Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях

Акиньшина, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях"

Акиньшина Татьяна Викторовна.

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К ВИРУСУ БЕШЕНСТВА В СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ.

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Щелково - 2005г.

Лкнньшина Татьяна Викторовна.

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук.

I Л

■ **» л*

Щелково -2005г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель

Доктор биологических наук - Кузнецова Светлана Владимировна

Научный консультант:

Академик РАСХН, профессор, доктор ветеринарных наук, лауреат Государственной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ - Самуйленко Анатолий Яковлевич

Официальные оппоненты:

Доетор ветеринарных наук, профессор - Масимов Нусрат Абулфатович

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор - Уласов Валентин Ильич

Ведущее учреждение - ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Защита состоится 23 сентября 2005 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006 069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г Щелково, Московская область, пос. Биокомбииат, ВНИТИБП)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан 22 августа 200

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность темы

К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. Борьба с бешенством была и остается проблемой медицины и ветеринарии. По данным ВОЗ (Expert committee on rabbits, 1992) в мире ежегодно регистрируют более 50 тысяч случаев гибели людей и более 1 миллиона животных от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотологическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдаются более чем в 110 странах мира (Груздев К.Н., 2001). По оперативным данным ФГУ «Центрветеринарии» (лаборатории эпизоотологии ВИЭВ) в течение первой половины 2005г., на охваченной эпизоотией территории РФ были выявлены 386 неблагополучных пунктов по бешенству, в Московской области 6 эпизоотических очагов. Этот процесс в мире не имеет тенденции к затуханию, напротив, поражаются все новые и новые, ранее благополучные районы.

Вирус бешенства, несмотря на то, что методика получения антирабической вакцины была разработана Л.Пастером более 100 лет назад и с тех пор достигнуто многое в изучении этого заболевания, остается предметом изучения многих исследователей. В основном, это практические аспекты: изготовление и применение вакцин, разработка методов репродукции вируса бешенства в тканевых культурах, создание диагностикумов. Вакцины и диагностикумы, изготавливаемые из культуральных вируссодержащих суспензий, содержат небольшое количество специфического антигена в сравнении с множеством сопутствующих балластных белков. Поэтому внимание исследователей привлекает разработка методов получения очищенного и концентрированного вируса. Такой препарат представляет собой материал для изготовления надежной и эффективной вакцины против бешенства,

обладающей высокой иммуногенностью, и более чувствительных диагностикумов, не дающих побочных неспецифических реакций.

Исследование структурных компонентов нуклеопротеида и гемагглютинина вируса бешенства представляет не только теоретический, но и практический интерес. На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин, содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Изучение этого вопроса может создать предпосылки для практического применения компонентов вируса в составе вакцин и диагностикумов, чистых и высокоэффективных.

При организации целенаправленных профилактических мероприятий необходим контроль за иммунным состоянием вакцинированных против бешенства животных. Уровень антител в сыворотках животных определяется несколькими методами. Трудность выбора состоит в том, что большинство методов не всегда точно стандартизировано

Таким образом, создание тест-системы для ускоренной индикации вируса и определения уровня антирабических антител в сыворотке иммунизированных культуральной антирабической вакциной животных является на сегодняшний день важной и актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось разработка реагентов на основе очищенных и концентрированных

препаратов вируса бешенства для постановки серологических реакций, а также высокочувствительных и специфичных компонентов для иммуноферментного анализа при оценке эффективности поствакцинального иммунитета у животных при бешенстве.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Получить очищенные и концентрированные препараты вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51.

1.2.2. Выделить структурные компоненты вируса бешенства -нуклеопротеид и гемагппотинин.

1.2.3. Испытать антигены вируса бешенства, полученные на базе очищенных и концентрированных препаратов, в качестве компонентов для постановки серологических реакций при определении уровня антител в сыворотках вакцинированных животных.

1.2.4. Получить антирабические сыворотки на лабораторных животных, выделить IgO крупного рогатого скота, получить анти-IgG сыворотки на кроликах и выделить анти-Ig крупного рогатого скота из них, получить конъюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG крупного рогатого скота.

1.2.5. Изучить напряженность гуморального иммунитета и получить антиидиотипические поликлональные антитела к вирусу бешенства на лабораторных животных и изучить их свойства.

1.2.6. Разработать компоненты иммуноферментного анализа для . оценки эффективности поствакцинального иммунитета у животных при бешенстве и провести сравнительную оценку определения уровня антирабических антител в традиционных серологических реакциях и ИФА.

1.3. Научная новизна.

В процессе работы были модифицированы и усовершенствованы методы очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-

51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, ранее разработанные в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП.

Выделены структурные компоненты вируса бешенства гемагглютинин и нуклеопротеид, и подтверждено, что гемагглютинин вызывает интенсивное образование вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных животных и является компонентом, ответственным за иммуногенную активность вириона и может быть применены в качестве антигена при определении уровня вируснейтрализующих антител.

Показана возможность повысить чувствительность серологических реакций РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000 и РИГА концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.

Установлена корреляция между показаниями активности сывороток при постановке ИФА при добавлении коньюгата с пероксидазой и с протеином А.

1.4. Практическая значимость.

На основании модифицированных во ВНИТИБП ранее разработанных методов очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, созданы антигены для определения в серологических реакциях уровня антирабических антител в сыворотках животных в реакции связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, а также применяемые в качестве компонентов для иммуноферментного анализа и показавшие высокую эффективность в реакциях. Методической комиссией ВНИТИБП утверждены 4 методики по получению антигенов для серологических реакций.

Разработаны компоненты и создан набор для иммуноферментного анализа эффективности антирабического поствакцинального иммунитета в сыворотке животных.

1.5. Апробация результатов работы.

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета и Методической комиссии ВНИТИБП 20022005гг, на научных Международных конференциях 2003-2005гг (г.Щелково, ВНИТИБП).

1.6. Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

1.7. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 142 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (281 источников, в том числе 95 отечественных). Работа иллюстрирована 23 таблицами, 13 рисунками и дополнена приложениями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и Методы

Работа выполнена в 2002-2005 г.г. в лаборатории молекулярной биологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2000-2005г., в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.

Вирус бешенства В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Титр инфекционности вируссодержащего материала, использованного в работе, был 5,5-6,5 1§ ЬО50/„л-

Концентрирование вирусов методом ультрафильтрации проводили на УФ ячейках ФМ02-200 и ФМ02-1000 с использованием ядерных фильтров, полученных из лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна).

Градиентное центрифугирование. В работе использовали, линейный градиент CsCI, сахарозы и глицерина.

Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5-недельных мышах массой 10-12г.

Белок определяли по методу Лоури и др. и на спектрометре СФ-26 Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

Комплементсвязываюшую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Soulebot J и др.

Преципитирующую активность определяли по методу Ouchterlony L. в 1,0% агаре "Дифко"

Гемагглютинирующую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Kuweit Е. с эритроцитами гуся.

Гемагглютинин вируса бешенства выделяли по методу Schneider L и др. из очищенного и концентрированного препарата.

Нуклеопротеид вируса бешенства получали по методу Socol F, которой заключается в разрушении вирионов бешенства при помощи дезоксихолата натрия (ДХН) и выделении иуклеопротеида.

Гипериммунные антирабические полиспецифические антисыворотки получали по методу, разработанному нами в лаборатории и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-трисакрил-М.

Препарат анти-1еС выделяли с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбенте на основе СпВг - агарозы и АсА-34 (ЬКВ, Швеция) по методу Маслова Е.В.

Выявление специфических антител антигенов вируса бешенства методом ИФА В работе применяли стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96-луночных микропланшетках по Еп§уа11 и др.

Определение иммуногенности препаратов вируса бешенства проводили по методу ШН (Национального Института Здравоохранения США) на белых мышах.

Поликлональные антиидиотипические антитела (анти ИД) к антигенам вируса бешенства получали гипериммунизацией мышей и кроликов антирабическими антителами (анти-ВБ 1§С) из сывороток вакцинированных животных.

2.2. Очистка и концентрирование вируса бешенства.

С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования культурального вируса бешенства был испытан ряд методов. Для концентрирования вируса бешенства можно использовать ПЭГ М-1000, 3000, 6000 дальтон. Препараты с практически полным выходом вируса и с наименьшим количеством белка получаются при использовании ПЭГ М-1000 10,0% концентрации, М-3000 - 5,0% и М-6000 - начиная с 2,5%.

Изучались условия очистки и концентрирования вируса бешенства на геле фосфата алюминия (А1Р04). В связи с потерей вируса в процессе однократной адсорбции и элюции с геля фосфата алюминия, концентрировали вирус путем двукратной адсорбции и элюции. В результате чего удается снизить потерю вируса до 11%, а очистку повысить до 93%.

Далее мы объединили 2 метода концентрирования вируса: осаждение ПЭГ и на геле фосфата алюминия. Было выяснено влияние

последовательности методов концентрирования. Потеря вируса составляет 29,2%, а балластного белка в варианте осаждение вируса ПЭГ М-3000, затем концентрирование на геле А1Р04 остается в 2 раза меньше, чем в варианте применения сначала А!Р04, а затем ПЭГ (3.07 и 1.58 мг/мл, соответственно).

В вирусологических исследованиях для концентрирования вирусов находит все более широкое применение метод ультрафильтрации. При концентрировании вируса в 5-15 раз инфекционный титр вируса повышался на 0.5-1.0 а количество белка в препарате

увеличивалось с 0,3±0.01 мг/мл до 1,5-4,3±0,02 мг/мл. Таким образом, метод ультрафильтрации пригоден для получения концентрированных препаратов культурального вируса бешенства без его очистки.

Для концентрирования вируса бешенства было испытано равновесное центрифугирование на "подушке" сахарозы (55%), хлористого цезия (22%) и глицерина (80%). При концентрировании в глицерине потеря вируса составляет 99,7%, в СяС1 - 93,7% и в сахарозе - 75,0% Очистка вируса при центрифугировании на "подушке" сахарозы равна 62,5%. В связи с тем, что лучшие результаты были получены при осаждении вируса бешенства на "подушке" сахарозы этот способ применялся в дальнейшей работе.

Отработав отдельные этапы концентрирования, мы объединили их для получения высокоочищенного и концентрированного вируса бешенства. Инфекционность этих концентрированных препаратов была на 2,65 ^ ЬВ5о/мл выше, чем исходного вируса. Содержание белка снизилось с 9.3 мг/мл в исходном вирусном материале до 0.4 мг/мл. Потеря вируса составляла на первых трех этапах 9,0% (адсорбция-элюция, осаждение ПЭГ М-3000 и высокоскоростное центрифугирование), после центрифугирования на "подушке" сахарозы - 77,7%. Удается получить высокоочищенный на 99,99% вирус. Применяемые методы очистки и концентрирования вируса бешенства не влияют на его биологическую активность.

2.3. Выделение гликопротеина и нуклеопротеида вируса бешенства

Нуклеопротеид (НП) получали, обрабатывая очищенный и концентрированный вирус бешенства дезоксихолатом натрия (ДХН). ДХН разрушает оболочку вириона и приводит к выделению НП. Были получены очищенные на 99,6% препараты НП вируса бешенства, которые были неинфекционны и содержали 0,16 мг/мл белка (в исходном вирусном материале - 10.0 мг/мл). Препарат проявлял комплементсвязывающую активность и был неиммуногенным.

Гемагглютинин (ГА) вируса бешенства получали путем обработки высокоочшценного и концентрированного вируса бешенства сапонином в концентрации Г мг/мл при +37°С. Мы получали очищенные на 99,25% препараты гемагглютинина, обладающие высокой гемагглютинирующей активностью. Сравнивали антигенные и иммуногенные свойства цельного вируса и выделенного из него гемагглютинина. Было установлено, что титры вируснейтрализующих антител в сыворотках кроликов и мышей, полученных на введение им исходного вируса и гемагглютинина, были в 2 раза выше, а при использовании очищенного и концентрированного в 30 раз препарата вируса и полученного из него гемагглютинина в 3 раза выше при применении последнего.

Для сравнения иммуногенности неконцентрированного, очищенного и концентрированного в 10, 30 и 50 раз вируса бешенства, а также полученным из этих же препаратов гемагтлютинином иммунизировали мышей. Иммуногенность препарата гемагглютинина, полученного из культурального вируса, была в 3 раза выше иммуногенности исходного препарата. После очистки и концентрирования в 10 раз иммуногенность вирусного препарата повышалась до 6,3, а гемагглютинина из него - до 10.0. При дальнейшей очистке и концентрировании в 30 и 50 раз эти цифры увеличивались до 9,1-12,0 и 12,0-20,0, соответственно.

Таким образом, иммуногенность препаратов гемагглютинина, а также их способность вызывать образование ВН-антител у иммунизированных ими животных, были значительно выше по сравнению с препаратами вируса, из которых они были получены.

2.4. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных препаратов культурального вируса бешенства

2.4.1. Серологические методы диагностики бешенства.

Быстрый и точный диагноз инфекционных болезней является решающим условием в организации необходимых мер борьбы с ними. Для лабораторной диагностики бешенства используется гистологический метод обнаружения под микроскопом телец Бабеша-Негри в мазках отпечатках или срезах, окрашенных соответствующими красителями, метод иммунофлк)оресценции, агглютинации эритроцитов,

комплементсвязывания, преципитация.

При постановке реакции необходимо использовать высокоочищенные компоненты, не дающие побочных неспецифических реакций. В своих исследованиях мы применяли концентрированный в 20 раз ПЭГ М-3000 и инактивированные р - пропиолактоном (1:8000) препараты для постановки РСК и РДСК. Исследовали 273 сыворотки крови КРС, вакцинированных антирабической культуральной вакциной из штамма «Щелково-51», собак - 67. Сыворотки исследовались через 28-96 дней после иммунизации животных. Из исследованных сывороток крови положительная реакция в РДСК установлена в 72 случаях в титрах 1:21:128. Вируснейтрализующую активность определяли в 20 произвольно взятых сыворотках, 7 из которых имели комплементсвязывающую активность, равную 1:4-1:32 Вируснейтрализующая активность сывороток в Международных единицах (МЕ) была равна от 0,02 до 3,4 МЕ.

В качестве контроля исследовали 200 сывороток крови 5 видов животных, не подвергавшихся иммунизации: лошадей - 12, крупного

рогатого скота - 120, овец - 12, коз - 12, собак - 44. Ни в одном случае комплементсвязывающих антител против бешенства не обнаружено.

Полученные данные позволяют концентрированный ПЭГ М-3000 вирус бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13, рекомендовать в качестве антигена для постановки РДСК, а реакцию длительного связывания комплемента с использованием этого антигена - как серологический метод обнаружения комплементсвязывающих антител в сыворотках крови, привитых против бешенства животных.

Вирус очищенный и концентрированный в 50 раз на геле фосфата алюминия (А1Р04) и ультрацентрифугированием, инактивировали р-пропиолактоном (1:8000), испытывался в РИГА для определения уровня антирабических антител в сыворотках животных. В РНГА исследовали сыворотки крови 422 голов КРС, из них 236, вакцинированных антирабической вакциной, и 20 сывороток кроликов.

Сыворотки исследовались в различные сроки после иммунизации животных (28-178 дней). Всего выявлено положительно реагирующих 217 сывороток крови КРС и все 20 сывороток крови кроликов.

Исследованные 35 произвольно взятых сывороток крови КРС в РН имели титры ВН-антител от 0,01 до 3,4 МБ. Из них только 16 сывороток имели титры выше 0.5 МЕ (45,7%). Все остальные сыворотки имели титры ВН-активности от 0.46 до менее 0.01 МЕ. Сыворотки крови кроликов в РН имели титры ВН-активности от 2,25 до 27,5 МЕ.

Таким образом, реакция непрямой гемагглютинации является чувствительным тестом для определения эффективности антирабических вакцин. Полученные данные свидетельствует о том, что вирус бешенства, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13 и концентрированный с помощью адсорбции-элюции на А1РО4 и ультрацентрифугирования, можно рекомендовать в качестве антигена для РНГА, а реакцию непрямой гемагглютинации с использованием этого антигена как серологический

метод для обнаружения гемагглютинирующих антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных.

2.4.2. Иммуноферментный анализ для определения уровня антирабических антител.

Для проведения иммуноферментного анализа необходимо иметь положительный и отрицательный антиген и сыворотки, антивидовой коньюгат.

Иммуноглобулин Б-из сыворотки крови КРС выделяли осаждением сернокислым аммонием. Выход очищенного иммуноглобулина составил 260 мг/мл. Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1:256-1:512 и выше.

Гипериммунную анти-^О-КРС сыворотку крови получали от кроликов массой 2.5-3.0 кг, в качестве антигена использовали ^в-из сыворотки крови КРС. Получены анти-^в- сыворотки КРС с титром 1:321:256.

В качестве фермента для маркирования антител использовали пероксидазу хрена, марки А, Яг = 2,8-2.9 Рабочая концентрация полученного иммунопероксидазного конъюгата составляла 200 нг/мл. При данном разведении величина ОП490 в реакции с положительным антигеном составила -1,48, с отрицательным -0,03-0,04.

2.5. Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной 1

антирабической вакциной.

При организации целенаправленных профилактических мероприятий необходим контроль за иммунным состоянием вакцинированных против бешенства животных. Специфическая резистентность к вирусу бешенства, в основном, связана с развитием гуморального иммунитета. В связи с этим, мы изучали содержание антирабических антител, относящихся к классам ]gG и его

подклассам у животных, вакцинированных культуральным вирусом бешенства.

В сыворотках вакцинированных животных определяли титр ВН-активности антител. Гуморальный иммунный ответ при вакцинации кроликов инактивированным культуральным вирусом исследовали методом твердофазного ИФА с использованием класс-специфических антивидовых коньюгатов против 1§М, и кроликов.

Исследуемые сыворотки отбирались на 3, 7, 11, 15, 19, 21, 28 и 40 день с момента первичной вакцинации.

Первыми в ИФА выявляются противовирусные антитела класса ^М на 7-ой день после вакцинации, а пик активности приходится на 11-15 дни. После ревакцинации содержание противовирусных антител класса ^М постепенно снижалось. Специфические антирабические иммуноглобулины подкласса ^в) выявлялись на 15-19 день у всех подопытных кроликов. Титр активности возрастал к 21 дню и сохранялся в течение 45 суток. Значительный скачок титров этого подкласса иммуноглобулинов в 4-16 раз отмечался после ревакцинации, когда ^в! становился доминирующим в общем иммунном ответе. Рост титров антител этого подкласса регистрировался в течение 1,5 месяцев, а затем оставался на достигнутом уровне в течение 6 месяцев, после чего титры начинали постепенно снижаться

Антитела подкласса вируса бешенства не были выявлены

после первой вакцинации ни в одной из исследованных сыворотках. Достоверно регистрировали появление антител этого подкласса только на 21-28 день. В дальнейшем титры антител возрастали в 2-8 раз, но уровня антител подкласса 1§0| они не достигали.

Таким образом, к числу ранних антител, появляющихся при вакцинации бешенством, помимо ^М можно отнести и антитела, в го время как в первые недели после вакцинации отсутствуют антитела.

2.6. Политональные антиидиотипические антитела к вирусу бешенства.

Иммуноглобулины содержат антигенные детерминанты, расположенные в вариабельной области (V) Ь и Н-цепей, получившие название идиотипические. Эти иммуноглобулины своим антигенсвязывающим центром взаимодействуют не только с чужеродным антигеном, но и с другой молекулой иммуноглобулина экспрессирующий идиотипическую детерминанту (идиотип), которая сходна антигенной детерминантой (эпитоном)

Мы получали антиидиотипические антитела к белкам вируса бешенства на лабораторных животных и изучали их свойства.

Антирабические ^С выделяли из иммунных сывороток аффинной хроматографией на колонке с ВгСЫ-агарозой с иммобилизированными вирусными белками. Аффинноочищенной фракцией антирабические иммунизировали 6 кроликов и 6 мышей антирабическим

Для выявления в исследуемых сыворотках анти-ИД проводили 2 серии опытов. Во-первых, оценивали способность содержавшихся в них 1§С связываться с антирабическими Кривые титрования в непрямом твердофазном ИФА 6-ти сывороток кролика, содержащих анти-ИД показывают, что титр анти-ИД антител в кроличьих сыворотках реагировавших с анти ВБ КРС, варьировал от 1:160 до 1:1280. Титры анти-ИД, выделенных из 6-ти сывороток мышей, реагировавших с анти ВБ КРС, были - от 1:80 до 640. В следующей серии опытов изучали способность кроличьих и мышиных анти-ИД подавлять связывание антирабических КРС с белками вируса бешенства КРС в конкурентном варианте ИФА.

Все 6 проанализированных образцов кроличьих и мышиных 1§0 в разной степени, но достоверно снижали связывание антирабических КРС с вирусным антигеном.

На основании этих данных был сделан вывод, что в полученных нами сыворотках кроликов и мышей присутствуют анти-ИД - АТ2.

Следующим звеном в механизме сетевой регуляции иммунитета в организме является продукция анти-анти-идиотипических антител (АТ3). В связи с этим изучали способность полученных кроличьих и мышиных АТ2 вызывать специфический иммунный ответ, подобный тому, который возникает в ответ на введение вируса бешенства лабораторным животным.

Полученные таким образом анти-ИД были использованы в новом цикле иммунизации. Для сравнения иммуногенной активности полученных кроличьих и мышиных анти-ИД и вируса ВБ, двух кроликов и 6 мышей иммунизировали вируссодержащей суспензией с титром инфекционности 5,5-6,5 ^ ЬД50/мл в дозах 1 мл и 100 мкл, соответственно. Установлено, что все сыворотки кроликов, иммунизированных мышиными АТ2, так же как и все сыворотки мышей, иммунизированных кроличьими АТ2, обладают способностью взаимодействовать с антигеном ВБ.

Однако и в первом и во втором случае титры АТ| полученные на введение животным цельного вируса, намного превышали титры сывороток, содержащих АТз. Титры АТ3, полученные в результате иммунизации препаратами АТ2, не превышали в обоих случаях 1:800, тогда как антирабические сыворотки работали в ИФА до 1:12800.

При анализе репродукцию вируса бешенства в культуре клеток в присутствии всех полученных кроличьих и мышиных сывороток, содержащих АТз. было установлено, что все сыворотки нейтрализовали от 1,5 до 3,7 ^ ЬДзо/щ, вируса

Суммируя результаты проведенных экспериментов, можно заключить, что полученные нами анти-ИД действительно содержат внутренний образ вирусного антигена бешенства. Об этом свидетельствует способность кроличьих и мышиных АТ2 распознавать антитела АТ1 в сыворотках животных вакцинированных ВБ.

2.7. Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабических антител методом ИФА

Уровень антител в антирабических сыворотках можно определить с помощью различных методов. Трудность выбора состоит в том, что большинство из методов не всегда достаточно стандартизировано. Мы для определения уровня антирабических антител сравнивали наиболее часто употребляемые в практике реакцию нейтрализации на мышах, преципитации, связывания комплемента, гемагглютинации, и иммуноферментного анализа.

Реакция нейтрализации в настоящее время является основной методикой официального контроля антирабических антител. В качестве стандартного контрольного вируса использовали вирус CVS, и референс-сыворотку, отгитрованную по Международному стандарту.

2.7.1 .Коньюгат с пероксидазой хрена (ПО) в титровании методом ИФА антирабических антител.

Для выявления антител применяли ИФА. в непрямом варианте. В качестве конъюгата использовали анти-IgG различных животных, полученных на кроликах, конъюгированных с пероксидазой хрена.

С целью оптимизации процесса постановки реакции для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реагентов, необходимо подобрать концентрации используемых реагентов. Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной сывороткой в разведении 1:200. Оптимальный титр антигена для ИФА составил 1:10-1:20. При определении пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость результатов от разведения сыворотки. Двукратные разведения сывороток начинали с 1:100. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 более чем в 2 раза наблюдалось в разведения специфической и контрольной сывороток 1:200 и выше. Таким образом, была определена доза антигена вируса бешенства

и положительной сыворотки, которое использовались для определения уровня антирабических антител.

Методом РН, РДП, РСК и ИФА были исследованы партии сывороток крупного рогатого скота, кроликов и лис. На основании данных РН исследуемые сыворотки КРС были распределены по трем группам: в I группу вошли неактивные в рН сыворотки, во II - слабоположительные сыворотки с титром в РН 0,72-2,0 Международных единиц и в III -положительные сыворотки с титром в РН 10-14 МЕ.

Наименее эффективным оказался метод РДП, активность в котором , проявляла I сыворотка третьей группы. В РСК выявлялись все сыворотки

третьей группы, но чувствительность метода была недостаточной для обнаружения антител в слабопоположительных образцах. Метод непрямого ИФА превосходил по чувствительности РДП и РСК и его показатели были в наибольшей степени адекватны результатам РН, если в качестве антигена при постановке анализа использовали гемагглютинин. Измеряемые в ИФА титры антирабических антител были несколько выше при использовании для анализа цельного вируса бешенства. Так как рабический ГП является белком вируса, ответственным за индукцию ВН-антител, его использование в качестве антигена для ИФА дает возможность "настроить" анализ на выявление нейтрализующих антител, тогда как интактный вирус бешенства в условиях анализа способен ► ассоциироваться и с антителами к другим вирусным белкам, что и

подтверждается результатами настоящей работы.

Установлена линейная корреляция связи между результатами РН и непрямого ИФА при фиксированном разведении сыворотки:

г = 0.94 (Р < 0,01). Установлено также, что метод непрямого ИФА значительно превосходит по чувствительности методы РДП и РСК. При использовании метода ИФА с фиксированным разведением сыворотки отмечена линейная корреляция между показателями ОЩ» и ВН-активностью сывороток в РН для диапазона активности 0-14 МЕ.

Группа сывороток КРС и лис после вакцинации культуральной антирабической вакциной, изготовленной во ВНИИТИБП (лаборатория вирусологии), на 39 день была исследована в РН и ИФА. Чувствительность ИФА выше, чем РН. Это выражается выявлением большого числа антителсодержащих сывороток и показателями титров их активности. 2 сыворотки, давшие отрицательный результат в РН, оказались положительными в ИФА, титр антител в ИФА был в 2-3 раза выше, чем в РН. Гипериммунные антирабические сыворотки кроликов, полученные на введение культуральной антирабической вакцины исследовали в ИФА, РСК, РДП и РН. Результаты ИФА, позволяют констатировать, что титр антител в ИФА пропорционален уровню ВН-антител в РН. Чем ниже титр антител в РН, тем ниже титр и в ИФА, с повышением титра в РН повышается и титр в ИФА. Так сыворотки, имеющие титр в ИФА 1:32001:6400, обладают и большей ВН-активностью в РН (2587-3590). Корреляционной зависимости между результатами, полученными в РСК, РДП и ИФА, РН не установлено. Метод ИФА можно рассматривать, как быстрый метод определения титра антител в антирабических сыворотках, что дает основание рекомендовать его для определения уровня ВН-антител.

При сравнении определения уровня эффективности иммуногенности вируса бешенства в ИФА, РГА и Ы1Н установлено, что препараты вируса бешенства, не активные в ИФА, имели индекс иммуногенности < 0,3 и низкие титры в РГА (1:2-1:4). С возрастанием активности в ИФА от 1:5 до 1:80 увеличиваются титры в РГА с 1:4 до 1:64, а индекс иммуногенности до 0,96. Подобная корреляция, наблюдаемая в наших опытах, согласуется с теоретическими предпосылками. Так как гемагтлютинин вируса бешенства, обуславливающий гемагтлютинирующую активность, ответственный за иммуногенность, участвует, по-видимому, в ИФА, то этим должно быть и объясняется коррелятивная зависимость в титрах реакций РГА, ИФА и ШН

2.7.2.Протеин A (Staphylococcus Aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител.

Протеин A (Staphylococcus aureus) (ПА) способен фиксироваться на фрагментах Fc IgG многочисленных иммуноглобулинах млекопитающих. Коньюгат его с изоционатом флюоросцеина или с ПО используют для обнаружения клеточных и вирусных антигенов. В иммуноферментном анализе (ИФА) он может заменить антитела антииммуноглобулинов.

В настоящей работе представлены результаты попытки заменить регламентированные методы контроля препаратов титрованием аитирабических антител методом ИФА, который в настоящее время получил широкое распространение в вирусологии. Антигеном, сорбируемым на плашку, являлся полный вирус или выделенный из него гликопротеин - иммуногенный компонент вируса бешенства. При исследовании иммуноглобулинов и сывороток крови использовался коньюгат против иммуноглобулинов различных животных с ПО и ПА.

Мы определяли количество антирабических антигел в сыворотках КРС, лошадей., собак, кошек, лис, кроликов и хомяков, вакцинированных культуральной антирабической вакциной, выпускаемой Государственным Щелковским Биокомбинатом, и в препаратах иммуноглобулинов до и после вакцинации.

При использовании в качестве антигена гликопротеин (1.25 мкг/лунку) показания ОП были ниже, чем при добавлении в лунки концентрированного вируса (2.55 мкг/лунку). При увеличении концентрации гликопротеина ОП увеличивалась незначительно.

Мы установили незначительную разницу между показаниями одной и той же сыворотки при добавлении коньюгата с ПО и с ПА. ОП изменялась линейно в зависимости от логарифма разведений сывороток в интервале от 1:80 до 1:1280 в случае использования в качестве коньюгата антииммуноглобулинов, и от 1:40 до 1:640 в случае с ПА.

Таким образом, использование тест-системы ИФА в контроле специфической активности противоантирабических препаратов выявило ряд преимуществ этого метода: сокращение сроков контроля минимум на 7 суток, простота постановки, исключение работы с живым вирусом, достижение большей стандартности при постановке опытов титрования сывороток и иммуноглобулинов, возможность дифференциации активности препаратов в зависимости от титра антител при постановке ИФА.

На основании разработки компонентов для постановки иммуноферментного анализа, а также результатов, полученных при сравнительной оценке иммуноферментного анализа и других серологических методов, был создан «Набор для определения уровня антирабических антител методом иммуноферментного анализа».

3. ВЫВОДЫ

3.1. Модифицирован разработанный ранее метод очистки и концентрирования вируса бешенства штамм Щелково 51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, включающий ультрафильтрацию, адсорбцию-элюцию на геле фосфата алюминия, осаждение ПЭГ, высокоскоростное ультрацентрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Метод позволяет получать очищенные более чем на 99 % от балластных белков препараты вируса.

3.2. Получены структурные компоненты вируса бешенства -нуклеопротеид и гемагглютинин. Нуклеопротеид вируса обладает компле-ментсвязывающей активностью, а гемагглютинин - гемагтлютинирующей, комплементсвязывающей и преципитирующей активностью.

3.3. Разработаны антигены, которые позволяют повысить чувствительность серологических реакций РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000 и РИГА, концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.

3.4. При вакцинации культуральной антирабической вакциной помимо ранних антител ^М появляются и антитела, в то время как 1яС2 антитела отсутствуют. В сыворотках вакцинированных животных противовирусная активность в более поздние сроки (особенно после реиммунизации) обусловлена высоким содержанием ^О | антител. Антитела существенного вклада в противовирусную защиту не вносят

3.5. Полученные анти-ИД содержат внутренний образ вирусного антигена бешенства. Об этом свидетельствует способность кроличьих и мышиных АТ2 распознавать антитела АТ| в сыворотках вакцинированных животных. Кроличьи и мышиные АТ2 способны индуцировать противовирусный и иммунный ответ у животных в отсутствии вируса и вирусного антигена.

3.6. При сравнительной оценке различных методов определения уровня антирабических антител наименее эффективным был метод РДП. Метод ИФА превосходит по чувствительности РДП и РСК и его показатели в наибольшей степени адекватны результатам РН. Установлена линейная коррелятивная зависимость между результатами, полученными в РН и ИФА /г=0.94, Р < 0.01/. Метод ИФА по чувствительности превосходит метод РН в 2-3 раза и может применяться для определения уровня вируснейтрализующих антител.

3.7. Разработаны компоненты набора для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства иммуноферментным методом.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основе проведенной работы представлен проект нормативной документации:

«Временная инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе» (утверждена директором ВНИТИБП 25.04.05).

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе»

Проект «Временного наставления по применению набора реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе».

«Метод получения антигена из концентрированного полиэтиленгликолем вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, для постановки РДСК» (утверждена методической комиссией ВНИТИБП)

«Метод получения антигена из концентрированного на геле фосфата алюминия вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, для постановки непрямой гемагтлютинации» (утверждена методической комиссией ВНИТИБП).

«Концентрирование культурального вируса бешенства методом ультрафильтрации» (утверждена методической комиссией ВНИТИБП).

Список работ, опубликованных по теме диссертации :

1. Акиньшина Т.В., Сазанова Э.Я., Самуйленко С.А., Кузнецова C.B., Кузнецов Д.П.- Некоторые аспекты инактивации вируса бешенства химическими агентами // Материалы международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», ВНИТИБП, 2004, 3-5.

2. Акиньшина Т.В., Самуйленко С.А., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я.- Поликлональные антиидиотипические антитела к антигенам культурального вируса бешенства // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005,261-266.

3. Гринь С.А., Акиньшина Т.В., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я.- Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антирабической вакциной // Журнал «Ветеринария и кормление», 2005, 5, 14-15.

4. Гринь С.А., Акиньшина Т.В., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я.- Антиндиотипические антитела к антигенам культурального вируса бешенства // Доклады РАСХН, 2005,5,10-11.

5. Гринь С.А., Акиньшина Т.В., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Сазанова Э.Я.- Клеточный иммунитет при вакцинации хультуральной антирабической вакциной // Вестник РАСХН, 2006 (в печати), №1.

112135 1 б

РНБ Русский фонд

2006-4 9921

Отпечатано в ООО «Мещера» Московская обл., г. Щелково, ул. Свирская, 8а. тир. 100 экз. зак. № 428

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акиньшина, Татьяна Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Морфология вируса бешенства

2.2. Химический состав вируса бешенства

2.3. Очистка и концентрирование вируса бешенства

2.4. Диагностика бешенства

2.5. Выделение антивидовых иммуноглобулинов и получение конъюгатов с пероксидазой хрена для иммунофериментного анализа

2.5.1 Выделение имуноглобулинов

2.6. Анти-идиотипические (анти-ИД) антитела

2.7. Заклю чение

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Очистка и концентрирование вируса бешенства

3.2.2.Биологические и физико-химических свойства очищенного и концентрированного культурного вируса бешенства

3.2.3. Выделение гликопротеина и нуклеопротеида вируса бешенства

3.2.4. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных препаратов кулътурального вируса бешенства

3.2.4.1. Серологические методы диагностики бешенства

3.2.4.2. Иммуноферментный анализ для определения уровня антирабических антител.

3.2.4.2.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови крупного рогатого скота

3.2.4.2.2. Получение анти-IgG-KPC из гипериммунной сыворотки и выделение из нее антивидовых иммуноглобулинов

3.2.4.2.3. Меченые антивидовых иммуноглобулинов (анти

IgG-KPC) ферментом пероксодазой

3.2.5.Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антирабической вакциной

3.2.6. Поликлональные антиидиотипические антитела к вирусу бешенства.

3.2.7. Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабических антител методом ИФА

3.2.7.1.Конъюгат с пероксидазой хрена (ПО) в титровании методом ИФА антирабических антител

3.2.7.2.Протеин A (Staphylococcus Aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях"

1.1. Актуальность темы.

К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. Борьба с бешенством была и остается проблемой медицины и ветеринарии. Эту проблему значительно осложнило отмеченное в последние десятилетия возрастание роли диких животных в распространении болезни. По данным ВОЗ (Expert committee on rabies, 1992) в мире ежегодно регистрируют более 50 тысяч случаев гибели людей и более 1 миллиона животных от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотологическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдаются более чем в 110 странах мира (20, 21, 89).

По оперативным данным ФГУ «Центрветеринарии» (лаборатории эпизоотологии ВИЭВ) в течение первой половины 2005г. на охваченной эпизоотией территории РФ были выявлены 386 неблагополучных пунктов по бешенству. В Московской области были выявлены 6 эпизоотических очагов. Этот процесс в мире не имеет тенденции к затуханию, напротив, поражаются все новые, ранее благополучные районы (12, 21).

Вирус бешенства, репродуцированный в культуре ткани, используется в качестве исходного материала при изготовлении антирабических вакцин и диагностикумов. Вакцины и диагностикумы, изготавливаемые из культуральных вируссодержащих суспензий, содержат небольшое количество специфического антигена в сравнении с множеством сопутствующих балластных белков, так как при промышленном изготовлении обычно используют неочищенный вируссодержащий материал. Поэтому внимание исследователей привлекает разработка методов получения очищенного и концентрированного вируса. Такой препарат представляет собой материал для изготовления надежной и эффективной вакцины против бешенства, обладающей высокой иммуногенностью, и более чувствительных диагностикумов, не дающих побочных неспецифических реакций (24, 25,27,44).

Исследование структурных компонентов, нуклеопротеида и гемагглютинина, вируса бешенства представляет не только теоретический, но и практический интерес. В связи с этим важным представляется вопрос выделения и изучения их биологических свойств. На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин, содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Поэтому перспективным является разработка теста in vitro, основанного на определении содержания протективного антигена — гликопротеина, коррелирующего с иммуногенностью (51). Изучение этого вопроса может создать предпосылки для практического применения компонентов вируса в составе вакцин и диагностикумов, чистых и высокоэффективных.

Ускоренные методы вирусологической диагностики, такие как иммуноферментный анализ, обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами серологической диагностики. Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность является действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Быстрота и простота постановки этого теста делают его удобным для исследования динамики инфекции в очагах заболевания, а полученная информация может служить ориентиром для принятия соответствующих мер по предупреждению и распространению инфекции.

1.2. Цель и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание реагентов на основе очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства для постановки серологических реакций, а также высокочувствительных и специфичных компонентов для иммуноферментного анализа при оценке эффективности поствакцинального иммунитета у животных, вакцинированных антирабической вакциной.

Решались следующие задачи:

1.2.2. Выделить структурные компоненты вируса бешенства нуклеопротеид и гемагглютинин

1.2.4. Получить антирабические сыворотки на лабораторных животных, выделить IgG различных животных, получить анти-IgG сыворотки на кроликах и выделить анти-IgG из них, получить конъюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG и сравнить его с протеином А.

1.2.5. Изучить напряженность гуморального иммунитета и антиидиотипические поликлональные антитела к вирусу бешенства на лабораторных животных.

1.2.6. Разработать тест-систему для иммуноферментного анализа, оценку эффективности поствакцинального иммунитета у животных при бешенстве и провести сравнительную оценку определения уровня антирабических антител в традиционных серологических реакциях и ИФА.

1.3. Научная новизна.

В процессе работы были модифицированы и усовершенствованы методы очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, ранее разработанные в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП. Выделены структурные компоненты вируса бешенства - гемагглютинин и . нуклеопротеид. Подтверждено, что гемагглютинин вызывает интенсивное образование вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных животных и является компонентом, ответственным за иммуногенную активность вириона и может быть применен в качестве антигена при определении уровня вируснейтрализующих антител.

Показана возможность повышения чувствительности серологических реакций^РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000, и РИГА, концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.

Установлена корреляция между показаниями активности сывороток при постановке ИФА с добавлением коньюгата с пероксидазой и с протеином А.

Изучен гуморальный иммунитет на уровне образования антирабических антител, относящихся к классам IgM и IgG и его подклассам.

Получены антиидиотипические антитела, содержащие внутренний образ антигена бешенства и способные индуцировать иммунный ответ у животных в отсутствии вирусного антигена.

1.4. Практическая значимость.

На основании модифицированных ранее разработанных во ВНИТИБП методов очистки и концентрирования вируса бешенства, штамм Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, созданы антигены для определения в серологических реакциях уровня антирабических антител в сыворотках животных в реакции связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, а также применяемые в качестве компонентов для иммуноферментного анализа и показавшие высокую эффективность в реакциях. Методической комиссией ВНИТИБП утверждены 4 методики по получению антигенов для серологических реакций.

Разработаны компоненты и создан набор для иммуноферментного анализа репродукции антирабических антител в сыворотке крови животных. НТД на набор утверждается в общепринятом порядке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бешенство - остро протекающая инфекционная болезнь теплокровных животных, характеризующая поражением центральной нервной системы. Бешенство зарегистрировано в большинстве стран мира. Помимо собак, кошек, диких животных, бешенство передают кровососущие летучие мыши - вампиры. Из диких животных бешенством часто заражаются лисы, барсуки, скунсы, шакалы, койоты, еноты, хорьки, куницы, летучие мыши и дикие кошки. Поэтому взаимосвязи вируса бешенства представляет собой сложное явление, связанное с экологией диких животных.

По классификации Международного Комитета по таксономии вирусов (МКГВ) с 1975 года вирус бешенства относится к семейству Rhabdoviruses, роду Lyesavirus. Криптограмма вируса: R/I:4/2-u/u:V/0. Расшифровывается, криптограмма следующим образом: однонитчатый РНК-содержащий вирус (R/I), молекулярный вес 4млн. дальтон, что составляет 2%массы вириона (4/2), наружные очертания вируса и нуклеокапсида продолговаты с закругленным концом (U/U), для разных представителей семейств хозяевами являются позвоночные (V), пути передачи: контактный (0) (64).

Бешенство представляет собой важную проблему современной инфекционной патологии животных, проблему экологическую, эпизоотологическую, эпидемиологическую и экономическую. Проблема эта существенно обострилась в последние десятилетия в связи с широким распространением болезни в большинстве стран мира почти всех континентов, увеличением видов животных, участвующих в эпизоотологическом процессе, ростом числа случаев болезни среди людей.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Акиньшина, Татьяна Викторовна

5. ВЫВОДЫ

5.1. Модифицирован разработанный ранее метод очистки и концентрирования вируса бешенства штамм Щелково 51, репродуцированный в культуре клеток BHK-2I/I3, включающий ультрафильтрацию, адсорбцию-элюцию на геле фосфата алюминия, осаждение ПЭГ, высокоскоростное ультрацентрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Метод позволяет получать очищенные на 99% от балластных белков препараты вируса.

5.2. Получены структурные компоненты вируса бешенства нуклеопротеид и гемагглютинин. Нуклеопротеид обладает комплементсвязывающей активностью, а гемагглютинин гемагглютинирующей, комплементсвязывающей и преципитирующей активностью

5.3. Разработаны антигены, которые позволяют повысить, чувствительность серологических реакций РДСК при применении концентрированного вируса ПЭГ М-3000 и РНГА, концентрированного на геле фосфата алюминия и ультрацентрифугированием.

5.4. При вакцинации культуральной антирабической вакциной помимо ранних антител IgM появляются и IgGi антитела, в то время как IgG2 антитела отсутствуют. В сыворотках вакцинированных животных противовирусная активность в более поздние сроки (особенно после реиммунизации) обусловлена высоким содержанием IgGi антител. Антитела IgG2 существенного вклада в противовирусную защиту не вносят.

5.5. Полученные анти-ИД содержат внутренний образ вирусного антигена бешенства. Об этом свидетельствует способность кроличьих и мышиных АТ2 распознавать антитела ATi в сыворотках вакцинированных животных. Кроличьи и мышиные АТ2 способны индуцировать противовирусный и иммунный ответ у животных в отсутствии вируса и вирусного антигена.

5.6. При сравнительной оценке различных методов определения уровня антирабических антител наименее эффективным был метод РДП. Метод ИФА превосходит по чувствительности РДП и РСК и его показатели в наибольшей степени адекватны результатам РН. Установлена линейная коррелятивная зависимость между результатами, полученными в РН и ИФА /г=0.94, Р < 0.01/. Метод ИФА по чувствительности превосходит метод РН в 2-3 раза и может применяться для определения уровня вируснейтрализующих антител.

5.7. Разработаны компоненты набора для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства иммуноферментным методом.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основе проведенной работы представлен проект нормативной документации:

- «Временная инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе» (утверждено директором ВНИТИБП 25.04.05).

- Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе»

- Проект «Временного наставления по применению набора реагентов для определения уровня антирабических антител в иммуноферментном анализе».

- «Метод получения антигена из концентрированного полиэтиленгликолем вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, для постановки РДСК» (утверждено директором ВНИТИБП 04.04.05).

- «Метод получения антигена из концентрированного на геле фосфата алюминия вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, для постановки непрямой гемагглютинации» (утверждено директором ВНИТИБП 04.04.05).

- «Концентрирование культурального вируса бешенства методом ультрафильтрации» (утверждено директором ВНИТИБП 04.04.05).

Выражаю глубокую признательность и благодарю администрацию ВНИТИБП за предоставленную возможность провести научные исследования по представленной теме, руководителю работы Кузнецовой С.В., научному консультанту Самуйленко А.Я., заведующему отдела молекулярной биологии Кузнецову Д.П., сотрудникам отдела Сазановой Э.Я., Сорокиной Е., Ярыгиной Е.И и всему коллективу за помощь в проведении и оформлении работы.

2.7. Заключение.

Исходя из анализа данных литературы, характеризующих состояние изученности проблемы создания биопрепаратов для серологической диагностики вирусных инфекций на период проведения исследований, подход к решению поставленных задач представляется нам следующей.

Очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения серологических реакций.

Знание качества и количества компонентов вирусов является необходимым условием понимания их взаимодействия, определяющего стабильность структуры вирусы и его биологических свойств.

Таким образом, для эффективности диагностики вирусных инфекций необходимо располагать стандартизироваными, высокоспецифическими и высокочувствительными реагентами для проведения анализов.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1.Вирус бешенства. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штамм Щелково-51,репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Титр инфекционности вируссодержащего материала, использованного в работе, был 5,5-6,5]gLD5o/M.v Суспензию вирусного материала хранили при температуре -50°С.

3.1.2.Концентрирование вирусов методом ультрафильтрации проводили на УФ ячейках ФМ02-200 и ФМ02-1000 с использованием ядерных фильтров, полученных из лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна).

3.1.3. [ г Центрифугирование в работе использовали, линейный градиент CsCI, сахарозы и глицерина. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL (Польша) по составленным калибровочным кривым.

3.1 А.Контрольные антигены получали в тех же условиях, что и вирус, но без добавления последнего (с п.3.1.1 по 3.1.3.)

3.1.5.Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5-недельных мышах массой 10-12г, заражая их интрацеребрально по 0,03мл препарата. Число павших от специфических причин мышей (паралич, судороги, гибель) учитывали с 6 по 11день заражения.

Титр инфекционности вирусов рассчитывали по методу Ашмарина И.П. и др.

3.1.6.Белок определяли по методу Лоури и др. (177) и на спектрометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

3.1.7.Комплементсвязывающую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Soulebot J и др.(245), с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. За титр комплементсвязывающей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, вызывающее частичный гемолиз эритроцитов (на 2+).

3.1.8.Преиипитирующую активность определяли по методу Ouchterlony L. в 1,0% агаре "ДифСо" (206).

За титр преципитирующей активности принимали высшее разведение антигена или сыворотки, дающее выраженную полосу преципитации.

3.1.9.Гемагглютинирующую активность вируса бешенства определяли по микрометоду Kuwer Е. (170) с эритроцитами гуся.

За титр гемагглютинирующей активности вируса бешенства принимали высшее разведение вируса, агглютинирующее эритроциты на 1+.

3.1.10. Титр вируснейтрализующих (ВН) антител в антирабических сыворотках определяли следующим образом: к двукратным разведениям сыворотки приливали равный объем определенного разведения вируса (для мышей количество вируса соответствовало 100LD5o/W). Затем инкубировали 1ч при +37°С и заражали этими разведением интрацеребрально мышей весом 1012г. В качестве контроля брали десятикратные разведения вируса СVS, также прогретого 1ч при +37°С. За титр ВН-антител принимали последнее разведение сывороток, предохраняющее 50% животных.

3.1.11 .Гемагглютинин вируса бешенства выделяли по методу Schneider L. и др. (189) из очищенного и концентрированного препарата. Для этого вирусную суспензию после высокоскоростного центрифугирования обрабатывали 5% сапонином, добавляя его до конечной концентрации 1мг/мл, и инкубировали 20мин при +37°С. Затем проводили очистку и концентрирование гемагглютинина при помощи равновесного центрифугирования на "подушке" хлористого цезия плотностью 1,29г/см , в течение 4,5ч при ЗООООоб/мин (90000g) и собирали нижний слой, содержащий гемагглютинин.

3.1.12.Нуклеопротеид вируса бешенства получали по методу Socol F. (240), которой заключается в разрушении вирионов бешенства при помощи дезоксихолата натрия (ДХН) и выделении нуклеопротеида. Согласно этому методу, обрабатывали очищенный и концентрированный вирус ДХН в концентрации 5мг/1000 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц) в течение Юмин при +20°С. Для отделения нуклеопротеида от белков оболочки и не полностью разрушенных вирионов обработанный вирус фракционировали при помощи высокоскоростного центрифугирования. Разрушенный вирус наслаивали на 1028% линейный градиент сахарозы и центрифугировали 2ч при 22500об/мин (60000g) и собирали фракции. В нижней фракции содержались не разрушенные вирионы, в верхней - белки оболочки, а в средней - нуклеопротеид. Среднюю,. содержащую нуклеопротеид, фракцию диализовали 18ч против бурного ФР при +44°С. Затем препарат концентрировали в 3 раза диализом против ПЭГ и центрифугировали на "подушке" хлористого цезия плотностью

1,32г/см , 24ч при 40000 o6/MHH(125000g). После центрифугирования собирали нижнюю фракцию и диализовали 18 ч против буферного ФР при +4°С.

3.1.13.Гипериммунны еантирабическиеполиспеиифические антисыворотки получали по методу, разработанному нами в лаборатории и утвержденному на методическом совете ВНИИТИБП (177). Метод основан на пятикратном введении антигена лабораторным животным в лимфоузел: внутри-и подкожно и 2 раза внутримышечно в течение 3-4 недель. Для получения специфических гипериммунных сывороток в качестве продуцентов использовали взрослых клинически здоровьях кроликов весом 2,0-2,5кг.

3.1.14.Иммуноглобулины класса G выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-трисакрил-М.

3.1.15.Препарат анти-IsG выделяли с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбенте на основе СпВг -агарозы (Таллинн, СССР) и АсА-34 (LKB, Швеция) по методу Маслова Е.В. (48). Элюцию антител с АсА-34 проводили бесколоночным методом, с СпВг-агарозой - в колонке К 9x15 (LKB Швеция).

3.1.16.Контролъ чистоты препарата иммуноглобулина G проводили с помощью электрофореза (ЭФ) в полиакриламидном геле в слабощелочной среде, принятой для анализа иммуноглобулинов. Для этого использовали 7,5% гель акриламида (28). При ЭФ в ПААГ IgG обнаруживается в зоне гаммаглобулинов, располагаясь ближе к катодной части столбика. В результате проверки препарата IgG в ИЭФ с кроличьей сывороткой ко всем сывороточным белкам КРС должна, быть получена дуга преципитации располагающаяся ближе к катоду.

3.1.17.Выявление спеиифических антителиантигенов вируса бешенства методом ИФА. В работе применяли стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96-луночных микропланшетках по Engvall и др. (149)

3.1.17.1.Учет результатов анализа. Результаты анализа учитывали визуально или фотометрически через ЗОмин после внесения субстратного раствора. Регистрацию результатов анализа проводили с использованием специализированного спектрофотометра " Dynatech " позволяющего выразить результаты в единицах оптической плотности на<длине волны 490нм (ОП490)

Положительными считаются пробы,, уровень оптической плотности которых, начиная с разведения 1:200 в 2 и более раза превосходит уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом должен быть не ниже 0,200 ОП490. Сомнительные пробы - это те, уровень оптической плотности которых выше отрицательного контроля и составляет 0,150-0,199ед. ОП490. Уровень оптической плотности ниже 0,150ед. свидетельствует об отрицательной реакции. Визуальный учет: при наличии специфических антител ряд лунок с исследуемыми сыворотками имеет оранжево-коричневое окрашивание, начиная с разведения сыворотки 1:200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле. Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

3.1.18. Определение иммуногенности препаратов вируса бешенства проводили по методу NIH (Национального Института Здравоохранения США) на белых мышах (49). В этом методе сравнивается минимальная доза

ШАЮ испытуемой вакцины, запцйцая 50% мышей (50% конечная точка), с таковой международной или национальной референс-вакцины. Испытуемая вакцина признается эффективной при индексе иммуногенности не ниже 0,5".

3.1.19.Получение политональных антиидиотипических антител к антигенам вируса бешенства. Получение поликлональных антиидиотипических антител (антиИД) к антигенам к белкам вируса бешенства получали гипериммунизацией мышей и кроликов антирабическими антителами (анти-BBJgG) из сывороток вакцинированных животных. Антирабические JgG получали аффинной хроматографией на колонке с BrCN-агарозой с иммобилизованными, в качестве лиганда, вирусными белками.

3.1.20.Статистическая обработка результатов. Результаты исследований обрабатывали статистически по таблицам Фишера и Стьюдента. российская госудлрстппииля

БИБЛИОТЕКА

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акиньшина, Татьяна Викторовна, Щёлково

1. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егорова A.M. Иммуноферментный анализ. // Ветеринария, 1981, 8, 33-35

2. Аксенова Т.А., Михайловский Е.М., Селимов М.А. Экспериментальная культуральная антирабическая вакцина, концентрированная полиэтиленгликолем. // Симпозиум по бешенству, М., 1972, Мат.н.сессии Ин-та полиомелита и вирус.энцефалитов (тезисы докладов), 8-12

3. Аксенова Т.А., Селимов М.А., Чумаков М.П., Бреслер С.Е., Катушкина Н.В., Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В., Жданов С.П., Кромальди Е.В. -Гельхроматографическая очистка вируса бешенства на широкопористом стекле. // Acta Virologica, 1973, 17,449-454

4. Басова Е.Н., Стефани Д.В. — Некоторые особенности выделения миеломных IgG человека различных субклассов и их распределение по аллотипам, субклассам и типам легких цепей. //ЖМЭИ, 1977, 5, 77-81

5. Бирюков А.Г., Титеричев В.И., Самуйленко А.Я., Клюкина В.И. -Совершенствование методов диагностики бешенства. //Научные основы производства ветеринарно-биологических препаратов, Щелково, 2000, 218-220

6. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (Обзор) //с/х биология, 1983,5,32-36

7. Борисов А.В. Испытание эффективности вирусвакцины "Синраб" на диких плотоядных. //Проблемы зооинженерии вет.мед.:Сборник научных трудов "Ветеринарная наука", Харьков, 2001, 7, 293-294

8. Борисов А.В. Разработка технологии изготовления вирусвакцин против бешенства диких плотоядных. //Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Владимир, 2003

9. Брендз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распозновании. //М., 1987

10. Бурлаков С.В. Профилактика бешенства. //Ветеринария, 2002, 2, 8-9

11. Вагабов Р.М.-А., Баринский И.Ф. — Вирусы группы бешенства //Вопр. вирус.,1979, №5,451-458

12. Васильев А.В., Музычин С.И. Получение специфической сыворотки к вирусу ИРТ на телятах. //Проблемы вирусологии, молекулярной биологии и гистологии с/х животных, 1983, 11-12

13. Волкова Р.А., Рунова В.М., Романова JI.H., Храпова И.С., Эльберт Л.Б., Мальдов Д.Г. Применение ракетного иммуноэлектрофореза для определения гликопротеина в концентрированных антирабических вакцинах //Вопросы вирусологии, 1994, 39,2, 68-71

14. Голшмидт В.К., Шоринев А.Г., Гензова О.И. К методике выделения фракций I^G из кроличьих агглютинирующих сывороток. //Лаб. дело, 1976, 10, 601

15. Горшкова Т.Ф., Недосеков В.В., Жестерев В.И., Лаптева О.Г. -Технологические разработки рм активированной антирабической вакцины. // Материалы международной научно-практической конференции 30-31 мая 2001 г., ВНИИВВиМ, Покров, 2001, 37-58

16. Гочмурадов М.Г., Улупов Н.А. — Роль адьювантов в вакцине против бешенства. //Материалы международной научно-практической конференции, Воронеж, 1999, 97-98

17. Грибенча С.В., Игнатьев Г.М., Амитина Н.Н., Тазулахова Э.Б., Ершов Ф.И., Баринский И.Ф. — Влияние некоторых иммуномодуляторов на гуморальный антирабический иммунитет. //Вопросы вирусологии, 1985, №2, 198-200

18. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Sew?:нство животных //М., «Аквариум», 2001, 303

19. Джугина С.И., Завадских А.В. Клиническое проявление бешенства у животных //Ветеринария, 2002, 2, 9-10

20. Емельяненко П.А., Грызлова О.Н., Кузьмина М.Н. — Приготовление очищенных препаратов иммуноглобулинов крупного рогатого скота. //Доклад ВАСХНИЛ, 1973, 3, 35-37

21. Иванов B.C. — Особенности крупномасштабного культивирования первичных и перевиваемых клеток животных на микроносителях, изготовленных во ВНИИТИБП. //Культивирование клеток человека и животных: Матер, всесоюзного совещания, Пущино, 1990, 93-94

22. Иванов B.C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных неактивированных антирабических вакцин. //Вирусные болезни животных, Владимир, 1995, 203

23. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспектива борьбы с бешенством животных и человека. //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, 2000, №2, 63-65 и №3, 62—65

24. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработка и внедрение в промышленное производство, в ветеринарную практику России культуральных неактивированных вакцин против бешенства. //Т.докл. научыо-произв. конф., Курск, 1996, 126-128

25. Иммунологические методы, М., Мир, 1979

26. Исаевич Л.В. Биологические и физико-химические свойства вируса бешенства и его структурных компонентов. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 1976, М

27. Ищенко A.M., Жахов А.В. — Роль комплимента в имунной и центральной системе. //Иммунология, 1998, 6

28. Каверин Н.В., Лукашевич И.С. Вирионная негативная РНК-как вирусный геном //Вирусология, 1977, т.6, 5-38

29. Кицак В.Я. Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы. //МРЖ, 1988, раздел М., I, 20-23

30. Кицак В.Я., Майсиади С.А., Бочаров А.Ф., Ландин Л.К., Скляыская Б.И. -Сравнительное изучение эффективности очистки и концентрированиявируса простого герпеса типов I и II //Вопросы вирусологии, 1979, 2, 142148

31. Косицкая Л.С., Сафронов Б.Н. Динамика образования антикриотипических антител в ходе иммунного ответа. //ЖМЖ, 1984, №1

32. Крюков Н.Н., Семенихин A.JL, Зудилина З.Ф. Экспериментальный ринотрахеит крупного рогатого скота. //Вирусные болезни с/х животных, Мат. 1Межвуз. вет. вирусол. конф., 1980, М., МВД, 118-119

33. Крюков Н.Н., Сологуб В.К., Шуляк А.Ф. Гемагглютинирующие свойства инфекционного ринотрахеита. //Ветеринария, 1982, 1, 26-28

34. Кузнецова С.В. Диагностика на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов. //Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук, 1991

35. Кузнецова С.В., Исаевич JI.B., Кузнецов П.П., Иванов B.C. Получение антирабической вакцины из иммуногенного компонента — гемагглютинина вируса бешенства. //Доклад ВАСХНИЛ, 1987, 10, 40-41

36. Кузнецова С.В., Передереев Н.И., Кузнецов П.П., Игнатьева B.C. -Очистка и концентрирование вируса бешенства полиэтиленгликолем. //Ветерин., 1974, 9, 42-43

37. Кузнецова С.В., Передереев Н.И., Кузнецов П.П., Простяков А.П., Игнатьева В.Н. Метод получения антирабической сыворотки. //Тр. ВГНКИ, 1975, XXII, 36-41

38. Кульберг А .Я. Иммуноглобулины, обозначаемые как антикриотипические антитела, структурный эквивалент антигена (гипотеза). //Иммунология, 1987, 1

39. Кучерявенко Л.И. Реакция связывания комплемента для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Киев, 1983

40. Кэрстак Э. Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретация результатов. //Семинар ВОЗ по проблеме получения вирусных реагентов, М., СССР, 1983, 11-12/XXII

41. Лаптева О.Г. Усовершенствование технологии изготовления ^активированной вакцины против бешенства. //Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Покров, 2003

42. Лейбензон А.С., Малахова Т.С. — Применение иммунопреципитации в агаровом геле для ускоренной диагностики бешенства в лабораторных условиях. //Вирусы и вирусные заболевания, Республиканские межведомственные сборники, 1977, 5, 106-107

43. Макаров В.В. Бешенство : очерк мирового назоареала и общие элементы контроля. //Ветеринарная паталогия, 2002, №1 стр. 12-20

44. Маслов Е.В., Кузнецова С.В., Иванов B.C., Бойко А.А., Сазанова Э.Я. -Эффективность различных методов определения активности антирабических сывороток. //Перед, научн.-произ. опыт в биол. промышленности, 1986, 4, 1-5

45. Маслов Е.В., Панферова С.М., Бойко А.А. Сравнительная характеристика препаративных методов очистки антивидовых иммуноглобулинов. //Перед, научн.-произ. опыт в биологической промышленности, 1985, 8

46. Методы лабораторных исследований по бешенству, ВОЗ, Женева, 1975, 192

47. Науменков В.И. Применение иммунопероксидазного метода для индикации вирусных антигенов в культуре клеток. //Ветеринария, 1984, 7, 70-71

48. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, 1998

49. Недосеков В.В. — Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики бешенства. //Ветеринарные паталогии, 2002, №1, 41-47

50. Недосеков В.В. Технология изготовления антирабического антигена. //Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в паталогии с/х животных и людей. Материалы международной конференции, Покров, 2002, 225-227

51. Недосеков В.В. Технология изготовления антирабического антигена. //Материалы международной конференции, Покров, 2002, 225-227

52. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Груздев К.Н. Изучение влияния способа и локализации места введения антигена на формирование антирабического иммунитета (опыты на лошадях, овцах и белых мышах).

53. Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотич. болезнями животных, Покров, 1998, с.239-240

54. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Груздев К.Н. Перспективы использования иммуночистохимического тестадля диагностики бешенства. //Развиток ветеринарной науки в УKpami : здобутки та проблеми - Харыав, 1997, с. 120-121

55. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И., Балышев В.М., Горшкова Т.Ф. Обнаружение антител к вирусу бешенства методом иммунолероксидозного молослоя. //Проблемы инфекц. паталогии с/х животных, Владимир, 1997, 181-182

56. Недосеков В.В., Цыбанов Я.С., Романова У.Н., Куринов В.В., Тимошенко С.Г. Лабораторная диагностика арктического бешенства животных. //Достижения науки и техники АПК, 2002, №3, 15—17

57. Непоклонова И.В. Применение метода ELISA для обнаружения антигена вируса ИРТ. // Проблемы ветеринарной иммунологии под редакцией академика ВАСХНИЛ Урбана В.П., М., Агропромиздат, 1985, 152-153

58. Непоклонова И.В., Васильев А.В. ИФА для выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. //Бюллютень ВИЭВ, 1985,58,30-35

59. Нестеренко В.Г. Генерация иммунологической памяти и создание иммунологической толерантности. //Иммунология, 1986, 1, 78-83

60. Нестеренко В.Г. Способность АТ2 индуцировать продукцию антител и Т-клеточные реакции.//Иммунология, 1986, 1,24-26

61. Осидзе Д.Ф. Классификация вирусов. //ВАСХНИЛ Всесоюзный научно-исследовательский институт информации и технико-экономических исследований по сельскому хозяйству, обзорная информация, 1979, М

62. Первиков Ю.В. Антикриотипические антитела как новое биотехнологическое направление в разработке вакцин против инфекционных болезней. //Иммунология, 1989, 2

63. Пешкус Ю.К., Маркунас А.Б., Диканене Н.П. Применение иммуноглобулинов для получения специфических антисывороток к иммуноглобулинам IgGi и IgG2 коров. //Метаболизм и его регуляция биол. Активными веществами, Вильнюс, 1979, 237—241

64. Равилов А.З., Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., Чернов А.Н., Иванов А.В., Королева Л.В., Рафиков Р.К. — Комплексное изучение бешенства животных и меры борьбы с ним. //Ветеринария, 2000, 6, 7-10

65. Роменко М.В., Тутов И.К. Порядок и оценка результатов лабораторных исследований при диагностике бешенства. //Вестник ветеринарии, 1997, №6 (4), 47-50

66. Ручко В.М., Михайлов В.В., Борисевич С.В., Лебедев В.М., Ручко С.В., Ионов С.М., Максимов В.А. Некоторые методические аспекты создания вакцин нового поколения. //Биотехнология, 2002, №1, 70-77

67. Сазанова Э.Я., Кузнецова Д.П., Кузнецова С.В., Бойко А.А. Выделение анти-IgG-лошади из сыворотки крови кролика методом аффинной хроматографии. //Передов, научн.-производ. опыт в биологической промышленности, 1986, 12, 1-3

68. Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Бойко А.А., Иванов B.C., Кузнецов П.П. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определении уровня антител. //Ветеринария, 1991, т.8, 62-64

69. Селимов М.А. Оральная иммунизация арктических лис живой рабической вакциной, полученной из штамма Внуково-32. //Вестник АМН СССР, 1987, 32, 622-623

70. Селимов М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспективы эмиминации бешенства.//Вопросы вирусологии, 1998, 5

71. Селимова Л.М., Кротова Л.И., Зайдес В.М., Селимов М.А., Эльберт Л.Б., Аксенова Т.А., Жданов В.М. Препаративное получение и изучение структурных белков вируса бешенства. //Вопр. вирус., 1978, №5, 583-593

72. Семенова М.А., Розанова И.И. Актуальные вопросы диагностики бешенства у животных и человека. //Восьмой международный конгресс по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных: Материалы, М., 2000, 221-222

73. Сугобаева Б.П., Дадабаева Ж.С., Сайдулдин Т.С. Выявление рабических антител с помощью РСКК. //Диагностика, лечение И профилактика инфекционных болезней животных Казахстана, Алма-Ата, 1989,45—53

74. Супатов Н. Получение гипериммунной сыворотки против ИРТ на телятах- продуцентах. //Бюл. ВИЭВ, 1976, 26, 62

75. Сюрин В.Н. Ветеринарная биотехнология: создание средств диагностики и профилактики вирусных болезней животных. //Вестник с/х науки, 1989, 2, 88-94

76. Сюрин В.Н. Конструирование диагностикумов и противовирусных вакцин: современные биотехнологии. //Вестник с/х науки, 1986, 2, 141— 148

77. Тарасинин JT.A. — Иммуноферментный анализ и его модификации в исследовании вирусных антигенов. //Микробиол. ж., 1986, 48, 4, 99—104

78. Тарасинин JI.A. — Применение иммуноферментной детекции для выявления вирусных антигенов. //Мол. генет., микробиол. и вирус., 1986, 5,45-46

79. Тихоненко Т.Н. Химия вирусов. - В книге : Химические основы процессов жизнедеятельности. //Медгиз, 1972

80. Урываев JI.B., Силаги Дж. Ф. Выделение и характеристика инфекционного рибонуклеопротеида вируса везикулярного стоматита, содержащего активную транскриптазу. //Сборник "Молекулярная биология вирусов", М., 1973, 113-121

81. Фоменко М.В., Тутов И.К. Порядок и оценка результатов лабораторных исследований при диагностике бешенства. //Вестник ветеринарии, 1997, №6 (4), 47-50

82. Хисматуллина Н.А. — Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства. //Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных, Покров, 1998, с.77-78

83. Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х. — Производство набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА. //Научные основы технологии промышленного . производства ветеринарно-биологических препаратов, Щелково, 1996, стр.59

84. Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., КурбановаИ.А. — Производство наборов препаратов для лабораторной диагностики бешенства. //Вирусные болезни с-х животных, Владимир, 1995, стр.73

85. Холмогорова Г.Т., костюкова Н.Ю. выделение иммуноглобулина G из малых количеств сыворотки крови человека. //Лаб. дело, 1974, 10, 581— 582

86. Цеденхуу Пуревхуу — Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERQ». //Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, 2005

87. Шеффер Ф.Л. Очистка и физико-химические свойства вирусов растений и животных. //Иммунитет и вирусные инфекции, М., Медгиз, 1972, 202215

88. Шоршнев В.И., Муравьев В.К., Онуфриев В.П. — Выделение иммуноглобулинов и получение моноспецифических сывороток. //Ветеринария, 1978, 1, 44-46

89. Щесникова Л.А. — Получение чистых антител к иммуноглобулинам классов М и крс методом аффинной хроматографии на сефарозе. //Сборник научн.тр.МВА, 1979, 107, 34-35

90. Эрнст Л.К., Коромыслов Г.Ф., Газдаров А.К. — Иммуноферментная диагностика в животноводстве и ветеринарии. //Ж. Всес. хим. общества им. Д.И.Менделеева: 1989, XXXIV, I, 86-90

91. Яковлев Ю.С., Трусова Л.И., Воробьева Т.И., Павлова А.Ф., Бродецкая С.Е., Гангалюк Е.А. — Получение препарата иммуноглобулина неспецифического с помощью полиэтиленгликоля. //Передов, научн.-производ. опыт в биологической промышленности, 1985, 10, 5—6

92. Янкин Н.Ф., Ванеева Л.И. Разработка метода получения коньюгатов пероксидазы с антииммуноглобулином для иммуноферментного анализа. //ЖМЭИ, 1985, 1, 35-40

93. Aaslestad H.G., Urband Charlotte. Nucleotide composition of the ribonuclec acid of rabies virus. //J. Virology, 1971, 8, 922-924.

94. Ahmed M,E., Sinha R.C., Hochster R.M. -. Purification aad some morphological characters oh wheat striate mosaic virus. //J. Virology, 1980, 41,768-771.

95. Albas A., De Camargo L.M., Giometti J., Tarumoto M.H. Avaliacao de soros de caes imunizados contra a raiva pelo metodo de contra imunoeletroforese-CIE. //Veter. Zootecn., 1995, Vol.7, 101-105

96. Almeida J.D., Howatson A.F., Pinterich, Fenje P.— Electron microscope observation on rabies virus by negative staining.//ViroIogy, 1972,18, 147—151.

97. Arstila P. — Characteristics of vesicular stomatitis virus envelopes released with saponin. //J. Gen. Virolog, 1974, 34, 319-326

98. Atanasiu M.M.P., Lepine P., Dighe P. Purification partielle et concentration du virus rabique des rues, cultivi sur une soche de cellules clomales de rein de hamster//Comp -rend, des seans., 1973, 256, 1415-1417.

99. Atanasiu P., Datar P.V., Lopeg J.H., Wacei AR, Delsal J.L.//Rev, Immunol., 1971, 35, 7.

100. Atanasiu P., Perrin P., Delegneau J.E. Use of on engyme immunoassay wint protein a for rabies antigen and antibody determination. //Develop, in Biolog. Stand., 1980,46,207-215

101. Atanasiu P., Tsiang H., Perrin P., Favre S., Sismen J. Pouvoir immunisant d'un antigene soluble (glycoproteine) du virus rabique purifie, traite par le "Triton X 100". //C.r. acad. Sci., 1974, 279, 10, 875-878

102. Avrameas S., Ternynck T. Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enchanced intracellular penetration. //Immunochemistry, 1971, 8, 1175— 1179

103. B. LOUS. U.A., Ttiffany J.,Aaslectad H. -Lipids of rabies virus and BHK-21-cell membranes. //J.Virol., 1977,21,3, 950-955.

104. Beccari E., Ferrari A., Nachtmann C., Boniolo A. Rapid detection of antibodies to infections bovine rhinotracheitis by "macro" and "micro" ELISA. //Develop. Biol. Stand., 1982, 52, 141-146

105. Bishop D., Roy P. Dissociation of vesicular stomatitis virus and remation of the virion propeins to the viral transcriptase. //J.Virol.,1972,10,.234-243.

106. Blancou J., Aubert U. Comparison de 4-techniques de titrages serologiqnes des anticarps centre le virus de la rage ches le chien. // J.Biol.Stand. US, 1983, 11, 271-277

107. Bode L., Beutin L., Kohler H. — Nitrocellulose-enzymelinked immunosorbent assay (NC-ELISA) a sensitive technique for the rapid visual detection of both viral antigens and antibodies. //J.Virol.Meth., 1984, 8, 111-121

108. Bowen-Davies J., Lowings P.— Current perspectives on rabies. //In Pract, 2000,vol.22, №6, 170-175

109. Bradley Y. -Laboratory diagnosis of rabies in western Canada (1968-1977).//Can.Vet.J., 1979,20,7,186-190.

110. Brown F., Crick J. Rabies and rabies virus. //Biologist, 1978,25,25,3, 91-97.

111. Buczek J. Wscieklizna-historia, stan obecny, kontrola epidemiologiczna. //Med. weter., 1999, R 55, №12, 783-787

112. Busbnell S., Edwards S. The development and standardization of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine herpesvirus 2. //J. of Biol.Standard., 1988, 16,45-53

113. Bussereau F., Vincent J., Sureau P. Techniques d'immunofluotescence utilisant des anticops monoclonaux, appliquees au diagnostic des infections a virus apparentes au virus rabique. //Rec.Med.Veter., 1989, t.165, №8/9, 733736

114. Chambers T. Growley N., Francki R. Localization of lettuce necrotic yellows virus in nost leaf tissue. // Virology, 1975, 27, 320-328.

115. Cohen G., Alkinson P., Summers D. Interactions of vesicular stomatitis virus structural proteins with HeLa plasma membranes. //Nature N. Biol., 1981, 231, 121—123.

116. Collard A. Isolation and purification of bovine immu-noglobulins: Use of sephacryl S-300 filtration avods protein precipitation steps. //Ann.Rech.Veter., 1984,15,4,497-501.

117. Corthier G., Boschefti E., Gnarbeg, Poulain J. //J. Immunol. Meth., 1984, 66,1,75-79.

118. Costa L.L.S., Muller E.E., De Freitas J.C., Alfieri A.A., Mediol J. -Imunofluorescencua direta em cerebro e glandula salivar de Camundongosunocilados experimentalmente com virus rabico. // Semina, 1991, t.vol. 12, №1,38-41

119. Davies M., Englert M., Sharpless G., Cabassso V. The electron microscopy of rabies virus in cultures of chicken embryo tissue. //Viroly, 1973, 21, 643— 651.

120. Diringer H., Kulas K., Schneider L., Schlumberger H- The lipid composition of rabies virus. //Z. naturf., 1973, 28c,90.

121. Ebner D. Stand und Ausblick der Labordiagnostik von Tollwutviren. //Mh. Veter. Med., 1989, t.44, №6, 185-187

122. Eugster A., Angulo A. The use of the micromodified direct-CF-test in the detection of IBR and BVD antibodies. //Proceedings 77-th Ann.Meet. of the US Animal Health Association, 1974, 77, 615-620

123. Ferrua В., Vincent G., Revillard J., Petazzi G., Malionni R., Viot G., Masseyeff R. A sand vich method of enzyme-immunoassay. Ill Assay for human beta-2-microglobulin compared with radioimmunoassay. //J.Immunol.Meth., 1980, 36, 2, 149-158

124. Fey H., Prister H., Messerli I., Sturzenegser, Grelimund F. — Methods of Isolation, purification and Quantitation of bovine immunoglobulins. //Zbl.Vet.Med., 1976, 23, 269-300

125. Fields В., Eagle H. — The pH-dependence of reovirus synthesis. //Virology, 1973,52, 581-583

126. Fiszman M., Leaute J., Girard M. Mode of action of acid pH values on the development of VSV.//J.Virol., 1974, 13,801-808

127. Franki R — Plant rhabdoviruses.//In "Advances in Virus Rtstarch", 1973, 18, 257-347., Acad. Press. N.Y.,London.

128. Fricsen A, Process for preparing purified immune globulin (IgG). //Пат. 1201063, Канада,МКИ A 61 К 39/395.

129. GaudinY., Raux H., Flamand A., Ruigrok R.W.-Identification of amino acids controlling the low-pH-induced conformational change of rabies virus glycoprotein. //J Virol. 1996 70: 7371-7378.

130. GaudinY., Ruigrok R.W., Knossow M., Flamand A Low-pH conformational changes of rabies virus glycoprotein and their role in membrane fusion.//J Virol. 1993 67.

131. GaudinY.-Folding of rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulum chaperonts //J Virol. 1997 71: 3742— 3750.

132. Gresser J., Enders J. — The effect of trypsin on representative myxoviruses. //Virology, 1971, 13,420-426

133. Griffiss J., Bertmar M., Broud D. Separation and purification of immunoglobulins M, A and G from small vollumes of human sera by a continuous, inline chromatographic process. //J.Chromatogr., 1978, 156, I, 121— 130.

134. Gupta A.K., Blondel D., Choudhary S., Banerjee A.K.- The Phosphoprotein of Rabies Virus is Phosphorylated by a Unique Cellular Protein Kinase and Specific Isomers of Protein KinaseC //J Virol. 2000 74.

135. Hall W., Martin S. The biochemical and biological characteristics of the surface components of measles virus. //J. Gen. Virolog, 1974, 22, 363—374

136. Halonen P., Murphy F., Fields В., Reese D. Hemagglutination of rabies and some other bullet-shaped viruses. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1968, 127, 1037-1041.

137. Hanham C.A., Zhao F., Tignor G.H.-Evidence from the anti-idiotypic network that the acetylcholine receptor is a rabies virus receptor //J Virol. 1993 67:530— 542 Abstract.

138. Harboe H., Ingild A. //Scand.J.Immunol., 1983, 13, 301.

139. Harrison В., Growley N. Properties and structure of lettuce necrotic yellows virus. //Virology, 1975, 26,297-310.

140. Herring A., Nettleton P., Burells C. — A microenzymelinked immunosorbent assay for the detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis virus. //Veter. Rec., 1980, 107, 7, 15

141. Hills G., Sampell R. Morphology of broccoli necrotic yellows virus. //J.Uitrastruct.Res., 1978, 24, 134-144.

142. Horejsi v., Hilgert I. Nitrocellulose membrane as an a antigen or antibody carrier for screening hybridome cultures. //J.Immunol.Meth., 1983, 62, 3, 325— 329

143. Hoscka Y. Izolation and structure of the nucleocapsid of HVJ. //Virulogy, 1978,35,445-457

144. Huang A., Greenewalt J., Wagner R. Defective T particles of vesicular stomatitis virus. I. Preparation, morphology and biological preperties. //Virology, 1976, 30, 161-172.

145. Huang A., Wagner R, — Defective T particles of vesicular stomatitis virus. II.Biological role in homologous interference. //Virology, 1976, 30, 173—181.

146. Hull R. -//Advan Viris.Res., 1976,20,1-22.

147. Hummeler K., Koprowski H., Wiktor Т.- Structure and development of rabies virus in tissue culture. //J.Virol., 1977, 1, 152-170.

148. Ide P. Use of frozen cells in the microtitre serum neutralization test for infectious bovine rhinotracheitis. //Canad.J.comp.Med., 1975, 39, 101-103

149. JacobY., Badrane H., Ceccaldi P.E., Tordo N.-Cytoplasmic Dynein LC 8 Interacts with Lyssavirus Phosphoprotein.//J Virol.2000 74: 10217-10222.

150. JacobY., Real E., Tordo N- Functional Interaction Map of Lyssavirus Phosphoprotein:Identification of the Minimal Transcription Domains //J Virol. 2001 75.

151. Jallet C., JacobY., Bahloul C., Drings A., Desmezieres E., Tordo N., Perrin P.— Chimeric Lyssavirus Glycoproteins with Increased Immunological Potential. //J Virol. 1999 73:225-233.

152. Jerne N.K.—Use of monoclonal antibodies in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related virusts //Ann. Immunol., 1974, 125, 373-389.

153. Kang C., Prevec L. Proteins of vesicular stomattis virus. Immunologycal comparisons of viral antigens. //J.Virol., 1980, 6, 20—27

154. Kang C., Rpevec L — Proteinsof vesicular stomatitis virus //J.Virol., 1979, 3, 404-413.

155. Kawai A. — Transcriptase activity associated with rabies virions. //J.Virol., 1977, 24, 3, 826-835.

156. Kawai A., Matsumoto S. — Detection of transcriptase activity in rabies virions. //Ann.Rept.Viros Res, Kyoto Univ., 1976, 19,35-37.

157. Kelley J., Emerson S., Wagner R. The glycoprotein of vesicular stomatitis virus is the antigen that given, rise to and reacts with neutralizing antibody. //J.Virol., 1972,10,1231-1235.

158. Knudson D. Rhabdoviruses. //J.Gen.Virol., 1973, 20, 105

159. Knudson D., McLeod R.- The proteins of potato yellow dwarf virus. //Virology, 1972,47, 285-295.

160. Kundsen K. //Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1981, 78, 6071

161. Kunkel H.G., Mannik M., Williams R.C.// Cell-mediated immunity to Herpes simplex virus in man //Science, 1963, 140, 1218-1219.

162. Kuwert E. — Реакция связывания комплемента.// Методы исследований по бешенству, ВОЗ, Женева,1775, 124-133.

163. Kuwert Е.- Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютинации.//Методы лабораторных исследований по бешенству, ВОЗ, Женева, 1975, 134-145.

164. Kuwert Е., Wictor Т., Sokol F., Koprowski Н. Hemagglutination by rabies virus. //J.Virol, 1978, 2,138I-I392.

165. Lee P. Partial purification of wheat striate mosaic virus and fine structural studies of the virus. //Virology, 1978, 34, 583.

166. Lepin P. Реакция диффузной преципитации. //Методы лабораторных исследований по бешенству, ВОЗ, Женева, 1975, 150-156.

167. Lery L., Joubert L. — Le groupe d"etudes sut la tage et les maladies appatentles G.E.R.M.A. //Sc. veter. med. сотр., 1988, t.90, №5/6, 339-347

168. L'ltalien J. -Solid-phase methods in protein microsequence analysis. //In "Methods of Protein Microcharacterisation", 1986, 279-314.

169. Livingstone D. //Methods enzymol., 1974, 34, 723

170. Lodmell D.L., Esposito J.J., Ewalt L.C.— Rabies virus antinucleoprotein antibody protects against rabies virus challenge in vivo in inhibits rabies virus replication in vitro.//J Virol. 1993 67: 6080-6086.

171. Lowry O., Rosebrough N., Farr A., Randall R Protein with the Folin phenol reagent.//J. Biol. Chem., 1951, 193,265.

172. Ludwig H. Bovine herpesviruses. //In: The herpes viruses, 2,4 135-214, Plenum Press, N.Y.

173. Mac Leod R. An interpretation of the observed polymorphism of potato yellow dwarf virus. //Virology, 1973, 34, 771-777.

174. Mackett M., Yilma Т., Rose J., Moss В.- Vaccinia virus recombinants : Expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. //Sci., 1985,227, 433-435

175. Madiadipuren A., Sadikin G. Suckling mouse brain (SMB) . rabies vaccine. //Bull.Bio-Fraha, 1975, 2, 24- 39.

176. Magy M., Gray G.M. //Biochemistry, 1980,19, 2351

177. Margaret A. Keller, E. Richard Aiehm Passive Immunity in Prevention and Treatment of Infections Diseases. //Clin. Microbiol. Rev., 2000, 13, 602-614

178. Matsumoto S. Rabies virus. //Adv. in Virus Resrarch, 1970, 16, 257-307

179. Matsumoto S- Electron microscopy of nerve cells infected rabies virus. //Virology, 1972, 17,3,327-336

180. Matsumoto S., Schneider L„ Kawai A, Yonezawa T. —Further studies on the replication of rabies and rabies-like viruses in organized cultures of mammalian neural tissues. //J.Virol., 1974, 14, 4, 981-996.

181. Mebatsion Т., Frost S.W., Krauss H Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) USING STAPHYLOCOCCAS PROTEIN A for the measurement of rabies antibody in various species //J veter. Vtd. Ser. В., 1989, T.36 №7,-p.532-536.

182. Mebatsion Т., Schnell M.J., Conzelmann K.K.-Mokola virus glycoprotein and chimeric proteins can replace rabies virus glycoprotein in the rescue of infectious defective rabies virus particles.//J Virol. 1995 69: 1444-1451.

183. Mebatsion Т., Weiland F., Conzelmann K.K.-Matrix Protein of Rabies Virus Responsible for the Assembly and Budding of Bullet-Shaped Particles and Interacts with the Transmembrane Spike Glycoprotein G//J Virol. 1999 73: 242-250.

184. Mikhailovsky E.M., Tsiang H., Atanasiu P. Concentration du virus rabigue par le polyethylene glycoll.//Ann. Inst. Pasteur, 1971, 121, 563-568.

185. Morrison S Z., Wims L.A., Oi V.T.- Polymorphonuclear neutrophilmediated antibody dependent cell cytotoxicity of herpes virus infected cells: Ultrastructural studies//Biol. Olin Appi, Florence, 1984,2.

186. Muller R.H Application of ion exchange re sine to the purification of certain viruses.//Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1980, 73, 239-241.

187. Murphy F.A. Physical characterization of rabies virus haemagglutinin.//J. Gen. Virol., 178,3,289-293.

188. Nakane P.K., Kawaoi A. Method of HRPO Labeles lg preparation. //J.Histoche. Cytochem., 1974, 22, 1094

189. Nandi S., Maiti S.K. Recent advancement in the diagnosis of tabies. //Asian. Livestock, 1994, Vol. 19, №11, 150-152

190. Narayan K.G., Kotwal S. — Labaratory oliagnosis of tabies in animals in Ranchi. //Inolian veter. J, 1989, t.66, №9, 797-800

191. Nasseman T. -Herpes simplex tipe 2 vaccine: the favourable Euoperan experience.//Int.Dermatol.,1976, 15, 587-593.

192. Neurath A.R., Rubin B.A- Viral structural components as immunogens of prophylactic value. //Monographs in Virology, 1981, 4, Basel: Karger.

193. Neurath A.R., Vernon S.K., Dobkin M.B., Rubin B.A. Characterization of subviral components resulting from treatment of rabies virus with tri (n-butyl) phosphate. //J. Gen. Virol., 1972, 14, 33-48.

194. Neurath A.R., Vernon S.K., Wiener F.P., Hartzell R.W., Rubin B.A. The rabies virus glycoprotein: partial purification and some properties. //Microb., 1983,7,7-15.

195. Neurath A.R.-"Soluble" antigens from cells infected with rabies virus. //Nature, 1976,212/857/405.

196. Nguyen Thu Hong, Nguyen Thuy Duyen- Chuan do virus dai bang Phuong phap ngung ket hong cau //Nang Nghiep Cong Nghiep Thu'с Pham, 2000, №2,-p.68—69.

197. Nikiel J. — Attempts to obtain rabies virus haemagglutinins and evaluation of their immunogenic properties. //Bull. Veter. Inst, in Pulawy, 1974,18, 79—86

198. Oghyanov D., Haralambiev H. —Studies on the CFT in infections rhinotracheitis in cattle. //Vet.Shi.:(Sofia), 1976, 13, 4, 23-28.

199. Oslerhaus A.D.M.E., Bunschoten E.J., Weijer K., Uytbe-Haag F.G.C.M.//Biological Applications of Anti-idiotypes. Vol.2/Ed. C.A/ Bona-Boca Raton, 1988-P. 14-29.

200. Ouchterlony Antigen - antibody reactions in gels.//Arch.-forklini, 1949, 26, 1-9.

201. Oudin S., Michet M.C.R.—Cell fusion induced by herpes simplex virus is promoted and suppressed by different viral glycoproteins //Acad. Sci., 1963, 257 805-808.

202. Pedersen C.E., Eddy G.A. — Separation, isolation and immunological studies of the structural proteins of Venezuelan eguine encephalomyelitis virus. //J.Virol., 1974, .14, 740-744

203. Peharte D.,Cliguet F.,Sagne E.,Renders C.,Costy F.,Aubert M. —Comparison of visual microscopic and computer-automated fluorescence detection of rabies virus ntutralizing antibodies//J. veter. Diagnostic Investig, 1999, Vol. 11, №4,-P. 330-333.

204. Pertic M., Prevec L Vesicular stomatitus virus - a new interfering particle, intracellular structures and virus-specific RHA. //Virology, 1980, 41, 615—630.

205. Peters D., Kitajima E.W. — Purification and electron microscopy of sowthistle yellow vein virus. //Virology, 1978, 41, 135-150.

206. Pinteric L., fenje P., almedia J. — The vizualization of rabies virus in mouse brain. //Virology, 1973, 20, 208-211

207. Rossi C.R., Kiesel G.K. Antibody class and complement reguirement of neutralizing antibodies in the primary and secondary antibody response of cattle to infections bovine rhinotracheitis virusvaccine. //Arch.Virol., 1976, 51, 191-198

208. Rossi C.R., Kiesel G.K. Complement-Reguiring Neutralizing Antibodies in cottle to Infections Bovine Rhinotrachgeitis virus. //Archiv. Virusfors., 1974, 45, 328-334

209. Sahasrabuddhe M.G., Sherikar A.A. Comparison of rapid rabies enzyme immunodiag nosis (RREID) technique with rovtinely used tests. //Indian V. anim. Sc., 1990, t.60, №11, 1271-1273

210. Salmi A.A. Purification of soluble gel precipitating an-antigen of rubella virus and antibody responses to the purified antigen. //Acta path, microbiol. Scand Sect. В., 1972, 80, 545-558

211. Sarkar N.H., Moore D.N., Charney J. The effect of pH on the morphology, electrophoretic mobility, and infectivity of the mouse mamery tumor virus. //Cancer Res., 1973, 33, 2283-2290

212. Sawai Y., Yanaka H., Makino M.A., Kikuchi K. The purification of rabies virus using ion-exchange resins. Japan.//J. Bacteriol., 1974, 9. -509—5 1 2.

213. Schick M.R., Dressman G.R., Kennedy R.C.// Protection against Iethol challenge of BALB/c mice by passive transfer of monoclonal antibodies to five glycoproteins of herpes simplex virus type-2//Ibid.-1987-Vol. 138.- P. 3419— 3425.

214. Schincariol A.Z., Howatson A.F. //Virology, 1980, 42,732-738.

215. Schlumberger H.D., Schneider L.G., Kulas H.P., Diringer H. Gross chemical composition of strain Flury HEP rabies virus. //Z. Naturforsch., 1973, 28, 103— 104.

216. Schmidth J.R., Williams M.C., Lule M. //East Afr. Virus Res., 1975. 15, 2426.

217. Schneider L.- Epidemiologic und diagnostic der Toiiwut. //Med. Klin., 1976, 81,15,609-615.

218. Schneider L.G., Horzinek M., Matcheka H.D. -Purification of rabies virus from tissue culture //Arch. ges.Virusforsch., 1981, 34 351-359

219. Schwartz Warren E. Process-scale isolation and purification of immunoglobulin. //1С GC, 1986, 4, 5, 442^44,446, 448.

220. Shchlumberger H.D., Wiktor T.J., Koprowski H. Antigenic and immunogenic properties of components contained in rabies virus-infected tissue culture fluids. //J.Immunol., 1980, 105, 291-298

221. Shneider L.G., Dietzchold В., Dierks R.E., Matthaeus W. Rabies group-specific ribonucleoprotein antigen and a test system for grouping and typing of rhabdoviruses.//J.Virol., 1973, 11, 748-755

222. Sikes R.K., Larchi O.P., Simpson C.F., Winkler W.G. -Physical and chemical properties of rabies virus. International Symposium on Radies, Talloires 1975. //Symp.Scries Immunobiol. standard, 1, p.55-64. Karger. Basel/New York, 1966.

223. Skrzynecki E., Januszewska M-Proba wygaszania niespecyfucznego swiecenia w preparatach odcishowych mozgowia zwierzat podejrzanych о wscieklizne//Med. Weter., 1996,R. 52, №1,-S.38^0

224. Socol F. Clark H.F.,Gyorgy E., Tomassini N. Heterogene-city in the phospholipid content of purified rabies virus (ERA strain) particles.//J.Gen. Virol., 1972, 16, 173-183.

225. Sokol F. — Biochemical of viral vaccines. /Лn "Recent Advances in Microbiology X international Congress for Microbiology", 551-562, Ed. by A. Perez-Miravete and D. Pelaez, Mexico City, 1981

226. Sokol F. — Purification of rabies virus and isolation of the components. //In "Labaratory Technigues in Rabies", 3-rd ed., World Health Organisation, Geneva, 1973

227. Sokol F., Clark H.F. .Nucleocapsid protein' of a rabies virus - a phosphoprotein. //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1972, 225

228. Sokol F., Clark H.F. Phosphoproteins, structural components of rhabdoviruses.//Virology, 1973, 52, 246-263

229. Sokol F., Clark H.F., Gyorgy E., Tomassini N. Heterogene-city in the phospholipid content of purified rabies virus (ERA strain) particles.//J.Gen. Virol., 1972, 16, 173-183.

230. Sokol F., Clark H.F., Wiktor T.J., Mc Falls M.L. et al. -Structural phosphoprotains associated with ten rhabdoviruses. //J. Gen. Virol., 1974, 24, 433-445.(471)

231. Sokol F., Kuwert E., Wiktor T.J., Hummele K. ,et al. Purification of rabies virus grown in tissue culture. //J. Virology, 1978, 2, 836.

232. Sokol F., Schlumberger H.D., Wiktor P.J., Koprowski H., et al. Biochemical and biophysical studies on the nucleocapsid and on the RNA of rabies virus. //Virology, 1979, 38, 651-665.

233. Sokol F., Stancek D., Koprowski H., Structural proteins of rabies virus. //J. Virol., 1971.7,241-249.

234. Sokol F., Tan K.B., McFalls M.L., Madore P.- Phosphate acceptor amino acid residues in structural proteins of rhabdoviruses. // J. Viroi., 1974, 14 145—151.( .476.)

235. Solsona M., Perrin В., Perrin M. Recherche des anticorps contre le virus de la rhinotracheite bovine infectieuse par la methode ELISA. IIBull. Acad. Vet. De France, 1980, 53, 215-225

236. Soula A., Laurent N., Tixier G., Moreau Y. ELISA JBR-expression d'un titre ELISA 50%.//Develop. Biol. Stand., 1982, 52, 147-157

237. Soulebot J. Vaccins et vaccination contre la rhinotracheitl infectieuse bovine. //Devel. in Biol. Standart., 1981, 52, 415-427

238. Soulebot J.P., Petermann H.G., Branche R.,- Reaction de fixation du complement. Application au virus rabigue.//Bull. Acad. Veterin, 1979, 42, 187-211.

239. Spieck M. Immundiffusionstest zum Nachweis von Antikorpern der infectiosen bovinen Rhinotraheitis im Vergleich • mit Neutralisations und Enzumtest. //Tierarzte, Umschan., 1986, 41, 958-961

240. Sreevalson Т., Allen P.T. — Replication of Western eguine encephalomyelitis virus. Cytoplacmic structure involved in the synthesis and development of the virioney.//J.Virol., 1978, 2, 1038-1046

241. Strauss J.I., Burge J., Pfetterkorn B.W., Darnell E.R. Identification of the membrane protein and "core" protein of Sindbis virus. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1978, 59, 533-537

242. Surreau P., Rollin P. Correlations entre e'epreuve immunoenzym atigue, la seroneutralisation et la reduction de foyers fluorescents pour le titrage des anticorps rabigues. //Compar. Immun., 1982, 5, 1-3, 143-150

243. Swanepoel N.K., Blackbrun Wilson A comparison of methods for demonstrating antibodies to the virus of IBR. //Brit. vet. J., 1976, 132, 4, 423427

244. Szilagyi J.F., Uryvayev L. Isolation of an infectious ribonucleoprotein from vesicular stomatitis virus containing an active RNA transcriptase. //J.Virol., 1973,11,279-286

245. Tagawa I., OzawaW., Kondo A.-Studies on the purification of rabies virus. I. Application of methanol precipitation and two other methods. //Yokohama Med. Bull., 1973, 4,78-86.

246. Talens L.T., ZeeY.C. Purification and Byoyant Density of infections Bovin Rhinotracheitis virus. //Exper. Biol, and Med., 1976, 151, 1, 132—135

247. Tanyi J., Porkolab L., Tenyiesi A, Foldi J. A szarvasmarha-veszottseg klinikumahos, jarvanytanahos es elkulonito koijelzesehez. //Magyar allatorv. Lapja, 1988, t.43, №7, 407-413

248. Thraenhart O. Aktueller Stand der Epidemi ologie, Didgnostik und Pravention derTollwut. //Prakt. Tierarzt., 1996, Jg.77, №5, 433^142

249. Tierkel E.S.- Ускоренный метод микроскопического исследования с целью выявления телец Негри и подготовка материала для биологической пробы.//Методы лаб. исследований по бешенству, ВОЗ, Женева, 1975, 41— 55.

250. Turner G.S., Kaplan С. Some properties or rixed rabies virus. //J. Gen. Virology, 1977,1,537-551.

251. Wagner R,R., Snyder R.M., Yamazaki S. Proteins of vesicular stomatitis virus: kinetiks and allular sites of synthesis. //J. Virol., 1980, 5, 548—558.

252. Wagner R.R., Kiley M.P., Snyder R.M., Schnaitman C.A. Cytoplasmic compartmentalization of the protein and ribonucleicacid species of vesicular stomatitis virus. //J. Virology, 1972,3, 141-151.

253. Wagner R.R., Prevec L., Brown F., Summers D.F., et al. — Classification of rhabdovirus proteins: a proposal. //J. Virology, 1972, 10, 1228—1230.

254. Wagner R.R., Schaitman T.C., Snyder R.M., Schnaitman C.A. Protein composition of the structural components of vesicular stomatitis virus. //J. Virol., 1979,3,611-618.

255. Wagner R.R., Schnaitman T.C., Snyder R.M. Structural protein of vesicular stomatitus virus. //J. Virol., 1979, 3, 395^03.

256. Wecker E., Richter A. Conditions for the replication of infectious viral RNA. //Cobt. Spring Harbor Symp. Quapt. Biol., 1972, 27, 137-148

257. Wiktor T.J., Gyorgy E, Schlumberger H.D., Sokol F. et al. — Antigenic properties of rabies virus components. //J. Immunol., 1973, 110. 269—276.

258. Wolanski B.S., Francki R.L.B., Chambers T.C. — Structure of lettuce necrotic yellows virus. I. Electron microscopy of negatively stained preparations. //Virology, 1977,33, 287-296. .

259. Wu X, Gong X., Foley H.D., Schell J., Fu Z.F Both Viral Transcription and Replication Are Reduced when the Rabies Virus Nucleoprotein is Not Phosphorylated.//J Virol.2002 76: 4153-4161.

260. Yamada S., Koda Y., Schinara T. Distribution of neutralizing antibody against infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus in southern Japan //Jap.Vet.Med.Ass., 1964, 17, 28-30

261. Yang J., Koprowski h., Dietzschold В., Fu Z.F.— Phosphorylation of Rabies Virus Nucleoprotein Regulates Viral by Transcription and Replication by Modulating Leader RNA Encapsidation.//J Virol. 1999. 73: 1661-1664.

262. Zajac J., Zuffa A. Kjoodnotenie immunoenzymatickej reakcie pri kvantifikovani protilatok proti virusi infekcnej . bovinej rinotracheitidej. INeter.Med. (Praha), 1980, 3, 11, 643-650

263. Zanetti M. — Effect of tuncamycin and monensin on biosynthesis, transport and maturation of bovine herpes virus type-1 glycoprotein. //Crit.Rev.Immunol., 1996, 6, 151-183

264. Zavadova J., Svrcek S. Zdokonalenie laboratornej diagnostiky besnoty a titrocie virusu besnoty. //Veter.Med.Praha, 1994, r.39, c.l 1, 663-676

265. Zemp K., Steck F. Comparison of serum neutralization and the ELISA. //Technique in the detection of antibodies to IBR-JPV-virus in cattle. //Experientia, 1981, 37, 1229

266. Zimmer K., Wiegand D., Manz D. Evaluation of five different methods for routine diagnosis of rabies. // J. veter. Med. Ser. В., 1990, t.37, №5, 392-400

267. Zygraich N., Lobmann M., Vascoboinic E et al // In vivo and in vitro properties of a temperature sensitive mutant of infectious bovine rhinotracheitis virus.//Res. Vet Sci, 1974, 16: 328-335.

Информация о работе

Акиньшина, Татьяна Викторовна
кандидата биологических наук
Щёлково, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы