Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование вируса бешенства штамма Внуково-32 в культуре перевиваемых клеток для производства антирабической вакцины

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование вируса бешенства штамма Внуково-32 в культуре перевиваемых клеток для производства антирабической вакцины"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. М.П.ЧУМАКОВА

Волк

На правах рукописи

лита Витальевна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСА БЕШЕНСТВА. ШТАММА ВНУКОВО-32 В КУЛЬТУРЕ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Государственного предприятия НПО "Иммунопрепарат".

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, вед.н.сотр. Р.С.Шафеева

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАЕН ТА.Бектимиров

Ведущая организация: Институт вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, ст.н.сотр., В.В.Хозинсюш; доктор биологических наук, профессор В.В.Гуненков

Защита состоится: " М " /¿Л1! 1997 г. в ^ час. на заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан " ^" ¡уСс^с-^^и^^ 1997 г

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук О.А.Медведкина

р Я ¿"(О/ Аа^о-^с^е о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалыгость проблемы. Бешенство остается постоянной угрозой для человечества во многих частях света. Ежегодно регистрируется более 30000 случаев смерти от бешенства и 4 млн. человек требуется постэкспозиционное лечение более чем в 80 странах, где болезнь существует в наиболее опасном резервуаре инфекции среди собак (М.А. Селимов, 1965-1975; Vodopija Ivan, 1988; WHO, 1994).

По сводным данным ВОЗ в 1989 г. в мире отмечено 1670 вирусологически подтвержденных случаев бешенства у людей. За период с 1977 по 1990 г.т. в Европе зарегистрировано 108 случаев бешенства людей в 14 странах (Dtsch. Artebl., 1994). Заболеваемость этой инфекцией на 100 тыс. населения в России возросла с 1981 г. по 1991 г. в 2 раза. Ежегодно в стране прививается от бешенства около 200 тыс. человек (обращаемость составляет около 130 на 100 тыс. населения в год) (М.А.Величко, 1994).

Единственным методом предупреждения и лечения этого заболевания по-прежнему являются антирабическая вакцина и рабический иммуноглобулин. Поэтому необходимость усовершенствования и разработки новых эффективных и безопасных антирабических вакцин является наиболее реальным путем улучшения антирабической помощи.

Многочисленными исследованиями подтверждено, что в сравнении с мозговой вакциной и вакциной, приготовленной на куриных или утиных эмбрионах, культуральная вакцина на первичных клетках почек сирийского хомяка или диплоидных клетках человека является более безопасным препаратом (М.А.Селимов с соавт., 1965-1974; В.М.Морогова с соавт., 1980, 1981; P.Fenje, 1960; Y.Crick, F.Brown, 1970; S.Sehgal, 1992).

Культуральная вакцина на первичных клетках почек сирийского хомяка, впервые лицензированная в нашей стране для лечебной иммунизации человека, изготавливается с 1974 г. в ИПВЭ АМН СССР и с 1976 г. в НПО "Иммунопрепарат" (г.Уфа). Многолетними наблюдениями подтверждена ее высокая эффективность и хорошая переносимость при

профилактическом лечении многих тысяч людей, укушенных явно бешеными животными (М.А.Селимов, 1986).

Однако в свете последних практических достижений в области биотехнологии клеток животных, в качестве субстрата для изготовления противовирусных инактивированных вакцин приоритет отдается перевиваемым гетероплоидным клеткам. Их применение позволяет накапливать вируссодержащий материал с большим инфекционным титром и в больших количествах, а приготовленная вакцина, как правило, является более безопасной и имеет более низкую себестоимость (B.Y.Montagnon et al., 1981, 1983; R.E.Spier,1992; WHO, 1994).

Целью нашего исследования являлось изучение возможностей культивирования вируса бешенства штамма Внуково-32 в культуре перевиваемых клеток Vero для производства антирабической вакцины. Задачи исследования:

1. Подбор субстрата перевиваемой клеточной линии для успешной репродукции вируса бешенства штамма Внуково-32.

2. Адаптация штамма Внуково-32 к культуре гетероплоидных клеток зеленой африканской мартышки Vero.

3. Изучение репродукции штамма Внуково-32 при различных методах культивирования в культуре клеток Vero.

4. Поиск оптимальных условий суспензионного метода культивирования штамма Внуково-32 в культуре клеток на отечественных микроносителях.

5. Масштабирование процессов культивирования вируса бешенства, штамм Внуково-32, в культуре клеток Vero.

6. Получение экспериментальных серий антирабической вакцины в культуре клеток Vero на отечественных микроносителях.

Научная новизна и практическая значимость: - впервые изучена репродуктивная активность штамма Внуково-32 в перевиваемых клетках Vero, культивируемых различными методами (стационарным, роллерным, псевдосуспензионным);

впервые определены оптимальные параметры культивирования клеток Vero и вируса Внуково-32 на отечественных микроносителях;

впервые определены оптимальные условия крупномасштабного культивирования вируса бешенства Внуково-32 в псевдосуспензионной культуре;

- разработана технология получения антирабической вакцины из штамма Внуково-32 на псевдосуспензионной культуре клеток Vero.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены в докладах на конференции "Культивирование клеток животных и человека" в г.Пущшю. Результаты. исследований были доложены на. международном симпозиуме "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине" (Уфа, 1995) и международной конференции "Настоящее и будущее вакцинологии" (Уфа, 1996).

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова. По материалам работы составлена и утверждена Инструкция по изготовлению и контролю препарата "Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая на перевиваемых клетках".

Дисссертация апробирована на заседании Ученого Совета Уфимского НИИ ВС им. И.И.Мечникова.

Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 9 публикациях. По способу получения вирусного материала подана заявка ГР № 94043360 и получено положительное решение о выдаче патента РФ от 22.01.96.

Объем и структура работы. Работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов (1 глава), раздела собственных исследований (4 главы), обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 5 рисунками и 14 фотографиями. Библиографический указатель содержит 77 отечественных и 100 иностранных литературных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

КЛЕТКИ И СРЕДА. В работе использовали гетеро-плоидные перевиваемые клетки почек зеленой африканской мартышки Vero, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург) на уровне 153 пассажа. В качестве ростовой среды использовали среду Игла MEM с 7% инакгивированной гыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и добавлением канамицина в концентрации ЮОмкг/мл. Культивирование клеток на микроносителях проводили при 37° С в силиконизи-рованных ферментерах фирмы Techne вместимостью Зл и Юл, а также в ферментерах вместимостью 50л, изготовленных в Институте медицинской биотехнологии МЗ СССР. Жизнеспособность клеток определяли методом включения трипанового синего (Р.Адамс, 1983).

МИКРОНОСИТЕЛИ. В качестве микроносителей использовали Цитолар-1 и Цитолар-2 производства НПО "Биолар" (г.Олайнс, Латвия). Микроносители применяли в концентрации 3-5 мг/мл.

ВИРУС. Использовали вакцинный штамм культурального вируса бешенства Внуково-32, применяемый в производстве культуральной антирабической вакцины на первичных клетках почек сирийского хомяка. Заражение клеток проводили в монослой и во взвесь. Контакт клеток с вирусом составлял 1,5 ч при (20 + 2)° С. Множественность инфекции составляла 0,001-0,1 ЛДзо/клетку. На 3-й день проводили смену ростовой среды на поддерживающую, в качестве которой использовали среду 199 с добавлением 0,1% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Сборы вируссодержащей жидкости проводили каждый день. Перед сбором контролировали качество монослоя на микроносителях.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. Работа проведена совместно с И.Б.Ишкильдиным в лаборатории физических методов исследований Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова. Препараты исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100B фирмы JEOL (Япония)

при инструментальном увеличении 20000-25000Х, просматривали не менее 5-6 ячеек предметной сетки. Для фотографирования объектов применяли фотопластинки для ядерных исследований типа "МК" и "MP".

ЖИВОТНЫЕ. Использовали в работе кроликов породы шиншилла массой 2,0-2,5 кг, беспородных белых мышей для титрования вирусного материала массой 6-8 г, контроля имму-ногенности и антигенности массой 10-12 г, безвредности -16 г. Животных получали из питомника лабораторных животных Уфимского НИИВС им, И.И.Мечникова.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО ТИТРА. Инфекционный титр вирусного материала на всех этапах работы проверяли путем интрацеребрального заражения мышей десятикратными разведениями вируса в объеме 0,03 мл. За мышами наблюдали 21 день. Гибель мышей учитывали с 5 дня. ЛД50 вируса определяли по Reed и Muench (1938).

Контроли экспериментальных серий проводили в соответствии с ФС на культуральную антирабическую вакцину инактивированную сухую и приказом Минздрава СССР N31 от 13.01.83 г.

Определение глюкозы проводили О-толуидиновым методом согласно приказу МЗ СССР № 290 от 11.04.72.

ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСА. Инактивацию концентрированного очищенного культурального вируса бешенства, после добавления к нему стабилизатора - 1% желатозы и 7,5% сахарозы, проводили на аппарате-иррадиаторе УФ-лучей конструкции Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова.

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ. Изучение иммуногенной активности проводили на мышах по методу национальных институтов здоровья, США (Методы лабораторных исследований бешенства, Женева, 1975, с.275). В качестве референс-препарата использовали отраслевой стандартный образец, полученный из НИИСК медицинских биологических препаратов им. ЛЛ.Тарасевича, приготовленный на основе штамма Внуково-32 фиксированного вируса бешенства.

Оценку антигенных свойств вакцины осуществляли с помощью реакции нейтрализации (РН) на мышах по общепринятой методике (А.К.Шубладзе, С.Я.Гайдамович, 1954)

я реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диагностикумом, полученным в нашей таборатории Р.Г.Латыповой, Р.С.Шафеевой, В.М.Мороговой ;1980).

Антигенную активность вируссодержащего материала эпределяли с помощью иммуноферменной тест-системы для выявления антигена вируса бешенства, выпускаемой малым предприятием "Диагност" при Омском НИИ природноочаговых 1шфекш1Й.

Статистическую достоверность разницы между сравниваемыми результатами средними индексами имму-ногенности и титрами вируссодержащей жидкости проводили путем вычисления показателя t Стьюдента-Фишера. При оценке достоверности результатов пользовались руководством И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева ( 1962 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общеизвестно, что одним из нежелательных контаминатов вакцин, полученных в клеточных культурах, является сыворотка, добавляемая в ростовую, а иногда и в поддерживающую среду. Поэтому усилия разработчиков направлены либо на снижение концентрации сыворотки в среде, либо замены ее на ростовые факторы.

На первых этапах нашей работы мы провели исследования, направленные на снижение содержания сыворотки крупного рогатого скота (КРС) в среде культивирования клеток Vero. Для этого мы постепенно снижали содержание сыворотки КРС с 10% до 7%. Коэффициент прироста клеток при этом не изменился и составил 6,2-6,4. Кроме того, мы изучили возможность культивирования клеток Vero в среде с 1% сыворотки КРС с одновременным добавлением панкреатического гидролизата казеина-14 (ПГК-14) в комплексе с поливинилпирролидоном (ПВП). В результате 10 серийных пассажей, проведенных различными способами культивирования клеток Vero, индексы пролиферации клеток не изменились по сравнению с контролем. Использование ПГК-14 в комплексе с ПВП позволяет снизить содержание сыворотки КРС в питательной

среде в 10 раз, что дает большие преимущества в производстве иммунобиологических препаратов.

Пролиферация клеток Vero при культивировании в среде с 1% СКРС и ростовыми добавками

Способ культивирования клеток Индексы пролиферации клеток

Игла МЕМ+1%СКРС+ ПВП+ПГК-14+ХХ Игла МЕМ+10%СКРС

стационарный 6,2-6,5 6,2-6,4

роллерный 4,0-4,5 4,0-4,5

суспензионный 7,0-7,5 6,8-7,6

С целью удаления высокомолекулярных белков сыворотки, не связанных с ростовыми свойствами, мы провели фильтрацию ее через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 300 кД и затем культивировали клетки Vero в среде с добавлением 7% фильтрата сыворотки КРС. Результаты, полученные после 10 серийных пассажей, свидетельствуют о возможности использования фильтрата сыворотки КРС с сохранением ростовой активности для клеток Vero.

Изучение ростовых свойств различных фильтратов сыворотки КРС при культивировании клеток Vero

Ростовая активность

Среда количество коэффициент

пассажей прироста

1. Игла МЕМ+фильтрат-25 (мембрана с порогом отсечения 25 кД) 1 -

2. Игла МЕМ+фильтрат-100 2 2,0-3,0

3. Игла МЕМ+фильтрат-300 10 6,0-6,2

4. Игла МЕМ+7% СКРС 10 6,2-6,4

Таким образом, нами показана возможность культивирования клеток Vero в среде с уменьшенным

количеством сыворотки КРС в питательной среде или фильтрата сыворотки КРС.

В процессе исследования мы провели опыты по адаптации культурального вируса бешенства Внуково-32 на уровне 35 пассажа на клетках почек сирийского хомяка с титром 5,0 lg ЛД50/о,оз мл к культуре гетероплодных клеток Vero. После 20 серийных пассажей в процессе адаптации инфекционный титр вируса повысился с 4,5 lg ЛД50/МЛ до 8,0 lg ЛД50/МЛ. Определение специфической активности вируса в тесте связывания антител на мышах показало увеличение ее в 3-4 раза. Индексы антигенности при этом на уровне 10, 20 и 30 пассажей составили соответственно 0,5, 1,6 и 1,9 против 150 ЛД50 фиксировано«) вируса бешенства CVS.

При выращивании вируса бешенства Внуково-32 в линии клеток Vero ни в одном из опытов не было обнаружено цитопатического действия вируса. Следовательно, размножение вируса в клетках Vero проходило по типу хронической инфекции. При исследовании культуры клеток Vero методом флуоресцирующих антител в цитоплазме клеток обнаруживался специфический антиген в виде ярких желтовато-зеленых включений.

Результаты электронномикроскопического контроля адаптированного к клеткам Vero вируса бешенства Внуково-32 показали, что в процессе адаптации не происходит морфологических изменений вирионов бешенства. Размножение вируса происходит без задержки зрелого вируса в клетках. Формирование вирионов происходит в основном в матриксе.

С целью повышения титра штамма Внуково-32 в культуре клеток Vero определяли оптимальные значения температуры и времени адсорбции. Наиболее высокое накопление вируса было отмечено при продолжительности адсорбции до 120 мин и температуре +22° С. Понижение температуры до +4° С или повышение до +37° С и сокращение времени адсорбции приводили к удлинению сроков накопления вируса и снижению урожая вируса.

Накопление вируса бешенства Внуково-32 в клетках Vero при различных условиях адсорбции

Температура адсорбции Время адсорбции, мии Тптр вируса, lg ЛД50 /мл День с момента заражения

30 н.3,0 6

+4° С 60 3,0 9

120 3,5 9

30 7,5 11

+ 22° С 60 7,0 8

120 8,0 6

30 7,0 9

+37° С 60 7,0 6

120 7,5 6

Изучение размножения вируса бешенства Внуково-32 при различной температуре инкубации показало, что наиболее активно вирус размножался при +32° С и +37° С. Существенных различий в накоплении вируса при +32° С и +37° С нами не выявлено. Снижение температуры инкубации до +22° С приводило к удлинению сроков максимального выхода вируса.

Изучение размножения вируса бешенства Внуково-32 в культуре клеток Vero в зависимости от неличины его заражающей дозы показало, что наибольшее накопление вируса в культуральной жидкости достигается, когда заражающая доза вируса составляет 0,001-0,1 ЛД50 на клетку. Инфекционный титр вируса при этом достигал 8,0 Ig ЛД50/МЛ- Использование высокой концентрации вируса (до 10 ЛД50) не способствовало более интенсивному накоплению вируса в среде, что, видимо, объясняется превышением в популяции количества интерферирующих частиц над инфекционными и в целом приводит к снижению инфекционного титра. Влияние множественности инфекции 0,001-0,1 ЛД50 на клетку на динамику и сроки максимального накопления вируса бешенства в линии клеток Vero нами не обнаружено.

Рост требований к качеству вирусных вакцин предполагает усовершенствование методов культивирования клеток, подразумевающее более жесткий контроль процесса культивирования (van Wezel A.L., 1978; Грачев В.П. с соавт., 1983,1985). Принципиальный шаг в этом направлении был связан с переходом к суспензионному культивированию. Согласно литературным и экспериментальным данным (D.W.Levine et al., 1978; BJ.Montagnon et al., 1981,1983; Nilsson Kjell, 1988; Leist C.H. et al., 1990) этот метод имеет наиболее высокие характеристики использования питательной среды, продуктивности клеток в накоплении вируса и наиболее реальные перспективы усовершенствования.

Мы провели серию исследований по изучению размножения вируса бешенства Внуково-32 в клетках Vero, культивируемых различными методами (стационарный, роллерный и псевдосуспензионный). Сравнительное изучение накопления вируса показало, что при роллерном и псевдосуспензионном методах максимальный титр вируса был выше и составил 8,0 lg ЛД50/МЛ.

Инфекционный ТИТр, Ig ЛД50/МЛ

abe

(По оси ординат: инфекционный титр вируса в ДД50/МЛ. а-культивирование в монослое; Ь-культивирование в роллере;

с-культивирование на микроносителях в биореакгоре.)

Установлено, что динамика накопления вируса бешенства Внуково-32 не отличалась при культивировании клеток Vero различными способами и графически представляет собой кривую, имеющую два максимума накопления вируса. Наши данные подтверждаются работами других авторов на культурах клеток 455, Vero, 4647 (Аксенова Т.А. с соавт,, 1991).

Изучение способа заражения клеток Vero (в монослой и во взвесь) для различных методов культивирован™ не выявило преимущества какого-либо из них. Антигенная активность вирусного материала, полученного разными методами культивирования, не отличалась. Индексы антигешюсти составили в среднем 2,0 против 158 ЛД50 стандартного вируса С VS.

Накопление вируса бешенства, штамм Внуково-32, при различном способе заражения клеток

Способ заражения Инфекционный титр, lg ЛДед/мл

стационарный метод роллерный метод на микроносителях в ферментере

в монослой 5,7 ±0,3 7,2 + 0,5 7,0 ± 0,6

во взвесь ' 6,0 ± 0,5 7,1 ±0,4 7,5 ±0,5

Таким образом, при прочих равных условиях псевдосуспензиониый метод получения вирусного материала выгодно отличается от стационарного и роллерного. Этот метод позволяет значительно увеличить поверхность для роста клеточного монослоя, обеспечить постоянство условий культивирования системы вирус-клетка, снизить расход питательных сред и сывороток, повысить производительность труда. Так, на одной частице микроносителя диаметром 160-280 мкм могут поместиться 350-630 клеток. При этом в 1 мл среды можно суспендировать несколько тысяч частиц микроносителей, общая ростовая поверхность которых составляет от нескольких квадратных сантиметров до 48 см2/мл. В 1 л культуры на микроносителях можно получить такое же количество клеток, как в 100-150 матрасных колбах объемом 1,5 л или 400-

530 чашках Петри диаметром 100 мм (Грачев В.П.. Завальный М.А., 1983).

Результаты работы, проведенной в нашей лаборатории, свидетельствуют о возможности накопления вируса бешенства в 3, 10 и 50 л биореакторах на клетках Vero псевдосуспензионным методом для приготовления антирабической вакцины.

Сравнительное изучение репродукции вируса бешенства Внуково-32 в культуре клеток Vero при использовании трех типов микроносителей (Cytodex 1, Цитолар 1 и Цитолар 2) показало, что отечественные микроносители Цитолар могут применяться с той же степенью эффективности, как и зарубежные микроносители Cytodex 1. Нами установлено наличие прямой пропорциональной зависимости между исходной концентрацией клеток во взвеси, временем генерации и инфекционным титром вируса.

Наиболее оптимальными условиями для накопления вируса в псевдосуспензионной культуре клеток Vero явились: посевная доза клеток-2,0х105 кл/мл, множественность инфекции-0,01 ЛД50/КЛ, концентрация микроносителей Цитолар 2-3 мг/мл. Инфекционный титр вируса при этом варьировал от 7,1 lg ЛД50/МЛ до 8,0 lg ЛД50/мл.

Для наилучшего прикрепления клеток к микроносителям и увеличения урожая вируса в процессе культивирования важен режим перемешивания суспензии. Мы отработали оптимальные режимы вращения магнитной мешалки для 3, 10 и 50 л биореакторов. Интенсивность и время перемешивания взвеси зависели от объемов биореакторов. Для 3 л биореактора оптимальным режимом работы являлось периодическое перемешивание со скоростью вращения мешалки 25 об/мин в течение 1 мин, остановка - 30 мин в первые 4-5 суток с последующим постоянным перемешиванием со скоростью 30 об/мин. Для 10 и 50 л биореакторов перемешивание проводили 5 мин со скоростью 25 об/мин, остановка - 90 мин и далее время покоя уменьшали ежесуточно на 30 мин.

Динамика репродукции вируса при переходе объема биореакторов от 3 л к 50 л сохранялась. С целью оптимизации процесса получения вирусного материала в большом объеме и с высоким инфекционным титром мы производили подсев в

биореактор свежей порции зараженных вирусом клеток. По данному способу подана заявка ГР №94043360 с решением о выдаче патента РФ от 22.01.96.

Полученный псевдосуспензмонным методом вирусный материал обладал высокой антигенной и иммуногенной активностью. Индексы антигенности в тесте ИФА и в тесте связывания антител на мышах соответственно были 1,8 и 2,0 против 158 ЛДзо вируса CVS. Индексы иммуногенности колебались от 3,6 до 15,0 против 50-100 ЛД50 вируса CVS при контроле общепринятым тестом NIH США.

Специфическая активность вируса бешенства Внуково-32 при суспензионном культивировании в клетках Vero на микроносителях (тест связывания антител - па мышах)

Сутки Инфекцион- Количес-

культи- ный титр, тво анти- Тест связывания антител

вирова- Ig ДЦ50/МЛ гена,

ния МЕ/мл индекс антигенности доза вируса, лд™

4 6,9 0,7 1,8

5 7,4 1Д 1,9

6 8,0 1,2 2,0

7 8,0 1,3 2,0 со

8 7,3 1,6 2,0

9 7,3 1,6 2,0

11 7,3 1,6 2L0 в

Одним из требований, предъявляемых к инактиви-рованным вакцинам, приготовленным на перевиваемых клеточных линиях, является отсутствие биологически активных макромолекул в препарате, в том числе и клеточной ДНК. По данным A.L.Weze] el al. (1982) и B.J.Montagnon et al. (1985) количество клеточной ДНК в неочищенной культур альной жидкости после разрушения зараженных вирусом полиомиелита клеток Vero составляло 0,28 мкг/мл и от 5 до 100 мкг/мл соответственно. Контроль на содержание остаточной

клеточной ДНК вирусных проб, приготовленных псевдосуспензионным методом, проведен нами совместно с В.В.Блохой в НИИСК медицинских биологических препаратов 1Ш.Л.А.Тарасевича. Количество клеточной ДНК в пробах колебалось в пределах 800-4000 пг/мл. С помощью гель-фильтрации на сефарозе 4В и протамин сульфата очищали суспензию вируса бешенства и снизили концентрацию остаточной ДНК до 32-64 пг/мл.

Очистка суспензии вируса бешенства Внуково-32 гелъ-филътрацией на сефарозе 4В

Вирусный материал Методы очистки Степень очистки Концентрация остаточной ДНК, пг/мл

вирусный сбор 800-1600

концентрат вируса Уф+Дф 2 320-800

концентрат вируса Гх.сеф. 12-25 32-64

концентрат вируса Уф+Дф+Сеф. 25-50 32

Очистка концентрата вируса Внуково-32 от клеточной ДНК обработкой протамин сульфатом

Вирусный материал Содержание клеточной ДНК в пг/мл при концентрации протамин сульфата

до обработки 1мг/мл 5мг/мл 10мг/мл

концентрат вируса 800-4000 128 64 32-64

инфекционный титр вируса, Ы ДД^/мл 8,0-8,5 8,0 8,0 8,0

В процессе исследований мы показали возможность масштабирования псевдосуспензионного метода накопления вируса бешенства Внуково-32 в клетках Vero при переходе от Зл к 50 л биореактору. В процессе масштабирования проводили последовательное наращивание клеточной массы в 3, 10 и 50 л биореакторах путем снятия клеток с частиц микроносителей Цитолар 2 аналогично процедуре снятия клеток для монослойных культур. Снятые с микроносителей клетки со свежей порцией носителей загружали- в биореактор и проводили дальнейшее субкультивирование. Визуальный контроль проб и подсчет клеток в камере Горяева показали сохранение ростовой активности последних и хороший уровень формирования монослоя на носителях ( до 80% ).

Таким образом, в нашей работе мы показали возможность получения эффективного препарата КОКАВ да вирусного материала, полученного псевдосуспензионным методом на отечественных микроносителях Цитолар 2, используя фиксированный вирус бешенства Внуково-32 и культуру перевиваемых клеток Vero.

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность выращивания перевиваемой клеточной линии Vero в малосывороточной среде, что достигается в результате:

a) снижения содержания СКРС (сыворотки крупного рогатого скота) до 7% в ростовой среде;

b) снижения содержания СКРС до 1% в среде при добавлении в качестве ростовых добавок 5% ПГК-14 (панкреатического гидролизата казеина-14), 2% ПВП (поливинилпирролидона) и 50 мг/л XX (холинхлорида);

c) использование фильтрата СКРС (мембрана с порогом отсечения по молекулярной массе 200-300 кД ).

2. Получен вариант фиксированного вируса бешенства Внуково-32, адаптированный к гетероплоидной перевиваемой линии клеток Vero и сохраняющий морфологию и специфическую активность исходного штамма.

3. При сравнительном изучении репродукции вируса бешенства Внуково-32 в культуре клеток Vero при разных способах их культивирования установлено преимущество псевдосуспензионного метода.

4. Установлены оптимальные условия получения вирусного материала при псевдосуспензионном культивировании зараженных вирусом клеток в биореакторах объемом 3, 10 и 50 л на микроносителях Цитолар 2: посевная концентрация клеток - 2x10s кл/мл, концентрация микроносителей - 3 мг/мл, множественность инфекции - 0,001-0,1 ЛДзо/кл.

5. Изучение специфической активности вируссодержащей жидкости, полученной в биореакторах на микроносителях, показало высокую антигенную и иммуногенную активность • вируса. Индексы антигенности в тесте ИФА и связывания антител соответственно были 1,8 и 2,0 против 158 ЛД50 вируса CVS. Индексы иммуногенности колебались от 3,6 до 15,0 против 50-100 ЛД5о вируса CVS при контроле общепринятым тестом NIH США.

6. Показана возможность получения эффективной концентрированной очищенной культуральной инакгивированной антирабической вакцины из вирусного материала, при использовании нового клеточного субстрата перевиваемой гетероплоидной линии Vero и фиксированного вируса бешенства Внуково-32.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хасанова С.С., Шафеева P.C., Фролова A.B. Изучение возможности культивирования перевиваемых клеток на отечественных микроносителях Цитолар // Тез. докл. республ. научной конференции, Уфа, 1991.

2. Шафеева P.C., Фролова A.B., Хайбуллина С.Ф., Муллагулова М.Н. Получение культуральной антирабической вакцины на основе линии перевиваемых гетероплоидных клеток // Здравоохранение Башкортостана. - 1993. - №3-4.

3. Фролова A.B., Шафеева P.C. Культивирование вакцинного вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero на микроносителях // сб. науч. трудов "Вирусные инфекции. -Екатеринбург. - 1993. - С.295-299.

4. Шафеева P.C., Фролова A.B. Репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток // Цитология . -1994. - т.36, №6. - С.587.

5. Шафеева P.C., Фролова A.B., Хайбуллина С.Ф., Муллагулова М.Н. Культуральная антирабическая вакцина на клетках Vero // Цитология . - 1994. - т.36, №6. - С.588.

6. Шафеева P.C., Фролова A.B. Способ получения вирус-содержащего материала для изготовления антирабической вакцины. Заявка ГР №94043360 с решением о выдаче патента РФ от 22.01.96.

7. Шафеева P.C., Фролова A.B., Муллагулова М.Н. Получение в эксперименте концентрированной очищенной культуральной антираб]тческой вакцины на основе перевиваемых клеток Vero // Материалы межд. симп. "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине", г. Уфа. - 1995. - С.191-194.

8. Фролова A.B., Шафеева P.C. Крупномасштабное культивирование вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток // Материалы межд. симп. "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине", г.Уфа. - 1995. - С.194-198.

9. Бектимиров Т.А., Блоха В.В., Шафеева P.C., Бекетова Т.В., Фролова A.B., Хайбуллина С.Ф., Муллагулова М.Н. Очистка суспензии вируса бешенства от клеточной ДНК // Материалы межд. симп. "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине", г. Уфа. - 1995. -С.199-202.

10. Shafeeva R.S., Volkova A.V., Mullagulova M.N. Reproduction of Vnukovo-32 fixed rabies virus in VERO cells by suspension cultivation // Inter.Conf. on Modern Vaccinology "Present Status and Future Prospects", Ufa, May 14-17, 1996. - P.35.