Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций (Экспериментальное исследование)
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций (Экспериментальное исследование)"
РГ6 од
РОССИЙСКАЯ/,АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
■--* I I'; >•.; \г.<т __
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО
На правах рукописи
ГРИБЕНЧА Сергей Васильевич
СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЛИССАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
(Экспериментальное исследование) 03.00.06 —вирусология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форме научного доклада
Москва — 1993 г.
Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановской РАМН и НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.
Научные консультанты:
доктор мед. наук, профессор И. Ф. Баринский доктор мед. наук, профессор |Р. А. Канторович. |
Официальные оппоненты:
Почетный член Академии естественных наук, заслуженный деятель наук РФ,
доктор медицинских наук, профессор С. Я. Гайдамович Доктор медицинских наук, профессор Л. Б. Эльберт Действительный член Российской Академии естественных наук, доктор медицинских наук, профессор В. А. Зуев
Ведущее учреждение: Московский научно-исследовательский ин ститут вирусных препаратов РАМН.
Защита состоится 3 Н4Оь/'ЬЯ. 1994 г. в чяг.ог
на заседании специализированного Совета Д 001.20.02 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Моек ва, ул. Гамалеи, 1С.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусо логии им. Д. И. Ивановского РАМН.
Автореферат разослан « гэ » дё/с-богНь-Л 1993 г.
Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук
А. М. Жуковский
• ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вирусы группы бешенства относят к семейству Rhabaoviridae . Интерес, который проявляют исследователи к этим вирусам на протяжении длительного времени, определяется, прежде всего, глобальный распространением лиссавирусов среди животных, высокой угрозой инфицирования людей и неизменным летальным исходом развившегося заболевания. На всей обширной территории Российской Федерации (Р5) постоянно сохраняется тяжелая эпизоотическая и эпидемиологическая ситуация по бешенству. Количество пострадавших людей от укусов различными видали яивотных имеет тенденцию к росту (Черкасский, 1992). Несмотря на более чем 100-леткюз история изучения рабической инфекции, до сих пор недостаточно известно о фундаментальных свойствах уличного вируса бешенства и интимных механизмах его взаимодействия с иакросрга-низмом. Не имеет еще убедительного экспериментального объяснения широкая вариабельность биологических свойств уличного вируса и механизм сохранения вируса в природе.
Одним из наиболее укоренившихся представлений о бепенстве является тезис о неизбежности летального исхода инфекции ( stell 1971 ; Селкмов, 1978). Эта концепция продолжает оставаться общепринятой. Однако, ряд фактов и наблюдений свидетельствуют о возможности существования и других форм инфекции. Pasteur и соавт. еа.в в 1982 г. наблюдали выздоровление собаки от экспериментального бешенства. Аналогичные случаи были описаны и другими авторами (Гайдамович, 1958 ; Гориуно-ва, 1962 ; Bolin f 1959 . Johnson 1943. Martin ,1c:?).
Однако, до последнего времени факт выздоровления, который, казалось бы, противоречит самому понятию оешенства, только констатировался, но не подвергался исследования. Аналогичная ситуация складывалась и с другими неклассическими формами рабической инфекции (хроническая, возвратная).
Изучение антигенной структуры штаммов вирусов группы беаенства и их антигенных взаимоотношений с помощью систем, основанных на поли-клональных антителах, предоставляло информации лишь на уровне серо-типа и не позволяло проводить дифференциальную диагностику и точную идентификацию вирусов группы бешенства, а также экологических вариантов в пределах серотипа. В частности, о циркуляции в европейской части республик бывшего СССР штаммов диссавируса европейских летучих
мышей, антигенно связанных с вирусами 4-гс серотипа, циркулирующих только на вге Африки, стало известно только благодаря гибридомной технологии. Вышеизложенное обуславливает необходимость использования гибридомной технологии для современного обеспечения изучения экологии и эпидемиологии лиссавирусных инфекций, а такие разработке нового поколения препаратов для диагностики и идентификации лиссавирусов.
Как известно, до начала 60-х годов все тиш антирабическкх вакцин, независимо от степени инактивации вируса, применялись путем еяе-, дневного введения препарата в течение 14-25 дней, одно- или двукратно в день, под кожу кивота (Селимов, 1978: Комитет экспертов ВОЗ, 1974). В К и большинстве стран Латинской Америки, Азкв и Африки ежедневные прививки сохранились до настоящего времени. Ежедневные схемы лечебно-профилактических прививок чрезвычайно громоздки (до 48 инъекций вакцины) , сопряжены с физическим и моральными стрессами как для пострадавших, так и для медицинских работников и основаны на эмпирическом опыте. Нет экспериментальных обоснований, указывающих, что ежедневное введение антигена является оптимальным для формирования иммунитета. Наоборот, данные литературы, касающиеся микробных инфекций, свидетельствуют, что эффективность иммунизации зависит от схем применения вакцины (Здродовский, 1963). На эмпирическом опыте основана и лечебная схема иммунизации другой лиссавирусной инфекций - острого энцефаломиелита человека (ОЭМч).
Подкожный метод аппликации антирабической вакцины, предложенный Пастером еще в конце XIX века, оказался гениальным, в плане безопасности использования вакцины, содержащей живой вирус. Однако в конце XX века, когда применяются полностыз инактивированные вакцины, с точки зрения наиболее быстрого и полного представленья антигена иммуно-компетентным клеткам, метод введения вакцины под кожу живота нельзя считать оптимальным. В связи с изложенцым разработка принципов построения оптимальной схемы применения вакцины, а также метода ее введения на основе изучения закономерностей иммунного ответа при антирабической вакцинации представляется актуальны! как с точки зрения теории, так и практики.
Стратегия профилактики бешенства обоснованно базируется на комбинированном применении антирабической вакцины и гамма-глобулина (Селимов, 1962,1978; Доклады КЭ ВОЗ, 1974г. и др.). Основная функция
антирабкческого иммуноглобулина (ЛИГ) гомологичного или гетерологич-нсго состоит s создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития бешенства с коротким инкубационным периодом. Однако, АИГ, в особенности гетерологичный, чрезвычайно реактогенен (вызывает аллергические реакции, в том числе анафилактический шок и сывороточную болезнь) И интерферирует С вакциной ( Atanaaiuet al. I96I . Corey
e#a> 1976). Последнее может быть причиной неудач антирабических прививок. Эти данные, а также случаи заболевания гидрофобией после своевременного и полного курса прививок (Селимов, 1967 ; 1969 ; Кравченко и др., 1975), указывает на необходимость не только совершенствования принятого метода лечения, но и поиска альтернативных специфических и неспецифических препаратов для профилактики этой опасной для человека инфекции.
Цзль и задачи исследования. Целы) настоящей работы было исследование фундаментальных свойств штаммов вирусов группы бешенства, а также разработка оптимальных схем и методов специфической и неспецифической профилактики, а также диагностики и идентификации возбудителей лкосавирускых инфекций.
В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучение биологических свойств штаммов вирусов группы бешенства из различных регионов, экологических ниш и хозяев: адаптационная характеристика, патогенность для различных видов животных (в том числе диких), антигенные свойства, популяциогаая структура штаммов уличного вируса бешенства.
2. Разработка моделей неклассических форм бешенства: воспроизведение и исследование абортивной, хронической и возвратной форм раби-ческой инфекции.
3. Исследование закономерностей вакцинального иммунитета при бешенстве и ОЗМч. Разработка оптимальных схем иммунизации.
4. Изучение зависимости антирабического иммунитета от места введения вакцины.
5. Изучение противовирусной и иммуномодулирующей активности препаратов различной природы при лиссавирусных инфекциях, определение оптимальных методов их введения.
6. Получение моноклональкых антител к структурным белкам вирусов группы бешенства с целью получения нового поколения препаратов для
диагностики и идентификации лиссавирусных инфекций.
Научная новизна работы. Открыт феномен гетерогенности популяции штаммов уличного вируса бешенства. Уст&ноолено, что популяция штамма уличного вируса бешенства кокет состоять из 1-го, 2-х или 3-х биологических вариантов, отличающихся друг от друга по таким призна-юш, как уровень накопления вируса в мозгу, продолжительность инкубационного периода и болезни, а также по клинической картина болезни. &гот новый факт, впервые с научной точки зрения объясняет широкую вариабельность биологических свойств штаммов уличного'вируса бешенства и различных форм рабической инфекции (паралитическую, буйную и др.), формирование экологических вариантов лиссавирусов, а также феномен "фиксации" штаммов уличного вируса бешенства в процессе длительных последовательных пассажей - как результат селекции одного биологического варианта (паралитического) из состава популяции штамма вируса.
- Экспериментально обоснована возможность развития не только острой летальной, но и различных неклассических клинических форм рабической инфекции: абортивной, хронической и возвратной. Впервые дана вирусологическая, патоморфологическая и иммунологическая характеристиках некдассич^ских форм рабической инфекции. Раскрыт главный фактор механизма становления хронического бешенства.
- Впервые показано, что абортивная форма бешенства может быть воспроизведена при различных путях ваедения вируса как фиксированного, так и уличного, как на лабораторных животных, так и на естественных носителях вируса домашних (собаки) и диких (корсаки) животных. Получены прямые доказательства специфичности абортивного и возвратного бешенства - неоднократного выделения вируса в течение болезни.
В ходе настоящего исследования были получены данные, позволяющие построить общую концептуальную модель механизма сохранения вируса в природе. #
- Впервые исследованы закономерности развития вакцинального и инфекционного антирабического иммунитета. Обоснован критерий, позволяющий их дифференцировать. Определены принципы построения оптимальной схемы иммунизации. Выявлена роль первичной иммунизации (грундиммунитета) , правила интервалов и разрешающей инъекции вакцины (бустер инъекции). Впервые установлены закономерности развития клеточного (Т-эффекторов) иммунитета 111 у1уо .
- На основании изучения противовирусного действия многочисленных препаратов различного происхождения обоснована возможность альтернативного неспецифического метода профилактики лиссавирусных инфекций. Установлено, что противовирусная лечебная активность препаратов при лиссавирусных инфекциях проявляется на двух уровнях: на уровне ворот инфекции и на уровне центральной нервной системы (ЦНС). Показано, что ряд препаратов (индукторы интерферон и соединения фу-рана с малеиновым ангидридом) наряду с противовирусной обладает выраженной иммуностимулирующей активностью.
- Впервые получены и охарактеризованы моноклональные антитела (МКА) к структурным белкам вакцинного вируса бешенства (штамм "Вну-ково-32") и к лиссааирусу европейских летучих мышей (штамм "Ели"), в том числе клон МКА, специфичный только к лиссавирусу европейских летучих мышей и вирусу ИштевНаее , Выявлена, из известная ранее, общегрупповая антигенная детерминанта, свойственная для вирусов 1-4 серотиг.ов и отсутствующая у лиссавирусов европейских летучих мыпей. Получение панели моноклонаяьных антител к структурным белкам различных лиссавнруссв позволило получить совершенно новую информацию об антигенной структуре вирусов группы бешенства. Создана основа для дальнейшей разработки нового поколения лечебных и диагностических препаратов, а также тест-систем для идентификации вирусов группы бешенства.
Практическая ценность.
1. Предложен новый вакцинный штамм для производства вакцины против одного из представителей лиссавирусов - вируса острого энцефаломиелита человека (ОЭМч). Получено авторское свидетельство на вакцинный штамм. Вакцина против ОЭМч на основе нового штамма внедрена в практику здравоохранения.
2. Успешное воспроизведение абортивной рабической инфекции на различных видах животных, в том числе естественных носителях вируса (домашних и диких) может служить экспериментальной базой для начала изучения различных аспектов механизма выздоровления от смертельного рабического энцефалита.
3. Установленные принципы построения оптимальной схемы прививок (правила грундимыунитета, интервалов и разрешавшей инъекции вакцины) нашли полное подтверждение в современных схемах применения концентрированных антирабических вакцин, в рекомендациях ВОЗ 1984 и 1392 гг.
е
(7-й и 8-й доклады Комитета экспертов ВОЗ по бешенству), в новой схеме по применению концентрированной антирабичеокой вакцины в РФ (о 1993 г.).
4. Предложена научно-обоснованная схема профилактических прививок КАВ на 0, 3, 7 и 30 день вместо существовавшей до настоядего времени схемы 0 и 10 день. Положение об интервале в 25-30 дней между подготовительной иммунизацией и бустер инъекцией получило отражение
в Инструкции по применению КАВ, 1991 г.
5. Предложена обоснованная схема прививок для лиц, ранее получивших полный курс профилактических или лечебных прививок, позволяющая значительно сократить принятый в настоящее время курс в 60-80)6 от исходного курса, до 2-5 инъекций для «сконцентрированной к 1-3 инъекции для концентрированной культуральной ьнтирабической вакцины.
6. Предложен внутримышечный метод аппликации антирабичеокой вакцины - вместо подкожного (под кожу живота). Предложенный шиш метод позднее был рекомендован Комитетом экспертов ВОЗ по бешенству (1934, 1992 гг.), ас 1992-1993 гг. начал применяться и в РЗ.
7. Установлено, что для экстренной профилактики бешенства решающее значение имеет инфильтрация противовирусных препаратов, • тон числе антирабического иммуноглобулина, в месте заражения (в ткани окружающие рану). Фармкомитет утвердил разработанную наш программу I фазы клинических испытаний бактериальной РНК-азы в качестве противовирусного препарата.
8. Получено 2 авторских свидетельства на мсноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства;
а) моноклональные антитела к гликопротеину вакцинного вируса штамм "Внуково-32" используются для разработки метода оценки качества полуфабриката антирабичеокой вакцины и Количественного определения антигена в готовой вакцине (ИПиВЭ РАМН) ;
б) на основе ноноклональных' антител к нуклеокапспдному комплексу разработан яюиинесцирующий препарат для экспресс-диагностики лвсса-вирусных инфекций. НТД представлена в ГИСК им.Л.А.Тарасовича.
Положения, выносимые на защиту.
I. Популяция штамма уличного вируса бешенства гетерогеина в мохе?
состоять кз I, 2 или 3-х биологических вариантов, отличающихся друг от друга как по уровню накопления вируса в мозгу, продолжительности инкубационного периода и болезни, а также по клинической картине.
2. В экспериментах на лабораторных животных, а также естественных носителях (домашних и диких) вируса бешенства установлена возможность развития не только острой летальной, но и различных неклассических клинических форм рабичеекой инфекции: абортивной, хронической и возвратной. Абортивная инфекция может быть воспроизведена на раз-яичных видах животных при любых способах заражения (в том числе внут-римозговом) как уличным, так и фиксированным вирусами бешенства.
3. Эффективность антирабической иммунизации определяется тремя главными принципами: силой грундкммунйтета, правилом интервалов, разрешающей инъекцией вакцины (бустер), & также мостом ее аппликации. Схема'леченяя'лиц, ранее привитых против бешенства, определяется характером вторичного иммунного ответа.
41 Доказана перспективность к возможность альтернативного метода профилактики бешенства путем комбинированного применения индукторов интерферона или бактериальной ИК-азы и вакцины. Для экстренной профилактики бешенства решающее значение имеет инфильтрация противовирусных препаратов, ■ в том'числе антирабического иммуноглобулина, в ткаки окружающие место заражения.
б. Монокдональные антитела к земтопам структурных белков вирусов группы бепенства позволяют изучать тонкую антигенную структуру, про-аодктъ-индикацию, идентификации и классификацию лиссавирусов.
Апробация заботы. Материалы диссертации были доложены на итоговых сзссиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (1969, 1972, 1975, I9&5 гг.) i конференциях. Омского НИШИ (1975, 1976, 1932 гг.) 5 Алма-Ата (1979) ; Симпозиуме по антивирусным веществам в Минска (1933, 1984, 1986) ; конференции Института прикладной молекулярной биологии ШЗ СССР (1990г., Москва) ; Всесоюзной научно-технкчес-кой конференции по созданию новых готовых лекарственных средств (1990, г.Харьков) ; Всесоюзном симпозиуме "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" (Москва-Лыткико, 1991) ; Втором конгрессе Европейского общества ветеринарной вирусологии (Кппсала, Швеция, IS9I) ; Ш конгрессе гигиенистов,
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Республики Молдова (Кишинев, 1992) ; Ученом Совете Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (1985, 1986, 1988, 1992 гг.); Сессии РАМН (1992г.).
Публикация работ. Основные положения диссертации отражены в 80 печатных работах (из них Ю- в зарубежных изданиях), в том числе 3 авторских свидетельствах, 40 статьях, из них 8 - в зарубежных научных журналах. Б настоящую работу вошли результаты многолетних исследований, которые выполнены при непосредственном участии автора с 1968 по 1992 гг. Работа выполнена в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского РАШ, а также ИПиВЭ. Отдельные фрагменты исследования выполнены в Омском НИИПИ, Ленинградской портовой и противочумной станцим, Институте прикладной молекулярной биологии МЗ СССР (г.Москва! НПАО "Оптичум-Био".
X х X
В данной работе отдельные ее этапы были проведены совместно с профессором М.А.Селиыовым, аспирантом Дж мухадэе В.А., ст.н.с.Зубри Г.. ст.н.с. Королевым М.Б. (ИП и ВЭ РАМН), ст.н.с. Грибановой Л.Я. (Оиский НШЛОИ МЗ РФ), к.б.н. Фуралевкм В.А. (Ин-т прикладной молекулярной биологии МЗ К), к.б.н. Василенко О.В. (НПАО "Оптимум/Био"), к.м.н.Клюшником С.Е., д.м.н.]К.А.ВанаН. д.м.н. H.H.Носиком, чл.-корр.
РАМН Ф.И.Ершовым и к.м.н..Г.М.Игнатьевым (Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАШ). Всем им автор приносит искреннюю благодарность.
Особую благодарность и признательность автор выражает своим научным консультантам,- профессорам И.Ф.Баринскому и(P.A.Канторович! за внимание и поддержку, за ценные дисскусии и консультации, а также своему первому учителю профессору М.А.Селиыову.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ «
Материалы и методы. В работе использованы методы вирусологические, иммунологические, иммуно-химические, морфологические, электронной микроскопии и гибрвдомной технологии.
Вирусы. В работе использованы вирусы группы бешенства. Среди них 1-й серотип:
а) классические штаммы уличного вируса бешенства .выделенные от собак, лис, енотовидных собак, корсаков, барсуков, крупного
рогатой скота, волков, а также от людей, умерших от гидрофобии;
б) штаммы арктического бешенства, выделенные в Якутии от песцов, оленей, собак, лошадей, полуострова Ямал от песцов ;
в) штаммы от рукокрылых на территории Pi ;
г) штамм от летучих мышей-вампиров из США ; •
д) штаммы от мышевидных грызунов из Центральной Европы (б) ;
в) штаммы острого энцефаломиелита человека (6);
и) фиксированные вирусы бешенства: штамм cvs » Внуково-32, ïlury Lep.Flury Hep (СМ) и Б&А. (Канада). Второй серотип - Le-goe Ъat ; третий серотип - штамм Мо1со1а , 4-й серотип - штамм Duvenhar.e . Лиссавирусы европейских летучих мшей (ЛЕЛЫ) штамм "Юли" (И) и stade (Германия).
Животные. На различных этапах работы были использованы следующие ввды животных: беспородные белые мыши, мыши линии Balb/c, СВА/6, D ВА/2,?1 , сс57Вг белые аутобредные крысы, морские свинки, сирийские хомяки, кролики породы "Шиншилла", собаки, дикие плотоадные корсаки, волчата, лисицы.
Клеточные линии. Были использованы первично-трипсинизированные клетки почек сирийских хомяков, BHK-2I, клетки мышиной миеломы Sp 2/0 . А 14, серии гибридом, секретируицие моноклональные антитела к различны* структурным белкам вирусов группы бешенства.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ СБСУВДЕНИЕ
Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКШ БИОЛОГИИ УЛИЧНОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА
Познание механизмов сохранения вирусов в природе составляет основу экологического изучения вирусных инфекций. Исследование процессов персистирования лиссавирусов на уровне их взаимодействия с организмом хозяина является одним из наиболее перспективных и информативных подходов. Особенности современных эпизоотии бешенства (ведущая роль в этом принадлежит лисам и другим плотоядным) (Канторович и др., 1963 ; Селимов и др., 1972), увеличение возможности изменчивости уличного вируса, случаи заболевания людей гидрофобией| несмотря на своевременное проведение полного курса прививок (Селимов и др.,1972 ; Черкасский и др.,1992) настоятельно требует изучения биологических
свойств штаммов уличного вируса, циркулирующих в природе, и, в первую очередь, их антигенной структуры. .
Настоящая глава посвящена изучению биологических свойств 40 штаммов уличного вируса бешенства, выделенных от различных видов диких и домашних животных, летучей ыши-ваыпир (США), а также от людей, умерших от гидрофобий после полного или неполного курса прививок и не получавших антирабическое лечение.
I.I. Особенности биологических свойств штаммов уличного вируса бешенства.
Опыты на мышах. На беспородных шшах, массой 6-7 г изучена адаптационная характеристика на протяжении 5-6 интрацеребральных пассажей по признаку накопления вируса в центральной нервной система (ЦНС) и продолжительности инкубационного периода у мышей при заражении вирусом в разведениях Ю-*-^' . Патогенность при периферическом методе заражения исследовали путем определения индекса инвазивности, который вычисляют по разнице между титром вируса при внутримозговом ( 1о ) и подкожном ( So) способах введения вируссодерзкащей взвеси мозга кролика. Патогенность штаммов уличного вируса изучали на уровне 2-го пассажа. Вирусы "дикования" - на уровне 4-го пассажа. Рабическая природа вирусов была подтверждена в реакции нейтрализации (РН) на мылах с антирабическим гамма-глобулином и методом флюоресцирующих антител (ЬЙА).
Результаты. По признаку накопления вируса в ЦНС все исследовану ные штаммы оказались высокопатогенными, титр вируса варьировал от 4,0 до 6,4 lg Ш50 /0,03 мл. Исключение составил штамм , выделенный из слюнной' железы американской красной лисицы (титр 8,2-8,8 lg ld^q/0,03 мл), который по данному цризнаку следует охарактеризовать как "усиленный" штамм. По признаку адаптационной характеристики все исследованные штаммы разделяются на 2 группы. Первая группа штаммов вируса вела себя как спонтанно адаптирЬванныэ к мозгу мыши: с I по 5 пассаж имели постоянные и высокие титры вируса, а также постоянные и короткие периоды инкубации (6,2-6,6 дня). Вторая группа штаммов вируса характеризовалась достоверным повышением титра вируса с I по 5 пассаж (на 2,0 и 1,8 1^50 /0,03 мл) и сокращением инкубационного периода на 5-7 дней, т.е. имела место быстрая адаптация к мозгу мыши.
Механизм адаптации будет раскрыт ниже. ,
Клиническая картина. У мышей, зараженных штаммами вируса, клиническая картина протекала с явлениями возбуждения и параличей. Важно подчеркнуть, что одни штаммы вируса вызывали паралитическую форму бешенства без элементов возбуждения по типу фиксированного вируса, а другие с преобладанием элементов возбуждения. Клинический период болезни у мышей, зараженных в мозг, в некоторых случаях продолжался необычно долго. Из литературы известно, что бешенство у мышей, при 10 V заражении протекает остро, а клинический период не превышает 4-х дней (Ванаг, 1958 ; ' 1969). По признаку продолжительности клиники
изученные штаммы был* разделены на 2 группы: а) штаммы вируса с клиническим периодом болезни от 12 часов до 5 дней и б) штаммы вируса, которые наряду с острым течением болезни (до 5 дней) , у части мышей вызывали хроническую форму бешенства с продолжительностью клинического периода болезни до 55 дней. Этот факт будет всесторонне исследован ниже.
Одним из характерных признаков уличного вируса является его ак- . тивность при периферическом способе введения. Результаты титрования штаммов вируса бешенства и "дикования" при подкожном методе заражения мышей показали существенные различия в титрах вируса между ними: от О до 4,0 18 11150 /0,03 мл. Однако истиннш показателем патогенности вируса является индекс инвазивности. По этому признаку наиболее патогенными оказались все штаммы (0В1-0В6), выделенные от людей, умерших от гидрофобии, несмотря на получение полного курса прививок, 2 штамма (ОН-1 и ОН-5), изолированные от непрививавшихся людей (индекс инва-йивности 2,0-2,6), а также от лисы (А-264), собаки (10/19), хорька (X—1009) и барсука (Б-456). Однако, все штаммы, вьщеленные от людей, умерших от гидрофобии, и животных по признаку накопления вируса в ВДС, продолжительности инкубации, скорости адаптации к мозгу мыши, по клинической картине и патогенности при периферическом способе введения относятся к классическим штаммам уличного вируса бешенства (Соловьев, 1954 ;Шен, 1958 ; Ванаг, 1963). Изученные нами штаммы вируса "дикования" по перечисленным выше признакам не отличались от штаммов уличного вируса бешенства (Канторович, 1965). Исключение составил один штрлш (Д-2), выделенный от песца, который при подкожном введении оказался апатогенным.
Важно подчеркнуть, что если патогенность штаммов уличного вируса
при le заражении существенно не зависит от кассы животного, то при периферическом способе заражения патогенность отдельных штаммов сильно зависит от возраста животного. Так, для мышей 6-7 г патогенность при se заражении выше на 0,4-2,0 lg LD50 /0,3 мл по сравнении со взрослыми животными (масса 18-20 гр). А при внутрибрюшинном способе введения вируса эта разница еще более выражена и составляет 1,0-2,1 lg LD5Q /0,3 мл.
1.2. Изучение чувствительности различных видов лабораторных жи/ вотных к штаммам уличного вируса бешенства.
В эксперименты были включены 6 штаммов вируса, выделенных от человека (10-19, ЛГ, ^убенков ), крупного рогатого скота (#71), собаки (№ 17) и лисицы (№31). В качестве лабораторных животных были использованы 168 сирийских хомяков (80-90 гр), ПО морских свинок (150-180 гр), 254 белых крыс (150-180 гр) и 124 кролика "Шиншила" (1,5-2,0 кг).
Результаты. По признаку чувствительности к io заражении исследованные животные существенно не отличались, наблюдалась практически 100% заболеваемость животных и титры вируса варьировали от 4,3 до 6,0 lg IDcq . Вместе с тем, по признаку чувствительности к вкутримышеч-нему (ira), подкожному ( 80 ) и внутрибрюшинному ( 1р ) заражению выявлено различие между видами животных в зависимости от штамма вируса. Наивысшей чувствительностью ко всем штаммам вируса бешенства обладали сирийские хомяки независимо от метода введения вируса. Смертность животных колебалась от 90 до 100%. У некоторых сирийских хомяков при io, im , во и ip способах заражения выявлено сравнительно высокое накопление вируса в мышце сердца (от 1,5 до 2,5 lg LD ^ ) и особенно в надпочечниках (1,6-3,5 ь®5о ). Для белых крыс, морских свинок и кроликов наибольшей патогенностью обладали штаммы "Рубенков", 31 и 10-19, меньшей патогенностью - штаммы 71, ЛГ и 17. По степени чувствительности к исследованным штаммам за сирийскими хомяками в порядке убывающей чувствительности следуют морские свинки, белые крысы и кролики. После 'заражения наибольшая патогенность исследованных вирусов наблюдалась при Зл способе введения вирусов, а наименьшая - при во заражении животных. Так, при во введении 1,5-3,0 млн ЫВДкф вирусов 71 и 17 из 29 зараженных кроликов не отмечалось ни одного случая заболевания.
Необходимо отметить, что из б исследованных вирусов бешенства относительно слабопатогенный штамм у отдельных животных вызывал заболевания с необычно длинным инкубационным периодом: у белых крыс -32-33 дня, морских свинок - 30-42 дня и сирийских хомяков - до 69 дней. Аналогичный признак был установлен и у сравнительно высокопатогенного вируса № 31 при 1л заражении белых крыс: одна крыса заболела с инкубационным периодом в 78 дней. Период болезни у этой крысы составил 29 дней.
Клиническая картина у заболевших животных протекала как в паралитической форме, так и в форме энцефалита, которому предшествовали явления возбуждения, агрессивности и тремора.
Таким образом, в экспериментах на сирийских хомяках, морских свинках, крысах и кроликах подтверждена (выше было показано и в экспериментах на мышах) широкая вариабельность биологических свойств штаммов уличного вируса бешенства.
1,3. Сравнительное изучение чувствительности к вирусу бешенства
■ диккх, домашних и лабораторных животных.
Для понимания и объяснения механизмов резервации и распространения вируса бешенства з природе важное значение приобретает вопрос о видоеой чувствительности -плотоядных животных к вирусу бешенства (Канторович с соавт., 1963 ; 31кеа, 1962 ; Грибанова с соавт.,1979). Для решения этого вопроса в серии экспериментов были включены молодые животные 2,5-3-месячного возраста, предварительно прошедшие 45-дневный карантин: 7 лисиц, 10 корсаков, 9 волчат, 9 собак и в качестве контроля 12 морских свинок. Для заражения был использован вирус К-862, выделенный от корсака в 0 мской области. Животных заражали 1т -вируссо-держвщей взвесью слюнных желез корсаков и лисиц в области жевательных мышц вирусом в дозах 8-10, 80-100 и 800-1000 иьзиных 10 ДДдо-Результаты экспериментов показали, что наиболее высокая чувствительность к вирусу бешенства наблюдалась у волчат, которые заболели в 100? случаев при заражаэдей дозе в 8-10 ДЦзд- Д°эа 8 8-10 ЛД^д вызывала заболевание з 505 случаев у лисиц и корсаков и не вызывала заболевание у собак и морских свинок. Для заболезания собак и морских свинок необходимо было введение вируса в дозе 80-100 ЛД.^.
Таким образом, дикие-плотоядные животные (волчата, лисицы и корсаки) оказались более чувствительными к вирусу бешенства, чем домашние
и лабораторные животные. Клиническая картина бешенства у диких плотоядных характеризовалась преобладанием буйной формы, а у домашних и лабораторных животных - "тихой", паралитической формой. Так, из 9 заболевших волчат - 7 заболели буйной формой, а у двух наблюдалась паралитическая форма бешенства. Интересные результаты были получены при титровании слюнных желез заболевших бешснством животных^ Оказалось, что вирус в слюнных железах диких плотоядных вьщелллся регулярно и в существенно более высоких титрах (1,2-3,6 ^ ДЦ^о), чеи У домашних и лабораторных животных. Важно подчеркнуть, что титр вируса и частота его выделения определялись заражающей дозой. При заражении малыми дозаш вирус обнаруживался в более высоких титрах, а у собак и морских свинок более часто, тогда как при инфицировании животных большими дозами вируса, последний имел низкий титр при исследовании диких плотоядных или отсутствовал в слюнных железах собак и морских. свинок, У некоторых диких плотоядных вирус обнаруживался в висцеральных органах (в почках, сердце, надпочечниках), а у 4-х волчат - в мышцах шеи.
В заключение необходимо констатировать, что проведенные исследования в условиях, приближенных к естественным (дикие плотоедные животные и вируссодержащая взвесь слюнных желез), позволили сделать два очень важных заключения. Первое - объясняет механизм поддержания инфекции в природном очаге: очень высокая чувствительность диких плотоядных к минимальным дозам вируса и важнейшая роль малых доз заражения в накоплении большого количества вируса в слюнных железах, что создает предпосылки для эффективной передачи инфекции. Второе - то, что штамм К-862 вируса, выделенный от корсака, вызывает две клинические формы бешенства (буйноо и паралитическое) у диких животных (лис, корсаков и волчат) одного помета, содержащихся в одинаковых условиях и зараженных в одно и то же место одной дозой вируса, свидетельствует о неубедительности существующего представления, что генез возникновения этих форм бешенства связан с локализацией инфекционного процесса в ЦНС и решающей ролью макроорганизма.
1.4. Открытие феномена гетерогенности популяции штаммов уличного вируса бешенства по составу биологических вариантов, отличающихся по клинической картине, уровню репродукции вируса
в ЦНС и продолжительности инкубационного и клинического периодов заболевания.
Несмотря на более чем 100-летнюю научную историю изучения вируса бешенства, ряд его фундаментальных свойств остается неясным, не имеет научного обоснования.
Продолжают оставаться загадкой следующие явления:
1) почему вирус бешенства в природе у одних естественных носителей вируса вызывает "буйную", а у других - паралитическую форда бе- . шенства?
2) что лежит в основе механизма "трансформации" уличного вируса бешенства, вызывающего буйную форму болезни в фиксированный, который вызывает только паралитическое бешенство?
3) в чем состоит механизм "адаптации" вируса к организму животного или к культуре клеток и получения вакцинных вирусоз?
4) с чем связана хорошо известная, широкая вариабельность биологических свойств вируса бешенства, такие как титр вируса в НДС, продолжительность инкубационного и клинического периодов заболевания?
5) в чем состоит механизм формирования экологических вариантов вируса бешенства?
6) почему вирусные иэоляты от заболевших животных или человека при пассажах в лабораторных условиях с применением стандартных методик проявляют свои свойства по-разному: одни вирусы с первого пассажа ведут себя как фиксированный вирус, т.е. с неизменяющимся высоким титром вируса, клинической картиной и постоянным и кириткик инкубационным периодом, а другие (большая часть) штаммов с I^ro по-5-й пассаж резко меняют свои свойства: достоверно увеличивается титр вируса в ЦНС, существенно сокращается продолжительность инкубационного периода, а в клинической картине постепенно исчезают элементы возбуждения.
Род перечисленных выше явлений в литературе только констатируются или высказываются предположения о роли макроорганизма (Селимов, 1965) или локализацией патологического процесса в ЦНС ( nikolau 1962 ;
Murphy • 1985). Другие явления объясняется терминами "адаптация" или "трансформация" вируса в процессе последовательных пассажей.
Нами, на основании анализа полученных выше результатов исследований фундаментальных свойств 40 штаммов уличного вируса бешенства,
в экспериментах на лабораторных, домашних и диких плотоадных животных, а также исследования морфогенеза вируса шташ "Як" (Грибенча и др., 1974) была высказана гипотеза о гетерогенности популяции штаммов'' вируса по составу биологических вариантов. Для доказательства ввдвину-той гипотезы были предприняты исследования структуры популяции штаммов, выделенных от заболевших бешенством двух лис, барсука и мальчика, умершего от гедрофобии. Эксперименты проводились на мышаЗс и собаках.
Методика выделения биовариантов: из числа мшей, массой 6-7 г, зараженных в мозг исходным материалом изолята, для выделения и последующих пассажей соответствующего биологического варианта, брали мозг мыши на высоте развития клинической картины (паралитического, судорожного или хронического бешенства).
В результате исследования было установлено, что популяция штамма вируса может содержать от I до 3-х биологических вариантов. Так, популяция двух штаммов, выделенных от лис, содержала только один биологический вариант, вызывающий острое паралитическое бешенство. Популяция штамма "БЕ", выделешого от барсука, содержала два биологических варианта: один вариант вызывал острое паралитическое бешенство, а другой - хроническую форму инфекции.
- ° Исходная популяция штамма "Як" вируса бешенства, выделенного от мальчика шести лет, умершего от гидрофобии после своевременного и полного курса прививок, содержала три биологических варианта (РисЛ).
Первый биологический вариант на протяжении 59 последовательных внутримозговых пассажей вызывал только острую паралитическую форму бешенства (ВПБ) с постоянным и очень коротким инкубационным периодом болезни. В начале болезни мыши становились малоподвижными с въерошен-ной шерстью, затем у них наступало быстрое развитие аялих параличей, прострации и смерти. Инкубационный период болезни у мышей, зараженных ВПБ в разведении 10"^'® до 4-го пассата был равен 4 дням, а с 5-го по 59-й пассаж - 2,5-3,0 дням. Период болезни не превышал 6 дней (обычно 2-4 дня). Титр вируса ВПБ до 21-го пассажа варьировал от 6,0 до 7,5 ЛД^О.ОЗ мл, а с 29-го по 59-й пасса» - от 7,2 до 8,41«
Д%0- ' •
Вторсгй биологический вариант вызывал судорожную ("буйную") фор- • му бешенства (ВСБ) на протяжении 20 последовательных внутримозговых пассажей (срок наблюдения). Эта форма болезни характеризовалась црис-
Рис. I. Разделение популяции штамма "Як" уличного вируса бешенства на 3 "клинические" варианта.
59-й пасс.
туиаьш тонических судорог туловища и конечностей, с выраженным компонентом возбуждения. Приступ тонических судорог сопровождался напряжением всех мышц, выпрямлялись задние и передние конечности, тело высоко поднималось, шерсть дыбилась, уши были подняты и растопырены. Мыши с напряженным, как струна, телом начинали разбег с прыжками, на большой скорости ударялись головой в стенку клетки, вцеплялись зубами в других мышей и иногда долго не разжимали челюсти, хватали и носили в зубах опилки. В период между приступами заболевшие животные не отличались от здоровых мышей. Приступы судорог и возбуждения провоцировались механическими или звуковыми раздражителями. Смерть животного наступала, как правило, внезапно, без продолжительной агонии и параличей, как это имело место у мышей, зараженных ВПБ. Инкубационный период болезни у мышей, зараженных ВСЕ в разведении 10 был равен 3,57,5 дня, а период болезни - 12 часов-3 дня. Титр вируса колебался от 5,1 до 6,6. ДЦдо/0,03 мл.
Для выделения и длительного пассирования ВСЕ решающее значение имеет время взятия мозга. Так, при использовании мозга для последующего пассажа, взятого на высоте развития клиники судорожного бешенства, основная клиническая картина ВСЕ сохранялась-до 20-го пассажа. Иопользование мозга для последующего пассажа ВСЕ, взятого в начале болезни", приводило к угасанию элементов картины судорожного бешенства и появлению признаков ВПБ. Следовательно, популяция ВСБ гетерогенна, содержит также частицы ВПБ, которые при определенных условиях пассирования могут вытеснить из популяции ВСЕ. Последнее на наш взгляд связано с более коротким периодом инкубации и более интенсивной репродукцией ВПБ: по сравнению с ВСЕ (таблица I).
Третий биологический вариант вызывал хроническую форму бешенства на протяжении 27 последовательных пассажей через мозг мыши. Эта. форма болезни характеризовалась медленным и длительным течением болезни, до 55 дней. Период болезни состоял из 3-х фаз. В первой фазе болезни (7 дней) отмечалось медленное развитие атаксии или легкий парез одной из задних лап. Затем наступала вторая фаза интенсивных кло-нических судорог головы и передней части туловища, которая длилась до 15 дней. В период фазы клонических судорог и их утихания начиналась третья фаза - фаза медленного развития парезов и параличей по типу Ландри. .Иногда фаза медленного развития параличей могла выпадать. В
Таблица I.
Характеристика биологических вариантов ВПБ, ВББ -и ВХБ
Варианты Клиническая форма болезни 1Л) Титр .вируса в1£ 50/0,03 мл Продолжительность инкубации периода в днях клиники
ВПБ паралитическая 7,2-8,4 3-2,5 2-5
ВББ судорожная 5,1-6,6 4,5-3,5 0,5-3
ВХБ хроническая 4,2-0,8 7-143 8-55
этих случаях период болезни бьи короче и составлял 18-23 дня- Смерть наступала в 100$ случаев.
Инкубационный период болезни, продолжительность жизни животного и титр вируса находились в прямой зависимости от продолжительности болезни животного, мозг которого был взят для заражения. Если брали мозг мышей (разведение 1:10) с периодом болезни 1-7 дней, то инкубационный период составлял 6-8 дней, продолжительность жизни животного - 8-47 дней, титр вируса 4,2-5,5 . При использовании для заражения мышей мозга (слюнной железы) мыши с периодом болезни 8-55 дней инкубационный период составлял от 7 до 143 дней, срок жизни - 8-146 дней, титр вируса 4,2-0,8 1« . Популяция вируса ВХБ в 10-45$ случаев вызывала хроническую форму бешенства и в 90-55^ - острую паралитическую форму.
Влияние Фактора смешивания популяций ВПБ и ВСЕ на клиническую картину болезни. При смешивании одинакового количества ЛД50 ВПБ и ВСБ у заболевших мышей наблюдали преобладание острой паралитической формы болезни и лишь единичные заболевания с клиникой судорожной'формой бешенства. Однако клиническая картина у большинства заболевших животных содержала элементы, присущие обоим биологическим вариантам. От мышей, зараженных смесью ВПБ+ВСБ, были реизолированы ВПБ и ВСБ, которые после второго пассажа имели характеристики, присущие только ВПБ и ВСЕ.
При заражении мышей смесью вирусов, в которой количество ЛД§д ВПБ превышало количество ЛДдд ВСБ в 10 и 1000 раз, наблюдали только паралитическую форму болезни, а при превышении количества ЛЗ^д ВСБ
над ДЦ50 В® в тех же соотношениях отмечали только клиническую картину типа судорожного бешенства. Следовательно, клиническая картина определялась доминирующим в смеси биологическим вариантом.
Идентификация ВДВ. ВСВ и ВХБ проводили тремя методами: в реакции нейтрализации на мышах антирабическим гамма-глобулином, выявлением телец Бабеша-Негри и прямым методом флюоресцирующих антител. Все три метода подтвердили рабическую природу исследованных вариантов.
■ Попытки воспроизведения хронической и судорожной форм рабичес-кой иН(!'окции ВПВ. Из 3000 мышей, зараженных в мозг ВДВ в различали разведениях, ни в одном случае не удалось отметить развития хронической или судорожной форм бешенства.
Попытки воспроизведения хронической формы бешенства ВСВ, Из 1500 мышей, зараженных в мозг различными разведениями (10~А-10""®) ВСБ, ни у одной хронического течения бешенства не было отмечено.
Попытки воспроизведения судорожной формы бешенства ВХБ, Из 630 мышей, зараженных в мозг различными разведениями ВХБ с 10 по 27 пассаж, ни в одном случае не удалось наблюдать проявление судорожной формы бешенства.
° Следовательно, на уровне использованных нами методических приемов установлена совершенно четкая биологическая специфичность выделенных вариантов вируса и различная степень "чистоты" их популяции по составу биологических вариантов.
Опыты на собаках. Выше было установлено, что популяция штамма уличного вируса бешенства может содержать от одного до 3-х самостоятельных биологических вариантов, отличающихся по ряду признаков. Однако, открытие феномена гетерогенности популяции штамма уличного вируса было установлено в экспериментах на мышах (линейных и нелинейных), которые не являются естественными носителями вируса бешенства в природе. Естественно, что для решающего суждения о значении' этого нового факта необходимо его подтверждение на животных - естественных носителях вируса. С этой целью 14 беспородных собак были заражены в мозг ВПБ 3-го пассажа (5 собак) и ВСБ 3 и 4 пассажей (5 и 4 собаки). Проведенный эксперимент на естественных носителях вируса бешенства - соба-' ках - показал, что ВПБ и ВСБ, полученные из популяции штамма "Як" уличного вируса бешенства, по своим биологическим свойствам отличаются
друг от друга. ВПБ вызывал острую Паралитическую форму болезни с коротким инкубационным периодом (средний 6,4 дня), а ВСЕ - совершенно другую клиническую картину - судорожную форму бешенства. Эта форма болезни характеризовалась приступами тонических судорог туловища и конечностей и напряжением всех мышц. Парезы и параличи, свойственные для ВПБ, полностью отсутствовали у собак, зараженных ВСЕ дате в терминальной стадии болезни. Вторым отличительным признаком ЕСБ от ВГЕ является более продолжительный средний инкубационный период болезни. У собак, зараженных ВСБ 3-го пассажа, он составил 18,5 дней.
Таким образом, установлен новый факт - феномен гетерогенности популяций штаммов вируса бешенства по составу биологических вариантов, отличающихся по клинической картине вызываемого им заболевания, продолжительности инкубационного и клинического периодов болезни и уровни ;репродукции вируса в головном мозге. Результаты, полученные в экспериментах на мышах, подтверждены в опыте на собаках, естественных носителях вируса бешенства.
Возможность существования самостоятельных биологических вариантов в составе популяции штамма вируса бешенства подтверждена в 4-х опытах по смешиванию популяций ВПБ и ВСБ в различных сочетаниях ЛД^д, а также последующей реизоляцией ВПБ и ВСБ из полученной смеси. Эти результаты позволили заключить, что биологические проявления штамма вируса определяются количеством и сочетанием биовариантов, или биологическим вариантом, доминирующим в популяции штамма вируса. Подтверждением сказанного служат следующие экспериментальные и эпизоотоло-гические данные. Так, нами (см.выше) при заражении лис, корсаков и волчат, а Yaugh е.а. (1965) при заражении собак одним штаммом вируса наблюдали буйную и паралитическую форму бешенства, свидетельство наличия в популяции штамма двух биовариантов, которые находились в динамическом равновесии, piaclnteanu (1885) описал в Румынии эпизоотию паралитической формы бешенства среди собак (буйная форма отсутствовала). По данным Z.Tuncraan (1952), в Турции с 1900 по 1923 гг. доминировала эпизоотия паралитического бешенства, а 1923 - буйная форт, что привело к резкому увеличению количества укушенных людей. Анализ приведенных литературных данных с позиции открытого нами феномена позволяет заключить, что в этих случаях популяция штаммов вируса бешенства состояла из одного биологического варианта или в ее
составе доминировал вариант, вызывающий паралитическое, а в других -буйное бешенство. Наконец, Биа1аа ь.ьалзка (1992) из медицинского центра при Кентукском Университете (США) на основании анализа многочисленных эпизоотологических и эпидемиологических данных (с 1920 по 1990 гг.) приводит доказательства зависимости клинической картины бешенства у животных и человека от свойств вируса, тем самым подтверждая основную идею открытого нами феномена гетерогенности популяции уличного вируса по составу биологических вариантов.
Открытие данного феномена объясняет:
1) широкую вариабельность фундаментальных биологических свойств вируса бешенства и механизм формирования экологических вариантов вируса, который в процессе эволюции при передаче от животного к животному могли образовать популяции штаммов о различными по составу и сочетанию биологических вариантов ;
2) механизм "трансформации" уличного вируса бешенства в фиксированный - суть селекции паралитического варианта вируса в процессе последовательных пассажей через мозг животного или в культуре клеток. Селекция ВШ, на наш взгляд, связана с его большей скорость» и интенсивностью размножения по сравнению с другими вариантами и, следовательно, вытеснением их из состава популяции штамма вируса;
3) хорошо известные в литературе явления спонтанно, быстро и трудно фиксируемые штаммы вируса бешенства ( Ьеуеи11Л1 е.а. 1929), которые связаны с составом популяции исходного штамма: популяция спонтанно фиксирующихся штаммов состояла из одного паралитического варианта вируса, популяция быстрофиксирующихся штаммов - из двух вариантов с доминирующим вариантом паралитического бешенства, при трудно или нефиксирукхцемся вирусе популяция исходного шташ'Д вируса состояла из одного или доминирующего биологического варианта ВХБ или типа ВХБ со сравнительно длинным инкубационным периодом;
4) адаптационную характеристику (динамика клинических проявлений, длительность инкубационного периода и титр вируса в ЦНС) изолятов вируса бешенства при последовательных пассажах через мозг вторичного хозяина, которая зависит от состава и сочетания биологических вариантов в исходной популяции вируса и последующей селекцией варианта паралитического бешенства. Этим объясняется, что практически все лабораторные штаммы уличного вируса, которые прошли 5-10 1с пассажей, вы-
зываат у экспериментальных животных паралитическую форму бешенства. Следовательно, адаптация вируса к вторичному хозяину или культуре клеток - суть селекции варианта'паралитического бешенства.
В заключение необходимо отметить, что открытие феномена гетерогенности популяции штаммов вируса бешенства не только объясняет широкий круг ранее неясных явлений, но и открывает'новые перспективы в проведении молекулярно-экологических исследований, получения гибридом с заданными характеристиками, а также открывает новые возможности для исследования неклассических форм рабической инфекции. В пользу сказанного свидетельствует не только признание западными исследователями приоритеты открытого нами феномена, но и начатые ими исследования молекулярно-генетических основ феномена гетерогенности популяций вирусов (Bennansour,е.а. 1992, Virology,v. 187).
Глава П. РАЗРАБОТКА НЕКЛАССИЧЕСКИХ ФОРМ БЕШЕНСТВА
Бешенство рассматривается как острая летальная инфекция с летальным исходом ( Koprowski ( 1967). Однако существование бешенства на протяжении тысячелетий, глобальное распространение, способность поражать всех теплокровных животных предполагает наличие и других форм инфекции. Клинические наблюдения и экспериментальные данные показывают, что наряду с острой летальной формой бешенства, рабическая инфекция может протекать инапарантно ( piscman and Strandberg 1973), латентно { Bq11 , 1975), абортивно ( Bell , 1964^ и хронически ( Schileider u Burtscher , .1967). Для понимания природы И механиз-
ма сохранения вируса бешенства в природе • разработка неклассических форм беиЯэнства представляется весьма актуальной и важной.
ПЛ. Абортивная форма бешенства
Случаи спонтанного выздоровления экспериментально зараженных животных были списаны разнили авторами ( Pastsr 1882 ; Гайдамо-еич, 1958 ; ГоршуноЕа,1962 ; Bolin , 1959 и др.). До последнего времени факт выздоровления только констатировался, но не подвергался исследованию.
К началу наших исследований по воспроизведен!® нелетального бешенства в эксперименте были известны лишь работы Bell Р. (1964, 1966, IS7Irr.), выполненные на модели слабопатогенного вируса бешенства-,
выделенного от летучих мышей, а также Ва<11а11 и АЪои-БоияеГ (1968) - на модели алатогенного вируса при периферическом заражении.
Учитывая большое значение модели абортивной инфекции для понимания природы вируса бешенства и механизма выздоровления от рабичес-кого энцефалита, мы поставили задачу выяснить возможность воспроизведения абортивной инфекции при использовании высокопатогенных классических штаммов уличного вируса бешенства, определить условия ее воспроизведения, патогенез, а также выяснить, насколько это явление универсально для различных видов животных, в том числе естественных носителей вируса.
Опыты на мышах. Из 213 заболевших мышей после 1р заражения уличным вирусом бешенства, выделенного от человека, умершего от гидрофобии, 9 мышей (4,2?$) выздоровели. Клинические проявления у выздоровевших мьшей варьировали от легких парезов и тремора до выраженных параличей. Вивотные, в зависимости от степени выраженности признаков болезни, выздоравливали полностью или с остаточными неврологическими явлениями в виде парезов и параличей. Причем выздоровевшие от бешенства мыши могли жить очень долго (22 месяца, срок наблюдения).
Проведенные многочисленные эксперименты на мышах показали, что уопешное воспроизведение абортивного бешенства зависит от рада условий.
1. Степень патогенности вицуса^ Эксперименты показали, что эффективность воспроизведения абортивного бешенства находится в прямой зависимости от патогенности вируса: чем ниже патогенность вируса, тем выше процент выздоровления животных и наоборот. По этому критерию классические штаммы уличного вируса, выделенные в Европейской и Азиатской части территории бывшего СССР, вызывали абортивное бешенство у 4,2£-19£ мышей. Тогда как аттенуированные иггаммы вируса бешенства - 80-100^ случаев. . ,
2. Воэ2аст_жив£тного_;_ Установлено решающее значение возраста животного для воспроизведения абортивной инфекции. Так, на мытах массой 5-6 г нелетальное бешенство не удается воспроизводить, вместе с тем, начиная с массы 8-9 г для аттенуированных вирусов и с 14-15 г - для патогенных штаммов уличного вируса процент "выздоравливающих" животных увеличивается. Наиболее оптимальный вес мышей 17-18 г. Следовательно, возможность установления абортивной формы инфекции, по-видимо-
му, находится в прямой зависимости от зрелости специфических и неспецифических реакций защиты организма.
3. Ит^одепресанты^ В пользу данного предположения свидетельствую? безуспешные попытки воспроизведения абортивного бешенства у мышей, обработанных циклофосфаном и зараженных как патогенным, так и аттенуироганным вирусами.
4. Вид животного.. Абортивное бешенство успешно нами воспроизведено на беспородных мьшах, линий Ва1Ъ , ДВА/2 ,. СС57ВИ, сирийских хомяках, морских свинках, белых крысах, кроликах, а также естественных носителях вируса - собаках и диких плотоядных - корсаках.
Опыты на собаках. Особый интерес представляет то, что нам удалось воспроизводить абортивное бешенство у I собаки (из 6 заболевших), зараженной внутримышечно вируссодержащей взвесью сданных желез корсака, в дозе 80-100 ДЦкд. Собака заболела на 15 день инкубационного периода и выздоровела на 25-й день от начала болезни.
Опыт на корсаках. В опыт были включены 8 корсаков 2-3-месячного возраста, которых заразили внутрибрюшикно вирусом, выделенным от лисицы. "р 5 заболевших короАков I животное выздоровело. У этого корсака после 13-дневной инкубации развилась типичная картина бешенства (беспокойство, макежныо движения, взъерошенная шерсть, обильное слюна течение, параличи передних и задних конечностей). Животное отказалось от шщи и зодц. Отмечалось обезвоживание и истощение организма. На 7 день болезни корсах стал подымать голову и пить воду, а на II день болезни корсак начал подниматься на передние лапы. Наступало постепенное выздоровление. После 25 дня корсак зыздоровел, но сохранился парез правой задней конечности. Срок наблюдения за выздоровевшие собакой а корсаком - 85 дней.
В проблеме абортивного бешенства центрально? место занимает получение прядах доказательств специфичности инфекционного процесса. У выздоровевшей собаки на 5 и 8 день болезни был выделен вирус из слюны, а у вкэдоровазшзго корсака на второй день болезни титр вируса в крова составляя 1,3 ЛДсф/О.ОЗ мл - убедительное свидетельство актизного инфекционного процесса. У обоих животных наблюдалось нарастание титра шггигед в крови до 1:1032 и 1:3125. Следовательно, были получены пркмкэ и непрямые доказательства специфичности абортивного бешенства у естественн;*-* носителей вируса. Таким образом, нам впервые
удалось воспроизводить абортивное бешенство у собаки, зараженной взвесью слюнной железы (т.е. при моделировании естественного заражения), а таю»э впервые получить абортивное бешенство у дикюс плотоядных животных.
Способ заражения. Для воспроизведения абортивного бешенства наиболее оптимальным способом заражения животных является внутрибрю-шинный, однако выздоровление животных возможно и при внутримышечном и подкожном методах заражения как с классическими, так и аттенуиро-ванными штаммами вируса бешенства. Эти данные нами были получены в опытах на мышах, сирийских хомяках, морских свинках, а такяе у со- * бак, как было изложено выше. Известно, что внутримозговой метод; ( 1с) заражения при бешенстве является самым жестким, и заболевание у животных неизменно заканчивается летально. Bell и др. (1966) указали, что при ¡с. методе заражения абортивное бешенство не удается воспроизводить. Bodlady и Abou- Jousef (1968) наблюдали абортивное бешенство при ic заражении глубоко аттенуированным вирусом. В связи с этим для-сувдёния о вероятной универсальности явления абортивной инфекции при бешенстве было принципиально важно выяснить, возможно ли воспроизведение абортивной инфекции при lo пу-¥и заражения вирулентными вирусами? Проведенные нами исследования на мышах, крысах и кроликах показали, что предварительное (за 10-14 дней) внутрибрюшинное введение сублетальной дозы вируса позволяет регулярно воспроизводить абортивное бешенство в 13-17? случаев при i с методе введения высоковирулентных вирусов.
Дальнейшее изучение этой проблемы позволило впервые показать возможность воспроизведения абортивного бешенства у собак, зараженных в мозг высоковирулентным вирусом без предварительной иммунологической перестройки организма. Из 5 заболевших собак после заражения в мозг биологическим вариантом вируса бешенства штамм "Як", вызывающий паралитическую форму бешенства, в дозе 3.10^ rale ЛД^д/О.З мл, одна собака после развития выраженных параличей передних и задних конечностей к 25 дню после начала болезни выздоровела полностью. Диагноз бешенства был поставлен на основании клинической картины, интенсивности нарастания титра вируснейтрализующих антител в крови до 95 дня после начала болезни (625-2500-6776-4242-2707), а также ввделения вируса из слюны на 8, 15 и 16 дни болезни. В конце срока наблюдения (192 день) ни вирус, ни антиген не были обнаружены в слюнных железах и
различных отделах головного мозга.
Иммунитет. Установлено, что у всех выздоровевших от бешенства животных,независимо от их вида,' способа заражения, происхождения и вирулентности вируса, определяются высокие титры вируснейтрализующих антител .в ткани мозга, сравниваемые с уровнем сывороточных антител и коррелирующие с выраженностью клинической картины. Титры антител в ткани мозга достигали 1:6000. Особенно высокие титры AT в ткани мозга определялись у животных, выздоровевших после заражения в мозг (более чем 1:28000). Вируснейтрализующие антитела в мозге определяются с 7-8 дня болезни, затем титр их быстро увеличивается и одновременно уменьшается концентрация вируса, который к II—13 дню болезни не определяется в головном мозге мышей, зараженных классическим уличным вирусом.
При вакцинальном иммунитете вируснейтрализующие антитела в мозге не выявляются. Антитела в ткани мозга нам не удалось определить даже при введении вакцины в мозг. Аналогичные данные были получены Bell е.а. (1966), Ark0 e>a. (1973), а также cough е.а. (1974) при гипериммунизации собак живым вирусом.
Таким образом, приведенные данные позволяют заключить, что высокие титры вируснейтрализующих антител в,ткани мозга, сравнимые с уровнем сывороточных антител, закономерны для абортивного бешенства и являются критерием постинфекционного антирабического иммунитета.
Остается открытым вопрос о природе и месте продукции антител, выявляемых в ткани мозга выздоровевших от бешенства животных. Уста-г новлено, что "мозговые" антитела по своим физико-химическим свойствам соответствуют ss в иммуноглобулину, а перфузия мозга не влияет на соотношение титра "мозговых" и сывороточных антител. Следовательно, наиболее предпочтительной является гипотеза о местной продукции антител. Однако вопрос о субстрате, ответственном за продукцию антител, остается открытым. Наконец, абортивная инфекция оставляет высоконапряженный и строгоспецифичный иммунитет. Об этом свидетельствует абсолютная резистентность выздоровевших мышей к ic введению 20000 Д%о высоковирулентного вируса штамм cvs и отсутствие иммунитета к вирусам Западного Нила (16 ДДзд) и энцефаломиокардита мьшей (32Л%0).
Интенсивность размножения вируса. В опытах на мызах, беспородных и линии ВА1ъ/с, а также сирийских хомяках, зарсленных классическим уличным и аттенуированным вирусами, выявлено, что при одинаковых способах заражения животных и продолжительности периода инкубации у животных с абортивно протекающей инфекцией титры вируса варьируют от 1,2 до 2,7 lg ЛД§о, а при летальной от 4,0 до 8,4 1еЛДдо/0>3 мл. Интенсивность размножения вируса вероятно определяет продолжительность и исход инфекции. Чем выше титр вируса в первые 2 дня болезни, тем короче продолжительность болезни. При титре вируса в.1,2-2,7 lg ЛДсф продолжительность болезни (10-13 дней) достаточная для формирования защитных реакций организма, в том числа для продукции антител в головном мозге и ликвидации инфекции.
Можно предположить, как было указано выше, что пысокое содержание антител в мозге, приводит к ликвидации инфекции. Однако, в настоящее время нет данных, позволяющих утверждать, что эти антитела определяют развитие абортивной инфекции, так как к 1-2 Дню болезни, когда титр вируса достигает своего максимального уровня (1,2-2,7 igAߧQ). т.е. абортивная инфекция уже установилась, антитела в мозгу еще не опроделя^гся. С момента появления первых признаков болезни интерферон, пю-видимому, также не влияет на развитие инфекции. Возможно, что свое влияние интерферон оказывает на начальную фазу инфекции.
Более низкая интенсивность размножения вируса в головном мозге (1,5-2,5 -ц, ЛДзд) при абортивной форме инфекции подтверждена в опытах по воспроизведению абортивной инфекции в 100% случаев у мышей, зараженных внутримышечно аттенуированным вирусом штамм ESA, а также электронной и световой микроскопией. При световом и электронно-микроскопическом исследовании абортивной инфекции морфологические признаки вирусной репродукции, в том числе тельца Бабеша-Негри, отмечались в нейронах в течение первых 10 суток болезни, однако они бьши в значительно меньшем количестве, чем при летальном бешенстве. Спустя 20-240 дней после начала заболевания у большинства животных ни вирусные частицы, ни тельца Бабеша-Негри в клетках мозга не обнаруживались. Однако, у отдельных мышей обнаруживались редкие и мелкие тельца Негри в спинном или головном мозге - свидетельство латентной инфекция на фоне полного выздоровления. -
На наш взгляд, механизм абортивной инфекции связан с врожденной
способностью организма формировать защитные (иммунные) реакции. Причем способность формировать защитные реакции, а также юс сила генетически предопределены для каждого индивидуума (Петров, 1974). Этим объясняется, что у одних животных инфекция протекает абортивно, т.е. титр вируса не превышает 3,0 ig ДЦ501 а у других животных, в этот же срок после заражения, титр вируса достигает 5,5-5,0 ig ЛД^д с летальным исходом инфекции.
Естественно, что выяснение интенсивности размножения вируса при абортивной инфекции не объясняет механизмы данной инфекции, а лишь ставит новые вопросы. Какие защитные реакции участвуют в становлении абортивной кнфзкции и на какую стадию развития вирусной» инфекции она воздействуют?
Одним кз важнейших вопросов, связанных с проблемой абортивного беиенства, является вопрос о том, какую роль играет эта форма инфекции в эпидемиологии я эпизоотологии бешенства? Выделяется ли вирус через стену и как долго? Проведенные нами исследования по воспроизведению абортивного бешенства на различные видах животных, з том числе естественных носителях, вируса - собаках и диких плотоядных, -при различных путях заражения, включая внутримозговой, с использованием классических вирусов, в том. числе взвесью слюнных желез диких плотоядных э небольшое дозах, позволяет предположить возможность существования в природе-абортивного'бешенства. Длительное выделение вируса.из сданы•собак.указывает на'вогмогность передачи инфекции друг:«! квотным и человеку* Наконец, yenesmoe воспроизведение абортивного беагенства .на животных, а тапке три документированных случая выздоровления .бздей ст- 6рязкстеа, ка ная взгляд, серьезно поколебали тезис об абсолютной летальности развившегося заболевания, зародили луч оптимкзга как-для жерт'з этой стратой инфекции, так и в плане воеыоЕкезти раскрытия механизма выздоровления о? бешенства и зыраб0'£-кя научно обоснованных подходов для перевода летальной формы инфекции в абортиг-нуа.
П.2. Хроническая форма бегеиства
Хроническая форма беиенства является одним из наименее исследованных дискуссионных разделов рабиологии. Под этим понятием различными авторами подразумевается различные по сути явления ( Bell ,1964,
1966 ; Schneider o.a. 1967 ; Wiktor е.а. 1972a ; Грибенча, 1975 ; Селимов, 1978 ; Зуев, 1988). В данном разделе речь идет о клинической форме хронического бешенства, при которой наблюдается длительное течение болезни, на протяжении которой выделяется вирус или обнаруживаются антиген и нарастание вируснейтрализующих антител. Первое успешное воспроизведение хронической инфекции было осуществлено на цыплятах Schneider И Burtsctier (1967). Болезнь продолжалась иногда до 85 дней. На протяжении болезни регулярно выявлялся антиген в ЦНС, но вирус выделить не удавалось. Однако птицы - наименее чувствительный вид к вирусу бешенства. Известно, что бешенство у мышей, зараженных в мозг, протекает остро, а клинический период не превышает 4 дней (Валаг, 1963). Нами совместно с М.А.Селимовым, а также Дкмуха.. дзе (1972, 1972) при изучении биологических свойств большого количества штаммов вируса бешенства было также зарегистрировано явление необычно продолжительного течения болезни (до 31 дня) у некоторых мышей 6-7 г, крыс и сирийских хомяков, зараженных в мозг отдельными штаммами уличного вируса. В последующих исследованиях у мышей, забитых или павших на 26, 36, 44 и 48 дни болезни после внутри-брюшинного или внутримозгового заражения был вьщелен вирус в титре до' 1,0 ig ОД50* Сатаров и Селимов (1975) наблюдали хроническое течение болезни у отдельных мышей, зараженных в мозг или внутрибрюшинно штаммом вируса (Л-28) с периодом болезни в 20, 23, 28, 43 и 49 дней. В эти сроки в отпечатках мозга мышей был выявлен специфический антиген, а в мозгу и слюнных железах - вирус. Таким образом, была получена вторая модель хронического бешенства (ХБ) на молодых мышах, высокоЧувствительных к вирусу бешенства.
В связи с этим представляло большой интерес выяснить, каков механизм и условия становления хронической формы бешенства, какова ее вирусологическая, иммунологическая и геоморфологическая характеристика. Проведенные исследования позволили выявить следующие факторы, определяющие эффективность воспроизведения ХБ:
1. Штамм виЕуса^ Из 32 штаммов вируса бешенства, выделенных от различных видов домашних и диких животных, а также от людей, умерших от бешенства, только 5 штаммов вызывали хроническое течение бешбнст- -ва у мышей с периодом болезни от 15 до 55 дней.
2. До за_и_в^^л шт но с т ь_шт амма виЕуса^ 10-1000 ДДвд вируса
являются наиболее оптимальными для воспроизведения Ж. Эффективность воспроизведения ХБ с вирулентным штаммом существенно более низкая по сравнению с менее вирулентным.
3. Длина инкубационного^ериода^ Наиболее оптимальны* является инкубационный период в 9-13 дней. При этом инкубационном периоде наб-лвдалась и максимальная продолжительность болезни (40-55 дней).
4. Возраст жимтного._ Наиболее оптимально возрастом для воспроизведения ХБ являются мыши массой 6-7 г, но ХВ с периодом болезни до 40-53 дней удается воспроизводить и у 1-2-дневных мышей-сосунков. У взрослых мышей 16-22 гр продолжительность болезни редко превышает 10 дней.
5. Пол животного. Нет статистически достоверной разницы между эффективностью воспроизведения ХБ у самок (33$) и самцов (29$).
6. Метод да^ажения^ Наибольшую воспроизводимость ХБ и продолжительность болезни отмечали при 10 (53-55 дней) и 1р методах (40 дней), однако ХБ принципиально можно воспроизводить и при 1га
и »с путях введения вируса.
Характеристика хронического бешенства
1. Клиническая картина. При заражении мышей 1с штаммом "Як" наблюдали в 80-98$ случаев острую и в 2-20$ случаев хроническую формь болезни. При острой форме инфекции (от 12 часов до 7 дней) отмечалось, как правило, быстрое развитие клиники: возбуждение, атаксия, взъерошенная шерсть, судороги всего тела, полный паралич, прострация и смерть животного. Болезнь при ХБ характеризовалась медленным началом, легкой атаксией одной из задних лап, возможно легкое возбуждение. Начинал с 8 до 13 дня, возбуждение сильно нарастает, животное быстро и много двигается, псявляатся выраженные клонические судороги головы, которые через 8-12 дней уменьшаются, но сохраняются до 30 дня болезни. За 5-15 дней до летального исхода развиваются вира-генные парезы и параличи всех конечностей. Животное сильно отстают в весе и росте. Мышь на 30-50 день болезни весит в 3 раза меньше (9-П г) по сравнению с незаболевшей (31 г). Болезнь во всех случаях заканчивалась летально.
2. Развитие вирусной инсЬекцки. Титр вируса и количество флюоресцирующих включений определяли индивидуально у 5 мыпей на I, 3 и б
день инкубационного периода, а тагае ita I (33 мьши), 2 (7), 3 (7), 4 (6), 5-6 (10), 8 (13), 9-13 (12), 19-30 (15) и на 40-55 (8 мышей) дни болезни. В эти же сроки определялись вируснайтралиэуюцие антитела в сыворотке и ткани мозга. Результаты исследования (Рис. 2) показали, что вирус и антиген впервые обнаруживаются на 3 день инкубации. Затем титр вируса и количество антигена быстро нарастали и к 1-2 дет болезни достигали 5,8-6,8ig ЛЦзд/О.ОЗ мл у мышей с острой формой бешенства. У мъией с хроническим течением болезни в первые дни болезни титр вируса был ниже и составлял 4,2-5,5ig Д%о- Сывороточные антитела (CAT) впервые были выявлены в конце инкубационного периода или в первый день болезни, а "мозговые" вируснейтрализующие антитела (МАТ) впервые выявляются на 7-9 день болезни. Титры CAT и МАТ по мере удлинения периода болезни нарастали и к 40-55 дня болезни достигали 1:97913 и 1:63090 соответственно. С момента появления и увеличения титра МАТ происходило "снижение" титра вируса в головном мозге и к 37-55 дню болезни титр вируса никогда не превышал 1,0 Xs . Следует отметить, что для выявления вируса у мышей с длинным периодом болезни исследовать мозг необходимо было сразу не после его извлечения, т.к. после его замораживания вирус не выявлялся. Иммунофлюоресцентное исследование показало, что размер и количество включений до 20 дня не отличались от их уровня при острой инфекции, однако после этого срока, вплоть до 55 дня болезни, количество флюоресцирующих включений нарастает и достоверно превышает их количество и размеры включений при острой инфекции.
При исследовании сланных желез у мышей с периодом болезни в 7, 8, 10, II, 19, 38, 51 и 55 дней вирус был выделен в 100$ случаев.
Важно отметить, что мыши, зараженные в мозг взиеслю мозга или слюнных желез от животных с хроническим бешенством, заболевали с необычно длинным инкубационным периодомt вплоть до 143, дней,- Следова-. тельно, можно предположить, что животные, которые болеют ХЕ, могут передавать через укус бешенство с очень длинным инкубационным периодом. Вероятно, это является одним из механизмов сохранения вируса в природе. В пользу данной гипотезы свидетельствует обнаружение в природе бешеных животных ( Wllsnack and Parker 1965)', содержащих в тканях мозга и слюнных желез как вирус, так и "вирусингибирующиз" вещества (антитела), а также специфический антиген в головном мозге,
I - Дни инкубации; 2 - Дни болезни. Рис. ¿. Развитие вирусной инфекции и иммунного ответа при хроническом бешенстве.
т.е. заболевание с такой ке характеристикой, как и при описанной тами модели хронической инфекции. При острей летальной инфекции МАТ не обнаруживаться (Таблица 2),
Таблица 2..
Дифференциальная диагностика различных форм бешенства
Йорка инфекции AT ' в сыв-кэ AT • в ткани мозга Выделение вируса Антиген в ткани мозга Тельца В.— Негри
Абортивная инфакция Хроническая инфекция Острая инфекция ++++ пи ++ ++++ ++Т+ ++ ++++ ++++' ++++ ++++
(-) - отрицательные, (+) - положительные результаты.
3. ПатомооЬология. Световая микроскопия. Исследования коры, Ам-монова рога, мозжечка и спинного мозга выявило, что в зависимости от
продолаtir елыюсти болезни количестпо «¿йроиов, содеряадюс тельца Бабеша-Ногри в аони "А" Аммоноиа iura, варьировали от -17-54,5 на 4-9 день болезни и до 09-9I;£ iu 42-56 дни бсл^ыш. В.и-ло пидчершуть, что несмотря на тотроплегил у К'-ссй, иаходждехся ü стадии предага ши min агонии, обнаружили ограниченные инфильтраты вокруг сосудов, участки менингита и очагов энцефалита. Отсутствовали также распространенные поарездения нейронов и клеток глии. А у мышей с парезами одной 'или двух лап, исследованных на 30 и 42 дни болезни, вообще отсутствовали воспалительные явления, хотя 76-87$ нейронов Амыонова Рога содержали крупные тельца Бабеза-Негри, а титры ИТ и ЦАТ достигали более 1:70000 и 1:55000. По-видимому, предполагаемый иммунопатологический компонент в патогенезе ХБ не является доминирующим звеном. Кроме того, медленной, но постоянное и значительное нарастание количества нейронов, содержащих тельца Бабеша-Нсгри по мере увеличения периода болезни, а также количества флюоресцирующих включений свидетельствует о том, что чрезвычайно высокие тигры МАТ ь ткани мозга но ограничивают распространение инфекции в ЦНС. Эти результаты, на наш взгляд, являются доказательством причины безуспешных попыток лечить развившееся заболевание назначением гамма-глобулина о мышцу или р цистерны головного мозга.
Наконец, обработка мышей циклофосфаном (Ц5) на 0, 2, 5 и 12 день, который как известно подавляет иьшунный ответ Т- и В-клеток ( S^th 1981), показало, что Ц5 не оказал никакого влияния на частоту воспроизведения ХБ. В условиях подавленного иммунного ответа (отсутствия как САТ и МАТ) титр вируса в ЦНС был неизменно высоким (5,2-6,4 Ifi ), а продолжительность болезни (жизни) била больше (29,4 дня), чем у необработанных Щ животных (23,3 дня) - свидетельство повреждающего дейстьин иммунного ответа. В свете отих данных "снижение" титра вируса в головном мозге при ХБ на фоне увели^рния количества антигена и телец Бабеша-Негри наступает вследствие маскирующего действия высокой концентрации антител в ткани мозга.
4. Морфогенез вируса. Электронно-микроскопическое изучение показало, что при острой инфекции в пирамидальных клетках Аммонова рога появляются вирусный матрикс (с;:опленпс вирусных нуклеокапсидов) и многочисленные вирионы, сборка которых осуществляется с участием пред-существумцих мембран эндоплазматического ретикулума. Развитие хрони-
ческой инфекции также сопровождалось появлением п нейронах вирусных матриксов, число которых увеличивалось с течением инфекции. Однако, тп.геоппсант'е пирненн в клетках не обнаруживались. В то же время в материале матрпкеа иногда наблюдались вирусные частицы, сборка кото-рьтх осуществлялась с помощью пластинчатых структур, ке теач1« какоЯ-лг.бо связи с предсуцествуищими клеточтми мембранами. Особенность» морфогенеза вируса при ХБ являлось наличие во многих включениях цилиндрических ферм диаметром 200-250 им. Важно подчеркнуть, что наблюдавшееся различие в морфогенеза вируса пел острой и хронической формах инфекции имеют место при использовании одних и тех же ыта'аюв вирусов бешенства и, следовательно, не могут б1тгь объяснены ита-'в/овгми варкадоигш (,иапав1и е. аД-^С'З) ил)! различной сгепсньп адаптации.
5. Изучение всзмо-чюсти интеграции генома вируса в геном клетки хозгуна. Предпоясягмае о возможности икт-зграции генсма (фрагментов генемд) чируса геном клетки хозяина, как возможный механизм становления хронической рабической инфекции, на подтвердилось в результата совместны-; исследований с академиком В..'.{.Ждановы.!.
Та: образом, на основании проведении исследований ресаадее значение в становлении ХБ играет только биологические особенности ктам-мл вируса бешенства. Способность щтпмма Еируса вызывать одновременно острое и хренпческоо заболевание, различный морфогенез вируса при острой и хронической инфекции явились исходны«! данными для предположения и а дальнеГ.сем установления нового факта - феномена гетерогенности популяции ата.ч'л по био.тегнчеекга вариантам, описанного а первой главе, Как было изложено в I главе, популяция штамма зируса "Як" содержит 3 биологических' варианта: паралитического, судорет-ного и хронического йс.'зкзтЕа. Из 3-х гариашгоп только вариант ХБ способен В'.:-51 вггй хронтос:/са бс-Пч-нетво регулярно з 1С-4о,з случаев нл протл-хнин У:7 к?с.т-и:,-.с каемт".! (срок наблгд' иая). Следовательно, з оо-
м 'с,лн.,.."а сот-.с-иния Х5, вероятно, лслиг особенность юрргенс-~а Сполов ,:"сс;кого ларизн-;! вируса бсленствч, л'.'знва-.пегл >.Б. Реалкза-:>игг о г;:" езейгта а полней мере 21?,поит .->- структур: п^ву-ищая стал, ; и состн.г:.енлл г ч":,::;гт! л кзк/гчкки штамма, в'.¡траста и, , г : ■'.". "и: т.
Ш.З. Возвратное бешенство
Возвратное бешенство принято считать заболеванием животных, при котором проявления болезни сменяются периодами улучшения или кажущегося выздоровления.
Первый случай возвратного бешенства описан в 1879 г ( Galtier 1879), а в эксперименте эта форма бешенства впервые била воспроизведена paster е.а. в 1884 г. Диагноз бешенства был поставлен на основании клинической картины. Впоследствии появились единичные сообщения о возвратном бешенстве- в эксперименте и у естественно зараженных собак (ВаЪеа, ВоЪев 1921 ; Vedraxaghavail о.а. 1969). Важность данного аспекта рабической инфекции связана с тем, что внешне здоровые собаки наносили укусы животным или людям, которые заболевали бешенством до того, как оно развилось у покусавших.их собак (Герман, 1926; ВаЪва, ВоЪез 1921 ; Veoraxaghtvau 1969). Однако отсутствие лабораторно подтвержденного бешенства у собак, принимаемых за источник инфекции у человека, а также отсутствие современных данных о возможности воспроизведения этой форш инфекции в эксперименте у естественных носителей вируса иногда приводило к сомнениям в достоверности этих наблюдений и отрицанию возможности существования возвратной формы бешенства (Селимов, 1978). Учитывая теоретическую и практическую важность этого аспекта рабической инфекции, мы поставили задачу попытаться получить лабораторно подтвержденные доказательства возможности воспроизведения возвратного бешенства у собак - естественных носителях вируса бешенства. В опыт были включены 9 беспородных собак в возрасте 6 месяцев, которых, заразили в -мозг биологическим вариантом вируса штамм "Як", вызывающий судорожную клиническую форму бешенства в дозах I2.I04 и 18,9.Ю4 ШЦ^д/О.З мл. Из 9 собак 7 заболели с инкубационным периодом в 8-22 дня. Клиническая картина характеризовалась приступами тонических судорог конечностей, туловища, частыми подергиваниями головы, сильной заторможенностью и быстрым исхуданием животного. Смерть у собак наступала внезапно, без парезов и параличей на 2-9-й день болезни (средняя продолжительность болезни 3,1 дня). Исключением стала I собака, у которой наблюдали возвратное течение болезни.
Животное заболело на 22-й день после заражения. Вначале болезни отмечались слабо выраженные приступы судорог конечностей и туловища
и взъерошенность персти. Между приступами судорог наблюдались сильная заторможенность животного, напряженность мышц, уши были напряжены и подняты, хвост поджат. С 3-го по 7-й день болезни состояние животного все более ухудшалось: приступы судорог усиливались, учащались и становились более продолжительными, появились тоскливый взгляд, сильное напряжение мышц. Собака больше лежала, свернувшись "калачиком", с трудом поднималась, однако полностью отсутствовали парезы я параличи конечностей. При любом прикосновении к животному возникали новые судороги. Отмечалось прогрессивное исхудание животного. В таком состоянии животное находилось до 16-го дня болезни. На всем этом отрезке болезни собака регулярно принимала пищу и воду, хотя пищу с 8-го по 16-й день болезни не доедала. На 17-й день болезни наступило улучшение: собака стала съедать всю пищу, чаще поднималась, уменьшились заторможенность и напряжение мышц, но приступы судорог сохранялись, особенно при попытке расшевелить собаку. В дальнейшем интенсивность, частота и продолжительность приступов судорог быстро уменьшались, и к 20-му дню болезни все клинические признаки постепенно исчезали. На 21-й день болезни у собаки взята кровь для вирусологического и серологического исследований. Для этого туловище и голову собаки прижимали к стенке клетки металлическими рычагами и дополнительно фиксировали корнцангами. Кровь (3-4 мл) брали из задней лапы, после этого собака хорошо себя чувствовала еще 3 дня. Однако на 4-й день у собаки вновь появились приступы тонических судорог конечностей и туловища. Болезнь быстро прогрессировала, смерть животного наступила внезапно, без продолжительной агонии на 3-й день после возврата клинических признаков бешенства. Вирус бешенства был выделен из слюны за 3 дня до начала заболевания и на 4-й день болезни. В головном мозге и слюнных железах собаки, погибшей от возвратного бешенства, титр вируса был равен 2,3 и 1,3 lg ЛД^о/О.ОЗ мл соответственно. С помощью люминесцентной микроскопии специфические для бешенства флюоресцирующие структуры обнаруживали в различных отделах головного мозга. Уровень вируснейтрализующих антител против 100 ДЦ50» тест-вируса штаммcvs ■ на 8-й день болезни составлял 111,7, а на 21-й день - 343,3.
Следовательно, в наших экспериментах удалось воспроизвести лабо-раторно подтвержденную возвратную клиническую форму бешенства у собаки, зараженной в мозг вариантом уличного вируса бешенства. Таким
образом: I) экспериментально подтверждены наблюдавшиеся ранее в естественных условиях случаи возвратного бешенства у собак и кошек (Герман, 1926 ; Babeo, ВоЪев 1921) ; 2) полученные результаты, а также строго документированные данные о периодическом выделении вируса из слюны у внешне здоровых отловленных собак на протяжении II-37 месяцев ( Debbie 1974 ; Veerarachavan 1969), на наш взгляд, свидетельствует о том, что возвратное бешенство является одним из редких, но реальных проявлений рабической инфекции ; 3) возвратное бешенство, вероятно, является одним из механизмов сохранения вируса в природе, эволюционно более адекватного, чем острая инфекция.
В заключение необходимо отметить, что экспериментальное обоснование возможности существования неклассических форм бешенства и открытие феномена гетерогенности популяции вируса, обуславливающая многообразие биологических проявлений вируса бешенства, на наш взгляд, свидетельствует о его генетически детерминированной пластичности в системе экологических связей, которая обеспечивает устойчивый'механизм сохранения вируса в естественных популяциях на протяжении тысячелетий.
Глава Ш. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ ВАКЦИНАЛЬНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА
Предложенный Л.Пастером принцип профилактики бешенства путем ежедневного введения живой вакцины сохраняется практически без изменений на протяжении 100 лет. Однако, нет никаких экспериментальных данных, указывающих, что ежедневное введение вакцины является оптимальным для формирования иммунитета. С целью разработки экспериментально обоснованных принципов иммунопрофилактики бешенства проведен ■ цикл исследований по изучению закономерностей иммунного ответа и эффективности различных схем иммунизации инактивированной культураль-ной антирабической вакциной (КАВ). ,
Ш.1. Исследование закономерностей формирования резистентности к уличному вирусу бешенства при иммунизации КАВ. Эксперименты проводили на мшах по 40-50 голов в группе, которых иммунизировали КАВ по 23 схемам. Затем на 14-15 день испытания иммунитета проводили путем введения уличного вируса бешенства в дозе от 3 до 6 ЛДзд, в подкожную клетчатку губы или внутримышечно - наиболее объективный,
жесткий и приближенный к естественным условиям тест. Смертность животных в контроле варьировала от 93 до 100??.
Проведенные исследования показали следующее (табл.3).
1. Ежедневное введение вакцины не является оптимальной схемой для формирования напряженного антирабического иммунитета.
2. Наиболее выраженный иммунитет наблюдался при использовании принципа интервалов между инъекциями вакцины - 1-й принцип. При введении вакцины с интервалом в 5-10-12 дней проявлялся бустерный эффект по типу вторичного иммунного ответа. При этом защита животных былаг
а) достоверно выше (93,5$, Р с 0,001), чем при введении того же количества вакцины ежедневно (26,6-51$) ;
б) достоверно выше (защита 93,5$, Р^ 0,001), чем при введении ежедневно, вдвое большего количества вакцины (защита 64$) ;
в) такая же защита (93,5$), как и при введении в 4 раза большего количества вакцины ежедневно, 8 дней (90$). ' ■
Бустерный эффект инъекции ва!щины не проявлялся, если интервал между инъекциями вакцины был менее 5 дней.
3. Бустерный эффект инъекции вакцины, сделанной с интервалом, определяется силой грундиммунитета,. т.е. силой первичного антигенного стимула (подготовительной иммунизацией) - второй принцип. Эффективность инъекции вакцины, сделанной с интервалом в 10 дней, находилась
в прямой зависимости от количества введенного антигена при подготовительной иммунизации. .
4. Эффективность разрешающей (бустер инъекции) инъекции вакцины, сделанной с интервалом, определяется ее антигенной силой - третий принцип.
Выявленные три закономерности иммунного отпета на модели инакти-вировапной КАЗ полностью совпадают с закономерностями иммунного ответа, полученными ранее при применении КЛЗ с остаточным инфекционным титром (Грибенча, Селимов, 1969,1969), а так:ке обнаруженными П.Й.Здро-довским на моделях бактерийных антигенов (1963). Кроме того, выявленные нами принципы построения оптимальных схем антирабических прививок полностью подтверждены Н.А.Ковалевым (1971, 1972, 1975), а также в экспериментах, проведенных нами на морских свинках, предварительно зараженных уличным вирусом бешенства. Результаты показали, что предложенная нами сокращенная схема с интервалами (0, 2, 8, 17, 26, 60-й
Таблица 3.
а) Сравнительное изучение эффективности введения вакцины ежедневно или с интервалом
Разведение и объем вакцины Схема иммунизации Кол-во мышей Выживаемость в %
1:20 - I мл 0,5 мл х 2 0,1 день 45 26,6
_ rt_ 0,5 х 2 0,3 день 50 22
вИи 0,5 х 2 0,7 дней 50 88 '
0,5 х 2 0,11 дней 46 93,5
—и— 0,25х 4 0,1,2,3 дней 42 47,6
0,25х 4 0,1,2,11 дней 44 93,2
1:10 - I мл 0,1 х 10 0-9 дней 50 51
0,25х 4 0,1,2,3 дней 50 64
— И — 0,25х 4 0,1,2,11 дней 50 94
1:10 - 2 мл 0,25х 8 0-7 дней 45 90
Контроль вируса 4 ьЛДдд 45 2,2
б) Влияние антигенной силы бустер инъекции вакцины на эффективность иммунизации
Схема подготови- Интервал тельной иммунизации в днях
Кол-во введен- Кол-во Выживае-ной вакцины ■ мышей мость — •
в %
1:50-0 25 мл х 2 0,1 день
10 1:50 -0,25 мл 41 61
10 1:250-0,25 мл 42 28,6
в) Елияние силы подготовительной иммунизации на
эффективность инъекции вакцины с интервалом
1:250-0,25 мл х 2 10 1:10- 0,25 мл 50 60
0,1 день
1:50 - 0,25 х2 10 48 87,5
0,1 день
день) из 6-ти инъекций КА5 защитила 40$ животных (Р-С 0,05), тогда как при ежедневной схеме из 14 инъекций вакцины, защита животных оказалась недостоверной (24% Р> 0,05). Изучение уровня вируснейтрали-зующих антител в динамике выявило, что до 21 дня не было разницы между титром антител у животных, иммунизированных по сокращенной схеме с интервалами и ежедневной. Однако в дальнейшем разница между титрами антител резко возрастала и к 90 дна у морских свинок, иммунизированных по сокращенной схеме, титр антител достиг 1:3162, а у животных, вакцинированных ежедневно, - 1:631. Интересно отметить, что до 21 дня не было разницы между титрами антител в обеих группах (1:224 и 1:224). Отсутствие корреляции иеяду уровнем защиты и титром антител в наших экспериментах, а также аналогичные данные других авторов (Turner Х972 ; Hab®! I957 и др.) позволило предположить, что клеточный иммунитет играет существенную роль в антирабическом иммунитете.
3.2. Сравнительное изучение показателей клеточного иммунитета, исследованных в реакции бласттпанссЬормации лимфоцитов (FETJI), с напряженностью антирабического иммунитета к уличному вирусу бешенства и уровнями гуморального иммунного ответа при различных схемам иммунизации животных. Клеточная форда иммунитета, наряду с гуморальной, играет важную роль в антирабическом иммунитете ( 'Turner 1976 ; Wiktor э.а. 1974). Было высказано предположение, что изучение клеточного иммунитета в НЗТЛ позволит разработать оптимальные схемы прививок ( Atanasiu. е.а. 1977). Однако во всех этих работах не исследовали корреляцию показателей РБТЛ с напряженностью иммунитета. Проведенные нами исследования показали, что к 7 дню после вакцинации животных сформировался клон лимфоцитов, обладающий иммунологической памятью к антигену вируса бешенства, способный ответить достоверным повышением бласттрансформации при повторной встрече с ним vitro . Эта память специфична и сохраняется до 100 дней, срок наблюдения. Однако показатели индекса стимуляции в FEM не зависели от схемы и количества введенного при этом антигена и не коррелировали с уровнем вирус-нейтрализующих антител, а также напряженностью вакцинального иммунитета. РБТЛ может быть использована только с целью диагностики, т.е. выявления иммунологической памяти к рабическому антигену. Отсутствие корреляции между показателями FBTfl и защиты к вирусу, по-видимому,
объясняется тем, что антигензависимая бласттрансформацик осуществляется одним классом Т-лимфоцитов, а противовирусная активность -клетками, обладающими цитотоксическими функциями ( "Uttor е.а. 1977),
3.3. Изучение in vivo защитного действия цитотоксических Т-лимФоцитов (ЦТЛ) при антирабической иммунизации. Действие Т-килле-ров рассматривается как один из ведущих механизмов в освобождении организма от зараженных клеток (Семенов, 1979). Однако роль клеточного иммунитета, индуцированного инактивированной КАВ, мало изучена. Wiktor и др. (1977) исследовали роль ЦТЛ ^ . Uifune (1981)
получил иммунных ЦТЛ от мышей, иммунизированных высококонцентрированной вакциной (индекс иммуногенности 5,0), которые защищали 30-37$ зараженных животных. Однако, Turner (1972) не выявил защитного действия ЦТЛ от мышей, иммунизированных 6-кратно ноконцентрированной вакциной. Таким образом, зопрос о роли Т-киллеров в антирабическом вакцинальном иммунитете остается открытым и неясным. Целью наших исследований на первом этапе было выяснить, формируются ли ЦТЛ, обладающие защитными свойствами in vivo ( в ответ на введение неконцентрированной инактивированной КАВ, а также установить некоторые условиях их формирования.
Проведенные исследования методом адаптивного переноса показали, что: I) КАВ индуцирует образование ЦТЛ, способных защитить предварительно зараженных уличным вирусом животных в 23-43$ случаев ;
2) образование ЦТЛ зависит от дозы антигена (не менее 0,7 мл КАБ) ;
3) установлено, что иммунные к вирусу бешенства ЦГЛ обладали строгой специфичностью и их действие проявлялось только в сингенной, но не аллогенной системе, т.е. протективная активность ЦТЛ проявлялась только при идентичности антигенов Н-2 эффекторных клеток с аналогичными продуктами системы главного комплекса гистосовместимости зара-жотцк мышей реципиентов. Обнаруженная нами двойная специфичность иммунных к бешенству ЦТЛ, полностью согласуется с данными, полученными на моделях некоторых флавивирусных инфекций (Хоэинский, Семенов, 1980) ;
4) ежедневное введение вакцины по 0,1 мл в течение 7 и 14 дней не индуцирует образование иммунных Т-киллеров, тогда как одно или двукратное введение ударной дозы (0,7 мл) антигена приводит к формировании Т-киллеров, защищающих 24-4?$ инфицнроваиных ms,шей. Следовательно, ежедневная схема введения вакцины не является оптимальной с точки
зрения формирования противовирусных ЦГЛ. Вероятно, этим следует объяснить значительно большую резистентность к уличному вирусу мышей, иммунизированных КАВ с интервалами, чем ежедневно ;
5) комбинированное введение у-глобулина и вакцины (0,8 мл) также ьо и.щуцировало образование иммунных T-киллерсв. Вероятно, Тг -гло-булии "нейтрализует" большую часть введенного антигена и таким образом блокирует индукцию ЦГЛ ;
6) при характеристике защитного действия ЦГЛ, иммунных к вирусу бешенства, теоретический и практический интерес прсдставляэт выявление уровня их протективного действия. В литературе известна одна попытка сравнить уровень защиты Т-киллеров с экзогенным интерфероном (Uifune 1981). Однако эта попытка не увенчалась успехом, так как интерферон ни в одном случае не проявил защитного действия. Проведенные нами исследования показали, что иммунные спленоциты защищают 31-43$ син-генных мышей, зараженных уличным вирусом в дозах 2 и 4И1и Д%о и неэффективны при заражающей дозе в 12Н1о ЛД^. Кроме того, уровень защиты, обусловленный Т-киллерами (38-43$), сравним с уровнем защиты индуктора интерферона дсНЖ (40-50$).
3.4. Изучение закономерностей индукции Т-киллеров. обладающих задитным действием ln vivo при антирабической иммунизации. Проблема индукции Т-киллеров имеет отношение к разработке стратегии вакцинации при вирусных инфекциях, в защите которых важную роль играют цитотоксические Т-лимфоциты (Бил. ВОЗ,1985, т.63, №5). Это положение ВОЗ имеет особое отношение к рабической инфекции, для профилактики которой используется громоздкий ежедневный курс прививок. Однако совершенно не исследованы закономерности индукции иммунных Т-киллеров, обладающих защитным действием 1л vivo _ этого важного звена клеточного механизма вакцинального антирабического иммунитета.
Проведенные исследования позволили выявить ряд закономерностей индуцирования иммунных Т-киллеров, обладающих защитны* действием
la vivo при иммунизации мышей неконцентрированной КАВ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при двукратной иммунизации субпороговыми дозами антигена (0,3 мл + 0,4 мл) для ранней индукции ЦГЛ вторую иммунизацию необходимо проводить с интервалом в I, 2 или 3 дня, т.е. не позднее 3-го дня (табл.4). Введение второй субпороговой дозы антигена с интервалом в 5, 7 и 14 дней не индуцировало образование
Т-эффекторов, обладающих защитным действием. Следовательно, для быстрой и ранней индукции Т-эффекторов критическим является введение одной ударной или 2-3 субпороговых доз антигена в первые 2-3 дня иммунизации. Трехдневный интервал важен и для схемы 0,7 мл + 0,3 мл, т.е. когда первая иммунизация проводится пороговой, а вторая - субпороговой дозами антигена (та£л. 4). Этот новый факт, с позиций клеточного иммунитета, объясняет и подтверждает ранее выявленный нами принцип построения оптимальной сокращенной схемы иммунизации с интервалами -о важности создания достаточного грундиммунитета в первые 2-3 дня для эффективности последующей инъекции вакцины с интервалами.
Иммунизация субпороговыми дозами антигена (0,3+0,4 мл (0,3 мл) двукратно с интервалами в 5, 7 и 14 дней (табл.ф, а также 3 и 4-х-кратно с интервалом в 7 дней (табл.5)-не индуцировало образование Т-эффекторов. Вместе с тем, введение второй субпороговой дозы антигена (0,1-0,3 мл вакцины) с интервалом в 30, 37, 60, 64, 103, 160 и 406 дней регулярно индуцировало образование Т-киллеров (табл.5). Эффективность второй субпороговой иммунизации с интервалами в 30, 37, 60, 64, 103, 180 и 406 дней, на наш взгляд, связана с образованием клона лимфоцитов, обладающих иммунологической памятью, который реагировал по вторичному типу. Эти результаты позволяют заключить, что:
1) Клон ЦГЛ памяти формируется, по-видимому, к 30-35 дню от начала иммунизации. В пользу данного предположения косвенно свидетельствует•и эффективность 6- и 7-кратиой иммунизации и неэффективность 2, 3 и 4-х кратных иммуниэаций субпороговой базой антигена (0,3 мл, табл.5). Так, 6 и 7-я иммунизация приходилась на 35-42 день, когда уже сформировался клон ЦГЛ памяти, способный реагировать по вторичному типу. Этот факт касается не только ЦГЛ иммунных к вирусу бешенства. При иммунизации мышей инактивированным вирусом гриппа индукция Т-эффекторов наблюдалась при двукратном введении антигена только с интервалом в I месяц (Калашникова, 1983). Кроме того, клон ЦГЛ памяти формируется после первичной иммунизации как субпороговый (0,3 мл), так и пороговой (0,7 мл ; 0,7 мл+0,3 мл) дозами антигена.
2) Уровень стимуляции клона ЦГЛ памяти зависит от иммунизирующей силы второй иммунизации. Так, при введении вакцины в объеме 0,( мл с интервалом в 60 дней донорские спленоциты защищали 24$ животных, а 0,3 мл - 54$ инфицированных сингенных мышей (табл.5, гр. 9,10). Не-
Таблица 4»
Влияние интервала на индукции Т-киллсров при двукратной иммунизации субпороговыми дозами антигена
.J'S Схема Интервал Адаптивн. Р по отноие-
гр. введения ме.жду им- перенос % ния к неим-
вакцины мунизаци- после нача- гащи- мунньм лим-
ями ла иммуни- ты фоцитам зацки на:
I 0,3мл xi 7 де^ь 7 >0,03
2 0,4 мл х I 7 день 7 >0,05
3 0,3мл + 0,4мл I день 7 день 40 <0,01
4 0,3мл + 0,4мл 2 дня 7 " 43 <0,01
5 0,3мл + 0,4мл 3 дня 7 " 47 -10,01
6 0,3мл + 0,4мл 5 дней 7 " 13 ? 0,05
7 0,3ил + 0,4мл 7 дней 14 " 7 7 0,05
8 0,3мл + 0,4мл 14 " 21 " 5 >0,05
9 0,3мл + 0,4мл 30 " 36 " 31 < 0,05
10 0,3мл + 0,4мл 37 " 44 " 27 <0,05
II 0,3мл + 0,4мл 64 " 71 53 <0,01
12 0,3мл + 0,4мл 103 " но - 46 <0,01
13 0,7мл х I 7 день 24 < 0,05
14 0,7мл х I 68 " 0
15 0,7 мл х I 180 " 5 >0,05
16 0,7мл + 0,3мл 3 дня 7 день . 51 <0,01
17 0,7мл + 0,3мл 7 дней 14 " 13 >0,05
18. 0,7мл + 0,1мл 60 " 68 " 24 <0,05
19. 0,7мл + 0,3мл •60 " 68 " 54 < 0,01
20. 0,7мл + 0,2мл 180 дней 185 " 80,5 * 0,001
21 (0,7+0,3)х+0,3мл 406 " 411 " 70,3 ¿0,001
х Первичная иммунизация состояла из 2-х инъекций КАВ: 0,7 мл -О день и 0,3 мл - 3 день.
обходимо подчеркнуть, что доза'антигена, необходимая для индукции Т-эффекгоров а организме животного, который ранее был иммунизирован, з 2,3-7 раз меньше пороговой дозы, необходимой для индукции ЦГЛ при первичной иммунизации.
Таблица Б.
Влилшо дозы рсбкческого антигена 113 мкукцк» ЦЕЯ при !Я)ого:!р1тиой гсс-униз^цин о иггерзалаил
групп Схема иммунизации ■ Интервал !'.е.еду ик-муниэаци-ями Адаптивный перенос поело начала юыунизашш Вариабельность ЗАЩИТЫ 2 £ Р 110 отно-с;ек,ц) г. кеиммунныи сгсленоци-там
I 0,3мл X I 7 0-6 >0,05
2 0,3мл :< 2 7 дне;1. 14 0-7 >0,05
3 0,3м;: X 3 7 п 21 0-13 >0,05
4 0,3мл X 4 7 о 28 0-7 >0,05
&х> 0,3мл X 6(7) 7 п 35 (42) 33-44 <0,05-0,01
6 О.Емл X 4 7 п 28 32 ¿0,Сс
7 0,7мл X I 7 24-47 ¿0,05-0,01
0 0,74л X 2 7 дне.". 14 2:;-43 ¿.0,05-0,01
9 0,7мл X 3 7 г 21 2Л-13 -¿о.к-о.сх
10 0,7мл X 4 7 н 23 33 '-0,0-
11 0,3мл + 0,7ыл п >1 14 «-4 ¿0,01
к> В одном иг 3-х опытов получен стрпцатслънь;Г: рсэульгь*.
сбхсдвмо подчеркнуть, что доз» антигена, ис зблодиия для гнду;-цпп Т-о'фоктороо в организм*» животного, историй рошс С;'.', ии^ш^дк.о!!, в 2,3-7 раз мон^иэ пороговой г.эзч, ««..ОходклоГ. дял ¿.идуг-;;-:, ьрк
ПСрВИЧНОй И^.'уНПЗйЦП!].
3) ;;тor.-c.-i аг .птньпого иг.ооюоа устс (.;.".(":.;, ч -.'.• '■: .1
г: ' 'ом/ о.' .^.ч, ; с-;
и-..:.; ^. зстого!! п.о.лг.! к г. у
м .;.''> . *.-: ij.ii, долге (с г и!; ниб.щдо!:;!л чС > уаи так"'1 и!:;;.; пом.уани, «о к. с./-:, 1,:..гьез; д:> 13.) г.чл, срок '
И Г. -:!.) С-Т1.1, , т. о }гхг. \
■ .-¡ь ; !;.;>..г. ■ ;'.. ,',<, г;.. го;- .. :,'.•>.' ■: . о оС;
.'.. и. > . -: .. ..'.'.о :. " ;
: '.'.иг
- '. .но.. :.:;уот >
>■ .■ и:!,...:!..
Л1 и;.:.! ■■
.14: "С И1.0-1 ¡'X, С^у . ; :: ; .. -
■г (ь
. .Л
цнгч 3'-;;:дали n Ü—• раза to coi:i> " (avaura C-2--C0,T>;.
о) .'{л;: Сл;лэ bit:-'1 лэхаз«шэ, с.-": ioe ы:г ^лле г.ап:,'Л1ы й течи'п'З 7 ;<..-:• 14 гн-зй я-;1 приводило :: вз^уивш К п ■:зр • i, с 'SJ-, т; . • i;;.-,.! дл'зтзпем. И;..; j-.^rcktiíг::;о 1 сзаз.глзсь ¡1 ;зз.!у:::;зл|Ля о.,'Охмрз: пгл /.оса ¡4 (0,3 мл) антигена с г;::ераалсм в 7 дне.";, 2, 3 и 4-;-pa?¡:c 'Л'абл. о", г р. 2—1). ¿месте с ¡t.:.;, ззздеппе ¡хрогогчх, удар;!'.::: доз ра-бяиесксго антигч-иа (0,7 мл или 0,5 |,1л 2au;:'.¡:i,:) Z, 3 пли 4-::piTHO о r.HTepi а"см в-7 днс-íi Ен>тр;:3р:-;::>'.нн0 всегда шцущ-рсггяо сбразсгчи;« иммунных Т-юияъроз, обладсвдкх seqsmu дийетькса ia vivo . Аноло-г.лнко результаты были получены ршее путей определения цлтотегест-
■f vf t-T*0
нести " , ;:сг.ольэуя донероз, кг<ун::с:«рс:«га:!к s< кезг п-соко-
кснцектрфсезшю?. вакциной «яого!фатко с шеерггдем в 7 дней ( -fuctor 1978). Следовательно, вэеденкз ударных дез г_-,тлгс!:а с интервалом в 7 дней позволяет создать непрерывное состояние вь-ргленнего клеточного ¡еммунитета (Т-зффекторзв).
TaniBi образом, выявленные закономерности индукции Т-о|)?есторов, обладающих защитнил действием vivo , расширили паси представления о механизма 'формирования снтирабяческого (.мунитета, поэзолязт сформулировать ряд пгппцвпоз построения экспериментально обоснованной схемы антирабическ:1х привлзок.
1-й гринцип. Для ранней индукции "»эффекторов, обладающих гащит-н>м действием, ta vivo з псрв;,:э 3 дня необходимо ввести 2-3 ударные дозы антигена. Соблюдение этого принципа обязательно и для создания достаточного грундиммуннтота, необходимого для обеспечения эффективности последующих инъекций вакцины с интервалами.
2-й пс'.зшпп. Непрерывнее состояние клеточного иммунитета Т-оффокторов, обладавших защитным действием in vivo f молот бьть поддержано введением повторных ударных дез антигена (0,5 или 0,7 ид вакцины) с интервалами. Этим требованиям отвечает только концентрированная культуральнал антирабическая вакцина, которая применяется по схеме 0, 3, 7, 14, 23 и 90 день.
3-й пр'.зтип. Дяительноз сохранение клеточной иммунологической памяти (более 4С0 дней) и втор:затй характер иммунного ответа на впадение субпсрогошс: доз антигена указывают на то, что при повторной :.ммуннззци.1 достаточно 2-5 инъекций для исчонцеитрирокшчой и 1-3 -для концентрированной вшздшш для стимуляции выраженного актирвб:з;ес-
кого иммунитета (Еместо 50-80$ шгьекций вакцины от первичного курса принятого в настоящее время в Р5 и в странах СНГ).
4-й принцип. Учитывая, что клон иммунологической памяти, способный реагировать по вторичноцу типу, формируется к 30 дню после первичного введения рабического антигена, при профилактической иммунизации интервал между подготовительной иммунизацией и бустер дозой должен быть 25-30 дней вместо принятого в настоящее время интервала в 10 дней (Наставление по применению КАВ, МЗ СССР 30Д1-1976г.). Причем подготовительная иммунизация неконцентрированной КАЗ должна состоять из 3-х инъекций вакцины по 5 мл на 0, 3 и 7 день.
Таким образом, нам удалось установить закономерности индукции Т-эффекторов, обладающих противовирусной активностью, которые оказались идентичными закономерностям формирования резистентности к улич-кому вирусу при антирабкческой иммунизации.
В заключение необходимо отметить, что установленные закономерности иммунного ответа при антирабической иммунизации и принципы построения оптимальных схем прививок нашли отражение: I) в рекомендованной схеме ВОЗ при применению концентрированной антирабической вакцины на 0, 3, 7, 14, 30 и 90 день (Комитет экспертов ВОЗ, 1984, • 1992) ;
2) е Инструкции по применению концентрированной КАВ в России и странах СНГ с 1993 года и частично в новой Инструкции по применению но-концентрироаанной КАВ (раздел профилактическая иммунизация) ;
3) Подтверждены в экспериментах с езкцкной против лисса.вируса острого энцефаломиелита человека (Игнатьев, ГркЭенча и др.,1998) ;
4) Подтверждены при разработке схемы и о?раде;и в новой действующей инструкции по профилактическому применению дивакцины прэгив вирусов Западного и Восточного энцефааомиелитов лсиадей (Грибенча, Баринский, 1984). Таким образом, можно предположить, что. установленные закономерности иммунного ответа, в тон числе клеточного на моделях 3-х вирусных вакцин имеют, вероятно, общебиологический характер.
Глава ТУ. ВЛИЯНИЕ МЕТОДА И МЕСТА ВВЕДЕНИЯ А1ГГИРАБИЧШШ ВАКЦИНЫ НА ЙОЙИРОВАНИЕ 1ШУНИТЕХА
Подкокный метод аппликации антирабической вакцины, предложенный Пастером в конце XIX века, был гениальным в плане безопасности для
вакцины, содержащей живой вирус. Однако з конце XX зека, когда применяются полностью инактивированкке вакцины, с точки зрения наиболее быстрого и полного представления антигена иммунокомпетентньм клеткам, метод введения вакцины под кожу яивота не является оптимальным. В пальм с изложенным определение наиболее оптимального метода и места аппликации вакцины представляется важным как в теоретическом, так и практическом плане. Нами (Грибенча, Селимоз, 1972) прсаналиог.роЕЫ-а.' 37 работ с 1881 по 1971 год, касающихся изучения зависимости эффэк-тивности антирабической иммунизации от места введения вакцины. Так, Грязно в и др. (1933), Муратова и др.' (1942), Koprowsld.1 е.а. (1955) указывали на преимущество внутримышечного метода, Аккер (1935), 110ое-(1945), Нагоренко (1958), Зибицкер и Ковалев (1968) - внутрикожного метода, Eorison (1962) - внутривенного, fester е.а. (1936) и Дедова (1947) - знутрибрюшинного, a Koprowski и Black (1954), Селшов и Калинина (1962) и Шукейр (1963) показали возможность внутри-мозговой иммунизации животных живым и апатогенкым вирусом р1игУ HEP. Однако вирус ?iury HEP успешно иммунизировал животных при введении з мозг и слабо или совсем не иммунизировал лабораторных животных при других способах вакцинации, что не позволило сравнить эффективность внутримозговой иммунизации с другими методами.
В связи с изложенным мы поставили перед собой задачу изучить эффективность антирабической иммунизации при различных способах введения КАЗ. На различных этапах исследования использовалась инактивиро-ванная или с остаточным инфекционным вирусом КАВ.
Результаты многочисленных опытов (табл.6) показали, что наиболее напряженный иммунитет к уличному вирусу бешенства формируется при введении КАВ в мозг, в кожу губы и подошвы задней лапки (100-98^). Далее, в порядке снижения уровня иммунитета, идут методы: внутрибра-шшный (78% защиты), внутримышечный (5ОД, под кожу бедра (22%) и под кожу живота (10%) и неэффективным оказалось введение вакцины под кожу спины и шеи.
Таким образом, проведенные исследования показали, что место введения вакцины играет исключительно важную роль в формировании антира-бического иммунитета. В теоретическом плане, особый интерес представляет абсолютная защита при введении КАВ в ЦНС. Исследование титра сывороточных антител выявило исключительно высокий титр антител при
Таблица 6.
Зависимость уровня иммунитета и.заболеваемости от места аппликации КАВ или уличного вируса
Место введения вакцины Всего Защита Смерти!
или вируса ' мышей • в % в %
I. В мозг 46-50 100 100
2. В кожу губы 50 100 100
3. В кожу подошвы задней 50 98 96
лапки
4. Внутрибрюшинно 45-50 78 . 24
6. В мышцу бедра 50 50 80
6. Под кожу бедра 50 22 54
7. живота 49-50 ■ 10 ■ 14
8. -"- спины 48-50 0 8
9. звеи ' 30-49 0 3
10. Контроль 50 0
введении вакцины в мозг 1:1400 и в 14 раз меньший титр при внутри-бршинной иммунизации (1:96). Предположение о местной продукции антител в ЦНС не подтвердилось - в ткани мозга вируснейтрализующие антитела обнаружены не были. С точки зрения современного представления О механизме иммунитета - представления антигена иммунокомлетентньм клеткам, - наиболее оптимальным является введение антигена внутри-бршинно или внутривенно (Грибенча, 1968). Однако, как напряженность иммунитета, так и титры антител оказались выше при введении вакцины в мозг. Не ясен с точки зрения возможности представления антигена им-мунокомпетентным клеткам и феномен 100% защиты при введении ьакцина в кожу подошвы лапки или губы. На наш взгляд, в плане обсуждения полученных фактов, представляет интерес результаты изучения зависимости уровня смертности мышей, от места введения уличного вируса. Из таблицы 6 видно, что самая высокая смертность отмечалась таете при введении вируса в мозг, кожу верхней губы и подошвы задней лапки. Показатель смертности постепенно снижался при введзнии вируса в мышцу бедра (80$), под кожу бедра (54?) и внутрибрюшинно (24^). Самая низ-
кая заболеваемость наблюдалась при аппликации вируса под кожу живота, спины и шеи. Такт.! образом, результаты, представленные в табл.6, свидетельствуют о прямой корреляции между уровнем смертности и напряженностью иммунитета.
Известно, что частота воспроизведения бешенства определяется обилием нервных окончаний (рецепторов) в месте проникновения вируса. Вместе с тем, очень высокая эффективность иммунизации в мозг, кожу губы и подошвы лапки и отсутствие защиты при аппликации вакцины под кожу спины и шеи, позволяет предположить, что обилие нерзных окончаний на месте введения вакцины также играет определенную роль в формировании антирабического иммунитета. Вероятно, для такой строгой ней-роинфекции как бешенство, для формирования напряженного иммунитета важным является "доставка" вакцинного вируса (или его фрагменты) в ЦНС. А это, по-видимому, возможно при введении антигена з места, богатые нервными рецепторами, которые его "захватывают" и "транспортируют" подобно уличному-вирусу, по нервным волокнам в ЩС, В пользу данной гипотезы свидетельствует данные Л.П.Горшуновой и др. (1967), что при антирабической иммунизации происходит регулярное проникновение в мозг минимального количества антигена. Низкая заболеваемость при внутрибрпшинном заражении, возможно, следует объяснить тем, что вирус, попадая в брюшную полость, не соприкасается с раневой поверхностью (и нервными элементами) в той степени, как это имеет место при попадании в кожу губы или интраплантарно.
В заключение необходимо отметить, что если введение вакцины в ■ мозг, в кожу губы, интраплантарно и внутрибрюшинно имеет теоретическое значение, то для практики наиболее эффективными и приемлемыми методами иммунизации могут быть рекомендованы внутримышечный и внутри-кожный, которые оказались значительно более эффективными, чем различные зоны подкожного метода (живот, спина и шея).
Полученные нами результаты подтверждены в полевом опыте по внутримышечному применению КАВ из штамма "Внуково-32" (Тойгомбаева, 1986), получили отражение в рекомендациях ВОЗ (1984, 1992) по внутримышечному применению концентрированной КАВ, в Инструкции по применению кон' центрированной КАВ в Р5 (1993), а также в Инструкции (1991) по внутримышечному применению неконцентрированной КАВ при профилактическом курсе иммунизации.
Глава У. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ И тгЛУНОМОДУЛИРУЩЕЙ АКТИЗНОСГИ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНОЙ' . ПРИРОДУ Г1Д1 ЛИССАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
Стратегия профилактики бешенства обоснованно базируется на комбинированном применении антирабической вакцины и гамма-глобулина (Сэлимов, 1962,1978 ; Доклады Комитета экспертов по бешенству ВОЗ,1974 и 1992гг.). Основная функция антирабического иммуноглобулина (ЛИГ), гомологичного или гетерологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития бешенства с коротким инкубационным периодом. Однако, АИГ, в особенности гетерологичнай, чрезвычайно реантогенен (вызывает аллергические реакции, в том числе анафилактический аск и сывороточную болезнь), интерферирует с вакциной ( Atauaeiu е.а. 1961 ; Corey e.a. 1976) и блокирует индукцию им-' мунных Т-киллеров (Грибенча и др., 1988). Последнее может быть причиной неудач антирабического лечения. Эти данные, а также случаи за-бслосан»'.^ Г1йрйф"зией посла своевременного и полного курса прививок (Селимоа, 1967 ; Rubin е.а. 1969 ; Кравченко и др., IS76) указывают на необходимость не только совершенствования принятого метода лечения, ко и поиска альтернативных специфических и не-^лшцмфкческих " препаратов для профилактики этой.опасной для чзловекв инфекции.
К началу наших исследований в литературе имелось сообщения, касающиеся противовирусного действия индуктора кнтзрфзрона псдк(И), поли(Ц) при бешенстве ( S««*» и Habel , 1972 ; Beer «.а, Х379 и др.). На протяжении последних 10 лет нами изучено противовирусное и ш.гмуноиодуяирувщее дейстгие 53 препаратов и ссединэвия различного происхождения. Среди них больваи группа гндукторов интерферона, большая групгл соединения фуран.ч к маявумового ангидрида, рибвмидэд к его аналог;;, а также црепэраты: ханерол, эихад, леакадин, адамантен, кемантан, рибавирин, хелипш, ьегетаи, Сч-2 - (Академия nävx и'олдовы), 'Pffi-аза бактериальная (Казанский университет) и. др.
Проведенные исследования показали, что при ри5кческой инфекции наиболее существенную и значимую противовирусную активность Е экспериментах на мышах показали индукторы интерферона ларифан, рздостин, ряфасткн, БП, ряд соединений фурана и малеинового ангидрида, ханерол, ui-2 к P.iK-аэа бактериальная, Необходимо подчеркнуть, что все прега-
раты и соединения испытывались в "лечебном" режиме, т.е. применялись в различные сроки после заражения уличньм вирусом в мозг или внутримышечно. Установлено, что защитный эффект при внутримышечном методе заражения проявлялся только при введении препаратов в место заражения или в мозг (табл. 7).
Таблица 7.
Изучение противовирусной активности препаратов и соединения у мышей, предварительно зараженных внутримышечно уличным вирусом бешенства
Место введения препаратов и уровень защиты в % Препараты м03г вена мышца ин- мышца
фициро- неинфи- брвшина под ванная цирован. кояу
Ларифан 32 0 25-45 0 0 0
Ридастин 32 0 24-45 0 0 0
Рифастин 45 0 40-65 0 0 0
БП 30 0 20-40 0 0 0
Декстансульфат 0 - 0 0 0 0
С -2 токсичен 0 50-70 ' 0 0 0
Ханерол « - 60-60 0 0 0
РНК-аза и . 0 40-62 0 0 0
102-63 и 0 22-50 0 0 0
Контроль -
антирабический 44-63 18-20 18 0
гамма-глобулин 20
Статистически недостоверная (Р>0,05) обозначена "О".
По уровня защиты исследованные препараты делятся на три группы. Первая группа - это индукторы интерферона, характеризующиеся средним уровнем защиты (24-45%). Затем идут препараты ИК-аза и рифастин (4062%) и препараты с выраженным защитным действием Си-2 (50-70%) и ха-нерол (60-80%). Важно подчеркнуть, что положительный контроль - специфический антирабический гаммаглобулин (200 МЕ/кг) по свсей эффективности занимает промелуточное положение, однако как и у других препаратов наибольшая его эффективность (в 2-3 раза) проявлялась при
введении в место заражения.
При внутримозговом заражении животных защитный эффект индукторов проявляется только при их введении в мозг (защита 21-4055). Зффектив- > ность остальных препаратов не представлялось возможным испытать, т.к. при введении юс в мозг они оказались токсичными. *
Известно, что вирус бешенства первоначально размножается в нейро-мышечных бляшках в месте заражения и только после этого инфекция распространяется центростремительно к ЦНС (1,игР11У , 1973). Это подтверждается и фактом защиты инфицированных животных при ампутации зараженной лапки вскоре и в первые дни после заражения ( Баег е.а. 1972, 1979). Таким образом, защитный эффект изученных препаратов связан с блокировкой инфекции в области "входных ворот", независимо от механизма их действия. Так, при использовании индукторов И<5 установлено, что наивысшие-титры КЗ (в 4-8 раз), спреяелячись в ткани, в которые был введен индуктор И5, т.е. местная продукция Ш по-видимому является решающей в прерывании инфекции. РНК-аза, которая, вероятно, нарушает один из этапов репродукции вируса, свое действие проявляет также у ворот инфекции. Ханерол, который по своему "механизму" свертывает белок, в том числе мышечной ткани,.по-видимому, "замуровывает" вирус у входных ворот и не позволяет ему распространяться к ЦНС. Антирабический гаммаглобулин как и другие препараты наиболее эффективно может нейтрализовать вирус при его инфильтрации в месте заражения. В 2-3 раза меньшая защита, отмечаемая при его введении в неинфициро-ванную лапу, внутрибрюшкнно или внутривенно, связана с неэкономным способом его применения, т.к. антитела, всасываясь в кровоток, достигают ворот инфекции в концентрации значительно меньшей, чем при непосредственной инфильтрации в месте заражения. Наконец, установленный нами впервые факт эффективности внутримозгового введения индукторов И5 при внутримышечном заражении, связан также с местной продук-* цией И2 в ЦНС и защитой клеток-мишеней.
Все эти материалы позволили нам сформулировать положение, что экстренная профилактика бешенства возможна на двух уровнях: на уровне ворот и>1фекции и на уровне ЦНС. Из этого положения следует вывод исключительно важный для практики антирабической службы - максимальный эффект антирабического иммуноглобулина, проявляется только при инфильтрации всей его дозы в ткани окружающие инфицированную рану.
Однако, как было указано выше (табл. 7), при введении ЛИГ в места другие чем инфицированные ткани, эффективность ЛИГ падает в 2-3 раза. Поэтому при тяжелых повреждениях лица и головы,.анатомическое расположение которых не позволяет тщательно инфильтрировать АКТ в окружающие повреждения (раны) ткани и как следствие необходимостью введения остатка АИГ^внутримышечно (плечо, лопатка, бедро), то для создания необходимой концентрации антител в инфицированные ткани (опосредовано через кровоток) рекомендованную дозу ВОЗ (40 Ш2/кг массы тела) необходимо увеличить не менее чем в 3-5 раз.
Вывод о решающем значении введения всей дозы АИГ в ткани вокруг инфицированных ран, полученный на основании изучения противовирусного действия препаратов с 4-мя механизмами прерывания инфекции в области зходних ворот, получил отражение в рекомендациях ВОЗ (1992) и инструкции РФ (1993) по применению АИГ.
Введение исследованных препаратов в различные сроки после заражения показало, что наиболее высокий защитный эффект наблюдался через 1-4 часа после заражения, однако существенную защиту наблюдали и через 24-48 часа после инфицирования. Наиболее эффективным в этом плане оказался препарат ханерол, который оказывал достоверную защиту {2П% Р< 0,05) спустя 96 часов после заражения. Однако, у большинства мышей, обработанных ханеролом, наблюдались остаточные повреждения мышцы обработанной лапки вследствие свертывания мышечного белка. По этой.причине ханерол был исключен из дальнейших исследований.
Другой исключительно важный для предупреждения бешенства эффект индукторов ИЗ заключается в удлинении инкубационного периода на 1,83 дня. АИГ также удлиняет регулярно инкубационный период на 1,5-2 дня, в том числе при использовании малых доз АИГ (0,63 ЫЕ/мышь), однако при его введении в места другие чем вирус, инкубационный период , удлиняется незначительно (0,6-0,7 дня).
В плане возможности разработки альтернативного метода профилак-* тики бешенства заслуживает серьезного внимания изучение комбинированного применения индукторов ИЗ и антирабической вакцины, а также АИГ.
•Проведенные исследования показали, что при комбинированном применении индуктороЕ И$ и вакцины отмечалась более высокая защита (51-582), чем при введении одного индуктора (30-41%). Одна вакцина во всех экспериментах оказалась неэффективной. Это связано с коротким инкуба-
■О/
ционным периодом, з течение которого не успевает развиться иммунитет. Особенно выраженный эффект комбинированного "лечения" наблюдали при введении индуктора в мозг. Так, при начале "лечения" через 4 и 24 часа защита составляла 68 и 65% 0,001), а через 4Й часов - 44% (Р<0,01). Лечебный эффект наблюдался и в случае начала "лечения" через 72 часа (32% Р40,05). Более того, при введении индуктора в мозг формируются более высокая и ранняя резистентность к внутримоз-говому или внутримышечному заражению, чем при введении вакцины и индуктора в мы..:цу или одной вакцины (таол. 8), При комбинированном применении индукторов и вакцины наблюдался и более выраженный гуморальный иммунный ответ. Так, при исследовании уровня антител в динамике на 9 и 14 день, при комбинированном применении прэпаратов титр антител составил 1:32 и 1:692 (соответственно), тогда как при использовании одной вакцины 1:13 и 1:138. Иммуномодулятор инозиплекс усиливает в 2,5 раза стимулирующее действие ларифана на гуморальный отеот. Кроме того, индукторы 1п:торферона ларифак, ридастин, рифасткн и 102-63 (производное фурана с мел'иновым ангидридом) в комбинации с вакциной' увеличивают в два раза защитную активность Т-киллероз (61-63%) по сравнешш с одной вакциной (30-33%).
. Таким образом, проведенные исследования показали. ч.о индукторы И'5, наряду со свойствами, присущими АИГ (защита и удлинение инкубационного периода), обладают рядом г.есьма существенных преимуществ:
- вместо торможзния иммунного ответа Т- и В-клзток, как это играет место при применении АИГ, индукторы Ий стккулируат гуморальный и клеточный иммунитет ;
— стимулируют формирование более раннего, напряженного и. продолжительного иммунитета.
Однако, особый интерес представляет то, что г:.ои коыбинирокиыом применении индукторов И2 и вакцины ьрэди забояешьгс «-'»¡зй с т;га:иной клинической картиной бешенства 25-50% пивотних выздоравливали тд-мостыо или с остеточнкми неврологическими явлениями в виде парезов и параличей. При прдаенекии одной вакцину выздороалеиие »¡встньгс отмечалось редк в единичных случаях. Мг&но заключить, что перечисленные выше свойства индукторов И-5 в комплексе с вакциной создают условия для перевода летальной формы бртенстг-а в абортивную - уакт исключительной важности для теоретической и прикладной рьбиологии.
Таблица 8.
Динамика развития резистентности к уличному вирусу бешенства у мышей, обработанных вакциной в сочетании с гамма-глобулином или ларифаном
5 лень
обработки ! 3очига "Ри заР**ении
мышей
в мозг
*
в мышцу
I
9 день
14 день
Выживаемость при
заражении
--------г-----
Резистент-! ность к
в мозг
% !• р
в "ьшцу _}
- • " В%
I
1
Вакцина 0 53 <0,01 0 73 4 0,001 63
Гаммагло-булин + вакцина 0 27 ¿0,05 0 44 4 0,05 2,5
Ларифан, -+ вакцины Ларифан, + вакцина 0 65 40,01 .62 ¿0,01 73 ¿.0,01 501
54 4 0,01 73 4 0,01 80 <-0,001 73 < 0,001 537
Гаммагло-булин 0 21 0,05 0 0 0
Ларифан, 0 0 -
Ларифан, 0 21 0,05 - -
Статистически недостоверная (Р* 0,05) защита обозначена "0".
При комбинированном применении РНК-азы и ва'кцины не было обнаружено ни стимулирующего, ни повреждающего действия как на формирование резистентности к вирусу бешенства, так и на уровне гуморального иммунного ответа. Более высокий уровень защиты РНК-азы по сравнению с индукторами №5, а также сообщение о возможности гидролиза РНК-овых индукторов ( Заег е.а. , 1979) ферментами сыворотки приматов, предопределил ее выбор для дальнейшего изучения противовирусной активности на других животных. В условиях абсолютной смертности животных в контролях, РНК-аза защитила 40% морских свинок и 75% кроликов, предварительно зараженных уличным вирусом внутримышечно. Нами подготовлена и реализуется программа дальнейших испытаний РНК-азы на собаках. Получено разрешение Фармкомитета на проведение I фазы кли-
нпчоскпх испытаний, которые проходят в настоящее время на базах Московской и Петербургской клиник.
Резюмируя итоги проведенных исследований, можно заключить, что комбинированное применение индукторов интерферона или бактериальной РНК-азы с ентирабической вакциной могут быть перспективыми в качества альтернативного метода профилактики бешенства, или б качестве дополнения к существующему методу, особенно при укусах опасной локализации с высоким риском заболевания.
Глаза У1. АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ЛИССШРУСОВ, ' ЦЦРКИМРЛЦИХ НА ТЕРРИТОРИИ СТРАН БЫВШЕГО СССР
У1.1. Изучение антигенных взаимоотношений штаммов уличного и фиксированного вируса бешенства.
Данные литературы свидетельствуют об антигенном единстве цирку- ' лирующих в природе штаммов уличного вируса бешенства. Вместе с тем известны сообщения об антигенных различиях между штаммами уличного и вакцинного вируса {Pwicpi, 1921 ¡¿гг/Л'й , 1950 -A/M
1955 ; S1/2 £41/ et ai. %
1963). С другой стороны, вполне возможно допустить появление внтигенноизменеммх вариантов вируса бешенства в условиях современных природных эпизоотий. Такого рода предположения возникают также в связи со случаями регистрации заболевания гидрофобией после своевременного полного курса антирабических прививок (Селим о в , 1972,1984; Черкасский и др. ,1992). Вше сказанное свидетельствует о том, ото изучение антигенной структуры циркулирующих в природе лиссавирусов должно быть предметом постоянного виюшш»: со стороны исследователей.
Антигенные взаимоотношения изучали в реакции нейтрализации (Я!) с коммерческим алтирабическим гшма-глобулином, ь также в иммунологических опытах. В исследованиях были использованы 30-38 вирусов, выделенных в различных географических регионах (Pi, страны бывшего СССР и США) от лздей после полного курса прививок, неполного курса прививок, непрививавшихся людей, диких и домашних животных, летучих мышей, а также штаммы вируса дикования, вцдэленныо от песцов и оленя на Крайнем Севере Якутии. В FH на ¡.аллах не выявили статистически достоверной разницы между индексом нейтрализации гомологичного фикси-
рованного вируса и 30 штаммами вируса бешенства, выделенными от людей, диких и домашних животных.
В иммунологических опытах испытывали резистентность мышей, иммунизированных коммерческими вакцинами, приготовленными на базе двух ьаюинных штаммов Москва-Пастер и Внуково-32 к заражению 38 штаммами уличного вируса бешенства. Материалы экспериментов показали, что обе коммерческие антирабические вакцины создают одинаково напряженный иммунитет ко всем штаммам■вируса бешенства и "дикования".
Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что изученные штаммы уличного вируса, выделенные в различных географических регионах, а также штаммы вируса "дикования" едины в антигенном отношении с двумя вакцинными штаммами - Москва-Пастер и Внуково-32. Следовательно, случаи гидрофобии у людей, получивших своевременно полный курс прививок, нельзя объяснить антигенныйи различиями между вакцинным и диким вирусом бешенства.
Проведенное исследование антигенной структуры 5 штаммов лисса-' вируса острого энцефаломиелита человека (ОЭМч) в перекрестных реакциях нейтрализации и иммунологических опытах позволило рекомендовать штамм "Резник" в качестве вакцинного штамма для изготовления лечебной вакцины против лиссавируса ОЭМч. Штамм "Резник" обладал более высокими иммуногенными и антигенными свойствами по сравнению с вакцинным штаммом "СВ". Получено авторское свидетельство на штамм "Резник", который используется в настоящее время для изготовления вакцины против лиссавируса ОЭМч.
Необходимо однако констатировать, что выявленная антигенная однородность исследоЕаншх штаммов вируса бешенства касается исследования, в первую очередь, антигенной структуры гликопротеидного белка вирусов на поликлональном уровне. Поликлональный анализ адекватен для исследования антигенной структуры вирусов на уровне серотипа и не пригоден для изучения тонких штаммовых различий и антигенных особенностей вирусных структурных белков. Только гибридомная технология ( иЦсЬог е.а. 1978), позволяющая получить моноклональные антитела (МКА) к отдельной антигенной детерминанте, к отдельному эпитопу структурных белков вируса бешенства открывает новые возможности и перспективы как для теоретических исследований, так и прикладных разработок.
У1.2. Получение моноклокальных антител к структурным белкам вирусов группы бешенства.
В Pi и других странах СНГ для профилактики бешенства изготовляется культуральная антирабическая вакцина (КАВ) из штамма "Внуково-32". В связи с этим встает ряд важных в теоретическом и практическом плане вопросов. В каком соотношении находятся антигенная структура глико-протеидного и нуклеокапсидного белков вакцинного штамма "Внуково-32"г с вирусами группы бешенства, циркулирующие в странах бывшего СССР и других регионов мира. Эта задача, а также необходимость оценки качества антирабических вакцин по количеству гликопротеина и нуклео-капсидных белков, согласно рекомендациям Комитета экспертов по бешенству ВОЗ (8-й доклад, октябрь 1992г.) могут быть решены с помощью МКА к различным эпитопам структурных белков вакцинного вируса штамм "Внуково-32".
У1.3. Характеристика гибридом продуцирующих МКА к гликопротеид-. ному структурному белку вируса бешенства.
Нами получено 76 клонов гибридом продуцирующих МКА к гликопро-теину. Из них, по признаку вируснейтрализующей активности отобраны 3 стабильные линии специфичные к различным эпитопам гликопротеидного структурного белка вируса бешенства штамм "Внуково-32" (I-C5, Е6 и BII), которые характеризовались по следующим параметрам: '
1) В реакции непрямой иммунофлаоресценции окрашивали цитоплазматичео-кую мембрану живых инфицированных клеток ВНК и не окрашизали фиксированные ацетоном клетки.
2) Гибридомные клетки при введении под кожу мышам линии ВА1В/с за 6-7 дней до их заражения в мозг в дозе > 1000 ЛД^ вирусом "Внуково-32" защищали 100% животных.
3) Асцитические жидкости, содержащие МКА, обладали'высокой вируснейтрализующей активностью в разведениях 1:^00-1:2000, в особенности клон МКА IC5, который в реакции с гомологичным и гетерологичным вирусами имел индекс нейтрализации, равный 7,34 и 5,0lg ЛД^ соответстпенно. МКА Е6 и ВЦ не нейтрализовали гетерологичный вирус штамм CVS .
4) МКА у мышей, предварительно зараженных внутримышечно абсолютно смертельной дозой вируса, оказывали значительно более выраженную защиту, чем антирабический иммуноглобулин (АИГ). Так, АИГ в разведении
1:26 (200 ME/кг массы тела), введенный через 2-3 часа после заражения, защищал 50% животных. Тогда как клон МКА I-C5 защищал 100$ животных в разведении 1:160, 76$ в разведении 1:480 и 36$ в разведении 1:1440. Применение АНТ в той же дозе через 24 и 48 часов после зара-*>оюи только удлиняло инкубационный период, но не защищало животных. Тогда как МКА в разведении 1:40 в эти же сроки оказывали выраженный защитный эффект (82-67$ соответственно).
У1.4. Характеристика гибридом, продуцирующих МКА к нуклеокапсидному комплексу вируса бешенства. В результате слияний и скрининга были получены и проанализированы около 400 клонов гибридом, продуцирующих МКА к нуклеокапсидному комплексу вируса бешенства. Отобраны были 7 клонов гибридом (А7, CI, Ell, A4, Н2, Н5,' F7 и А2), которые имели следующие характеристики:
1) МКА. в реакции непрямой иымунофлюоресценции (НЙ5) окрашивают внутриклеточные цитоплазматические включения в фиксированных ацетоном препаратах отпечатков тканей мозга инфицированных мышей или клеточных культур и не окрашивают живые, не фиксированные ацетоном клетки. Титры AT в НИ5 достигали 1,6.10^.
2) МКА (Ell, Н2) не оказывали лечебного эффекта при их введении инфицированным животным. Другие клоны el и A4 защищали 50$ инфицирован-•ных животных в разведении не выше 1:18,
3) Не обладали вируснейтрализующей активностью.
4) В реакции непрямого имыуноферментного анализа (НИЗА) МКА реагировали с цельным вирионом адсорбированным на планшетах, но не реагировали с очищенным гликопротеидом. Титры AT в HHSA достигали.?5,0.10^.
5) МКА не реагировали с нуклеокапсидными антигенами в отпечатках мозга мышей, зараженных неродственным рабдовирусом - вирусом везикулярного стоматита и флавивирусом клещевого энцефалита.
Проведенные, выше критерии свидетельствуют о строгой специфичности МКА CI, Ell, A4, Н2, Н5, Р7, Ä2 и А7 к нуклеокапсидному комплексу.
Получение панели МКА к гликопротеину и нуклеокапсидному комплексу вируса "Внуково-32" позволило -перейти к следующему этапу - исследованию антигенных взаимоотношений штамма "Внуково-32" с представителями вирусов группы бешенства основных экологических ниш, циркулирующих на территории РФ и стран СНГ (из них 17 штаммов любезно предоставлены
доктором А.Д.Бствинкииым), е лиссалодсбными вирусами, а также лисса-вирусами "европейских летучих мышей штаммы "Юли" и "Stade ", лзо- • безно предоставленные доктором А.Г.Татаровым и доктором А.Д.Ботвин-киным.
У1.5, Взаимодействие МКА к нуклеокапсидному комплексу (НКК)
вируса бешенства, штамм "Внуково-32", с вирусами группы бепенства в реакции непрямой иммунофлаоресценции (НИФ),
На основании результатов, представленных в таблице 9, можно зак-люмить, что моноклональные антитела к нуклеокапсидному комплексу (А2, CI, A4, Н2, Ell, РГ, Н5) у 59 штаммов вирусов группы бешенства узнают 3 антигенные (АГ) детерминанты, условно обозначенные А, В, С: I) АГ детерминанта "А" (МКА F7 и А2) является общей для всех исследованных вирусов группы бешенства. Вторая АГ детерминанта "В" (МКА CI, А4,.ЕИ, Н2) также является общей для исследованных лиссавирусов, за исключением вируса "Юли". Третья АГ детерминанта "С" (МКА Н5) отсутствовала у вируса "Юли" и частично представлена (на 1+ по 4х- + шкале) у вирусов "лиса 15", "лиса 48", "Як", "собака" и у 5 штаммов вируса "дикования", выделенных от песцов в Якутской АССР.
Интересно подчеркнуть, что АГ детерминанта -"С" полностьэ представлена у двух вирусов "дикования" Д-2К и Д-42, выделенные на полуострове Ямал. В заключении можно отметить, что штамм "Юли" по выявленным антигенным детерминантам "расположен" дальше от ртамма "Внуково-32" и штаммов уличного вируса, чем африканские лиссаподобные вирусы.
У1.6. Взаимодействие МКА к гликопротеидному белку вируса "Внуко-во-32" с вирусами группы бешенства в реакции нейтрализации на мышах массой 7-8 г.
Вышэ было показано, что МКА IC5 в высокой степени нейтрализовал как гомологичный, так и гетерологичный, а МКА Еб и BII нейтрализовали только гомологичный вирусы. В связи с этим важно было выяснить, как взаимодействуют МКА IC5, Еб и BII с другими штаммами вирусов группы бешенства. Результаты исследований (табл. 10) показывают, что:
А) Все 3 МКА четко отличаются друг от друга по количеству штаммов, с которыми они взаимодействуют. Эти данные указывают на специфичность выявляемых МКА антигенных детерминант.
Таблица 9.
Взаимодействие МКА к нуклеокапсидному комплексу (НКК) вируса . "Внуксво-32" о вирусами группы бешенства в реакция НИФ
Вирус;.' t\oa- Название ! ооозначение wmA
во шт . штаммов ¡да ! PV} CX J A4 f H2 ■Ell , H5
Фиксированные вирусы 2 Внуково-32 ' ' ! ' i 1 !
2í4uryleр,Flury Нер ! ! ! t
6 лиса ' ! • t | 1 1 .. ..
4 корсак ¡ Í l ! i ■ 1
2 ! i корова , ! ¡ ! ! 1
2 кошка i . j ! j ! ! • I
Уличные 2 волк ! ' ! i i ! •
вирусы бешенства 3 енотоведн. | собака , ! i : ! ! ! 1
6 ' лиса i ! ! 1 1
2 ' i лет.мьшь i j ¡ ' } . i !
2 лиса 15. 48 ! j 1 ! ! XXX
2 "Як", собака' I i i ! XXX
"Аркт.бе- Якутия 7 Песцы №1-7 ' 1 i i XXX
шенство ¡¡^ 2 Д-2К, Д-42 ' ; ! ! J
ОЭМч 5 св. мам.-, ; ; . 288, 289¡Pe3Í ! ! ! r 1 ! -—•
Бешенство мышей Центр.Европа 6 № 3-8 1 ¡ 1 1 . - • ? 1 i i
Бешенство- I Lagos bat j j. I ! ! (
подобные I Molcola , j 1 ! ! »
Африка I Duvenhage ■ | ¡ ¡ ! ! i i
Лмссавкрус европейских летучих мышей Кэссия I "Юли" ] ! 1 i i , ! jxxxzpíooí xxxx ! . ' i 1 bocxx i ! I л. xxxx
Антигенные детерминанты j д р" 3 i q
СЗ - полное взаимодействие ; хххх - МКА не взаимодействуют, ххх - взаимодействуют частично.
Таблица 10.
Взаимодействие в № на мышах 3-х МКА к белку С вируса "Внуково-32" с различными представителями лиссавирусов
»» серо-типа Субгруппа вирусов Кол-штам MOB во Обозначение - штамма представителя Титр • »пруса %0 МКА, ралиг индекс нейтт Антигенная группа
IC5 Е6 ВЦ
вакцинный вирус I Внуково-32 7,0 6,3 5,4 4,8
I Волк 5,17 4,8 4,46 3,83
уличный вирус г . 2 Лиса-48 Фрол 6,78 4,75 4,46 2,95 4,28 2,43 4,28 2,38
2 Собака 5,68 4,00 2,65 3,18 I
ОЭМч 3 СВ . 7,38 5,31 4,88 4,0
I "Аркт. бешенство" Якутия б Д-П25 4,7 3,38 3,38 3,2
"Артк. бешенство" п-ов Ямал .2 . Д-42 . 6,32 5,32 5,0 2,82
вакцинный вирус I Flury Lep 5,15 3,83 4.0 0 . П .
ОЭМч I "Резник" 7,5 4,87 4,67 0
лиссавирус европ.лет. I "ВлииХ 3,68 3,68 0 . 2,00 ш .
мышей 3,0 3,0 0 1,83
вирус фикс. I 6,5 5,13 0 0
бешенство мышей Центр.Евр. 4 W1 6,5 5,0 0 0 1У
П Бешенство-подобные I Lagos bat 7,12 4,67 0 0
ш вирусы I Uokola 4,34 0 0
1У I Duvenhage 6,87 5,34 0 0
Представлены результаты двух опытов,
В) Включенные в исследование штаммы вирусов в свою очередь отличались по количеству fJKA, с которыми они взаимодействовали. Этот факт свидетельствует о степени гомологии антигенных детерминант (АГ), расположенных на гликопротедце вируса "Внуково-32" и изучаемых вирусов. По этому признаку исследованные штаммы вирусов были разделены на 4 группы (табл.10). К первой группе относятся 19 (большинство) аз 30 исследованных вирусов, котсрые реагировали со всеми МКА, т.е. отмечалась полная гомология АГ детерминант, циркулирующих на территории И штаммов вируса бешенства с вирусом "Внуково-32". Ко П-ой группа относятся 2 вируса Flury Lep и "Ройник", у которых отсутствует одна АГ детерминанта, выявляемая МКА. ВН. В 3-ью группу входит один вирус "Ели", у.которого отсутствует АГ детерминанта, выявляемая МКА Е6, Относительно невысокий гадекс нейтрализации вируса "Юли" с МКА BII связан с исходно низким титром вируса 3,68 и 3,0 ДЦдд.
Следует отметить, 'что уровень ненейтрализации в 1,17 и 1,68 lg ДЦ^д для штамма "Или" сравним с уровнем ненейтрализации для вирусов "Фрол" и Д-П25 - 2,37 и 1,5 ДД^ соответственно. Кроме того, ваяно отметить, что вирус "Юли" во всех 3-х опытах полностью нейтрализовался антирабическиы гамма-глобулином (АГГ) в разведении 1:20 и 1:160, тогда как контрольный уличный вирус штамм "Зрол" нейтрализовался АГГ з этих же разведениях в 3,34 и 2,0 ЛД5д при титре вируса в 5,5 и 5,3 lg Таким образом, на основании представленных материалов,
антигенная структура белка С вируса "Или" принципиально не отличалась от других вирусов 1-ой серогруппы. Вместе с тем,, по антигенам нуклео-калсидного комплекса вирус "Юли" резко отличался от всех исследованных вирусов. . ■ ' .
К 1У-ой группе вирусов были отнесены вирусы мышевидных грызунов, бешенствоподобные вирусы и штамм cvs . Эти вирусы нейтрализовались только одним МКА IC5, т.е. имели только одну АГ детерминанту из трех выявленных у штамма "Внуково-32". Исходя из этих данных, использование вируса cvs для определения иммуногенности вакцины, приготовленной из штамма "Внуково-32", не. является оптимальным. Гомологичный вирус, на наш взгляд, является наиболее адекватным тест-вирусом для определения иммуногенности.вакцины.
Другим важным результатом проведенных исследований является выявление практически полной гомологии АГ детерминант НКК и белка С
вируса "Внуково-32" с пятью штаммами вируса ОЭМч, а также отсутствие АГ различий вирусов ОЭМч от других штаммов вируса бешенства (табл.9, 10). Аналогичные результаты были получены ранее с двумя итаммаш вируса ОЭМч "СВ"-"Резник" с помощью панели МКА Института Вистар, США ( Wiktoi е.в, 1980). Все эти данные позволяют ставить вопрос об экспериментальной проверке возможности терапии больных ОЭМч современной и высоксиммуногенной культуральной вакциной из штамма "Внуково-32", вместо применяемой в настоящее время мозговой вакцины, приготовленной из штамма "Резник".
В заключении необходимо отметить, что в результате получения ЖА к АГ детерминантам НКК и белку С вакцинного вируса "Внуково-32" соз- ■ дан тонкий инструмент иммунологической экспертизы, который позволит определить причину смерти людей, получивших своевременный и полный курс антирабического лечения путем определения степени гомологии АГ детерминант вакцинного и "дикого" вирусов, открывает новые возможности для диагностики и идентификации вирусов группы бешенства.
У1.7. Получение гибридом, декретирующих МИД к иуклеокапсидному
комплексу лиссавиоуса европейских летучих мышей штамм "Юли".
Род лиссавирусов охватывает представителей 4-х серотипов. Для идентификации этих вирусов получены МКА (502-2,422-5 и др.), позволяющие классифицировать выделенные штаммы вирусов ( wiktor е.а. ,1978).
Вместе с тем, в последние годы появился ряд сообщений о выделении лиссавирусов от летучих мышей в Европе, которые по антигенной структуре нуклеокапсидного комплекса были сходны с вирусом Duvenhege серотип 4 ( Schneider Ь. , 1982). Эти вирусы в антигенном отношении рассматриваются как европейский вариант вируса Duvenha^e и получили название лиссавирусы европейских летучих мыпюй (ЛЕЯМ). Аналогичные вирусы были вьщелены в европейской части бывшего СССР, в частности, в Pi ( Selimov е.а. , 1989). Поэтому проблема идентификации ЛЕЯМ для Pi является весьма актуальной. Для этой цели нами были получены 8 стабильных гибридом, секретирующих МКА к иуклеокапсидному комплексу ЛЕШ штамм "Юли". Из них 4 клона были отобраны для дальнейшего исследования в сравнении с 3 МКА (А4, CI и EII) в реакции непрямой иммунофлюоресценции с 59 вирусами.
Из табл. II видно, что МКА В6 и BI2 положительно реагировали
Таблица II.
Взаимодействие МКА к нуклеокапсидному комплексу вирусов бешенства "Юли" и "Внуково-32п с вирусами группы бешенства в реакции непрямой иммунофлюоресценции
Кол- во Название Обозначение МКА
штам мов штаммов п. DO BI2 П Г2 А4 EII CI
Фиксированный вирус 2 Внуково-32 0VS хххх хххх ; хххх хххх
2 Flury Lep Plury HEP хххх хххх хххх хххх
I "ФролЧчел.) хххх хххх
3 енотовидная собака хххх хххх
8 лиса хххх хххх
Уличный вирус 2 барсук XXX XXX
2 кошка ХХХХ хххх
4 корсак хххх хххх
2 лет.мышь хххх хххх
2 корова хххх хххх
3 корсак хххх хххх
2 собака хххх хххх
"Аркт.бешенство" Якутия 7 п'есцы 1-7 хххх хххх
Уличный вирус I суслик хххх хххх
"Аркт.бешенство" п-ов Ямал 2 песцы Д-2Й7 Д-42 хххх хххх
ОЭМч 5 СВ. Рез.,Мам, 28Й, 289 хххх хххх
Беш-во мышей, Центр.Европа 6 № 3-8 хххх хххх
Бешенство-подобные, Африка I хххх хххх
I И око 1а хххх хххх
I Duvenhage
Лиссавирусы R5 I "Юли" хххх хххх хххх
европ.лет. рпгма_т мшей 1 S tade хххх хххх хххх
Антигенные детерминанты А В . с
а - полное взаимодействие МКА ; хххх - МКА не взаимодействует ; ххх - МКА взаимодействует частично.
со всеми лиссавирусами и по-видимому выявляют общую антигенную детерминанту для всех вирусов группы бешенства. Шесте с тем ЫКА Г1 и Г2 взаимодействовали положительно только со штаммами "Ши" и " stade " лиссавируса европейских летучих мышей, а также с вирусом Duvenhage (4 ссротип).
Таким образом, МКА Г1 и Г2, по-видимому, обладают строгой специфичностью и могут служить в качестве кандидатов для создания препарата с целью диагностики и идентификации лиссавируса европейских летучих мышей.
ïïiktoE е.а. (1978) обнаружили 2 общегрупповые антигенные детер-
минанты: 502-2 - общая антигенная детерминанта для всех лиссаьирусов и 422-5 - общая для лиссаподобных вирусов (2-4 серотип), позволяющие классифицировать лиссавирусы.
Важно отметить, что все три МКА A4, CI и Ell к нуклеокапседному комплексу вируса "Внуково-32" положительно реагировали со всеми вирусами группы бешенства, в том числе с вирусами 2, 3 и 4 серотипов, за исключением вирусов "Вли" и " stade", Германия, прототипа ЛЕЛМ. Таким образом, нами установлена новая общегрупповая антигенная детерминанта, представленная МКА A4, CI и ЕП и позволязщая классифицировать новые антигенные варианты. Эти результаты указывают на то, что у лиссавируса европейских летучих мышей отсутствует такая общая, может быть, фундаментальная антигенная детерминанта, присущая представителям лиссавирусов всех 4-х серотипов. Этот факт, а также отрицательная реакция штаммов лиссавируса европейских летучих мышей с МКА 402-5 ( Schneider L. 1982? Ботвинкин и др., 1990), квляюцимся ' маркером для всех лиссаподобных вирусов, е том числе для вируса Duvenhage ( Wiktor с.а. , 1978), свидетельствует о том, что
ЛЕЯМ, несмотря на антигенную связь с вирусом Duvenhage ( Emith 1989), существенно отличается от последнего и может быть выделен в самостоятельный серотип.
У1.6. Использование МКА пля создания нового поколения препаратор и тест-систем для экспресс-диагностики и идентификации лиссавирусоз.
Получение МКА к общей детерминанте нуклеокапсидного комплекса вирусов группы бешенстьа позволяет разрабатыглть препараты и имыуно-ферманлыа тест-системы на основа "коктейля" МКА длл экспресс-диаг-
ностики и идентификации вирусов группы бешенства. Нами разработан препарат моноклоналький, дшинесцирущий, мышиный, сухой для диагностики бешенства, успешно прошедший предварительные испытания. НТД передана в ГИСК ии.Д.А.Тарасовича. В настоящее время, на основе ЙКА к гллкопротеину вакцинного вируса "Внуково-32" успешно разрабатываются иммуноферментные тест-системы для оценки качества полуфабриката антирабической вакцины на промежуточных стадиях производства, а также количественного определения гликопротеина в готовой антирабической вакцине.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. Исследование фундаментальных биологических свойств штаммов уличного вируса бешенства показало, что широкая вариабельность и многообразие биологических проявлений вируса бешенства свидетельствует
о его генетически детерминированной пластичности в системе экологических связей, которые обеспечивают устойчивый механизм сохранения вируса на протяжении тысячелетий.
2. Открыт феномен гетерогенности популяции штаммов уличного вируса бешенства. Установлено, что популяция штамма вируса может состоять из 1-го, 2-х или 3-х биологических вариантов, отличающихся друг от друга по уровню накопления вируса в мозгу, скорости его репродукции, продолжительности периода инкубации и клиники, а также по клинической картине болезни. Этот новый факт, впервые с научной точки зрения объясняет: I) широкую вариабельность биологических свойств вируса и различных форм бешенства (буйная, паралитическая и др.), а также формирование экологических вариантов, которые эволюционно в процессе пассажа от животного к животному (или в рамках одного вида) могли образовать популяции штаммов, различные по составу и по количеству биологических вариантов ; 2) феномен "фиксации" штаммов уличного вируса в процессе последовательных пассажей, как результат селекции паралитического варианта из состава популяции вируса, а также другие явления.
3. Экспериментально обоснована возможность развития не только острой,летальной, но и различных неклассических клинических форм бешенства: абортивной, хронической и возвратной. Впервые дана вирусологическая, патоморфологнческая (+ морфогенез) и иммунологическая
характеристика неклассических форм бешенства. Раскрыт решающий фактор механизма становления хронического бешенства.
4. Продемонстрированная нами универсальность воспроизведения абортивного бешенства на различных ведах животных, в том числе собак и диких плотоядных, при различных методах заражения, в том числе внут-римозговом, с использованием как высоколатогенных классических штаммов уличного вируса, так и аттенуированных, большими дозами мозговой взвесью вируса, так и' малыми дозами (8 ДЦад) взвесью слюнных желез . корсака, прямые доказательства специфичности процесса, наконец, три документированных случая выздоровления людей от бешенства свидетельствуют о возможности абортивного исхода бешенства не только в природе, но и у людей.. '
5. Впервые установлены закономерности развития вакцинального иммунитета. . Определены принципы . построения оптимальной схемы прививок. Эффективность иммунизации определяется силой грундиммунитета (I), интервалом между подготовительной иммунизацией и последующей инъекцией вакцины (П), а также анти-. генной силой разрешающей Инъекции вакцины (111).
6. Установлено, что клон иммунологической памяти Т-эффекторов формируется к 30 дню и сохраняется неопределенно долго (406 дней). Этот новый факт, а также вторичный характер иммунного ответа на введение антигена с 30 по 406 день позволило рекомендовать научно-обоснованные схемы профилактических и повторных антирабических прививок.
7. Па основании изучения зависимости напряженности иммунитета от способа и зоны аппликации вакцин рекомендованы внутримышечный и внутрикожный методы введения вакцины как значительно более эффективные по сравнению с различными зонами подкожного метода иммунизации.
8. Обоснована возможность альтернативного метода профилактики бешенства путем коьйинированного применения индукторов интерферона или бактериальной FHK-азы и антирабической вакцины.
9. Экстренная профилактика бешенства как специфическими, так и неспецифическими противовирусными препаратами (независимо от механизма их действия) может бить осуществлена только на уровне ворот инфекции. Из этого положения следует, что всю рекомендованную дозу антирабического иммуноглобулина (а также альтернативных препаратов) необходимо инфильтрировать в ткани окружающие инфицированную рану.
10. Впервые получены и охарактеризованы моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства штамм "Внуково-32" и к лисса-вирусу европейских летучих (ЛЕЯМ) мышей штамм "Оли". На основе МКА
к нуклеокапсидному комплексу разработан препарат моноклональний, лшмесцирующий для экспресс-диагностики вирусов группы бешенства. Установлена полная гомология антигенных детерминант вакцинного вируса штамм "Внуково-32" и штаммов уличного вируса, циркулирующих на территории бывшего СССР.
11. Впервые выявлена группоспецифичная антигенная детерминанта нуклеокапсидного комплекса (ККА. /.1, CI и Ell), присущая всем четырем серотипам вирусов группы бешенства, за исключением лиссавирусов европейских летучих мышей. Кроме того получены 2 клона ШСА специф'г-шыз только для нуклеокапсидного комплекса ЛЕЕМ и антигенно связанного с ним вируса Duvenhage . Перечисленные клоны MU образуют систему двойной надежности для индикации и идентификации лиссавирусов европейских летуч1вс мыией, а также классификации шовь выделенных лиссавирусов.
Основные публикации по итогам работы:
1. Грибенча C.B., Селимов М.А. Адаптационная характеристика штаммов уличного вируса бешенства. - Симп. по бешенству. Матер.ХУЛ научн.ко сессии ШВЭ, Ii., 1972. - с.101-104.
2. Грибенча C.B., Селимов М.А., Дшухадзе В.А. Изменив антигенных взаимоотношений между штаммами уличного и вакцинного вируса бешенства. - Там же. - Ii. - 1972. - с. 104-106.
3. Грибенча C.B., Селимов М.А,- Патогенность штаммов уличного вируса бешенства "диковани'я" при подкожном заражении мышей. - Там же. -M. - 1972. - с. 107-109.
4. Селимов Ü.A., Шосайловский Е.М., Грибенча C.B. Эпизоотическая ситуация и состояние антирабических прививок в СССР. - Там же. - М,-1972. - с.75-79.
5. Селимов М.А., Михайловский Е.М., Грибенча C.B. К эпидемиологии заболеваемости гидрофобией в СССР за I964-I97I гг. - Там же. - М,-1972. - с.79-82. '
6. Грибанова Л.Я., Грибенча C.B., Селимов М.А. Изучение некоторых биологических свойств штаммов уличного вируса. - Там же. - M.-I972.-c.II5-II8.
7. Грибанова JI.Я., Грибенча C.B., Селимов М.А. Патогенность для крыс штаммов уличного вируса бешенства, выделенных из природного очага. //Симп. по бешенству. Мат. ХУЛ научн.сессии ИПВЭ. - М. -1972,-С.118-121.
8. Джмухадэе В.А., Селимов М.А., Грибенча C.B. Некоторые биологические свойства штаммов уличного вируса бешенства, выделенных из природного очага в Груз.ССР. /Дам же. M. - 1972. - с.ИО-112.
9. Джмухадэе В.А., Селимов М.А., Грибенча C.B. Патогенность ютам мов уличного вируса бешенства, выделенных из природного очага в Груз, ССР для лабораторных животных. //Симп. по бешенству. Мат. ХУЛ научн. сессии ИПВЭ, М., 1972, с.112-115.
10. Дисмухадзе В.А., Грибенча C.B. Изучение некоторых генетических признаков вируса бешенства. //Кн. "Вопр.общей вирусол,", Ы.,
1971. - с.95-96."
11. Джмуха дэе В.А., Грибенча C.B. Изучение уличного вируса бешенства, выделенного в природном очаге. /Д. "Ветеринария". - Ы.-
1972. - с.49-50.
12. Грибенча C.B., Селимов U.A., Первиков C.B. Нелетальное бешенство у белых мышей, зараженных различными штаммами уличного вируса. /
В кн."Акт.вопросы вир.инфекций". Алма-Ата. - I0-II.X.I973, - с.144-146.
13. Грибенча C.B., Селимов М.А. Влияние места введения антира-бической вакцины на формирование антирабического иммунитета. /Д.Бюл. экспер.биологии и мед. - M. - 1972. - »6. - 0.81-64.
14. Дчсмуха дзе В.А., Селимов М.А., С&фаров Р.К., Грибенча C.B. Сравнительное изучение штаммов уличного вируса бешенства "городского" типа и штаммов, выделенных из природных очагов. /Д.Вестник с/х наук. -Баку. - 1974. - №1. - с.24-29.
15. Gritenoha S.V. »on-fat&l гаЪ1вв in ubite aiot. ÎAna. tüorobiol. " Pari», 1975, 125A, 2, р.227-1ЭЭ.
16. Грибенча C.B., Селимов М.А., Грибанова Л.Я. Изучение штаммов вируса бешенства, циркулирующих в природе. //"Вопр.вирусол.* И. - 1974. - »6. - с.700-704.
17. Грибенча C.B., Зубри Г.Л., Савинов А.П. Абортивное бешенство в эксперименте. //В кн.:"Вопр.мед.вирусологии". М.~ 1975. - с.484-485.
18. Грибенча C.B., Овсянникова H.B. Развитие вирусной инфекции при абортивной и летальной форме рабической инфекции. //В кн.:Вопр. мед.вирусологии". - M. - 1975. - с.485-486.
19. Grlbeneha S.V. Atortiae rabies la rabbits and white rats llLTected intracerebraly. Arch, of virology, 1975, 49, p.31?-322
20. Грибанова Л.Я., Мальков Г.Б., Рудаков В.А., Грибенча C.B. Абортивное бешенство у диких животных в эксперименте. //В кн."При-родноочаговые антропозоонозы". -■ M. -1976. - с.64-65.
21. Грибенча C.B. Абортивная и бессимптомная форда рабической инфекции (обзорная). /ДМЗИ. - 1976. - MI. - c.II-16.
22. Грибенча C.B., Овсянникова Н.В. Интенсивность размножения вируса при абортивном бешенстве. //"Вопр.вирусол." - M.- 1976.-!í6.-с.692-696.
23. Грибенча C.B., Королев М.Б., Стефанов С.Б. Хроническая раби-ческая инфекция у мышей, зараженных в мозг уличным вирусом. //Вопр. вирусол. -M. -1977. - №2. - с.147-151.
24. Грибанова Л.Я., Рудаков В.А., Грибенча C.B. Абортивное бешенство у диких животных в эксперименте. //В кн."Вопр.природной очаговости болезней". -Алма-Ата. -1979. -с.183-184.
25. Грибанова Л.Я., Мальков Г.В., Грибенча C.B. и др. Определение чувствительности к вирусу бешенства некоторых диких, домашних и лабораторных животных. //В кн."Совр.методы в изучении природно-очаго-вых инфекций". Л. -1979. - с.28-33.
26. Gribencha S.V., Vanag К.A., Obukhova V'.H., Shubladze А.К.-Experisental studies of chronic rabies. Ann. virol (inst. Pasteur),
1900, 131, 302-312.
27. Ванаг К.А., Грибенча C.B., Горшунова Л.П. и др. Патоморфо-логия абортивного бешенства._//Вопр.вирусол. - I9S.I. -I. - с.ПО-114.
28. Грибенча C.B., Ванаг К.А., Баринский И.Ф. Получение двух биологических вариантов вируса бешенства из одного штамма. //Вопр, вирусол. -1981,- КЗ.- с.315-318.
29. Грибенча C.B., Ванаг К.А., Баринский И.2. Иммунный ответ при экспериментальном бешенстве. //Вопр.вирусол.-I98I. -,Jí5. -с.601-604.
30. Gritenoha S.V.Vanag К.А.,Баг1пвку I.?.-Separation of 2 street reblas staain populations into two biological variant*.Acta
31. rpwfeíwá Изучение лечебного действия сочотанкого применения дс-FitK и вакцины у мышей зараженных уличным вирусом бешенства. //Сб. "Индукторы интерферона". И. - 1982. - с.140-146.
32. Баринский И.Ф., Грибенча C.B., Моисеев В.П. Сравнительное изучение лечебного эффекта некоторых индукторов интерферона при экспериментальной рабической инфекции. //Сб."Индукторыинтерферона.-М.- 1982. - с.146-147, .
33. Грибенча C.B., Баринский И.О. Влияние циклофосфана на воспроизведение с эксперименте абортивной и хронической форм бешенства.. //Вопр.вирусол. -1982. - If à. - с. 74-77.
34. Грибенча C.B., Ваяаг К,А., Баринский И.¡6. Изучение биологических вариантов популяции ряда втаммоэ уличного вируса бешенства. //Вопр.вирусол. -1982. - Кб. - о.98-103.
35. Oribenoha s.V.,3erinsky I.P.-Viremia'in rabies-Act* Tirol
1982,26001. -
36. Грибенча C.B., Игнатьев Г.M., Ершов S.И., Бариксккй И.fi. Иммуноадьевантное действия ицдуктора интерферона дс-ШК на вакцинальный антирабический иммунитет, //Сб.*Иммунобиолог.препарата. - Уфа,-1903. - о.79-80.
37. Грибенча С.Е,, Ершов fi.И., Баринский И.й. -Оффектиакость о-гв-честасшого индуктора интерферона. дс-ЖК и тактика его применения лря экспериментальной рабической ш¡фагами. //Там ¡»е. - с.81-82.
38. Грибенча C.B., Носик H.H., Ершов S.U. Использование кнд)-¡.гора инторферона для иммунопрофилактики бешенства. У/Сб.Ащирир.ггч-Ба.-Нинск. -1903. - с.IIO-III.
39. Баринский , Грибеича C.B., Нсси.у. H.H. и др. Срапнитсльно« изучение дингакки развития резистентности у иье эй к уличному вирусу Сешенства при сочетанием гаедении индуктора интэрфвроиа дс-РНК и вакцины или гамма-глобулина. //Сб."Антигир.вез-ва. -Минск,-1933. -с.112. '
40. Oribenoha S.V. »Barineky I. P.-Pc pula ti on etruoture of «oiría sreot rabie® virus strfeinE.Rablsa Information. Exchange 1903, 82, p. 31-32
41. Грибенча C.B., Носик H.H., Ершов Ф.И., Баринский И.О. Профилактическая и лечебная активность индуктора интерферона у ышйй, зараженных в ыозг уличным вирусом бешенства. //Вопр.вирусол. -1983,-»I. - C.7I-74.
42. Грибекча C.B., Носик H.H., Ершов Ф.И., Баринский И.й. Эффективность дс-FHK как индуктора интерферона при внутримышечном заражении иышей уличньм вирусом бешенства. //Вопр.вирусол. -1983. -£2. - с.232-235.
43. Ершов С.И., Баринский И.®., Подчерняева Р.Я., Грибенча C.B. и др. Иммуностимулирующий эффект индукторов интерферона. //Вопр. ви-руоол. - 1983. М. - 0.74-79.
44. Грибенча C.B., Носик H.H., Ершов ¡5.И. и др. Лечебная активность комбинированного применения индуктора интерферона и вакцины при экспериментальном бешенстве. //Вопр.вирусол. - 1983. №5. - о.590-694.
45. Баринский И.Ф, Грибекча C.B., Носик H.H. и др. Сравнительно» изучение динамики развития резистентности у мышей к уличному вирусу бешенства при сочетанием введении индуктора интерферона дс-FHK и вакцины или га!зш-глобулкна и вакцины. //Сб.Антивир. вещ-за.-Минск.-Беларусь. - 1984. - с,127-131.
46. Грибекча-C.B., Попова О.М., Игнатьев Г.Ы. и др. Изучение байтного действия индуктора интерферона дрожжевой дс-РНК в опытах на мышах, зараженных вирусами бешенства и клещевого энцефалита. //Сб. "Антивир.вещ-ва". -Иинск. -1984. - с.71-72.
47. Грибенча C.B., Носик H.H., Ершов Э.И. Влияние индуктора интерферона двуспиральной РНК на развитие вакцинального антирабическо-го иммунитета. //Вопр.вирусол. -1984. - №2. - с.223-227.
.. 4Б. (Jribenoha S.V.,Popova O.II.,Ignatiev О.М. е.a.-étudiée et the protective end immunoetimuletive effects of the de-RNA ae ал interferon" induoer on nioe infected wi.th rabies virus.-Rabies infornation Exchange,1984,N11,p.17-18,USA,Atlanta.
49, Грибенча C.B., Игнатьев Г.М., Амитина H.H. Влияние некоторых иммуноыодуяяторов на гуморальный антирабический .иммунитет. //Вопр. вируссл. - 1985. - »2. - O.I9&-200.
50. Баринский И.Ф., Грибенча C.B., Игнатьев Г.М. и др. Влияние некоторых кымуноиодуляторов на напряженность вакцинального анткраби-ческого иммунитета. //Вопр.вирусол. -1985. *2. - о.163-185.
51. Грибенча C.B., Игнатьев Г.M., Киркин А.в. Сравнительное изучение клеточного и гуморального иммунитета, а также резистентности к вирусу бешенства при антирабической вакцинации. //Вопр.вирусол. -1985. !f3. - с.358-352.
52. Колотвина П.В., Грибенча C.B., Касаткин В.В, Экспериментальное изучение эффективности кнактивированной КАВ в зависимости от активности и схем применения. //Акт.проблемы мед.вирусологии. -М,-1985. - Ç.I6I.
53. Грибенча C.B., Игнатьев Г.М., Баринский И.Ф. Изучение клеточного иммунитета при антирабической иммунизации. /Дам же. -с.163-164.
54. Игнатьев Г.М., Бычкова E.H., Грибенча C.B. и др. Штамм вируса острого энцефаломиелита человека "Резник", используемый для приготовления кнактивированной вакцины. //А/с I? I2352I8 I.П.1986г.
55. Грибенча C.B., Киселева A.C., Баринский И.О. Изучение ин ви -во защитного действия слленоцитов мьягей линии СВА, иммунизированных инактивированной неконцентрированной антирабической вакциной. //Вопр. вирусол. - 1986. - Jf6. - с.691-694.
56. Игнатьев Г.М., Тазулахова Э.Б., Грибенча C.B. Етияние некоторых иммуностимуляторов на поствакцинальный иммунитет при экспериментальной инфекции, обусловленной вирусом острого энцефаломиелита человека. //Сб. Антивир.аещ-ва при экспер.терапии вир.инфекций. -Минск.- 1986. - с.94-97.
57. Грибенча C.B., Баринский И.О. Разработка в эксперименте принципов построения оптимальной схемы прививок инактивированной культуральной антирабической вакциной. //Вопр.вирусол. -1987. - Н. с.487-492.
58. Игнатьев Г.М., Грибенча C.B., Воробьева U.C. и др. Сравнительное изучение в эксперименте эффективности двух схем иммунизации вакциной против острого энцефаломиелита человека. //Вопр.вирусол.-1988. !'2. - с.232-235.
59. Грибанова Л.Я., Грибенча C.B., Мальков Г.Б. и др. Противовирусная активность дроюсевой дс-FHK при экспер.инфекции, обусловленной вирусом острого энцефаломиелита человека. //Вопр.вирусол.-1988. №2.-с.201-206.
60. Грибанова Л.Я., Грибенча C.B., Мальков Г.Б. и др. Изучение биологических свойств вариантов уличного БИруса бешенства. //Вопр.
вирусол. - 1988. - »2. - с.201-206.
61. Сербии A.B., Стоцкая Л.Л., Крендель Б.А., Грибенча C.B. Сополимеры на осноЕе фурана и калеинового ангидрида и перспективы
их использования в медицине. //В сб. "Пол!П^еры мед.назначения,АН СССР, И.ч-т нофтехим.синтеза. - M. - 1988. - с. 127-133.
62. Грибенча C.B., Ревенко Н.Г,, Баринский И.¡5. Влияние ежедневной иммунизации и антирабического глобулина на формирование иммунных Т-киллеров у линейных мышей, зараженных уличным вирусом бешенства. //Вопр.вирусол. - 1988. №. - с.576-580.
63. Грибенча C.B., Грибанова Л,Я., Мальков Г.Б., Беринский И.5. Абортивное и возвратное бешенство у собак, зараженных в мозг уличным вирусом бешенства. //Вопр. вирусол. - 1989. - '."2. - с. 217-221.
54. Грибенча C.B., Баринский И.О. Изучение в эксперименте закономерностей индукции Т-киллеров при антирабической иммунизации. //Вопр.вирусол. - 1989. - №3. - с.325-330.
65. Gribencha S.V..Gribanova L.Ya.,Malkov G.B..Barinaky I.P. Population structure oí some street rabies virus atraina-Arch.vi: rol.(1989) 104047-350.
66. Свешников. П.Г., Грибенча C.B. Моноклональные антитела к гли-копротеину вируса бешенства обладают протективным действием.//I Всесоюзный съезд иммунологов (Тезисы). - 1989г. - Сочи. - с.171.
67. Грибенча C.B., Фуралев В.А., Кяюшник C.D. Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для получения монокло-нальиых антител к гликопротеидному структурному'белку вируса бешенства. // А/с JS> 1631072. - M. - 1990.
68. Грибенча C.B., Василенко О.В., Клюшник C.D. и др. Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для получения мо-ноклональных антител к нуклеопротевдному структурному белку вируса бешенства. // А/с. » I63I073. - M. - 1990.
69. Колотвина П.В., Грибенча C.B., Касаткин В.В., Романова Л.Н. и др. Изучение эффективности культуральной антирабической вакцины на морских свинках, предварительно зараженных уличным вирусом бешенства. //МЭИ. - 1990. - т. - с.58-64.
70. Грибенча C.B., йуралев В.А., Василенко О.В. и др. Моноклональные антитела к гликодротевдному и нуклеокапсидному структурным
белкам вируса бешенства штамм "Внукозо-32". //В сб.Разработка и производство пре-тов мед.биотехнологии, (тез.докл.) г.Махачкала.-1990,-C.I50-I5I.
71. Поцелуева Л.А., Лопатнев С.В., Волкова Т.И., Грибенча С.В. Перспективы разработки и применения инъекционной лекарственной формы бактериальной рибонуклеазы. /,/В тез.докл.Всеооюзн.н.-техн.конф."Состояние и перспективы создания новых готовых лек. средств и фитохим. пре-тов". - г.Харьков.- 3-5 октября 1990г. - с.91-92.
72. Грибенча С.В.,и Василенко О.В., Фуралев В.А. и др. Получение и характеристика гибрвдом, продуцирующих моноклопальные антитела к структурным белкам вируса бешенства щт."Внуково-32". //Вопр.вирусол. ■ 1991. - М. - с.318-321.
73. Грибенча С.В,, Василенко О.В., Цузьмицкая Т.М. и др. Взаимодействие моноклональных антител к структурно белкам вакцинного вируса "Внуково-32" с другими вирусами группы бешенства. //Вопр.вирусол.-1991. - !f5. - с.399-402.
74. Клюшник С.Ю., Мчедлишвили Б,В., Грибенча С.В., Барине кий li.fi Очистка и концентрация вируса бешенстза методом диафиль^рационного концентрирования. //Вопр.вирусол. - 1991. - ,¥5. - с.394-498.
75.Barinsky I.F.,Krentesl В.А.,Gribanoha S.V. a.a.-Furan - maleic 6 hydride copolymers and their potential uses In the chemotherapy • of Viral infectiono.-Cov. Med.Rev.E.Virology reviews,1991,4,
p.79-10?.
76. Грибе.'гча С.В., Поцелуева Л.А., Баринский И.4., Заклоннико-ва И.В. Противовирусная активность бактериальной рибонуклеазы при экспериментальной рабической инфекции. /Дерментк микроорганизмов: Матер, конф. - Казань.' - 1991. - о.33-35.
77. Barineky I.P., Gribenclia S.V., YaeilenioO.V. et al.-Monoclonal antibodies to rabies virus and their practical application. The pathogenesis of viral diaesaoeo. Molecular, virological and iraaunologica
Aspects. (Second Congress of the Еигорзап society for veterinary virology). Abstracts 22-26 September, 1991, Uppsala, Sweden, p.80.
78. Грибенча C.B., Василенко 0.В., «уралев В.А. и др. Разработка нового поколения препаратов, основанных на моноклональных антителах для диагностики и лечения лиссавирусных инфекций. //В сб.Акт. проблемы современной эпцдемиол. .микробиол. и паразит. -Кишинев.-1?92. - с.284-286.
79. Грибенча C.B., Василенко О.В., Баринский И.О. Получение панели моноклопальных антител к нуклеокапсиднсыу комплексу лисзавируза Юли". //Мат-лы 52-й научн.г.ракт.конф. проф.преподават. состава Турк. мед.ин-та. - Ашхабад. - 1992. - с.64-65,
80. Грибенча C.B., Василенко О.В., 5уралев В.А. и др. Гибридсм-ная технология в исследовании лиссавируснкх инфекций, //Итоги науки и техники. С.Вирусология. - 1992. - т.28. - с.45-58.
-
Грибенча, Сергей Васильевич
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 1993
-
ВАК 03.00.06
- Роль грамотрицательных условно-патогенных бактерий в развитии внутрибольничных инфекций в стационарах хирургического профиля г. Махачкала
- Иксодовые клещи Карачаево-Черкесской Республики и их эпидемиологическое значение
- Клинико-микробиологическая оценка эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения при лечении урогенитального хламидиоза у женщин репродуктивного возраста
- Распространение возбудителей урогенитальных инфекций у обезьян и их роль в патологии беременности и родов
- Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота
