Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии и биохимических свойств шапероноподобного 65К белка, закодированного в геноме клостеровируса желтухи свеклы

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии и биохимических свойств шапероноподобного 65К белка, закодированного в геноме клостеровируса желтухи свеклы"

московский государственный университет имени М.В.ломоносова

' " биологический факультет

1 1 MAP Ш»

На правах рукописи

фолимонова (никифорова) Светлана Юрьевна

- изучение экспрессии и биохимических свойств шапероноподошого 65к белка, закодированного в геноме клостеровируса желтухи свеклы

03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кавдвдата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор И.Г.Атабеков доктор биологических наук А.А.Аграновский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологически наук Ю.Л.Дорохов член-кор. РАМН, профессор Н.В.Каверин

ВЮТЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и

Ю.А.Овчинникова

на заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический

С . диссертацией можно ознакомиться в 'библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится

1996 г. в

факультет.

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь ,• Специализированного совета, кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование структуры и особенностей выражения вирусных геномов, а также сравнительное и функциональное изучение кодируемых ими белковых продуктов являются в настоящее время основными направлениями молекулярной вирусологии.' Знание первичной структур! вирусных геномов позволяет построить модель их организации и экспрессии, выдвинуть обоснованные гипотезы о функциях кодируемых полипептидов и, в сочетании с широким спектром генно-инженерных подходов, проводить исследования отдельных белков. Кроме того, сравнительный анализ структуры генома и последовательностей вирусных белков дает возможность судить о филогении рирусов и • путях их эволюции. Изучение молекулярной биологии вирусов растений имеет также большое практическое значение, • поскольку знание тонкой структуры вируса и механизмов его взаимодействия с щюткой-хозяином являются основой для разработки эффективных »•годов борьбы с вирусными заболеваниями сельскохозяйственных культур. .

РНК-содержащие вирусы характеризуются исключительным разнообразием вариантов организации и экспрессии генома. Вирусы растений с позитивным РНК геномом составляют более 80*-известных (итовирусов, включая возбудителей заболеваний' многих экономически важных растений. Вирусы данного класса представляют дабой удойную модель для изучения механизмов взаимодействия гномов патогена и хозяина, а также принципов устройства, шражения й эволюции РНК геномов вообще. Особенностью вирусных ;+)РНК геномов является многообразие способов их экспрессии при йбольшом размере и кодирующей емкости, а также высокая скорость ®олюции, -.' одним из ключевых факторов которой считается перетасовка генов" с помощью рекомбинации РНК (Morczov et ai., 989). . ;

Семейство ciosteroviridae объединяет ' около 20 *)РНК-соДержащих вирусов растений, обладающих целым рядом труктурных и. биологических особенностей. Так, клостеровирусы меют сверхгибкиа.нитевидные вирионы, которые содержат молекулу еномной РНК очень большого размера, до 15-20 тысяч вуклеотвдов.

отличиё от всех других известных вирусов растений с ктевидными частицами, инфекция которых не обладает ткансзнм

тропизмом и которые либо не имеют природных переносчиков, либо переносятся насекомыми-векторами неперсистенгно, клосгеровирусы вызывают флоэмно-ограниченную инфекцию в зараженных растениях и переносятся векторами лолуперсистентно. Нельзя исключить, что эволюционная адаптация клостеровкрусов к той специфической экологической нише, которую они. занимают, сопровождалась приобретением новых функций, закодированных в больших РНК геномах. Интерес к данному вирусному семейству продиктован также практическими целями сельского хозяйства: многие клостеровирусы являются опасными возбудителями заболеваний сахарной свеклы, винограда и цитрусовых.

Объектом настоящей работы является вирус. желтухи свеклы (ВЖС), типовой представитель рода ciosterovirus. 'семества Closteroviridae (Dolja et al., 1994). ВЖС передается ТЛЯМИ полуперсистенгнш способом и в экспериментальных условиях поражает более 100 видов растений из 15 семейств. Частицы ВЖС обладают спиральным типом симметрии,' имеют длину I250-I45Q нм и состоят из одной непрерывной молекулы РНК и примерно 4000 белковых СУбЪеДИНИЦ (Bar-Joseph and Hull, 1974,- Carpenter et ai., 1977). К моменту начала выполнения работы была определена ■полная нуклеотидная последовательность РНК ВЖС и предсказано существование девяти открытых рамок.трансляции (ОРТ), кодирующих целый ряд уникальных белковых продуктов (Agranovsky et al., 1991; Agranovsky et al., 1994; Boyko et al., 1992). В ЧЭСТНОСТИ, с помощью компьютерного анализа было обнаружено близкое родство аминокислотных последовательностей гипотетического 65К белка BSC (продукта ОРТ-3) а клеточных белков теплового шока' семейства hsp70 (Agranovsky et ai., 1991). Впоследствии гены гомологичных 65К белков были обнаружены в геномах еще нескольких клостеровирусов; таким образом, уникальный ген гомолога HSP70 можно считать характерной чертой данного вирусного-семейства

(Klaassen et al., 1995). .

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение биохимических свойств иапероноподобного 65К белка BSC. В ходе исследования решались следуигае задачи: ;

- экспрессия- полноразмерного 65К белка ВЖС к его фрагментов в бактериях и. получение препаратов нативного белка в чистом виде I ■ ■

- получение политональной антисыворотки, специфичной к

S5K, и тестирование синтеза вирусного бедка в зараженных ВЖС растениях,- изучение АТФазной активности и картирование АТФазного цомена в молекула 65К с помощью делеиионного анализа!

- исследование взаимодействия 65К с белковыми субстратами (синтетическими пептидами и денатурированным балком) in vitro.

Научная.новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе'впервые была осуществлена экспрессия юлноразмэрного 65К Ж и его фрагментов в штаммах в.coli, получены препараты гативного растворимого белка и антисыворотка к с-концевой части 55К. С помощью антисыворотки, специфичной к уникальному жонцевому фрагменту, белок 65К был идентифицирован в ¡араженных растениях. С использованием полученных препаратов ¡чищенных рекомбинантных 65К и его фрагментов впервые была продемонстрирована ■ магний-зависимая АТФазная активность [одноразмерного 65К белка ВШС, а АТФазный домен картирован в i-концевом . 40К фрагмента вирусного белка. Показано, что, в 1тличиэ. от клеточных белков hsp7o, 65К не взаимодействует с is специфическими белковыми последовательностями.

Таким образом, в работе впервые доказывается экспрессия !апероноподобного белка ВЖ! в растениях и дается характеристика го биохимических свойств in vitro. Результаты могут иметь прадэленное практическое значение для дальнейшего Изучения рпнцшов функционирования вируаш белков-гомологов 'hsp70 при лостеровирусной инфекции.

Апробация работы состоялась на семинаре каф. вирусологии ГУ 24 апреля 1995 года.

■ 'Материалы исследований докладывались .на меадународной энференщш "Фундаментальные и прикладные аспекты в иовирусологии" (Ялта, 1994), на международном симпозиуме Молекулярные ответы растений на биотические и абиотические грессовые воздействия'* (Хельсинки, 1994), на III Российском шюзиуме "Новые метода биотехнологии растений" (Пущино , 1995), з меадународном симпозиуме "75 лет исследованиям в области «опатологии и устойчивости в Ашерслебене" (Ашерслебен, 1995), такяи на лабораторных семинарах НИИФХБ им. А.Н.Белозерского.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора гтературы, материалов и. методов, результатов и обсуждения, гводов и списка цитированной литературы.

з

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Клонирование рекомбинантного 65К и его фрагментов

В настоящей работе были получаны генные конструкции на основе экспрессионных векторов серии р<зе (01адеп), содержащие кассету последовательностей промотера фага тб, синтетического участка для связывания рибосом, короткой ОРТ, кодирувдей пептид меъ-иа-зду.-8ег-бхн1в, и полилинкера (Рис.1 А,Б). . Продукты генов, вставленных в полилинкер в рамке с короткой векторной ОРТ, должны экспрессироваться с н-концевым (в случае ¿Ое-60 - с с-концевым) довеском, включающим Последовательность из 6 гисгидинов, что позволяет очистить рекомбинантный белок с помощью афйшной хроматографии на щ-ыта агарозе (косьин еь

а1., 1988).

А г-

■ -ГТ5 Б ;

Рис.1. (А) Схема строения векторов ров 9,11,30.

(Б) Схема строения вектора ров-бо. нвэ - сайт

связывания рибосомы, ♦ - инициаторный кодон, б*н!а

гексагистидиновая последовательность, —.. -

терминирующий кодон. ч •

Последовательность гена 65К вмшшфицировалась .р"-помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с двумя специфическими затравками олиго65(+) и олиго65(-), комплементарными концам кодирующей последовательности (Рис.2), на матрице•• кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции РНК ВЖС с олиго65(-) (Никифорова н др., 1995). Подученный продукт" дотировали е плазмиду рвЕмз (Ргошеда) и использовали для трансформация компетентных клеток е. сои хь-1. Этот этап был необходим да создания нужной конфигурации сайтов рестрикции в левой часта вставки. Далее из этих вставок вырезали нхпаш 'фрагмент I

p65Nco,

ОДР

pS5-pTZ19

У H

н[

65(+) v 65(—)

pTZ-p65Nco

S. .Е

H-BfWf"

I

• pQE-N6Hp65 H

ИЕнНИ^ЧЖ

S. .В

s. .н

6xHis

atg aga gga tcg[ m r g s

jgga tcc cct cgt gcc ATG GTT GTT gapraMVV-

' Рис.2. Схема клонирования гена 65К ВЖС в экспрессирующий вектор. Клонированный в плазмиду продукт ГЩР, полученный с. затравками олиго65(+,). и олиго65(-) (-» и на схеме), выделен штриховкой. Восклицательными знаками отмечены инициаторше кодоны в гене 65К и в последовательности короткой ОРТ в векторе рОнэ. тэ-рг - промотер фага тэ,- rbs -синтетический участок присоединения рибосом,-B,E,H,N,S - сайты рестрикции BamHI, EcoRI, HindiXI, Ncoi, sali в полилинхерах плазмид и вирусной последовательности. Внизу показан фрагмент нуклеотидной последовательности ОРТ экспрессирующей плазмиды pQE9-N6H65K, кодирующий первые 18 N-концевых аминокислот рекомбшантного 65К. Прописными- и заглавными . буквами обозначены, соответственно, вектор-специфические и вирус-специфические триплеты-и аминокислоты. Последовательность шести гистидинов показана в виде прямоугольника (6xHis).

агировали его В плазмиду р65-рТ219 (Кагаееу et а1., 1992), из эторой нхпаш фрагмент удалялся. В результате был получен клон гг-рб5ысо (Рис.2). При данной схеме использование продукта ПЦР соторая часто вносит мутации в амшшфицированную )Следовательность) . для получения полного гена 65К ■■рани читалось коротким Мпспп фрагментом. Секвенирование жазало идентичность этой части вставки соответствующей юледовательности генома ВЖС (Адгапслгзку еъ а!.. 1994).

Экспрессирующая конструкция рОЕ-ыбНрб5 (Рис.2), несущая полноразмерный ген вирусного 65К, а также последовательность из 6 гистидинов на к-конце, была получена клонированием вставки ртг-рб5Ысо в векторе ров-э. Схема клонирования фрагмента гена 65К, кодирующего неконсервативный с-концевой домен, основывалась на том, что последовательность ОРТ-3 . содержит уникальный рестриктный сайт БаиЗа, разделяющй области гена,, кодирующие высоконсервативный ы-концевой домен (52К, 482 аминокислотных остатка) и неконсервативный с-концевой сегмент 013К, 116 остатков) (Рис.3). Фрагмент Баиза-заи клона ртг-рб5ысо вставлялся мевду соотвествующими сайтами полилшпсера ■'•' плазмвды

N

B-t

Sea _I_

Xho _t_

Sau Xho _1_L_

>s

65(+)

65(-)S 65(-)Bg

PQE-N6H52K

pqe-N6H40K

PQE-N6H13K

pQE-N6H35K

Рис.3. Схема расположения сайтов рестрикции в гене 65К БЖС (широкий прямоугольник), клонированного В ЭСПреССИруЮЩИХ ВеКТОраХ pQE-N6Hp65 И pQE-p65C6H. Узкими прямоугольниками показаны фрагменты гена, использованные для получения конструкций, экспрессирующих укороченные версии 65К. Сайты рестрикции: В, BamHI; Bg, Bglll; N, Mcol; S, Sali; Sau, Sau3a( Sea, Seal; Xho, Xhol. Стрелки указывают позиции цраймеров, применявшихся для реакции ПЦР, с введенными сайтами рестрикции. ■

pQE-ii в рамке со- стартовым äug кодоном короткой ОРТ вектора (конструкция pqe-N6H13K). Аналогичным- образом, -фрагменты BamHi-xhoi и BamHi-scai исходного клона pTz-p65Nco клойировали в векторе pQE-ЗО ДЛЯ получения конструкций pQE-NSH40K и pQE-N6H35K (Рис.3). Результирующие конструкции несли вставки, -кодирующие N-концевые фрагменты 65К с размерами 40К (363 остатка) и 35В (317 остатка). Эти фрагменты содержали лишь часть- доменов, консервативных у 65К И белков HSP70 (Agranovsky et al., 1991а,-Bork et al., 1992). Так, у 40K была делегирована вся .с-концевая

еконсервативная часть и консервативный домен connect i, а в елке 35К, кроме того, отсутствовал консервативный домен denosine (Рис.4).

|-> p65N6H,52K,40K,35K

mrgshhhhhhgspraMWFGLDFGTTFSSVCAYVGEEbYLFKQRDSAYIPTYV ИМЯ! PHOSPHATE 1 ИЩ Up65C6H

FLHSDTQEVAFGYDAEVbSNDLSVRGGFYRDLKRWIGCDEEMYRDYLEKLKPH YKTELLKVAQS S KSTVKLDCY SGTVPQNATLPGLIATFVKALISTAS EÄFKCQ CTGVICSVPANYNCLQRSFTESCVNLSGYPCVYHVHEPSAAALSACSHIKGAT

— CONNECT 1 ■•

SPVLVYDFGGGTFDVSVISALNNTFWRASGGDMNLGGRDIDKAFVEHLYNKA

[РЗД PHOSPHATE 2 РЯЩ QLPVNYKIDIS FLKESLSKKVSFLNFPWSEQGVRVDVLVNVSELAEVAAPFV

ertikivkevyekyc'ssmri.epitvkakllmvggssylpgllsrlssipfVdec

35KJ ADENOSINE gg^g?

LVLPDARAAVAGGCALYSACLRIJDSPMLLVDCAAHNLSISSKYCESIVCVPAG » CONNECT 2 ——- '

. 40k«j , ' ■

. S PI PFTGVRTVNMTGSNASAVYSAALFEGDFVKCRLNKRIFFGD WLGNVGVT GSATRTVPLTLEIHVSSVGTISFSLVGPTGVKKLIGGNAAYDFSSYQLGERW 52K«J UN-mgrshhhhhh-13K

ADLHKHNSDKVKLIHALTYQPFQRKKLTDGDKALFLKRLTADYRREARKFSSY DDAVLNSSELLLGRIIPKILRGSRVEKLDVrshhhhhh p65N6K«J p65C6H<J

Рис.4. Аминокислотная последовательность • 65K ВЖС. Стрелками обозначены фрагменты -65К, экспрессированные в ■ векторах серии ' pqe. Консервативные аминокислоты в 65К и в белках hsp7o выделены жирным- шрифтом. . ■ Положение пяти • консервативных мотивов, выявленных .в N-концевых доменах hsp70, гексокиназ, актина и 65К показано. по Bork et al. (1992).

Стратегия получения рон.-рбэсбн и • pQe-n6H52k, спрессирущих полноразмерный 65К с 6 гистидинами на -с-конце и ороченный с с-конца фрагмент 65К размером 52К (482 инокислотных остатка) с 6 гистидинами на ы-конце, отличалась вышеописанной для остальных клонов. Ис;:одвый клон pTZ-pssNco

использовался для ППР-амплификации с позитивным праймером олиго65(+), комплементарным началу кодирующей последовательности вставки, и одним из негативных праймеров, олиго(-)Вд1 или oJmro(-)Sai (Рис.3). Продукты ПЦР обрабатывались рестриктазами и датировались в плазмиду pgem-з между соответствующими сайтами полилинкера. Эти цромевуточные конструкции (pgem-p65 h'pgem-52k) использовали для трансформации клеток е. coi i штамма xl-i. Экспрессирущие плазмида pQE-p65C6H и pqe-N6H52k были получены клонированием вставок из этих промежуточных конструкций в векторах pqe-6o и pqe-'э. • , ,

2. Экспрессия и очистка рекомбинантных балков

Экспрессирущие КОНСТРУКЦИИ pQE-N6HpS5, PQE-P65C6H, pqe-N6HS2K, pqe-N6H40K, pQE-N6H35K И PQE-N6H13K ИСПОЛЬЗОВаЛИСЬ

для трансформации клеток e.coií штаммов mis и SG13009, содержащих репрессорную плазмиду pREP4. Эта плазмида кодирует белковый репрессор, в отсутствии - индуктора (изопропилтиогалактозида, МИТ) подавляющий транскрипцию с ts промотера .плазмвд pQE, что способствует росту продуцентов на жидких средах и значительно повышает выход экспрвссируемого •бежа.

Уровень экспрессии белков 52К, 40К, 35К и I3K' в. клетках e.coií, несущих рекомбинантные плазмида, после индукции ИПТГ составлял 15-20% от общего количества белка в бактериальных клетках (Рис.5). Уровень экспрессии рекомбинантногр • 65К был существенно ниже, 1,5-2% (результат не показан).

Лизис клеток и последующая очистка рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на ni-ota агарозе осуществлялись двумя методами: в денатурирующих условиях (в присутствии 6Ы гуанидингидрохлорида и 8М мочевины) или в нативных условиях (лизис клеток с помощью ультразвука с последующей хроматографией при повышающейся концентрации имидазола). Известно, что в нейтральной и слабощелочной среде белки, содержащие гексагистндиновую последовательность, задерживаются на ní-эта колонке вследствие образования хела^ного комплекса Между ионом Ni2' и двумя соседними гистидинами полипептида. В кислой среде (или при повышении концентрации имидазола в растворе) хелатный комплекс разрушается. Таким образом, варьируя состав элюирующего

буфера, молено избавиться от баластных бактериальных белков и получить гомогенный препарат рекомбинантного белка (носыи ей

а1., 1988),

М 1

97 —

68 — , 55 43 40

п ус.яя»

л *Ч

31-

и

22

~ (7

О

2

Бис.5. Эяекгрофораграмма рекомбинантного ' 52К белка, экспрессированного в клетках е.сои (12/5% денатурирующий, ПААГ), Дорожка м, маркерные белки с . указанными мол. весами в килодальтонах,• х, суммарный белок из нешдуцированных клеток с плазмидой рое-шнзгк,- 2, то же после 1шдукции I мМ ИПТГ.; з, рекомбинантный 52К после очистки на ш-итд-агарозе.

При использовании "денатурирующего" метода . возникает необходимость перевести рекомбинантный белок в физиологический буфер, . не содержащий мочевины, и вернуть ему нативную конформацшо. Прямой диализ денатурированного 65К против буфера, не содержащего мочевину, ■приводил к выпадению значительного количества рекомбинантного белка в виде осадка. Поэтому в ходе дальнейшей работы для рефэлдинга наш использовался градиентный диализ, в процессе которого 8М мочевина постепенно замещалась буфером, содержащим неионный детергент (тмееп), ЭДТА, меркаптоэтанол и 1М хлорид натрия.. Эти.: методом нам удалось получить высокоочищенные препараты растворимых рекомбинантных

белков 65К (с 6 гистидинами на ы-концэ и на с-конце), 52К, 40К, 35К и 13К,- их молекулярные веса, по данным определения в полиакриламидном геле (ПААГ), хорошо соответствовали ожидаемым значениям (Рис.6),

М 1 2 3 4 5 в М

еаа . ©

31- '.*■?:

«ига. 3

Рис.6. Электрофореграмма препаратов

хроматографически очищенных Ъекомбинзнтных белков (15% денатурирующий ПААГ). Дорожка м, маркеры с

указанными МОЛ. ВесаМИ; 1, Ы6Н-65К,- 2, 65К-С6Н; з, 52К; 4, 40К; 5, 35К; б, ХЗК. ,

Рекомбинантные белки Ыбн-65К и 65К-С6Н, , выделенные в нативных условиях (без применения гуанидинтидрохлорида ж мочевины), также давали при электрофорезе в ПМГ гомогенные зоны, соответствовавшие белкам с мол.весом 65К (результат не показан). Фрагменты 65К выделить в нативных условиях не удалось,-вероятно, высокий уровень их экспрессии в клетке (по сравнению с полноразмерным 65К) способствовал образованию телец .включения, содержащих нерастворимый рекомбинантный белок.

Полученные препараты были использованы для дальнейшего тестирования биохимических свойств • 65К ВЖС. . Очищенный рекомбинантный белок 13К использовался также для .получения кроличьей антисыворотки к с-концевой части 65К ВЖС.

ю

3. Идентификация 65К балка в зараженных вирусом растениях

Поскольку кг-коншвая последовательность 65К Оелка гомологична таковой в белках семейства нбр70, для идентификации 65К в ' зараженных растениях мы использовали поликлональную антисыворотку к уникальной с-концевой части вирусного бежа (АС-1ЭХ).

■■'■•; Балки. .' выделенные из зараженных ВЖС и здоровых растений Те1гадат>1а еграпэа, подвергались электрофорезу в денатурирующем полиакриамидном геле и переносу на ' нитроцеллюлозную . мембрану, которая обрабатывалась Ас-13К и затем антикроличьим коныогатом с щелочной фосфатазой.-Параллельный блот проявлялся преиммунной сывороткой, которая давала очень низкий уровень фоновой: реакции с. растительными белками и не выявляла зон, специфичных для' 'зараженных вирусом растений (не показано). Четкая мажорная зона, соответствующая бежу с молекулярным весом около 65К, выявлялась только среди бежов- из . зараженных растений (Рис.7). . Этот

Рис.7.. Вестерн-блот бежов из здоровых и зараженных ВЖС растений, проявленный с помощью • антисыворотки к с-концевому I3K пептиду 65К бежа ВЖС. Дорожка 1,- -белки из - здоровых растений т. expanse; 2, белки из зараженных ВЖС растений т. expansa; з, • белки из неинфицированного растения Nicotiana benthamiana.

2 3.

66К-1

результат подтверждает, что 65К белок (продукт ОРТ-3) действительно экспрессируется в инфицированных ВЖС растениях. На Вестерн-блотах белков из зараженных и здоровых растений Т.expansa, а Также здоровых растений Nicotiana benttiamiana, С помощью Ас-13К выявлялась мажорная зона, соответствующая белку с молекулярным весом около I40K (Рис.7). Происхождение этой зоны' остается неясным. Нельзя исключить (при условии, если эта зона не имеет артефактной природы), что она соответствует некоему клеточному белку, несущему общие эпитопы с с-концевым фрагментом 65К ВЖС. Вместе с тем, отсутствие заметной кросс-реакции Ас-13К с эндогенными белками hsp7o в дорожках белков из здоровых и зараженных растений (Рис. 7), по-видимому, указывает на отсутствие общих эпитопов в с-концевом домене 65К и бейках hsp70 хозяйской клетки.

4. АТФазная активность рекомбинантного 65К и его фрагментов. Картирование АТФазного домена '

АТФазная активность препаратов белка определялась в бесклеточной системе по их способности гидролизовать [у-32р]-АТФ; в качестве маркера подвижности неорганического •фосфата для тонкослойной хроматографии использовались пробы, в которых АТФ гидролизовался апиразой (serva). В ряде опытов в качестве положительного контроля использовался DnaK, бактериальный шаперон семейства HSP70 (препарат любезно предоставлен О.Н.Денисенко, Институт белка РАН, " Пуишо). Результаты, представленные в таблице I и на Рис.8 (дорожки 3, 4 и 7, 8), показывают, что полноразмерный 65К действительно обладает активностью магний-зависимой АТФазы in vitro',, характерной для белков hsp70 (Flynn et ai., i989).

АТФазная активность препаратов 65К в значительной степени зависела от метода их выделения и от положения вектор-специфической последовательности в • рекоыбкнзнткой белковой молекуле (Рис.9). Так, активность препаратов'.nsh-ssk и 65к-с6н, выделенных в присутствии денатурирующих агентов и подвергнутых рефолдингу, была существенно низке, чем у тех же версий рекомбинантного 65К, выделенных в-нагившх условия:! (Рис. 9). Этот эффект не был для нас неожиданным и он вполнё мог бы объясняться неполным восстановлением функциональной конфэрмации

Таблица I. АТФазная активность препаратов рзкомбинантного белка Ы6Н-65К"СИ (полученного в денатурирующих условиях) и ОпаК. Продукты гидролиза разделяли с номощью тонкослойной хроматографии, радиоактивные пятна проявляли авторадиографией, вырезали и просчитывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Цифры в таблице соответствуют значениям процента гидролизованного АТФ в каждой пробе. Пептид бацитрацин использовался в качестве субстрата для тестирования шаперошшх взазшодействий.

проба N-6H-65K DnaK

- .0,7% 0,5%

+ 5,0% 45,5%

+ +бацит-рацин 5,1% 31,0%

Рис.8. . Гидролиз [у-32р]АТФ препаратами рекомбинантного бежа ыбн-б5К"С" и DnaK. Продукты гидролиза разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и проявляли авторадиографией. Дорожки 1-е соответствуют следующим инкубационным пробам: 1, без добавления бежа,- z, с апиразой; з, с опак,- 4, с DnaK и 5 Mill MgClgi 5, с DnaK, 5 мМ MgClg И I MM

бацитрацпна/ 6, С Н6Н-65К"С"; 7, С N6H-65K"C" II 5 ММ MgClg; s, С N6H-65K'!C", 5 ым MgClg И i .мм

бацитрацина. Инкубационные пробы з-s содержали I икг соответствующего бежа. -

молзкул 65К при рефолдивге с помощью градиентного диализа. Еолее интересными представляются полученные нами данные . о влияний

положения векторной последовательности бхн1а в белковой молекуле на ее биохимическую активность. АТФазная активность препаратов Ы6Н-65К была заметно более низкой по сравнению с таковой у 65К-С6Н (Рис.9), указывая на негативное влияние я-концевой (в сравнении с с-концевой) вектор-специфической последовательности на правильное сворачивание или функционирование АТФазного домена

Рис.9. АТФазная активность препаратов различных версий 65К ВЕС и его фрагментов in vitro. Продукты .

гидролиза 1г-32р]АТФ в ■ стандартных.. инкубационных . . пробах, содержавших 0,5 мкг белка, разделяли • с помощью тонкослойной хроматографии, радиоактивные пятна проявляли авторадиографией, вырезали и просчитывали в жидкостном сцинтиллявдюнном счетчике. Обозначения: ыбн-б5К"н» и 65К-Сбн"нп - белки, выделенные в нативных условиях, n6h-65k."c", С6Н-65К"С", 52К"С", 40К"С" И' 35К"С» - беЛКИ,

полученные в денатурирующих условиях и затем "свернутые" путем градиентного диализа,- nrlwltg,

nllrltg, ndllltg и sngslqcric - линвйныв пвптиды в однобуквенном аминокислотном коде,- bacitracin ■ -циклический пептид бацитрацин. Колонки на диаграмме соответствуют значениям процента гвдролизованного АТФ в кавдой пробе.

65К. Таким образом, гетерологичная последовательность 6xHis в рекомбинантных белках не обязательно нейтральна по отношению к его биохимическим свойствам, как постулировалось в недавних работах (Janknecht et al., 1991; Restrepo-Hartwig and carrington, 1994), и ее положение на n- или с-конце молекулы следует учитывать при конструировании рекомбинантных белков.

АТФазная активность 65К ВЖС полностью сохранялась у его n-концевых фрагментов с молекулярными весами 52К и 40К, но не у ы-концевого 35К и с-концевого I3K фрагментов (Таблица'2, Рис.9; для I3K результат не показан).

Таблица 2. АТФазная активность препаратов рекомбинантных белков в процентах гидролизованного АТФ.

проба N-6H-65K"C" 65K-6H-C"C" 52К"С" 40К"С» 35К"С"

- Мд*+ 0,2% 0,5% 0, 3% 0,3% 0,5%

+ Mg¿+ 3,5% 9,5% 3,0% 5,5% 0,7%

, Таким образом,. проведенный нами делеционный анализ показывает, что АТФазная активность 65К бежа ВЖС связана с его консервативным n-концевым доменом, в соответствии со сделанными ранее предсказаниями (Agranovsky et ai., i99ia). Следует также отметить, что n-концевай часть 65К, как указывают• недавние результаты компьютерного моделирования (F.Rippman, персональное сообщение), вероятно, имеет общую пространственную структуру с таковой АТФазного домена клеточных hsp70, актина и гексокиназ. chappel et al. (1987) показали, что АТФазная активность цитозольного hsc70 ассоциирована с его n-концевым 44К фрагментом, полученным при расщеплении химотрипсином.'в нашей работе мы Дополнили эти результаты по картированию. АТФазного домена, получив фрагмент 65К с более обширнойделецией с-концевой области. Поскольку 40К полностью сохранял АТФазную активность, можно заключить, что часть- .консервативной последовательности ы-концевого домена (включая субдомен connect 2, который сохранялся в 44К фрагменте, полученном chappeii et al. (1987)) не существенна для АТФазной активности белков данного семейства, по крайней мере in ritro. Деления следующего консервативного мотива (adenosinb) в 35К фрагменте' (bo.rk et al'., 1992), приводила к полной утрате активности АТФазы (Рис.9).

5. Исследование ' взаимодействия 65К с белковыми субстратами (синтетическими пептидами и денатурированным белком) in vitro.

Способность . клеточных hsp7o взаимодействовать в АТФ-зависимой манере с различными пептидами и денатурированными белками была продемонстрирована для DnaK, многофункционального шаперона, кодируемого единственным геном hsp7o е. сои (Gragerov et ai., 1994), и для нескольких эукариотических представителей данного семейства (Beckmann et al., 1990; Flynn.et al. , 1989). Хотя белки HSP70 связывают in vitro некоторые аминокислотные последовательности лучше, чем другие (Fiynn et al., 19911 Gragerov et ai., 1994), эти взаимодействия в широком смысле можно рассматривать как •сиквенс-неспецифкчвские, поскольку индивидуальные шапероны способны взаимодействовать , :с широким спектром белков в клетке и. связываться со случайными синтетическими пептидами in vitro.

. Способность 65К ВЖС присоединяться к несвернутый белковым цепям была исследована ■ с помощью. хроматографии. - на колонке с ковалентго пришитым к сефарозе денатурированным белком в условиях, позволяющих избирательно сорбировать ' и затем элшровать белки HSP60 И »HSP70 (Sherman and Goldberg, 1S92; O.H.Денисенко, персональное сообщение). В нашем эксперименте, при хроматографии лизатов ретикулоцитов кролика на колонке с денатурированным овальбумином наблюдалась сорбция и последующая элюция буфером' с I мМ АТФ . эндогенного 70К белка, идентифицированного. как HSC70 ■ млекопитающих с" помощью моноклональных антител к белкам hsc70/72 (Рис.ЮА). В тех же =-условиях меченный s-метионином. 65К, - продукт трансляции Т7 транскрипта клона ркз-$5к в лизатах ретикулоцитов кролика, не. связывался с денатурированным овальбумином (Рис.ЮБ). ртсутствие связывания наблюдалось•' также при хроматографии .очищенного рекомбинантного К6Н-65К результат не показан). ■ ...

В следущей серии опытов. мы сравнили стимуляцию АТФазной активности очищенных белков 65К BSC и DnaK синтетическими линейными пептидами nrlwltg, nllrltg, kdllltg и sngslqcric ' (являющимися, как было показано ранее, эффективными субстратами, для клеточных шаперонов DnaK, BiP И HSC70; Flynn et al., 1989; Gragerov and Gottesman, 1994), И ЦИКЛИЧвСКИМ 'ПвПТИДОМ

М 1 2 3 4 J 5 6 b

92- — —

6 7— * * «ЗКЯ» -r^

43- ^S^

30-

с_____J.

Б

65 K-

Рис.10. Элзктрофореграмма фракций лизата ретикулоцитов кролика, содержавших- меченный

•эс

s-метионином 65К ВЖС, полученных в результате элюции с колонки с денатурированным овальбумином. (А) Денатурирующий 12,5% ПААГ, окрашенный Coomassie Blue, н, белковые маркеры мол.веса. Цифры указывают номера . фракций; справа от стрелки - фракции, элюированные раствором АТФ .(фракции 0Ч1щенных hsp70). ' (Б) Авторадиограмма того же геля. Стрелка указывает положение 65К белка, синтезированного in vitro.

(bacitracin, Serva); Все эти пептиды значительно стимулировали АТФазную активность юпак, взятого в качестве положительного контроля (Рис.9, Таблица 3). В частности, наш было впервые показано, что АТФазная активность клеточного шаперона может симулироваться как линейными, так и циклическими пептидами (Рис.8, дорожки 4 и 5, Таблицы I и 3); этот результат позволяет предположить, что вытянутая конформация белковой цепи не является обязательным условием для присоединения шаперона in vitro. В тех же условиях АТФазная активность 65К не изменялась при добавлении в реакционную смесь любого из этих пептидов (Рис.8, дорожки 7 и 8,- Таблицы I и 3).

Таблица 3. АТФазная активность препаратов рекомбшантных белков 65K-C6H"H", H6H-65K"H", N6H-65K"C" И DnaK В ПрОЦвНТвХ гидролизованного АТФ.

проба DnaK 65К-С6Н"Н" N6H-65K"H" N6H-6SK»C"

0,6% 0,9% 0,8% 0,4%

+мд*+ 23% 18,0% 9,5% 4,0% .

+Мдй++ SNGSLQCRIC 77% 16,0% - 4,0%

+Mg^++ NRLWLTG 59% 19,0% - ■3,5%

+Мд + NLLRLTG 52% 18,0% ' - . • 3,0%

+Мд^++ NDLLLTG 80% 19,5% - 4,0%

+мд^++ бацитрацин 82% 18, 5% 9,0% ■:з,8%

Результаты наших экспериментов по колоночной хроматографии и стимуляции АТФазной активности, очевидно, указывают на неспособность клостеровирусного 65К бежа взаимодействовать со случайными пептидными последовательностями, имеющими развернутую конформацию, что отличает 65К от его клеточных гомологов. Иными словами, с точки зрения субстрат-специфичности 65К не . является "шапероном" в классическом бначении этого термина, т.о.- "белком, связывающим полипептидные цепи" по определению Rothman (1989). Этот 'вывод согласуется и с тем обстоятельство^, что и аминокислотная последовательность,: и предполагаемая вторичная• структура с-концевой . части 65К- отличаются от таковых в пептид-связывающих доменах клеточных белков hsp?o (Agranovsky et • ai., 1991,- f.Rippmann, персональное сообщение).; ..

Неспособность 65K взаимодействовать in vitro , с бежовыми мишенями в АТФ-зависимой манере указывает на то, что вирусный, белок выполняет особую функцию, отличную, от функций клеточных шаперонов. В ранней работе высказывалась гипотеза об участии 65К ВЖС В межклеточном транспорте инфекции ВЖС (Agranovsky et al., 1991). Недавно было показано, что меченый 65К, синтезированный в лизатах ретикулоцитов кролика, способен . соосавдаться с микротрубочками из мозга быка, на основании чего было сделано предположение о вероятной связи транспорта клостеровирусной инфекции со специфическими взаимодействиями 65К с цитоскелетом

(Karasev et al., 1992). ХОТЯ ЭТИ предположения остаются ЧИСТО спекулятивными, можно заметить, что транспортные белки некоторых РНК-содержащих вирусов растений содержат консервативные НТФазные домены ДНК и РНК хеликаз (Oorbaienya et ai., 1988) и проявляют магний-зависимую АТФазную активность in vitro (Rouleau et al., 1994). Хотя эти белки не родственны 65К BSC, сходство их ферментативных активностей может указывать на энергозависимый характер транспортной функции, закодированной в геномах различных РНК-содержащих вирусов растений.

вывода

1. Получены шгазмадныа конструкции для экспрессии в бактериях полноразмерного В5К белка ВИС, и его н-концевых фрагментов 52К, 40К и 35К, а также с-концевого фрагмента 13К.

2. Отработаны методы суперэкспрессии в бактериях и очистки препаратов 65К, 52К, 40К, 35К и 13К белков.

3. Получены поликлональше антитела.к с-концевому 13К фрагменту . 65К бежа. С помощью Вестерн-блоттинга установлено, что белок 65К синтезируется в зараженных ВЖС растениях.

4. Продемонстрирована магний-зависимая АТФазная активность препаратов полноразмерного рекомбинантного 65К ВЖС. АТФазный

домен картирован в ы-концевом 40К фрагменте вирусного белка, • 1

5. Установлено, что 65К, в отличие от его клеточных гомологов, не взаимодействует , с неспецифическими пептидными последовательностями в А!ГФ-зависимой манере, что может указывать на осуществление белком 465К особой функции при. вирусной инфекции. ...

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Agranoveky, A.A., tunina, N.A., Nikiphorova, ¿.Yu. and Atabekov, J.G. On the properties of p65, a homologue of the HSP70 family of heat shock proteins encoded in beet yellows closterovirus genome. Abstracts of International Conference "Fundamental and Applied Aspects in Phytovirology",' 1994, May 22-26, Crimea, Yalta, f. 3.

2. Agranovsky, A.A., Nikiphorova, S.Yu. and Atabekov,- J.O. Р65, the beet -yellows closterovirus-encoded homologue of HSP70 cell heat shock proteins, is a molecular chaperone interacting with microtubules. Proceedings of International Symposium "Molecular responses of plants to biotic and abiotic atressee", 1994, December 8-9,'Finland, Helsinki, pp. 9-10.

3. Аграновский, А.А., Никифорова, C.D.,' Фолимонов, А.С., Вятушкина, M.B., Зиновкин, P.А. и Атабеков, И.Г. Вирус'желтухи свеклы: картирование функций, закодированных . в большом РЩ геноме, hi Российский сими. "Новые методы биоте'хнблогии растений", Пущино, 1995, 23-24 мвя.

4. Agranovsky, A.A., nikiphorova, S.Yu., Folimonov, A.S., VituBhkina, M.V. and Atabekov, J.G. Beet yellows closterovirus: napping functions encoded in a large RNA viruG genome. Proceedings of International Symposium "75 Years of Phytopathologlcal and Resistance Research in Aschersleben",

Aschersleben, 1995, June 12-16, pp. 43-46. * -

s. Никифорова C.D., Аграновский А.А. и Атабеков И.Г. (1995). Экспрессия в бактериях и некоторые свойства рб5,.. гомолога клеточных белков теплового шока HSP70, закодированного в РНК геноме кдоствровируса желтухи свеклы. Докл. Акад. Наук 340, 416-418.