Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Принципы молекулярной организации, экспрес... ..ции РНК генома клостеровируса желт... свеклы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Принципы молекулярной организации, экспрес... ..ции РНК генома клостеровируса желт... свеклы"
РГб о
о г4. "П
/ и
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА
На правах рукописи УДК: 519.6.875 + 573.55 + 578 * "»
АГРАНОВСКИЙ Алексей Анатольевич
ПРИНЦИПЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ, ЭКСПРЕ©' , И ,. 4ИИ РНК ГЕНОМА КЛОСТЕРОВИРУСАЖЕЛт СВ КЛЫ
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биоло -песких наук 4 а форме научного доклад»
(03.00.03 - молекулярная биология)
Москва - 1994
Работа выполнена а отделе биохимии вирусов растений Института физико-химической биологии им.А.Н.Белоэерского МГУ
член-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор
B.И.Агол
доктор химических наук
А.Б.Варгапетин
доктор биологических наук
C.К.Завриеа
йяпушая гургями-.щ |МЯ
Центр "Биоинженерия" РАН
<Л£>
Защита состоится * О 'С^/^ТЛ'^-^ 994 г. в'/с^ часов на заседании Специализированного совета Д.053.95 70 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.
С диссзртацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. ,
Автореферат разослан
1994 г.
Ученый секретарь .>
Специализированного ссзета , ^
Кандидат химических наух \ " ... - ■ ' Р Н.Каграманов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вирусы, геном которых представлен однонитчатой (+)РНК. представляют собой наиболее многочислен! й класс вирусов, ряд представителей которого являются важными патогенами животных и растений. Интерес к ним, однако, продиктован не только ближайшими практическими целями здравоохранения и сельского хозяйства (при всей их важности), но и удобством использования вирусных РНК в качестве компактных моделей для изучения механизмов взаимодействия геномов патогена и хозяина, а также принципов устройства, экспрессии и эволюции геномов вообще. Особенностью вирусных (+)РНК геномов является многообразие способов их экспрессии при небольшом размере и кодирующей емкости, а также высокая скорость эволюции, одним из ключевых факторов которой считается 'перетасовка генов* (Morozov eta.'., 1989).
Группа клостероеирусов, молекулярная биология которых цо самого последнего времени оставалась неизученной, объединяет некоторые (-t-)PHK-содержащие вирусы с гибкими нитевидными частицами, имеющие рекордно большие (среди вирусов растений) размеры генома - до 15-20 тысяч нуклестдов. Таккм образом, существование клостгроеирусных геномов, которые имеет кодорующуя емкость в несколько раз превышающую таковую вируса табачной мозаики, 'стандартного" вируса растений, ставит фундаментальные вопросы о направлении эволюции и, возможно, новых Функциях, закодированных в вирусных РНК.
Оируо желтухи свеклы. (ВЖС). . типовой представитель группы клостеровирусов, встречается во всех регион« мира, где выращивается сахарная свекла; кэ известных вирусных патогенов, ВЖС приносит наиболее ощутимые потери урожая этой культуры. Вирус передается тлями пояуперсистеитным способом и в экспериментальных условиях поражает 150 видов растений из 15 семейств. Ччстицы ВЖС обладает стиральным типом
Э
симметрии, имеют длину 1250-1450 нм и состоят из одной непрерывной молекулы РНК и примерно 4000 белковых субъединиц с мол .весом 22500 дальтон (Bar Joseph A Hull, 1974; Carpenter et si., 1977)..
Цель И задачи пяСютм Целью настоящего исследования было изучение молекулярной организации клостеровирусного РНК генома, выяснение механизмов его экспрессии и направления эволюции. Работа была направлена на решение следующих основных задач:
1) создание полной библиотеки вирус-специфических кДНК клонов;
2) определение полной первичной структуры геномной РНК ВЖС;
3) предсказание возможных элементов вторичной структуры РНК ВЖС и анализ их роли;
4) компьютерный анализ кодирукхцего потенциала генома ВЖС;
5) компьютерный поиск гомологов гипотетических белков ВЖС в базах данных, предсказание вероятных функций вирусных белков;
6) филогенетический анализ белков ВЖС;
7) предсказание и экспериментальная проверка механизмов экспрессии генома ВЖС;
0) экспрессия вирусных белков in vitro о бактериях, их очистка и получение снтисывороток
9) обнаружение индивидуальных бели» ВЖС в зараженных вирусом растениях.
Научная новизна работы. В данной работе была впервые определена полная последовательность 15480 нуклеотмдоа генома украинского штамма ВЖС (ВЖС-У). Установлено, что гоном ВЖС содержит 9 открытых рамох считывания (ОРС), кодирующих белки 295К, ЬОК, 6.4К, 65К, 64К, 24К, 22К, 20К и 21 К. Сравнение аминокислотных последовательностей этих продуктов с базами данных выпоило уникальные особенности генома ВЖС. Tax. установлено, чю перегрызающиеся OPC-ta и ОРС-1о, находящиеся в 5'-концсеоП чссти гемзглз, кодяругат вирусную РНК роплиьазу эоолюционно
• близкую к релликазам Синдбис-подобных вирусов и содержащую консервативны» домены метилтрансферазы, РНК хеликазы и РНК ггалимераэы. Однако..а отличие от всех известных родственных репликаз, гипотетическая * репликаза ОЖС содержит уникальный Н-концевой домен папаин-падобмой протеаэы (близкой к НС-протеазам потиаирусое) и внутренний домен гипотетической кислой протеаэы (напоминающей протеаэы лентизирусоа). Показано, что в,4К белок (продукт ОРС-2) напоминает небольшие гидрофобные белки, гзкаифосонныэ а тройном блок» генов потексвирусов; 65К белок (ОРС-3) валяется уникальным вирусным гомологам клеточных белков теплового шока семейства НвРТО; 24К белок (ОРС-5) родственен капсидному белку ВЖС (23К. ОРС-6) и, вероятно, представляет собой его диэергированную копи». Эти данные позволяют предположить, что в процессе эволюции ВЖС происходил захват (с помощью рекомбинации РНК) генов других вирусов и генов клеткм-хоэздна, а тоске дупликация собственного гена белка оболочки. Таким образом, геном ВЖС (и, возможно, других клосгеровирусов) можно рассматривать как исключительный пример эволюции геномных РНК путем "перетасовки генов* (Могагоу еГ а!.. 1989). В робота была также определена последовательность 6000 нуклеотедоа с З'-конца генома немецкого изолята ВЖС, имеющая приницилиально ту же организацию ОРС 2-8. Сравнение белкоеьвс последовательностей дзух отсекиенированных штампов показало, что степень - их консервации различна для продуктов индивидуальных ОРС ВЖС.
Полученные в работе результаты выявили также уникальное сочетание механизмоа экспрессии клостеровирусного генома. Как показано о эксперименте, аатолротеолнтическая активность лидерной протеазы ВЖС высвобождает И-концевой 65К фрагмент продукта ОРС-1а. Анализ первичной и вторичной структуры РНК я районе перекрывания ОРС-1а и ОРС-1Ь указывает, что продукт последней скорее всего акспрессируется в виде фыожн-белка в результате необычного сдвига рамки считывания в м-1 направлении (во всех прочих случаев, описанных для вирусных РНК, рибосомальный сдвиг рамки
происходит в -1 направлении). Показано, что гены, расположенные в 3'-концевой части генома ВЖС (ОРС 2-8), экслрессируются с помощью набора субгеномных РНК (сгРНК); в зараженных клетках обнаружены 5 типов сгРНК, размеры которых хорошо согласуются с расположением ОРС в геномной последовательности. В настоящей работе были впервые картированы 5'-концы сгРНК для капсидного белка и его гомолога, 24К белка, и сделано предположение о том, что консервативная последовательность РНК в районе начала обеих матриц является элементом субгеномного промотера. В работе была осуществлена суперэкспрессия капсидного белка, 24К и 55К белков ВЖС в шгаммах Eco'/, и получены антисыворотки к рекомбинэнтным белкам, очищенным до гомогенного состонния. Установлено, что 24К и капсидный белек серологически родственны (имеют общие эпктопы). Гипотетические белки 2iK и 65К идентифицированы в зараженных растениях серологическими методами с помощью полученных антисыаороток.
Таким образом, полученные данные позволяют понять основные принципы и некоторые интересные детали молекулярной организации, экспрессии и эволюции генома типового представителя группы клостеровирусов.
Практическая ценность работы. Полученная в настоящей работе полная библиотека кДНК клонов ВЖС может применяться для диагностики вируса методами гибридизации нуклеиновых кислот. Экспрессирующие плазмиды, содержащие индивидуальные гены ВЖС, уже использовались для получения антигенов и эффективных антисывороток для серологической диагностики индивидуальных вирусных белков в растениях. В честности, экспрессирующие плазмиды, полученные совместно с коллегами из Федерального Биологического Центра (Брауншзейг, ФРГ), были переданы в Германскую коллекцию микроорганизмов и распространялись среди лабораторий стран ЕЭС, занимающихся диагностикой вирусов сахарной свеклы. Клонированный
ген 65К белка ВЖС используется в настоящее время для получения трансгенных растений о целью изучения функций 65К и поиска новых источников устойчивости к ВЖС.
Материалы работы используются в курсах лекций на Биологическом факультете МГУ.
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в секторе биохимии вирусов растений НИИФХБ им. А Н.Белозерского, возглавляемой академиком АН России, профессором И.Г.Атзбековым. Ряд исследований проводился в Федеральном Биологическом Центре (Брауншвейг, - ФРГ) совместно с сотрудниками центра Э.Маиссом, Р.Фротчлом и Р.Кенип значительная часть работы сделана совместно с Е.В.Куниным (Институт микробиологи»; АН СССР - Национальный институт здоровья США).
Алройяиия работы. Материалы работы докладывались на II и III международных симпозиумах по (+)РНК-содержащим вирусам (Вена, 1989 и Майами, 1992), на школе ФЕБО "Геном вирусов растений: структура и экспрессия" (Рига, 1991), на VIII и IX международных вирусологических конгрессах (Берлин, 1990 и Глазго, 1993), а также на научных конференцию и лабораторных семинарах НЦИФХБ им.А.Н.Белозерского и Федерального биологического центра ФРГ.
1. Полная нуклеотпдная последовательность и
молекулярная организация РНК генома ВЖС
1.1. Клонирование генома ВЖС
Клоны кДНК, использованные в настоящей работе, были получены с помощью разных подходов, в основе которых лежал, известный метод синтеза двуспиральной (дс) гДНК на матрице РНК с использованием РНКазы Н и ДНК-полимеразы 1 (Gublei & Hoffman, 1983). Полученная кДНК встраивалась в плазмидные векторы серий pTZ и pGEM либо с помощью лигироеания по тупым и липким концам, либо путем достраивания олигодрзоксицитидиловых
последовательностей на кДНК и ее отжига с плазмидой pUC-9, имеющей комплементарные олигонуклеотидные хвосты (Maniatis et «I., 1989; Agranovsky et al., 1991b; 1993). Вирус-специфическая природа вставок кДНК подтверждалась методом гибридизации колоний in situ, а также с помощью Саузерн и Нозерн гибридизации (Maniatb ' et al., 1989). Для синтеза кДНК использовалась суммарная вирионная РНК ВЖС, полученная из очищенных препаратов вируса. При выделении натианых препаратов ВЖС и вирусной РНК мы столкнулись с определенными трудностями, связанными с хрупкостью частиц и их относительно невысокой концентрацией в зараженных растениях (следует заметить, что клостероеирусная инфекции в растении является полуфлоэмно-осраимненной). Поэтому известные методы выделения ВЖС и вирусной РНК ■(Bar «Jgepph & НиИ, 1984; Cassanb et al., 1977) были существенно •модифицированы (Karasev et А, 1989; Rogov et al., 1993).
i- Клоны, полученные и использованные в данной работе, можно разделить •ма.три гриппы; (а) клоны кДНК, полученные с рассеянной затравкой (г2, гЗ, и г9; Рис.. 1);.(6)1 .клоны кДНК, полученной со специфическими олионуклеотидными пр«Лиогщ»н, ,или затравками (рЗб, к19, а также «се клоны, изображенные на Ямс. 1. слева от клона 36); и (в) клоны кДНК. возникшей в результате "фоновой" (ъе.-мезааисимой от экзогенной затравки) обратной транскрипции РНК (р43, Ю-7 « <1121; Рис. 1). Кроме того, короткий участок генома (200 нт) в районе предполагаемого сдвига рамки клонировался в виде продукта реакции PCR, синтезированного с олигонуклвеямами 21 и 22 в качестве плюс- и минус -затравок (Agranovsky et al., 1993; Рис.1).
Феномен "фонового" (т.е. независимого от экзогенного праймера) синтеза кДНК, создававший определенные технические проблемы при направленном клонировании генома ВЖС, был нами специально исследован (Agranovsky, 119В£) заслуживает здесь особого комментария. При клонировании кДНК ВЖС, синтезированной с использованием специфических затравок, мы обычно получали большую фракцию вирус-специфических клонов.
в
которые не содержали последовательностей этих затравок и картировались в других областях генома ВЖС. Например, при использовании затравки 1 (комплементарной 3'-концу РНК ВЖС ) был получен "правильный" клон р36 и "фоновый" клон р4Э, покрывавший внутреннюю область генома; аналогичным образом, клоны 1121 и Зба не имели ничего общего с затравками 11 и олиго(дТ), добавленными в систему обратной транскрипции in vitro (содержавшей, соответственно, натиэную или З'-полиаденилированную РНК ВЖС) - ни по последовательности, ни по месту на карте генома (Рис. 1).
«13 «18
О*"
«20 21»
«22
12
15
Be XbHDSHS Xh
*1S «15 4U *13 '12 *11
U «1
1а -J СЦ
5
ê
□175
I 11311 СЭ124
31520 ' I : ; 11313 Я1518 ■ ЧЯП
1154
1561
1=31615 СП1510 DIGS C11Ï6
3143 3142
31213
3115 3112
31121
ilt-7 !M3
3>2
338a
C=3p3S =J*19
3031 =SD22
Рис. 1. Схема стратегии клонирован!«! и карта генома ВЖС. Зерхняя шкала (с дистанциями от Б'-конца в кил об азах) изображает геномную РНК. Обозначения сайтов, использованных для клонирования: Bg. Bgl II; Xb, Xba I; H, Hind III; S, Sat I; Xh, Xho К Стрелки указывают положения затргвок, применявшихся для сиквенса и ^локирования. Открытия рамки считывания изображены в виде широких боксов и пронумерованы так же, как в тексте. Узкие боксы обозначают кДНК клоны (светлые - ВЖС-У; черные - ВЖС-Н).
Было установлено, что включение меченых двэоксинуклвотид трифосфатов различными препаратами обратной транскрилтазы вируса миелобластоза птиц (ВМП) in vitro на матрице вирусной РНК происходит и без добавления затравок, хотя и менее эффективно (Рис. 2А). Синтез кДНК в отсутствие затравки происходил и на матрицах РНК двух других вирусов растений, имеющих отличные от ВЖС типы терминальных структур РНК; кроме того, препараты клонированной обратной транскрилтазы вируса лейкемии мышей (ВЛМ), в отличие от выделенных из частиц ВМП, не направляли фонового синтеза кДНК (Рис.2А).
Рис. 2. (А) Аотородиограмма (а-32р]-<1СТР-меченных кДНК. разделенных в 5% ПААГс 7М мочевиной. (1-3), продукты обратной транскрипции РНК ВЖС без экзогенной затравки; обратная трамскриптаза ВМП (1) Омутнинского химзавода, (2) Serva, и (3) обратная транс кригттаза ВЛМ Serva. Продукты в дорожках (4-6) были получены с теми же ферментами, что и в (1-3), но синтез кДНК проводили в присутствии ВЖС-специфичной затравки. Синтез кДНК без затравки на матрицах РНК Х-еируса картофеля (7) и вируса мозаики костра (8). (Б) Ааторадиограмма (у-32р]-АТР-меченных примесей в коммерческих препаратах обратной транскрилтазы из Boehringer Mannheim (2) и Serva (3) в сравнении с меченой тРНК (1); (4), то же, что и (3), после обработки РНКазой А.
Эти данные позволили исключить самозатравление синтеза кДНК на вирусной РНК за счет образования шпильки, подобное описанному ранее для флааивирусов (Hahn et al., 1987). По полученным нами данным, коммерческие препарат обратной транскриптазы ВМП содержат примесь низкомолекулярной ДНК или РНК, которую можно выявить мечением с помощью Т4 полинуклеотидкиназы (вероятнее всего, это тРНК, включаемая в ретровирусные частицы) (Рис. 2В). По нашему предположению, такая примесь служит эндогенной затравкой для обратной транскриптазы, что приводит к фоновому синтезу кДНК на различных РНК-матрицах (Aorancrvsky,1992).
В настоящей работе были получены кДНК клоны, целиком представляющие геном украинского штамма ВЖС (ВЖС-У; Рис.1). Кроме того, для сиквенса использовались клоны к немецкому штамму ВЖС (ВЖС-Н), представляющие З'-концееую треть его генома (последние были получены от З.Маисса и Й.Шуберта, Брзуншвейг). Вирус-специфические вставки далее субклонирсвались для последующего сиквенса либо в виде рестрикгных фрагментов, либо путем внесения направленных делений зхзонуклеазой Ш и нуклеаэой SI (Henikoff. 1984).
1.2. Определение нуклеотиднсй последовательности генома ВЖС
Для определения З'-концвоой последовательности, РНК ВЖС метилась ЗЗр-рСр в реакции с Т4 РНК липазой (England & Uhlenbeck, 1978) и затем подвергалась ограниченному подзолизу РНКазой 11; полученные фрагменты разделялись в сиво ейском геле и эяюировались (Aßrancrvsky et al., 1991b). Реакции модификации и прямого сиязенса РНК проводились по методу Peaffia (1979). Дополнительно, проводился полный Tl-гидролиз З'-меченной РНК. выделялся из геля меченый тетрануклеотид и концевой остаток затем
определялся методом "ближайшего соседа" (Karasev et al.. 1989). Этими
*
методами нам удалось получить сиквенс 120 нт с З'-кюнцз генома ВЖС; на его
основе была синтезирована затравка, комплементарная последовательности 17 нт с З'-конца геномной РНК, которая использовалась для дальнейшего клонирования (Agranovsky et al., 1991b) и сиквенса с обратной транскрилтазой и дидезоксинуклеотидными аналогами на матрице РНК (Fichât & Girard, 1990). Последний метод применялся также для прямого секвенирования РНК о затравками 20 и 22 (область предполагаемого сдвига репликазной рамки) и затравками 17,18 и 19 (5'-концевая область генома) (Рис,1).
Чтобы добиться разрешения 5'-концевого нуклеотида, продукты сиквенсной реакции РНК с затравкой 19 достраивали в реакции с терминальной трансфераэой ДНК и анализировали в сиквенсном геле (de Borda et а)., 1987); кроме того, были получены и отсеквенированы несколько кДНК клонов этой области (Agranovsky et al, 1993; Рис.1).
Последовательности вставок кДНК определялись по методу Сзнгера с использованием модифицированной' полимеразы фага Т7 (Sequenase) на матрицах плазмцдной дсДНК, или однослиральных ДНК (осДНК) фагмид серий pUC. pTZ и pGEM. Примерно 90% геномной последовательности ВЖС-У было определено на обеих целях кДНК и 70% секвенировано на дзух и более независимых клонах. Кроме того, была определена последовательность 6 тыс. нуклеотидов на кДНК клонах штамма ВЖС-Н (Рис.1). Последовательности РНК ВЖС двух штаммов были помещены в базы данных EMBL и Ge ne Bank под номерами Х73476 и Х73475 (ВЖС-У и ВЖС-Н. соответственно). Полная последовательность генома ВЖС-У представлена 16480 нуклеотидами (Agranovsky et al.. 1993).
1.3. 5'- и З'-нзтранслируемые области РНК ВЖС
Поскольку трансляция РНК ВЖС в бесклеточных системах из ретикулоцитов кролика и из клеток Кребс-2 подавляется аналогом кепа m7Gppp, мы предполагаем, что еа 5'-конец блокирован кеп-структурой (Кагаззу
•I Ы., 1969). На 5'-концв имеется иетранслируемая область длиной 107 нт, обогвиданная остатками уридина и цитоэина (37 и 31,4%, соответственно) и содержащая мало остатков гуаноэина (8,6°Л). По данным компьютерных предсказаний вторичной структуры РНК, зга область ге*<эма ВЖС скорее всего нэ структурирована, что типично для эукариотических матриц, включая и вирусные плюс-РНК.
Можно выделить три типа З'-концееых структур вирусных РНК - это или некая гетерополимерная последовательность, или гомополимерная поли(А), или ТРНК-подобная структура (имеющая характерную пространственную укладку и способная специфически взаимодействовать о теми же белками, что и тРНК). Иетранслируемая область на 3'-конце РНК ВЖС гетерололимерна, имеет длину 101 нт, обогащена остатками А и и и, вероятно, образует две стабильные шпильки (Рис.3).
тата
т.
т т т - а т - а С - В т - а т - а т - а т - а
,т
5*
СА
4С - -15.5 кса!
" а - т
а - т
а - т
а - т
а - i -
С - О
С - С
т - а
С - с а" - а
о т
а с
а С -
С - С С - О О - С а - т - т - а С - О
с - с * т - а. /
ДО - -15.9 кса!
*сааааааталссссссс-си
3'
Рис. 3. Гипотетическзя вторичная структура З'-юонцевой области РНК ВЖС. Наверху указаны свободные анергии двух потенциальных шпилек.
Возможная вторичная структура конца РНК ВЖС не напоминает типичные тРНК-подобные структуры других вирусов растений - в частности, для иве нельзя предсказать такие характерные элементы, как псевдоузлы (Кориелиус Плейдж. персональное сообщение). Проведенные нами тесты на аминоацилирование и аденилирование РНК ВЖС in vitro дали отрицательный результат (данные не показаны), что позволяет исключить присутствие тРНХ-подобной структуры в геноме ВЖС (Agranovsky et d., 1091b). Можно предполагать, что структурированный З'-конец РНК ВЖС служит специфическим сигналом для узнавания вирусной реплихазой. Механизм подобного узнавания в случае РНК ВЖС может оказаться принципиально иным, чем для тРНК-подобных терминальных структур в вирусных геномах; в репликации последних, по-видимому, участвуют клеточные белки, взаимодействующие с тРНК и бвлок-сингезирукхцим аппаратом клетки (AMqutot, 1992; Quad: at at., 1993).
1.4. Кодирующие области, мажгенныв участки и потенциальные гены в РНК ВЖС
Компьютерная трансляция с помощью программы PROTMAKE выявляет 9 протяженных открытых рамок считывания в геноме ВЖС-У (Рис.1; Agranovsky et el., 1991а,b; 1993). Инициаторный кодой для первой с 5'нсонца ОРС (ОРС-1я). валяется также первым триплетом AUG в последовательности и находится в благоприятном контсхсте для трансляции, с остатозди гуснозина в +4 и -3 положениях (Kozsk, 19S6). ОРС-1а занимает примерно половину всего генома (остатки 107-8000; здесь и далее нумерация нуклеотидос с 5' конца полного сихвенса ВЖС-У) и кодирует белковый продукт из 2630 аминокислот с мол.сосом 29SK (Рис. 1). ОРС-lb перехрыезет последние 113 hi ОРС-1а и терминируется UOA стоп квдоном (нт 9391-9393); считая от первого метионииа о этой рамко, балкозый продукт ОРС-lb теоретически должен состоять из 420 аминокислот. Мы постараемся привести кгсго данные в польеу нашего предположения о том, что ОРС-1о зкспрессируотся с поиощьо рибосомального
сдвига рамки и что ее продукт представляет собой С-концевую часть крупного фыожн-белка, а не отдельный белок. За терминатором ОРС-1в следует нетранслируемая область длиной 51 остаток, отделяющая 5'-концевые ОРС от блока перекрывающихся ОРС 2-5 (Рис.1); втог \ юток имеет вьюокое содержание остатков и (51%) и низков • остатков А (10%).
ОРС-2 (нт 9444-8608; здесь и далее границы рамок даются от первого нуклеотида инициаторного кодона до последнего нуклеотида стоп-кодона) потенциально кодирует белок с мол.весом 6381 (6,4К). Среди других маленьких ОРС, предсказанных компьютером, ОРС-2 была единственной, в которой наблюдались благоприятное окружение инициаторного кодона (Когак, 1938) и оптимальное распределение гугиилоаых остатков в триплетах [мы пользовались алгоритмом Трифонова (ТгНопоу, 1987), согласно которому в большинстве вукариотических генов гуанозин статистически превалирует в первом положении триплетов и реже встречается во втором). ОРС-3 (нт 9608-11404), ОРС-4 (нт 11310-12971) и ОРС-5 (нт 12919-13569) кодируют, соответственно, белки с мол.весами 65156 (65К). 63931 (64К) и 24260 (24К).
Третий блок перекрывающихся ОРС в-8 отделен от блока ОРС 2-5 нетронслируемой областью длиной 70 остатя, также обогащенной остатками и (47%) и содержаний относительно мало О и С (17% и 14% соответственно). ОРС в (нт 13640-14254), ОРС 7 (кг 14251-14793) и ОРС в (кг 14768-15301) кодируют белки с мол.весеыи 22200 (22К, белок оболочки), 20395 (20К) и 20534 • (21 К).
Как показывают результаты компьютерных предсказаний с помощью алгоритма Цукера и Стиглера (й&ег & ЭйоЬг, 1981), межгенные участки в РНК ВЖС скорее всего не вовлечены о образование вторичной структуры (Аогалоузку Л Ы., 1891Ь).
Компьютерная трансляция комплементарной (минус) цепи РНК ВЖС-У не сыягила ОРС, кэдярующих потвнциальнаэ богкосыэ продукты размером более 10К.
1.5. Сравнение последовательностей штаммов ВЖС
Определенная нами частичная последовательность ВЖС-Н позиции 8375-15353 ■ координатах генома ВЖС-У. Нуклеотидиые последовательности РНК этих штаммов на 88,54 идентичны, что отражается а одинаковом расположении ОРС-2 - ОРС-8. Следует отметить, что последовательности межгенных участков также были консервативны (Табл. 1), что указывает на их важную функциональную роль. Большинство даман нуклеотидое а ВЖС-Н приход ились на третье положение а триплетах, а а тех случаях, когда они изменяли под, только половина аминокислотных замен были
Туйлши 1
Сравнение муклвстидмых и белковых последовательностей троя изолятов ВЖС
Ген ОРС-2 ОРС-3 ОРС-4 ОРС-5 ОРС-6 ОРС-7 ОРС-8
Продукт 6,4К 65К 64К 24К 22К 20К 21К
Штамм ВЖС
У/Н 11 4 8 2 5 16 12
У/Б 7 2 5 -
Н/Б 2 2 0 -
Нетранслируемые
области 1 » З'-вонец
Штамм ВЖС
У/Н 14 14 4
У/Б 13 -
Н/Б 1 -
В цифрах даны проценты аминокислотных замен (для кодирующих районов) или нуклеотидньа замен (указаны только для »«транслируемых областей) при сравнении штаммов ВЖС. В левой колонке У, Н и Б обозначают украинский, немецкий и британский штаммы, соответственно. Прочерк (-}. последовательность для ВЖС-Б не определена. Нетранслируемые области I и I) расположены цржду ОРС-1е и 2, и между ОРС-5 и 6, соответственно.
неконсервотиаными. Тем не менее, данные сравнений, сведенные в Табл. 1, указывают на некоторые различия в уровне консервации аминокислотных последовательностей, закодированных в различных О PC. Так, гипотетические 24К белки ВЖС-У и ВЖС-Н различались лишь в трех аь нокислотых позициях; 65К, 64К и белок оболочки также показывали низкую вариабельность последовательностей. С другой стороны, последовательности низкомолекулярных белков этих штаммов оказались значительно менее консервативными. Так, в 6,4К белке ВЖС-Н есть в аминокислотных замен, причем все неконсереативные. Наконец, последовательности 20К и 21К белков показывали наибольшее число замен (Табл. 2).
Анализ частичной последовательности британского изолята ВЖС (ВЖС-Б; Bfunjtacft et at., 1991) выявил сходные закономерности консервации белковых последовательностей (Табл. 1). Очевидно, ВЖС-Н и ВЖС-Б ближе друг к другу, чем любой из них к ВЖС-У, по крайней мере в границах последовательности, определенной для британского штамма (11684-14407 в координатах ВЖС-У). В частости, последовательности структурных белков западноевропейских штаммов были идентичными (Табл. 1).
1.8. Резюме; общий план устройства генома ВЖС и других
вирусных (+)РНК
Непрерывные геномы (+)РНК-содержащих вирусов можно условно разделить на два типа - "вытянутые" и "компактные". Вытянутые геномы, с минимальным перекрыванием генов или вообще баз такового, более характерны для вирусов со спиральной симметрией частиц (тобамо-, потеке-, поти- и карлазирусов). Отсеквенированный нами геном ВЖС относится к этому типу - если не считать ОРСИа и ОРС-1в (при любом вероятном механизме экспрессии транслироваться может только часть ОРС-1в, лежащая ниже стоп-кодона ОРС-1в), самая протяженная область перекрывания (ОРС-З/ОРС-4) имеет всего 96 остатков в длину.
Компактность генома достигается использованием двух рамок считывания в качестве кодирующих на одном и том же отрезке последовательности; так, в геномах сферических лютео-, томбас- и тимовирусов некоторые гены целиком содержится внутри других или же ети гены в значительной степени перекрываются. По-видимому, такое экономное использование нуклеотидной последовательности диктуется двумя противоположными факторами: необходимостью приобретения новых генов и функций, и физическими ограничениями на дальнейший рост длины генома, связанными с упаковкой РНК в сферические частицы. Интересная гипотеза об эволюционной увязке типа капсиды и размера геномной РНК недавно высказывалась для торо- и коронавируСов в работе Godenyet at. (1993).
Разделение вытянутого генома между индивидуальными компонентами РНК (у сферических комо-, нело- и трикорнавирусов), по-видимому, представляет собой альтернативное решение проблемы упаковки. Заметим, что
многокомпонентные геномы есть и у многих вирусов со спиральным типом
<
симметрии (Mathews, 1991). Происхождение по крайней мере части из них (например, гордеи- и тобравирусоа) может объясняться ограничениями максимальной длины жестких палочковидных частиц; в обзоре Dolja et а!. (1994. In press) сформулирована привлекательная гипотеза о том, что эволюционное "изобретение' гибких (у погивирусов) и супергибких (у клостеровирусов) капсмд позволило обойти эти ограничения. Вместе с тем, существование двухкомпонентных геномов, упакованных в ""гибкие нитевидные частицы бимоеирусое (Kostiiwasaki et el., 1990) и некоторых клостеро-подобных вирусов (Klaasen et al., 1993; Стефан Винтер и Эдгар Маисс, персональное сообщение), заставляет предположить, что 'технологическая* проблема упаковки и стабильности капсид является не единственным (а иногда и не главны!-*) фактором эволюции, способствующим разделению генетической информации между несколькими компонентами РНК.
2. Большие неструктурные белки, закодированные в 8'-коицевой части генома клоетероаируса: способы •кспрессии, вероятные функции и еволюциоиныв связи
2.1. ОРС-1а и 1в могут транслироваться с помощью рибосомального сдвига рамки, давая один большой белок
5'-концевая область ОРС-1в, перекрывающая З'-концавую область ОРС-1а, не содержит инициаторных кодонов; это дает возможность предположить, что домен РНК-подобной РНК полимеразы, содержащийся в продуете ОРС-1в (Aomovsky et al., 1991b; см. раздел 2.2), акспрессируэтся с помощью рибосомального сдвига рпмки. Действительно, элементы первичной и вторичной структуры РНК, окружающие стоп-кодон ОРС-1а, очень похожи на классические сигналы сдвига рамки в гене полимеразы у столь различных вирусов как ретроеирусы и коронавирусы животных, L-A вирус дрожжей и лютео- и диантовирусы растений (Jacks et al., 1988). Это последовательность GGGUUUA, удовлетворяющая консенсусу "скользящих" гелтануклеотидов (заметим в скобках, что эта последовательность абсолютно одинакова у ВЖС и L-A вируса дрожжей), и две потенциально прочных шпильки, одна из которых мижет образовывать характерный псевдоузел о нижележащей последовательностью (Рис. 4А). Следует отметить тот необычный монет, что ОРС-1в ВЖС находится в +1 конфигурации по отношению к предыдущей (нулевой) рамке считывания, в то время как у всех вирусов высших растений и животных, использующих подобный механизм экспрессии, полимеразные гены находятся в -1 конфигурации. Для объяснения -1 сдвига (т.е. сдвига рибосомы на один нуклеотид назад) были построены остроумные модели (Atkins et al., 1990: ten Dam et al., 1990) и получены исчерпывающие экспериментальные доказательства (Brautt & Miller, 1692; Brierly et al., 1992; Chamorro et al., 1992; Dinman et al., 1991; Pruter et al., 1S92). Сдвиг рамки в направлении +1 описан для ретротраиспозоноа Ту1 и ГуЗ дрожжей и гена релиз-фактора Е.соЯ(Craigen et al., 1985; Clare et al.. 1988; Ferabaugh et al.. 1993). Однако, в этих случаях
А
в* С*
С А*
А
С в в-С С-д С-д С-д
А-и
и в*
С-в в-С С-в и-А
и и А-и О-С
5' в и и а вСиС СиААбАСОАААССОиСОС'и'СС'А
В V * (СЖР1а)
5'...саа йш ¿шас исв лии...з'
III Б в I (ОЯР1Ь) СААузз
я V в в I (0*^1 а/1 ЬП181оп)
5'...сас йши Айс исв лии...з'
II:
СААиЗЗ
Рис. 4. (А) Предполагаемая вторичная структура района РНК между остатками 7983 и 8045. "Скользящий" гелтануклеотид СООииЦЦА показан строчными буквами, ЦАО стоп-кодон в ОРС-1а подчеркнут. Остатки, которые могут образовывать псевдоузел, отмечены звездочками. (6) Модель сдвига рамки. Триплеты и аминокислоты указаны в нулевой (ОРС-1а) и +1 рамке (ОРС-1в). СААи, остатки 36-33 в антикодоновой петле валиновой тРНК. Верхняя строчка, обычное спаривание тРНК с валиновым кодоном, приводящее к терминации трансляции на следующем стоп-кодоне. Нижняя строчка, нетрадиционное спаривание, приводящее к +1 сдвигу рамки считывания. Вертикальные линии, обычные водородные связи между комплементарныви основаниями, двоеточие - воббл-спариоание 11-11.
В
нухлеотидные последовательное™ "скользящих" сайтов не консервативны и вторичная структура на эффективность сдвига рамки на влияет; смещение рибосом, в этом случав направляется "голодными" кодонами (ГагаЬаиоЬ е1 а!.. 1993) или последовательностью типа Шайн-Дальгарно ("'э!зз <Л а!.. 1988). Таким образом, известные варианты +1 и -1 сдвига рамки совершенно различны по своему механизму. Сочетание элементов первичной и вторичной структуры, характерных для -1 сдвига рамки, и 0/+1 конфигурации ОРС в геноме ВЖС может указывать на существование нового механизма.
Мы предлагаем свою модель, объясняющую потенциальный +1 сдвиг рамки при трансляции 5'-концевых генов ВЖС. Обычное спаривание антикодона валиновой тРНК с предпоследним ко до ном ОРС-1а приводит к терминации трансляции на следующем стоп кодоне ЧАО и синтезу 295К белка (Рис.4В). С другой стороны, статистически более редкое воббл-спаривание с участием остатка и-33, прилежащего к антикодону (заметим, что он консервируется во всех "скользящих" тРНК, включая и валиновую тРНК), со "скользящим" триплетом ЦШ, может приводит к сдвигу рамки считывания в направлении +1 (Рис.4В) и синтезу фыожн-белка - продукта ОРС-1а/1в с мол.весом 348272 (¿>48К). Вторичная структура РНК ВЖС в районе стоп-кодона ОРС-1а может способствовать "зависанию" рибосом, увеличивая таким образом вероятность сдвига рамки считывания; подобный эффект был описан при экспрессии гена полимеразы 1-А вируса дрожжей (Ти е1 а!., 1992).
Сходство элементов последовательности РНК ВЖС с типичными сигналами для сдвига рамки, а также очевидная логичность этого события при экспрессии ОРС-1а и -1в (ген РНК полимеразы должен экспрессироваться первым или в числ» первых, поскольку от его продукта зависят последующие раунды репликации и экспрессии), оставляют мало сомнений в реализации данного механизма при экспрессии клостеровирусного генома. Уточнение его деталей, однако, потребует гкеперимгнтоз по кгЛргэленному ыутггенззу экспрессирующих конструкций о рспозтерчым геном. .'
2.2. Принципиальные репликатмвные домены: полимераза.
хеликаза и метилтрансфераза
Компьютерное сравнение последовательностей аминокислот, закодированных в О PC генома ВЖС, производилось по следующей схеме: поисковая последовательность сначала прогонялась по банку аминокислотных последовательностей SWISSPROT (выпуски с 12 по 24) с помощью программ QUICK и SMART пакета GENEBEE (Brodsky et al.. 1990). В некоторых случаях применялись программы BLASTP (скрининг базы белковых последовательностей) и TBLASN (скрининг базы нуклеотидных последовательностей, транслируемых в б возможных рамках считывания), основанные на алгоритме BLAST (Altschul et al., 1990). Отобранные после первичного скрининга банка белковые последовательности, показывавшие сходство с поисковой последовательностью, затем сравнивались с ней индивидуально с помощью программы DOTHEUX, дающей полную карту локального сходства с оценкой статистической достоверности в единицах стандартного отклонения (SO) от средней величины сходства для случайных последовательностей той же длины и состава (Леонтович и др., 1990). Наконец, в пределах границ достоверного сходства делалось выравнивание последовательностей программами CLUSTALV (Higgins & Sharp, 1988), MACAW (Schuler et al.. 1991), OPTAL (Gorbalonya et d., 1989) или PBIOCKS (Boguski et ai.. 1992).
Компьютерный поиск о Сазах данных выявил несомненное сходство 346К белка (продукта ОРС-1в и ОРС-1в ВЖС) с большими неструктурными белками (гипотетическими репликозгми) (+)РНK-содержащих вирусов, принадлежащих к супергруппе Синдбмс-подобных вирусов (Goldbach et el., 1991). Наиболее близкое сходство наблюдалось с реллихазами тобразирусов (вероятность случайного совладения аминокислотных последовательностей ниже 10"25) и несколько меньшее с ропликззами тсбгмэзкрусов, гордеивирусоё. бромоаирусоз, кукумовирусоа. вируса мозаики люцерны (ВМЛ) и вируса
í I
i
1 У0 IOCO I» ЗООв 1S» Km
Рис. 5. Диагональные сравнения гипотетических рептиказ ВЖС и других Синбис-подобньи вирусов растений. Последовательность 3094 остатков фьюжн-балка ВЖС. реконструированная на основе модели сдвига рамки (Рис. 4), сраввалась с выровненными последовательное- 1ми репликаз тобравирусов (А); трикориааирусоа ВМЛ и ВККЗ (Б); ВХПЯ (клостеровирус?) п вируса гравировки стебля яблони (калилловирус) (В).
кустистой карликовости земляники (ВККЗ). В соответствии с этим, попарные сравнения выявили наиболее протяженные участки сходства продукта ОРС-1 а/1 в ВЖС с белками тобравирусов, и более короткие с белками В МЛ и ВККЗ (Рис. 5А,Б). Сравнения показали также, что сходство между 348К ВЖС и репликазой вируса хлоротических листовых пятен яблони (ВХПЯ) ограничено коротким участком в домене РНК полимеразы (Рис. 5В) Эти данные подтверждают вывод об эволюционной отдаленности ВХПЯ (который классифицируется как клостеровирус, хотя наиболее близок к капилловирусам) от "настоящих" клостеровирусов, сделанный на основе сравнения белков оболочки и фрагментов РНК-полимераз (Dotja et al.. 1991; Koonin, 1991).
Участки наиболее сильного сходства между 348К белком ВЖС и реллшсазами эволюционно близких вирусов концентрировались вокруг консервативных доменов метилтрансферазы (МТР; Rozanov et al., 1992), РНК хеликазы (ХЕЛ; Qorbalenya et al., 1988) и РНК-зависчмой РНК полимеразы (ПОЛ; Kamer & Агооз, 1984; Koonin, 1991). Функции, приписываемые этим доменам, заключаются в метилировании 5'-концевой кеп-структуры (МТР домен), нуклеозидтрифосфит-зависимом расплетании дуплексов РНК при репликации (ХЕЛ домен) и синтезе комплементарных плюс- и минус-цепей РНК (ПОЛ домен). Эти функции были экспериментально доказаны для некоторых (+)РНК-содержащих вирусов биохимическими и генетическими методами, и предсказываются для остальных на основании достоверного сходства аминокислотных последовательностей (обзор см. 8 работе Koonin & Dol/a, 1993). Сходство 348К ВЖС с репликазами тобравирусов распространяется и за пределы этих доменов; выравнивание полных аминокислотных последовательностей показало, что в 348К белке практически полностью отражаются последовательности тобравирусных релликаз (не показано). Можно допустить, что эти дополнительные консервативные домены также связаны с некоторыми специфическими аспектами репликации» вирусного генома, например, гуанилированием 5'-конца РНК при синтезе кеп-структуры. Следует
отметить, что сходство продуете ОРС- 1в ВЖС с белками тобраеирусов начинается почти сразу после предполагаемого фьюжн-пептида в 348К белке, что косвенно подтверждает предполагаемый сдвиг рамки считывания (Рис.4, 6).
2.3. Эволюционные связи ВЖС с другими (+)РНК-содержащими
вирусами
Сравнительный анализ большого числа вирусных белковых последовательностей, накопленных в современных базах данных, показывает, что РНК релликазы наиболее консервативны и могут, таким образом, служить мерой эволюционного родства вирусов, которое можно оценить компьютерными методами (Кооп'ш, 1991). Наш предварительный анализ показал, что круг вирусов, к которым ВЖС наиболее близок по гомологиям репликазных последовательностей (по данным скрининга баз аминокислотных последовательностей и попарных дот-матриксных сравнений), очерчивается рамками недавно описанного кластера "тобамо-подобных" вирусов (Кооп!п & Оо1|а, 1993). включающего тобамовирусы, тобравирусы, трикорнавирусы, • гордеивнрусы, ВККЗ (идоовирус), и вирус передаваемой через почву мозаики пшеницы (фуровирус).
Чтобы получить более точное представление об эволюционных связях ВЖС с другими (+)РНК-содержащими вирусами, мы использовали филогенетические реконструкции для отдельных репликазных доменов (МТР, ХЕП'и ПОЛ), сделанные с помощью различных алгоритчов на базе частичных выравниваний фрагментов вирусных репликаз (РеЬепйет, 1989). В анализ были включены аминокислотные последовательности "тобамо-подобных" вирусов, а также вируса Синдбис; последняя использовалась в качестве наиболее отдаленного гомолога для очерчивания "корня" филогенетического древа. Топология филогенетических деревьев для ХЕП и ПОЛ доменов была несколько нестабильна, поскольку некоторые алгоритмы указывали на Солее тесное родство ВЖС с тобра-, тобамо- и гордеивирусами, а другие относили
ВЖС ближе к корню филогенетического древа, к точке, предшествующей дивергенции этих вирусных групп и трикорнавирусов. В то же время древо для МТР доменов, вне зависимости от метода его построения, ясно указывало на
Рис. 6. Филогенетическая реконструкция консервативных доменов 348К белка ВЖС и репликаэ тобра- (TRV и PEBV), фуро- (SBWMV), гордеи- (BSMV), тобамо- (PMMV и TMV), трикорнавирусоэ и близких к ним вирусов (AIMV, RBDV, PSV, CMV, TAV, BMV и CCMV), и вируса Синдбис (SIN).
'прикорневое' положение ВЖС (результат не показан). Поскольку кластер ропликотивных доменов ВЖС, как и у других родственных вирусов, скорее всего эволюционировал как единое целое, в окончательном варианте филогенетическая реконструкция строилась для искусственно совмещенных (на компьютере) консервативных доменов МТР, ХЕЛ и ПОЛ. При этом eco использованные алгоритмы, кроме парсимоничоского, помещали аминокислотную последовательность ВЖС на первое ответвление филогенетического древа (не считая последовательности вируса Синдсис)
(Рис.6). Таким образом, ранняя дивергенция ВЖС от общего предка с "тобамо-подобными* вирусами представляется, наиболее вероятным вариантом эволюционного сценария.
2.4. Уникальные районы в 348К белке ВЖС содержат два гипотетических протеазных домена разного типа
Гипотетический 348К фыожн-белок ВЖС длиннее на 1387 и 1328 еминоючслотиых остатков, соответственно, чем родственные репликазы тобравирусов погремков ости табака и раннего побурения гороха. Сравнение, представленное на Рис.5, и более детальные выравнивания позволили установил, границы двух уникальных районов в белке ВЖС, определяющих эту разницу. Первый район представлен Ы-концевым довеском из примерно 600 аминокислот, и второй - вставкой из 722 аминокислот между МТР и ХЕЛ доменами. Сравнение последовательностей этих уникальных районов с базами данных не- выявило статистически достоверных .гомологий. Поэтому они проверялись на известные функциональные мотивы. ,
При анализе М-концевого района мы обратили внимание на тетралептид С5Ц5У (аминокислотные остатки 507-510 с Ы-конца продукта ОРС-1а), напоминающий последовательность в активном центре папаин-подобных тийловых прогеаз (СогЬа1епуа е! а!.. 1991). Более детальное сравнение последовательности белка ВЖС, окружающей этот тетралептид, указывало на ее сходство с хелпер-компоненгами (НС-протеззами) пспивирусов и с
I
родственной им протеазой бимовируса желтой мозаики ячменя (Рис.7). Хотя статистическая оценка достоверности выравнивания белкового сегмента ВЖС с этими п роте азами была скромной, 3,8 БО при эволюционной дистанции 209,5 (ОооШе, • 1986), большинство аминокислотных остатков, которые консервируются во всех НС-подобных протеазах, также сохранялись в белка ВЖС, включая и трипегтгид КЗв, С-концевой сай| рехрезания у этих протеаз (Рис. 7). Кроме того, компьютерный скрининг баз данных выявил уникальность
TEV HC
PPV HC
PVY HC
SMV HC
PEMV HC
■RIHV HC
TVMV HC
PSBMV HC
ВаУНУ 'HC*
consensúa
BYV la
TEV HC
PPV HC
PVY HC
SMV HC
PEMV HC
TUMV HC
TVMV HC
PSBMV HC
BaYHV •HC'
consensúa
BYV 1«
TEV HC
PPV HC
PVY HC
SMV HC
PEMV HC
TUMV HC
TVMV HC
PSBKV HC
BaYHV •не*
consensúe BYV la
338-460 YIANEGYCYMNIFFALLVNVKEEDAKDFTKFIRUT IVPK 337-459 FIAJCACYCYINIFLAMLININEDEAKSmCTVRDTLVPK
335-457 YIAKQGYCYINVFLAMLINISEEDAKDFTXKVRDMCVPK
336-458 YIAKEGFCYLNIFLAHLVNVNEDEAKDFnCHVFUVIVPR
335-457 YIALDGYCYINIYLAULVHISEEEAKDFTKKVRDIFKPK
337-459 YIAKECYCYINIFUMLVNVKESQAKEFTXVVRnCLVSE
336-458 YIAKBCYCYINIFUMLVNVDEANAKDrnCRVRKSVgC
338-457 VIAKECYCYINIFFAKLVNVSEXDAKOFTKFVRDEIMPQ 136-256 FNFAHGYCYLSLFIPLSFRITPENARSFSRFL-BQLPDI
R SH E
JxxxxCYCYUxxJOxUxOxxxxxxAKxFIXxUxDxxxxx • • ••• • ■ • ■ ■
502-589 YRPGECLCYLA-HAAL---CCALQKHTT-B—EEDFF—
I
LGAVPTMQDVAT ACYLLSIL YPD VLRAELPRILVDHDNKTMHVLD iJCTtfPSHMDLATACHFLAVLYPETRNAELPR I LVDItEAK IFHWD LGTHPTMKDLATTCAQKRIFYPD VHD AELPRILVDHDTQTCHWD UaCVPIMJ) V AT AA YMLTVTHPETRH AELPRILVDHAOQTMHVID LGKVPTLMDLATTCAQLRIFHPD VHD AELPR ILVDHNTQTCHWD UXVPTIXDV ATACYFLKVFYPO V ANAELPRMLVDHKTKIIHWD LGKKPSLIDVATECALLSTYYPAAASAELPRLLVDHACKTIHWD UaCVPTHHDVATACYKLA 11 YPD VRDAQLPRILVDHSEQIFHVID LCAYPTLASLYXTKLFAVRLFPEVLQAPIPIIAKRPGVLQFHVSD S
LCxJPTUxxUxxxxxxxxxOxPxxxxAxUPxUxxxxxxxxxHVxD •• ••• ■ • • •
VGMYPTKFYFAKR—LTEKLGPSA1JCHPYRGRQVSRS—LFHCDV
SYGSRTTG YHHLKMNTTSQLIEFVHSGLESEKKTYNVG/G STCSLSTCKHVXJCANTINQLISFASDTLDSNHKTYLVG/G SreSQTTCYHILKASSVSQLILFANDEL£SDIKHYRVC/C SPGSLTVGYHVLKAGTVNQLIQFASHDLQSEKKFYRVG/G SYCSISTC YHILXAATVSQLVLFADDNLESEIKJIYRTC/C SYCSLSTCYHVUCTNTVEQLIKFTRCMLESSUCHYRVG/G SYGSLHTCYHILK ANTVSQLÍXF ASNTL£3PMAQYKTC/C SYUSMTTGTHILKACTVSQLJSFAHGALIjGEKKMYRVC/C ahc-LPPSVFPMKCGSYASFIALITNNLNSDLLNGIVG/S AS S SxCxxxxGOxxUKxkxxxxOxxOxxxxLxxxUxxxxV"C/G ■ i • • •
ASAFSSPFY--------------------SLPRF-IG/G
Рис. 7. Ы-концевая область продукта ОРСНа ВЖС содержит гипотетический домен папаин-подобной тиоловой протеазь*. Выравнивание фрагмента 348К белка ВЖС и НС-протваз потивирусов (ТЕУ. РРУ. РУГ, БМУ, РЕМУ, ТиМУ, ТУМУ и РЭВМУ) и бимовируса (ВаУМУ) делалось с помощью программы ОРТАЬ. Консенсус указывает консервативные или сходные остатки со всех девяти последовательностях, и, алифатический остаток; и. ароматический остаток; О, гидрофобный остаток; х, любой остатоя. Звездочками и жирным шрифтом отмечены совпадения мр»ду консенсусов и последовательностью болка ВЖС. Предполагаемые каталитические остатки Суз-509 и Н13-569 выделены восклицательными знаками.
мотива JxxxxGOCYU для группы белков, представленной на Рис.8 (J и U обозначают, соответственно, ароматические и алифатические остатки; О -ароматические либо алифатические остатки; х - любые аминокислотные остатки). Предсказание N-концевого домена папаин-пос 5кзй протеазн и сайта разрезания no GJy-588/Gly-589 косвенно подтверждалось ранеэ полученными результатами трансляции вирионной РНК ВЖС in vitro о лептах ретикулоцитов кролика. По этим данным, геномная РНК направляла синтез двух основных продуктов о мол.весом 65К и 250К (ferasev et al., 1939; Dolja et al., 1990), размеры которых хорошо согласуются с предполагаемой схемой автопротеолиза 295К продукта ОРС-1а.
Последовательность вставки между МТР и ХЕП доменами продукта О PC-la ВЖС содержит трипегттид OSQ (остатки 1283-1285), консервашзный мотив
consensus xxxxxxxxPxUxxxUxxxxxxOUUxDTCxxxxTUxUxxxxxxxxx
S S
CAEV РПО 1-92 SYGITSAPPMVQYRIGSQQRNLLF ГШб] ADRTIV---RWHEGSG
VISNA PRO 1-92 PYWTEAFPKIDIКYGTNVKKVLV DTG ADRTIV---RYHDNSG
OLV PRO 1-92 PYWTEAPPKIEIKVGTRWKKLLV ETC ADKTIV---T5HDM9G
HIVI PRO 1-90 PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEAIX DTG ACDTVL--EEMNLPG
HIV2 PRO 1-90 PQFSLWRRPWKACIEGQSVEVLL DTG VDDSIV---AGIEUGS
: 1 it tji :t t: BYV la 1259-1348 KTWRKAKVIUEAYWEVHFESILS DSC EYSA VEFCSSWITLL
consensus xxxxxxxUxCUGGxxxxxxxxxxxxxjooooaooocUOxxxxxxxxUOGIfflxU
N
CAEV PRO КРЛСП1Шу:1С01\таЕКТОМУЕЗЛУКСЕТШЯ1УУЬРСРРУЕУШ!1Ш VISNA PRO 1РТСН1ШК:1а:11ЕЕОСи1Ж^10УтСЯ1ЕЙТ1УУЬРЗЗРУЕУ1ЛН1»,'И OLV PRO ' IPKGRIILQGIGG11 EG EKUEQVHLQYKDKMIKGTIWLATS?VEYLGM*ffl HIV1 PRO KWKPKM-IGGIGGFIKVRQYDQILIEICEHKAIGTVLV-GPTPVNIIGBKLL HIV2 PRO HYTPKI-VGGIGGFIHTKEYKDV'EIEVVGKRVRATIin'-GDrPINIFGRIUL :t: i »• : !*:::": ti BYV la TNSGRL----LPGFSPSAIITEVLLDLATK-ISIEVLUCQISPADSTASSAL
Рис. 8. Вставка в- продукте ОРС-1а ВЖС содержит домен, отдаленно напоминающий кислые протеазы лентивирусов. Консервативный трипептид. типичный для активных центров кислых протеаэ, выделен рамкой. Консенсус обозначает консервативные остагпси в большинстве ретровирусных протеаз. Звездочками показаны совпадения и двоеточиями • сходные остатки между фрг- ментом белка ВЖС и протеззой ВИЧ-2. Остальные обозначения такие же, как и на Рис. 7. .
активного центра клеточных и ретровирусных аслартиловых (или кислых) протеаз (Rao et al., 1991). Компыотерное выравнивание показало некоторую степень сходства последовательности белка ВЖС длиной примерно 100 аминокислот, окружающей этот трипегттид, с доменами аслартиловых протеаз лентивирусов (Рис. 8).- Сайт разрезания в этом случае компьютерными методами предсказать было невозможно в силу вариабельности этих сайтов для различных аслартиловых протеаз (для сравнения отметим, что GG сайт разрезания палаин-подобных НС-протеаз инвариантен; см. Рис.7). Статистические оценки выравнивания белка ВЖС с протеазами вирусов иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2 - 4,3 SD при эволюционной дистанции 198,3 - в общем, типичны для родственных аминокислотных последовательностей (Doolittle, 1986). Хотя выравнивание последовательности ВЖС и пяти лентивирусных протеаз выявило всего лишь четыре инвариантных аминокислотных остатка, следует отметить примечательную консервацию остатков гидрофобных и неполярных аминокислот (Рис.8), которые важны для формирования характерной р-складчатой структуры этих протеаз (Rao et al., 1991). Эти наблюдения дают возможность предполагать, что уникальная вставка в большом неструктурном белхе ВЖС несет домен аспартиловой протеазы, вовлеченный^ дополнительный азтолротеолиз этого белка. Очевидно, это лишь теоретическое предсказание, к которому следует относиться с осторожностью, поскольку уровень сходства согменга белка ВЖС с аспартиловыми протеазами был невысоким, и подобный тип протеаз до сих пор в (+)РНК-содержащих вирусах не обнаруживался.
2.5. Доказательство процессинга продукта ОРС-1а лидерной
лротоазой
Для проверки автопротеолитичоского еыщепления N-концевою фрагмента из продукта ОРС-1а ВЖС были получены два типа зхспрессирующих конструкций. Клон рВ515 содержал фрагмент геномной последовательности
ВЖС между позициями 1 и 2604 (здесь и далее нумерация нуклеотидов с 5'-конца полной последовательности), т.е. весь 5'-некодирующий участок и фрагмент ОРС-1а, кодирующий полипептид с мол.весом 92К (92К). Нужная вставка была получена методом PCR с помощью эатрзаок 5 и 15 (Рис. 9А) и лигировалась между EcoRI и Xbal сайтами полилинкера плазмиды pGEM3 под контроль промотера фага Т7 (Agranovsky et al., 1993). Во втором клоне (рВД245, Рис.ЭА) первые 254 триплета ОРС-1а были замещены кодирующей последовательностью 11-ти триплетов, перенесенной из экспрессирующей плазмиды pQE-11, после чего такая промежуточная конструкция переклонировалась в pGEM3 между EcoRI и Xbal. Таким образом, оба типа клонов, 'полный* рВ515 и "усеченный* рВД245, содержали одинаковую правую часть вирус-специфической вставки, включая гипотетической домен папаин-подобной протеаэы и вероятный сайт разрезания (Рис.9А).
Трансляция синтетических Т7-транскригттов рВ515 in vitro в присутствии ^^S-метионина давала .меченые продукты с мол.весом 92К. 66К и 26К; транскрипты рВА245 направляли синтез 41К и 26К продуктов (Рис.ЭВ). Очевидно, размеры этих полипептидов полностью согласуются « автопротеолизом по предсказанному сайту (Рис.ЭА.В). Полученные результаты указывают, что удаление по крайней мере 245 аминокислот с N-конца продукта ОРС-1а ВЖС, равно кгк и добавление последовательности из 11 гетерологичных аминокислот (клон рВД245), не ингибируют процессинг. папаин-подобной протеазой; более юго, раэрезаниэ 67К продукта рВЛ245 на41|< и 26К фрагменты было количественным, в то время как разрезание 92К продукта рВ515 на 66К и 26К'фрагменты было неполным (Рис.ЭВ).
Нами были получены мутанты клонол рВ515 и рВД245, несущие точечные замены каталитических остеткоэ цистеинз-509 (на треонин) и гистидина-56Э (на глг;тЕМИновую кислоту), или же глицина-583 в сайте рагрезания (на аспартиловую кислоту) (Рис.7). Замены вносились* квтодом направленного олигонуклеотидного мутагенеза (Kunkrt et el., 1987).'Как показали результаты
Igffl
s*
-ж
66K
__IU1
2 мГ
с на/в
■ ■ 1 2SK t"pB518
-ш
<1К
' | ?SK Ь- рВЛ2«5
Imll
^R£§-i!ilfl«hhhhhhgl S H
I-----(ДСП-----1
* # ///J/Jtf/f
х ULiJJJJJJJl.
# f t
В2К»
«97К
«41К
26K- —-»-я- -2ек
Рис. 9. Анализ протеолитичиского процессинга гидерной папаич-подобной протваэой ВЖС. (А). Схема экспрессирующих конструкций На верхней шкале показаны дистанции в килобазах от 5'-конца генома и рестриктные сайты, использованные для клонирования. Боксами обозначены вирус-специфические вставки в плагчмидах рВ515 и рВА245; восклицательными знаками отмечены инициаторные кодоны, черными квадратиками каталитические остатки, пунктиром - гипотетический сайт разрезания Gly/Gly, и цифрами - мол.вес потенциальных продуктов разрезания. Плазмида рВЛ245 содержала последовательность из вектора pQE-11. отмеченную снизу пунктирной скобкой, включая RBS (синтетический участок присоединения рибосом). (В), Авторадиограмма белкового геля меченных 35Э-метионином продуктов, синтезированных при трансляции in vitro Т7 транскриптсв клонов рВ515 и рВД245; мутантные конструкции отмечены сверху соответствующих дорожек. Стрелки и цифры показывают положения мажорных продуктов и их мол.веса, определенные при сравнении с немечеными белкозыми маркерами
трансляции мугентных транскриптов, любая из этих точечных мутаций Полностью блокирует автолротеолиз и приводит к синтезу полнораэмерных продуктов 92К (рВ515) или 67К (рВД245) (Рис.9В). Замены неконсервативных остатков цистеина и гистидина в активном центре (Р>'с.7) имели различный аффект на протеолиз. Так, мутация по Hls-556 совершенно не влияла на разрезание, в то время как замены Суз-517 или -5 t 0 сильно его ингибировали (Рис.9В). Следовательно, неконсерв&тивный цистеиновый дублет может являться важным структурным элементом лидерной протеазы ВЖС, возможно, влияющим на конформацию ее активного центра. Это предположение согласуется с результатами, полученными при мутагенезе неконсервативных остатков цистеина в папаин-лодобной протеаээ вируса гиповирулентности грибкового увядания каштана (Chol et al., 1991).
Суммируя наши данные, можно заключить, что N-концевой (лидсрный) фрагмент действительно оыщвпляется из продукта 0РС-1а ВЖС в результате его автолротеолитического разрезания между остатками Gly-588/Gly-589. Результаты также подтверждают идентификацию каталитических остатков цистеина и гистидина, сделанную на основе анализа выравнивания тиоловых. НС-протеаэ потивирусов и протеазы ВЖС.
Выщепляемый в результате автопротсолиза лидерный белок ВЖС, как и у потивирусов, мог бы влиять на перенос вируса- насекомыми. С другой стороны, основываясь на положении ОРС-1а в геноме, можно предположить, что лидерный белок выполняет на Позднюю функцию (векторная трансмиссия), а раннюю - например, участвует в репликации или транспорте.
2.6. Резюме: стратегия экспрессии и дробление репликативных
доменов
С учетом сдвига рамки считывания, трансляция 5'-концевых генов "ВЖС должна приводить к синтезу набора лолипелтмдов.'а именно 295(( 'и 348К (продуктов ОРС-1а и ОРС-1а/1в, соответственно),' которые подвергаются
автопротеолиэу с образованием N-концевого 66К белка и 229К и 282К продуктов. Картина процессинга может быть и более сложной, если гипотетический домен аспартиловой протеазы действие ально активен, и соответствующий сайт разрезания находится в 348К продукте. По аналогии с другими вирусными системами, вполне естественно предположить, что только незначительный процент рибосом проходит стоп-кодон OPC-la ВЖС и считывает ОРС-1в. синтезируя фыожн-белок с полной кассетой релликативных доменов (МТР-ХЕЛ-ПОЛ). В ходе эволюции геномов многих (+)РНК-содержащих вирусов выработались механизмы, позволяющие экспрессировать домен РНК-зависимой РНК полимвразы отдельно от других релликативных доменов, или снижать уровень экспрессии этого домена. Например, у гордеивирусов и трикорнавирусов домены МТР и ХЕЛ, с одной стороны, и ПОЛ, с другой, закодированы в разных геномных РНК (Ahlquist et al., 1984; Gustafson et at., 1989). У тобамовирусов, тобравирусов и некоторых альфавирусов ПОЛ домен выражается в составе фыожн-белка при сквозном прочитывании слабого терминатора (Pelham, 1978; Hamilton et al., 1987). Принципиально сходный механизм, но с применением рибосомвльного сдвига рамки, используется лютеовирусами. доантовирусами и корона-подобными вирусами (Lai, 1990; Brault & Millar, 1992). Наконец, у пихорна-подобных вирусов растений и животных домены ХЕЛ и ПОЛ обнаруживаются в индивидуальных белках, образующихся в результате процессинга суперполипептида-предшественника (Eggen & Van Kämmen, 1988; Dougherty & Carrington, 1988).
Очевидно, аетомомизация и дифференциальная экспрессия доменов вирусных репликаз придает необходимую гибкость при регуляции различных ферментативных функций репликации РНК, таких, как разделение дуплексов, ассиметричный синтез плюс- и минус-цепей, синтез субгеномных РНК и кепирование матриц.
3. Поиск гомологий и предсказание функций гипотетических белков, закодированных в З'-концевой части генома клостеровируса
3.1. Маленький гидрофобный белок, продукт ОРС-2
Сравнение аминокислотной последовательности 6,4К белка, закодированного в ОРС-2 ВЖС, с базами данных, показало его наиболее близкое родство к 14К белку, продукту центрального гена в "тройном блоке' генов лотексвируса мозаики нарцисса (ВМН). Выравнивание 6,4К с Гомологичными гидрофобными белками потеке- и карлавирусов выявило два
1 I I II I I I
• • •
15 ршбктиаауусуэьауиупгткзтшггсш 1нзипжсшггшс-тту 9 гоп1пгу1£ААи:У5ЬА1УУ«1Х1пзтилт;пвонтрнссплт1х-ткз
12 'Л<5ЕКУУ1Уи:1^Г^У31ТШ^га(5и,НУСГ)М11БЬРНаСАУВ1ХЗ-ТКА
10 УНУПЗУУКУЬА1СШГА31УШ^ШЬР1т;Ш11Би>НССНУАГ)С-Т*П РСУ1ДЗУЦХАГОП.1С1ГШЛ.УУ-----------------ПУГУУКО
II • •
ю-уюты------сгойсроктiрьуца 31
ук-умбрс------шл81еагосат^ 30
хо-упср------тюнзуерснуиутор зо
хь-утрм----цютубишскл—аар 32
хкутвРыоиБьэаижйнлттитха 31
уо-трн-----язтетосггАЬСАУ!. я
--------тл<35яешш1бтуу
Рис. 10. Выравнивание последовательностей б,4К белка ВЖС и маленьких гидрофобных белков потеке- и карлавирусов. Слева и справа каждой последовательности указано число аминокислот, не вошедших в выравнивание. Жирным шрифтом и ззоздочками выделены идентичные или сходные сходные остатки во всех белках, восклицательными знаками - гидрофобные остатки. Непрерывный гидрофобный сегмент в белхе ВЖС подчёркнут.
слабоконсервативкь« района , (следует отметить, что только часть консервативных позиций между 6,44 ВЖС и 14К ВМН сохранялась о общем вьг явниваиииЬ с большим разрызом между ними в последовательности 6,4К белка (Рис. 10). N-1X11106800 район содержал силы» гидрофобный' сегмент, причем его длина была наибольшей в 6.4К белке (25 гидрофобных остатков
СУНУ 12К РУН 12К РУБ 12К РУХ 13К «С1МУ 13Х МНУ 14Х ВУУ 6.4К
СУМУ 12К РУН 12К т 12К РУХ 13К «С1НУ 13К МНУ 14К ВУУ 6.4К
подряд; Рис.10). Возможно, этот сегмент служит в качестве "якорного" пептида, закрепляющего вирусный белок в клеточных мембранах (Agranovsky et al., 1991а); это предположение согласуется с мембраносвязывающими свойствами б,4К In vitro (см. обзор Dofya et al., 1994).
Гены, кодирующие компактные гидрофобные белки, гомологичные 6,4К ВЖС, были недавно обнаружены в геномах клостеровирусоа тристецы цитрусовых (ВТЦ) и инфекционной желтухи салата-латука (ВИЖЛ) (см. обзор Dolja et al., 1994). Такая консервация гена и его продукта указывает на некие общие механизмы репродукции клостеровирусной инфекции, с которыми связана специфическая функция этих белков. Гомологичные белки, закодированные в тройном блоке генов потеке- и карлавирусов, обладаю* способностью связываться с клеточными мембранами (Morozov et al., 1990) К вовлечены в транспорт вирусной инфекции из клетки в клетку (Morozov et al;. 1989; Beck et al., 1991). По аналогии можно предположить, что вероятна* функция 6,4К белка также связана с транспортом клостероеирусной инфекций (Agranovsky Mat., 1991s).
3.3. 65К белок, продукт ОРС-3, является уникальным гомологом
клеточных бел хоо теплового шока семейства HSP70
Наиболее неожиданное и интересное свойство клостеровирусного генома - это присутствие гена 65К белка, гомолога клеточных белков теплового июка семейства HSP70 (Agranovsky et el.. 1991а). Сходство аминокислотных последовательностей 65К и белков HSP70 было в выезкой степени статистически достоверным, со значениями до 10 SO при попарных дот матриксиьк сравнениях Вместе с тем. клеточные HSP70 при попарных сравнениях друг с другом давали более высокие статистические значения. Эти денные, а таске анализ выравнивания (Рис.11), указывают, что 65К ВЖС является наиболее дивергированным членом данного семейства белкое. *
onaxe
НТР70ТСЯ СП78НЦН hs70hum KS71M0U 1E7CAEE HS71YEA HS70MA1 HS72DR0
Л а
• * *•• • •■*•« * •• •••
3 IIGIDLGTTNSCV 125 VITVPAYFHDAQRQATKDAGRIAGLEVKRI1HTPTAAALAYGLD
28 VICIDLCTIYSCV 122 VVTCPAYFMGPQHQAHCDAGTIACLMVIRW1KPTAAALAYCU)
29 WCUJLCTr*SCV 129 VVTVPAYrHDAQRQAlXMGTIACLNVffilINEFTAAAIAYGLD 5 AVCIDUrmSCV 128 VITVPAYTNDSQRCIATKDAGVIACLNVLRIIKEPTAAAIAYCLD 5 AVCIDUrmSCV 128 VVTVPAYFKDSQRQATÍCDAGTIACLNVLRI INEPTAAAlAYCLD 5 AVCIDLCTTYSCV 129 WTVPTYFNDSQRQATKDAGA1ACLNVLRIIHEPTAAAIAYCLD 3 AVCIDLCTTYSCV 128 VVTVPAYrNDSQRQATKDAGTIACLNVLRIIHEPTAAAIAYCLD 7 AIGIDLGTTYSCV 128.WTVFAYFKDSQRQATKDAGVIACLNVKRIINEFTAAAIAYCLO 2 AIGIDLGTTYSCV 128 VITVPAYFNDSQUQATKDAGH1 ACLNVLRIIHEPTAAALAYGLD
65KBYV 2 VFCLDFGTTFSSV 133 1 CSVPANYNOjQRSFTESCVm^YPCTYKVNEPSAAAJLSACSR
DNAXE 7 IAVYDLGGCTTDISIJ
КТР70ТСП 6 IAVYDLGGGTFDISVL
GR78HUH 7 ILVFDLGCCTrUVSU.
HS70HUM 8 VLlFDUGGCTrUVSIL
KS71H0U 8 VLIFDLCGGTnJVSIL
HS7CAEE 8 VL1FDLCGGTT0VSIL
HS71YEA 7 VLinnJGGCTnjVSU.
HS70KAI 10 VLIFDLCGCTFDVSLL
KS72DRO 8 VUFDLGCCTFDVSIL
0
• a •• •»• • •
10 rEVLATNGDmCCEDFDSRLIHYL 96 6 FEVKATNGDTHIjCGEDFDLCLSDYI 96 6 FEWATNCDTHLGGEDFDQRVHEHF 92 6 FEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHF 92 6 rEVKSTAGOTHUCGEDnWHHVRHF 92 6 rEVXSTACDTHLCGEDFDNHMVHWF 92 6 rEVKATAGOTrajCGEDFWRLVHHF 92 6 FEVKATACDTHUCGEDFWmHVHHF 92 6 FEVF'^TAGDTHLCGECFDNRLVTlfl. 92
65XBYV 7 VLVYDrCCCTTÜVSVl 6 FWRASCCEHNLCCRDIBICAFVEHL 84
DHAKE МТР70ТСЙ GH78IIUH HS70HUN HS71M0U HS7CAEE 1Б71УЕА HS70MAI 1Б72Ш0
65KBYV
VILVGCQTRMPMVQKKV 12 mVCCMTOlPICVIEAV 12 IVLVGCSrminCIQQLV 13 LVLVCGSTRIPKVQKU. 13 IVLUGGSTRIPKIQUX 13 IVLVCCSTRIPKVQKU. 13 m.vaaroimQKL»
WLYCGSTRIPKVQQL-xm'ccsraiiTVQstx
13 13 13
• •• • • » •
KPDEAVAIGAAVQGGVLTGD 3 HPDEAVALGGATLGGVLBRD 3 NPDEAVAYCAAVQAGVLSGD S HPDEAVCYCAAVQAAILMGD 7 NPDEAVAYCAAVQAAILSCD 7 KPDEALAYCAAVQAAILSCD 7 KPDEAVAYCAAVQAAILTGD 7 WPDEAVAYGAAVQAAILSGE 6 KPDEAVATCAAVQAA tLSGD 7
LUtVGGSSYLFGlLSBI. 13 DARAAYAGGCALYSACLRND 2
В
ONAXE MTP70TCR GR78HUM HS701PJM KS71IRW 1Б7САЕЕ KS71YEA HS70MAI 1Б72КЮ
65KBYV
VtXLUVTP-LvmjvTP-LVLLHVCP-LL1XDVAP— 1Ш.ПУТР-1111ПУАР--Щ1ГСУАР--LIXL0VTP-VU.VDVAP-
--LSLGIETMGGVKTT 56 -LSLGVErjCGVrra 57 ■LTLCIETVGCVfflX 56 LSLCLETAGCVHTA 56 LSLGIETAfiGVKTV 56 LSLGimGCVHTA 56 LSLGIETAGGVHTK 56 LSLGLETAGCVMTV 56 LSLGIETAGGVHTK 5«
юото-х mr 162
RGVPQ-IEVTF 160 1SCVPQ-IEVTF 154 BGVPQ-IEVTF BGVFQ-IEVTF nGVPQ-IEVTF nGVPQ-IEVTF BCVPQ-IIVTF BGVPQ-IEVTF
164
169 162
170 166 170
KUVDCAAHiaSISEKYCESIVCV 60 ВТУП-ТЦЕЮТ 122
Рис. 11. Выравнивание фрагментов 65К белка ВЖС и последовательностей белков теплового шока семейства HSP70. Консервативные домены А-Н выделены и обозначены, гак в работе Гшд 4 Lee (1938). Для неконсерватизньк участи» указано число остатков. Остальные обозначения такие же, кзх иа Рис. 10.
Белки HSP70 являются "шаперонами", т.е. балками, помогающими правильному сворачиванию других белков, их транспорту и секреции внутри клетки, а также формированию мультимерных белковых комплексов (Pelham. 1988; Rothman, 1989). Таким образом, хотя они получили собирательно« название "белки теплового шока", далеко не все HSP70 связаны собственно с ответом клетки на стресс. Несмотря на широкий репертуар функций HSP70, все они АТФ-зависимы, т.е. работа шаперонов сопровождается связыванием и гидролизом АТФ (Gattung & Sambrook, 1992). Аминокислотные последовательности HSP70 высоко консервативны в белках из разных типов клеток, от бактерий до человека. Наиболее консервативной является N-коицевая часть молекул, с которой связана АТФазная активность шалерона; С-концеоая область белков HSP70 принимает. участие в белок-белковых взаимодействиях (Chappell et а)., 1988, 1987), что естественно объясняет большую вариабельность ее последовательности.
Мы опирались на эти данные, пытаясь представить себе возможные функции 65К, гипотетического клостеровирусного шапврона. Анализ выравнивания последовательностей показал, что консервативная область в 65К ВЖС и HSP70 захватывает примерно 450 остатков с N-конца белков, в то время как их С-концевые сегменты показывают лишь очень слабое сходство (Рис.11). В N-концевой части 65К обнаруживаются восемь консервативных доменов, ' присутствующих во всех белках HSP70 (домены А-Н, Рис.11) и связанных с АТФазной а>. ивностью этих белков (Chappoll et al., 1988; Tino & Lee, 1988). Таким образом, функция 65К белка ВЖС при вирусной инфекции скорее всего является АТФ-зависимой, как и функции клеточных шаперонов HSP7Q. Можно предложить несколько гипотез о роли вирусного шалерона в репродукции ВЖС, например, он мог бы участвовать в сборке вирус-специфических белок-белковых или белок-нуклеиновых комплексов, от мультикомпонентной репликазы до вирионов. Однако, наиболее привлекательной представляется гипотеза о вовлеченности 65К в транспорт вирусной инфекции из щетки в
клетку. По данным Карасева и др. (19Э2), меченый 65К, синтезируемый а бесхлеточной системе при трансляции Т7 транскрипта ОРС-3, связывается Irr vitro с микротрубочками клетки, причем это связывание усиливается при гидролизе свободной АТФ апираэой. Как известно, микротрубочки осуществляют внутриклеточный молекулярный транспорт, включая и транспорт некоторых мРНК (Davis et al„ 1987).
Гены, кодирующие Н5Р70-подобные белки, были недавно обнаружены и о частично отсеквенированных геномах еще нескольких представителей группы клостеровирусов, причем по аминокислотным последовательностям все они гораздо ближе друг к другу, чем к клеточным шаперонам (Oolja et al., 1994, In press). По-видимому, ген HSP70 был захвачен геномом предка современных клостеровирусов в результате "перетасовки генов", т.е. рекомбинации с хозяйской мРНК, и затем значительно • дивергиросал о хода 'эволюции, приспосабливаясь к выполнению новых функций.
3.3. Дупликация гена белка оболочки в клостеровирусном геноме
Структурный белок (СБ) ВЖС закодирован в ОРС-6. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: а) мол.вес и аминокислотный состав (Табл.2) продукта ОРС-6 очень близки к экспериментальным оценкам, полученным в ранних работах для белка из очищенного вируса (Carjtenter et al., 1977; Short et al., 1977); и б) продукт ОРС-6, клонированной в экспрессирующий вектор, давал четкую позитивную реакцию с антисывороткой к ВЖС, и наоборот, антисыворотка к очищенному рекомбйнантному продукту узнавала вирусные частицы (см. ниже).
Неожиданным результатом, полученным при сравнении белковых последовательностей ВЖС, было явное сходство СБ, продукта ОРС-в, и 24К белка, продукта соседней OPC-S. При компьютерном сканировании баз данных единственным, белком, показавшим статистически достоверное сходство с СБ и
-[flfinmu^ ft
Аминокислотный состав структурного белка ВЖС
Аминокислота Число остатков на субъединицу белка
А Б в
Алании 14 17 17
Аргинин 11 12 12
Асларагин 17 1в 22
Валин 5 7 в
Глутамин 22 22 21
Глиц1'" 18 .17 21
Гистидин 5 5 в
Иэолейцин в 7 0
Лейцин 28 26 31
Лизин 14 14 17
Метионин 0 1 1
Пролин 8 8 в ,
Серии 17 16 21
. Тирозин 6 4 3
Треонин 15 15 17
Триптофан 0 0 0
Фенил ал анин 8 11 /
Цистеин 7 в 3
А, аминокислотный состав продукта ОРС-6 украинского штвм«а ВЖС, полученный с помои'ыо компьютерной транслвц/и. Б, В, аминокислотный состав' структурного белка иэ очищенного британского штамма ВЖС, определенна" экспериментально в работах Carpenter et al. (1977) и Short et al„ 1Q77, соответственно.
24K белком ВЖС, оказался структурный белок родственного клоствровируса ВТЦ 23 из 200 аминокислот в общем выравнивании были инвариантны для всех трех белков, и еще 39 позиций были заняты функционально сходными остатками (Рис. 12).
Анализ выравнивания (Рис. 12) указывает, что СБ и 24К ВЖС имеют
сходную пространственную структуру; поэтому естественно предположить, что •
consensúe •+ +_ + — + + + +,
BYV CP ( 3-193) AIAT-FENVSLAD--QTC---LHGEDCDKLRKNFEECLKLK—GVPEDHL
*, * *, . ** * , * • « * . * * ;
BYV р24 (20-216) AMETFFNSYDIAEYSEVNPNKLNRKETDELLGVIEERFKSEL-VITDEDF • * « , . *.*, * ¡ * *
CTV CP (38-221) TLIT-MNDVR-----Q-----LSTQQNAALNRDLFLTLKGKHPNLPDKDK
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaa a
1 10 20 30 40
consensúa ++ ++++ + ч-S + + + ■ +
BYV CP GIAIGLCLYSCATXGTSNKVMVQPTS-TFIKASFGGGKELYLTHGELNSF-LGSQKL *. *. * * ** ***• ¡ *** :* : * *
BYV p24 VKBLAFALIRAANITTSVKVNYVGAY-EYTI----GGKK-FLVKDAW-VFPLIKECM
¡» * * * ;; ; ** * * * ; ; •
CTV CP DrRIAMMLYRIAVKSSSLQSDDDATGITYTR----EGVEVDLSDTO,WTDVVFNSKGI
aaaaaaaaaaaaa bbbb aaaaaaaaaaaaaaaaa
50 60 70 80 90 100
! £ ч rf ! f
consensus +R ♦+ y + y + ky fDFy
BYV CP IE-GKPNKLRCFCRTFQKDYISLRKEYRGKLPP1ARA-HRHGLPAEDHYIAADFIS *** .****«. *».;•; ** ; * ..*;*' .*;***;;
BYV p24 KKFHKPNPVRTFCATFEDAYIVIARSLP-KL-FLNRTIGKEGIPSGYEFLGADFLT *.*.*. * . *. . * * . * . *** ** ■•* *****
CTV CP G--UKTNALRVWGRTNDALYIAFCRONR-HX.SYGGRPLD-AGIPAGYHYLCADFLT a bbbb aaaaaaaa bbbbaaaaa
110 120 130 140 150 160
e
consensúa + d ++ + *■ +
BYV CP TSTE-LTDLQQSRLLLA-RENATHTEFSS-ESPVTSLKQLGRGLG .. * * . .* * * ****** .*** *
BYV p24 ATSVCLNDHEKAIVLQASRAAXDRAVSSSTOGKIVSLFDLGR-LS . * * * *...** ... * . . ;**; ;
CTV CP ¿AG—LTDLECAVYIQA-JCEQLIJCKRGAD-DWVTNVRQLGK-FN aaa aasaaaaaaaaaaaa bbbbb
170 180 190 200
Рис. 12. Выравнивание последовательностей СБ и 24К белков ВЖС, и СБ клостеровируса тристецы цитрусовых. В строчке "консенсус" заглавными буквами указаны строго консервативные остатки в общем выравнивании 16 последовательностей СБ нитевидных вирусов, и прописными буквами -консервативные остатки, встречающиеся в 12 из 16 последовательностей (ЭоЦа е1 а1.,. 1991). Плюсами отмечены консервативные позиции, занятые гидрофобными остатками. Остатки аргинина и аспартиловой кислоты, предположительно сформирующие солевой мостик, отмечены восклицательными знаками. Показаны участки, предположительно имеющие а-спиральный (а) и р-складчатый (Ь) тип вторичной структуры.
они могут выполнять похожие функции (Воуко ег а!., 1992). Хотя общий уровень консервации последовательностей (30%) указызает на существенную
дивергенцию 24К от СБ ВЖС, почти все консервативные аминокислоты, типичные для структурных белков нитевидных вирусов растений (Dolja et а!.. 1991), сохраняются в обоих клостеровирусных белках. В тех случаях, когда в клостеровирусных белках наблюдались отклонения от консенсуса, выведенного из общего выравнивания СБ, они, как правило, были общими для 24К и СБ 8ЖС и ВТЦ (Рис. 12). Следует особо отметить, что остатки серииа-66, аргинина-115 и аспартата-158, инвариантные, для всех СБ нитевидных вирусов, есть и в 24К белке ВЖС; последние два остатка предположительно образуют функционально важный солевой мостик в структурных белках данного типа (Dolja et al., 1991). Консервативные аминокислотные остатки в 24К и СБ ВЖС в общем выравнивании были, в основном, гидрофобными, т.е., вероятно, это те остатки, которые определяют пространственную укладку белков. Наконец, предсказание вторичной структуры с помощью алгоритма Гарнье указывало на сходство ее основных элементов в СБ и 24К; оба белка имеют а-спиральный тип структуры (Рис. 12).
Гены, кодирующие диоергированные копии структурных белков, причем гомологичные СБ и 24К ВЖС, были обнаружены также в неопубликованных последовательностях клостеровирусов ВТЦ и ВИЖЛ (Dolja et el., 19S4, in press). Наиболее вероятным эволюционным сценарием появления этих генов представляется дупликация гена СБ в геноме предка клостеровирусов с последующей дивергенцией последовательностей (Boyfco et в)., 1992).
Дупликация гена СБ в геноме (+)РНК-содержащого вируса со спиральном типом симметрии обнаружена нами впервые. Ближайшую аналогию представляют геномы некоторых сферических вирусов, пикорнавирусов животных и комовирусов растений, кодирующие, соответственно, три и две дивергироеаиные копии СБ. Однако, в отличие от ВЖС, сходство между структурным) белками этих вирусов проел ивазтея в основном на уровне вторичной и третичной структуры, в то время как степень сходства их
аминокислотных последовательностей несравнимо ниже таковой для 24К белка И СБ ВЖС.
Высказывавшиеся нами ранее гипотезы о функции 24К в клостеровирусной инфекции базировались на допущении, что этот белок не входит в состав вирусных частиц (Воуко е1 а!., 1992). Об этом свидетельствуют следующие факт: (а) при электрофорезе СБ из диссоциированных вирионов выявляется только одна зона, соответствующая белку с мол .весом 22,5-кДа, т.е. продукту ОРС-6; и (б) гминокислотный состав, вычисленный для продукта ОРС-б (но не продукта ОРС-5), близок к экспериментально определенному для белка из очищенных частиц ВЖС (Табл. 2). Основываясь на данных об общности структуры 24К с СБ нитевидных вирусов, было сделано предположение, что этот белок принимает участие в формировании альтернативных вирус-специфических нуклеолротеинов, например,, информосом, предназначенных для транспорта инфекции по растению (Воуко « а!., 1992).
Хотя эта гипотеза пока не может быть ни подтверждена, ни опровергнута, полученные нами недавно предварительные данные по иммуно-электронной микроскопии частиц ВЖС, заставляют предложить альтернативную функцию для 24К белка. При обработке адсорбированного на подложку ВЖС поликлональной антисывороткой к рекомбинантному 24К белку,' окспрессированному в Е. со//, один из концов частиц декорировгугся этими антителами и затем четко обозначался вторичными антителами, меченными золотом. Было замечено также, что сегмент длиной около 50 нм на одном из концов частицы ВЖС (общая длина 1250-1450 нм) имеет структуру, морфологически отличную от остальной части вириона; именно этот сегмент специфически метится антителами к 24 К белку. Эти результаты свидетельствуют о том, что 24К, дизергирозгнный дупликзт СБ, является минорным структурным белком ВЖС.
Капсиды некоторых вирусов растений, например, сферических лютеовирусов и палочковидных фуровирусоз, содержат небольшое количество
модифицированного СБ с длинным С-концевым "хвостом* (Bahner et al., 1Э9С; Richards i Tamada, 1992). Такой фыожн-бе/кж образуется при сквозном пропитывании слабого терминатора в гене СБ; предполагается, что i*t инициирует сборку аирионов и является детерминантой переноса фуровирусов грибковыми зооспорами и лютеовирусов тлями. В этой связи следугг вспомнить, что клостеровирусы - это одна из немногих групп нитевидных вирусов растений, представители которой переносятся векторами полуперсистентно, т.е. вирусные частицы задерживаются в насекомом и сохра'мют в нем инфекционностьдо 72 часов (Duffus, 1977). Это подразумевает существование неких факторов, ' обеспечивающих более тесное и специфическое взаимодействие клостероаируса с насекомым-вектором. Можно предположить, что конец частицы ВЖС, построенный из 24К белка, также служит детерминантой переноса вируса тлями. Например, взаимодействуя с неким рецептЪром, он мог бы закреплять частицу в пищеварительнсм тракте или стилете насекомого.
3.4. Продукты других генов в клостеровирусном геноме
Ранее сообщалось, что последовательность 64К, продукта ОРС-4 (Рис. 1), содержит внутренний сегмент длиной примерно 100 остатков, показывающий отдаленное сходство с сегментами другого семейства клеточных белков теплового шока, HSP90 (Koonin et al.; 1991). Однако, в гомологичном 61К белке ВТЦ сохраняется только часть консервативных позиций выравнивания 64K/HSP90 (В.Бойко и Е.Кунин, персональное сообщение). По-видимому, решение вопроса об эволюционном родстве и функциональном сходстве 64К с, белками HSP90 потребует секвенирования геномов большего числа клостеровирусов и построения более полного выравнивания, либо экспериментальной проверки.
Достоверных гомологий для 20К и 21К белков, продуктов З'-концевых ОРС-7 и ОРС-8, в современных базах данных пока найдено не было. В геномах
двух Других клостеровирусое, ВТЦ и ВИЖЛ, положение и последовательность продуктов этих генов варьирут. Так, в геноме ВТЦ закодирован 20К продукт,' близкородственный 21К ВЖС, и 18К продукт, показывающий лишь отдаленное сходство с 2СК ВЖС: в геноме ВИЖЛ эти гены отсутствуют (Dolja et al., 1994). Следует отметить также, что аминокислотные последовательности продуктов ОРС-7 и ОРС-8 были наиболее вариабельны на уровне штаммов ВЖС (Табл. 1). Такая пластичность низкомолекулярных белков ВЖС примечательна, поскольку указывает на повышенное, по сравнению остальными вирусными белками, давление естественной селекции на их последовательности. Возможно, это объясняется выполнением этими белками неких функций 'быстрого реагирования"; например, они могли бы быть связаны с модуляцией симптомов При инфекции или с адаптацией вируса к насекомым-переносчикам.
3.5. Резюме: вспомогательные гены в геноме клостеровируса
Согласно приобретающей популярность концепции. Вирусные геномы содержат консервативные гены "сердцевины", кодирующие ферменты реплъжации РНК, и значительно более вариабельные гены "чехла", продукт которых выполняют вспомогательные функции (Koonin & Dolja, 1993). В геномах (+)РНК-содержещия вирусов растений (исключая пикорна-подобные вирусы! можно выделить три генных модуля (блока): релликазный, трансрортный и структурный. 3 минимальном варианта каждый из вспомогательных модулей содержит только один ген, как в генома 8ТМ; с другой стороны, транспортный модуль у потеке-, керла-, гордеи- и фурооирусов представлен "тройным блоком" генов (Morozov et el., 1989). Наконец, геномы всех описанных до
настоящего времени вирусов растений со елнргльным типом симметрии (и, %
шире, веля Синдбис-подобных вирусов) содержат один ген структурного белка. Анализ структуры генома ВЖС указывает на болев широкий круг вспомогательных генов, сосредоточенных в З'-концееой трети последовательности РНК. В частности, высказывалось предположение, что
модуль транспортных генов клостеровируса кодирует несколько белков, включая и АТФ-зависимые шапероны (Адгапоуэку е1 а!., 1991а,Ь; КоогИп е1 а1., 1991). Данные о присутствии второго структурного белка в частицах ВЖС указывают на возможность принципиально новых механизмов самосборки (или даже более сложного типа сборки с - участием других белков) и функционирования вирионов. Не следует забывать, что инфекция ВЖС, как и других клостеровирусов, ограничена проводящими тканями растения, и вирус переносится тлями полуперсистентным Образом: Достаточно сложная биология взаимодействия клостеровируса с хозяином и переносчиком может, таким образом, естественно отражаться а расширении репертуара закодированных в геноме функций.
4. Экспрессия белков ВЖС в бактериях и в растениях
4.1. Экспрессирующие конструкции и очистка рекрмбинантных,
белков
Для экспрессии продуктов генов ВЖС в Е. со// мы' использовали плазмиды серии рОЕ (ЙЛСЕИ), содержащие кассету, последовательностей лромотера фага Т5; синтетический участок для связывания рибосом, короткую ОРС, кодирующую пептид Мет-Лиз-Гли-Сер-бхГис, и полилинкер (Рис." 13Б)', Продукты генов, вставленных в полилинкер в рамке с короткой ОРС, должны экспрессироваться с М-концевым. довеском из 11 аминокислот,' включающим последовательность из 6 гистидинов, что.позволяет очистить .рекомбинантный белок с помощью аффинной хроматографии на Ш-МТА вгарозе (Рис. 13Б; НосЬиН е1 а!.. 1988).
Для получения экспрессируюШих конструкций 24К и' СБ ВЖС использовалась следующая стратегия. кДНК, полученная на матрице вирионной РНК с затравкой 1,' использовалась для РСЯ-амплификации с той же затравкой ' и одним из позитивных праймеров (22 или 24), представляющих начало гена СБ или 24К белка (Рис. 13А). В оба позитивных праймера был введен сайт Вд1 II.
Hind Xho
13 14 • 15
8.8 ♦ Ч 9 . ♦
0RF4 | If 0RF6.CP lorn I a'
Il 1 0RF5.р24 I 0RF7 I
zî * ■ \
P2*l
CP I
pQE-BYVpZ4
T5f«d» r.BS CtH» TTSGœca:==
I H |<йэ»даез««еа1 lra»h<-| pQE-BYVCP
e> t щ s e s I
* ATBGBAC M f
Рис. 13. Общая схема экспериментов по экспрессии СБ и 24К белка ВЖС в бактериях и картирования 5'-концов субгеномных РНК. (А) Шкала обозначает З'-концевой район вирусного генома с отмеченными дистанциями в килобазах от 5'-конца и рестриктыми сайтами, применявшимися' для клонирования фрагментов. ОРС отмечены боксами, восклицательные знаки обозначают первые AUG кодоны в ОРС-5 и ОРС-6. Стрелки указывают положения затравок, применявшихся для реакции PCR <1, 22 и 24) и картирования концов (6, 8 и 9); продукты реакции изображены в виде узких боксов. (Б) Схема плазмидных конструкций pQE-BYVCP й pQE-BYVp24. Обозначены Т5 промотер, участок присоединения рибосом (RBS) и последовательность, кодирующая 11 остатков плазмидной ОРС (строчные' буквы), включая 6 остатков гистидина. Первые триплеты и соответствующие аминокислоты ОРС-5 и ОРС-6 _ показаны заглавными буквами.
Продукты реакции PCR обрабатывались рестриктаэами и лигировались в плаэмиду pQE-9 между соответствующими сайтами полилинкера (Рис. 13Б). Эти конструкции использовались для трансформации клеток Е. coli штамма M15.
Уровень экспрессии СБ и 24К ВЖС в клетках В. coli, несущих рекомбинантные плаэмиды, составлял 25-35% от общего количества бактериального белка (Рис. 14). Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков в денатурирующих условиях (Laemmll, 1970)
соответствовала молекулярным весам, вычисленным для продуктов ОРС-5 и ОРС-б. 24К ВЖС имеет аномальную подвижность и мигрирует в геле быстрее, чем СБ (Рис. 14; Boyko et al., 1992). Аффинная хроматография на NI-NTA агароэе позволяла практически полностью очистить оба белка (Рис. 14), которые далее использовались для иммунизации и получения кроличьих антисывороток.
M i 2 3 4 S в »
45 К----fiÉf» ' »3 '
36 К--§Вк-~т '
W--- щщЖЩр ■
29К- ■ ~v- —à -.rs
24K- m M
. 20 K- »s. _ . *
мк-%2 m rs \
Рис. 14. Электрофореграмма белков, экспроссированных в штамме Е coll М15 (8-20% градиентный денатурирующий гель). Дорожка М, маркеры с указанными мол.весами; 1, суммарный белок из 'неиндуцированных клеток с плазмидой pQE-BYVCP; 2, то же после индукции 1мМ IPTG; 3, 4, соответственно, рекомбинантные СБ и 24К ВЖС после очистки Ha NI-NTA-агарозе; 5, суммарны" белок из клеток, несущих плазмиду pQE-BYVp24, после индукции; 6, то же, без индукции.
Поскольку N-концевая последовательность 65К белка гомологична таковой в белках семейства HSP70, для получения 85К-специфичного антигена для иммунизации клонировался не весь ген, а его фрагмент, кодирующий не» ~>нсервативный С-концевой пептид. Схема клонирования основывалась на том, что последовательность ОРС-3 содержит единственный рестриктный сайт Sau За, ниже которого лежит часть OH<J-S, кодирующая 17К пептид. Рестриктный фрагмент Sau За - Sal I клона гЗ вставлялся между Bam HI и Sal I
сайтами полилинкера плаэмиды рОЕ-11, попадая в рамку со стартовым AUG кодоном и последовательностью шести гистидинов. Результирующий С-концевой пептид 6SK белка с мол.весом экспрессировался в данной системе и счищался тем же методом, что и СБ и 24К 8ЖС (результат не показан). Полученный антиген использовался для получения поликлональных антител к 17К пептиду 65К белка (АС-17К).
4.2. Серологические свойства структурного белка ВЖС и его 24К-
гомолога
Серологические свойства СБ и 24К белка ВЖС изучались для разных состояний этих белков: для белка, денатурированного при электрофорезе в присутствии додецилсульфатл натрия (ДСН) и перенесенного на нитроцеллюлозные мембраны (Вестерн-блоты), для белка, денатурированного 8М мочевиной, и для нативного белка (иммуно-ферментативный анализ, ИФА). Для получения рекомбинантного 24К и СБ в натиеной (растворимой) форме, элюат с NI-NTA-агароэы, содержащий фракцию очищенного белка, подвергался градиентному диализу против буфера, не содержащего мочевины.
Очищенные рекомбинантные 24К и СБ ВЖС давали, соответственно, слабую и сильную реакцию на Вестерн-блотах с поликлональными антителами к вирусу (Рис. 15Г). Этот результат согласуется с данными по иммунопреципитации меченых продуктов ОРС-5 и ОРС-6, синтезированных In vitro, с этими антителами (Boyko et el., 1992). Кросс-реакции между 24К и СБ наблюдались и с использованием антисывороток к рекомбинантному 24К (Ас-24К) и СБ (Ac-СБ) (Рис. 15А.Б). Истощение АС-24К рэкомбинантным СБ практически полностью снимало ее способность Реагировать с СБ (Рис. 15В). Аналогичный результат был получен при истощении Ac-СБ рекомбинантным 24К белком. Наконец, очистка антител из Ас-24К или Ac-СБ с помощью сорбции на гомологичные антигены, перенесенные на нитроцеллюлозу (Harlow & Lane, 1989), не снимала их способности реагировать с гетерологичным белком на
Вестерн-Слотах. Все эти данные свидетельствуют о том. что СБ и 24К белок ВЖС имеют общие антигенные детерминанты (эпитопы), устойчивые к денатурации ДСН.
1 2 3 4 6 6
-А«р24
Б
-Л»СР
В
АС* р1 рЗО вЭО^ Г Л I Г. I Ь I
-Аар24 РГ.СР
i
I
1:
. _ _ -Авр24 _ . — -ч» [ ргСр
Рис. 15. Весте?н-блоты СБ и 24К белков ВЖС, экспрессировашых в бактериях и в растениях Т. ехрапза, зараженных вирусом. Белки разделялись в линейном 15% денатурирующем геле. Блоты обрабатывались поликлональными аитисыворотками к очищенному ВЖС (АзВУУ), или к' индивидуальным рекомбинантным СБ и 24К (АзСР и Азр24, соответственно). Блоты С и О обрабатывались Аэр24, предварительно истощенной рекомбинантным СБ ВЖС. (А-С), на дорожки 1, 2 и 3 наносилось 1, 0,1' и 0,01 микрограмма рекомбинантного СБ ВЖС; на дорожки 4. 5 и 6 - такие же количества рекомбинантного 24К белка. (О), левая и правая дорожки - 1 мкг рекомОинантного 24К и СБ, соответственно. (Е), Субклеточные фракции из зараженных ВЖС (1) и здоровых растений (Ь). Дорожка с«, фракция клеточных стенок: р1. осадок при 1000 д; рЗО и в30, осадок и супернатънт при 30000 д. На край»» две дорожки (р24 и СР) в качестве контроля наносились, гк> 1 мкг, рекомбинантный 24К и СБ ВЖС.
Для тестирования серологических свойств растворимых белков мы использовали два варианта ИФА - непрямой тест (адсорбция белха на> полистирольную плашку - реакция с Ас-24К или Ас-СБ - реакция с коньюгатом на основе антикроличьей сыворотки) и прямой сэндвич-тест (адсорбция антител Ас-24К или Ac-СБ' на плашку - реакция с белком - реакция с коныогированными антителами из Ас-24К или Ac-СБ). Кросс-реакция между 24К и СБ наблюдались в непрямом ИФА тесте, причем реакция была более сильной в варианте Ас-24К/СБ (Рис. 16). Однако. в прямом ИФА тесте кросс-реакции практически не ■ было (Рис. 16). что может объясняться более узкой избирательностью антител.
и
структура которых модифицирована конъюгацией с ферментом (Koenig, 1981; van Regenmorte) & Burkhardt, 1980)
Рис. 16. Реакции денатурированного и нагиеного СБ и 24К белков ВЖС и вирусных частиц, с онтисыворотками к каждому рекомбинантному белку при иммуноферментном анализе. DAS, прямой "сэндвич-тест*; РТА, непрямой тест. В каждой колонке слева направо идут - денатурированный 24К; нативный 24К; денатурированный СБ; натияный СБ; очищенный препарат ВЖС.
В прямом ИФА тесте, Ас-24К лучше реагировала с денатурированным 24К, чем с нативным, указывая тем самым, «по многие эпитолы этого белка язляотся крилтотопзмн (Рис. 16). В непрямом тесте такой разницы не
наблюдалось, что можно объяснить частичной денатурацией натианого 24К при сорбции на полистирол, приводящей к экспонированию скрытых эпитолов. Наконец, рекомбинантный СБ в нативной и денатурированной формах давал почти одинаковые сигналы в обоих вариантах ИФА (Рис. 16). Однако, реактивность Ac-СБ с очищенным вирусом была выше в непрямом ИФА тесте (вероятно, из-за частичного раздевания частицы при сорбции в щелочном буфере и высвобождения СБ). Можно предположить, таким образом, что некоторые эпитопы, узнаваемые антителами на свободном СБ ВЖС, который использовался для иммунизации, недоступны в собранных вирусных частицах.
4.3. Экспрессия структурного белка, 24К и 65К белка в зараженных
вирусом растениях
Для идентификации СБ и 24К белка в растениях использовались субклеточные .фракции S30 (цитоплазма,. растворимая фракция), Ре1 (ядра и крупные органеллы), РеЗО (мембраны) и CW (клеточные стенки). Белковые фракции выделялись из зараженных ВЖС и здоровых растений Tetragonb expanse методом дифференциального центрифугирования и фильтрации (Godefroy-Colbum в( а/., 1986). Эти фракции подвергались электрофорезу и переносу на мембраны; в качестве контролей использовались рекомбинантные
СБ и 24К, смешанные с S30 фрацией здоровых растений для создания равных
©
условий электрофорез^ в геле. Вестерн-блоты обрабатывались Ас-24К и Ас-СБ. истощенным« соответствующими гетерологичными антигенами. Параллельный блот проявлялся преиммунной сывороткой, которая давала очень низкий уровень фоновой реакции с растительными белками и не выявляла зон, специфичных для зараженных вирусом растений (результат не показан).
Меткая мажорная зона, соответствующая 24К продукту, выявлялась в различных субклеточных фракциях зараженных ВЖС (но не здоровых) растений (Рис 15Е). Этот белок был очень близок по электрофоретической подвижности к рекомбинантному 24К, прогнанному по соседней дорожке (Рис. 1SE).
Небольшая разница в их подвижности может объясняться последовательностью из 11 гетерологичных аминокислот на N-конце рекомбинантного белка.' Поскольку Ас-24«, истощенная структурным белком, не давала в контроле ощутимой положительной реакции с последним, мажорная зона на Вестерн блоте врядли может объясняться кросс-реакцией с СБ, экспрессируемым в растениях. Аналогичные результаты были получены при анализе распределения СБ ВЖС в субклеточных фракциях с помощью Ac-СБ, истощенной 24К белком (Рис. 15F).
24К белок был обнаружен в растениях еще двумя независимыми серологическими методами, с помощью ИФА и техники отпечатка зараженной ткани на нитроцеллюлоз ную мембрану (результат не показан). При проявлении мембран с отпечатками поперечных и продольных срезов растений, Ас-24К-специфическая окраска концентрировалась в проводящих тканях, что согласуется с полуфлоэмно-ограниченной природой клостеровирусной инфекции (Bar-Joseph & Murant. 1982; Coffin & Goutta, 1993).
Таким образом, полученные нами результаты четко показывают, что 24К белок, продукт ОРС-5 в геноме ВЖС, синтезируется в зараженных вирусом тканях, причем основное количество 24К, евк и СБ ВЖС, приходится, на растворимую фракцию клетки (Рис. 15E.F). Похожее распределение по субклеточным фракциям сообщалось для СБ вируса штриховать мозаики ячменя и вируса некротического пожелтения жилок свеклы; по-видимому, его можно считать типичным для структурных белков вирусов растений (Donald et at., 1993; Richards A Tamada. 1992).
Используя поликлональную антисыэоротку к С-концевому пептиду 65К белка (Ас-17К), экспрессированному в системе ОЕ-11/М15, мы обнаружили белок с мол.весом 65К в растворимой фракции (S30) зараженных растений Т. orpansa (Рис. 17). Зона, соответствующая этому белку, четко выявлялась и во фракции клеточных стенок (CW; результат не показан). Интересно, что на Вестерн-блотвх белков из растений как зараженных ВЖС, так и здоровых, Ас-
17К четко проявляла мажорную зону, соответствующую белку с мол.весом 140К (Рис. 17; следует заметить, то сигнал для этого белка был в несколько ра* сильнее, чем для 65К белка ВЖС). Эти данные, хотя они и требуют дальнейшей
1 2 3 4 б в
т*
!
140К-штт я—»«■—
65 К-
Рис. 17. Вестерн-блот белков из здоровых и зараженных ВЖС растений, проявленный с помощью антисыворотки к С-концввому 17К пептиду 65К белка ВЖС. Дорожка 1, белки из здоровых растений Т. expanse; 2, белки из зараженных ВЖС растений Т. expanse; 3,4, 5 и 6, каждая дорожка соответствует белкам из индивидуального растения Nlcotlana benthamlana. Отмечены положения мажорных зон 65К и 140- I50K белков.
экспериментальной проверки, заманчиво интерпретировать в пользу существования некоего клеточного белка, синтезируемого ■ больших количествах и содержащего сегмент аминокислотной последовательности, родственной С-концевой части 65К ВЖС.
4.4. Картирование 5'-концов субгеномных РНК для структурного белка и 24К белка
При экспрессии геномов плюс-РНК вирусов растений используются два ба^аых типа механизмов - синтез суперполипегттида-предшественника и его последующее разрезание на функциональные белки протеазами (супергруппа пикорна-подобных вирусов) или считывание 5'-концевого гена (репли^азы) при первом раунде трансляции и последующий синтез набора З'-котерминальных
субгеномных РНК (сгРНК), • которых на 5'-конце экспонируются внутренние гены вирусного генома и которые служат матрицами для их трансляции-(супергруппа Синбис-подобных вирусов). Для многих вирусов доказано существование субгеномных промотеров, специфических сигналов е последовательности (-)цепи РНК," служащих для узнавания репликазой и синтеза сгРНК с определенной стартовой точки (Meshl et al., 1987; Marsh et al.. 1988).
В растениях, зараженных ВЖС, помимо геномной РНК обнаруживаются по крайней мере 5 вирус-специфических субгеномных РНК, присутствующих в одноцепочечной и двухцепочной формах (Dotja et al., 1990). Анализ их размера позволил приблизительно предсказать набор и порядок расположения внутренних генов ВЖС. С помощью трансляции In vitro индивидуальных дсРНК, выделенных из агарозного геля и расплавленных метил-гидроокисью ртути, было показано, что мажорная сгРНК ВЖС длиной около 1600 остатков кодирует структурный белек вируса, а две минорные сгРНК длиной 2700 и 1000 остатков кодируют белки с мол.весами 22К (24К, ОРС-5) и 1SK (21К, ОРС-8) (Dolja et al., 1990).
Для картирования 5'-концов сгРНК для 24К и СБ нами были использованы два метода.. Для краткости, эти два метода будут далее называться "удлинение холодной затравки" и "удлинение горячей.затравки*. Первый метод, впервые предложенный в настоящей работе, представляет собой адаптацию сиквенсных реакций мечения и наращивания цепи для синтеза кДНК от немеченой затравки на матрице индивидуальной дсРНК. ДсРНК, соответствующие сгРНК для СБ и 24К, выделялись из агарозного геля с помощью набора яля экстракции OIAEX (OIA EN), предназначенного для очистки дсДНК. Тем не менее, в наших условиях эта методика давала хорошие результаты и для дсРНК, с выходом индивидуальной РНК из геля около 50-70%. После расплавления дсРНК метил-гидроокисью ртути и отэсигания немеченой споцифической затравки, последняя удлинялась с помощью обратной
транскриптазы в присутствии [а-32Р]-СТР и трех немеченых дезоксинуклеотид-трифосфатое (20°, реакция мечения). Затем добавлялись все четыре дезоксикуклеотид-трифосфата в высокой концентрации, и смесь дополнительно
1дШ-р24 »ОВНА-СР
г
С С
12815 А •
и и и с
А
а о с
Ее Л а АС Еббдисье с * и с [9
"и пи
и и и
—С2 - - "-а ' о
Рис. 18. Картирование 5'-концов субгеномных РНК для СБ и 24К белков ВЖС. Левый блок, авторадиограмма меченых продуктов 'удлинения холодной затравки" (Е8 и Еб, по номеру праймера) на матрице сгРНК для 24К; в сравнении с продуктами сиквенсных реакций с теми же праймерами. Правый блок, продукты аналогичных реакций с праймером 9 и сгРНК для СБ. Стрелки показывают продукты, соответствующие стартовым точкам сгРНК, с указанием окружающий нуклеотидной последовательности.
инкубировалась (42*, реакция достраивания кДНК). Меченые продукты обратной транскрипции сравнивались с продуктами реакции сиквенса РНК ВЖС,-полученными с той же затравкой, в 6% полиакриламидном геле.
Второй метод, использованный нами, является стандартным подходом к картированию 5'-конца мРНК (Sambrook et al., 1989). Реакции синтеза кДНК проводились с теми же специфическими затравками, но в качестве матрицы использовалась суммарная дсРНК и осРНК. выделенная из зараженных ВЖС растений, а "горячив затравки* метились по 5'-концу [у-^Р]-АТР в реакции с Т4 полинуклеотидкиназой.
Олигонуклеотидные затравки, использованные в настоящей работе, комплементарны нуклеотидным позициям 22-38 и 125-142 ниже первого AUG кодона в ОРС-5 (затравки вив, соответственно), и позициям 72-87 ниже первого AUG в ОРС-6 (затравка 9; Рис. 13А). Продукт кДНК полученный с затравкой 9 на матрице сгРНК для СБ ("удлинение холодной затравки") мигрировал в гепв в виде двойной зоны, причем нижняя мажорная полоса совпадала с остатком А-13588 в соседней сиквенсной дорожке, полученной в. реакции с той же затравкой (Рис. 18). Это соответствует 5'-некодирующему участку в сгРНК для СБ длиной 52 нуклвотида. Сходный результат был получен при достраивании 5'-меченной затргехм 9 на матрицах суммарной осРНК и дсРНК из зараженных растений. Следует отметить, что удлинение горячей затравки давало одну полосу кДНК, совпадающую с остатком А-13588, для обоих типов матриц (результат не показан).
Попытки картировать 5'-конец сгРНК для 24К метопом удлинения горячей затравки были безуспешными, вероятно, вследствие низкого содержания соответствующих еаятриц в препаратах суммарной осРНК и дсРНК. а текже низкого удельного мочения кДНК. Метод удлинения холодной затравки дал продукты преймерсз б и 9, которые проявлялись из езторедеогрзммв а вида двойных зон. Нижняя, более сильная полоса в обоих случаях соответствовала остатку А-12315, а верхига - С-12814 (Рве. 18). Н=м
представляется, что нижняя полоса соответствует истинной стартовой точив а сгРНК для 24К (S'-нетранслируемая область в атом случав будет иметь длину 105 нуклеотидов). Это предположение согласуется с тем, что мРНК ВЖС имеют В'-концаеую кеп-струкгуру (Karasev et al., 1089). Поскольку во всех изоесткык •укариотических мРНК предпоследний нуклеотид перед 5'-кепом • Q или А (обзор см. в Banet}ee, 1980), А-12815 является более вероятным кандидатом на роль стартового остатка, чём С-128М. Таким образом, верхние полосы, соответствующие удлинениям кДНК на один нуклеотид выше А-13588 и А-12815 в сгРНК для СБ и 24К, скорее всего являются артефактами обратной транскрипции при удлинении холодной затравки. Тем не менее, нельзя полностью исключить и существования михрогатерогенкости 5'-коицд сгРНХ для 24К.
В ОРС-5 ВЖС имеются два AUQ кодона. расположенные на расстоянии 60 нуклеотидов друг от друга, причем второй потенциальный инициаторный кодон находится в контексте, более благоприятном для трансляции (Приложение 1; Kozak, 1986). Тем не менее, ранее были получены данные по трансляции Т7-транскриптов ОРС-5 4г> vitro в присутствии блокирующих затравок, свидетельствующие об использовании рибосомами именно первого AUQ в качестве инициаторного (Boyko et el., 1992). Наши данные по картированию Б'-концу сгРНК для 24К подтверждают зтот результат, ясно показывая, что при репродукции ВЖС синтезируется один тип субгеномной матрицы, включающей первый AUG кодон. В соответствии с этим, в растениях, зараженных ВЖС, обнаруживается толы» полноразмарный 24К белок (Рис. 15Е).
Следует обратить внимание на две интересные особенности нетранслмруемых лидерных последовательностей в сгРНК ВЖС. Во-лервьк, длина 5'-лидора в сгРНК для 24К в два рагз длиннее, чем в сгРНК для СБ. Можно допустить, что это различие используется для регуляции экспрессии этих белков на уровне трансляции. Во-вторых, сравнение последовательностей
РНК вокруг стартовых точек двух сгРНК ВЖС указывает, что синтез обоих матриц на минус-цепи РНК инициируется с консервативной последовательности-5'-ССДиииРуА (показана в плюс-цепи, первый нуклеотид мРНК подчеркнут), юошрая может быть элементом субгеномного промотора. Эта последовательность консервируется и в геномах двух других штаммов вируса, ВЖС-Н и ВЖС-Б (Тебл. 1) Любопытно, что последовательности на 5'-концах двух сгРНК (АШиРуА ) и на б'-конце геномной РНК ВЖС ((¡ШАЛША) похожи; вероятно, это как рзэ те сигналы, которые узнаются вирусной репликазой при синтезе геномной и субгеномных РНК на матрице минус-цепи.
Таблица 3-
Срвзнэние последоввтельностей вокруг 5'-ствртовых точек в субгеномных РНК (элементов субгеномного промотора) в геномах ВЖС и других вирусов растений
мРНК
Последовательность вокруг 5*-концевого остатка
ВЖС. сгРНК для СБ ВЖС, сгРНК для 24Х
CCAUUUUAa CCAUUUCA0
ВТМ. сгРНК для СБ
ЕЮМ, сгРНК для СБ (РНК 4)
а а
UCSUUUUA0
с аоии GCSUUUAQO
ВМК. сгРНК для СБ (РНК 4) ВМЛ. сгРНК для СБ (РНК 4) Консенсус
иа а и
GCSUAUUA0
CCSUUUUUA0 XCPuUXUPyA0
последовательности вокруг стартовых нуклеотидов (подчеркнуты) приведены для еируса табачной мозаики (ВТМ), типичного штгкка; вируса огуречной мозаики (ВОМ) штамма О; вируса мозеихи костра (ВМК); и вируса мозаики пхшерны (ВМЛ). Замены нуклеотидов, обнаруженные в других тобамоэмрусах, кукумовирусах и бромсвирусах, указаны над строчкой прописными буквами. Консенсус выведен с тремя исключениями в 16 последовательностях, выровненных без разрывов.
Более того, консервативная последовательность 5'-ССДиииРуА вокруг стартовых точек сгРНК ВЖС напоминает аналогичные последовательности • сгРНК для структурных белков тобамовирусов и трикорнавирусоа (вирусов мозаики костра, огуречной мозаики и мозаики люцерны; Табл. 3).
Очевидно, стоит сопоставить эти данные с результатами филогенетического анализа последовательностей РНК полимвраз, указывающего на эволюционную близость ВЖС и этих вирусов (Рис. 7). Вполне возможно, что в процессе дивергенции "тобамо-подобных" вирусов происходила параллельная консервация доменов полимвраз, ответственных аа связывание матрицы, и нуклеотидных последовательностей узнаваемых ими сигналов.
4.5. Резюме: экспрессия клостеровирускых белков
Сконструированные нами акспрессирующив плаамиды позволили получить в чистом виде рекомбинантные белки ВЖС. С помощью поликлональных антисывороток к 24К и 65К эти белки были обнаружены в зараженых вирусом тканях растения. Таким образом, уникальные гены ВЖС, кодирующие дивергированный дупликат структурного белка и гомолог клеточных шаперонов НвР70, не являются псевдогенами, и их продукты, очевидно, играют роль в репродукции вирусной инфекции (вывод, который представляется нем достаточно очевидным лишь после получения эксперимент ,1ьных доказательств экспрессии 1л Предсказанное
компьютерными методами сходство 24К и СБ ВЖС на уровне первичной и вторичной структуры подтверждается серологическим родством этих белков. Наконец, сходство. элементов субгеномных промотеров соответствующих сг^НК, арранжировка ОРС-5 и ОРС-в в геноме и одинаковые профили распределения 24К и СБ ВЖС в субклеточны' фракциях зараженных растений, свидетельствуют о скоординированной функции этих белков при
Это данные не противоречат нашей гипотезе о существовании двух структурных белков в частицах ВЖС.
Наконец, экспрессия белков ВЖС в бактериях открывает дорогу для изучения белок-белковых взаимодействий, биохимических свойств индивидуальных белков и механизмов сборки частиц клостеровируса.
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе была впервые определена полная последовательность 15480 нуклеотидов геномной РНК вируса желтухи свеклы, типового представителя группы клостеровирусов. Это самый большой геном сируса растений, полностью отсеквенированный к настоящему времени. Проведенный нами анализ показал, что ВЖС имеет уникальное устройство и стратегию экспрессии генома. По эволюционным связям, клостеровирусы близки к "тобамо-подобным* вирусам растений. Принципиальные репликативные домены в больших неструктурных белках ВЖС и родственных вирусов (МТР, ХЕЛ, ПОЛ и, вероятно, другие менее консервативные домены, Рис. 10) весьма близки по'аминокислотным последовательностям и выстроены в одном порядко, что подчеркивает их происхождение от репликазы общего предка, а также консервацию Структуры и аранжировки ее доменов в ходе эволюции. Более того, наши данные указывают на возможность "зеркальной консервации" аминокислотных последовательностей доменов, ответственных за связывание матрицы, и нуклеотидкых последовательностей элементов субгеномных промоторов, у ВЖС и тобгмо-подобных вирусов. Очевидное отличие генома ВЖС от других родственных вирусов состоит в значительно большем размере закодированной в нем РНК репликазы. Корреляция между размерами репликазы и генома (которую, кстати, легко проследить и для корсма-подобных вируссз) может отражать некие специфические механизмы
копирования длинных РНК. Нельзя исключить, что в репликации геномов клостеровирусов и коронаеирусоа участвуют* дополнительные активности, повышающие ее точность (например, экзонуклеаэная активность 'вычитывания гранок").
ССР")
Рис. 19. Сравнение молекулярной организации геномов ВЖС и ВТМ. Родственные домены выделены одинаковой штриховкой и соединены тонкими линиями. Вероятный сдвиг рамки в репликазном модуле ВЖС показан как небольшое смещение блоков, изображающих ОРС-1а и- ОРС-1в. Сайт разрезания яидерной протеазы помечен стрелкой. (JAG, слабый терминатор в репликазном гене ВТМ. Обозначения белков и доменов: C-PRO, почаин-подобная цистеиновая протеаза; О-PRO, кислая протеаза; MTR, HEL, POL -домены метилтрансферазы, РНК хеликазы и РНК полимеразы; СР. структурный белок; М, транспортный белок.
Если консервативные домены репликазы составляют вертикально , унаследованный "костяк" клостеровирусного генома, происхождение ряда других генов естественно объяснить горизонтальным переносом из генома клетки и геномов других вирусов с помощью рекомбинации РНК. И-концевая область репликазы ВЖС содержит домен папаин-подобной протеазы, который, возма:ло, был захвачен из генома потивируса или родственного вируса (Рис. 19). Вставка между доменами МТР и ХЕЛ а этом белке включает домен гипотетической аспартилоеой протеазы, появление которого в принципе можно объяснить рекомбинацией генома ВЖС с РНК параретроеируса растений.
Наконец, среди продуктов З'-концевых генов 6.4К белок показывает отдаленное родство с маленькими гидрофобными белками потексвирусов, 65К белок очень-близок к клеточным белкам теплового шока HSP70, и 24К белок является гомологом структурного белка ВЖС (Рис. 19). Таким образом, геном ВЖС представляет собой гротескную иллюстрацию принципа "перетасовки генов" (M0r020vetal., 1989).
Два гена в геноме ВЖС представляют особый интерес - это дупликат гена структурного белка (ОРС-5) и ген 65К белка (ОРС-3). 65К белок, как показывает анализ его структуры, мог бы выполнять функции АТФ-зависимого вирусного шаперона, управляющего белок-белковыми взаимодействиями при вирусной инфекции. 24К белок, по предварительным данным, является минорным компонентом частицы ВЖС, формирующим короткий сегмент на , одном из ее концов. Эти белки не имеют аналогов у других <+)РНК-содержащих вирусов растений и животных, что может указывать на принципиально новые механизмы самосборки (или управляемой сборки) частиц ВЖС и репродукции вирусной инфекции в растениях.
Сочетание механизмов, используемых для выражения генома ВЖС -автопротеолиз, вероятный рибосомальный сдвиг рамки и образование набора субгеномных РНК - ни встречается больше ни у одного из известных вирусов растений. Скорее, напрашивается близкая аналогия клостерфирусов с короназирусями и вртеривирусами животных. Экспрессия 5'-концевых реплмкативных генов у этих вирусов так же включает сдвиг рамки и автопротеолиз лидерной папаин-подобной протеозой, в то время как 3'-концевые гены экспрессируются с помощью субгеномных матриц (Lai, 1990; Lee et nl., 1991; Godeny et el., 1993). Клостеровмру j и корона-подобныя вирусы имеют максимальные размеры геномоз среди (+)РНК-содержащих вирусов растений и животных, соответственно. Вместе с тем, они очень далеки гэолюционно (т.е. родства на уровне аминокислотных последовательностей «ежяу ними найти невозможно). Можно предположить, таким образом, что
6J
сходные механизмы экспрессии этих вирусов возникли конвергентно. параллельно с увеличением размера геномов. •
ВЫВОДЫ
1. Получена библиотека кДНК клонов РНК генома клостеровируса желтухи свеклы (8ЖС); определена полная последовательность (15480 иуклеотидоо) РНК украинского штамма и частичная последовательность (6000 нуклвотидоа) немецкого штамма ВЖС.
2. Предсказано существование девяти открытых рамок считывания (ОРС) о последовательности генома клостеровируса. ОРСИа и ОРС-1в кодируют гипотетическую вирусную репликазу, содержащую домены метилтрансферазы, РНК хеликазы и РНК-зависимой РНК полимеразы. В ОРС-2 закодирован
маленький гидрофобный белок (6.4-кДа), напоминающий белки тройного блока «
генов потеке- и карлавирусов. ОРС-3 кодирует уникальный 65-кДа белок-гомолог клеточных белков теплового шока семейства НБР70. ОРС-6 и ОРС-5 кодируют, соответственно, .основной структурный белок (СБ. 22.3-кДа) и его дивергированную копию (24-кДа). Для гипотетических продуктов ОРС-», ОРС-7 и ОРС-8 родственных белков в современных базах данных обнаружено не было.
3. Проведен филогенетический внализ консерзативньк доменов- репликазы ВЖС; установлено, что клостеровирусы относятся к супергруппе Синдбис-подобных вирусов и наиболее близки к кластеру, представленному тобамо-, тобра- и трикорнав ярусами.
4. Высказано предположение о рибосомальном сдвиге рамки считывания (в необычном для вирусных генов +1 направлении) при трансляции ОРС-1а и ОРС-1в. приводящему к синтезу фыожн-белха (репликазы) с мол. весом 348-кДа. Предложена модель, объясняющая подобны** сдвиг рамки при трансляции 5'-концевых генов ВЖС.
в. Предсказано существование в продукте ОРС-1а двух гипотетических протеазных доменов разного типа • папзин-подобной лидерной протеазы и, вслартиловой (кислой) протеазы. Экспериментально доказано, что при трансляции ОРС-1а происходит автолротеолитическое выщепление концевого лидерного белка с мол.вбсом ббК; с помощью точечного мутагенеза техже идентифицированы каталитические остатки папаин-лодобной протеазы и ее сайт разрезания за остатком глицина-588 с М-конца 348К белка.
в. Сконструированы плазмидньга векторы для суперэкспрессии С5. 24К белка и С-концевого пептида 65К белка в бактериях. Получены поликлональные антисыворотки к этим рекомбинантным белкам, очищенным до гомогенного состояния.
7. Серологическими методами установлено, что гипотетические 24К и 65К белки синтезируется в зараженных ВЖС растениях. Показано, что СБ и 24К белок ВЖС имеют общие антигенные детерминанты (эпитопы).
8. Показано, что в зараженных ВЖС клетках синтезируется набор субгеномных (сг) РНК, служащих для экспрессии З'-концевых генов ВЖС. Картированы 5'-концы сгРНК для СБ и 24К белка. Установлено, что последовательность вокруг стартовых нуклеотидов обеих сгРНК консервативна и может представлять собой основной элемент субгеномного промотера; эта последовательность также близка к субгеномным промотерам генов СБ ряда вирусов растений, эволюционно наиболее близких к ВЖС. Высказана гипотеза о согласованной консервации белковых последовательностей ре пли газ клостеро-, тобамо- и трикорнавирусоз, и узнаваемых ими нуклеотидных последовательностей субгеномных промотеров.
9. Высказано предположение о том, что клостеровирусный геном формировался из вертикально унаследованного "костяка" репликативных модулей, а также генов, приобретенных с помощью горизонтального переноса (РНК
рекомбинации) из геномов других РНК-содержащих вирусов и генома хозяина, или путем дупликации собственного гена капсидпого белка.
10. Обнаружен параллелизм между общим планом молекулярной организации и способом экспрессии геномов корона-подобных вирусов и клостеровирусов. Предполагается, что сходные механизмы экспрессии возникли у вирусов животных и растений с максимальными размерами (+)РНК геномоа конвергентно.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую признательность своем/ учителю академику РАН И.г.Атабекову, в лаборатории которого настоящая работа была начата и закончена, а также сотрудникам и аспирантам кафедры вирусологии и отдела биохимии вирусов растений НИИФХБ им. А.Н.Белозерского В.П.Бойко, В.В.Доля, А.В.Карасеву, Н.А.Луниной и В.В.Рогову, совместно с которыми выполнялись отдельные разделы работы и оживленные дискуссии с которыми ■ предопределили ее дальнейшее направление. Отдельную благодарность хотелось бы выразить Е.В.Кунину за предсказания свойств вирусных белков (которые неизменно сбывались при экспериментальной проверке) и неоценимую помощь в компьютерном анализе последовательностей, наконец, данный проект получил второе дыхание благодаря всесторонней помощи, полученной автором от сотрудников Федерального биологического центра ФРГ, в первую очередь Р.Касперэ, Р.Кениг, Д.-Е.Лоэеманна, Э.Маисса и Р.Фротчла, и материальной поддержки исследований со стороны, фонда им. Александра фон ГумболКата.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ. ДИССЕРТАЦИИ
1. Karasev, A.V., Agranovsky, A.A., Rogov, V.V., Miroshnichenko, N.A., Oolja, V.V., and Aiabekov, J.G. (1989). Virion RNA of beet yellows closterovirus, cell-free translation and some properties. J. Gen. Virology 70, 241-245.
2. Dolja, V.V., Agranovsky, A.A., Karasev, A.V., ii.id Atabekov, J.G. (1989). Organization of beet yellows dosterovirus genome 2nd International Symposium on Positive Strand RNA viruses, Vienna, p.30.
3. Dolja, V.V., Karasev, A.V., and Agranovsky, A.A. (1990). Organization of beet yellows closterovirus genome. In Wow Aspects of Positive-Strand RNA Viruses, pp. , 31-35. edited by M.Brinton and F.Heinz. Washigton, D.C., American Society for Microbiology.
4. Agranovsky. A.A., Karasev, A.V., Boyko, V P., Dolja, V.V., and Atabekov, J.G. (1990). Structure and expression of beet yellows closterovirus genome. VIII International Congress of Virology, Berlin, p.478.
5. Agranovsky, A.A., Boyko, V P., Lunina, N.A., Karasev, V.K., Koonin, E.V., and Dolja, V.V. (1990). Sequence and expression of beet yellows virus closterovirus geriome. FEBS Advanced Course "The Plant Virus Genome: Structure and Expression, Riga, p. 7.
6. Agranovsky, A.A., Boyko, V.P., Karasev, A.V., Koonin, E.V., and Dolja, V.V. (1991a). The putative 65K protein of beet yellows closterovirus is a homologue of HSP70 heat shock proteins. J. Mo/. Biology 217,603-610.
7. Agranovsky, A.A., Boyko, V.P., Karasev, A.V., Lunina, N.A., Koonin, E.V., and Dolja, V.V. (1991b). Nucleotide sequence of the 3'-terminal half of beet yellows dosterovirus RNA genome: unique arrangement of eight virus genes. J. Gen. Virology 72, 15-23.
8. Dolja, V.V., Boyko, V.P., Agranovsky, A.A., ana Koonin, E.V. (1991). Phytogeny of cspsid proteins of rod-shaped end filamentous RNA plant viruses: two families with distinct patterns of sequence and probably structure conservation. Virology 184, 79-83.
9. Agranovsky, A.A. (1992). Exogenous primer-independent cDNA synthesis with commercial reverse transcriptase preparations on plant virus RNA templates. AMI. Biochemistry 203, 163-165.
10. Koonin, E.V., Agranovsky, A.A., Boyko, V P., Karasev, V.K., Lunina, N.A., and Dolja, V.V. (1992). Beet yellows closterovirus: an unusual positive strand RNA virus With a chimeric genome. 3rd International Symposium on Positive Strand RNA viruses, Maiami, p.61.
11. Boyko, V.P., Karasev, A.V., Agranovsky, A.A., Koonin, E.V., and Dolja, V.V. (1992). Coat protein gene duplication in a filamentous RNA virus of plants. Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89, 9156-9160.
12. Rogov, V.V., Karasev, AA, and Agranovsky. A.A. (1093). Purification and some properties of an isolate of beet yellows vlnis from Ukraine. J. PtiytoptthobQy 137, 70-88.
13. Agranovsky, A A. Koonln, E.V., Boyko, V.P., Lunina, NA, and Atabekov, J.Q. (1993). The structure and expression of beet yellows dosterovirus genome. IX International Congress of Virology, Glasgow, p. 97.
14. Agranovsky, A.A., Maiss, E., Boyko, V.P., and Atabekov, J.Q. (1993). Expression of beet yellows virus (jene» for the coat protein end its non-vkton ' homotogue In vitro and In vivo. IX International Congress of Virology, Glasgow, p. 330.
15. Agranovsky, AA, Koonin, E.V.,Boyko, V.P., Maiss, E., Froetschl, R.. Lunina, and Atabekov, J.G. (1694). Beet yellows dosterovirus: complete genome stroduro and Identification of a leader papah>Bke thiol protease. Virology MS, 311-324.
18. Agranovsky, AA., Koenig, R., Maiss, E., Boyko, V.P., Casper, R„ and Atabekov, J.(3.(1994). Expression of the beet yellows dosterovirus capsld protein and p24, a capsid protein homologue, in vitro and in vivo. j. Sen. Virology, in prats.
-
Аграновский, Алексей Анатольевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1994
-
ВАК 03.00.03
- Изучение локализации белков клостеровируса желтухи свеклы в вирионах и в зараженной клетке
- Структура 3'-концевой половины генома клостеровируса желтухи свеклы
- Изучение функции межклеточного транспорта и свойств транспортных белков клостеровируса желтухи свеклы
- Структура генома Х-вируса
- Использование 3'-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы в качестве индуктора устойчивости к ризомании
