Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение локализации белков клостеровируса желтухи свеклы в вирионах и в зараженной клетке

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение локализации белков клостеровируса желтухи свеклы в вирионах и в зараженной клетке"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Г 3 ■••■> имени М.В. ЛОМОНОСОВА

1 3 ОПТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЗИНОВКИН Роман Алексеевич

Изучение локализации белков клостеровируса желтухи свеклы в вирионах и в зараженной клетке

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук А.А.Аграновский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наукС.К.Завриев доктор химических наук А.Б.Вартапетян

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН.

Защита состоится " СеЛУс'.М1998 года в [[) час. на заседании

Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан \и" сентября 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

V.

В Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе развития молекулярной зирусологии определены и проанализированы полные последовательности еномов большинства известных вирусных групп, что позволило сделать выводы эб их эволюционных связях и предсказать функции ряда вирусных белков. С завершением "эры сиквенса", основными направлениями современной зирусологии растений становятся исследования экспрессии вирусных генов, а также функциональный анализ кодируемых ими белковых продуктов.

Объектом данной работы является клостеровирус желтухи свеклы (ВЖС), типовой представитель рода Closterovirus семейства Closterovirídae. ■Спостеровирусы имеют очень большие позитивные РНК геномы и обладают эядом уникальных свойств организации генома и структуры вирионов. Гибкие нитевидные частицы клостеровирусов имеют морфологически полярную структуру (получившую название структуры "гремучей змеи"), в которой небольшой концевой сегмент покрыт минорным 24-кДа структурным белком (СБ), тогда как большая часть инкапсидирована мажорным 22-кДа СБ (Agranovsky et al., 1995). Следует отметить, что структура такого рода уникальна для нитевидных вирусов, и способы ее сборки и функциональный смысл пока не изучены. Исследование положения молекулы РНК внутри частицы ВЖС является первым шагом для решения этой проблемы, открывающй перспективы для построения моделей сборки вириона ВЖС и его диссоциации на ранних этапах инфекции в клетке, а также взаимодействия различных сегментов вириона с эелками растений-хозяев и насекомых-векторов.

Одной из характерных особенностей экспрессии консервативных генов репликазы ВЖС [открытых рамок считывания (ОРТ) 1 а/1 Ь] является автопротеолиз папаин-подобной протеиназой, приводящий к выщеплению N-концевого фрагмента с мол. весом 66 кДа (Agranovsky et al., 1994а). В настоящей работе были получены плазмидные конструкции для экспрессии фрагментов ОРТ 1а в бактериях, отработаны методы очистки рекомбинантных фрагментов белка 1а и получены высокоспецифичные моноклональные антитела (монАТ) к консервативным доменам репликазы ВЖС. С помощью монАТ была впервые доказана экспрессия ОРТ 1а ВЖС in vivo и определена локализация компонентов

репликазного комплекса в субклеточных фракциях. Обнаружение продукт! экспрессии репликативных генов клостеровируса в зараженных растени: представляется перспективным для последующего изучения процесс! репликации вирусной РНК и локализации субклеточных структур, в которых oí происходит.

В геномах клостеровирусов закодирован также ряд неконсервативнь белков с неизвестными функциями. Один из таких белков (р21) закодирован ОРТ 8 ВЖС. Получение специфичной антисыворотки к р21 и определен! локализации данного белка в зараженных тканях растений, проделанные данной работе, важны для последующего изучения функции р21 и для поиа клеточных белков, которые могли бы взаимодействовать с ним.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработ! методов иммунологического обнаружения ряда структурных и неструктурнь белков ВЖС и изучение их локализации в вирионе и в зараженной клетке. В хо/ исследования решались следующие задачи:

- экспрессия рекомбинантного белка р21 ВЖС и получение специфично поликлональной антисыворотки к этому белку;

- определение локализации p21 in vivo с помощью полученных антител;

- разработка методов определения участка геномной РНК ВЖС, покрыто минорным СБ в вирионе, и картирование этого участка;

- получение моноклональных антител к консервативным домена метилтрансферазы (МТ) и хеликазы (ХЕЛ) в белке 1а ВЖС;

- исследование экспрессии и субклеточной локализации репликативнь белков ВЖС в зараженных растениях с помощью моноклональных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работ была осуществлена экспрессия неструктурного белка р21 ВЖС в Е. coli получена антисыворотка к рекомбинантному белку. С помощью серологическог анализа р21 был идентифицирован в зараженных растениях.

Были разработаны новые методы для решения задачи картирования конц вирусной РНК, покрытой в составе вириона минорным СБ. Полученные с и помощью результаты позволяют сделать вывод о локализации минорног сегмента вириона на 5'-конце РНК ВЖС. Авторская методика, использовавшаяс для решения поставленной задачи, может в дальнейшем применяться дл

пределения локализации минорного СБ в вирионах других клостеровирусов.

Получены моноклональные антитела к метилтрансферазному и еликазному доменам продукта ОРТ 1а ВЖС; впервые показано, что in planta анные домены присутствуют в составе отдельных белковых фрагментов, а не в дном большом белке, как предполагали ранее. Результаты могут иметь пределенное практическое и теоретическое значение для дальнейшего зучения схемы процессинга клостеровирусных репликативных белков.

Полученные в работе поликлональные и моноклональные антитела могут ыть использованы для диагностики клостеровирусной инфекции.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном аседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела -иохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. АН. Белозерского 16 марта 1998 г. Материалы исследований, представленных в аботе докладывались на международных конференциях: "Lomonosoff-98" Москва, 1998), "Biocatalysis-98: fundamentals and applications" (Пущино, 1998), на I Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и находится в ечати 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", Эбзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", список итированной литературы включает более 200 публикаций. Работа зложена на страницах, содержит 13 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Экспрессия неструктурного белка р21 ВЖС in vitro и in vivo

Белки, родственные р21 ВЖС, закодированы в геномах других днокомпонентных клостеровирусов, переносимых тлями: вируса, ссоциированного со скручиванием листьев винограда-2 (ВАСЛВ-2), вируса ристецы цитрусовых (ВТЦ) и вируса желтой карликовости свеклы (ВЖКС). Хотя

геномы других клостеровирусов также несут на З'-конце небольшие ОРТ, и продукты не показывают статистически достоверного сходства с р21 и ег гомологами. Для изучения профиля консервативности продукта ОРТ 8 ВЖС родственных клостеровирусных белков, нами было построено выравнивани аминокислотных последовательностей, которое обнаруживает 6 инвариантных 30 консервативных позиций в белках р21 ВЖС, р20 ВТЦ, р22 ВЖКС и р24 ВАСЛЕ 2 (Рис. 1).

ВАСЛВ-2 ШтУЗРУЕАЕОНЖЕЗТОМЪ-НЫЮБСУ---ЬЗ-ТКЕС1КАЕЗТ1ТР0Ь

ВТЦ МВАУЕЗУШУ13ЬЬАКУЗАУУЕКЬС0РЗУТ--1,АЕУМ0Е1Ы0ЕЫЗЕ1,АЬУ

ВЖС МКЕЕЬКОСЕТЗКАЬЗНЗЕЗЫ,ККУКЕЬСТЫ30<23Е13ЕСУОЕЕЫЕ1,АЗЕЫ

ВЖКС МКЪЬЬЗОЗУУУОЗТЫЬАЫКСЬЫЕЬШКЗУ----Р-ЬЕЗС1АЗУМЕЬЬ-1К

ВАСЛВ-2 НСАКАЭУСДОСУОТСЬУОРЫСАЕКК1,1-ОТУЕЗЫ1К1,А(2Р1,УКЕКМАУН--

ВГЦ НЗШ30МЫС0НООСННЕМСЕНКЗЕЬЬ-СЫ1ЕАКЬКУЬЬО11КР1КЕТР;ОКЬ

ВЖС НЬЬУТУЕНЯЕИМЕ-ОНРЫОЗЗКЬНУР-ЗРХСЕМЬКЕШАЕЬКУРУУТР--

ВЖКС УМАОЗОЗОА1НКЫЕКЫЕЫЬЕРОЬЗУМТТ01,ЕЬМУК01Р,С>1ЛГ<АЕ1ЫКЕ--

ВАСЛВ-2 Е-СК0ЕРКЕЬУАЕ1ТНКУУЕЬТСУСМИЕ------АУКР-ЕМЛЗЬТКТУЬЫ

ВТЦ Ь-С-ТЗАТОУМСЕЕУМКУМЗЗ-ЭНТЗЕЕ-----ЗУМЕГГ-ЕЫи,УУКАУ1,3

ВЖС М-НКЕТА30ТЬЫАЕЬЕЕУСК1-ТСЬАНЕ-----ОАЬРЕ-КМИКУКЗУУЬЕ

ВЖКС ЕЫС-ЗЗШ0УУКМ11ЕЫУ:ШТНРЗЫЗКЕКРУТЕЕ<2103ГЗМКСУ1КТ31,0

ВАСЛВ-2 КМЗЬЕМАЕУМЗРКАИКЫАЕИЬЕ1,КЕЗР-'УК1Е-К0ЪЪ

ВТЦ ОЬЗШШКЬОЕЗЕКАЕААУС11,-1,ОКСТ-УЗТУ-СС-<2

ВЖС ННЗЕЫЖЕЕУТЕШЕЗУТЕЫ-КЬНЪЗЬ-КУХЗ-ЗОИ

ВЖКС Щ,ЗУКУКЕЕУТ1ЫУЕКСЫАЫ,ОУКМСУЗУКТЕУЕЫУЬ

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков р2-ВАСЛВ-2, р20 ВТЦ, р22 ВЖКС и р21 ВЖС. Звездочками обозначены идентичньн аминокислотные остатки, двоеточиями - сходные остатки. Выравниванш построено с помощью программы ОРТА1. (воФа/епуа е/ а/., 1986). Данньп последовательности обнаружили сходство на уровне 8,4 во при дистанцш Дулиттла 176 (ОооМИе, 1986). Вариабельные участки на С-конце белков н< показаны.

1.1. Клонирование гена р21 в экспрессирующий вектор рОЕ-ЗО и экспресса вирусного белка в Е.соН

Вставка, несущая полную ОРТ 8 ВЖС, была получена с помощью ПЦР н; клоне р36 с праймерами В171 и Ро1. Данные праймеры были синтезировань таким образом, чтобы последовательность ОРТ 8 в «ДНК могла бьт

заклонирована в вектор pQE-ЗО в одной рамке трансляции с короткой векторной ОРТ (кодирующей Met-Arg-Gly-Ser-6xHis) под контролем промотора бактериофага Т5 и сайта связывания рибосом (Рис. 2). Индукция с помощью изопропил ß-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) клеток Е. coli штамма SG13009, несущих полученную конструкцию pQE-p21, приводила к суперэкспрессии белка р21, количество которого составляло до 30% суммарного клеточного белка (Рис. 3).

ОРТ 1а

1Ь 3

2

5 7 4 6 8

П

о

Т5-иромогор ССР His,

Ват\\\

Pst I

pQE-p21

Рис. 2. Схема экспрессирующей конструкции pQE-p21, использованной в •заботе. Сверху изображена карта генома ВЖС с открытыми рамками трансляции (ОРТ1а - 8), обозначенных прямоугольниками. Последовательность ОРТ 8 (зачерненный прямоугольник) амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в плазмиде pQE-ЗО между рестриктазными сайтами ВатHI и Pst\. В векторе pQE-p21 обозначены Т5-промотор, сайт связывания рибосом (ССР) и последовательность, кодирующая элигогистидиновый "хвост" (Hise).

1.2. Очистка рекомбинантного белка р21 и получение поликлональной энтисыворотки

Рекомбинантный р21 белок ВЖС содержал на N-конце последовательность иести гистидинов. Присутствие этого позитивно заряженного сегмента позволяет эчищать рекомбинантные белки с помощью аффинной хроматографии на никель--штрилтриацетат (Ni-NTA) - агарозе (Hochuli et al., 1988). Очищенный этим

методом р21 не содержал видимых примесей бактериальных белков (Рис. 3), и имел электрофоретическую подвижность в 15% ПААГ, соответствующую белку с мол. весом около 22 кДа. Препарат очищенного белка использовали для получения кроличьей антисыворотки (АБ-р21).

1 2 3

Рис. 3. Электрофореграмма рекомбинантного белка р21, экспрессированного в штамме Е. coli SG13009 (15% денатурирующий ПААГ). Дорожка М -маркеры с указанными мол. весами в килодальтонах (К); 1 суммарный белок из

неиндуцированных клеток с плазмидой pQE-p21; 2 - то же, после индукции 1 мМ ИПТГ; 3 -рекомбинантный белок р21 после очистки на Ni-NTA агарозе.

-14К

1.3. Идентификация р21 в инфицированных ВЖС растениях

Суммарная антисыворотка As-p21, взятая в разведениях от 1:500 до 1:50000, проявляла многочисленные белковые зоны на иммуноблотах белков из здоровых и больных растений, что затрудняло анализ р21 (результат не показан). С целью получения более специфичных антител, As-p21 истощали с помощью инкубации с экстрактом из здоровых растений Tetragonia expansa, после чего выделяли фракцию IgG хроматографией на сорбенте Avid-Gel (BioProbe Int.).

Для детекции и определения внутриклеточной локализации p21 in vivo, были получены субклеточные фракции клеточных стенок, мембран и цитоплазмы из здоровых и инфицированных листьев Т. expansa (Niesbach-Klosgen et al., 1990). Белки различных фракций разделяли в денатурирующем градиентном 8-20% полиакриламидном геле (ПААГ), переносили на нитроцеллюлозу и инкубировали с очищенными IgG. В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный белок р21. На полученном иммуноблоте белков из инфицированных (но не здоровых) растений отчетливо выявлялись мажорные полосы, соответствующие белку р21 (Рис. 4А). Зона р21 выявлялась на дорожках

21-кДа

Б

р21 0 20 60 90 120

Ч-21-к Да

Рис 4 Обнаружение белка р21 ВЖС в зараженных вирусом растениях. [поты проявляли иммуноглобулинами IgG из кроличьей антисыворотки к р21. трепка указывает зону белка с мол. весом 21 кДа, определенным по равнению с белковыми маркерами (Mid Range Protein Markers, Promega) A -Шмуноблот субклеточных фракций, полученных из зараженных ВЖС (I) и доровых (Н) растений Tetragonia expansa. Обозначения дорожек: CW- фракция неточных стенок; РЗО - фракция мембран (осадок при 30,000 g); S30 - фракция итоплазмы (супернатант при 30,000 д); р21, маркерный р21 (1 мкг). Б -Шмуноблот суммарного белка из листьев растений, собранных через О, ¿0, О, 90, и 120 дней после инокуляции вирусом.

всех субклеточных фракций, хотя максимальное его количество было обнаружено во фракциях клеточных стенок и цитоплазмы (Рис. 4А). Разница в электрофоретической подвижности рекомбинантного р21 и белка в зараженном растении может объясняться тем, что рекомбинантный белок содержал на 14-конце дополнительную последовательность из 12 аминокислот, закодированных в векторной ОРТ. Белок р21 был обнаружен как в молодых, так и в старых листьях растений (собранных в интервале от 20 до 120 дней после инокуляции), хотя его количество несколько снижалось в ходе инфекции (Рис. 4Б).

Биохимическая активность и биологические функции ряда гипотетических белков клостеровирусов (например, репликативных белков, протеиназы и НБР70-подобного белка) были предсказаны с помощью компьютерного анализа аминокислотных последовательностей, что дало возможность проверить некоторые из них экспериментально (Адгапоуэку et а/., 1991а, Ь, 1994а, 1997). Белки, гомологичные р21 ВЖС, закодированы только в геномах однокомпонентных клостеровирусов ВТЦ, ВЖКС и ВАСЛВ-2; однако, их последовательности не несут функциональных мотивов, содержащихся в современных базах данных (Рис. 1; Рарри е/ а/., 1994; Кагаэеу е( а/., 1996; Не е{ а/., 1998). Недавно проведенные эксперименты с инфекционной кДНК ВЖС (Регетуэ1оу а/., 1998) показали, что транскрипт кДНК ВЖС, содержащий мутацию в старт-кодоне гена ОРТ 8, накапливался в протопластах с эффективностью в пять раз ниже по сравнению с немутированным транскриптом; при этом уровень синтеза минус-цепей геномной РНК и количества субгеномных РНК также существенно уменьшались. Из этого следует, что р21 ВЖС играет важную роль в процессах репликации и транскрипции вирусного генома, или же защищает вирусную РНК от деградации (РегетуэЫ е< а/., 1998). Хотя уровень сходства между р21 ВЖС и его гомологами незначителен, выравнивание последовательностей выявляет некоторые консервативные позиции (Рис. 1), которые могут быть мишенями для точечного мутагенеза в дальнейших экспериментах по картированию домена, ответственного за трансактивацию синтеза РНК. Тот факт, что белок р21 был обнаружен как в молодых, так и в старых листьях растений, позволяет предположить постоянство экспрессии ОРТ 8 в процессе инфекции, или же значительную стабильность самого белка. Эти данные могут указывать на существование у р21, помимо его активности как

трансактиватора репликации РНК, неких функций на поздних этапах инфекции, когда синтез вирусной РНК в клетке закончен (например, связанных с переносом вируса тлями-векторами). Бактериальный продуцент р21 и антитела, специфичные к этому белку, дают возможность дальнейшего изучения функций р21 и поиска его гипотетических белковых партнеров в клетках растений-хозяев и насекомых-векторов.

2. Картирование минорного структурного белка р24 в вирионах ВЖС.

2.1. Саузерн-гибридизация специфических РНК-зондов с кДНК ВЖС

Поскольку структура типа "гремучей змеи" ВЖС уникальна, в нашем распоряжении не было стандартных методов, пригодных для картирования хвостового сегмента аириона, построенного из минорного СБ. Для определения локализации минорного структурного р24 белка в частицах ВЖС нами был разработан новый метод, основанный на иммуноселекции фрагментов вирусных частиц, полученных с помощью обработки ультразвуком. Для проведения иммуноселекции, к суспензии озвученного вируса добавляли антисыворотки Аэ-Ыр24/р35 (или Ав-ВУ\/), специфичных к минорному и мажорному структурным белкам ВЖС, соответственно (Адгапоувку а/., 1995). Далее фрагменты вирионов, декорированные антителами, отбирали на Белок А-Сефарозе. Контрольная аликвота фрагментов частиц ВЖС не подвергалась серологическому фракционированию. В результате мечения у-[32Р]-АТФ РНК из опытной и контрольной аликвот были получены РНК-зонды двух типов: контрольные зонды содержали рандомические фрагменты геномной РНК ВЖС, а опытные зонды были обогащены последовательностями РНК, которые в составе вирионов одеваются минорным структурным белком р24. При гибридизации с кДНК клонами, соответствующими различным областям генома украинского штамма ВЖС (Рис. 5А), контрольный зонд давал достаточно сильный гибридизационный сигнал со всеми клонами, за исключением 1615 (вставка в этом клоне соответствовала участку около 800 нт с 5-конца генома) (Рис. 5Б). Этот результат можно объяснить присутствием кеп-структуры на 5'-конце РНК ВЖС (Кагаэеу е? а/., 1989); после озвучивания суспензии ВЖС кепированные

5'

12 15 у

-I_I_I_I_1—

И5 а

1615

1520

ИЗ а

р36

г9

515

гЗ

9

Контрольный зонд Опытный "р24 зонд"

в г

05 03 05 03 05 03 05 03

Контрольный Опытный зонд "р24 зонд"

Опытный Опытный "р22 зонд" "р24 зонд"

Рис. 5. А. Схема кДНК клонов украинского штамма ВЖС (ВЖС-У, светлые прямоугольники) и немецкого штамма (ВЖС-Н, заштрихованные прямоугольники) по отношению к геному ВЖС (верхняя линия с масштабной линейкой в тыс. нт). Б. Саузерн-блот гибридизация вставок кДНК клонов ВЖС-У с у-32Р-мечеными фрагментами РНК ВЖС; контрольный РНК зонд - РНК, полученная из озвученной суспензии вирионов без иммуноселекции; опытный "р24 зонд" - РНК из фрагментов вириона, отобранных антисывороткой к р24. В. Блот кДНК вставок 05 и 03 ВЖС-Н с гомологичными РНК зондами (контрольным зондом и "р24 зондом"). Г. Блот 05 и 03 с гомологичным "р22 зондом" и "р24 зондом".

фрагменты РНК не могли узнаваться полинуклеотидкиназой и метиться радиоактивным у-[32Р]-АТФ. Следовательно, суммарные РНК зонды должны были 5ыть обеднены мечеными последовательностями, представляющими 5'-концевую эбласть генома.

Опытный зонд давал более сильный гибридизационный сигнал с клонами 1615, 515 и 1520 (соответствующими 5'-концевой области РНК ВЖС), и несколько эолее слабый с клонами, представляющими З'-концевые области генома, /казывая тем самым, что иммуноселекция As-p24 привела к обогащению зонда 5'-концевыми фрагментами вирионной РНК. Аналогичные данные были получены л для кДНК клонов немецкого штамма ВЖС, представлявших 5'- и З'-концевые /частки РНК длиной 413 и 274 нт, соответственно (Рис. 5В).

Для исключения возможности того, что полученная картина гибридизации зыла следствием некоего артефакта, связанного с самой процедурой /1Ммуноселекции, был поставлен дополнительный эксперимент. Наряду с эпытным "р24 зондом", был получен зонд с использованием антисыворотки, ;пецифичной к мажорному р22-сегменту в частицах ВЖС (Agranovsky et al., 1995). По сравнению с "р24 зондом", который лучше гибридизовался с клоном D5, "р22 зонд" давал сильный гибридизационный сигнал с D3, и намного более слабый с D5 (Рис. 5Г). Полученная картина гибридизации вполне согласуется со ;пособностью антител к р22 реагировать с широким спектром фрагментов частиц ЗЖС, включая и те, которые могли содержать оба СБ. Таким образом, весьма маловероятно, что характерная картина гибридизации "р24 зонда" (Рис. 5) была :ледствием артефакта метода селекции. Скорее, следует заключить, что знтитела к р24 в нашем эксперименте специфично взаимодействовали с фрагментами вирионов, содержащих 5'-концевые фрагменты РНК ВЖС.

2.2. Локализация р24 в вирионах с помощью метода иммунозахвата-эбратной транскрипции-полимеразной цепной реакции

В качестве дополнительного экспериментального подхода к решению данной проблемы, нами был адаптирован метод "иммунозахвата с обратной транскрипцией и ПЦР (ИЗ-ОТ-ПЦР)" (от англ. "immunocapture-reverse transcription-Dolymerase chain reaction"). Антитела к p24 или к р22 (в отрицательном контроле -эуфер без антител) иммобилизовали на плашках для иммуноферментного

анализа (ИФА) и инкубировали с озвученной суспензией вирионов ВЖС. Из захваченных антителами фрагментов вирусных частиц выделяли РНК, которую использовали в дальнейшем для реакций амплификации с праймерами, специфичными к 5'- и З'-концевым участкам геномной РНК. Продукты ПЦР, соответствующие 5'-области генома ("5'-ПЦР фрагменты"), обнаруживались во всех пробах, за исключением отрицательного контроля. "З'-ПЦР фрагменты" были выявлены для РНК, захваченной антителами к р22, но не для РНК, захваченной антителами к р24 (Рис. 6). Таким образом, иммуноселекция фрагментированных частиц ВЖС с антителами к р24, очевидно, обогащает препарат б'-концевыми последовательностями и практически полностью отсеивает З'-концевьге последовательности геномной РНК.

Рис. 6. Электрофоретический анализ в 1% агарозном геле продуктов обратной транскрипции-ПЦР, полученных на матрицах РНК из иммуноселектированных фрагментов частиц ВЖС. Амплификацию проводили с наборами праймеров, специфичных к 5'-концевым (дорожки 1, 3, и 5) и З'-концевым (дорожки 2, 4, и 6) участкам генома ВЖС. 1 и 2, - контроль без антител; 3 и 4, - амплификация материала, отобранного антителами к р24; 5 и 6, - то же, с антителами к р22. Цифрами справа обозначены длины фрагментов (в п.н.) маркерной ДНК фага лямбда, расщепленной эндонуклеазой Pst\.

Эти данные, в совокупности с результатами Саузерн-гибридизации, ясно указывают, что именно 5'-концевой участок РНК кпостеровируса находится в составе "хвоста", построенного из белка р24. На основании полученных нами данных можно построить рабочую гипотезу о механизме процесса сборки вирусных частиц со структурой типа "гремучей змеи". Ранее высказывалось предположение, что в РНК ВЖС может существовать участок, дискриминирующий р22 и р24 при одевании РНК (Agranovsky et al., 1995). Проведенное нами картирование р24 в вирионах позволяет сконцентрировать поиски гипотетического сигнала инициации сборки в районе 800-900 нт от 5'-конца геномной РНК ВЖС. При репликации близкородственного кпостеровируса ВТЦ in vivo образуются дефектные РНК (Д-РНК), состоящих из 5' и 3' сегментов геномной РНК (Mawassi et al., 1995). По крайней мере, некоторые Д-РНК

инкапсидированы СБ двух видов (Febres et al., 1996), что не противоречит сходному положению гипотетического дискриминирующего сигнала инициации сборки в геномах ВЖС и ВТЦ. Д-РНК ВТЦ (доступная в настоящее время в виде кДНК; Yang et al., 1997) могла бы послужить хорошей моделью для изучения механизма сборки клостеровирусов; в частности, логичным представляется проведение делеционного мутагенеза Д-РНК и последующий анализ белков, одевающих мутантные формы.

Присутствие минорного СБ на 5'-конце РНК ВЖС может играть важную роль в процессе экспрессии вирусного генома на первых этапах инфекции. Известно, что при электронной микроскопии препаратов сока растений и очищенного вируса можно обнаружить лишь два типа вирионов: полноразмерные, инкапсидированные двумя типами СБ, и "бесхвостые" частицы, одетые только р22 (со средними длинами 1370 и 1290 нм, соответственно). Фрагментов размером 75 нм, покрытых минорным СБ, при этом обнаружить не удается (Agranovsky et al., 1995), что указывает на склонность "р24-хвоста" скорее быстро диссоциировать, чем механически отламываться. Можно предположить, что при попадании частиц ВЖС в поврежденные стилетом тли клетки флоэмы происходит "раздевание" участка геномной РНК, покрытого р24, что делает 5'-конец РНК доступным для рибосом. Возможно, что на этом этапе большая часть геномной РНК остается в составе комплекса р22, и экспрессия 5'-концевых генов происходит одновременно с котрансляционным раздеванием вирусной частицы рибосомами (в соответствии с механизмом, предложенным для ВТМ; Wilson, 1984). Вероятно, такой способ экспрессии клостеровирусных генов мог бы служить для защиты их РНК геномов, которые, в силу больших размеров, являются легко доступными мишенями для клеточных нукпеаз.

3. Экспрессия in vitro и in vivo фрагментов гена репликазы (ОРТ1а) ВЖС

3.1. Клонирование метилтрансферазного и хеликазного фрагментов гена репликазы (ОРТ 1а) ВЖС и экспрессия вирусных белков в E.coli

Нами были получены экспрессирующие конструкции pQE-N6H-mt и pQE-N6H-hel со вставками, соответствующими коротким участкам ОРТ 1а ВЖС (Рис. 7А). В «ДНК pQE-N6H-mt был закодирован N-концевой участок белка 1а ВЖС из

66KL(* ОРТ 1а 229KL lb

1 П-Про[ МТ ХЕЛ

пол

156 ,-. 115

Т5 ^

пром Hiss ✓

РШ i oat

ССР

pQE-N6H-mt pQE-N6h-hel

/

Б

MTR I

mrgshlihhhhtdpslsisnpPQFNLSFTHSVYSDHPAAAGSRLLENETLAS

_MTR In_ MTR II

MAKSSFSDiGGCPLFlllKRGS'mYHVCRPIYDMKDAQRRVSRFI.Q

MTR 11a

ARGLVEN LSREQLVEAQARVSVCPHTLGNCNVKSDVLIMVQ

_MTR III_

VYDASLNEIASAMVLKESKVAYLTMVTPGELLcstaakln

_HF.L V_

mrgshhhhhhtDLLKSFGKRSRSSVEKPTVLTVHEAQGETYRKVNLV HEL VI

RTKFQEDDPFRSENHITVALSRHVESLTYSVLSSKRDDAIAQAIV KAKQLVDAYRVYPTSFGGSTLDVSVNPSTSDRSKCKASSAPYEV 1NSFLESVVPGTTSVDFGDVSEEMGTQVFESGADNVVIRDSAPV NKSTDHDPQRV

Рис. 7. А. Схема OPT 1a/1b ВЖС, кДНК клонов 156 и 115, и экспрессионных конструкции pQE-N6H-mt и pQE-NBH-hel. использованных для синтеза антигенов с целью получения моноклональных антител. Обозначены консервативные домены папаин-подобной протеиназы (П-Про) метилтрансферазы (МТ), хеликазы (ХЕЛ), и РНК-полимеразы (ПОЛ) Стрелкой показан сайт разрезания П-Про; мол. веса продуктов расщепления указаны в килодальтонах (К). На карте плазмид заштрихованными прямоугольниками обозначены Т5-промотор, сайт связывания рибосом (ССР) и короткая ОРТ кодирующая олигогистидиновый "хвост" (His6). Масштаб соблюден приблизительно. Б. Аминокислотная последовательность рекомбинантных белков, содержащих домены МТ (N6H-mt, сверху) и ХЕЛ (N6H-hel снизу)-прописными буквами обозначены вектор-специфические аминокислоты Указаны консервативные домены МТ (I - III) и ХЕЛ (V и VI).

148 остатков (19.5 кДа), несущий консервативные метилтрансферазные домены -III (Рис. 7Б), а «ДНК pQE-N6H-hel - С-концевой участок 1а из 180 аминокислотных остатков (21 кДа), содержащий НТФазный/хеликазный домены V л VI (Рис. 7Б). Индукция ИПТГ клеток Е. coli, несущих плазмиду pQE-N6H-mt, приводила к экспрессии белка (N6H-mt), который имел электрофоретическую подвижность, близкую к ожидаемой (мол. вес около 18 кДа; Рис. 8). Белок N6H-hel мигрировал в ПААГ с аномальной подвижностью (около 28 кДа; Рис. 8). Белки, очищенные с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе и ренатурированные прямым или градиентным диализом, не содержали видимых примесей бактериальных белков.

Рис. 8. Электрофореграмма рекомбинантных белков N6H-mt и N6H-hel, экспрессированных в штамме Е. coli SG13009 —200 (градиентный 6-15%

денатурирующий ПААГ). 1

_j 2о суммарный белок из

=-,00 неиндуцированных клеток; 2 и 4 -~ ,;о белки из индуцированных ИПТГ

— клеток с плазмидами pQE-N6H-mt —60 и pQE-N6H-hel, соответственно;

— 3 и 5 - рекомбинантные белки N6H-mt (3) и N6H-hel (5) после

_40 очистки на Ni-NTA агарозе. Для

определения мол. весов использовались маркеры с мол. ~ весами от 10 до 200 кДа (с промежутком в 10 кДа в области 10-120 кДа) (10 kDa Ladder, Promega). Цифрами справа 20 показаны мол. веса (в килодальтонах) для каждого второго маркера.

3.2. Получение моноклональных антител

После иммунизации мышей Ы6Н-т1 и последующих двух этапов слияния клеток были получены 384 гибридных клона, продуцирующих монАТ. Одиннадцать из них (ЗВ6, ЗС5, 2Р5, 4А5, 2С10, 2010, 4В4, 4С5, 2А4, 4А2, и ЗН4)

реагировали с гомологичным антигеном (N6H-mt) при непрямом ИФА и на иммуноблотах (данные не показаны). Все полученные монАТ принадлежали к классу IgGi. В результате иммунизации N6H-hel и трех последущих экспериментах по слиянию, были получены 288 монАТ-клонов. Пять из них узнавали N6H-hel иммуноген в ИФА и на иммуноблотах; монАТ 1А2, 1D1, 2С6, и 2В5 принадлежали к классу 1дМ, а 1С4- к IgGi. Антитела из этих панелей имели высокий титр и узнавали менее 50 пикограмм гомологичного антигена на иммуноблотах. Нами был модифицирован традиционный метод иммуноблотинга - после переноса белков из гелей, нитроцеллюлозные мембраны подвергались облучению ультрафиолетом, что значительно увеличивало чувствительность детекции белков.

3.3. Идентификация метилтрансферазного и хеликазного фрагментов репликазы ВЖС в инфицированных растениях

На иммуноблотах субклеточных фракций зараженных ВЖС растений, монАТ ЗВ6, ЗС5, 2D5 и 4А5 (панель монАТ к метилтрансферазному фрагменту 1а ВЖС) проявляли единственную зону, соотвествующая белку с мол. весом около 63 кДа (рбЗ); судя по отсутствию видимой реакции антител этой панели с белками из здоровых растений, монАТ обладали весьма высокой специфичностью (результат для ЗВ6 показан на Рис. 9А). Остальные семь монАТ из данной панели не реагировали ни с одним белком в инфицированных растениях. Максимальное количество рбЗ обнаруживалось в мембранных фракциях Р1 и РЗО, хотя минорные количества белка присутствовали также во фракции клеточных стенок CW (Рис. 9А).

Антитело 1С4 (из "хеликазной" панели монАТ) специфически выявляло на иммуноблотах вирус-специфический белок с мол. весом около 100 кДа (рЮО) (Рис. 9Б) и практически не реагировало с белками из здоровых растений (Рис. 9Б). Распределение рЮО в субклеточных фракциях зараженных растений практически не отличалось от такового у рбЗ, т.е. белок был в основном сосредоточен в мембранных фракциях. МонАТ 1D1 также узнавали зону рЮО, хотя и с меньшей эффективностью, чем 1С4; остальные три антитела из этой панели не реагировали ни с одним белком зараженных растений (данные не показаны).

CW PI P30 S30 N6H-mt H I H I H I H I

— 200

— 120 =- 100

— 80 — 60

— 40

— 20

Б

CW PI P30 S30

N6H-hcl ÍI I И I H I H I

— 200

— 120 =■ 10(1 — 80

— 60 — 40

— 20

Рис. 9. Вестерн-блот рекомбинантных MT и ХЕП белков и белков субклеточных фракций здоровых (Н) и инфицированных (I) ВЖС растений Tetragonia expansa. А, - Иммуноблот с монАТ ЗВ6, специфичным к МТ домену. Дорожка N6H-mt, один пикограмм рекомбинантного белка, взятый в качестве контроля; CW- фракция клеточных стенок; Р1 - осадок 1000 g; РЗО - осадок 30000 g; S30 - супернатант. Б, - Иммуноблот с монАТ 1С4, специфичным к ХЕП домену. Дорожка N6H-hel, 1 пг рекомбинантного фрагмента хеликазы; остальные обозначения такие же, как и в А. Мол. веса 63-кДа и 100-кДа вирусных белков были определены с помощью маркеров (10 kDa Ladder, Promega). Цифрами справа показаны мол. веса (в кДа) для каждого второго маркера.

В экспериментах по исследованию кинетики синтеза вирусных белков, тотальные белковые препараты из зараженных ВЖС образцов растений, взятых через определенные интервалы времени после инокуляции, тестировали с монАТ ЗВ6, 1С4 и 1470 (специфичными к вирусному белку оболочки р22). Белки рбЗ и рЮО появлялись одновременно с р22 на 11 день после инокуляции (д.п.и.), вместе с началом развития симптомов вирусной инфекции (Рис. 10А,Б,В). Максимальное количество рбЗ и рЮО наблюдалось в пробах, собранных на 20 д.п.и. В пробах, собранных в последующие дни, их количество заметно уменьшалось, и на 49 д.п.и. белки уже почти не проявлялись на иммуноблоте. В отличие от репликативных белков, количество р22 возрастало до 20-32 д.п.и. и оставалось стабильным в последующие дни, лишь немного уменьшаясь к 49 д.п.и. (Рис. 10В), указывая тем самым, что компоненты репликазы синтезируются на более ранних стадиях инфекции, чем структурный белок.

До настоящей работы экспрессия и локализация клостеровирусных репликативных белков оставались неизученными, и продукты ОРТ 1а и 1Ь обозначались в литературе как "гипотетические" белки. Мы установили, что метилтрансферазный и хеликазный домены ВЖС присутствуют in planta в составе индивидуальных зрелых белков с мол. весами 63 кДа и 100 кДа соответственно, а не в едином белковом продукте, как предсказывали ранее на основе компьютерной трансляции (Agranovsky et а!., 1994а). Сумма мол. весов обнаруженных МТ- и ХЕЛ-содержащих белков составляет 163 кДа, что значительно меньше ожидаемого мол. веса С-концевого фрагмента белка 1а, образующегося в результате расщепления лидерной протеиназой (229 кДа). Это может объясняться присутствием нескольких сайтов расщепления протеиназами в середине цепи белка 1а, или же аномальными электрофоретическими подвижностями рбЗ и рЮО белков в полиакриламидных гелях.

Ранее было показано, что лидерный 66 «Да белок автопротеолитически выщепляется из состава полипротеина 1а (Agranovsky et al., 1994а). Однако, как следует из наших данных, продукт 1а ВЖС подвергается дальнейшему протеолитическому процессингу с образованием N- и С-концевых фрагментов, несущих, соответственно, домены МТ и ХЕЛ. Эта схема напоминает процессинг предшественника неструктурных белков nsP1-nsP4 альфавирусов и слитного белка 1 а/1 b корона-подобных вирусов (Dougherty & Semler, 1993). Центральный

I 2 4 7 11 15 20 32 49 Н 2 4 7 11 15 20 32 49

рбЗ

----*-р100

В

Н 2 4 7 11 15 20 32 49

р22

Рис. 10. Кинетика синтеза белков ВЖС в инфицированных растениях etragonia expansa. Тотальные препараты белков готовили из листьев зраженных растений на 2, 4, 7, 11, 15, 20, 32, и 49 д.п.и. Дорожка Н, белки из дорового растения. Иммуноблоты инкубировали с монАТ ЗВ6 (А), 1С4 (Б), и 470 (В), специфичным к СБ ВЖС. Вирусные белки обозначены стрелками права от блотов.

участок белка ОРТ 1а ВЖС имеет отдаленное сходство с аспартиловыми протеиназами ретровирусов (Agranovsky et at., 1994а). Однако, последовательность этого домена неконсервативна (или слабоконсервативна) в белках 1а других клостеровирусов, что заставляет сомневаться в его функциональной активности, хотя и не исключает ее (Karasev et al., 1995; Klaassen et al., 1995). Не исключена возможность, что выщепление МТ и ХЕЛ белков происходит под действием либо лидерной 66-кДа протеиназы, либо какого-либо клеточного фермента. На первый взгляд, эта гипотеза противоречит картине трансляции РНК ВЖС в бесклеточной системе, при которой образуются белки с мол. весами 250 кДа и 65 кДа (Karasev et al., 1989), что соответствует действию лидерного белка П-Про только лишь на один сайт в белке 1а. Однако, вполне вероятно, что для дополнительного протеолиза in trans требуется присутствие каких-либо кофакторов П-Про, или присутствия клеточной протеиназы; данные компоненты могли отсутствовать в бесклеточной системе трансляции.

Репликативные комплексы многих РНК вирусов ассоциированы с клеточными мембранами (Buck, 1996). Полученные нами данные также указывают на связь МТ и ХЕЛ белков ВЖС с мембранами зараженной клетки. Известно, что инфекция клостеровирусов индуцирует образование мембранных везикул ВЖС-типа, которые могли бы быть связаны с репликацией (Coffin & Coutts, 1993). Используя полученные в данной работе монАТ, было бы интересно определить, присутствуют ли в этих структурах репликативные белки, т.е., являются ли они на самом деле специфическими сайтами репликации клостеровирусов. Локализация рбЗ и рЮО в мембранных фракциях указывает на присутствие в этих белках мембрано-связывающих доменов (если, конечно, они не удерживаются в мембране с помощью белок-белковых взаимодействий). Вместе с тем, следует отметить, что белок аа гордеивируса штриховатой мозаики ячменя, содержащий консервативные МТ и ХЕЛ домены, обнаруживается главным образом во фракции цитоплазматических белков (Donald et al., 1993). Можно предположить, таким образом, что внутриклеточную локализацию репликативных белков родственных вирусов растений определяют скорее некие вариабельные аминокислотные последовательности, а не сами консервативные МТ и ХЕЛ домены.

выводы

1. Получены поликлональные антитела к неструктурному белку р21 ВЖС, экспрессированному в бактериях. С помощью Вестерн-блоттинга установлено, что р21 синтезируется в зараженных ВЖС растениях, причем наибольшее количество белка находится во фракциях цитоплазмы и клеточных стенок.

2. Показано, что минорный структурный белок р24 в составе вириона покрывает 5'-концевую часть вирусной РНК ВЖС.

3. Получены моноклональные антитела к метилтрансферазному и хеликазному доменам белка 1а ВЖС и с их помощью проведен Вестерн-блот анализ зараженных вирусом растений. Установлено, что эти домены присутствуют в составе индивидуальных белков с молекулярными весами 63 кДа и 100 кДа, соответственно, которые связаны с фракциями мембран зараженной клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Аграновский, А.А., Никифорова, С.Ю., Фолимонов, А.С., Витушкина, М.В., Зиновкин, Р.А. и Атабеков, И.Г. Вирус желтухи свеклы: картирование функций, закодированных в большом РНК геноме // III Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 23-24 мая. - 1995.

2. Agranovsky, А.А., Folimonova, S.Yu., Folimonov, A.S., Denisenko, O.N., Zinovkin, R.A. The beet yellows closterovirus p65 homologue of HSP70 chaperones has ATPase activity associated with its conserved N-terminal domain but does not interact with unfolded protein chains //Journal of General Virology. - 1997. - V. 78. -P. 535-542.

3. Agranovsky, A.A., Zinovkin, R.A., Erokhina, T.N., Vitushkina, M.V. Detection of the beet yellows closterovirus methyltransferase-like and helicase-like proteins in vivo with help of monoclonal antibodies // International conference "Biocatalysis-98: fundamentals and applications", Pouschino, June 13-18. - 1998. - P. 25.

4. Зиновкин, P.A., Йелкманн, В. и Аграновский, А.А. Минорный структурный белок клостеровируса желтухи свеклы инкапсидирует 5'-область вирусной РНК в вирионах // V Международная конференция по фундаментальным наукам "Ломоносов-98", Москва, 7-10 апреля, - 1998.

5. Зиновкин, Р.А. и Аграновский, А.А. Обнаружение неструктурного белка р21 клостеровируса желтухи свеклы in vivo с помощью поликпональных антител к белку, экспрессированному в бактериях // Молекулярная биология. - 1998. - т.32. - в печати.

6. Zinovkin, R.A., Jelkmann, W., Agranovsky, А.А. The minor coat protein of beet yellows closterovirus encapsidates the 5'-terminus of RNA in virions // Journal of General Virology. - 1998. - в печати.