Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (На модели вируса бешенства и инфекционного ринотрахента 1<рупного рогатого скота)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (На модели вируса бешенства и инфекционного ринотрахента 1<рупного рогатого скота)"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Светлана Владимировна

ДИАГНОСТИКУМЫ НА ОСНОВЕ ОЧИЩЕННЫХ И КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ

(На модели вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота)

03.00.06 — ВИРУСОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА—1991

/

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности ГК СССР по продовольствию и закупкам.

Официальные оппоненты:

— доктор ветеринарных паук, профессор 10. Д. КАРАВАЕВ;

— доктор биологических наук, профессор Н. Г. ОСИДЗЕ

— доктор биологических наук Р. К. САФАРОВ.

Ведущее учреждение — Украинский научно-исследователь

ский институт экспериментальной ветеринарии.

Защита диссертации состоится «3 » Я1991 го/и

в «/¿З» часов на заседании специализированного совете Д 020.28.01 по защите диссертаций па соискание ученой сте пенн доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно исследовательском институте экспериментальной ветеринара им. Я. Р. Коваленко (109172, Москва, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инсти тута. 1

Автореферат разослан « » 19Э1 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук Ф. Г. ТВРЕШКОВ

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАНГ,;!

~Ту1. Актуальность теш. Успешное развятиэ вирусолог.тл г -разрывно связано с дссткзеннямн молекулярной биолог:::?, ;.'-тог.':г-л> биофизики и ряда других наук. Рекенпе частных проблем л сбг:с-гл ветеринарной вирусологии в значительной степаи ■:• от глу-

бины теоретических исследований в изучении прлроды вирусов, биохимических и биологических свойств кошонгнтов вирусов, ,;а взатдютногения его с клеткой, факторов специфического и нз-зпецчфгшеского т.С!уш1тета. При проведении фязаго-зсжячесхгнс исследований структуры вирусов необходим очищенные н ::онцснтр::ро-занные препараты. Это условие обязательно при получокгп сгруг.тур-шх компонентов внраонов.

Несмотря на то, что ветеринарная пра~т!п:а '^.-.оа1 в с,:; >аспоряяеняи больной набор диагностических ек-о^.отс" :: •лкумов, увеличение номенклатуры, удучтате качества п сгацдар-'изации диагностических препаратов для прагг'.чзсках лабораторий :о-прежнецу остается вс/ной задачей.

Быстрый и точный диагноз инфекционных вирусных бо.-озпзЛ вляется решающий условием организации необходимых 1:зр, бо^ьсг? кии. Хотя традиционные методы лабораторной диагностики, приятые ныне в вирусологии, достаточно спец'.фшш к чувстЕпте"!!"" ни часто трудоемки, елоаш, а иногда и недоступны для кекстг : абораторий. 3 послед!г:а годы разработано несколько носы:;, \ .с-ах л быстрых гетодов диагностики вирусных инфекций. Уг:'/\ зтоды диагностики вирусных болезней является тестами, которые эзволяют получать результаты за более короткое вр-зия, чел при зимененкн традиционных методов, л те« с&уыц обеспечивать более

I

эффективно профилактику ж контроль распространения инфекций.

При диагностике вирусных инфекций все более широкое применение находит имцуноферментный анализ. Высокая разрешающая способность зтого метода обусловлена, главный образом, природой ли-ганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблвдаемый эффект.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченных пероксидазой хрена, необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов. Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то-есть иммуноглобулина, меченного пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности ишф-ноглобулжна, активности фермента и условий связывания этих компонентов СЯнкин Н.в. в др., 1985).

Гибридомная технология, созданная 15 лет назад, представляет на сегодняшний день наряду с генетической инхзнерией одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии. Получение моноклональных антител и их применение позволяет рассчитывать на существенное усовершенствование методов диагностики и индикации вирусных инфекций. В Советском Союзе широкие исследования по получению гибридом начаты в конце 70-х- начале 80-х годов. Идут интенсивные работы по получению моноклональных антител в протащенных условиях.

При создании диагностикумов следует отдавать предпочтение инактивированюш антигенам. Для получения эффективных инактквиро-ванных препаратов необходим обоснованный выбор инактиванта и условий инактивации. Практически любой ннажтивирующий агент в той или иной мере затрагивает не только геном, но и компоненты белко-

вой оболочки вириона, что ослабляет имиуиогенные и антигенные свойстза вируса. Подбор инактивирущего агента и оптимальных условий инактивации для определенного вируса позволяет получить максимальное различие скоростей модификации геноыа л белкового калспда.

Основное требование, которое предъявляется я ннаэтивируг^огу агенту - необратимая инактивация renoua при нахсжально:.; согра-нешш антигенных свойств вируса. В связи с решение задачи

сводится к разработке специфических реакций взгзглодоПстзпя :п:ак-ткванта с нуклеиновой кислотой вируса и условий ннгьтгллгщпи.

Ускоренные методы вирусологической диагностики сбладо,™? рядом преимуществ по сравнению с традкционшг-н методат серологической диагностшси. Быстрота и простота псс?с.чое::т! ?сстоп делггэт ее удобной для исследования динамики инфекции в очагах зг.бслеза-ния, а полученная инфор'.'лция мочет служить ориентиром г,ля :глня-тия соответствующих иер по предупраэдешга пнфошг.:"! и их распространению.

Таким образом, создание тест-систем для ускоренной тики вирусных инфекционных заболеваний на сегодняшний день ляется волной и ш-.туальной эада'юй,

1.2. Обоснование выбора объектов исследования. К вain'jïvy.'.ii задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания янвотных и человека - бешенства. Борьба с безенствои была и остается проблемой медицины и ветеринарии. Эту проблему значительно осложнило отмеченное в последние десятилетня зозрас-тание роли диких.животных в распространенна болезни. По дакни: КLtn у и др. (1955 ) в 1985 году неблагополучными по бешенству были 75 стран шгоа. Этот процесс не лиеет тенденция к зату-

3

гчлл'.г, капрттл.'. : л;ается новые к новые, ранге благополучные

с ¿г; , несмотря на то, что ыетодкка получения

гклпчЛжсзлй :;.». г. ш била разрабо-; гит Л.П&ст-:;.ом более 100 лет назад к с «гл:: ;.лр достих'нуто кногое б изучав»; этого заболз-ваннл, осхаето:: п; сдизтои нсучениг многих исследователей.

Влрус безопссЕа, рещюдуцпг.ованшй и культуре 'лсепп, используется б качестве исходного материала при изготовлении ан-зжрабячееккх сищт к диагностккумо:.. Вакцины и дпаг; тпкуки, к»Г05аБливаа..-г г.е кудьтурольшсс вирусесдеркачвх сус::е:юий, со-дертат ьебол„^ло количество специфического антигена с сравнении с кнсжсо'.то . сгиу;- ^.•.д^слшх , ::а:: при про-

шззднпои ■ го:,::он о(;: Чч., 1 сио,.'.-;.-уэг ¡юс вируссодер-

/ По-чееу глл'-.аию исследователей привлекает разработка геет- стойкого и концентрированного вируса. Тассо/, : .: собой материал для изготовления надобно:. ч ¡'сс-чг'ьы против бешенства, обладающей высоко;" гоушканностьгз; •.. ¿...¿о чувствительное ; ■сагаостшсуцов, не пзЗсчюк ксс1[с1;.-р^£ских реакции.

Иоелодсг-сеше Ьтруктурнкх кошоиентоа вируса Сог.епзтва представляв« не только теоретический, ко и практический ккгсрзс. В связи с эх:::; валкыи представляется вопрос об изучении биологических и ф:Iзпко,чееких свойств геисегглютинина вируса бепгнетва. Изучение отого вопроса может создать предпосылки для практического птт.'гзйашя этого компонента вируса в составе вакцин и диаг-ностакугов, чистых и высокоэффективных.

В связи с организацией в нааеЛ стране крупных животноводческих хозяйств, обострилась проблема диагностики и ликвидации ряда 4

инфекций, которые при большой концентрации животных часто проявляются у молодняка. Инфекционный ринотрахеит - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней телят при npojan-ленноы животноводстве. Изучение инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в течение последнего десятилетия показало актуальность данной проблемы.

Экономический ущерб, наносимый инфекционным рннотрахеитом, слагается из снижения удоя в период болезни (до 50-6055), значительного процента яловости коров, болеющих вагинальной формой ИРГ (69), слабого развития больного молодняка и частой слепотой телят, подлежащих по этой причине вынужденной выбраковке. При хронической серозно-гнойной пневмонии погибает до 20$ телят. Одной из форм инфекции является латентная. Латентная форма у быков-производителей представляет серьезную опасность для плецен-ного животноводства. Имеются сведения, что вирус ввделяется из спермы клинически здоровых быков (Изотова Н.В. и др., 1981 ; Скхрпъ/ьп- и др., 1979). Борьба с инфекционным рннотрахеитом требует больших затрат и зависит от эффективности методов диагностики и средств профилактики (Крюков H.H., 1980; Сухарев О.И., 1988).

Быстрый и точный диагноз инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с ним.

1.3. Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание диагностикумов на основе очищенных, концентрированных и инактквированных, с учетом изучения механизма инактивации ß -пропиолактоном биопрепаратов, использовав как цельные внрноны, так и их структурные коипокан-

5

ты, для постановки серологических реакция, а также высокочувствительных и специфичных компонентов для проведения иыцунофер-ментного анализа при определении уровня антирабических антител у иммунизированных животных и анти-ИРГ КРС антител в крови переболевших и больных животных. При создании диагностикумов представлялось необходимы*:

1.3.1. Разработать оптимальные условия очистки и концентрирования вируса беиенетва, репродуцированного в культуре клеток ВйК-21/13, вэдм Щелково-51, и игТ КРС, репродуцированного в культуре клеток ПГ-80, штамм ТК А (ВИЭВ) В2 и изучить их биологические и физико-химические свойства.

1.3.2. Ввделить структурные компоненты вируса бешенства -нуклеопротеид и гемагглютинин и изучить их биологические, физико-химические и имцуногенные свойства, изучить белковый состав вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

1.3.3. Определить условия инактивации культурального вируса бешенства фенолом,р -пропиолактоном и теплом и изучить их влияние на биологические свойства вируса и его белковый компонент -гемаг^лотинин, ответственный за иммуногенность.

1.3.4. Изучить механизм взаимодействия ^ -пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК вируса бешенства.

1.3.5. Испытать антигены вируса бешенства и ИРТ КРС, порченные на базе очищенных, концентрированных и инактивированных препаратов, в качестве компонентов для постановки серологических реакций при определении уровня антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных.

1.3.6. Получить антирабические и анти--ИРГ сыворотки на лабораторных животных, выделить 1^0- крупного рогатого скота, по-6

лучить анти-1^0- сыворотки на кроликах и выделить анти-1^& крупного рогатого скота из них, получить коньюгат пероксидазы ив хрена с анти-1ср крупного рогатого скота.

1.3.7. Получить линии гибридоыных клзгок, секретирупцие моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного рино-трахеита крупного рогатого скота.

1.3.8. Разработать тест-системы для нниуноферментноЯ индикации вируса бешенства при его репродукции и диагностики ИРГ КРС, провести сравнительную оценку определения уровня антнрабических

и анти-ИРТ антител в реакции нейтрализации и иамуноферментного анализа.

1.3.9. Представить и утвердить НГД, на основании которых изготовить в промышленных условиях "Наборы для определения уровня антирябнческих и анти-ИРГ антител в сыворотках в&яцнннрованпых, больных и переболевших животных методом ыгаогнофергенткого анализа?

1.4. Научная новизна. В процессе работы была научены биологические и физико-химические свойства вируса бешенства, штгищ Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13. Выделены структурные компоненты вируса бешенства - геиагглотишн и нуклеопротеид, показано, что геыагглотннин вызывает интенсивное образование вирусней?ралнэущих антител в крови иммунизированных животных и является компонентом, ответственный за имцуногениув активность вириока. Установлено влияние на вирус бешенства и его структурные компоненты таккх физических и химических факторов, как инактивирущнх агентов фенола, ^ -пропяолактона и тепла, рН среды, температуры и ферментов трипсина и РНКозы. РНКаза и трипсин в концентра дни выше 0.02-0.05$ существенно снижают титр ин-фекционности вируса, изменяют его морфологию. Полученные характе-

7

рисунки вошли в паспортные данные на штамм Щелкэво-51, на который получено авторское свидетельство (№ 890591 от 14.08.81, в соавторстве).

Обоснован выбор инактиванта для культурального вируса бешенства - ^ -пропиолактон, изучен механизм его взаимодействия с нуклеозидами вируса - гуакизином, аденозином и цитидином. ^ -пропиолактон не оказывает влияния на иммуногенный компонент вируса - гемагглютинин и взаимодействует с пуриновыми и пирими-диновыии основаниями вирусной РНК. Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием ^ -пропиолантона с основаниями, приводят я ее инактивации. ^ -пропиолактон инактивирует вирус бешенства полностью и необратимо.

При фракционировании вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, в градиенте плотности сахарозы, установлена гетерогенность вирусной популяции по плавучей плотности, юшуногенности, гемагглютинирущей и комплементсвязывапцей активности, скорости инактивации ^ -пропиолактоном. Скорость инактивации {} -пропиолактоном зависит от гетерогенности состава вируса. Причиной, обуславливающей "вирусный хвост" в процессе инактивации, является наличие фракции более устойчивой к воздействию инактиванта.

Выявлено в составе вируса инфекционного ринотрахеита крупно го рогатого скота, штамм ЗК А (ВИЭВ) В2, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, 33 структурных белка с молекулярной массе от 13 до 270 ВД, 6 из которых являются мажорными белками, 10 из II гликозилированшх белков - поверхностными. На 9 гликозилиро-ванных и 3 неглихоэилиров&нных белка вырабатываются антитела в организме восприимчивых животных. Получено б клонов гибридом, к< 8

торые являются основой для создания высокоэффективных диагности-кумов в промышленном производстве специфических моноклональных антител. Показана возможность применения моноклональных антител в качестве иыыуносорбента для ввделения методом аффинной хроматографии высокоочищенных препаратов белков вириота инфекционного ринотрахеита.

Разработаны тест-системы для имцуноферментнбго анализа при ивдикации и количественном определении антител к вирусу бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Основные положения научной новизны работы защищены авторскими свидетельствами: способ устранения антикомплементарной активности антигенов (№ 303075 от 23.02.71, в соавторстве) и защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины (№ 3694939)28-14 (013908) от 17.01.85 (в соавторстве).

1,5. Практическая значимость. На основании разработанных методов очистки и концентрирования вирусов бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм ТК А (ВИЭВ) В2, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, выделения структурных компонентов вируса бешенства - гемагглю-тинина и нуклеоцротеида, определения белкового состава 'вируса ИРТ КРС и изучения биологических и физико-химических свойств вирусов и их компонентов, а также условий хранения этих препаратов, разработаны компоненты для определения в серологических реакциях уровня антирабических и анти-ИРТ антител в сыворотках больных и переболевших животных в реакции связывания комплемента, преципитации и непрямой гемагглютинацни, а также применяемые в качестве компонентов для гошунофериентного анализа и показавшие

9

высокую эффективность и реакциях. Методической комиссией ВНИиТИБП утверядено 8 методик по получению антигенов для серологических реакций. Нами разработаны методические рекомендации по "Применению имцуноферментного анализа для выявления вируса в процессе репродукции к антирабических антител в сыворотках крови животных", которые были одобрены на заседании секции "Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных" отделения ветеринарии 14.01.88, и "Лабораторной диагностики инфекционного ри-нотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом", утвержденные Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 02.01.89.

Установлена принципиальная возможность использования гемаг-глвтиннна вируса б-зшекгтва в качестве антигена прк оценке уровня антител и изготовления субъединичной антирабической вакцины. Результаты изучения механизма действия -прспиолактона на вирус и его структурные компоненты явились теоретическим подтверждением правильности выбора инактиванта для вируса бешенства при создании антирабической вакцины (Инструкция утверждена начальником ГУБ 17.09.75). С целью стандартизации инактиванта внедрена в практику ВНИиТИБП методика определения концентрации ^ -прсгшолактона, утвержденная методической комиссией ВНИиТИШ 30.06.78.

Полученные клоны гибрвдокных клеток, синтезирующие моноклональные антитела к антигенам вируса ИРГ КРС со стандартными свойствами, являются основой для создания высокоэффективных диагностических препаратов и производства специфических моноклснальных антител в промышленных условиях.

На разработанные тест-системы ИФА для индикации, антител к вирусу бешенства и ИРГ КРС утверждены НГД (29.07.88 и 01.07.89, 10

соответственно), ТУ на "Набор для имиуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" переданы в МЦОМ Госстандарта 18.07.89, где зарегистрированы под № 005/019669. На ЩЕК изготовлены и реализованы партии наборов в количестве по 300 штук.

Внедрение наборов в практику позволит проводить серологическую диагностику ИРГ и оценку уровня антирабических антител у

КРС, эпизоотологическое обследование поголовья в племенных и пользовательных хозяйствах, что будет способствовать оздоровлении хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции. Наборы могут быть использованы на пунктах пограничного контроля для проверки импортируемых животных.

Экономический эффект от применения иьо^уноферкентного ана;л-за в расчете на использование I набора оценивается в размере 1396 руб.

1.6. На защиту выносятся:

1.6.1. Результаты разработки оптимальных условий очистк;: концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуг;;-рованного в культуре клеток BHK-2I/I3, и инфекционного ркнстг:1-хеита крупного рогатого скота, штамм ТК А (ВИЭВ) В2, репр-;;;;; рованного з культуре клеток ПТ-80 и изучения их биологичис:"г: фязико-химических свойств.

1.6.2. Результаты выделения структурных компонентой нчг; л л бешенства - нухлеопротеида и гемагглютинииа и изучения й;: : гических и физико-химическях свойств, изучения Сел'гоког.) вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого о:со--:?>.

1.6.3. Результаты определения условий ::нг.этииг.ц:::; ъчруса с' • -

шенства теплом, фенолом и ß -пропиолактоном, зависимости скорости инактивации культурального вируса ß -пропиолактоном от гетерогенности состава, изучения действия ß> -црошолактона на гемагглютинин и РНК вируса бешенства.

1.6.4. Результаты испытания антигенов вируса бешенства и ИРГ КРС, подученные на базе очищенных, концентрированных и инак-тивированных препаратов, в качестве компонентов в серологических реакциях (РДП, РИГА, РСК и ИФА).

1.6.5. Результаты получения линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела х антигенам вируса инфекционного рикотрахеи-та КРС, получения и очистки моноклональных антител к вирусу, использования ЫКА для очистки вирусных белков.

1.6.6. Результаты разработки тест-систем ИФА для индикации вируса бешенства при его репродукции, диагностики вируса ИРТ КРС и определения уровня антирабических и анти-ИРГ антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных и проведения сравнительной оценки определения уровня антител в реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа.

1.6.7. Результаты испытания и промышленного изготовления наборов для иммуноферментного анализа.

1.7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИиТИБП (1972-1990гг.); на научно-производственной конференции по проблемам стандартизации биологических препаратов, ВГНКИ, Москва (1974) ; 1У, У и У1 Всесоюзных ветеринарных вирусологических конференциях "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии (1976, г.Владимир; 1980, г.Казань ; 1990, г.Владимир) ; Всесоюзной конференции "Научные основы технологии 12

промышленного производства зетзркнарных бколопшеспи^ преп.-'р-д-тоз" (1978, г.Москва; 1931, г.Москва) ; мегинсти'.'утском рабочзн совещании "Научные основы производства гипергсгмуннкх сынорсго;:" (1979, г.Томск) ; Всемирном ветеринарном XXI Конгрессе (I973s г.Москва) ; Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфелщй" (ICSI, г.Томск) ; конференции "Разработка, апробация и государстзега::«П контроль ветеринарных препаратов" (1981, г.Иос;:ва) ; скмпозкуп "Методы получения и анализа биохимических реакций" (1987, г.Таллинн) ; Всесоюзной конференции "Эпизоотология, эгощеггаологпл, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных" (1988, г.Львов) ; Всесоюзном симпозиуме яБиохимия сельскохозяйствен/.::^ ливотннх и продовольственная программа" (190Э, г.глез) ; Всесог?-ной конференции "Современные проблеет иммунолог!':--:., генной п точной инженерии в ветеринарной медицине" (1990, г.Гогчпй) у Всесоюзной конференции "Методы анализа п пркчекегал ферлеп-гоп" (1990, г.Олайне).

Высокая эффективность "Набора для иммунофернзнтной диагностики вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" показана результатами комиссионных (по приказу I7B Госагрзг-с"' СССР » II от 09.02.89) приемочных иссыт?ж:: опытно-производс:»:-;> ной партии (300 штук), изготовленной в премшшенкых услсзн:::: (ЩЕК) и испытанной в ветеринарных лабораториях страны.

Набор демонстрировался на ДЦНХ СССР. За участие в ссплояг/ и внедрении набора автор награжден бронзозой и серебряно :i далд>^1

1.8. Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 76 печатных работ, принято во ВНИИТИ-Центр

и зарегистрировано три заключительных отчета по плановой тематике, в которых автор был ответственным исполнителем. Получено 3 авторских свидетельства.

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 326 страницах машинописного текста, включает введение (13 стр.), обзор литературы (62 стр.), материалы и методы (19 стр.), результаты исследований (167 стр.), обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения (37 стр.). Список использованной литературы включает 157 источников на русском языке и 413 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 68 таблицами и 56 рисунками. В приложении ( 34 стр.) представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.I.I. Вирусы. Вирус бешенства. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированный в культуре клеток BHK-2I/I3. Вирус получали из отдела противовирусных препаратов (заведующий Иванов B.C.). Титр инфекцион-ности вирусеодеркащего материала, использованного в работе, был Ю5-5-Ю6-5 tcj L Дбо/ыл* Суспензию вирусного материала хранили при температуре -50°С.

Вирус ИРТ КРС. В качестве исходного материала служил вирус ИРГ КРС, штамм ЕС А (ВИЭВ) В2, репродуцированный в культуре кле-14

тох ПТ—80, получаемой из лаборатории культурк клеток (заведующий Соловьев Б.В.), с титром инфекционности 6.0-7.0 ¿^ ТЦЦг^д^. Вирус репродуцировали в течение двух суток при температуре +37°С в бессывороточной среде Хенкса с 0,5$ лактальбумина.

2.1.2. Мечение вируса инфекционного ринотрахеита. Через 2 ч после адсорбции вируса добавляли в поддерживающую среду

3Н -валин (27 Ки/ммоль, "Изотоп", Ленинград) до 12 мкКи/мл среды и 3Н-лейцин (37 Ки/ммоль, "Изотоп", Ленинград) до 12 мкКи/мл среды, либо 3Н-глюкоэамин (42 Ки/ммоль, г? м е. г $ к О т.) до 25 ывсКи/мл среды, у? -активность определяли на счетчике Ьа 1217 (I- КВ). Работа проводилась в лаборатории радиобиологии МВА совместно с Лысенко Н.П.

2.1.3. Концентрирование вирусов методом ультрафильтрации проводили на УФ ячейках ©Ю2-200 и ФУ02-1000 ■ с использованием ядерных фильтров, полученных из лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г.Дубна) совместно с сотрудником лаборатории процессов и аппаратов Панферовой С.Ы.

2.1.4. Контрольные антигены получали в тех же условиях, что и вирус, но без добавления последнего

2.1.5. Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5-недельных мышах, титр инфекционности вируса ИРТ КРС - по ТВД^Дщ на культуре клеток ПТ-80. Титр инфекционности вирусов рассчитывали по методу Аимарина И.П. и др. (1962г.).

2.1.6. Белок определяли по методу Лоури и др. (1956г.)

и на спектрофотометре СФ-26 (СССР). Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

2.1.7. Комплементсвязывашцую активность вируса беиекстса

определяли по микронетоду Svu£e£ot и др. (1969г.), вируса '.'Л - пс кикрометоду ,'vüssl С. и др. (1974г.), прецапитирующую паизносгь - по ыетоду üи ch.tzxto /г у в агаре "Дифко" (IS49r,)s гекагглютинярузэщув активность вируса бешенства опреде-zr.rzi по методу ituiv 6'tt(i977r.), вируса ИРГ - по методу Крагой H.H. н др. (1932г.), татр вируснейтрализувщшс антител в аэтарабических сыворотках определяли по методу, рекомендованному ВОЗ (1975г.), в анти-ИРТ сыворотках - по методу Tloxentiig86г.).

2.1.8. Геиагглютинин вируса беаенства выделяли по методу Schneidet (1976г.) из очищенного и концентрированного препарата, :-гу;:леопрстеид - по методу So к. о t (1972г.).

2.1.9. Иммуноглобулины класса О- взделяли из цельной сыво-КРС ылаливанисм серкокислш аммонием с последующим обессо-

.-.„■.пжлеи препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-трисакрил-М.

Препарат анти-IqG- выделяли с помощью аффинной хроматографии не: ж-уносорбенте на основе ОВг- -агарозы (Таллинн, СССР) и ДпЛ-34 ( LKB, Швеция). Элюцию антител с АсА-34 проводили бесколо-ночкнм методом, с ВгСл/-агарозы - в колонке К 9x15 ( L КВ, Швеция).

Для получения коньюгата анти-I^G- с пероксидазой хрена пользовались перйодатным методом vVfltcft nß (1974г.).

2.1.10. При получении гибридом, продуцирующих антитела против антигенов вируса ИРГ, для иммунизации использовали линейных мысей линии BALB/c. 3 качестве плазмоцитомных клеток для слияния использовали линии миелоы S PZ/0-jlq 14 и

слняние проводили, используя модификацию классического метода К oh ¿¿l и MiCit ti 1975г.), скрининг антителообразующих плонов вели с помощью непрямого твердофазного ИФА. Клоны, дающие 16

положительные результаты в ША., реклонировались методом предельных разведений.

Моноклональные антитела к ИРТ КРС получали либо в клеточной культуре, либо путем пассирования гибридных клеток в виде асцит-ных опухолей на предварительно праймировэнных пристаном ( í¿(] ) мышей линии BAlB/c. Моноклональные антитела ввделяли из клеточных надосадков или асцитных жидкостей аффинной хроматографией на протеин-2-сефарозе 4В или на Bi(U- -сефарозе 4В (Phüimac-ÍCL) с иммобилизованными на ней вирусными белками.

2.1.II. При определении структурных белков вируса ИРТ прл-м еняли электрофорез в ДСН-ПААГ. Флюорографию после электрофореза в ДСН-ПААГ проводили с предварительной обработкой пластин I М салицинатом натрия, как описано CLdin ¿(bCh- (1979г.) с последующей 24 ч экспозицией на пленке ÍCос1&к- t'OMAT X,-1i1~5* при -70°C.

'¿.1 ЛИ. Иммуноблотинг проводили по методу, описанному Бере-зиным В.Э. и др. (1987г.;.

2.1.13. Константу скорости инактивации вируса бешенства рассчитывали по формуле 6-%e,¿^<f (1965г.), определение концентрации исходного ^ -пропиолактона проводили по методу ¡yítb (1952г.).

2.1.14. Определение иммуногенности препаратов вируса бешенства проводили по методу vv'JH (Национального Института Здравоохранения США) на белых мышах (94). В этом методе сравнивается минимальная доза испытуемой вакцины, защищающая 50JÍ iieeieü (50,,-á конечная точка), с таковой международной или национальной ре-ференс-вакцины. Испытуемая вакцина признается эффективной при индексе иммуногенности не ниже 0.3.

2.1.15. Электронную микроскопию препаратов вируса бешенства

и ИРТ проводили с использованием электронного микроскопа ^ЕМ-100 В. Работа проводилась в лаборатории электронной микроскопии ВНИТИЕП под руководством и участии Блехермана Б.Е..

2.1.16. Результаты исследований обрабатывали статистически по таблицам Фишера и Стьюдента.

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Вирус бешенства

С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования культурального вируса бешенства был испытан ряд методов, таких как оса.дение вируса полиэтиленгликолем ( ПЭГ) с ММ 3 тыс, 6 тыс и 20 тыс дальтон ( Д) в различных концентрациях, адсорбция-элюция »»руса с геля фосфата алюминия и ГОА, ультрафильтрация, высокоскоростное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности.

В результате проведенной работы была составлена схема очистки и концентрирования вируса бешенства, которая включает в себя адсорбцию-элюцию вируса на геле фосфата алюминия, ультрафильтра-цию, оса::депие вируса ПЭГ, высокоскоростное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Получен высоко-очшценный на 59.99% вирус, который пригоден для изучения йизико-химических свойств, а также выделения его структурных компонентов.

Концснтрирсзанный ПЗГ 1,1-3000 вирус бешенства использовали в качестве антигена при постановке РДСК. Препараты культурального вируса были сконцентрированы в 20 раз и инактивированы -^-про-пиолактоном (1:8000) .

Исследовали 373 сыворотки крови животных, вакцинированных

антирабической фенолвакциной. Из исследованных сывороток крови положительная реакция в РДСК установлена в 72 случаях, что составило 1956 всех исследованных сывороток, вируснейтрализующую активность определяли в 20 произвольно взятых сыворотках, 8 из которых дали положительную реакцию ( 40%) .

Полученные данные позволяют концентрированный ПЭГ М-3000 вирус бешенства, штамм Щелково-51, рекомендовать в качестве антигена для постановки РДСК. Кроме того, были проведены исследования по обнаружению поствакцинальных антирабических антител реакцией непрямой гемагглютинации РИГА) . В качестве антигена для постановки РИГА использовали вирус бешенства, концентрированный в 50 раз ультрацентрифугированием.

В РНГА исследовали сыворотки крови 217 голов КРС, вакцинированных фенол-вакциной, а также 20 кроликов, иммунизированных вакциной ВНИТИБП. Сыворотки исследовались в различные сроки после иммунизации животных ( 13-190 дней). Всего выявлено положительно реагирующих 117 сывороток крови КРС ( 54.7^) и все 20 сывороток крови кроликов ( 100$).

Исследованные 35 произвольно взятые сыворотки крови КРС в РН имели титры вируснейтрализующих антител ( в МЕ ) от 0.01 до 3.4 МЕ. Из них только 16 сывороток имели титры выше 0.5 МЕ (45.УА). Сыворотки крови кроликов в Ш имели титрн ВН-антител от 2.25 до 27.5 №.

Таким образом, реакция непрямой гемагглютинации является чувствительным тестом для определения уровня антирабических антител. Полученные данные свидетельствуют о том, что вирус бешенства, штамм Щелково-51, концентрированный с помощью ультрацентрифугирования, мо;;сно рекомендовать в качестве антигена для РНГА, а саму реакцию с использованием этого антигена, как серологичес-

кий метод для обнаружения гемагглютинирувщих антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных.

Были изучены следующие биологические свойства вируса: гемаг-глютинирующие, комплементсвязывающие, преципитирующие и иммуногент ные в процессе концентрирования вируса и влияния таких физико-хи-ческих факторов, как обработка вируса ферментами РНКаза и трипсин, влияние на вирус температуры и рН среды.

Установлено, что процессы очистки и концентрирования не влияют на биологические свойства вируса бешенства. В концентрированных препаратах титры ГА-, КС- и гтреципитирукщей активности выше, чем в исходной суспензии.

Иммуногенность концентрированных в 10 раз ПЭГ, на геле гидроокиси алюминия коллоидного и фосфата алюминия препаратов вируса бешенства определяли на мышах по методу «У 1Н. Концентрированные препараты инактивировали р-пропиолактоном. Иммуногенность концентрированных в 10 раз прег.аратов, по сравнению с неконцентрированным вирусом, выше в 6-9 раз. При проверке сывороток, полученных на введение концентрированного и неконцентрированного вируса по индексу нейтрализации удалось установить, что у первых сывороток индекс выше на 1.15-1.9 1с).

Известно, что рН среды оказывает влияние на биологические свойства вирусов. Мы провели опыты по выяснению влияния рН среды на биологические свойства вируса. Для этого доводили рН в препаратах вируса, имеющих начальный рН 7.2-7.6 , до 2.0-12.0. Установлено, что для проявления и сохранения биологических свойств вируса бешенства оптимальными являются пределы рН 5.0-9.0. При это.м рН остается неизменной биологическая активность вируса.

Данные литературы свидетельствуют о том, что протеолитичес-кие ферменты могут влиять на биологические свойства некоторых ви-20

русов и, в частности, вируса бешенства. В связи с этим нами было проверено влияние на биологические свойства и морфологию вируса бешенства, штамм Щелково-51, ферментов трипсина и РНКазы.

Гесагглютинин (ГА) вируса бешенства получали путем обработки высокоочищенного и концентрированного вируса бешенства сапонином с дальнейшей очисткой в градиенте CjCI. Получены очищенные на 99/в препараты ГА вируса бешенства. Препараты гемагглютинина обладали в 16 раз более высокой гемагглютинирующзй активностью /1:128/, чем очищенный и концентрированный вирус, из которого они были получены /1:8/. Оптимум pH для гемагглютинина вируса бешенства ле-лиг в пределах 5.0-9.0.

С целью выяснения вопроса, какой компонент вириона отвестве-нен за его иммуногенность, сравнивали антигенные и иммуногенные свойства цельного вируса и выделенного из него гемагглютинина. Для сравнения иммуногекных свойств вируса бешенства и его гемагглютинина мышей иммунизировали культуральным, очищенным и концент-рирооашии в 10, 30 и 50 раз вирусом, а таюяз полученными из эти:: де препаратов гемагглютинином. Иммуногенность препарата гемагглютинина, полученного из культурального вируса, была в 3 раза выше имыуногенности исходного препарата. После очистки и концентрирования в 10 раз иммуногенность вирусного препарата повышалась до б.Э, а гемагглютинина из него - до 10.0. При дальнейшей очистки и концентрировании в 30 и 50 раз эти ци;?ры соответственно увеличивались до 9.I-I2.0 и 12.0-20.0.

Талям образом, иммуногенность препаратов гемагглютинина, а Т1К.:с их способность вызывать образование БН-антител у пммунизиро-ванных :ши чивотных, были значительно выше, по сравнению о препаратами вируса, из которых они были г.олу-:ены.

При создании диагностикумоя против гпоустпт: и:; екц :Ч1 azvy-

21

ет отдать предпочтение инактивированным препаратам. В своих исследованиях мы провели сравнительные опыты по выяснению влияния таких инактивантов, как тепло, -пропиолактон и фенол на биологические и фкзико-хиьг. ческие свойства вируса бешенства.

Поскольку все процессы инактивации идут в условиях опрелен-ных температур, то вопрос влияния тепла на биологические свойства вируса является важным. Опыты по изучению влияния тепла на вирус бешенства проводили в условиях температур +37°, 56° и 62°С в течение б ч. Скорость тепловой инактивации препаратов культурально-го вируса бешенства зависела от температуры. Для характеристики тепловой инактивации используют обычно величину скорости реакции, т.е. константу скорости инактивации. Сопоставление констант скоростей инактивации наших препаратов позволило количественно оценить процесс инактивации, происходящей при температурах +56° и 62°С. Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс тепловой инактивации при +62°С протекает быстрее, чем при 5б°С. Надо отметить, что препараты вируса бешенства, обработанные при 56°С в течение 60 минут и при 62°С в течение 45 минут были неиммуно-генны.

Изучая в качестве инактиванта культурального вируса бешенства фенол, мы во всех опытах учитывали влияние температуры на процесс инактивации. На вирус возгс.'.ствовали ■.'.енологл в концентрации 0.25 , 0.50 , 0.75 и 1.0;: пои температурах 44°, 20° и 37°С. Через каждые 24, 48 и 72 часа в препаратах определяли инфекционноегь, комплементсвязывающую, гемагглютиниругащую и преципитирующую активность.

На основании полученных наш данных было установлено, что вирус бешенства инактивируется фенолом в концентрации 0.75% при температуре +20°С в течение 48 ч или при 37°С в течение 24 ч. 22

В этих преператах определяли иммуногенность по методу Л/1Н. Иммуногенность препаратов, инактивированных 0.75% фенолом при температуре +20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных при 37°С фенолом в такой же концентрации.

Опыты по изучению влияния трипсина и РНКазы на биологические свойства вируса бешенства показывают, что оба эти Лермента не влияют на его гемагглютинирующую и преципитгрующую активность. РНКа-за не спивает тают и ко.мплементсвязывающую активность, в то время как трипсин разрушает компле;.;ентсвязываицую активность.

При изучении под электронным микроскопом вирион бешенства после обработки трипсином в концентрации 0.15% сохраняет пулеоб-разнуто 1;юрму, однако поверхность его, по сравнению с интактным вирионом, изменена. Она вся как бы изъедена, бугриста. Двойная мембрана в некоторых местах отделяется. Эти изменения свидетельствуют о том, что трипсин отделяет от вириона некоторые белки оболочки и, так как при этом гемагглютинирующая активность препарата не снижается, к ним, по-видимому, не относится гемагглютинин. После обработки РНКазой вирион, очевидно, теряет весь нуклеопро-теидный компонент. На рисунке видна пустая оболочка, сохраняющая, однако, ;>,орму целого вириона. Рядом с плоским концом заметны скрученные в спираль нити, вероятно, представляющие собой.вышедший наружу нуклеопротеид.

Сложное строение Еируса бешенства, состоящего из двух основных компонентов - оболочки вириона и нуклеопротеида дает основание предполагать, что компоненты вириона отличаются по своим биологическим свойствам и имеют различные функции. В связи с этим мы выделили нуклеопротеид и гемагглютинин вируса и изучили биологические и физико-химические их свойства.

Нуклеопротеид получали, обрабатывая очищенный и концентриро-

23

ванный вирус бешенства дезоксихолатом натрия /ДХН/. Полученные препараты были неинфекционны, КС-активность была равна 1:16 /при 1:2-1:4 в исходном препарате/.

Изучение иммуногенных свойств нуклеопротеида вируса бешенства показало, что он не обладает иммуногенной активностью. Следовательно, нуклеопротеид вируса бешенства не иммуногенен и обладает КС-активностью. Оптимум рН для него ле.-кит в пределах 5.0-9.0.

При воздействии на препарат нуклеопротеида и гемагглютинина фенолом комплементсвязплающая и геыагглютинирующая активность не изменяется. По-видимому, этот инактивирующий агент, действуя на нуклеиновую кислоту нуклеопротеида, не оказывает влияния на его белковую часть.

На сегодняшний день при изготовлении противовирусных вакцин наиболее широкое применение из химических вецеств-инактивантов находит ^-пропиолактон. При изучении вопроса о влиянии ft-npo-пиолактона на антигенные свойства вируса бешенства мы испытывали р -прогоюлактон в следующих концентрациях: Л':8000, 1:4000, 1:2000. Учитывая, что период полураспада j} -пропиолактона в водном растворе при +37°С составляет 24-32 минуты, при +25°С - 210 минут, при +4°С от 16 до 20 ч, мы изучали инактивацию вируса бешенства Р -пропиолактоном в пределах этих сроков, а также влияние его на биологические свойства вируса бешенства /инчйекционность, компле~ ментсвязывающую, гемагглютишрующую и преципитирующую активность и гелмуногенность/ при различных температурах, длительности воздействия и концентрации инактиванта.

^-пропиолактон в концентрации 1:8000 и 1:4000 инактивировал вирус,в течение 30 минут при температуре ч-З^С, при температуре +20°С, инйекционность была равна 0 через 120 мин, а при +Й°С -через 180 после начала инактивации. С увеличением концентрации 24

^ -пропиолактона 1:2000 инактивация шла быстрее. Проведенные наш опыты показали, что на комплементсвязывающую, преципитирую-щую и гемагглютинирующую активности вируса бешенства у-пропио-лактон не влиял ни в одной из вышеперечисленных концентраций при всех исследуемых теппературах.

При используемых нами ре.;шмах инактивации вируса бешенства р -пропиолактоном мы наблюдали быстрое снижение титра инфекцион-ности вируса /на 2.5-3.0 Icj LDзо/мл^ Б пеРБне 30 мин с последующим замедлением скорости инактиващи.

Подобное явление при действии различных инактивантов на вирусы получило название в литературе "вирусный хвост". С целью выяснения его природы мы выделили 4 фракции вируса бешенства с помощью линейного градиента сахарозы 20, 30, 40 и 50%. Выделенные 4 фракции вируса обрабатывали р-пропиолактоном в концентрации 1:8000 при температуре +20°С в течение 180 мин с интервалом в 30 минут.

Кривая выживаемости исходного вируса имела характерный вид двухкомпонентной кривой. Кривые выживаемости вирусных фракций, в отличие от крирой исходного вируса, все имели линейный характер. Наиболее устойчивой к действию jh -пропиолактона /процесс инактивации длился 150 мин/ была фракция №1 с плоВостьй I.I9 г/см3, фракция ¡32, плотность 1,15 г/см3, инактивировалась ^-пропиолактоном в течение S0-II0 мин, фракция ц^з, с плотностью 1,11 г/см3, и №4, плотность 1.06 г/см3, в течение 60-75 минут.

Таким образом, фракция !i-I с плавучей плотностью 1,19 г/см3 i есть устойчивый к действию инактиванта вирус, который обуслов-швает в наших опытах "вирусный хвост".

Представлялось важным выяснить, обладает ли j} -пропиолактон, сак инактивирующий агеот, селективностью действия. С этой целью

1 25

мы изучали влияние его при выбранных ре-дамах на гемагглютинин, белковый компонент оболочки вириуса, ответственный за иммуноген-ность, и РНК вируса бешенства.

Полученный препарат - гемагглютинин обрабатывали ^?-пропио-лактоном в тех :хе условиях, что и цельный вирус. Установлено, что f!> -пропиолактон в максимальной концентрации 1:2000 при температуре +37°С в интервале от 15 до 120 мин не оказывал влияние на гем-агглютинирующую активность гемагглютинина в сравнении с исходной. При инактивации вируса в условиях температуры +4° и 20°С также не наблюдалось потери ГА-активности белкового компонента в течение всего срока наблюдения.

На основании полученных данных мы предположили, что ^ -пропиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в максимальной концентрации 0.05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности. Были проведены опыты по выяснению взаимодействия р -пропиолактона с пуриновыми и пиримидино-выми основаниями: аденозином, гуанозином, цитидином и уридином. Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спект-^ рофотометрически /по изменению характера спектра реакционной смеси во времени/ при длине волны 200-350 юл. При взаимодействии р -пропиолактона с аденозином было установлено изменение УФ-спек-тра в длинноволновой области 290-310 ни. В качестве контрольного спектра использовали спектр немо джоициро ванного аденозина. Для характеристики продукта реакции j? -пропиолактона с аденозином полученное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии. Спектр препаративного выделекля глог.^Ьицированлого продукта имел 2 максимума поглощения в области 260 нм и 305 нм, в то время, как аденозин в нейтральной среде имел максимум только в области 260 нм. При изучении взаимодействия ^-пропиолактона с 26

гугшог.ииои ток-:о бгл выделен продукт взаимодействия £ - про гаю-локтона с гуанозином.

В доступной нам литературе кн не нашли сообщений о реакции р-пропиолактона с цитидином. Однако, исходя из химического строения цитидинового ядра, а также учитывая, что ^ -пропиолактон -алкилирующий агент, мы предположили возможность взаимодействия его с цитидином. Проведя обработку цитидина ^5-пропиолактоном, бгло выделено модифицированное вещество, котордоотличалось по своему спектру от спектра поглощения цитидина. Мы так-:е провели опыты с уридинон, которые показали отсутствие взаимодействия -пропиолактона с этим нуклеозидом в выбранных нами условиях. Таким образом, аденозин, гуанозин и цитидин взаимодействуют с ^-пропиолактоном с образованием новых, модифицированных нук-леозидов. Полученные данные дают основание сделать вывод, что потеря инекционности вирусом бешенства в результате обработки его инективирую!!(им агентом ^ -пропиолактоном объясняется взаимодействием этого инактиванта с основаниями Й1К: аденозином, гуанозином и цитидином.

2.3. Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Для получения очищенных и концентрированных: препаратов вируса КРТ КРС были испытаны те /.е принципы выделения вирусов из суспензий, что и вируса бешенства. Надо отметить, что практически эти принципы позволяют выделить препарат вируса ИРТ в очищенном Биде, но нельзя переносить условия выделения вируса бешенства полностью. В каздом случае необходимо подбирать было условия, которые позволили получить очищенный препарат без существенных потерь.

Мы исследовали влияние этих методов на биологические свойства вируса ИРТ и возможность использования полученних препаратов в качестве а.нтигенов при различных серологических реакциях.

Для определения гемагглютинирующей /ГА-/ активности вируса ИРТ испытали эритроциты.барана, гуся, петуха, морской свинки, кроликов, мышей и крыс. Выявить ГА-активность исходного вируса удалось при использовании эритроцитов мышеи /1:4-1:32/. После гон-центрировгния вируса в 40 раз различней методами: ультрацонтри-фугирования, ультрафилтраг?«!, адсорбции-элюцип с геля Л1Р0Д и центрифугирования в градиенте плотности 40% сахарозы были подуче-ш следующие результаты. Наибольшие титр:? ГА-активности били у препаратов, получешпг: ультрлиильтрачцо? и центр»'угироваикя в гра/п,иенте сахарозы при использовании эритроцитов 1 илиеи. Эритроцит -доос::оН спинки , о'гргпа п крысы давали тятрг в £-{'; раз шг-е. Оритроинтг гуся, петуха и кролика эти -;с препараты агглютшшро-юали па ypor.uo последи ::кеек;1к рогжцл.' контрольных препаратов, ьолучепл:'.: тс- к -:о нстоде:ш ¡13 нсз-ч.р:г :сшчо". клеточио'; культуре.

При испытании концентрации 0.5% и 0.25% суспензии эритооци-тог. милей при постановке РТА установлено, что наиболее чувствительна: индикатором является 0.^5% суспензия эритроцитов, которая дает и наиболее стр&шлеч} репульт.чтк. ¿или определены температурные условия, даюлце наиболее стабильнее результаты и время прохождения реакции. Реакция проводилась при температуре 0° /на льду/, -|4° и +20°С в томские 2, 4, 5, 6, 18 ч. Установлено, что оптимальными является температура -|4°С и время 2-4 ч.

Буферная система к ее рН играют гл-сную роль при постановке серологических реакций. Б связи с этим мы испытали следующие системы: ^осфатно-бу.ерный раствор /ФБР/, Физиологически:1 раствор /§Р/ без и с добаЕлепиек1% нормальной сыворотки кролю; 1 и борет-28

шлй бу'ер /Б^/ без и с добавлением бычьего сывороточного альбумина 0.5",I, с рН S.0, 7.5 и 5.0. Установлено, что практически все бу ернке системы при рН 7.5 мо:.ло испольпов.-.ть при постановке РТА; тг.к как нп одна из них не оказывает резко выраженного влияния на ход реакции, однако более воспроизводимые резуьтатн получали при использовании ФБР с добавление!". г;£ нормально:1» сыворотки кролика. Надо отметить, что бу.ерные системы при рН S.0 дают, как правило, результаты в 2-4 раза ни те, 1;сы при рИ 7.5, а при рН 5.0 эритро-t^-iti' всех пеглттапных ..ивотных, кроме гусиных, лияировали.

Таким образом, были определены оптимальные условия постановки РГА для определения ГА-активности вируса ИРТ: реакция идет при использовании эритроцитов мышей в концентрации 0.25^ в ФБР с добавлением нормальной сыворотки кролика, рН 7.5, температуре 44°С в течение 2-4 часов.

К числу диагностических реакций при ИРГ КРС относится реакция связывания комплемента. При исследовании исходного культураль-ного гируса отмечали нерегулярное и слабое связывание комплемента с ип.унныги сыворотками. При использовании тех :~е концентрированна препаратов, что и в РГА, комплементсвязывающая /КС-/ активность повышалась. Так, при концентрировании вируса ультрафильтрацией и центрифугированием в градиенте сахарозы титр КС-активности повышался с 0-1:8 в исходно:! суспензии до 1:16-1:64, адсорбции-элюции с геля А1Р0Д - до 1:4-1:32. В рездоьтате высокоскоростного центрифугирования КС-активность вируса в препаратах не была выше 1:4. Г' _ . U •

Та:::::.: обраг.-ом, в результате концентрирования вируса ИРТ КРС мето.гои ультраяильтрации и центрифугирования в градиенте сахарозы получен активный "и специфичный КС-антиген для постановки ГСК при определении уровня КРТ-антител в сыворотках зараженных и переболевши-: -иботих. oq

Вирус исходной суспензии в РДП определить практически не удавалось. Титр определяли в редких случаях не вше 1:4. В результате концентрирования вышеописанными методами удавалось повысить титр преципитирутощей активности до 1:8-1:16.

Итак, в процессе концентрирования вирус ИРТ не теряет своих биологических свойств: гемагглютинирующую, комплегентсвязывающую, преципитирующую и инфекционную активность. За счет концентрирования активность препаратов повышается в 4-8 раз.

Прш определении условий хранения вируса ИРТ КРС его помещали в условия температуры -50°, -20°,' -7°, +4°, +20° и +37^0. Вирус хранится в условиях температуры от +4° до -50°С практически без снижения титра инфекционности в течение I мес. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на ЩЦед/мл практически ежемесячно. В течение первых суток титр инфекционности вируса ИРТ КРС снижается с 6.5 до 5.5 в условиях температуры +20° и до 4.5 -при +37°С. Далее при +37°С титр инфекционности снижается до 0 через 5 суток и до 2.25 -при +20°С.

Белковый состав вируса ИРТ ,штамм ТК А/ВИЭВ/В2 изучали с помощью электрофореза в ПААГ с добавлением ДСН. Для этого использовали вирус, меченный 3Н-глюкозамином. Электрофорез в ПААГ позволил выявить в составе вирионов 33 белка, 6 из них являются мажорными, их масса составляет 66.18% от общей массы белков вирионов, II белков гликозилированы, 10 из них являются поверхностными. Вирусные белки, индуцирующие выработку ИРТ-антител у восприимчивых к ИРТ КРС животных, определялись посредством иммуноблотинга с индикацией бедков в непрямом методе ША. У переболевших животных вырабатываются антитела к 9 гликозилированным и 3 негликози-лированным белкам.

Распространенным методом определения антител протиЕ ЮТ КРС

является реакция вируснелтрализзции. Однако, в связи с длительностью реакции, многие исследователи применяют другие серологические методы, которые дают высокий коэффициент корреляции с РН. Одной из самой распространенной реакцией является РИГА. В качестве антигена при постановке реакции мы использовали вирус, концентрированный в 40 раз ультрафильтрацией, который добавляли к ганнизиро-ванньш и „ормалинизироБанным эритроцитам мышей.

При сравнительной оценке титров антител в сыворотках, определенных в БИТА, РДП, РСК и И1 получены следующие результаты. Появляются ВН-антитела' на 7 день после заражения и достигают наибольшего титра к 21-28 дню. Затем идет снижение уровня ВН-антител. Преципитирующая и КС-активность выявляются в сыворотках на 5 день после заражения, тогда как ВН-антитела еще не выявляются. Динамика образования этих антител аналогична динамике образования ВН-антител. Титры ВН-антител в Ш были в 8 раз выше, чем в РСК, 32 раза-в РДП, в 2-4 раза - в ШГА.

С развитием биотехнологии, в частности, гибридомной, появилась возмо::яость создания более эффективных диагностикумов. Получение моноЕЛональннх /МКА/ антител и их применение позволяет рассчитывать на существенное усовершенствование методов диагностики и индикации вирусшз: ин;екций. При получении гибридо?,;, продуцирующих антитела к антигенам вируса ХРТ К?С для иммунизахдои использовали самцов гибридной линии мышей ВА1В/с, в качестве антигена -•хмепщий оболочку вирус. Выход составлял 100-300 млн спленоцитов 1а одну селезенку.

Для ка-дого из 6 прозедеши-х слпяын : с плззиоцитомнши клет-саш использовали спленопдтп от одной шин. Всего быхо проведено ю 3 слияния с х;лет::ами ыиелоыг линии Р5л/0-А^14 и 1/4.

1ли:пше проводили по мо,ци,иг,нро ванной методике Кок£еъ/19%/.

Через 4 дня после слияния заменяли половину среды в лунках на свежую порцию селективной ГЛТ средн. Через 20-;Л день ГАТ среду заменяли на ГТ сроду. Скрининг клонов, проудуцтрующих антитола к антигенам вируса ИРТ, вели с помощью непрямого твердофазного ИМ. Большинство работающих в ША клонов /83%/ были слабыми продуцентами антител. 12 высокоактивных в Ий1 I.; 2 активных в Ш клона были реклонировани методом предельных разведений.

В результате клонирования было получено 16 высокоактивных в ИЗА реклонов, 10 из них оказались нестабильными, требующими дополнительного реклонирования. Шесть клонов наряду с высокой продуктивностью антител оказались достаточно стабильны и были отобраны для дальнейших исследований в иммуноблотинге и различных серологических реакция::. Юняг.: 8-Д5 :: 11-Р5 лро^труэт антитела к вирусному белку 1(2.1 77 НД, клон 4-Е7 - к дв^и белкам - 77 и 140 КД, 6-Д£ и 4-С9 к гликопрогеида-м. 54 и XI кд, соответственно, 1-В6 - к негликозилироЕанноиу белку -65 ДД. Клонн 1-В6 и 6-Д' работали в РДП, 4-Е7, 8-Д5 и 11-Р5 - в Ш, 4-С9 - в РТГА. Ни один из полученных клонов не был активен в РСК.

Растущие потребности в высокоспецифичных моноклональных антителах требуют разработки эффективных методов их очистки. Очистку ЫНА вели с помощью а'фптпой хроматографии на протеин-А-сефарозе 4В и на ВгСл/-сефарозе 4В с иммобилизованными в качестве ллганда вирусным белками. Оба метода дали идентичные результаты для все?: клонов по степени очистки, которая составила 59%. Однако активность в И5А на I иг антител, снятых с протсин-л-сесдррозы, была на 10% виде.

1.П. й.а^'ноферыентный анслиз в диагностике гирусов бепепства и ни сирошюго рнпотрзхеита крупного рогатого скота.

Для определения уровня антнрг.бк''есккч антител отработали же-

тод ИЗА и сравнили его с 3 методам, наиболее часто употребляв-шчл-1 в практике: РН на ¡ъслах, рЦ1 и РСК. В качестве антигена использовали вирус бешенства, репродуцированный е бессывороточной среде /Селимов "1., 1982/, с титром ин^екционности 5.5-6.5

инактивированный ^-пропиолактоном, и гемагглютипин вируса, в качестве стандартного контрольного вируса использовали-вирус CVS • Были исследованы партии сывороток крупного рогатого скота, кроликов и лис.

Наименее эффективным оказался метод РДП, активность в котором проявляла только I сыворотка. В РСК выявлялась большая группа сывороток, но чувствительность метода была недостаточной для обнаружения антител в слабополо:;:ительных образцах. Метод непрямого И-5А превосходил по чувствительности РДП и РСК и его показатели были наибольшей степени адекватны результатам Ш, если в качестве антигена при постановке анализа использовали гемагглютинин. Измеряемые в ИМ титры снтарсбичоских Антител были несколько ветше при использовании для анализа цельного вируса бешенства. Так как рабический гликопоотенд явллется белком шр;са, ответственны; за индукцию ВН-антител, его использование в качестве антигена для И5А длет возможность "настроить" анализ на выявление' ВН-антител. Установлена линейная корреляция связи ме::ду результатами РН и ИША при фиксированном разведении cbiBopoTKn:x=0.S4, P4.0.0I.

Группа сывороток КРС и лис после вакцинации культуральной антирабической вакциной, изготовленной ео ВНИТИБП /лаборатория вирусологии/, была исследована в РН и И5А. Получены аналогичные результаты с предыдущим опытом. Корреляционной зависимости между результатами, получении® в РСК, РДП и ISA, РН не установлено. Метод. У~А мо :но рассматривать, как быстрый метод определения т:;тра "нтител в антирабических сыворотках.

При определении содержания антигена бешенства в вируссодер-жащей суспензии, использовали метод ИФА, РТА и ,У1Н. Препараты культурального вируса бешенства, не активные в И$А, имели индекс иммуногенности < 0.3 и низкие титры в РТА /1:2-1:4/. С возрастанием активности в ИФА от 1:5 до 1:80 увеличивался титр в РТА с 1:4 до 1:64, а индекс иммуногенности до 0.96. Подобная корреляция, наблюдаемая в наших опытах, согласуется с теоретическими предпосылками. Так как гемагглютинин вируса бешенства, обуславливающий гемагглютинирующую активность, ответственный за иммуногвн-ность, участвует, по-видимому, в KSA, то этим должно быть и объясняется коррелятивная зависимость в титрах реакций РТА, ША и «.IflH. Как эффективный, экономичный и быстрый метод определения уровня накопления антигена вируса бешенства ИОА может служить с успехом для контроля в процессе культивирования вируса.

Для выявления специфических антител к вирусу ЧРТ в сыворотках животных нами получены очищенный и концентрированный антиген, специфическая и отрицательная анти-МРТ сыворотки и коньюгат анти-IgG-KPC с пероксидазой.

Кроме очищенного и концентрированного вируса из г-нрус.содер-жащей суспензии, имеющей в ИЗА титр I:640-I:I:.80, антиген выделяли из инфицированных вирусом ПРТ клеток. Клетки обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кгц, плотности 2-2 ватт/мл, импульсивно 6 раз по 30 сек.

Методом ША исследовало более 3000 сывороток КРС, полученных из различных хозяйств страны, и определены благополучные и неблагополучные хозяйства по отношению к ИРТ КРС.

Из всех исследованных сыьороток произвольно взяли 107 с установленным титром в ISA и исследовали в РИГА, РД1, РСК и Ш.

Сравнивали результаты, полученные в ИФА и ШГА. 28 сывороток отрицательных в ШГА /26.°%/ были положительными в 1@А. Коэффициент корреляции равен:t=0.86, Р< 0.01. Преимуществом метода ШЛ является его более высокая чувствительность, чем FHTA. Титры, полученные в ИМ, в 10-20 раз выше, чем в РИГА. При сравнении уровня антител, определенных методом РДП и ИМ, 40 сывороток /37.5%/ , отрицательно реагировавших в РДП, в ИМ дали положительную реакцию. Титры в РДП были в 100 и более раз ниже титров, полученных в 1'йА.

Сравнительные исследования 107 сывороток КРС в ИМ и в РН показали, что S7 образцов, которые имели в РН титр антител 1:4 и випе, давали в ИМ значения СП^дд /при разведении сывороток 1:200/ выше 0.15. Кроме того, 3 из 10 отрицательных в РН сыворо-то:: имели в ИМ небольшие положительные значения /On^gQ= 0.1660.17В/. Чувствительность ИМ в 10-50 раз выше, чем РН. В результате сравнения титров сывороток, установленных в ИМ и РН, получена выраженная корреляция /t = 0.94+ 0.06, Р^. 0.01/.

Простой визуальный учет результатов ИМ позволяет оценить пологотельные сйворотки, в связи с чем анализ может быть проведен в отсутствии спектрофотометра.

В результате проведенных исследований, были созданы "Набор для иыыуноферментной индикации антител и антигенов вируса бешенства крупного рогатого скота",который разрабатывался совместно с сотрудниками лаборатории иммунологии Сазановой Э.Я., Масловым Е.В. и лаборатории вирусологии - Ивановым B.C. ВНИТИЕП я "Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", который разрабатывался наш совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии Г.ША Смоленским В.И. и Непоклоно-вой И.В. /зав. кафедрой - академик ВАСХНИЛ, профессор Сюрин В.Н./.

После проведения комиссионных: лабораторных испытаний наборов, согласно приказу ГУВ г.? 53 от 15.04.86, проведено широкое производственное испытание наборов. В 1988 г на ГЩЕК было изготовлено в производственных условиях по 300 наборов для иммуно.'т,ерментной диагностики вирусов бешенства и ИРГ КРС. В начале 1989 г опытно-производственная партия наборов была предъявлена межведомственной приемочной комиссии,'назначенной приказом по ГУВ II от 09.02.89. Комиссия на основании испытаний разрешила реализацию биофабричной серии наборов. Изготовленные в 1989 г наборы полностью реализованы. После проведения всех испытаний НТД на наборы была утверждена в установленном порядке.

3. ВЫВОДЕ

. 3.1. Разработан метод очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелкова 51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, включаю^й ультрафильтрацшо, адсорбцию-элюцию на геле госфата алюминия, оса.^ение ПЭГ, высокоскоростное ультрацентри'у-гирование и центрифугирование в градиенте плотности сахг.розк. Метод позволяет получать очищенные на 99.99% от 'балластнк-с белков препараты вируса.

3.2. Изучены биологические свойства вируса бешенства, штамм [фзлково-б!, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13. Вирус обладает комгшементсзязывающей, гемагглютшшрующей и преципити-рующей активностью. Своя биологические свойства вирус сохраняет в пределах рН 5.0-9.0. РНКаза в концентрации 0.02% и трипсин выше 0.05% существенно снижают титр инфекционности и изменяют морфологию вирионов. Вирус сохраняет комплзментсвязьтвающую, гемагг-лтотин^гаующуп и прецппитирующую активности нзигдоннпдо в течение 2-3 -гзскюз па:: т;-пера—ре -7° и -50°С.

3.3. Культуральнг"' гирус бешенства, ntrnr Уелково 51, чувствителен к повышенно:'. тетшсрст; рс. Прогревянпе при +!Х° п 62° С приводит к потере ин'екционнооти и иммуногс-пности л:руса чо:юя

60 и 45 минут соответственно.

3.4. ¿епол в коидснтргм-дк 0.инактчшруст шг склонность культуррльиого .-.пруса бешенства в точение ч при температуре +20°С и в тег-очие 24 ч при +:,7°С. Индекс кммуногсныости препаратов, инвктирирогоншт: еиолом пол +20°С, в 2 pona превышает индекс и^уыогеплости препаратов, oííprt^oTPшк'•■с при +37°С. Обработка ^енолом как при +20°С, ток и при +¿7°C сопровождается разрушением и!'.::.'? ногега-п"с сузоЛств впркопов.

С.5. р-нропполактон в конечной концентрации 1:8000 /0.01г5%/ инактивирует шм екцпонность кул&турслыгого вируса бешенства при температурам +4°, 20° и Л7°С в течение 180, 120 и СО мин. соответственно, в нон; ,ентр-ш, ии 1:4000 и температуре +20°С - в течение S0 мин и в концентрации 1:2000 и температуре +4°С - в течение ±50 мин. При обработке ькруссодержащей суспензии ^ -прогоголактоио'' в указ: ли: к ос .имач индекс нп.'уногснностп препг.рзток сохраняет; с в предела::: 1.0+0.2. Нелинейность скорости ияакптнрт культ. ач--ного вируса бешенства ^-пуоп:ю:мк7о:гоы зависит от гзтзро:'г ч: л: популяции ЕИр^са. Причино1" ,о0усларлива-п':;еч "гируспмй •rroci'" . процессе м:г. ктиааицп, .-гл : тс: наличие в популяции "ргкц;;.: ."о... . . сто:"".чро" к го; дс"г;т1;:п лп; ктч—апта .

.'.6. Гст'.чо-зла-мо при «-y!Gin:¡: мех'-'ппзма В'.:аиы!:дейст»а:л J -пуогтчоламаон? с пурхнол-"л и пирн''ид::ноз!а;и основан:;::;::: вдруг,: -?ИК, что по с::о;остп взаимодействия мссл°'З'емке нуклеоанды г»с-полагактся в следующий ряд: гуапозин /60 90 мин/, адепоачч / УС -120 м::н/, цктидлн /120 150 : ин/. ?У ::енс!::;я в ГШ, га-акнасае в:.пп.-.о. ,0 'ctí ием ^-щопиола.у.тоыа с основа пнями, гжчвод.чт к ее

37

инактивации. Препараты вируса бешенства, обработанные ^-пропио-лактоном в исследованных ре..:имах, не обладают ин екционностыэ, но сохраняют иммуногенность в результате различия скоростей модификации генома и белкового капсида вируса.

3.7. ^-пропиолактон, как инактивирующий агент, обладает преимуществом по сравнению с Фенолом. Он инактивирует инпекционность вируса бешенства полностью и необратимо, сохраняя иммуногенность на высоком уровне. Сам у'-пропиолактон в процессе инактивации вируса гидоолизуется на нетоксичные для орган/зма компоненты.

3.8. Нуялеолрогеид вируса бешенства выделяется при обработке вируса дсзоксихолатом натрия и проявляет только комплементсвязы-вающую активность. Свои биологические свойства нуклеопротеид сохраняет в пределах рН 5.0-9.0. Препарат сохраняет активность в течение одного месяца при температурах -50°, -7° и +4°С.

3.9. Гемагглютинин отделяется от вируса бешенства при воздействии на него сапонином. Препарат гемагглютинина проявляет высокую гемагглютинируюцую, а так:=:е коглшюыентевлзгваютту к преципи-тирующую активность, йнактивирукцие агенты енол и ^-пропиолак-тон в условиях проведенных исследований /концентрация 1:8000, 1:4000 и 1:2000 при температурах +<1°, +20° и +".7°С/ не влияет на гемагглютинирую:цуы активность препарата. Свои биологические свойства препарат гемагглютинина сохраняет в пределах рН 5.0-9.0. Препарат сохраняет активность е течение одного месяца при температуре -50°С. Гемагглютинин вируса бешенства является структурным компонентом, ответственны!.: за его иымуноганную активность. Препараты гемагглютинина обладают в 1.5-2.0 раза более высокой им.-у-ногенностью, чем использованный для их получения вирус, и вызывают в £ раза более интенсивное образование ыкруснелтрализующих антител в крови иммунизированы! к :ивотн1Х.

с /

^.10. Шзработан метод очистки и концентрирования вируса /¡РТ КРС, штамм Гк А/БИЗВ/Вл,, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80,включающий ультра.ильтрацию, оса :дение ПЭГ, высокоскоростное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и : иколл-400. :.:етод позволяет получать препараты с титром ин екционности вируса на дьа порядка Еыше, чем в исходной суспензии, степень очистки вируса достигает 90%.

3.11. Ззучены биологические свойства вируса ИРТ КРС, штамм ТК А/ЬЛаВ/ьЕ, репродуцированного в культуре клеток ГГГ-&0. Очищенный и концентрированный Еирус ЛРТ КРС обладает комплементсвязьшаю-цел, гемагглютинирующей и прецицитирующей активностью. Вирус сохраняет биологическую активность в течение одного месяца в условиях температуры +4°, -V"0, -20° и -50°С практически без снижения ин-екционности с дальнейшим понижением на I Щ%о/мл егсэыесячно.

З.Т.2. Вирус ]1РТ КРС, концентрированный в 40 раз методом ультра ильтрации и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, авляетсл активным и спец^ичным антигеном длл реакции непрямой гепагглютинации. Разработаны условия постановки РТА и РИГА при определении гемагглютинирующей активности вируса и уровня ИРТ-антител. Реакция идет при использовании мкниных эритроцитов в концентрации 0.25% в оосфатно--бу. ерном растворе,. рН 7.5, с добавлением Т/* нормально;'! сыворотки кролика, при температуре +4°С в течение 2-4 часов.

3.13.Препараты вируса 1гТ КРС в процессе очистки и концентрирования не теряют биологических свойств. За счет концентрирования активность препаратов вируса повышается в 4-8 раз и они при/ годны для использования в качестве антигенов в серологических реакциях при ,диагностике ИРТ и определении титра антител в сыворотках крови вакцинированных против ИРТ .давотных и определении актив-

39

kocïu гшфиздупют сгвоооток, а так :с для ИМ :i из^ешя гизюсо-хи.шческпх свойств шруса.

3.14. Получены гибридош, синтезтрутатие ИРТ-ыоноклопальные антитела. Л,.ф;;нпая очистка ii.l оелок-А-се ^арозе 4В позволила получить на 995» очищенные Препараты ыоноклональнкх антител с сохранением специфической активности.

3.15. На основе очищены;,'х, кои-.ептрироБашг.х и инактиБирован-ньх биопрепаратов разработаны компоненты .м^агностик^шв для индикации вируса бо,цзнства и "|УГ ;{РС и определении уроыш актпрабичес-ких и йЛ'-антител в сыворотках больных и переболевших .мвотнкх в имыуно _ерментном анализе.

3.16. При сронительной оценке различных методов определения уровни аптирабическпх апитчл наименее осу'юктипнки оказался метод, РДП. РСК недостаточно чувствительна. обнару. .зник актктел в слабо поло: 'ителышх сыворотках. Метод '.LA превосходит по чувствительности РДП и РСК и его показатели в н/шболыявУ степени адекватны результатам РН. Установлена линейная коррелятивная зависимость ме...ду результатами, ¡юлученнкми в RI у. /1=0.94, Р<0.01/. Корреляционной зависимости ыз.^у рэз^льтатами, получен»rai в РСК, РДП и'Ж'Л, РН не установлено. Цетод 1йА по чувствительности превосходит метод РН в раза и может применяться для определения уровня Екрус;ю:1трализую.^их антител.

3.17. При сранительно/. оценке различных методов о пределе .ия уровня лРТ-антител установлено, что прл сравнении результатов, полученных в И'ЗА и FHFA, коэффициент корреляции равен: х=0.С6,Р43.01 а ИФА и РН - т=0.94+0.Об, Р<0.01. Ь РДП получены наиболее низкие титры. Преимуществом метода И4А является его более высокая чувствительность, чем РДП - в 100 раз, РЫТА - в 10-20 раз, РН - в 1050 раз. Метод vM может применяться при определении уровня вирус-40

нейтрализующих антител при исследовании большого количества сывороток.

3.18. Разработана технология получения "Набора-для иммуно.ер-ментнои индикации антител и антигенов вируса бешенства коупного рогатого скота" и "Набора для диагностики иммунойерментным методом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота". Наборы изготовлены на Государственном Шелковской биокомбинате и реализованы. НТд га "Наборы" утаср. ,'.ены в установленном порядке. ТУ на "Лабор , ля ш я- у ко ермеитнок диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота переданы в „ДО;.; Госстандарта 18.08.89, г, с зарегистрированы под л- 005/019669.

4. 11РЛ1СГЙЧЕСКИЕ ПРВДШЖЕНИЯ

4.1. "Инструкция по изготовлению и контролю набора для имму-но.ерментно.. индикации антител и антигенов вируса бешенства крупного рогатого скота", утвер ;.,енная ГУВ Госагропрома СССР 29.07.88.

4.2. Технические условия "Набор для иммуно^ерментной индикации антител и антигенов вируса бешенства крупного рогатого скотаУ утвер -денные ГУВ Госагропрома СССР ¡¿5.07.83.

4.о. "Наставление по применению набора для иммуноферментной индикации антител и антигенов вируса бешенства кругпного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 29.07.88.

4.4. " методические рекомендации по применению имыуноферментного анализа для выявления вируса в процессе репродукции и анти-рабнческих антител в сыворотках крови животных", одобрена на'заседании секции "Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней. мявотшх" отделения ветеринарии ВАСЛШ 14.01.88.

4.5. 8 методик по получению антигенов для серологических реакций при диагностике бешенства, утвержденные Методическим Советом ВгйТКБП в период с 1975 по 1580 гг.

4.6. "Инструкция по изготовлению и контролю набора для имму-

\

но^ерментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рог ■

гатого скота", утвержденная ГУВ Госагропрома СССР 0I.08.8S.

4.7. Технические условия 10.IS.97-89 "Набор для иммунофер-ментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные 01.08.89 ГУВ Госстандарта СССР и зарегистрированные МЦ0М Госстандарта под № 005/019669 от 18.08.89.

4.8. "Наставление по применению набора для ю.ьупоферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР от 02.01.89.

4.9. "Методические указания по лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммунофермент-нын методом", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР от 02.01.89.

4.10. 3 методики по получению антигенов для серологической диагностики инфекционного ринотахеита крупного рогатого скота, утвержденные Методическим Советом ВНИТИБП в период с 1981 по IS84 гг.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕ!-,IE ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ устранения антикомплекентарной активности антигенов" - авт.св., №-303075 от 23.02.71.

2. Кузнецова C.B., Передереев H.H., Кузнецов П.П., Игнатьева B.C. - Очистка и концентрирование вируса бешенства из тканевой культуры полиэтиленгликолем.// Ветеринария, IS74, 9, 2, 42-43.

3. Кузнецова C.B.-, Исаевич Л.-В., Передереев Н.И., Кузнецов П., Иванов B.C. - Нуклеопротеид вируса бешенства, его выделение и биологические свойства.// Тездокл.науч.-произв.конференции ВГНКЙ, 1974, 26-28.

4. Кузнецова C.B., Передереев H.H., Кузнецов П.П., Простяков А.П., Игнатьева B.C. - Метод получения а^гтирабическай сыво-

ротки.// Тр.ВГНКИ, IS75, XXII, 51-54.

5. Кузнецова C.B., Исаевкя Л.В., Передереев Н.И., Кузнецов П., Иванов B.C. - Очистка и концентрирование вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВЖ-21/13, на геле фосфата алюминия.// Ветеринария, 1976, 5, 49-50.

6. Кузнецова C.B., Исаевич Л.В., Скороходоза Л.А., Передереев Н.И., Кузнецов П.П. - Биологические свойства вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВШ-21/13 и концентрире-ванного на геле фосфата алюминия.// Передовой науч.-произв. опнт в биол.промш., 1976, I- 13-15.

7. Исаевич Л.В., Кузнецова C.B., Кузнецов П.П., Передереев Н., Иванов B.C. - Влияние рН средь; на биологические свойства вируса бешенства. // Передовой науч.-произв. опыт в биол.промышл., 1977, 6, 3-5.

8. Кузнецош C.B., Исаевич Л.В., Блехерман Б.Е., Передереев Н., Кузнецов П.П. - Влияние трипсина и ИЖазы на морфологию и биологические свойства вируса бешенства.// Ветеринария, 1977, 8, 46-48.

9. Исаевич Л.В., Блехерман Б.Е., Кузнецова C.B., Передереев П., Кузнецов П.П. -Уорфология вируса бешенства, репродуцированного

в культуре клеток БНК-21/13.// Аокл.ВАСХНИ1, 1978. I, 31-33.

10. Сазанова Э.Я., Кузнецова C.B., Кузнецов П.П., Иванов В.С.-Влияние температурь; на вирус бешенства. // Ветеринария, 1978,

9, 44-45.

11. Сазанова Э.Я., Кузнецова C.B., Ккзнецов П.П., Иваноз В.С.-Инактивация вируса бешенства ^-пропиолактоном.// Передовой нач.-произв. опыт в биол.промышл., 1973, 2, 3-5.

12. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Кузнецова C.B. - Антираби-ческая вакцина из фиксированного штамма вируса бешенства, адаптированная к перевивемой линии клеток БЖ/21/13.// XXI Всемирный

43

вет конгресс, 1979, секция УН, 3, 38, Москва.

13. Сазанова Э.Я., Кузнецова C.B., Кузнецов П.П., Иванов В.С.-Иммуногенность вируса бешенства, обработанного фннолом, ^э-пропио-лактоном и теплом.// Ветеринария, 1980, 3, 32-33.

14. Кузнецова C.B., Кузнецов П.П., Иванов B.C., Исаевич JI.B.-Нуклеопротеидный комплекс вируса бешенства, репродуцированного

в культуре клеток BHK-2I/I3.// Передовой нач.произв. опыт в биол. промышл., 1980, 3, 27-30.

15. Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я., Кузнецов П.П., Иванов В.С.-Гемагглютжюн вируса бешенства.// Акт.вопр. внт.вирусол., 1980, 112, Казань.

16. "Штамм фиксированного вируса бешенства "Целково-51"-авт.св. А 61 К 39/205, 2977 598/15 /8878 68/ от 12.02.81.

17. Кузнецова C.B., Влехерман Б.Е., Кузнецов П.П., Иванов В.С.-Получение очищенного и концентрированного культурального вируса бешенства.// Вестник с/х науки, 1981, 6, 65-70.

18. Кузнецова C.B. - Гемагглютинин вируса бешенства и его свойства.// Ветеринария, 1981, 7, 32-33.

19. Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я., Панферова С.LI., Кузнецов П.П., Иванов B.C. - Концентрирование культурального вируса бешенства методом ультра^ильтрации.// Передовой науч.произ опыт . в биол.промышл., 1981, 2, 3-4.

20. -Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я., Кузнецов Л.П., Иванов В.С.-Иммуногенность гликопротеида, выделенного из культурального вируса бешенства.// Тез. докл. "Разработка, апробация и гос.контроль вет.препаратов", 1981, 79, Москва.

?Л. Сазанова Э.Я., Кузнецова C.B., Кузнецов П.П., Блехер-ман Б.Е., Иванов B.C. - Влияние гетерогенности состава вируса бешенства на скорость его инактивации.//' /ркл.ВАСХНИЛ,1982,11,41-43. 44