Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных белков вируса бешенства

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кротова, Лариса Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА КАК ТИПИЧНОГО ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЕМЕЙСТВА RHABDOVIRIDAE

1. Структура генома вируса везикулярного стоматита

2. Строение и состав вириона везикулярного стоматита . II

3. Транскрипция и репликация

4. Синтез вирусных белков

ГЛАВА П. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА

БЕШЕНСТВА

1. Морфология вириона бешенства

2. Физические характеристики и химический состав вируса бешенства

3. Антигенный состав вируса бешенства

ГЛАВА Ш. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА БЕШЕНСТВА С ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

1. Транскрипция и репликация генома

2. Синтез вирусных белков

ГЛАВА 1У.ИСТОРИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ШТАММ "ВНУК0В0-32"

ЧАСТЬ П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА У. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы и радиоактивные изотопы

2. Буферные растворы

3. Вирус, очистка, концентрирование и выделение его компонентов а) Клетки, их заражение и мечение б) Приготовление препарата вируса, используемого для изучения процесса гель-фильтрации в) Получение вирусных компонентов

4. Получение цитоплазматических экстрактов и анализ их структур

5. Фракционирование градиентов

6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

7. Сканирование окрашенных гелей

8. Авторадиография

9. Сканирование вирусных ^^С-белков

10. Пептидное картирование

11. Определение радиоактивности

12. Титрование инфекционного вируса на животных.

13. Оценка иммуногенной активности инактивирован ного вируса

14. Определение содержания белка в вирусных препаратах

15. Гель-фильтрационная хроматография на макропористых кремнеземах

16. Электронная микроскопия

17. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА У1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА БЕШЕНСТВА НА ДВУХ ПАССАЖНЫХ УРОВНЯХ.

ГЛАВА УП. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ КОНЦЕНТРАТОВ ВИРУСА

1. Изучение эффективности и параметров очистки вируса бешенства с помощью гель-фильтрации на модифицированных винилпирролидоном макропористых кремнеземах

2. Очистка и концентрирование вируса с помощью центрифугирования

ГЛАВА УШ. ИНДИКАЦИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ, • ОЦЕНКА ИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС И МОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ

1. Плавучая плотность вирионов бешенства.

2. Молекулярные массы отдельных структурных белков

ГЛАВА IX. ИЗУЧЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦАХ

1. Анализ результатов депротеинизирующих воздействий

2. Анализ набора и поступления белков во внутриклеточных нуклеокапсидах 4 ~ Стр. а) Условия мечения б) Морфология нуклеокапсидов в) Выделение нуклеокапсидов с определением набора белков .НО г) Кинетика поступления

ГЛАВА X. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА G ВИРУСА БЕШЕНСТВА

1. Действие КР-40 на вирусные частицы

2. Выделение структурных белков в препаративных количествах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурных белков вируса бешенства"

Вирус бешенства относят к семейству Rhabdoviridae (б) на основании ряда критериев: характерная пулевидная форма вирусных частиц и их размеры, наличие липопротеидной оболочки с ориентированными кнаружи вириона шипами (пепломерами), наличие и спиральная организация внутренних рибонуклеопротеидных тяжей (нуклео-капсидов), структура генома, представленная одноцепочечной кова-лентнонепрерывной рибонуклеиновой кислотой (101,131).

Эти, а такие некоторые другие характеристики казалось бы устраняют какие бы то ни было сомнения в правильности определения таксономической принадлежности вирусов бешенства. Вместе с тем, до середины 70-х годов были опубликованы многочисленные данные, которые могли свидетельствовать о существенных отличиях вируса бешенства от других рабдовирусов, например, от вируса везикулярного стоматита (ВВС). В частности, сообщалось о негативных результатах опытов по поискам РНК-транскриптазной активности в составе вирусных частиц (134,148), о неспособности вируса бешенства в отличие от ВВС размножаться в энуклеированных клетках (153),о зависимости репликации вируса от какой-то функции ДНК клетки хозяина (72,135,140).

В этой связи казались вполне оправданными попытки соотнести указанные особенности репликации вируса бешенства с экспериментальными данными и господствовавшими представлениями, согласно которым набор и локализация структурных белков вируса бешенства существенно отличаются от других рабдовирусов, в частности от классического представителя семейства - вируса везикулярного стоматита.

Вместе с тем развитие исследований по молекулярной биологии рабдовирусов убедительно показывало фундаментальность основных черт их строения и репликации. Поэтому предполагавшееся существование указанных выше отличий между вирусом бешенства с одной стороны и остальными рабдовирусами, с другой, вызывали определенное недоумение. Нам казалось, что эти вопросы требуют специального изучения. В частности, нам представлялось важным сравнить моле-кулярно-анатомическую организацию вируса бешенства с другими рабдовирусами. В практическом отношении роль вируса бешенства в инфекционной патологии человека остаётся весьма значимой; возникли новые задачи по совершенствованию вакцин и диагностикумов на основе биоинженерных методик и подходов. Решение этих задач требует, прежде всего, детальных сведений о характеристике и локализации структурных белков в вирионе.

Все вышеуказанное и обуславливает актуальность избранной нами темы экспериментальных исследований.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение набора, характеристик и локализация структурных белков вируса бешенства.

Были поставлены следующие задачи:

1. Отработать оптимальные условия получения концентрированного и очищенного вируса бешенства.

2. Изучить молекулярную "анатомию" структурных белков вируса бешенства в вирусных частицах.

Научная новизна. Полученные данные позволили придти к заключению об отсутствии предполагавшихся ранее существенных различий в белковой композиции вирусов бешенства, с одной стороны, и остальных рабдовирусов, с другой. Определен новый структурный белок - актин. Найдено, что в состав нуклеокапсидов вируса бешенства входят три структурные белка: l, и, its . впервые показано, что белок, ранее обозначенный как Ml, которому приписывалась мембранная локализация в вирионах, в действительности, входит. в состав рибонуклеопротеидов и является структурным и функциональным аналогом белка us других рабдовирусов. На этом основании было обосновано предложение об изменении символа для обозначения указанного белка. Эти данные получили полное подтверждение в работах других авторов, вышедших позднее (51,56,57,120). Получены данные о ступенчатой сборке доминирующих нуклеокапсидных белков путём взаимодействия с РНК белка и и последующего присоединения к комплексу молекул белка us .

Научно-практическая ценность работы заключается в разработке технологии получения высокоочищенных концентратов вируса бешенства, а также поверхностного антигена - белка G , в препаративных количествах. Выяснение молекулярной"анатомии"вирусных частиц бешенства способствует более совершенному пониманию механизма биосинтеза вируса в зараженной клетке и осуществления заключительных этапов морфогенеза вириона в зараженных клетках, вопросов, разрешение которых имеет важное значение для изыскания новых усовершенствованных способов борьбы с заболеваниями людей и животных бешенством. Кроме того, эти данные помогут решению будущих биоинженерных задач.

По результатам выполненного исследования на защиту выносятся следующие основные положения диссертации:

1. Наиболее крупным белком вирусных частиц является белок с молекулярной массой ^ 200.000 дальтон (l), ранее в вирионах не обнаруженный; белок ъ локализован во внутреннем рибонуклеопро-теиде вирусной частицы, с которым он связан относительно прочно; данный белок является очевидным аналогом белка ъ других рабдовирусов.

2. Следующим по размерам структурным вирусным белком является гликопротеид (g ), локализующийся на поверхности вирусных частиц; молекулярная масса составляет 65.000 дальтон, число молекул белка g в составе вириона ~ 1.700; отработаны оптимальные условия для очистки белка g от других вирусных белков с помощью его селективной солюбилизации; в результате получены препараты, в которых содержание белка составляет не менее 90а выход -сотни микрограммов.

3. Молекулярная масса доминирующего белка вирусного рибо-нуклеопротеида ( и ) оценена равной 54.000, его концентрация в вирионах составляет~1.800 молекул на одну вирусную частицу.

4, В тесной ассоциации с вирусными частицами обнаружен неизвестный ранее белок с молекулярной массой 40.000, являющийся клеточным актином (А).

5. Согласно полученным данным, белок, обозначенный ранее символом Ml, не является структурным компонентом вирусной мембраны, а входит в состав вирусных рибонуклеопротеидов и, по-видимому, является структурным и функциональным аналогом белка ш других рабдовирусов.

6, Сборка нуклеокапсидов вируса бешенства в зараженных клетках происходит путем взаимодеиствия с РНК белка и , а белок us присоединяется к уже образованному рибонуклеопротеиду.

7. Ранее предполагавшиеся существенные различия в белковой композиции и сборки нуклеокапсидов вируса бешенства, с одной стороны, и остальных рабдовирусов, с другой, отсутствуют.

Выражаю искреннюю благодарность директору Института академику АМН СССР С.Г.Дроздову за предоставленную возможность выполнения диссертационной темы.

Глубоко признательна своим научным руководителям д.б.н. В.М.Зайдесу и д.м.н. Л.Б.Эльберту за постоянную поддержку и помощь при выполнении настоящей работы.

Некоторые разделы работы были выполнены с- участием старшего научного сотрудника Института вирусологии им. Д.И.Ивановского JI.M. Селимо вой. Считаю своим-долгом принести ей свою благодарность.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кротова, Лариса Ивановна

В Ы В оды

1. Разработана технология получения высокоочищенных концентратов вируса бешенства штамм "Внуково-32" в препаративных количествах, позволившая обрабатывать десятки литров вируссодержащей культуральной жидкости. При концентрировании в 10^ раз и более степень очистки вируса по растворимым белкам составляла не менее 8.10 . Выход вируса в очищенных препаратах составлял 500 мкг белка на 10 литров исходной среды.

2. Проведена очистка и препаративное получение поверхностного антигена вируса бешенства - белка g . Выход этого белка в полученных препаратах составлял ~ 170 мкг на 10 литров исходной среды при степени очистки около 90%.

3. Изучена очистка вируса бешенства с помощью гель-фильтрационной хроматографии на модифицированных стеклах. Было показано, что выход вируса, приближающийся к полному, наблюдался при гель-фильтрации на двух кремнеземах: силохроме-80 с химически пришитым через винилтрихлорсалицилат ы -винилпирролидоном и макропористом стекле с полимеризованными на его поверхности молекулами и -винилпирролидона. Степень очистки составляла 88-99%. Указанные модификации стекла оказались пригодными для гель-фильтрации как инфекционного, так и инактивированного препаратов (с сохранением иммуногенной активности).

4. Сделана переоценка набора, характеристик и локализации структурных белков вируса бешенства. Показано: а) нуклеокапсиды вируса бешенства состоят из трех классов белков: l (200.000), и (54.000) и т (37.000); б) сборка нуклеокапсидов вируса бешенства в зараженных клетках происходит путем взаимодействия с РНК белка N , для чего используются молекулы из сформированного в зараженных

- 137 клетках пула. Белок us поступает в нуклеокапсиды без задержки и ассемблируется с предобразованными комплексами вирусной РНК с белком I? . Это указывает на сходство ключевых элементов сборки нуклеокапсидов вируса бешенства и других рабдовирусов; в) внутренний слой вирусной липопротеидной мембраны организован молекулами белка М (21.000) и молекулами белка А (43.000). Этот белок идентичен клеточному актину по двум характеристикам: размерам молекул и их олигопептидным картам; г) в состав наружных шипов (пепломеров) вирусных частиц входят молекулы гликопротеида G (65.000).

5. Полученные данные позволяют придти к заключению об отсутствии предполагавшихся ранее существенных отличий в белковой композиции вируса и сборки нуклеокапсидов вируса бешенства с одной стороны и остальных рабдовирусов, с другой.

- 125 -ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Многие из представленных результатов, в особенности по изучению набора и локализации вирусспецифических белков вириона бешенства резко отличаются от данных, опубликованных к началу нашей работы (134,135,153), но весьма сходны с данными, полученными для других рабдовирусных систем (43).

Как можно было ожидать, популяция вирусов бешенства содержит большое количество дефектных частиц. При распределении вирусного материала в градиенте плотности сахарозы выявлялись дополнительные пики, обусловленные уменьшением размера частиц. Так же как wictor et ai., (83), мы показали, что содержание структурных белков дефектных частиц не отличалось от белков стандартных вирионов. Таким образом, несмотря на то, что в популяции вирусов бешенства было обнаружено большое количество дефектных частиц, решению поставленных задач по изучению структурных белков это не мешало.

За последние несколько лет достигнут большой прогресс в изучении структурных белков вирионов и ассоциированных с вирионами ферментов. В большой степени этому способствовали разработки современных методов очистки и концентрирования вирусных препаратов. Как было установлено, метод препаративного получения вируса бешенства с использованием на начальном этапе проточной ультрацентрифуги с последующим циклом центрифугирования давал высокую степень очистки 8.10"* и соответствовал основной задаче работы.

В то же время полученные данные по подбору хроматографичес-ких сорбентов с модифицированной поверхностью также могли быть использованы при разработке эффективных способов очистки или этапов очистки взвесей вируса бешенства. Наиболее универсальными для очистки препаратов вируса бешенства являются макропористые кремнеземы, модифицированные производными поли- ж -винилпирролидона.

При использовании метода электрофореза в ПАГ мы обнаружили накопление в зараженных клетках следующих вирусспецифических белков: L, g, и, л, us, м . Заражение вирусом бешенства не приводило к быстрому развитию цитопатического эффекта и угнетению мак-ром олекулярных синтезов хозяина (98,99). По этой причине образующиеся в зараженных клетках вирусспедифические белки удавалось обнаружить с помощью электрофореза в ПАГ на фоне синтезирующихся клеточных белков, в виде гиперпродуцируемых электрофоретических классов. В ряде систем для этой цели приходилось прибегать к искусственному селективному блокированию синтеза белков хозяина с помощью повышения ионной силы поддерживающей среды (98,99).Однако, в изученной нами системе этого не требовалось. С помощью электрофореза в ПАГ в зараженных клетках удалось зарегистрировать синтез всех структурных вирусных белков. Все названные компоненты присутствовали в клетках как на ранних, так и на поздних сроках после заражения. Максимум накопления отмечался между вторыми и третьими сутками после заражения. Наблюдаемые изменения скоростей синтеза во времени можно объяснить очевидно так: меньшее образование структурных белков на ранних сроках связано с накоплением на этих сроках вирусных мРНК, а видимое уменьшение синтеза на поздних сроках обусловлено выходом сформировавшихся вирусных частиц из клеток.

Белки l,g, н, a, us, м , действительно, являются структурными, так как,во-первых, эти компоненты обладают электрофорети-ческой подвижностью идентичной соответствующим белкам вируса;во-вторых, белки, идентичные по электрофоретической подвижности белкам l, и, us были обнаружены в составе внутриклеточных вирусспецифических нуклеокапсидов; в-третьих, эти вирусспецифические

- 127 белки обнаружены в составе вирусных частиц потомства.

Следует напомнить, что по нашим оценкам молекулярные массы структурных белков отличались от таковых в работах Sokoi (135) и Feurath et al. , (35), изучавших штаммы Flury и РМ. Но данные различия, очевидно, не были обусловлены штаммовыми вариациями. После завершения нашей работы были опубликованы результаты Dietzschoid et al. ,(40), изучавших вирус бешенства штамм era , которые были сходны с нашими.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кротова, Лариса Ивановна, Москва

1. Аксенова Т.А» Экспериментальная кулмуральная антирабичес-кая вакцина. Дис. . канд. биол. наук. -М., 1967. - 230 с.

2. Аксенова Т.А., Красильникав И.В., Мчедлишвили Б«В. Инфекционные титры и иммуногенная активность культурального вируса бешенства, очищенного методом гель-хроматографии на макропористом. стекле: Тез. докл. Симпозиума по бешенству, Потсдам, 1977, с. 14.

3. Алыштейн А.Д., Власенкова Н.К. Радиоиммунологический метод выявления основного внутреннего белка онкорнавирусов: применение для индикации и идентификации вирусов и для обнаружения их антигенов в тканях. В кн.: Общая вирусология, М., 1977, с. 55-64.

4. Борисова В.Н., Мчедлишвили Б.В., Нахапетян Л.А. Синтетические макропористые кремнеземные сорбенты в хроматографии биополимеров. -М.ОШТЭИ Микробиопром, 1979, с. 34.

5. Будринская А.Г., Зайдес В.М# Молекулярная биология парамик-совирусов. -М., 1978, с. 30-62.

6. Жирнов О.П. Изучение белков вируса Сендай в.вирионах и в зараженных клетках. Дис. . канд. мед. наук. -М., 1978. - 136 с,

7. Жирнов О.П., Букринская А.Г. Изучение белков вируса Сендай: протеблитическая активность.в составе вирусных частиц. Вопр.виру-сол., 1977, № 5, с. 571-577.

8. Зайдес В.М. Белки РНК-содержащих вирусов с негативным геномом. В кн.: Вирусология. М., 1978, г. 7, с. 50-74.

9. Зайдес В.М. Химический состав, структура парамиксовирусов и их.взаимодействие с чувствительными клетками. Дис. ••• докт. биол. наук. -М., 1979. - 462 с.

10. Использование нового неионного детергента МЭСК для выделения и реконструкции в липосомы гликопротеидов вируса Сендай/ В.Э. Березин, В.М.Зайдес, Г.Г.Миллер и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1984, № 2, с. 36-41.

11. Каверин Н.В. Молекулярно-биологическая характеристика вируса везикулярного стоматита. Вопр.вирусол., 1980, № 2, с.132-140.

12. Мчедлишвили Б.В. Изучение и практическое воплощение процессов разделения растворов жестких коллоидных частиц и вирусов методами гель-фильтрации на макропористых стеклах и.микрофильтрации через ядерные фильтры. Дис. . канд. хим. наук. -Л., 1980. -162с.

13. Никитина Л.Ф., Селимов М.А. Экспериментальная селекция фиксированного вируса бешенства (штамм sad ): Материалы 13-й сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. -1л.,1967, с. 67.

14. Получение очищенных гликопротеидов вируса.гриппа и исследование их антигенной и иммуногенной активности/ В.Э.Березин, Е.С. Исаева, А.Ф.Артамонов и др, Ж.микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол., 1983, № 6, с. 81-88.

15. Структурные белки миксовирусов и парамиксовирусов/ Н.Ф. Правдйна, Н.Л.Пушкарская, Н.Л.Варич, Г.А.Галегов. Тез. докл.Симпозиума по биохимии и биофизике вирусных частиц и вирусных компонентов, М«9 1969, с. 34.

16. Селимов М.А. Бешенство. М«: Медицина, 1978, с. 53-58,

17. Урбах В.Ю. Биометрические методы. 2-е изд. - М.: Наука, 1965, с. 415.

18. Abraham G., Banerjee А.К. Sequential transcription of genes of vesicular stomatitis virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, p. 1504-1508.

19. Anilionis A., Wunner W.H.Curtis P.J. Structure of,the-glycoprotein gene in rabies virus. Nature (London), 1981,v.294» p. 275-278.

20. Anti-idiotypic antibodies induce neutralizing antibodiesto rabies virus glycoprotein/Reagan K.J», Wunner,W.H., Wictor T.J, Koprowski H. J.Virol., 1983, v. 48» P. 660-666.

21. Antigenic,analysis of rabies virus/ L.G*Schneider, B.Diet-zschold, J.H.Cox. IX Conference V.CBC, 1976, Madrid.

22. Antigenic properties of,rabies virus components/ T.Wiktor» E.Gyorgy, H.Schlumberger et al. J.Immunol., 1973, v. 110, p.269-276.

23. Antigenic structure of rabies virus glycoprotein* order? ing and immunological characterization of the large ClTBr peptide, fragments/ BiDietzschold, T.J.Wiktor, R.Macfarlan, A.Varrichio. -J.Virol., 1982, v. 44, p. 595-602.

24. Association of the envelope glycoproteins of influenza virus.with liposomes -.A model study,on viral envelope assembly/ R.Т.О.Huang, K.Wahn, H.Klenk, R.Rott. Virology, 1979, v. 97, p. 212-217.

25. Atanaвiu P., Lepine P., Dragonas P. Etude cinetique du virus rabique en culture de tissus a l!aide des anticorps fluores-cents et des coupes ultra-fines. Ann. Inst. Pasteur, 1963, v.105, p. 813-824.

26. Atanasiu P., Perrin P., Delagneau J.P. Use of an enzyme, immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody,determination. Developments in Biological.Standardization,(Ed. by P.H.Regamey. Basel: S.Karger), 1980, v. 46, p. 207-215.

27. Atkinson. P,H., Moyer S.A», Summers D.F. Assembly , of vesicular stomatitis virus glycoprotein.and matrix protein into Heba cell plasma membranes. J.Mol.Biol., 1976, v. 102, p. 613-631.

28. Ball.L.A. Transcriptional mapping,of vesicular stomatitis virus in vivo. J. Virol., 1977, v» 21, p. 411-414.-31. Ball L.A., White C.U. Order of transcription of.genes.of vesicular stomatitis virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, p. 442-446.

29. Baltimore D. Expression of animal virus genomes. Bact. Rev., 1971, v. 35, p. 235-241.

30. Blumberg B.M., Leppert M., Kolakofsky D. Interaction of VSV leader RNA and nucleocapeid. protein may control VSV genome replication. Cell, 1981, v. 23, p. 837-845.

31. Biochemical and biophysical studies onnucleocapsid and on the RNA rabies virus/ P.Sokol, H.D.Schlumberger, T.J.Wiktor, H.Koprowski. Virology, 1969, 38, p. 651-665.

32. Bishop D.H.L., Levintov L. Replicative forms of viral RUA,.Structure and function. Progr. Med. Virol., 1971, v. 13, p. 1-82.

33. Brown,F., Crick J. Antibody response to subunits of ra-« bies and VSV. -.In* Immunobiological Standardization (Ed. by.R.H. Regamey, R.Lang, W.Hennessen et al. Basel: S.Karger), 1974, v. 21, p. 114-123.

34. Both G.W., Moyer S.A., Banerjee A.K. Translation and identification of the mRNA species synthesized in vitro by the.virion--associated.RNA polymerase of VSV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, p. 274-278.

35. Characterization of subviral,components resulting from, treatment, of rabies virus with Tri (n-butyl). phosphate/ A.R.Neu-* rath, S.K.Vernon, M.B.Dobkin, B.A.Rubin. J. Gen. Virol., 1972, v. 14, p. 33-48.

36. Chemical and immunological analysis,of the rabies soluble glycoprotein/. B.Dietzschold,. T.J.Wiktor, W.H.Wunner, A.Varrichio.-Virology, 1983, v. 124, p. 330-337*

37. Clarke J.T. Simplified "diseV (polyacrylamine gel) electrophoresis. In: Gel Electrophoresis. Ann. New York Acad. Sci., 1964, v. 121, p. 428-436.

38. Clarke J.T. Nonmuscle contractile proteins: the role of . actin and myosin in. cell motility and shape determination. Annu. Rev. Biochem., 1977, v. 46, p. 797-822.

39. Crick У., Brown.P. An interferring component of rabies , virus which contains RNA. J. Gen. Virol., 1974, v. 22, p.147-151.

40. Collonno R.J., Banerjee- A.K. An unique RNA. species invol^-ved in initiation of VSV RNA transcription in vitro. Cell, 1976, v. 8, p. 197-204.

41. Collonno R.J., Banerjee A.K. Mapping and initiation studies on the leader RNA of VSV. Virology, 1977, v. 77, p. 260268.

42. Comparison of ribonucleic acid polymerases of two rhab-. doviruBes, Kern Canyon virus and Vesicular stomatitis virus/.H.G. Aaslestad, H.P.Clark, D.H.L.Bishop, H.Koprowski. J. Virol.,1971, v. 7, p. 726-735.

43. Coslett G.D., Holloway B.P., Obijeski J.P. The.structural proteins of rabies virus and evidence,for their synthesis from separate.monocistronic rita species. J. Gen. Virol., 1980, V. 49, p. 161-180.

44. Delagneau J.-P., Perrin P., Atanasiu P. Structure of the rabies virus; spatial relationships of the proteins G, M^, M,,, U.-- Ann. Virol., 1981, v. 132 E, p. 473-493*

45. Dietzschold В., Cox J.H., Schneider L.G. Rabies, virusstrains: a comparison study-by polypeptide,analysis of.vaccine strains with,different pathogenic patterns. Virology, 1979, v. 98, p. 63-75.- 143 * /у" ■ . «• J 4 - . • .

46. Dubovi E.I., Wagner R.R.-Spatial relationships of the > VSV:. induction. of reversible oligomers by.cleavable,protein pross--linkers and oxidation. J. Virol., 1977, v. 22, p. 500-527.

47. Electron microscope observations on rabies virus by negative staining/.J.P.Almeida, A.F.Howatson, L.Pinteric, P.FenJe. -Virology, 1962, v.18, p. 147-151.

48. Emerson S.U., Wagner R.R. L-protein. requirement for. in. vitro RUA synthesis by VSV. J. Virol., 1973, v. 12, p. 1325-1335.

49. Emerson S.U., Ju J. Both,US- and L-protein .are required for in vitro RHA synthesis by VSV. J. Virol., 1975, v. 15, p. 1348-1356.

50. Effective,subunit vaccines against,an enveloped animal virus/.B.Morein, A.Helenius, K.Simons et al. Nature, 1978, V. 276, p. 715-718.

51. Ermine A., -Flamand A. RITA synthesis in BHK-21 cells infected, with rabies virus. Ann.Microbiol. (Paris), 1977, v. 128A, p. 477-488.

52. Expression of,rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus/ M.P.Kieny, R.Lathe, R.Drillient et al. -Nature, 1984, v. 312, p. 163-166.

53. Fenje P.Propagation.of rabies virus in cultures of ham-, ster kidney oells. Canad. J. Microbiol., 1960, v. 6, p. 479-488.

54. Ferguson M.,-Schild G*C. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of-rabies glycoprotein antigen» applica-, tion for potency tests of vaccine against rabies. J. Gen.Virol., 1982, v. 59, p. 197-201.

55. Flamand A., Pese A.D., Busserean F. Effect of actinomy-r. cin D and cytosine arabinoside, on.rabies and VSV multiplication.-Virology, 1977, v. 78, p. 323-327.

56. Flamand A.,.Delagneau J.F. Transcriptional mapping of rabies virus in vivo. J. Virol., 1978, v. 28, p. 518-523.

57. Flamand A., Delagneau J.F. , .Busserean F. An EMA polymerase activity,in purified rabies virions. J. Gen. Virol.,1978, v. 40, p. 233-238.

58. Formation of protein micelles from amphihilic membraneproteins/.K.Simons, A.Helenius, K.Leonard;et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, p. 5306-53Ю.

59. Further studies on the replication of. rabies and rabies-like viruses in,organized cultures of.mammalian neural tissues/ S.Matsumoto, L.G.Schneider, A.Kawai, T.Jonezawa. J. Virol., 1974, v. 14, p. 981-996.

60. Harmon M.W., Janis B. Effects of cytosine.arabinoside, adenine arabinoside and 6-azauridine.on rabies virus in vitro and in vivo. J. Inf. Dis., 1976, v. 133, p. 7-13«

61. Hsu C.-H., Kingsbury D.W., Murti.K.G.Assembly of VSV nucleocapsids,in vivo: a kinetic analysis. J. Virol., 1973,v. 32, p. 304-313.. t , t 0 , . t j . . . .

62. Hsu M.-C., Scheid A., Choppin P.W. Reconstitution of , membranes with individual.paramyxovirus glycoproteins,and,phospholipid in cholate solution. Virology, 1979, v. 95, p.476-491.

63. Hsu C.-H., Morgan E.M., Kingsbury D.Y/. Site-specific phosphorylation regulates the.transcriptive activity of VSV US protein. J. Virol., 1982, v. 43, p. 104-112.

64. Huang A.S., Baltimore D. Defective.viral.particles, are Viral disease process. Nature (London), 1970, v. 226, p. 325327.79* HummelerK., Koprowski.H.Investigating the rabies virus. Nature (London), 1969, v. 221, p. 418-421.

65. Hunt L.A., Summers D.F. Association of VSV-protein with HeLa cell membranes and released virus. J. Virol., 1976, v.20, p. 637-645.

66. Hunt D.M., Emerson S.U., Wagner R.R. RNA-temperature--sensitive mutants of VSV: L-protein thermosensitivity accounts for transcriptase restriction of group I mutants. J. Virol., 1976, v. 18, p. 596-603.

67. Identification des. glycoproteins et nucleoproteine des cellules infeptees par des immunoglobulixies spepifiques marqees/ P.Atanagiu, J.Nozaki,.P.Perrin, J.Sisman. C.JUAcad. Sci. Paris, 1975, v. 281, p. 1913-1919.

68. Kaverin N.V. Delay in the incorporation of protein into viral nucleocapsid in Newcastle disease,virus-infected cells. -J. Gen. Virol., 1972, v. 17, p. 337-341.

69. Kawai A. Transcriptase activity,associated with rabies virion. J. Virol., 1977, v. 24, p. 826-835.

70. Knipe D.J., Baltimore D., Lodish H.F* Separate,pathways• of maturation of the.major structural proteins of VSV. J.Virol, 1977, v. 21, p. 1128.

71. Lowry G.H., Rosenbrough N.J., Parr A.L. Proteins, measurement. with, the Polinphenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265.

72. Matsumoto S. Electron microscopy of nerve cell? infec-. ted with street rabies virus. Virology, 1962, v. 17, p.198-202.

73. Matsumoto,S. Rabies virus. Advances in Virus Research, 1970, v. 16, p. 257-301.

74. McAllister P.E., Wagner R*R. Differential inhibition of host protein synthesis in Ъ cells by VSV. J. Virol., 1976, v. 18, p. 550-558.

75. Morphology:of the nucleoprotein component of rabies virus/ K.Hummeler,,N.Tomassini, P.Sokol et al. J. Virol.,1968, v. 2, p. 1191-1199.

76. Naito S., Matsumoto S. Proteins of rabies virus, т , Annu. Pept. Inst. Virus Res.,Kyoto Univ., 1976, v. 19, p.80-81.

77. NaitoS., Matsumoto S* The estimation of cells actin in the rabies viruses. Virology, 1978, v. 91, p. 151-163.106» Neurath A.R., Wictor T.J., Koproweki H. Density gradient centrifugation studies on rabies virus. J. Bact., 1966, v. 92, p. 102-106.

78. National Institutes.of Health, USA. Minimum requirem-, ents? rabies vaccine (3rd Red.), United States NIH, Bethesda,Md., 1953.

79. Plus and minus strand leader RNAs in.negative strand , Virus-infected.cells/ M.Leppert, L.Rittenhouse, J.Perrault et al. -Cell, 1979, v. 18, p. 735-747.

80. Rabies virus glycoprotein analogs:.biosynthesis in Escherichia coli/ E.Jelverton, S.Norton,,J.P.Obijeski, D.V.Goed-del. Science, 1983, v. 219, p. 614-620.

81. Radioiodination of proteins in single polyacrylamide gel slices. Tryptic peptide analysis of all the major members of complex multicQmponent.systems using microgram.quantities of,total protein/ J.H.Elder,.R.A.Pickett, J.Hampton, R.A.Lerner.

82. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 6510-6515.

83. Recevskis J., Koch,G.,Viral protein synthesisДп Friend erythroleukemia cell lines. J. Virol., 1977, v. 21, p. 328-337.

84. Reed L.J., Muench H. Д.simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg., 1938, v. 27, p. 493.

85. Rhabdoviridae/ F.BrQwn, B.S.L.Bishop, J.Crick et al. -Intervirology, 1979, v. 12, p. 1-7.

86. Replication and assembly of-VSV nucleocapsids: Protein/ association with RNPs and the effect of cycloheximide/on replication/ C.Rubio, Ch.Kolakofsky, V.M.Hill, D.F.Summers. Virology, 1980, v. 105, p. 123-135.

87. Rhodes D.P., Banerjee A.K. 5*rterminal sequence of,VSV mRNA's synthesized in vitro. J. Virol., 1976, v. 17, p. 33-42.

88. Robertson J.S., Etchison J.R., Summers D.F. GlycQsyla-r tio£ sites of VSV glycoprotein. J.Virol., 1976, v. 19, p. 871878.

89. Roots E., Schultze I.-M. Neuere elektronenmikroskopi-, sche.Befunde an Gehirnen.nach.Infektion mit Tollwutvirus. Zbl. Bakt. I. Orig., 1963, Bd. 188, S. 159-173.

90. Rose J.K., Kuipe D. Nucleotide sequence complexities ,, molecular weights-and, poly(A) content of the VSV in RNA species.-J. Virol., 1975, v. 15, p. 994-1003.

91. Saghi N., FlamandA. Biochemical,characterization of temperature-sensitive rabies virus mutants. J. Virol., 1979, v. 31, p. 220-230.

92. Schneider L.G. Concentration and purification. In: , The Natural History,of Babies (G.M.Baer, ed.). N.Y.-London:Acad. Press, 1975, p. 125-140.

93. Schneider L.G»,.Diringer H. Structure and molecular , biology of rabies virus. -. Current Topics in Microbiol, and Immunol., 1976, v. 75, p. 153-180.

94. Shatkin A.«T. Animal,ША .viruses:, Genome structure and function. Ann. Rev. Biochem., 1974, v. 43, p. 643-665.

95. Sokol F.Chemical and antigenic structure,of rabies virus, т Symp.,Ser. Immunobiol. Stand., Basel N.Y., Karger, 1974, v. 21, p. 35-49.

96. Sokol F. Purification of rabies virus and isolation, of its components. In:,Laboratory Techniques in Rabies, WHO, Geneva, 1973, p. 165-174.

97. Sokol F., Koprowski H. Structure-function relationships and mode of replication of animal rhabdoviruses. Proc. Nat. Acad. Sci. (Wash.), 1975, v. 72, p. 933-936.

98. Soria M,, Little S.P., Huang A.S. Characterization of, VSV nucleocapsids. I. Complementary,40S RNA molecules in nucleocapsids. Virology, 1974, v. 61, p. 270-280., ""■'•. ' " . . - , - . . - . . t 4

99. Sub-cellular localization, of VSV messenger RMs/ M.«J. Grubman, S.A.Moyer, A.K.Banerjee, U.Ehrenfeld. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 62, p. 531-538.. ,. . » ,„. . . . ^

100. Translation of VSV messenger RITA by extracts from.mam-, malian.and plant cells/ T.Morrison,,M.Stampfer, D.Baltimore, H.P. Lodish. J. Virol., 1974, v. 13, p. 62-72.

101. Treatment of controlled pore glass with polyethylene., oxide to.prevent adsorption of rabies virus/ C.W.Hiatt, A.Shelp-kov, E.J.Rosenthal, J.M.Gallimore. J. Chromatogr. ., 1971, v. 56, p. 362.

102. Tsiang H., Atanasiu P. Replication.du virus.rabique fixe en suspension cellulare. C.R. Acad. Sci., 1971, v. 272, p. 897-900.

103. Vernon S,K., Neurath A.R., Rubin B.A. Electron micros-, copic studies.on the, structure of rabies virus. J. Ultrastruct. Res., 1972, v. 41, p. 29-42.

104. Villarreal L.P., Holland J.J.Transcribing complexes in cells infected by VSV and rabies virus. J.Virol., 1974, v. 14, p. 441- 450.

105. Villareal L.P., Breindl M., Holland J.J.,Determination of molar rations of VSV-rinduced RUA species in BHK-21 cells.

106. Biochemistry (Wash.), 1976, v. 15, p. 1663-1667.# ., *. . . . f 4 . . #

107. Wagner R.R. Comprehensive Virology, N.Y., 1975, v. 4, p. 1-80.

108. WHO. Report of consultation of rabies prevention and control. WHO, Prance, 1980, p. 10-12.

109. Wictor T*J. Tissue culture methods.Ins,Laboratory Techniques in Rabies, WHO, Geneva, 1973, p. 101-123.153» Wictor T.J.,,Koprowski.H. Rhabdoyiruses,replication in enucleated host cell. J. Virol., 1974, v. 14, p. 300-306.