Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура генома Х-вируса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура генома Х-вируса"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ молекулярной БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

УДК 578.85/86

РОЗАНОВ Михаил Николаевич

СТРУКТУРА ГЕНОМА X-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в Отделе рекомбинантных ДНК Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Академии наук СССР.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

член-корреспондент ВАСХНИЛ, профессор К. Г. Скрябин кандидат биологических наук А. С. Краев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических паук Тальянский М. Э. доктор биологических паук Лукамидин Е. М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Межфакультетская ПНИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова.

. Защита диссертации состоится « /У 1990 г и

/у'" с °часов на заседании специализированного совета Д002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984 ГСП-1, Москва В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан .

</сР 1990 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

X -ГI

!

’ тд. л '' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

иссертг.и,ий

Актуальность проблемы. Изучение вирусных геномов на уровне гервичной структуры является одной из актуальных задач молекулярной жологии. Знание последовательности нуклеотидов РНК или ДНК вируса гозволяет построить модель организации и экспрессии генома, шдвинуть обоснованные гипотезы о функциях его участков или >елковых продуктов па.основе теоретического анализа нуклеотидных слп аминокислотных последовательностей. Достигнутый таким образом ачественно более высокий уровень представлений об исследуемом >бъекте в сочетании с появившейся возможностью легко применять штоды. генетической инженерии позволяет эффективно проводить функциональные исследования. Наиболее впечатляющие успеш ювременной молекулярной вирусологии базируется на изучении шспрессип клонированных нормальных или несущих искусственно шоденные мутация геномов или отдельных генов.

Структура генома - это вшпный признак, применяемый в :истематике вирусов. Его наиболее консервативные участки [спользуются для построения гипотетических эволюционных схем. За гаследние шесть лет сравнительного изучения первичных структур ятрусных генов и их продуктов пройден путь от обнаружения сходных гчастков между последовательностями аминокислот РНК-полимераз ткоторых (+)ЕНК-ВИруСОВ бактерий, растений И ЖИВОТНЫХ (Катег, ■г воз, 1984 1 до установления консервативности строения И, ю-видимому, общности происхождения этих важнейших для репликации зерментов для всех РНК содержащих вирусов, включая ретровирусы с 1ДН0Й стороны И (-)ЕНК-Содержащие вирусы С другой' стороны (РосЬ в! .1., 1989). Таким образом, РНК-содеркащие вирусы можно

«усматривать . как большой ряд родственных форм, приспособившихся [ля осуществления стратегически различных способов репликации и репрессии геномов. В то же время анализ структуры других генов :видетельствует о ключевой роли рекомбинационных процессов происходящих, в том числе, с участием нуклеиновых кислот клетки) в юзникновении и ЭВОЛЮЦИИ вирусов (71пт»гп et а1, 1988).

.. Помимо вклада в изучение проблем фундаментальной науки пределение первичной структуры генома вируса дает необходимую 'снову для решения таких важных прикладных задач как разработка пособов защиты от вирусной инфекции, создание новых векторных истем и т.д. •

Большинство описанных вирусов в качестве генетическо:

материала содержат одну или несколько молекул РНК. Разнообраз: организации и способов экспрессии в сочетании с небалыип

размерами делают ИК-геномы исключительно привлекательны] объектами исследований. Значительную часть. многест]

(+)РНК-содержащих вирусов составляют вирусы растений. К настояло! времени определены структуры геномов примерно трех десяти представителей этого класса. Анализ выведенных аминокислоты

последовательностей кодируемых ИМИ продуктов, В ОСНОВ1Ч репликативных белков, показал, что большинство (+)РНК-содерг;ац вирусов растений может быть отнесено к одной из двух супергрупп "Синдбис-подобным" и "Пикорна-подобным", включающим Bnpyi ЖИВОТНЫХ (альфавирусы И шкорнавирусы, соответственно) (Goldb^c 1987). к первым относились тобамо-, тобравирусы, гордеи-, кукуыо илар-, бромо- и фуровирусы, ко вторым - комо-, непо- и потнвирус: Таким образом впервые была создана наиболее естествепп классификация растительных (+)ИЖ-вирусов. Она не сбнаружива корреляций с такими важными биологическими характеристиками к спектр хозяев, тип строения вириона или количество молекул РНК геноме - эти признаки оказались вторичными!.

Суммируя сказанное, можно выразить уверенность, ч определение структуры генома каждого нового представите

РНК-содержащих вирусов не только слукит развитию части вирусологии и дополняет перечень способов устройст молекулярно-генетических систем, но и помогает выявлен общебиологических закономерностей организации и эволюции кивого.

Структура геномов потексвирусов к моменту выполнения настояз работы описана не была. Объектом исследования был выбран Х-вир картофеля (ХВК) - типовой представитель этой группы. Гибк нитевидные вирионы ХВК состоят из субъединиц белка оболочки молекулярной массой около 26 КДа и единственной молекулы (+)РНК молекулярной массой 2,1 ВДа (Purcifull, Edwardson, 1981). Эта Р кэпирована на б'-конце и псишаденилирована на 3' -кони Последовательность нуклеотидов з*-концевой области генома ХВК бы определена ранее (Морозов И др,1986, Morozov et al., 1987). в B1 участке РНК ХВК был идентифицирован ген белка оболочки и обнарухс примыкаодие к нему со стороны 5'-конца две небольшие nej крываодиеся открытые рамки трансляции (ОРТ) - потенциальные геи способные кодировать гидрофобные полипептиды с М.в.12 КДа и 7 КД

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы Сило:

) установление нуклеотидной последовательности кДНК клонов, фзкрывапцих весь геном ХВК (кроме гена белка оболочки) и шедениэ на этой основе полной первичной структуры РНК ХЕК.

| теоретический анализ полученной последовательности РНК ХВК с >лью установления количества и порядка располааепия генов и гдвикения гипотез о возможных функциях белковых продуктов этих шов на основе сравнения с белкагги других вирусов или клеточными глкага на уровне аминокислотных последовательностей.

I установление систематического положения потексвирусов среди эугах (+)РНК-содер2ащих вирусов. ' '

Научная новизна и практическая ценность р^боти. В настояло!! ’боте впервыо установлена последовательность нуклеотидов РНК ХВК. го пзрвый при!'вр определения поеной первичной структуры генома труса в СССР.

В процессе работы были получен набор Н13 клонов ?. их Уклонов, содерзацкх последовательности нуклеотидов всего ггяома ЗК в виде одноцепочочной ДНК. Эти клоны используются для пьнейшего изучения ХБК методам рекомбинантных ДНК в ИМБ АН СССР на кафедре вирусологии Биологического факультета !,{ГУ км. .В.Ломоносова.

На основании анализа первичной структуры РНК ХВК и вируса эзаики белого клевера (ЕМБК) впервые описана организация генома этексвирусов с указанем его вариабельных и консервативных районов, показаны обоснованные предположения о возможных функциях продуктов орвых двух генов патексвирусоз на основе анализа их выведенных ■яжоккслотных последовательностей. Обпаруг:ено неожиданно высокое и гатистически достоверное сходство аминокислотных

оследовательностей продуктов 0РТ1 потексвирусов и вируса желтой озаикя турнепса (ЕШТ, семейство тимовирусов), в то время как елковый продукт 0РТ2 проявлял наибольшее сходство с оответствувщми белками фуровирусов и гсрдеивирусов.'^ В овокупности с уке шевсимися данными по продуктам ОРТЗ, 0РТ4 и елку оболочки (Morozov et al.,1987) обнаруженные "родственные вязи" ХЕК дают дополнительные свидетельства в пользу представлений существенной роли рекомбинационных событий в возникновении и волюции вирусов.

Полученные результаты имеют такие большое значение и для рикладных работ. ХВК наносит ощутимый урон сельскому хозяйству,

снижая урожай картофеля примерно на 20*. На основании данных первичной структуре РНК ХВК в Отделе рекомбинантных ДНК ИМБ АН С( успешно проводятся работы по созданию растений, устойчивых к XI Перспективно также использование регуляторных участков генома 3 для конструирования высокоэффективных систем экспрессии чужеродц генов.

Апробация работы состоялась на заседании научного коллокви; N21 Отдела рекомбинантных ДНК ИМБ АН СССР им В.А.Энгельгардта мая 1989 года. '

■ Материалы исследований по теме диссертации 'долокени Мевдународном симпозиуме "Генетическая инженерия растоп; (г.Пущино, 1-3 октября 1987 года), школах-конференциях коло; ученых (г.Алушта, 20 октября-1 ноября 1987 года и г.Албо! Болгария, 18-23 сентября 1988 года), XVI конференции молодых учен ИМБ АН СССР, 27.04.1988,(2 премия) и на конкурсе работ мол о; ученых институтов АН СССР Октябрьского района г.Москвы 1988 года премия).

Содержание диссертации отражено в четырех публикациях.

Объем работы. Диссертация излажена на стран:::

машинописного текста и состоит из введения, обзора литерату] экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и спи цитированной литературы ( ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Предпосылки. ~

Ранее на Биологическом факультете МГУ и в Отделе генетичес инженерии ИМБ АН СССР были получены и клонированы в векторе ри шесть фрагментов кДНК, которые в совокупности представляли в геном ХВК (Морозов и др., 1987). Были также составлены рестрикт: карты для этих клонов и проведено их частичное секвенирова методом Максама-Гилберта (М.Л.Симонова, ИМБ). На основании а данных в группе Б.К.Чернова (ШБ) были синтезированы п 15-членных олигодезокси- рибонуклеотидов. Они были использоваш представленной работе для секвенирования клонов.

2.Получение М13 клонов. _

Исходные препараты рекомбинантных плазмид, содержав ХВК-специфические последовательности нуклеотидов и имевшиеся небольшом количестве (примерно 0,1 мкг), были использованы трансформации компетентных клеток Е.соИ (штамм тс-1).

лученных на питательной среде YT с ампицилпном культуры клеток деляли препараты ллагкяяных ДНК методом щелочного лизиса и аляли кснтаминанты высаливанием в 2 II растворе хлористого лития, русспецифические вставки ДНК выцепляли по концам при помоги ответствукют рестриктирупчзх ЗНДОНУКЛОаЗГ EcoRI И BamHI для ЗЗМПДЫ Х601, ВакН1 для х53, Hindlll ДЛЯ XSi И Х67, Sail для Хз2. ;он х47 (Рпс.1), который перекрывал область генома ХВК, не

«дставленнуа другими клспагз, л был удобен для секвенирозания был лучен слэдукцпм образе?.!. Исходным препаратом служила плаЕмида, державшая вставь ДНК длиной примерно 3000 нухлэотцщв, внутри отрей предположительно находился искомый фрагмент ДНК. Эту жомбпнгнтную плаз;,яду расцепляли рестриктазсй Accl. !разознЕпуюся смесь фрагментов ДНК фракционировали при помета ;ектрсфореза в агарозном геле, затем переносили на нитроцеллюлозу, щученный блот последовательно гибрпдпзевалп с I32 PJ-мечвными ШЗ Э0 б 21,51, СПНТеЗНроЗаНЕЫМИ К участкам ДНК КЛОНОЗ Хз2 И х67, зилег:ацих к интересующему участку (га. Рис.1). Для клонирования 1л выбран тот фрагмент ДНК, который гибридизовался с обеими эоба*,!и. .

Препараты расцепленных рестряктазами рекомбинантных плазмид шубировали с "холодными" дезоксинуклеозидтрифосфатами (dNTP) в рисутствии фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I для заполнения решей на их 5’-выступающих концах и фракционировали в агарозном эле. Нуяный фрагмент ДНК экстрагировали пз геля при помощи ЭАЭ-мембраны и лигировали с фаговым вектором, расцепленным по айту Siaai и дефосфорилированным бактериальной целочной фосфатазой. ЫЛИ использованы 2 типа векторов: Ы13шрЗ (АпегзЪаЫ И М13тр19, □лученный тате ке как плазмидныв ДНК, но дополнительно очищенный ри помоци хроматографии на Сефакриле S-1000.

В стандартной процедуре трансформации клеток E.coii екомбинантными ДНК помимо штамма TG-1 использовали геоА- штамм L-i Blue. Это позволило успесно клонировать в фаговый вектор гносительно крупные фрагменты ДНК, например, вставку хз2-клона линой 2855 нуклеотидов. . ^

. Скрининг рекомбинантных клонов.

В переклонировании и частичном секвенировании клонов х64 и х67 частвовали А.Г.Априкян и А.С.Краев(ИЫВ) (соответственно), в лонировании хз2 - А.С.Краев. .

Неокрашенные бляшки, образовавшиеся на клеточном газонэ пос. трансформации и инкубации при З'Яс в течение ночи в присутств1 изопропилтиогалактозида и его хромогенного субстрата Хр рассматривали как подозрительные на содержание рекомбинанты фаговой ДНК. Такие клоны М13 выращивали в жидкой срод одноцепочечную фаговую ДНК выделяли из культуральной жидкости гг помощи осакдения полиэтиленгликолем и депротеинизацпи феног. о: Отбор рекомбинантных ДНК осуществляли первоначально по их меныи электрофоретической подвшоїости в агарозе по сравнении с ДНК 5-і дикого типа. Затем отобранные препараты кагдой сорт проверял;; комплементарность друг другу (С-тест)(Messing, 1S83). Она икс место в том случае, если препараты содержат разные цепи Д клонированного фрагмента. Таким образом были получены матрицы д секвенирования ХБК-специфических вставок ДНК xSOl, х53, х64, х&Г, х67. Преііарага рекомбинантных ДНК серии х47 содержали встаь более, чем одного, вида, но приблизительно равной длили. В зт случае для распознавать нужных препаратов прменпли Т-то (Sanger, 19S0) - секвенирование матриц методом Сэнгера только одному нуклеотиду (это позволяет легко протестировать более ДТ! десятков клонов одновременно). Анализ результатов, выполненный и ПОМОЩИ программы ANALYSEQ (Staden, 1982) на персональном КОМПЬЮТи wicat і sows позволил идентифицировать клоны, СОДЄрїіаВППВ НуіЛ] вставку ДНК как в одной, так и в противоположной ориентации.

4.Секвенирование пеоеклонированных фрагментов ДНК.

Последовательность перепланированных в одноцепоцепочечі форму . фрагментов ДНК определяли методом терлшируюс дидезоксішуклеозидтріфосфатов (ddNTP) (Sangor Г 1977; Краев, 198£ Для визуализации продуктов полимеразной реакции применяли лі меченные Э2Р ПО 5’ -К01ЩУ праймеры. либо меченые [сг-32Р] I [а-33Р]dNTP (обычно, dATP или dCTP). Во втором случае стандарті протокол модифицировали так, чтобы на радиоавтографе структурне геля короткие и длинные фрагменты ДНК выглядели как полосы приме] одинаковой интенсивности. Для этого оказалось достаточно вдз увеличить концентрации ddNTP, что приводило к Евлаем: перераспределению длик терминированных цепей ДНК в сторону мены значений и, следовательно, более равномерному распределе] радиоактивности по гели. На первом этапе секвенирования в качек затравок использовали "универсальный праймер", комплементар

;астку полялппнерэ фаговых векторов и синтетические штодезокснрибонузиеотиды, комплементарные внутренним участкам зтавок ДНК. По мэре определения новых нуклеотидных гследовательностей синтезировали дополнительные затравки. Для эго, чтобы из определенных хотя бы по одной цепи эследователкюстей нуклеотидов ДНК составить "макет" полного ;зома ХЕК понадобилось 16 таких затравок. Однако, некоторые 12СТМ1 последовательности не могли быть определены однозначно пс опей цепи ДНК, а в одном случае дало по дву?! цепям. Для зтановлекия точной послвдовательЕОстл нугаеотидов РНК ХЕК ржекилп слвдутхцге приемы: ' '

)прозедениз реакций секвестрования и последующего электрофореза СИ Е0ВЫЕ5ЕН0Й температуре (55°С вместо 37°С и 70°С вместо 55°С, оответственно); ,

)секвенираванке методом Максшла-Гилберта - для уточнения первичной труктуры 5’-концевой области генома ХВК п доказательства равильности реконструирования последовательности нуклеотидов в бласти стыка кленов х601 я х53. В последнем случае секвешгровали репарат кДНК, полученный на РНК ХЕК обратной транскрипцией с спользованнем праймера, комплементарного этой РНК в области начала дона х53 (Рис.1) (при участки А.С.Краева).

Осубклопирование. Знание рестриктпых карт клонов позволило гаправленно субклонировать имеющиеся вирусспецифлческие участки ДНК •ак, чтобы уверенно прочесть нужные последовательности нуклеотидов ; использованием только универсальной затравки.

Для субклонироваяия 7 фрагментов одноцепочечнуэ матрицу зтзягали с одним из имеющиеся олигодозоксирибонуклеотидов, сомплементарным участку ДНК, располозенному вблизи от иптересупцего ^рагаента и синтезнровата вторую цепь ДНК при помогу фрагмента {ленова ДНК-полимеразы I. В качестве субстратов попользовали 3 ’холодных" й>;тр и один (а-згР}ашт. Меченый амтр вводили в реакционную смесь в таком количестве,чтобы он был в осно'вном тсчерпан при репликации интересужщэго участка. Затем добавляли лзбыток. соответстзущего немеченного <ул"Р и продолжали синтез ДНК. Толученные препараты частично двучепочечной ДНК обрабатывали зоответствущпли рестриктазами и фракционировали в полиакриламидном геле (ШАГ) в неденатурирупдих условиях. Непродолжительная авторадиография геля позволяла легко идентифицировать нужный 5ра1мент ДНК по сравнению его электрофоретической подвижности с

СЕКВЕНИРОВАНИЯ Г^ЫК Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ

ВИРИОННйЯ РНК

-лл,

хбО!

кДНК-КЛОНЫ

М13-КЛОНЫ

и 53

х67

ЗАТРАВКИ

саиклоны

к ь 2: асс47: «67:

р < —;• 5 М < 4—)

1

2

3

4

J_______и

I

ТЫСЯЧ НУКЛЕОТИДОВ

Рио.1. Пояснения в тексте.

>чеными маркерами молекулярного веса л интенсивности включения !ТКИ. _

Восьмой субклон (г67-1I был получен другим способом, щочепочечные фаговые ДНК, содержащие вставку х67 в хэтивоположных ориентациях, отжигали друг с другом, переваривали эстриктазой BspRi и фракционировали в 1,5* агарозе.

Описанные способы получения субфрагментов обладают очевидным эеимуществом по сравнению с обычными методами, которые эедполагают использование целиком двучепочечных рекомбинантных тазмид: одночепочечный вектор не ■ может служить источником

эполнительных рестрикционных фрагментов, что позволяет получать Гбфрагаенты при помост любых, даже частощешщих, рестриктаз в одну гадаю, используя тэ же препараты рекомбинантных ДНК, которые рименяли для секвенирования.

Полученные тем или иным способом субфрагменты элюировали и попировали в фаговый вектор как описано выше.

.Установление полноя первичной структуры РНК ХВК.

В результате проделанных экспериментовьной части работы около СК первичной структуры пэсти ХВК-специфических клонов было становлено по двум комплементарным цепям ДНК. Длина выведенной труктуры РНК ХВК составила 5711 нуклеотидов (Рис.2). 43 нуклеотида

5'-конца ' этой последовательности соответствовали ранее пределешой 5'-концевой области-вирпонноа РНК Морозов и др., 981). 3*-концевая часть полученной последовательности перекрывала а 57S нуклеотидов 5'-концевую область 3'-прилежащего фрагаента РНК ВК длиной 1300 нуклеотидов, структура которого была известна L'orozov et ai, 1987). Таким образом, было завершено определение олной первичной структуры РНК ХВК. Ее длина составила 6435 уклеотздов, не считая PoiyiА)-блока на 3'-конце (Краев и др., 988, Skryabin ct al., 1988а), НуКЛеОТИДНЫЙ СОСТЭВ бЫЛ СЛвДУНДКМ:

0,7% А, 22,62 и, 22,9% G и 23,88 С. ' "

.Варчабдленость лдр^ичноп структурч РНК ХВК.

Кло1Ш кДНК были получены из двух препаратов РНК ХВК, ыделеншх из растешй, зараженных одним и тем не изолятом В1фуса, 1984 (х53, хб4, 2.67) и 1935 (х601, Хз2, х47) годах. На области ерекрывакия клонов приходится около 38% определенной в настоящей

с Г

ftS5TT;;:cftAT:cTiiftKe;c!c:*::A:sMSi:T:ic*.ic:sa5sT6iS3:m:«ssiTsn:5Tc:cATCfiT6£;;wftWTss;:TAE:TA; :ь:

с с

c:cri:eLTCAA;:65i!5a«G:55:TWTEfiT:!As^:£jT!::::»TAs:cs::A;Tc::!ATA;:AT:5AsTiG:sTA:e:jTr':?';!:cs:Tsii5

т

а::ыа!:баьс;аа:11стазае5ТвСП53тт:«:сста:са;айза^:т5ттй:йттт;:6тт:ст:ааа:сси5аа5:тааа:т;са15Асай м j

EHAA:;:s:EsAi:AAS3A:AmTCMCAAT6n5::4tT3;;:csA5A6AT3;A::;;6su:cccAAb5AAA:;A:;;ii5AE:AAA:4A:asASAT s«e

с •

Сй:;;::зА:йг»зсА!л:в::5вї5АСй:тстр:бстт:ттБЕАїс:8А5Ст;:А!Азтс9АСА:йпс:А«а:т5СССр«;;»БммгжвтАт м ♦*

А ТА 7 [

Б:АА::;тА:тт:тс:::Е!:ЕАЕБ:сьСстт:ААА;тЕг;ААз;А:т:А:с:ЕА;тАТАТА:АБ::т1;ААТА:т!:ь5А5г,тЕВтттссА5т;итб: ??о Б А с с

«с::АА:сАГ5г:гз:;£сАі:;Ат;::;г«:вАА;гг?і:гс;7ГГА:ддгс::г:АААоГв::А^:йГ^«:т!:сйвв£А::с«АС£Ат;£:г7гсї е»? *

S СЕ

С5і5:,А::[:ААПн:АСБп::ЕА::А:5;ТвАЗА;5:А:;сАзіеА:Ао:А:Ав:т5;АЗі.*н:і[п:ь:в:слА:.:сА:тісі;:іі[Ат:й:сА?л Ч'О А 1-І

БЕТ С А

csA[’:;iAA3^n;:uiE;:a:A5:i:TTcn6:ii5iT;:s;:^;cA;cs::3:"-A;A;u::A:A;TTT:a::;A;:!:A:,-:“!,i;!T^. ц-..

і

А Т

А£Ас::1;1££:с;::115:тАА:АА:£А::':п5:А::з:ч^::с:ттгЗА:А;;.',=АСА.‘А..::Атг:'.;.'ТАтт*зёТ':тт^Е:А:?А:о:с:А:т іг^

С А Є Б б

из;:;;Аз:Ааіі:;пі;сА:;:;з;:;:ттт:ітт^-;5::;,:;,;п:с:А:тт:«з;тісс;:с:АТт^Аг:;;!Ес;Агз::ттз:г‘" hov

6 А С

1 Eft т ft

6аазаг!тсс:’с:;іі:а::. ^Азг^Ез^АГсїАіосі^іА'^стти.ігігзсіб^.з^АГ’АААтс^тА:::;.^:::!'::*.;.--* їм *♦

А А С 1 ' ft S

СтСЗГ.А^ААЗСІСЗАСАЗЗАААСгЗАЛАІЕЗАЕЗТЬАААЗАГСА^ЗІБСАААЗАпА^ТгААГсЗ'ЛА^СЗААчТСЗАІС^мССА’З^А;: 1?'.0 ♦ ♦

А С 1 Т

НАА^іеАБа^іАА'СііААТБАБАТІАБЗбССІЗСАІйЕ-ІЗ^АА^ГЗСАЗ^ЛСгЗСоАІСТТСССАЕиА^нзТ^ТЗ-.и.'ЗьСААС^ЗТСА:; 1300 нн .[ С L £г 5 А

CTCC:AA:CA:!AA3:CUrTCCT5CftAC£TGr/JAADi;T£CCTCATTtA:A!:;3TCTAET5TGGAAL-AE3A?:Ai33IGA;HCTCC:i3PSAAAE;AC:G 1Г;0 НІ А . Т Т А 5 Т 5 А

UW:;CA£Cfi«:s:sAtAABTMTt5;AS6ACIKCTTEEAAJ!:ACT53AlTCCICaA:iftAftI6:TSn£cAHCfiA56[5CT55WATTCAGHU53; :«•* Н SA А Б 6 ПА С

!CEs:r:o\;.A;:!,Aicf.!E:::fT:ft:ii£AAiiiSTCTc:5:ctTE-:AAAKt5ft5:AiTTcccE:-A;:c;fi:,"«A;5Ab!T£::A:3ASssTT6 «

»і і с : о

^i.^i'.i-C’r^^rTcr^ccAucrTTr^'AKrfcrT^AC'^^rT^r^L-crsATcrcii-!4:«::^;r«:r5:c4r:;:w ?:?.) t \ А Б

6 А Е Т - Т ATT

а;^г,:а,;і:а:е:са:::аса.с5:а:ті:-:а;'.аі;:::;£,;::;!:;зі:а:с:::с^[.":;':с:''::;а".:а;тсс:-‘зт'.:аттез53т jiv Т С і А 6

аа:;^;;і;:'Аа:;:і:;п:;;;а]д;ін;,і,-а::та:з;аа::"е;ь'-аг;5:;с;/.;-:::агм;:;сі':тттса"а:іагзіа.-: зі1?

і сії а :

1;:з;:::з;',-ЗА’;гАА::;;:А;т:тЕТ':т;:А:::':А;;ч"А^;тА:::А',:тА:';::--:А:..;гА;-:.";.;'з;:тА"^"'‘А,.з:‘ЗС *•

а в с а с т

ТвАЯ-ЗЗЗСТССАТЗАССЗАПиЗЬАССЕЗЗ'ЗнІАЗАЗІАСТТ'ЗІСА^АТАІТЗЗ-З-’йСТАІЗТСААТЕСТАСАЗАССЕС^-ІААЗ^ЗЗАлП 17 г,

Б А С С А

ЕЗААіЗАГБЗТІЗЗТЗІСтЗАСиАЗАЗААЗЗЗЗгЕК.'ЗЗЕАДАТСГЛАТЕіЗЗЗІЗЗ^ТТЗЛАЗА.'СС-ДІЗС^'ЗТТТАС^'.СЗТЗЗІА^ ГЗ :

Е Т Т Т '

АііАА;і';АА£і;ібТАСйГ5Сс:;сісЗ;«:з;"ГСАС^^гсь:н[А:з:і5&;г5гсАд:;5:гАА:гА^сс:ААА5;йСАААг*,іізгт5л;:сА :т:а«

А С С

САА;;с’СААЕТиТо!АоС£:гяА;5:іАтз:А:АСьЗЗ«:пкіАбмгЗА:Е5;'САьзліс-,1сттсБ:ЕА^А;А^!5-:А--:’:ттгзз::тт: у.;;

’ т т _ с

ТбЗакнААЕЇТнБАСАЬЗАССЗСІТАЇСКАА-ЗАЗШССиКАБТСБТЕАЄАгААЕААССаСТСААЗБАСТАСЕАЕаСЕСАЗАБьСАБАЗЗСААПС :юо» і С А Б Т

6;5A;c:uAE3ccEA:A'A;A:Aie;siG:csASAAT6A36A3TCC6TGCTA3AE3AoTA:AAAGAcsAAc:cTTB3AAAASTT::,‘.:AGA3A:ATc:A ::со«

A А 1 fi

СТСТ5^1СССА:ЕЗ;иТТСЕААСТЕТ2ІС:АААС1£ААЗАСАСААССАПСнБТТ5ШТСБСА;СААСААбСАнААгА;оАСА::СТа;СІБЗь:А ::0у A S

А:іА1А:А::::СЕ[.СК;А^С:АЕ:ААТС;А5іАССАААСТ;::ЕАБААТТСІТ6АБСАА5АА55;САТТББс5АССТТСТБтТТБААСТА:СААА 340^ »

С Т Бо С А

аа5сіагс5;іттс::саа:зазсьтаиссст;:тс*са;5а;бтст?5баазс!ТоТссс:асбда6тасаеаесаабіасстса5таа$тсааа5Т5-иоіі *«

Т Т С А

;A;CTTAA!CAA:GCSAr:3T5A3A:;5AaTC:AEACTTTS;:SAAAA:AAASTTATG3TsrTC:T:AA5TCS*A5TE5STCACAAAESTE6AAAK5CTA :в0іі і С СІ Б А А А

££тсі;:гсАААі!ТАЄ£с:АЕзі{^:гАГйз:^?гіітінісА5:;Ейст57Бйі:стніі5з;5:тяБ5Сс;ЕБ*йит5СЕАтсЕтт:Аа: з7л? >*

6 СЕ Т

й:-ес;ттс!:лскй^ьбг.«5тсттс;т«к:тстЕ«':1Ак^й5«сд:йТБтстбктЕ:::стт5Айсадстсе?«!т:й5с?:й^тРЕсп :е:е й а т т

е5С7;і;!:А::й:-Сг*::7іт:[й::.':,сі:/іся’£':-''::т;г::т£с«тЕ!іг?і5стгА;;«с:лйе:.и!:йі:т£:р?йс:йсйг:;ййт«тс З’оо»

І С Я

сгіїсітїсг^гг-і'гл'-с^е’-ггс'іг’ттгсст.'^-'^їтстсіеттг^ссстсй^тг^^сс^ттсАт::!^:^ <:::

£ ( ! 5

«гегйлс;г.;::с:й:Ас:и;й:йй«:77сбі;:Атсс:й:::«^С7::а:й-і5::г/»сс;іС?й:й:£д:7:йиі:АсіиЛГГ!;:сіі;:дог:5т тс С 7 С 7 7 ТСС А

і:\і:ді;5::ї::;:.-:::ге"^сг.д::д:7і"^ :тг^-.зі;л(іС^':.‘ЄТТг^[:стєьатт7ТСТсоТтє« с:о

1 Б Б Б

С"^ггі-':.:і.'---::;:т^';*;-:-н:с:^,-г;';:гс:г':гг;::гт"д;г'г;:сд.':сгс-,':5;^ї:гсг^д^г.г£;:.'д:нГгсс7 <;ч с

';:;:т::п;:й1*!Х7тсттсЕ»‘!:-и',:гс7Е7:й::с.‘:ят::йстсй:7тгсй'Е*гдст <г?

с

-::::.-гт&Т£”;:п:::;^с;;,»г гг7Т7стттй::::7Ті;.:тїд:с!7?:й:Аїї!£ййТйггйї::йТА77:7:г7: <:-:о •*

А 7 7

6 ТС А .

?йй::г.;с:7^:с:7:л:й:й:::;:.:й71;',:*57::г7г.:1*.:7с:Б7пссс7Сйс^!БТ!:г:сртк!:лйст»,гя?::(Пй:;:,,!;.г:сй'::г.сс с т

- ::":т’с::*:,::*.г;тггс*:Тн:і77::‘:г.':а::ї:;:гг;с:;;т;::*:с:.':т7Т7Те:т:ік:тт^с^::-‘::т «>■:

й 7*7

;:ти:гчгй:“'Е::г:тїй:;,,;й7:.>.г:::й7й7ттйї;,‘:зз::::тй:тт::сй^!::ем>:с:Аі7СА:гй::їг7с:5чс'Сйй:А:т5т: :':о *

7 С А 7

:гі,:*7-;:т:’::г-:тт7С’;:-:;:с7£:Е;;;т:г:7СР5:7!Егст7і:Аі'С7.,ст:;ст»ііЕ7Б7:тЕ::г:АСИ(!7і'іА::к",лт7в2::йв їісо »»» Её б в

’::-.:,::'Т7::::?'::::?т:е:::::::'.'-,::‘.,:т"!‘с*л?тЕт:сс:::::"::сАтг;*.с7:г::с;т::гз7:;лттстЕ.'г н'гтст^с ::со

І 7 5

й:,*::й7т;;::;г,‘,:::77ті::7 77 ':т7::д-,т:;::77чте:т77:т£с-%^г;;7Т7;с:::й£:?тіее75й7«':й77Гл^!‘П7.«::л:йс£ ;:гз 7 С 6 С С СЕ

Сй:ій::т7/.:г=;:д:£::::сА^::і97:і7(:7г:А.*,:7:,*,:сйїйт:тг:=Ет:г.:!:;стцгтстр:йс;йС£Бйй5:йР::с«-СйТ7Тв:тб: 5«ои і с

::7г:’*:\'.г:й;:;т,:::;::’::;:і.-“:й^';:йт;т:т:йд:с:дАг:.*.тгсгст::т;гтг:7й,,:йлг:;:<::йгтсйгТг*[:7«:г7С ::■?* *

Б е т

Б І І А й

с::м::й:7:::::т7’:,*?:::7Тйг:тгт::?тт:?тйС7Ссйл‘5АГб7с;!:сй:с8^7йгі:АКА:А:ссгА:гЕ-57:ААстАХтсг.А:т зюо й:с;сйй^;: :?п *’ •

:с.2.Первичная структура генома Русского штамма ХБК (в віще їследовательности нуклеотидов ДНК; пронумерована). Под ней з казани нуклеотидные замени, обнаруженные в геноме птаїсла ХЗ ХЕК. ЗЛИЧЄСТВО аМИНОКНСЛОТНЫХ замен мезду полипептидами, КОДИруЄТШМИ ІК этих штаммов, обозначено звездочками. З*-концевая область РНК :К, секзенировапная ранее, не показана. _

іс.З (на следующей странице). Компьютерный анализ потенциальных }нов (в трех россах считывания) геномной РНК ХВК, от 5’-конца їлева) до 3'-конца (справа). Прогрела амаі.узе(і, опция "ЗЬерЫгс*

ІУ ргєґегепсе" (Біасіеп, 1982). ВбрОЯТІШЙ КОДІфуВДІб ОРТ ПОКаЗЙІШ

зризонталькктлі отрезкага. Вертикально расположенные отрезки: выше лис-кодоны, ніше - терминирующие кодоны.

I ..... I...........1 I III1

тысяч нуклеотидов

работе структуры РНК ХВК. Между последовательностями нуклеотид этих участков вирусного генома, определенным по разным клони обнаружены следующие различия: для х53,х64/хз2 (с 1072 по 22 нуклеотвд) - 14 транзиций, 2 трансверзпи и одна аминокислот» замена; для Х47/Х64 (4090-4737) - 10, 1 и 0, • соответствен

Мевду клонами зз2 и х47 в области их перекрывания различий было. Из 27 обнаруженных нуклеотидных замен только одна А) приводила к изменению смысла кодона: А1а710 продукта ОГ менялся ка тьг). Позиция 710 этого полипептида ХЕК не консорватнв у потексвцрусоз (БкгуаМп et а1. , 19886), ПОЭТОМУ МОЕНО ПОЛагаТ что замена данного остатка аланина на приблизительно равный ему об] ему остаток треонина не должна привести к замети

структурно-СуХпсциональным изменения;,:. Еесьма вероятно, ч

отмеченное разлгпхя в первичной структура клонов отрава клкрогсгорогешгость популяции Епрусных РЫК, которая возникает из-

ЬНСОПСЗ иугабИЛЬНОСТИ РНК-ГеНСМОВ (Нэ11апа ег а1, 1982).

После того, как определенная в настоящей работа пзрвиш: структура РНК "Русского" штамма ХВК была опубликована (Краез и Д1 1КЗ), в Нидерландах было закончено секвешфование генома штамма ХЕК (Ни1Бп*1п еь а1., 1988). РНК этих штаммов имели ОДИНаКОВ}

длину, их нуклеотидные последовательности (PHC.2)(Skryabin et al., 1988b).

различались на 3,9*

7.Кодирующая способность генома ХВК.

В геномной РНК ХВК обнаружено 5 открытых рамок трансляции (ОРТ)(Табл.1, Рис.з и 66). В комплементарной цепи имеется несколько небольшие ОРТ, которые в отличие от ОРТ (+)цеш не консервативны для членов семейства потексвирусов.

ТаОлица 1.Открытые рамки трансляции геномной РНК ХВК и их продукты.

OPTJ Координаты] Контекст

! (нукл.) ! первого

! ! Аос-кодона

------------!------------

Стоп-: Колич.;ыол.вес. : * » « кодон! кодо- {продукта | ! нов ! (Дальтон)і

Гцдро-j Обознй-

фоб-. !чение

ность I :

і :

2!

3 :

4 і

5 ;

85-4452! ACAAAUCGC ! UAA !

44С6-5163j UAAGAUCGA I UAG І

5147-5490 І ACAUAUCUC І UAG І

5427-5636! AUCUAUGGA І UGA і

5650-6360! AAAGAUCUC і UAA І

1456 226 114 !

70 j 237 І

165405

24563

12201

7595

25055

-99,4 -2,9 2,1 11 ,6 -35,4

РІ65 р25 р12 р8 СР ,

AACAA0GGC - КОНТЄКСТ ЭффеКТИВНОГО кодона ІЛГОГПХ генов растений (Lutke et al., 1987)

oCqCcAUCG

пшшиаторного TO r<e ДЛЯ ГИВОТНЫХ (Kozak, 1984)

Кс:.шъптершП анализ FHK ХВК, еиполношшй при помоги программ основанных на неслучайном срэднестатпстлчссксгт распределении нуг-лестидов б г.одопах (Stodon, 1972), упазнвзл на ВОЗУОГЕОСТЬ существования этих пяти ОРТ (Ркс.З). Контекста перзнх AUG-КОДОНОВ не претквервчап их зврочтноЗ пнгзгсстстттсй рз.ти з трапсляцтгт Еирусппх гс-нов (Табл.1).

По совокупности иу.ег.ггсся била прздяезона

пнтотегп'т-ег.а." c~cv. эктарзгепгт г°пэз ХЕЗГ (Т'раг-п и гp., 1?23,

Skryabin e-t -.1., СЭГЛПСТТО ОТОЯ СГ-С'.'О . р!65 СЧТГГППайТСЯ

непосредственно с r«ro,fnc3 РНК. В ?ар.т:гпких потогссзтгруса’п клетках сбкзру^штатся два главких вида т’яадгхипрсчЕппк суСгокс’нгих РНК размером 800-900 и 2100 нуклеотидов к несколько ! талерных (Dolja., 1?С7). Порван слугшт гптрицчЛ для белке оболочки (Карасси и др., 1SS7). размер Солео крупкой FI-IK позволяет считать ее наиболее

вероятным кандидатом на роль матрицы для р25. Экспрессия перекрывающихся ОРТЗ и 0РТ4, возможно, происходит при помощи минорной субгеномной FHK размером около 1400 остатков. Механизм трансляции таких бифункциональных матриц предполагает проскок частью 403-субчастиц рибосомы инициаторного кодона первой ОРТ (Kozak, 1986). Из пяти предполагаемых инициаторных кодонов РНК ХЕК наиболее слабый контекст имеет как раз тот, с которого дол::н:. происходить инициация трансляции ОРТЗ (Таб 1).

Недавние экспериментальные данные по трансляции различны:: ХВК-специфических РНК в бесклеточной системе, полученные на кафедро вирусологии Ї.ЕГУ к.;.М.В.Ломоносова и в отделе рекомбинантных ДНК нашего ішститута, подтверждают правильность предложенной схемы организации и экспрессии генома ХВК. Оіш кратко перечислены нняе: по 0РТ1: Соответствие области вириоішой РНК с которой считываете.': основной белковый продукт, той части генома, где расположена 0РТ1. было доказано методом ареста трансляцій олигодезоксідіуі^іеоткдаг.'.’,: (Uiroahnichsnko el al., 1938). Э'ГОТ Продукт ИМЄЄТ кажущийся молекулярный вес от 180 до 210 КДа, в зависимости от вида буфера, используемого для проведения электрофореза, т.е. несколько превышает расчетный (165 КДа)(Кагазеу et al., 1989). Такое аномальное электрофоретическое поведение, возможно, связано с присутствием обширных гидрофильных участков (аминокислотные остатки 460-620 И 970-1100) ПОЛИПЄІІТИДНОЙ цепи р165 (KarassV et al., 1939). по 0РТ2: Большая из основных видов субгенсмных РШС ХВК способна направлять синтез полипептида с М.в. 25 КДа, иммунологически неродственного белку оболочки (А.В.Карасев, личное сообщение), по ОРТЗ и 0РТ4: Показано, что полипептиды, соответствующие вирусным р12 и рЗ, образуются при трансляции ' одного транскрипта клоїшроваїшого участка генома ХВК (Miroshnichenko et al. , 1990). Кроме того, р12 экспрессирован в E.coli в виде гибрида с фрагментом A-белка СТВфИЛОКОККа (Simonova et al., 1990)

В начале 1988 года, когда определение первичной структуры ХВК уже было завершено, была опубликована последовательность нуклеотидов РНК другого представителя семейства потексвирусов -вируса мозаики белого клевера (ВМЕК) (Forster et al. , 1988).

Сравнение продуктов потексвирусных 0РТ1 (р165 у ХВК и р147 у ВМБК) показало высокий уровень сходства (более 50£) этих белков на протяжении двух неравных частей: 1-230 и 617-1450 АО у р165

(Skryabin et al., 19886). Ыезщу этими участками аминокислотной

последовательности ХВК расположена область, где сходство становится мекее Еыранешшм ели совсем исчезает. У Е!.ЕК часть ее делетирована: в основном за счет этого продукт ОРТ! этого вируса и?'.с-ет ’гекьпгиЯ молекулярный вес, чем соответствующие белок ХВК. Интересно, что именно та часть потоксвлруслого полипептида, которая не продставхна в гонсме EI.SIC варьирует па 8,2* гго аминокислотной последовательности г.эзду ХЗ :i Русским г;та::мв:'П (АО -170-515), и кодируется лзкбслсо вариабельней областью гетто"? этого вируса (pE0.2)(Gkryabin «t al., 19326). ПО-ГПП’.^СМУ, ОНЭ НЭ H0CCT суцоствехшсз фупакопалшсй нзгрустсп-. Наличие консервативных участков внутри plS5 :: других нелтнтг-птидев ХВК, наоборот,

заставляет предполагать, ’-’то они выполняют какие-то существенные для вируса Оутгкцт'л. •

Э.Троп^тичргкия анализ р.укгочкслотрчх после.чочатольностдп

белков ХВК

Для проведения сравнительного анализа внведзшшх полтнтептидоз ЭК Сил создан банк последовательностей НК'-свпзивагг’И” белков, содер:-:аг2гЛ ;люгио глоточные и практ1г:ес?:и все вирусные, .как охарактеризованные, так и предсказаниис ЕГРгзы и полкгераз!;, а такте другие» белки (+)РНК содор:::аспх вирусов. За нск.'.гшгем на только све:-:с-го, но какого бы то ни било банка а-’,:пгс::нсдотних поеледсватвльпсстеЛ на персональном ксгепьюторе всю виюоучем.тнутую а&средкз экстрагировали из литературы таен г.? б'пгт Pro+^ir.

lisr.-irict-ticn Г’зо'огос (Pin, гт.тггуск 19°3 года), имевшегося !Га кегдн.ютерз серпк 20 в гружэ П.В.Костонкаго (J75X АН СССР), и

ВВ\”“''”0 ВВО^'Л™ В T7n’’^ТЬ т*нп"*}пт.

а)ОРТ! и 0РТ2

По тетогим глг-актетеистикам - исиользозглгно суСгзнсмных РНК для экспрессии 3’ -прплегаишх областей гп-нсмл, наличие кзя-сгруятурн ка 5'-конце, считывание большого негронессируемого пслипетгп!да (р!65) непосредственно с геномной РНК - ХЕК напс:ян:ал однскс^онетггнне Спндбис-подобкые вирусы (вирус табачной мозаики, вирус

погремковости табака). Но ссноватик сравнения последовательностей

неструктурных белков этих последних и других (+)РНК Еирусов с последовательностями идентпфшдироЕакних FHK-полпкораз полиозируса и фага IJSZ, и с учетом болэе косвенных экспериментальных данных по некоторым вирусам, было описано большое семейство РНК-зависнмых ЕНК-ПОЛИМЭраЗ (Kamer and Argos, 1934, КуНИН И Др., 1987».

1.PVX 163K

2.WCIMV 14 7K

3.TYP1V 206K

4.SNYVV 237K

3.TNV 163K

6.TRV 194K

7.BSMV 74K

9.CMV 9«K

9.BMV 94K

10.AIMV 90K

ll.SNBV OSP4

12.VFV ns3

13.IBV F2

14.BBV 102K

lS.C*r«V 86K

16.SSMV 103K

17.IBDV 90K

18.MS2 pol

“po 1 yi**ras«'

concensus

1238 SLAMDYTAFDOSODGAnLOFEVL_?3 i 073 _CFSNCFТАГDQSOPGSILGFEVf 23 1574_KJ ANCVT^DCI50HG£SWUCftL_23, 1637J4GVIDAAAC0SGQGVFTQL1ERHJZ7' 1382_Vl.ELDISKY0*<S0NCFHCAVEYEl24. 1451_FVEIDhSKFDKSANRFHLQLQLE”29 404_ALE IDFSKFDKSKTGLH IKAVl d?9 314 JCLEIDLSKFOKSQGEFHLMlDEH J?9^ 46S_FLEADLSKFDKSOGELHLEFORe3z9. S30”fkE1DF5kFDKS0NELHHLI0Er”29 «89_H_ETDIA5FDKS0D0Af1OLTGLM 29.

iflgtlsimrltgegptfoantecnjaythtkf_

JFLGTLSI«RCSGEGPTFBAWTEANIAVTHTKT_ "TOFGPLTCMRLTGEPGTYODNTDVNtAVIYSOY.,.

‘yvrahtisyvktsgdvttfigwtvi|AACLASML_

"gUCTCI WYORKSGD'/TTF I GMT V1 I AACLASnL_ ■Gn«AH 1WYOOKSGBAOTVNANSDPTLCALLSEL. “GUEAVLLYOOKSGNCDTYGSNTWSAALALLOa.^ “GVGMPl SFORRTGDAFTYFGNTI VTflAEF AWCY_ JKVGHSVSFO«RTGDAFTYFGNTLVTnAMIAYAS”

’gvffnvofdrrtgdaltyugntivtlaclcwvyI

‘STRFKFGAnPWCSGMFLTLFVNTVLNW:ASRVL_

53?_FVAD0TAGWDrRirEA0L00E0E. 573”lmGUDYPkCDRAHPN«_LR I AA&_* 58«IviETDFSNLDGRVSSWrtORNIло] 470~AIGFDMSRFDOHVSVAACEFEHs] 696_AAEADISGFDWSVaOUELWADVe] 411~UYSIDUEKGEANCTR0Hn0AA«Y* 254 J.ATIOLSSASOS1SORLVWSNLP’

3ej“TOVISRRDORGSGOWTYALNTJTNt.»CVGL!Rf1_ -33lGG IYVKPGGTSSG0ATTAYANSVFN11 OATSAn” 32JGFR1EPGVGVKSGSSTTTPHNTQYNGCVEFTAL^ ’31 JTLRYTKEGCRMS6DMNTALGNa.LACLlTK4L«I 33 J-LDCELPG IMKSGSYCTSSTNSRI RCLMAEI_1G_ 3b”hnlojksygqgsgnaatfinnhllstlvldown”

18~GETIRWELFSTnGNGFTFELESMJ FWA1 VKOTq”

SG

NT

11*.

. 7JJVYAGDDSALDC. . 7J3VVAGDDMSJDy] ’ fe~IMVSGDDSLIDh| . 7_MAMKGDDGFkRQ* ‘ 7JSAFCGDDSLL.YF] . 7_VTYGGDDSLJAF_ . 7JZVFGGDDSLILF , 7J.I.FSG0DSLAFS i 7IaIFSGDDSLIIS^ . 9_VVASGDDSLIGT) . 9_AAF1GDDNIihg]

“polyffleratt"

consensus

12. 37 hAVSGDDCWRP

13. la 1 j.m1lsddgvvcy'

14. 16 GPKCGODGLSRA IS... SJ.INNGDDCVUC.

16._ 3_C2A«GODSVEGF.

17._24_IERSIDD1RGKl]

18._ B_IGIYGDDI1CPS.

GOO

31_PEFCGWLITPK, .31_AEFCGWT1SPK, rfc.PLFCGYYVGPA^ [29~ITFCGYALSNC] [28_GYFCGRYV I Ни] 20~PMFCGKFLLKT^ [28.PAFCGKFLLCI’ 2fe_PYICSKFYSLM^ 26_PYVCSKFLVET 27 PFICSKFLITPl’ 30_PYFCGGFILQD.

36 VPFCSHHFHCL 41 HEFCSOHTHLV .23_IGLCFLSRVFV. 34 _I RFCOMAPVFD.

[sijvefcswvjkkr]

[sOJRi-FCSAAYPKG]

[20IRESCGAHFYRG*

FCG

S

. 2_MK0P f KL HVSL. *CL A£A

* 2”lKk.P£Kf1NttSIELDKN~

’ 2~1RNPLALFCKLM1AVo3 ’ o~hlfpsv-srkltkiaa~

“ 8”yyDPU*CL ISKLGAKHI ” ’ fe”vPDPVKVLTKLGKKSl” ’ blvPDAAKFITKLGRTDv” ' 6j3Sptire:qru3tkki“ ‘ 7_VPDPLREI0RLAKRKI_ Ii 1 II PNPLKLL1 RLGSKKv”

* 8~VADPLKRLFKLGKPLP~

7_1WPCREQDELIGRGR_

"io^ypdpsrildacvfvddI ’ bIigdpi.rtlrklk.ttr” ‘ 6IVRDPLVSMSKDSHSLV_ ’ 4J-TSWPKTLVRFLSTPR_

’io”g IEOAYK WRYEAt-RL^ ’ 3”KPFYlKKPVDNLFALn2

Рис 4. Сравнение консервативных участков предсказанных вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз (ЗкгуаЫп et ai., 19880, по Кунину II др., 1937). Цифры между АО обозначают количество пропущенных АО в данной последовательности, pvx = ХВК, wcimv = ВМБК, tyuv = ВМТ, 4-11 - Синдбис-подоОные вирусы, 12-18 - другие РНК-вирусы.

Следовало ожидать, что по аналогии с Скндбис-подобными вирусами РНК потексвируса должна была кодировать полимеразный домен в 3’-концевой области большой 0РТ1. И действительно, характеристические для РНК-полимераз блоки Dxxxxd, t/sgxxxtxxnt/s, GDD , фланкированный ГВДрофОбНЫШ аМИНОКИСЛОТНЫМИ остатками (Argos,

^Эдесь и далее для обозначения аминокислотных остатков применяется однобуквепный код. X - любой АО. Т/й - в данной позиции находится остаток треонина или серина. ’

1989), и другие консервативные мотивы были обнаружены в р165 ХВК, причем так ге как у других вирусов они находились в С-концевой области этого больного неструктурного белка и на тех т.е расстояниях друг от друга (Рис.4). Выравненные мвзду собой наиболее консервативные области полипептидных цепей членов семейства, не содержащие пробелов, являются подходящим материалом для оценки степени иг. сходства, а при кззестных допущениях, и родства (Кунин и др., 1937). Подсчет ссгпадакза для пар послгдсватзлыюстеЗ АО указывает на значительнее сходство потеке- и тпцовирусных полипептидов (33 АО из 95). Полимеразы этих вирусов имели наибольшее колтгчество идентичных АО с соответствукЕимя белками ■’Сизгдбис-подобных” вирусов (22 АО мегду потеке- п эльфавнрусг?:н).

Других последовательностей, содержащих полимеразные мотивы в гевскэ ХЕК не закодировано. Так:?.! образе:,;, с Сольной степенью у^=Р?"сс'тн »,'??а-о утверждать, что в С-конпевсй области р165 ХЕК располагается *’пеР4< Спндбнс)-подобий" полп.'зрааний дсмея.

Ранее было экспериментально показало, что р123 вируса табачной мозатгкн и к^стгукт'/гнне белки некоторых лту^пп РНК— и ДНК-согетгпегз вирусов являются куг-леотид-сзясызапдпз.я. Их последовательности содержали оба а’ггтнокислоткых мотива присущих КТ^асам: легенд А - < гидрофобный участокхс/л^жохсхз/т, и Б: «гидрофобный учаСТСК>В(Е/В) (см. СогЪа1епуа, Кооп1п, 1989). ПТЗП ПС\'С1^1Г ЭТ113* Л15-С2Л-1Т0ТГУСТ’Г’’‘;6СТ"*^Т £*£ЛЛ ГП}П 'ТСТ‘П.2ПТГгг

НТФ-связывандие белки многих вирусов (Горбаленя и др., 1935, 1987). Центральная часть продукта ОРИ (р165) и продукт 0РТ2 (р25) содержали эти мотивы в правильной ориенташги (сначала А, потом Б). Л*«5Г? ли отношение указанные домены к какому-либо известном? семейству пх~>-свяэыБак)дих белков? Сравнение белков ХЕК с каддзй послеловательностыжз банка вирусных и клеточных НТ5аз при помоги программы МАСОН показало, что они обладают наибольшим сходством с центральным доменом р237 и белком р42 вируса пожелтения Кйлок свеклы (ЕПКС) и белком р58 вируса штриховатой мозаики ячменя (ВПМЛ)., Это служило серьезным указанием на принадлежность р165 и р25 семейству НТОаз Синдбис-подобных вирусов. Скоро стало известно, что все эти пзР2-подобные белки, включая р237 и р42 фуровирусов и р58 гордеивирусов, родственны днк-хеликазам Е.СОИ (СогЪа1епуа ег а1., 1988а, Ной^пал в! а1, 1988). На РИС.5 ВИДНО, ЧТО бвЛКИ ХВК р165 и р25 содержат шесть основных аминокислотных мотивов.

l.PVX 25K 25_VVHAVAGAGKSTALRKLI_34_FAILDEYTLD!J_ 6_0AIFADPYQAPE_

2 . V.'CIUV 26K 24_VV'HAIAGSGKSTVIRKIL_34_LDILDEYG2LP_ 8_EFIFTDPYQAPT_

3.ESMV 56K 266_IISGVPGSGKSTIVRTLI__38_LLIIDEY'TLAE_11_VLLVGDVAQGKA_

4.BNYVV 43K 120_IVLGAPGVGKSTSIKNLL_46_TULVDEVTRVH_11_VICFGDPAQGLN_

5.PVX 165K 731_VIHGAGGSGKSHAIQKAI_47_IVIFDDYSKLP_16_VILTGDSRQSVY_

6. VC1MV 147K 566_VIHGAGGSGKSHAIQTVU_48_IIVFDDYSKLP_16_AILTGDSKQSFH_

7.BNYVV 237K 892_YVKGGPGTGKSFLIRSLA_45_IIFVDEFTAID_11 _IYLVGDEQ3TCI_

V G AG GKS I A P T

У

Г. _10 _TSFRVPRK V_4 7.

2 . _11 _TTYRFGPNT_4 7.

3 . _1 8_TTYRLGQET_62.

4 . _1 8_ASRRFGKAT_67.

5. _28_ATHRNKKDI____40.

6. _28_ITHRNKPDI____40.

7. _25_MNFRNPVHD_72.

R

VDE

I

F

FVKPCQVTGLEFKVVTVVS. .FFKVSDVIGYQVPTVTLYL. CALAIDVQGKEFDSVTLFL. SILYSDAHGQTYDVVTIIL. .TFT Y AGCQGLTKPK V QIVL. SMTY AGCGGLTTKAV QILL. „KTTVRANQGSTYDUVVLPV.

T

L

SQG E AK S VH T NA R

GD Q

S

,10_AFY!1AITRS_ ,13_LLFIGLTRH_ .12_LRLVALSRH_ .13_VRAVLLTRA_ ,10_VMYTALSRA_ .10_VIYTAI_SRA_ .12_XNLVALSRH_

VALSR

TLVT

GM

SI

Рис.5. Консервативные фрагменты аминокислотных последовательностей продуктов ОРТІ її 0РТ2 ХЕК (PVX) и Bi'iSK (vciijv) и НТФ-СЕЯЗывавдио мотивы вирусов птриховатой мозаики ячменя - Е2МЯ (BSMV), вируса некротического ПОХЄЛТЄЕКЯ КИЛОК свеклы - ВНПНС (ENYVV) (Gorbalonya et al., 1985а). Cons: - "НГФазНЫЙ-ХеЛИКаЗШС" КОНСОНСУС ПО

T.C.Hodgman (1988). .

свойственных членам этого суперсемейства. Таки.) образом, Селковыо продукты 0РТ2 к центральной части 0РТ1 является предсказанными по первичной структуре пбР2 (Синдбис )-ПОДОбНКМИ ЩФ-связывахснми хеликазами. Это первый случай обнаружения двух генов НТФаз в одной молекуле вирусной РНК. Ранее две КГФазы, кодируемые разными РЖ были предположиелыю идентифицированы у вирусов с сегментированным геномом - фуровнрусов и горцеивирусов (Горбаленя и др. 1937). Одной из наиболее вероятных функций таких белков мокет быть энергозависимое расплетание дуплексов РНК, например, при репликации

(СогЬа1епуа et а1., 1988а).

Как установлено поздаее ^огапоу ег а.1., 1990 ), "НГФазцые” домены больших неструктурных белков потексвирусов проявляют большое сходство с тимовирусными гомологами. Их расположение относительно других доменов соответствует таковому у всех друпп Синдбис-подобных вирусов.

б)ОРТЗ и 0РТ4

Последовательности, родственные ОРТЗ ХВК обнаруживается в генот/.ах фуровіїрусов, гордкпзіфуссв (Horozov et al. , 1937), И

карлавіїрусов (Rupacov at al., 1989). У ВСЄХ ЭТИХ ВИРУСОВ ОРТЗ вплотную протыкает со стороны 3'-конца пли перекрывается с ОРТ, кодяруиспкп родственные ?*езду собой "НГФ-связываизие хеликазн"

(Skryabin et al., 19В8Ь). ТгіСОЙ бЛОК ГЄНСВ ОТСУТСТВУОТ У ДРУГИХ

СггкдСззс-подобзтих витзусов.

Продукты ОРТЗ ті 0РТ4 прэдскасыЕгззтся з:ззс интегралкше Г'ОГ’ОраіШНе бЄчЧКИ (ЩЮГС2Т-.Г?а RAOARGOS паїсота PCGOIE; Morozov et al. ,

1987), их гот.'олспі в бозпсэ РІП лэ обнарупезш (Розанов, пеопублпковгзззлые данные). Предполагается, что спи могут отвечать га транспорт вируса от клетки к клетки. Эта Функция ХЕК Сила продвмонстртфована Экспериментально (Таїіапзку et al., 1982).

Необходимо папотзтть, что выравнивание последовательностей НТЇаз и полізмераз (Рис 4 и 5) выполняли вручпуз. Позднее нам стали доступна прогрз'гя гаопествеиного ЕІіраЕПКВЗШЯ MULTALIN (Corpot,

15S3 ) ІЇ CLUSTAL (Ні^іпз, 1989), !ГОЗГрі’?Я СТаТИСТИЧЄСКОЙ ОЦОШШ готового алаЯмента SCORE (Koonin et al., i9S9)ii пострсезіия деревьев максіс.'ального топологического подобия COMP И TREE (КуїШН и др., 19S7). Использоваїгне этих прогр2*подтвердило правильность и Латисткческув ппачизгасть полученных п опубликованных нетлі ранее результатов и правомерность отнесения потексвирусов :с супзргруппе Снндбтіс-подобзззіх вирусов (Розанов, неопубликованные данные). В исследоватзнях, посвяпезптх свквенированига и/іші анализу структур геномов потексвирусов: к сходным выводам припли такпо другие авторы E’ffiK (Forster et al., 1988), ХБК (Huissan et al, 1988, !!orozov et al - , 1989), вируса МОЗаЛКП нарцисса (EMH) (Zuider=a et al., 1989) И вируса мозаики папайи (E;.ttI)(Sit et al, 1989). Независимо проведенный анализ группы последовательностей потенциальных вирусных НТФаз, вклзэчаадих потексвирусннв показал правомерность включения р25 и центрального домена р1Б5 ХВК в суперсемейство хеллказ,, вместе с соответствушшмя белказ.я других Синдбис-подобных ВИРУСОВ (Gorbalenya et al.', 19886).

Как уже было упомянуто, сравнение выведенных полипептидов ХВК и ВМЕК показало налігше обширного консервативного домена на N-конце большого неструктурного белка потексвирусов (Skryabin et al., 19836). Можно было думать, что этот домен функционально важен и

надеяться на обнаружение его гомологов среди других вирусных или клеточных белков. Поиск был предпринят, и такой гомолог, действительно, был найден. Им оказался N-концевой домен большого полипептида (р206), вируса желтой мозаики свеклы (тимовнруса) (Рис ба) (Rozanov et al., 1990). Он имел 22-25% идентичных с потексвирусными белками АО. Высокая статистическая достоверность полученного результата (11-13 SD), расчитанная по алгоритму

Needleman, Wunach (1970) При ПОМОЩИ ПЭКвТЕ Программ PCGEKi;

(Швейцария), не оставляет сомнений в его биологической значимости. Имеются ли другие гомологичные домены у больших неструктурны* белков потеке- и тимовирусов, и если да, то сколько иг? При помощ;: программы diagon было установлено, что помимо N—концевого домена имеются еще два в центральной и С-концевой области (см также рис 4). Программа uultalin (Corpet, 1988), позволила выполнить процедуру множественного выравнивания целых последователыюстоЛ р206 ВНМС, р165 ХВК, р147 ВМБК и р186 ВЧН. Вслед за n-концєек:.! доменом ("А”) располагалась вариабельная область, затем пзР2-П0Д0бНЫЙ ("В") И nsP4-подобный Д0М0Н ("С") (Rozanov et al. ,

1990). Домены "В" и "С” обнаруживали несколько большее сходство, чем домены "A": 24-27S (для "В") и 25-28* (для "С") идентичных АО при 8-13 и 16-17 SD, соответственно (Рис. 66).

Обнаруженное близкое родство больших неструктурных репликативных белков потеке- и тимовирусов 'было довольно неожиданным, так как во многих отношениях эти семейства не похоеи друг на друга. Во-первых, у потексвирусов вирионы нитевидные, а у тимовирусов - сферические, и характеризуются совершенно различными принципами построения вирусных частиц. Во-вторых, для тимовирусов был описан процессинг большого неструктурного'белка, что, по мнению u-.D.Morch и соавт., сближало их с альфавирусаки животных, но не с каким-либо другим семейством вирусов растений (CM. Uorch et al.,

1988). В-третьих, другие гены этих вирусов не имеют достоверного сходства ни по количеству и расположению в геноме, ни по первичной структуре. Самое удивительное состоит в том, что ОРТ для белка р69 ВНМТ (Veiland, Dreher, 1989) практически ПОЛНОСТЬЮ ПбрекрЫВавТ ОРТ для р206 целиком пересекая область кодирования консервативного (f) домена "А" (Рис.66), в т время как в соответствующих областях геномов потексвирусов нет длинных ОРТ, помимо ОРИ (Еис.З).

Таким образом, разные гены потексвирусов обнаруживают различные "родственные связи": ОРИ - С тимовирусами (Rozanov et

< "domain A"

1 10 20 30 40 50

TYMV MA.FQLALDALAPTTHRDPSLHPILESTVDSIRSSYQTYPWSIPKELLPLLNSYGIPTSG PVX ttAKVREVYQSFTDSTTKTLICSDEAYRNIRPIMEKHKLANPYAaTVEAANDLEGFGIATNP NMV KAKVRAALER IRDPSVQTALSEAAYTHVRPVLKESLVNCPYALSNDEADCLESFGITVNP WCLM MAKVRAALDRITDPSVKA VLNEEAYSHIRPVLRESLTNNPYfl IAPDAADTLEKYGIATNP

1 10 20 30 40 50 60

70 BO 90 100 110

TYMV LGTSHHPHAAHKTlETFLLCTHWSFQATTPSSVMFMKPSKFNKLAOVNSNFRELKNYRLH PVX YSIELHTHAAAKTIENKLLEVLGSI LPnEPVTFKFT-KPRKLNYMRRNPR IKDIFHNVAIE NMV YANQTHTHAACKVIEURMLEIVCMHLPKHSCTMLFl-KRSKLRYMRRAAILKDVFLNKDVE WCLM FAVKVHSHGAVKSIENTLLERVGFNLPKEPCIFLFLKRSKLRYLRRGPSNKDIFIMLAIE 70 GO 90 100 110 120

130 140 150 160 170

TYMV PNDSTRYPFTS. . PDLPVFPT. . IFMHDALMYYHPSQIKDLFLRKPNLERLYASLVVPPE PVX PRDVARYFKETIIDKLTEITTDTAYIGDTLHFLDPSYIVETFQNCPKLQTLYATLVLPVE NMV PKDLFRYDRDTITSRLQDIDTKIAYMSDTLHFMSRREIVGLFEDSPKLETLLATVVLPVE WCLM PRDLCRYEEDTLVESWTRITTRYAYISDTLHFFTRKMLADUrFHNPALDVLYATLVLP~‘ 130 140 150 160 170 .

180 190 200 210 220 230

TYMV fiHLSDOSFYPKLYTYTTTRHTLHYVPEGHEAGSYNOPSDAHSWLRINSIRLGNHHLSVTI PVX AAFKKESTHPNIYSLKYFGDGFQYIPGNHGGGAYHHEFSHLGi.’LKVGKIKWRDPKDSFLG

NMV ALHKRTSUYPSUYSINYSAk-GFEYIPENHGGGCYFKPYTTLEKLKVRMIN------AEDFH.

WCLM ALHKHPSIEPDLYTINYNFNGFOYIPGNHGGGSYSHEFKCLEWLKVGHLK..............

190 200 210' 220 230

240 250 260 270 280 290

TYMV LESWGPVHSLLICRGTPPPDPSLQAFPTLMTSDLFRSYQEPRI______DVVSFRIPDAIELPQ

PVX HLNYTTEQVEM..........HTVTVGLGEGF AftNHLYCIRRGDLLTPEVRTFGQPDRYVIPP

NMV . .KLSTGFI...........LTFCLVESLGAN’HLFIVQKAKLLTPQMRTFCR.DSLVTLP

WCLM _____SPELS............LTFQMIESIG AN’HLFM ITRGIКITPRVRTFTK. DSYVLFP

240 250 260 270

300 310 320 330 340 350

TYMV ATFLOGPLR.DRLVPRAVYNALFTYTRAVRTLRTSDPAAFVRMHSSKPDHDWVTSNAWDN PV X QIFLPKVHNCKKPILKKTMKGLFL YVRT VK V AKNCDIFAKVRQLIKSSDLDKYSAVELVY NMV QVFCPAAMNANRPLSKTKAMGMLLYCKSVKGVTERDIYAKIRQ11PTSELELYDPDEIVH WCLM QIFHPRNLNPSKPFPKVKAMGLFTYVKSVKNPTERDIYAKIRQLIKTSELSDYHPDEIVH 2B0 290 300 310 320 330

165K

25K

CP

ф domains: Ши» в 12K U 8K

с к

0 t s

TYMV 1 Шш ••

206/221K

69K

CP

Рио.6а. Сравнение первичной структури N-концевых доменов больших несруктуршых полипептидов тимовируса (BEMT=TYMV) и потексвирусов (XBK=pvx, bmh=nmv и BMBK=wciuv). Выравнивание было выполнено программой multalin (Corpot, 1988) с использованием матрицы гомологичных замен ЫДМ78 (Dayhoff, 1978). Штраф за проб.ел был равои 10. Жирным шрифтом АО выделены в том случае, когда сходство мегіду не менее, чем трех АО в колонке было рано или превышало пороговое значение 11.

Рис.66. Сравнение организации геномов потексвирусоз и тимовирусов. Гомологичные домены одинаково закрашены.

al., 1990), блок 0РТ2-0РГЗ - с фуро-, гордеи- и карлавігруса.'.:: (Skryabin et al., 19886), 6ЄЛ0К ОбОЛОЧКИ - С ПОТИВИрусаМИ (Uorozov et al. 1967). Взятые В СОВОКУПНОСТИ, ВС6 БТИ ДНННЫВ свидетельствуют о ключевой роли рекомбинационных событий е.возникновении и эволоди: вирусов.

Итак, потексвирусы можно отнести к супергруппо Синдбис-подобных вирусов по совокупности признаков, из которых главным является сходство репликативных белков. Однако, помимо nsP2- II паР4-подобных ДОМСНОВ, беЛКП ВИРУСОВ ОТОЙ СуШрГруШШ, описанные ранее, имели еаз один консервативний домен, пзРі-подобшй (Coldbach, 19S7). Он расположен в N-концевой области полипептида, несущего "НГФазный" (пэРг-подобный) домен. У гордеивируса (В!Е.!Я), кодирукцего две "НГФазы", он находится в составе большего полипептида (р120) (Gustafson et al., 1989). Исключение составлял вирус .некротического пожелтения ПИЛОК свеклы (ВПЕС) - Eouzoubaa II соавт. (1987) не нашли похонего по первичной структуре домена в составе большого неструктурного полипептида (р237). Реальный кандидат на сходство с nsP2 или с N-концевой областью ВПЖС - домен "А" репликативного полипептида тимо-/потексвирусов ("типовирусов") очевидной гомологии с ними не обнаруживал. Таким образом, заметное сходство домена, расположенного в N-концевой области репликативного белка, содержащего "НТФазу-хеликазу", с пзРі вльфавирусов не является общим свойством представителей супергруппы

Синдбис-подобных вирусов (Rozanov et al., 1990).

. В И В О Д U

1.Определена первичная структура перекрыв ащихся клонов кДНК, представляющих последовательность нуклеотидов ЕНК X вируса картофеля. Длина определенной таким образом первичной структуры РНК ХЕК составила 5711 нуклеотидов. Полная длина генома ХВК оказалась равной G435 нуклеотидам. .

2.При помогу коетьютерного анализа обнаружены 5 • потенциальных открытых рамок трансляции РНК ХБК: 0РТ1 способна кодировать белок с М.в. 1G5 КДа, 0РТ2 - 24,5 КДа, ОРГЗ - 12 КДа, 0РТ4 - 8 КДа и 0РТ5 - 25 кДа .

3.На основании сравнительного анализа выведенных аминокислотных последовательностей

а Центральная часть продукта 0РТ1 и продукт 0РТ2 предпологкительно нделтифицирозаны как нуклеотидсзязывавдиэ хелгосазы, а С-концевая область продукта ОРИ как РНК-зависнмая ЕНК-полимераза.

б)потексвирусы могут быть отнесены к супергруппе Спндбис-подобных вирусов

в)обнарунено неожиданно высокое статистически достоверное сходство больших неструктурных белков потеке- и тпмовирусов, что свидетельствует об их относительно недавнем происхождении от

'общего предка; перекрывающиеся 0РТ2 и ОРТЗ консервативны для потеке-, фуро-, гордеи- и карлавирусов, но отсутствуют в геноме тимовирусов. Сделан вывод о существенной роли рекомбинационных процессов в происхождении и эволюции этих вирусов.

. Основные результаты диссертации изложены в сл едущих

публикациях:

1. Краев А.С., Морозов С.Х)., Лукашева Л.И., Розанов Ы.Н., Черно: Б.К., Симонова М.Л., Голова Ю.Б., Белжеларская С.Н., Позмогов, Г.Е., Скрябин К.Г.. Атабеков И.Г. Первичная структура : организация генома Z-вируса картофеля. Доклады АН СССР 1988.T.300, 0.711-716,

2. Skryabin K.G., Kraev A.S., Morozov S.Yu., Rozanov M.N., Cherno' B.K. , Lukas ho va L.I. & Atabekov J.G. The nucleotide sequence o, potato, virus X. Nucl. Acids Res., 1988, v.16, p.10929-10930.

3. Skryabin K.G., Morozov S.Yu.,Kraev A.S., Rozanov U.N., Cherno'

B.K. , Lukas he va L.I. & Atabekov J.G. Conserved and variabli elements in RNA genooes of potexviruses. FEBS Lett., 1933 v.240, p.33-40. •

4. Rozanov M.N., Morozov S.Yu. & Skryabin K.G. Unexpected closi relationship between the large non-virion proteins o: filamentous potexviruses and spherical tymoviruses. Vlru; Genes, 1990, v.3, p.373-379.

T- 0302 ОТ ог O1/. SO г.

3,к.М£а ТиР-100 Т1Ш- культуры СССР