не является, компонентом генома (Kikuno et ai., 1984; Mohana Rao, 1935). Этот полипэптид, кодируемый ДНК 2, вовлечен в процесс передачи вируса белокрылками. Этот феномен, описанный у вирусов совершенно иного класса, обнаруживает заслуживающую внимания аналогию с примером дупликации гена белка оболочки у ВЖС, который передается тлями (Bar-Joeeph к Murant,

1982).

0РС7 перекрывает цистрон белка оболочки на 1 нт и 0РС8 на 23 нт. Мол. вес потенциальных продуктов 0РС7 (нт 5517-6056) и ороа (нт 6034-6564) составляет 20395 и 20534, соответственно.

3'-концевая некодирупцая область РНК ВЖС

Проксимальная Э'-концевая последовательность длинсй 86 нт была определена Аграновским А. А. методом химического секвэнирования. На-, основании этих данных был синтезирован праймер х и затем при помощи этого праймера был получен 3'-концевой клон рзб (Рис. 1), последовательность которого определялась по Sanger, .. (1977). Последующий анализ нукпеотидной последовательности РНК ВЖС позволил обнаружить З'-некодирующую, область длиной 181 нт, размер которой , обычен для (+)РНК-содержащих вирусов. В этой области много олиго(А) и олиго(и) блоков, что отражает высокое содержание' А+и в пределах 3'-концевых 90 нт [65%). Анализ вторичной структуры 3'-концевой области РНК MC с помощью программы Zuker & Stieg ter (19S1 ) выявил

Тт jT, Ac = -15.5 koal ббво- t - a

Т - А -6690

с - с т - а I - А i - а

Л I-í G l ¿G = -15.9 koal

л 's А С

, À - T A С -бтго

6670- À - T С - С

a - i с - g

а -t g-c.

A - Г -6700 A - T С - G 6710- T - A G-C С - G

Г - A С - G

5, g - с . „ t - a /б73° /67ло t /GAA a ^ . AGAAAAAATAACGGGCCC-OH

: 6660 '

Рис. 8. Модель вторичной структуры 3'-концевой области РНК КЕС. Построена с помощью программ zuker & stiegier (1981 )v Нумерация нуклеотидов начиная с 5'-конца .устаповлоннай когввдотштедызоо-п' ДЛИНОЙ 674б НТ.

две стабильные шпилечные структуры (Рис. 8). Первичная и вторичная структуры, так ке как и отсутствие аминоацилирования и аденилирования РНК ВЖО tn. vitro (показано Аграновским А. А.), указывают на отсутствие тРНК-подобной структуры в геноме BSG. Таким образом, BSC напоминает (+)РНК-содеркащие, которые не содержат ни поли(а), ни тЕНК-подобной структуры, такие как илар- (Корег-ZwarthoiX et al., 1979), кармо- (Guillsy at al., 1985), ТОМбус-(Roohon Sc Trema in, 1989), ДИЭНТО- (Lomrnel et el., 1988), ЛЮТ80-(»iller et al., 1988) И СОбвМОВИрусЫ (Wu et al., 1987). ИНТврвСНО, что сходная организация З'-некодирувдвй области - наличие двух стабильных шпилек (Рис. 8), описана для диантовируса некротической мозаики красного клевера (Lomrael et ai., 1988). Такие шпилечпые структуры, по-видимому, служат специфическими сайтами: узнавания вирусных решшказ по аналогии с аминоацилируемыми 3' -концевыми последовательностями РНК-содерващих вирусов растений (Bujareky et al., 1986» Dreherei al., 1984).

Экспрессия 24K и белка оболочки BIG tn. uctro.

С целью изучения экспресии продуктов орс 5 и 6 были сконструированы рекомбинантныа плазмида рВУ24 и pBYCP, соответственно. (УЗе плазмида содержали полные последовательности - соответствующих генов и были встроены под промотор фага Т7. После транскрипции полученные РНК транслировались в бесклеточвых системах Кребс-2 и лизатах ретикулоцитов. Анализ продуктов трансляции:выявил два полипептида с мол. весом 22 (р24) и 24 (ср) кДа, соответственно. Белок оболочка

В4К- .„.■:

В7К •■

Рис. 9. Анализ продуктов трансляции с» ьиго в системе Кребс-2 Т7 транскриптов линеаризованных гхлазмид рВУ24 и рВУСР (дорожки 1 и 3, соответствепно). Иммуно-преципитация продуктов трансляции соот-^ ветствуицих РНК транскриптов с специфической к белку оболочки ВЖС внтисцворот-кой показана на дорожках 2 а 4, соотв.

*ак . эок-

тш «И»

аалк

1В а .4

ВЖС осаждался антисывороткой к ВЖС (Рис. 9). Слабая иммунопреципитация 24К балка объясняется его высоким сродством к нормальным глобулинйм сыворотки (не показано). Данные результаты хорошо согласуются с нашими предшествующими данными по трансляции in vitro ВЖС-специфических дцРНК длиной 2.7 и 1.6 тыс. пар оснований (Doljá et ai., 1990). CP . BIC, мол. вес которого составляет 22.2 кДа согласно оценки кодирующей емкости 0РС6, по-видимому, обладает аномально низкой подвижностью в системе' Трис-глицин-SDS (Рис. 9).

В 5'-проксимальной области 0РС5 (р24) обнаруживается два aúg кодона, причем второй имеет более предпочтительный контекст. С целью локализации ' инищаторного кодона был синтезирован олигонуклеотид (Боб), комплементарный часта мРНК 24К белка между ( Первым и вторым AUG кодонами. При трансляции т vitro в системе Кребс-2 соответствующего транскриптв вместе с олигонуклеотидом Do6 обнаруживался полипептид с мол. весом около 20 кДа. Это свидетельствует, что синтез 24К белка, по крайней- мере tn vitro, инициируется с 5•-проксимального AUG кодона 0РС5. Добавление олиго-Воб, по-видимому, приводит к разрезанию соответствующего транскрипта эндогенной РНКазой н и появлению укороченного продукта (20 кДа) в соответствии с последовательностью РНК ВЖС (не показано).

Экспрессия ОРО 2-8, по-видимому, связана с синтезом ряда сгРНК. (оц) и (дц)РНК, соответствующие, по крайней мере, пяти из них, выявлены в инфицированных ВЖС растениях, . включая мажорную' сгРНК для бежа оболочки (Dolja et al., 1990).

■ Общая организация секвенированной части генома ВЖС позволяет сделать предположение о существовании трех геномных модулей, которые отделены друг от друга не .структурированными межгенными учзстками: 1) геномный модуль, содержащий. РНК зависимую РНК полимеразу (850к); 2) геномный модуль, содоржащий 6.4K-65K[hsp70.-гомолог (АТФаза?)]-б4К- 24К блок генов; и 3) СР-2СЖ-21К генный модуль (Рис. 10). При этом генный модуль 1), по-видимому, вовлечен в репликацию РНК ВЯС; генный модуль £)- в транспорт вируса по растению; и, наконец, генный модуль з) связан с образованием вирионов и переносом вируса тлями. Подтверждение этой гипотезы требует дальнейшей эксперимонтельной работы, которая продолжается в нашей лаборатории.

250К? __ 65К 24К 20К

рнквжс CZZZZZZZZ ?о1 I )hsp7öh \ в4к j ~l22kj 121К

6.4К

Рис. ю. Гипотетическая генетическая карта генома ВЖС. Соответствующие гены показаны прямоугольниками.' Pol, РНК полимераза; нзр70н - гомолог белков теплового шока семейства hsp70; СР - бэлок оболочки. N-концевая часть РНК полимеразы, последовательность которой не установлена, показана прерывистой : линией.

Ряд данных, как полученных ранее, так и отраженных в этой работе, такие как наличие 5'-концевой кэп-структуры, стратегия экспрессии генома (Karasev et ai., 1909), филогенетическое родство РНК полимераз ВЕС и трикорнавирусов свидетельствуют; что вирус желтухи сахарной свеклы, несомненно, является представителем супергруппы альфа-подобных РНК-содержащих вирусов.

ВЫВОДЫ

1. Клонировано около половины генома ВЖС с 3'-конца РНК; определена первичная структура РНК ВЖС длиной 6746 нт.

2. Компьютерный анализ выявил восемь открытых рамок считывания* нвзавэршеная ОРС 1, ОРС 2 (кодирует 6.4 кДа белок), ОРС Э (65 кДа), ОРС 4 (64 кДа), ОРС 5 (24 кДа),. ОРС 6 (белок оболочки), ОРС 7 (20 кДа) и ОРС 8 (21 кДа).

3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей кодируемых белков позволил установить:

а) незавершенная 0РС1 представляет с-концевуго часть вирусной РНК полимерззы, родственной РНК полимеразам трикорнавирусав

О) ОРС 2 кодирует белок С мол. весом 6.4 кДа, обнаруживающий сходство с мембрано-связыввющимк транспортными 12-14 кДа бежали потеке- и карлавирусов

в) уникальной особенностью генома ВЖС является присутствие гея а бг> кДа бежа - прямого гомолога балков теплового сока семейства НЗР70

г) впервые выявлена копия гена белка оболочки в геноме нитевидного РНК-содеркащего фитоЕируса

4. В Оесклеточных системах экспрессированы 24 кДа к белок

. оболочки. ВЕС; локализован щшцяаторшй кодой цистрона 24 . кДа балка.:

5. На основании полученных данных вирус желтухи свэклы, несомненно может быть отнесен к альфа-подобным РНК-соде расащин вирусам..

Основные результаты диссертации изложены в сладувда.

публикациях:

1. Agranoveky, A. A., Boyko, V. Р., Катаевv, А. V., Lunina, N. A., Koonin, Е. V. and Dolja, V. V. (1991) Nuoleotlde eequenoe of the 3' terminal hall of beet yellows olosterovirus RNA genome: unique arrangement of eight virus genes, jr. Gen. Virol.72, 15-23.

2. Agranoveky, A. A., Boyko, V. P., Karasev,- A. V., Koonln, В. V. and. Dolja, V. V.(1991) Putative 65 kDa protein of beet yellows olosterovirus is a homologue of HSP70 heat shook proteins. J. Uol. Btol. 217, 603-610.

3—Dolja, V. V., Boyko, V. P., Agranoveky, A. A., and Koonin, Б. V. (1991) Phylogeny of oapeid proteins of rod-shaped and filamentous plant RNA viruses:. two families . with distinct patterns of sequence and probably etruoture conservation. Yirology, 184, 79-86.

4. Boyko, V. P., Karasev, А; V., Agranoveky, A. A., Koonln,..' E. V., . and Bolja, Y. V. (1992) Coat protein gene duplication in a filamentous RNA virus 'of plahts. Proo. Natl. load. Sol. USA, 89,

?Ш;Т)Щ.ВйР. Зав J631.Тяр. 100Vi.09.92. Веоялггио.