Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак"

РАХМАНИН Петр Владимирович

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ПРИВИТЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА КОШЕК И СОБАК

03.00.23 «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 1Т

003171228

РАХМАНИН Петр Владимирович

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ПРИВИТЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА КОШЕК И СОБАК

03.00.23 «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИТИБП))

Научный руководитель: доктор биологических наук

Клюкина Валентина Ивановна,

Официальные оппоненты: профессор, доктор ветеринарных наук

Белоусов Василий Иванович,

кандидат биологических наук Красуткин Сергей Николаевич

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко»

Защита диссертации состоится 27 июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006 069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 27 мая 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенств вом среди животных и возникновения случаев заболевания людей Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями ра-бического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (Селимов М А, 1998; Макаров В.В. и др , 2002)

В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев Бешенство среди различных видов животных в 2007 году распространилось на территории 49 субъектов РФ.

Интенсивность распространения бешенства домашних животных находится в прямой зависимости от численности безнадзорных собак и кошек. В Российской Федерации с 2000-2005гг увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%.

Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популя-ционной и индивидуальной защиты животных (Недосеков В В.2001, Иванов В С ,2002).

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (В1е1зс1гоШ В.,1990: Ьа&п М ,1990)

В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству содержание в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл считается минимальным уровнем антирабических антител, соотносимого с возможностью защиты от бешенства (Manual of standards Diagnostic Tests and Vac-cines,2004).

С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и уровня протективного антирабического иммунитета не менее 0,5МЕ/мл. (Регламент Совета и Европейского парламен-та,2003).

Общепринятым методом оценки рабического иммунитета у привитых против бешенства людей и животных является реакция нейтрализации (РН) на мышах, к недостаткам которой можно отнести трудоемкость, использование большого количества животных и длительного срока (14-21 день) наблюдения.

Среди новых, рекомендуемых МЭБ методов in vitro на культуре клеток, можно выделить тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN), которые позволяют по определенному в тестируемых сыворотках количеству антирабических антител определять уровень протективного иммунитета. Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса.

На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству рекомендует в качестве быстрого, пробный тест на основе непрямого иммунофер-

ментного анализа для количественного определения в сыворотках крови вакцинированных животных антител к вирусу бешенства.

К преимуществам ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса и возможность в короткие сроки (3-4 ч) количественно определять в сыворотках привитых против бешенства животных уровень антирабических антител (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).

С учетом этого, разработка тест-системы на основе непрямого им-муноферментного анализа для количественного определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак является актуальной задачей для практической ветеринарии.

Цель и задачи исследований

Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина (111) для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.

2 Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.

3 Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы

4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак

5 Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток

Научная новизна работы.

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Впервые в РФ разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с применением кулыурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Отработаны условия очистки и концентрирования кулыурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.

Подобрана схема иммунизации баранов и собак для получения ан-тирабической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.

Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак с помощью разработанной иммуноферментной тест-системой и РН в культуре клеток.

Практическая значимость работы.

Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.

Разработанная тест система может быть использована для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак при перевозе их через границу Российской Федерации.

Основные положения, выпосимые на защиту.

Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.

Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток.

Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.

1.6.Апробация и публикация результатов.

Основные материалы диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИИТБП по плану НИР ОКР на 2005-2008гг задания 08 06. 0¡.«Разработать новые диагностические системы и комплексные лечебно-профилактические препараты экономически значимых инфекционных болезней животных», на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и иммунологии животных» к 100-летию Я С. Коваленко, 16-17 мая 2006г, Международной юбилейной научно-практической конференции, поев 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленно-

ста (Курск, 2006г), Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 20-21 декабря 2007 (Щелково, 2007), на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково,2008).

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных

работ.

Структура объем и диссертации.

Диссертация изложена на 104 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 3 рисунками. Список используемой литературы включает 121 источников, из которых 61 отечественных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.Материалы и методы

Работа выполнена в 2005-2008гг в отделе иммунологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП).

Вирус бешенства В работе использовали культуральную суспензию фиксированного вируса бешенства штамм «CVS», адаптированного к культуре клеток ВНК-21, с титром инфекционности 5,0 lgLD50/cM.

Антигены для ИФА Очищенный вирус бешенства получали путем ступенчатого центрифугирования вируссодержащей суспензии при 1 тыс-g и 50 тыс g с последующей очисткой вируса гель-хроматографией на сефарозе 4В.

Гликопротен (ГП) вируса бешенства получали обработкой очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации и отделением ультрацентрифугированием при 50 Tbic.g.

Электронно-микроскопическое изучение препаратов вируса бешенства проводили с помощью негативного контрастирования Плавучую плотность вируса бешенства определяли дифференциальным центрифугированием в градиенте 10-60% сахарозы.

Титрование инфекционности вируса бешенства проводили путем ин-трацеребрального заражения мышей, согласно ГОСТ 26075-84

Сыворотки Исследовали сыворотки от вакцинированных против бешенства баранов (34 пробы), КРС (26 проб), кошек (26 проб), собак (24 проб) из приютов, ветлечебниц и хозяйств Московской области в период 2006-2008гг.

Антирабические сыворотки получали иммунизацией баранов и собак препаратом концентрированного очищенного вируса бешенства штамм «CVS» по разработанной в отделе иммунологии схеме совместно с аспирантом Проничевым А Б

Схема иммунизации включала подкожное введение животным инакти-вированного вируса бешенства штамм «CVS» и внутримышечные инъекции вируса с адьювантом

Пул нормальных сывороток от клинически здоровых не вакцинированных собак, отрицательно реагирующих в ИФА и РН, использовали в качестве отрицательного контроля для ИФА

Методы определена антител Антитела к вирусу бешенства выявляли исследованием сывороток крови методами РН, РДП, РСК, РНИФ как описано в «Методах лабораторных исследований по бешенству» (1975).

Синтез протеин А- пероксидазного конъюгата Конъюгат готовили меткой протеина A St. aureus с ферментом пе-роксидазы хрена (ПХ марка A, RZ = 2,8 -3,0 ("Sigma") периодатным методом по В Wilson, Р Nakane (1978 г) Иммунологическую и знзиматиче-скую активность протеин А-ПХ коньюгата определяли титрованием его в ИФА с сыворотками собаки, кошки

При постановке ИФА использовали также коммерческие антивидовые анти-IgG барана (производства ИЭМ Н Ф Гамалеи,РАМН), анти-IgG кошки и анти-IgG собаки («Sigma») коньюгаты.

Определение белка Общий белок определяли по Лоури и др (1956) и спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны 280 нм.

Непрямой иммуноферментный анализ для количественного определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных Для разработки иммуноферментной тест-системы был проведен ряд модельных экспериментов с сыворотками баранов

Антитела в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных определяли методом непрямого твердофазного иммунофер-ментного анализа (ИФА), используя 96-луночные панели или 16 луночные стрипы. Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра «Sigma»npH длине волны 490 нм.

Сенсибилизацию панелей проводили очищенным культуральным вирусом бешенства штамм «CVS» из расчета 10 мкг/0,1мл (гликопротеин 4 мкг/0,1мл) в ЮмМ фосфатном буфере рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% детергента в течение 18 ч при 4° С. Центры неспецифической сорбции блокировали 2% раствором обезжиренного сухого молока и выдерживали 12 ч при температуре 4°С

После каждого этапа проводили промывку лунок 4-х кратно трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 (ТСБ-Т)

Исследуемые сыворотки в разведении 1 100, контрольные сыворотки в разведении 1.10 и стандартный препарат в разведениях 1100-1 30 000 на ЮмМ ФБР с 0,5% сухого обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС, инкубировали в лунках одной панели в двух повторностях в течение 1 ч при 37° С

После 4-х кратной промывки в лунках инкубировали протеин А- пе-роксидазный (или антивидовой) коньюгат 1 ч при 37° С Субстратно-индикаторный раствором для пероксидазных коньюгатов служил 0,04%-

ный раствор орто-фенилендиамина (ОФД) в 0,1 $ М цитратно-фосфатном буфере pH - 5,0 с 2,4 мМ Н202.

Реакцию ИФА останавливали через 30 мин добавлением в лунки 50мкл 4Н раствора H2SO4 и определяли оптическую плотность при 490 нм (ОП490). Титром антигена или сыворотки считали конечное разведение, в котором ОП490 в 2 раза превышало ОЩю отрицательного контроля.

Количественное содержание антител в исследуемой сыворотке определяли по уравнению линейной регрессии, выведенному по результатам титрования стандартного препарата (зависимость ОП490 от концентрации антител (ME/мл) в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO Laboratory Techniques m Rabies, 2004,p.2.2.5).

В качестве стандартного препарата использовали коммерческий ан-тирабический у-глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 ME/мл (производства НПР «Вектор»).

Результаты ИФА сравнивали с результатами исследования сывороток в РН в культуре клеток. Относительную чувствительность и специфичность разработанной тест-системы определяли согласно рекомендациям ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).

Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического (х) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (а) средней арифметической проводили согласно руководству И.В .Полякова (1975).

При определении согласованности результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы и РН, использовали метод каппа-статистики (Shoukri М N. 1996, С А Дудников, 2005).

Обработка данных, полученных непрямым ИФА и оценка их достоверности включала регрессионный анализ, который позволил рассчитать значения параметров уравнения А,В, значение коэффициента корреляции R,

стандартную ошибху и построить линию регрессии (Методика статистической оценки экспериментальных данных в биологии Е.А.Рубан 1972).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Отработка условий очистки и концентрирования вируса бешенства.

Для постановки непрямого ИФА по определению уровня иммунитета, необходимо использовать антигены, обладающие высокой иммуно-генной активностью и имеющие в своем составе спектр антигенных детерминант, вызывающих при введении животным выработку вируснейтрали-зующих антител.

Для получения очищенного и концентрированного культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» были испытаны ряд методов, позволяющих максимально освободиться от белков клеточной культуры с сохранением целостности вирусных частиц, такие как последовательное центрифугирование и гель-хроматография.

После центрифугирования вируссодержащей суспензии с титром инфек-ционности 5,0 lg LDjo/cm при 1тыс g и концентрирования при 50 тыс g на центрифуге VAC-60 был получен препарат вируса бешенства с титром инфекционности 5,4 lg LDjo/cm. и очищенный на 90%, по сравнению с исходным содержанием белка

Хроматографический профиль очистки вируса бешенства на сефарозе 4В был представлен 2 пиками, причем комплементсвязывакицая активность была обнаружена в 1-2 пиках, инфекционность в первом пике. Результаты очистки вируса бешенства представлены в таблице 1

Таблица L

Результаты очистки культурального вируса бешенства

Материал и этапы Очистки Кол-во мл Белок мг/мл Инфек-ть Lg LDso/iui Очистка в%

Исходная суспензия 4500 22 5,0

Центрифугирование 50 тыс g 55 9,2 5,7 60

Хроматография на сефадексе 0-200 68 2,4 5,8 90

Антиген для ИФА 30 0,57 6,2 97,4

По данным электронной микроскопии, концентрированный материал первого пика содержал большое количество целых вирусных частиц с характерными выступами на наружной оболочке, типичной для вируса бешенства Дифференциальным центрифугированием очищенного вируса бешенства на градиенте 10-60% сахарозы был выявлен один пик инфекционное™ в зоне 1,16 г/см, что также свидетельствовало о наличии высоко-очищенного препарата Таким образом, оптимизация условий очистки позволила получить цельновирионный препарат вируса бешенства штамм «CVS» очищенный на 97,4%, с титром инфекционности на 1,2 Lg LD5iyCM выше, чем в исходной вируссодержащей суспензии.

Активность очищенного вируса бешенства оценивали в прямом ИФА с положительной антирабической сывороткой барана и анти -IgG барана пероксидазным коньюгатом в стандартных условиях Установлено, что активность очищенного вируса бешенства составила 1:800 и была в 200 раз выше исходной.

Антигенную активность и специфичность очищенного вируса бешенства определяли иммунизацией баранов, которым 2-кратно вводили вирус внутримышечно и подкожно Через 7,14, 30 дней брали кровь и исследовали на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в РН.

Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках иммунизированных баранов составили 1 64.

Препарат цельновирионного вируса бешенства штамм «СУБ» был использован для получения антирабической сыворотки для ИФА и в качестве антигена в разработке иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител у вакцинированных против бешенства животных

Получение гликопротеина вируса бешенства Из большого выбора реагентов, пригодных для солюбилизации мембранных белков, нами был выбран неионный детергент тритон Х-100, обладающий способностью дезинтегрировать мембраны и удерживать белки в растворенном состоянии, не нарушая их антигенной структуры и не препятствуя взаимодействию с антителами.

Исследована возможность использования тритона Х-100 в 1%-2% концентрации для растворения мембран очищенного вируса бешенства и разделения гликопротеина

Установлено, что при обработке очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации солюбилизируется 80% белка, против 48% при применении 1% -концентрации Гликопротеин вируса бешенства отделяли улырацентрифугированием при 50 тыс ё в течение 90 мин и диализовали надосадок против 1% лизина

Надосадок после ультрацентрифугирования содержал гликопротеин вируса бешенства, осадок содержал нуклеопротеид и небольшое количество цельного вируса, от которого освобождались хроматографией на сефадексе --<3-75. После гель-хроматографии растворенного осадка на се-фадексе С-75, в материале второго пика был получен нуклепротеин вируса бешенства и незначительное количество целого вируса обнаружено в первом пике

Анализ состава и мол массы выделенного гликопротеина гель-хроматографией на сефадексе 0-200 в трис буфере рН 7,8 показал присутствие единственного пика белка с м.м. 40 кД

Изучение фракции гликопротеина в ДСН-ПААГ и иммуноблотом с ан-тирабической сывороткой показало, что основная масса белка обнаружена в полипептидах с м м 46-56 кД

Специфичность выделенных фракций гликопротеина и нуклеопротеи-на была изучена в РСК, непрямом ИФА с антирабической сывороткой барана и прямом ИФА с мышиными пероксидазными коньюгатами моно-клональных антител против гликопротеина и нуклеопротеина вируса бешенства

Результаты серологических исследований показали, что гликопротеин не обладал комплементсвязывающей активностью и в ИФА реагировал с антирабической сывороткой в титре 1.12800, с мышиным моноклональным коньюгатом против ГП в титре 1 640, отрицательно с мышиным моноклональным коньюгатом против НК вируса бешенства.

В сыворотках иммунизированных кроликов гликопротеин вызывал образование вируснейтрализукмцих и агглютинирующих антител, выявляемых в РНвтитре1 16, РИГА в титре 1 64 и ИФА-1 6400.

Фракцию гликопротеина лиофилизировали с декстраном Т-70 в 1% концентрации и использовали в качестве антигена для ИФА.

Таким образом, обработка очищенного вируса бешенства 2% тритоном Х-100, позволила получить гликопротеин с максимальным сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА При введении кроликам ГП индуцировал образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титре 1 16 и агглютинирующих антител в титре 1 64. Препарат гликопротеина стабилизировали диализом против 1% лизина, хранили при -40° С и использовали в качестве антигена для ИФА

2.2. Синтез протеин-А пероксидазного коныогата Коньюгат протеина A (St aureus) с ферментом, является универсальным компонентом различных иммуноферментных тест-систем, применение которых позволяет определять антитела в сыворотках некоторых видов животных, заменив антивидовые коньюгаты Преимуществом использования протеин А-пероксидазного коньюгата является способность IgG сыворотки крови большинства видов животных связываться с белком А В целях стандартизации постановки непрямого ИФА была исследована возможность использования протеин А-ПХ коньюгата взамен коммерческих анти-IgG кошки, анти-IgG собаки пероксидазных коньюгатов.

Синтез протеин А - пероксидазного коньюгата проводили с использованием коммерческого препарата протеина A (St aureus,«Sigma») с содержанием белка 10 мг/мл, который метили ферментом пероксидазы RZ-3,0 в соотношении 1:2 и отделяли от свободного фермента гель-хроматографией на сефадексе G-200

После очистки коньюгата на сефадексе G-200 установлена иммунологическая и ферментативная активность, которой обладал материал первого пика. Специфичность и активность протеин А-пероксидазного коньюгата определяли титрованием его в сравнении с коммерческими ан-ти-IgG кошки и анти-IgG собаки коньюгатами Результаты представлены в таблице 2

Согласно представленным в таблице данным, при рабочей концентрации протеин А- пероксидазного коньюгата 240-200 мкг/0,1мл, величина ОП490 с антителами сывороток кошки и собаки составил 1,290 -1,140, ири низких фоновых значениях.

Следовательно, протеин А- пероксидазный коньюгат может быть использован для замены анти-IgG кошки и анти-IgG собаки коньюгатов в тест-системе при определении антител к вирусу бешенства методом непрямого ИФА

Таблица 2.

Характеристика протеин А- пероксидазного коньюгата.

Коньюгаты Рабоче разведение, дающее ОП490> 1,0 ОП490 с сывороткой кошки / БСА ОП490 с сывороткой собаки / БСА Рабочая концентрация по ПХ, мкг/0,1мл

Протеин А-ПХ р-р 14000 1,290/0,120 1,140/0,170 240

Протеин А-ПХ сух 1 3200 1,220 / 0,110 1,120/0,190 200

Анти-^в кошки 1 6000 1, 180/0,060 — 160

Антикв собаки 1 5000 1,210 /0,070 180

Включение сахарозо-желатиновой смеси позволило стабилизировать активность протин А- конъюгата и сохранить в лиофилизированном состоянии энзиматическую и иммунологическую активность в течение 2 лет (срок наблюдения).

2.3. Получение контрольных сывороток для иммунофермент-ной тест-системы.

Для постановки иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител необходимо располагать контрольными сыворотками: положительной -антирабической сывороткой с содержанием вируснейтра-лизующих антител и отрицательной - сывороткой, не содержащей антитела к вирусу бешенства.

Антирабические сыворотки, получаенные иммунизацией баранов и собак препаратом очищенного и инактивированного (3-пропиолактоном 1.4000 вируса бешенства, и сыворотки от невакцинированных собак исследовали на наличие антител к вирусу бешенства. Результаты серологического исследования сывороток представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты серологического исследования контрольных сывороток

Сыворотки Титры антител

РН РСК РДП РНИФ

Нормальная Сыв-ха собаки

Барана 1 64 1 40 1 12S 1 160

Собаки (1введ ) 1 16 1 10 1 2 1 20

Собаки (2 введ ) 1-32 1 10 1-8 1 40

Комплексное исследование антивирусной активности антирабических сывороток показало, что содержание специфических антител в них зависело от способа введения вируса бешенства и сроков взятия сыворотки Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках баранов в титрах Г64 выявлялись в РН на 30-45 дни от начала иммунизации, комплементсвязы-вающих 1:160 - на 45-60 дни, преципитирующих в титре 1: 128 на 70-105 день от начала иммунизации.

Антирабическая сыворотка собаки с максимальные титром вируснейтрализующих антител 1.32 была получена на 45 день после двукратного введения очищенного вируса бешенства.

Исследование антирабической сыворотки барана в реакции непрямой иммунофлюоресценции показало, что она способна подавляю специфическую флюоресценцию в мазках мозга от мышей зараженных вирусом бешенства штамм «CVS», в разведении 1:160. Сыворотка вошла в диагностический набор «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» методом флюоресцирующих антител (Регистрационный № 1.2.-9/00080, утверждена 20.02 2006 г)

Антирабическая сыворотка барана с титром вируснейтрализующих антител 1:64 и собаки с титром 1:32 и пул сывороток, отрицательно

реагирующих в РН, были использованы в качестве контрольных в разработке иммуноферментной тест-системы

2.4. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства.

Для разработки иммуноферментной тест-системы непрямого ИФА использовали рекомендации, указанные в руководстве ВОЗ ( Manual of standarts Diagnostic Test and Vaccines,2004 часть 2 2 5) Оптимизация условий постановки непрямого ИФА для количественного определения антител включала определение оптимальной дозы, времени и температуры сорбции компонентов в лунки микроплат, состава сенсибилизирующего и блокирующего буфера, режима и времени инкубации сывороток, регистрации и интерпретации результатов ИФА

Постановку непрямого иммуноферментного анализа проводили с использованием следующих компонентов

- антиген - препарат цельновирионного вируса бешенства с концентрацией 0,57 мг/мл, гликопротеин с концентрацией 0,12 мкг/мл, -контрольные сыворотки- положительная- антирабическая сыворотки барана с титром вируснейтрализующих антител1.64 и собаки с титром в РН 1 32, отрицательная сыворотка -пул сывороток не содержащих антител к вирусу бешенства,

- стандартный препарат антирабический у-глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл,

- протеин А -пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1 '4000

Отработка оптимальных условий постановки непрямого иммуноферментного анализа для определения антител Методом шахматного титрования препарата вируса бешенства и гликопротеина ( 0,12-10 мкг/мл) и

антирабического у-глобулина (1'50-1:6400) определена оптимальная концентрация вируса и ГП для сенсибилизации поверхности микроплат Оптимальная концентрация очищенного вируса бешенства составила 10мкг/0,1мл, гликопротеина 4 мкг/мл при времени экспозиции 1 ч при 37° С или 18 ч при температуре 4° С и использовании 10 мМ ФБР рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% тритона Х-100

Исследования активности сорбированного на микроплаты вируса бешенства и ГП, показали сохранность этих свойств при хранении микроплат при 4° С в течение 6 мес (срок наблюдения) плотно закрытыми.

Для определения оптимальных условий сорбции контрольных и исследуемых сывороток исследовали величину ОП490 от времени и условий инкубации с вирусом, адсорбированным на микроплаты Результатами опытов установлено, что инкубация предварительно инактивированных при 37° С в течение 30 мин контрольных , исследуемых сывороток и стандартного препарата в течение 1ч при 37°С, является оптимальным при включении в ЮмМ ФБР 0,5% обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС Отмывка лунок микроплат на всех этапах сорбции трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 и блокировка свободных сайтов связывания 2% раствором обезжиренного молока, позволила получить стабильные достоверные результаты ИФА

Аналитическую чувствительность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием стандартного препарата антирабического у-глобулина человека в диапазоне концентраций 0,018-9,0 МЕ/мл Установлено, что в оптимизированных условиях иммуноферментная тест-система непрямого ИФА обеспечивала обнаружение до 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител Тестированием в непрямом ИФА антирабиче-ских сывороток баранов установлено, что в сыворотках были обнаружены антитела к вирусу бешенства на 7 день после иммунизации.

Аналитическую специфичность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием гетерологичной сыворотки, содержащей антитела к энтеровирусу и отрицательной (не содержащей вируснейтрализующих антител) сыворотки собаки

Полученные результаты свидетельствуют, что разработанная тест-система ИФА является специфичной, так как позволяет достоверно дифференцировать антитела, специфические к вирусу бешенства (ОП4900,93610,014), от гетерологичных антител (ОП490 0,220±0,002) и антител отрицательной сыворотки (ОП490 0,120±0,001).

Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток

Для определения допустимых значений ОП490 контрольных сывороток, проанализировали ОП490, полученные титрованием 12 повторностей положительной и отрицательной сывороток собаки в разведении 1.10.

Установлено, что результаты определений антител в разработанной им-муноферментной тест-системе считаются достоверными, если допустимые значения для положительной сыворотки ОП^о S0,300 и для отрицательной сыворотки ОП490 <0,15.

Если ОН)ад контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты ИФА будут считаться сомнительными и пробы сывороток должны быть исследованы повторно

Для определения оптимального разведения исследуемых сывороток их титровали в разведении 1 50-1:1600. В результате исследований было выбрано в качестве рабочего разведение 1:100, при котором достоверно различались положительные (ОП490 0,83610,004) и отрицательные (ОП4900,12010,012) сыворотки.

2.5. Количественное определение антирабических антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Количественное определение антирабических антител проводили на основе сравнения ОП490 исследуемой сыворотки в разведении 1.100 с кривой титрования стандартного препарата у-глобулина человека с применением линейного регрессионного анализа. Для этого титровали стандартный препарат у-глобулин человека в диапазоне концентраций 0,03-9 ME/мл и строили линию регрессии, как функцию ОП490 (ось У) к концентрации антител (ось X). Используя результаты титрования стандартного препарата, рассчитывали коэффициенты А, В уравнения регрессии: IgY=A +Вх IgX (т/мл).

На основании расчетов коэффициентов регрессии А и В было выведено уравнение У= 0,56+ 0,108 х Хме/мл

Коэффициент корреляции результатов определения ОП490 и концентрации антител в стандартном препарате составил 0,84

Установлена пороговое значение ОП490 =0,620 о е, по которой определено минимальное содержание в сыворотках крови антирабических антител (<0,5 МБ/мл). При ОП490 £0,620 o.e. уровень антирабических антител в исследуемой сыворотке более 0,5 МЕ/мл

Следующим этапом было сравнение результатов количественного определения антирабических антител в 41 сыворотках привитых кошек и собак, полученных с помощью иммуноферментной тест-системой с применением в качестве антигенов очищенного вируса и гликопротеина с результатами РН в культуре клеток. Чувствительность и специфичность тест-системы ИФА и РН в культуре клеток определяли в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004) Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты исследования сывороток в тест-системах ИФА и РН

Результаты ИФА с очищенным вирусом бешенства РН > 0,5МЕ/мл РН < 0,5МЕ/мл

> 0,5МЕ/мл 23 в 21А 2

< 0,5МЕ/мл 18° 1 17 и

Результаты ИФА с ГП Вируса бешенства РН > 0,5МЕ/мл РН < 0,5МЕ/мл

>0,5МЕ/мл27в 24А 3

< 0,5МЕ/мл 15° 2 13 е

Примечание:

Относительная чувствительность А/В х100%,где

А- количество проб (> 0,5МЕ/мл) в разработанной тест-системе, совпадающих с количеством проб (> 0,5МЕ/мл) в РН, В- количество проб (> 0,5МЕ/мл) в РН, Относительная специфичность С/ОхЮО%,где

С-количество проб (< 0,5МЕ/мл) в разработанной тест-системе, совпадающих с количеством проб (< 0,5МЕ/мл) в РН, О- количество проб (< 0,5МЕ/мл) в РН,

Там образом, разработанная тест-система для определения уровня ан-тирабических антител в сыворотках привитых кошек и собак с применением в качестве антигена очищенного вируса бешенства, обладала большей чувствительностью и специфичностью (91% и 94%), по сравнению с ИФА на основе гликопротеина вируса бешенства (88% и 86% соответственно).

2.6.ГГрименение разработанной тест-системы для определения антира-бнческнх антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

С помощью разработанной иммуноферментной тест-системой было исследовано 17 сывороток от вакцинированных кошек и щенков,собак, а также 24 сыворотки КРС (стадо дойных коров Тульской области после однократной вакцинации, сыворотки взяты б мес п/в). Исследовали сыворотки крови кошек и собак 3-х групп: кошки и собаки, подвергнутые пла-

новой вакцинации (lrpynna), ранее вакцинированные, с неизвестным сроком после вакцинации (2 группа), ранее не вакцинированные (3 группа). Исследовали сыворотки кошек и собак после плановой вакцинации в ветеринарных клиниках, взятые на 30,60,90 дни после вакцинации и определяли динамику накопления антирабических антител.

Согласно полученным данным, после однократной вакцинации уровень антител у кошек на 30 день составил 1,0-2МЕ/мл, собак 2-4МЕ/мл, на 60 день 3,5-4 ME/мл и 6-8 ME/мл, на 90 день после вакцинации 2-2,5 ME/мл и 4-6,5 ME/мл соответственно.

Установлено, что у 56% кошек и 77% собак, 2 группы с неизвестным сроком вакцинации и у 97% 3 группы наблюдался низкий (мене 0,5МЕ/мл) уровень антирабических антител.

Содержание антирабических антител 1,5-3 МЕ/мл на 30-45 дни п/в определен в сыворотках крови кошек и собак, содержащихся в приюте, питомнике и домашнего содержания, подвергнутых ежегодной обязательной вакцинации.

Из 24 сывороток КРС, в 16 сыворотках уровень антирабических антител составил 1-2 ME/мл, в остальных 0,32-0,6 МЕ/мл.

2.7. Исследование эффективности применения нммуноферментной тест-системы и РН для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для оценки эффективности разработанной иммуноферментной тест-системы были отобраны по результатам ИФА и исследованы в РН 17 сывороток от привитых против бешенства кошек, собак и щенков с содержанием антител 0,5-0,9 ME/мл и 5 сывороток менее 0,5 МЕ/мл. Согласованность двух тестов определяли методом каша-статистики (Lan-dis Koch, 1997). Полученные данные представлены в таблице 4

Таблица 4

Результаты ИФА и РН при определении уровня антирабических антител

Сравниваемые Тесты Результаты РН Всего Выявленная превалентность в ИФА

>0,5МЕ/мл < 0,5МЕ/мл

ИФА > 0,5МЕ/мл 15А 2 17й (15+2)/22=0,77

<0,5МЕ/мл 1 4^ 5й (1-4)/22=0,13

Всего 16 6 22

Выявленная превалентносгь в РН (15+1)/22=0,72 (2-4)/22=0,09

Согласованность результатов 2-х тестов определяли по следующим показателям

-абсолютная согласованность результатов непрямого ИФА (17-2)/22=0,68

-случайная согласованность положительных результатов 0,77 х 0,72= 0,55

-случайная согласованность отрицательных результатов 0,09x0,13= 0,001

-обобщенная случайная вероятность согласованности результатов 0,55x0,001 =0,005

-наблюдаемая согласованность результатов без учета случайности 0,68-0,005=0,675

-неслучайная максимально возможная согласованность методов 1-0,005=0,995

К-критерий (каппа-статистика). 0,675/0,995=0,67

Значение каппа показывают:

-очень хорошая согласованность каппа 0,81-1,00,

-хорошая согласованность каппа 0,61 -0,80

-умеренная согласованность каппа 0,41-0,60

-слабая согласованность каппа 0,21-0,40

-очень слабая согласованность каппа 0,01-0,20

-незначимая согласованность каппа ^0 Определенная нами величина каппа 0,67 входит в интервал значений

0,61-0,80 и выражает параметр * хорошее* Следовательно, в нашем случае значение К-критерия, равное 0,67, свидетельствует о хорошей согласованности результатов двух тестов.

Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88% и специфичность 80%

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с использова-

нием вируса бешенства пггамм»СУ8», референс-препарата с известным содержанием вируснейтрализующих антител и протеин-А пероксидазного коньюгата для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Практические предложения

Для практического использования предлагаются:

Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2-9/00080, утверждена 22 02 Об. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» и утвержденная директором ВНИТИБП 01.2006г.

«Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Научно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня анти-рабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА».

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

«Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г)

Выводы

1 С использованием последовательного центрифугирования при 1 тыс-g и 50 тыс g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и онцентрированный вирус бешенства штамм «CVS» 97,4% чистоты по елку, инфекционностью на 1,2 IgLD jo/cm выше исходной и активностью в ФА 1:800

. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 поучен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, опре-еляемой в ИФА в титре 1.600.

. При введении животным очищенный вирус бешенства и ГП вызывал бразование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 181:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.

Иммунизацией баранов и собак инактивированным р-пропиолактоном 1.4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антира-ические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определен-ых в РН 1 16-1 64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в ка-гестве контрольных положительных сыворотох и референс-препаратов ля иммуноферментной тест-системы.

. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведе-ши 1.4000 и концентрации по ПХ - 240 мкг/0,1 мл может быть использо-ан в иммуноферментной тест-системы для количественного определе-ия антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак. . Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для ко-ичественного определения в сыворотках крови антитела к вирусу бешен-ва с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител, становлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность ест-системы непрямого ИФА с использованием в качестве антигена очи-енного вируса была выше (91% и 94%), в сравнении с использованием ликопротеина вируса (88% и 86% соответственно) Установлена пороговая величина ОП490 =0,620 о.е, по которой опреде-ен в сыворотках крови привитых кошек и собак уровень антирабических тател (менее 0,5 МЕ/мл).

Установлена согласованность (К=0,67) результатов, полученных при пределении уровня антирабических антител в сыворотках крови приви-it>ix против бешенства кошек и собак в разработанной иммуноферментной ¿ест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной

тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Клюкина В И, Гринь С А. Рахманин П.В., Востряков К В Современная эпизоотическая ситуация бешенства в республике Карелия. Материалы международной юбилейной научно-практической конференции поев. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России. Курск, 2006, - С 131-132

2. Клюкина В.И, Рахманин П.В.. Серологическое обнаружение антира-бических антител Материалы Международной научно-практической конференции к 100-летию рождения Я С.Коваленко «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных 16-17 мая 2006 г -Щелково-2007, - С 251.

3. Клюкина В.И, Гринь С.А., Рахманин П.В., Проничев А Б. Получение и изучение иммунохимических свойств компонентов вируса бешенства.. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г. -Щелково-2007, - С 95-99.

4. Рахманин П.В.,.Клюкина В.И, Проничев А Б, Востряков К.В.

Определение антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»,20-21 декабря, 2007г,-Щелково-2007, - С 99-103.

5 Клюкина В.И, Востряков К В., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Ситуация по бешенству в Ненецком Автономном округе Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2021 декабря 2007 г. - Щелково-2007, - С103-106 6. Рахманин П.В., Клюкина В.И, Проничев А.Б. Иммуноферментная тест-система определения уровня иммунитета у вакцинированных против бешенства кошек и собак. Ветеринария и кормление.№ 3, 2008,-С 12-14

Отпечатано в ООО «Мещера», г Щелково, М О , ул Свирская, д 8 а, зак N8 315, тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рахманин, Петр Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. БЕШЕНСТВО ЖИВОТНЫХ.

1.1.1. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ.

1.1.2. Эпидемиологическая ситуация бешенства (гидрофобии) в Российской Федерации.*;.

1.2. .ВОЗБУДИТЕЛЬ БЕШЕНСТВА.

1.2.1. ' Характеристика возбудителя.

1.2.2. 'Морфология и химический состав.

1.2.3. Устойчивость вируса.

1.2.4. Культивирование вируса.

1.3. ЭПИЗООТОЛОГИЯ.

1.4. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА.

1.4.1. Методы обнаружения антигенов вируса бешенства.

1.4.2. Методы выделения вируса бешенства.

1.4.3. -Методы обнаружения генома вируса.

1.4.4. Обнаружение антирабических антител.

1.5. ИММУНИТЕТ, МЕРЫ БОРЬБЫ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак"

- Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (собаки и кошки) [1,2,8,15,34].

В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев. Интенсивность распространения" бешенства домашних животных находится'в прямой зависимости от; численности безнадзорных собак и кошек [8,28,31,36,57,61].

В 2000-2005гг в Российской Федерации увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%. Бешенство среди различных видов животных регистрировалось в 2007 году на территории 49 субъектов РФ.

Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных [14,32].

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является фактором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции [15,119].

В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству, содержание в сыворотках крови привитых против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл, считается минимальным уровнем протективного антирабического иммунитета (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004) [120].

С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и содержание вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не менее 0,5МЕ/мл (Регламент Совета и Европейского парламента,2003). 44

Для определения антител в сыворотках крови к вирусу бешенства, ВОЗ рекомендует использовать реакцию нейтрализации in vivo РН на мышах и тесты in vitro на культуре клеток: тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN)[ 17,24,95,96,119,120].

Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Постановка РН на мышах трудоемка, длительна во времени (14-21 день), требует живого вируса и значительного количества мышей, что увеличивает • стоимость анализа.

В практике применяются традиционные методы определения антира-бических антител, такие как РНГА, РСК, РНИФ, РДП [24,26].

Для решения аналогичных задач предложены методы иммунофер-ментного анализа, основанные на использовании целого вируса бешенства, или и его оболочечного белка-гликопротеина (белок G), однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют количественно определять наличие антител против бешенства в сыворотках крови животных после вакцинации [3,10,26,35,45,66,79,113].

На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству, в качестве альтернативного, рекомендует метод непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотке крови привитых кошек и собак антител к вирусу бешенства [96].

К преимуществам непрямого ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса бешенства штамм «CVS», референс-сыворотки с известным содержанием вирус-нейтрализующих антител и возможность в короткие сроки (3-4ч) по количественному содержанию антител в сыворотках крови вакцинированных животных определить уровень антирабического иммунитета.

С учетом этого, разработка тест-системы непрямого ИФА для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак, является актуальной задачей для практической ветеринарии. 7 Цель и задачи исследования Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы, на основе непрямого иммуноферментного анализа, для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и его компонента-гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.

2. Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.

3. Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы.

4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.

5. Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток.

7 Научная новизна работы.

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Впервые в РФ разработана иммуноферментная /гест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства' штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.

Подобрана схема иммунизации продуцентов для получения антира-бической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.

Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства ко г Практическая значимость работы.

Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммунофермент-ная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий, позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител, и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.

Разработанная тест система может быть использована для определения антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак, при перевозе их через границу Российской Федерации. з Практические предложения

Для практического использования предлагаются: Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных» утверждена директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г).

Основные положения, выносимые на защиту.

Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.

Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной'тест-системе и РН в культуре клеток. :

Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.

Апробация работы и публикация результатов

Материалы исследований были доложены на заседаниях научного совета ГНУ ВНИТИБП. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария и кормление».

Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно. Практическую и консультативную помощь при исследовании сывороток крови кошек и собак в РН на культуре клеток оказал д.б.н., профессор Кузнецов Д.П., ведущий научный сотрудник ФГУ ВГНКИ к. б.н. Елаков A.JI.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ I. Бешенство животных.

Бешенство - особо опасная инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, к которой восприимчивы домашние и дикие животные, а также человек [2,5]. Бешенство, по оценкам ВОЗ, входит в пятерку зоонозов, наносящих наибольших социально-экономический ущерб и является постоянной угрозой для жизни человека и животных [15,17,89].

Бешенство распространено практически по всему миру, за исключением некоторых островных государств (Великобритания, Ирландия, Новая Зеландия, Япония) и Антарктиды. По данным экспертов'ВОЗ и МЭБ болезнь регистрируется более чем в 110 стран земного шара. Ежегодно погибает около 50 тысяч человек, из этого числа 35-45 тысяч (90%) приходится на Азиатский континент, в основном на Индию. Доля детской смертности составляет 30-50%, от числа заболевших [1,7,98].

В зависимости от резервуаров и особенностей течения, распространение t бешенства можно отнести к нескольким ареалам:

Полярный ареал, включающий РФ, Чукотку, Гренландию, Аляску, где в 60 - 90% случаев резервуаром вируса бешенства служат песцы.

Центральная и Западная Европа, азиатская часть РФ, США, Мексика входят в зону, характеризующуюся многочисленными носителями бешенства: куницы, красные лисы, барсук, волки, грызуны, скунсы, енотно-видная собака [75,117].

Южная и Центральная Америка, где резервуарами являются летучие мыши-вампиры [62,94,97].

Африканский ареал, где основными носителями вируса являются собаки, шакалы, мангусты.

Распространено бешенство, главным образом, среди плотоядных животных как диких, так и домашних.

Из всего многообразия животного мира только 4 отряда хладнокровных животных не подвержены этой инфекции, которая, помимо диких животных, поражает домашних и сельскохозяйственных животных, а также человека [25,36,48,50].

За период 2000-2005 гг. среди животных было отмечено более 82 тыс. случаев бешенства, подтвержденных лабораторным анализом; погибло свыше 30 млн человек и более 10 млн. человек получили различные повреждения от животных и более 5 млн. человек специфическое антираби-ческое лечение [15,22].

Несмотря на все усилия санитарных властей, случаи заболевания среди людей все еще регистрируются в районах, где дикие животные служат резервуаром вируса бешенства [29,34]. Спектр патогенности ВБ тесно связан с его экологией и имеются 2 формы эпизоотии Б: городская и лесная, при которой возбудитель циркулирует среди диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. Периодичность эпизоотии — характерная особенность Б, а сезонные подъемы заболеваемости Б среди животных тесно связаны с географией региона и биологическими циклами активности животных [75,90,121].

Лисицы обусловливают 60 - 85% от'всех случаев заболевания бешенством среди диких животных. Их роль в эпизоотологии бешенства объясняется чрезвычайной восприимчивостью к ВБ, увеличением популяции этих животных, а также возможностью перорального заражения[ 19,29,47].

Увеличению численности лисиц способствует истребление их естественных врагов - волков, рысей, медведей, орлов и других хищников, а также увеличение количества грызунов - основного источника корма для лисиц[69,70]. У 40-89% лисиц болезнь часто протекает хронически и латентно, обеспечивая длительную персистенцию вируса в естественных условиях^ 6,65].

Имеются сообщения о выделении возбудителя.Б от грызунов — белок, сурков, крыс, зайцев, ондатр, хомяков, мышей. Однако роль этих животных в экологии Б окончательно не установлена [29,47].

Несмотря на то, что эпизоотии Б поддерживаются, главным образом, дикими животными, человеку угрожают, прежде всего, собаки и кошки [5,8,34,48]. Собаки, летучие мыши, обезьяны, волки, енотовидные собаки, койоты, кошки составляют не более 5% от общего числа иммунизированных животных и существенно влияют на распространение Б [15,47,52,112,115].

Собаки среди прочих восприимчивых животных представляют собой группу наивысшего риска в виду их абсолютной преобладающей роли в реализации связей между природными и антропургическими экотипами бешенства за счет контактов с лисицами — в свою очередь преобладающими резервуарами и источниками инфекции.

В городских эпизоотиях бешенство у собак, как правило, заканчивается их гибелью, поэтому механизм поддержания вируса сводится к коротким циклам репродукции в организме и быстрой передаче восприимчивому организму [30,31,82].

В настоящее время наблюдается увеличение популяции собак, в том числе бездомных, которые служат звеном в цепи передачи инфекций во многих развивающих странах, продолжают также сохраняться среди диких животных очаги бешенства, даже в условиях ежегодной вакцинации^,30,81].

Кошки, среди прочих восприимчивых животных, представляют собой по значению вторую после собак и прогрессирующую группу риска. Кошки вовлекаются в экологические циклы инфекции лишь спорадически, не участвуют в циркуляции возбудителя, остаются его биологическими тупиками и обладают низким эпидемическим потенциалом[29].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рахманин, Петр Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. С использованием последовательного центрифугирования при 1 Tbic.g , 50 Tbic.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS», 97,4% чистоты по- белку, инфекционностью на 1,2 IgLD 5о/сМ выше исходной и активностью в ИФА 1:800.

2. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600.

3. При введении животным очищенный вирус бешенства и гликопротеин вызывали образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 -1:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.

4. Иммунизацией баранов и собак инактивированным (З-пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных, положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.

5. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000 и концентрации по ПХ - 240 мкг/ОДмл может быть использован в иммуноферментной тест-системе для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак.

6. Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Установлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность тест-системы непрямого ИФА с использованием в "качестве антигена очищенного вируса была выше ( 91% и 94%), в сравнении с использованием гликопротеина вируса (88% и 86% соответственно).

6. Установлена пороговое значение ОП490 =0,620 о.е., по которой определен в сыворотках крови привитых кошек и собак минимальный уровень антирабических антител (менее 0,5 МЕ/мл).

7. Установлена согласованность (К=0,67) результатов, полученных при определении уровня' антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в разработанной' иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.

6. Практические предложения

Для практического использования- предлагаются:

Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» и утвержденная директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в. сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рахманин, Петр Владимирович, Щёлково

1. Авилов В.М.,Седов В .А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства. //Ветеринария.-1998,№6,-С.З-б

2. Авилов В.М., Гусев А.А., Савин А.В. Эпизоотическое состояние и эффективность производимых мероприятий против бешенства в России. //Ветеринария., №6.,2002,-С.З-6.

3. Акиныпина Т.В. Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях. Автореферат дисс., Щелково, 2005, С.-25

4. Березин В.Э., Артамонов А.Ф.// Вопросы вирусологии-1985,-№ 5,-С.568-571

5. Бакулов И.А., Книзе А.В., Котляров В.М. и др. Система эпизоотологиче-ского мониторинга и особо опасных, экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных. Покров, ВНИИВВиМ, 2001,72С.

6. Белоусов В.И.; Бирюков А.Г.; Кузнецова С.В.; Клюкина В.И.; Кочиш ИМ. Флюоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови различных видов животных. Науч.основы технологии пром.пр-ва

7. Бешенство. Сюрин В.Н.,Самуйленко А.Я.,Соловьев Б.В.,Фомина Н.В. //Вирусные болезни животных.- МД998.-С.300-319

8. Березина Е.С. Особенности экологии собак.// Вет. консультант М.,2002,№5, -С.13-15

9. Бручнев К.Н.; Квасов И.Л.; Турсункулов Ш.Ж. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей,привитых ра-бическими вирус-антигенами. Вестник с.-х. .науки Казахстана, 1985; T.2I -С. 71-75.

10. Ботвинкин А.Д., Наволокин В.В. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ELISA в пробах крови, собранных на бумажные диски. Лаб. Дело,1988, №3, -С. 73-77

11. Волкова Р.А.; Рунова В.Ф.; Романова Л.Н.; Храпова И.С.; Эльберт Л.Б.; Мальдов Д.Г. Применение ракетного иммунозлектрофореза для определения гликопротеина в концентрированных антирабических вакцинах. Вопр.вирусологии, 1994; Т.39, N2 -С. 68-71 ,

12. Вишняков И.Ф., Недосеков В.В. ,Груздев К.Н. и др. Способ определения антирабических вируснейтрализующих антитиел.// Патент № 97116427, 1997г

13. Гринь С.А., Сазанова Э.Я.,Акиньшина Т.В. и др. Клеточный иммунитет при культуральной антирабической вакцинации. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2006, №2,-С 76-78.

14. Груздев Л.К., Дешевых А.Е., Груздев К.Н., Изучение репродукции фиксированного штамма вируса бешенства в культуре клеток. Вопр. Приклад. Экологии (природопользования), охотоведения и звероводства.-Киров,1997,-С. 285-286.

15. Государственный стандарт СССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81 ).-М. 1984.9с.

16. Дудников С.А., Кременчугская С.Р., Дудникова Е.К., Селютина И.Н. Получение гликопротеина GP-67 вируса бешенства. Проблемы инфек. па-тол, с-х животных.-Владимир,1997*.-С. 171-172

17. Дудников С.А. Лисы как маркеры при бешенстве. ч1-2., Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конфе-рен. Покров 2003.,-С 69-73

18. Идрисова Н.Т. Чувствительность некоторых культур клеток к вирусу бешенства. Бюл.ВИЭВ, 1991; Вып.75-76. -С. 119-121

19. Иванов B.C., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством. //Вестник РАСХН, 2000,№2,-С 63-65

20. КовалевА.Н.,ШашёнькоА.С.,Иммунофлюоресцентное исследование отпечатков роговицы глаза при бешенстве.//Ветеринария,1970,№9,-С.44-46.

21. Кунакаев Г.Г. Эпизоотическая обстановка по бешенству животных в

22. РБ. // Информ.бюл.МСХ и продовольствия Респ.Башкортостан,2000; N 11.-С. 26-27*

23. Кузнецова С.В. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита КРС). Авт. дис. док. биол. наук., ВИЭВ, 1991.

24. Кузнецова С.В.,Кузнецов П.П.,Иванов B.C. Субъединичная антираби-ческая вакцина.// Науч.основы технологии пром.пр-ва вет.биол.препаратов. -Щелково, 1996, -С. 54,

25. Литвинов О.Б., Яковлев С.С., Бессонов И.Е. и др. Информационный бюллютень «Бешенство».-М.2007

26. Макаров В.В. Бешенство, очерк мирового нозоареала и общие элементы контроля. /Ветеринарная патология. 2002,№1. -С. 13-20

27. Макаров В.В., Недосеков В.В.; Середа А.Д., Сошенко Л.П. Опыт серологического мониторинга популяции собак при бешенстве. Ветеринарная патология, 2002,№1,-С. 140-143

28. Макаров В.В., Джупина С.И., Ведерников В.А. и др. Бешенство животных разных видов в современных условиях-эпизоотологический образец и клиническая характеристика. Ветеринарная патология.-2002, №1.-С. 214-217

29. Макаров В.В.; Воробьев А.А. Актуальные проблемы бешенства: природная очаговость, методология исследований и контроля в центре России. Журн.микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 2005; N 1, С. 89-95

30. Мелимов М.А.; Татаров А.Т. Бешенство животных.// Ветеринария, 1984; № 12 . -С. 67-69

31. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом. Владимир, 1998г.

32. Мовсесянц А.А. Современные проблемы бешенства. //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конф. Покров 2003.,-С 26-31

33. Недосеков В .В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И.,Балышев В.М., Груздев К.Н Титрование антирабических антител с помощью теста фокусов флюоресценции. Ветеринария, 1998: №7,-С. 28-30

34. Пилявская Е.А. Изучение некоторых свойств антирабического имму-ноглобулина.Труды Томского НИИ вакцин и сывороток, 1983; Т. 7.-С. 103-109

35. Полюшкина Г.С. Изучение иммуномоделирующих свойств неотима при рабической инфекции.// Вирус.болезни с.-х.животных. -Владимира 1995 -С. 153,

36. Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Бойко А.А., Иванов B.C., Кузнецов П.П. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определения уровня антител. Ветеринария, 1991,Т 8,-С. 62-64

37. Селимов М.А.; Фодор И.И.; Грабко В.И. К проблеме генно-инженерной антирабической вакцины.//Генно-инженерные и синтетические вакцины. Пущино, 1990-С. 64-70

38. Селимов М.А.Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства. Вопросы вирусологии. Т 43., №5, 1998,—С. 196-198

39. Седов В.А.; Коромыслов Г.Ф.; Куликовский А.В. Семинар всемирной организации здравоохранения по борьбе с бешенством диких животных (Женева, июль 1990 г.), Вестн. с.-х. науки. М, 1991; № 4 -С. 172-173

40. Сологуб Т.В.,Никишин И.В.,Вишняков И.Ф и др.Совершенствование МФА для обнаружения антигена вируса бешенства. Вопр.вет.вирус.,микробиологии и эпизоотологии, 1992;Т.Ч.2;-С.260-261.

41. Тургенбаев А.а. Суюбаева Б.П. перспективы и практические аспекты применения гибридомной технологии на модели вируса бешенства.// Вестник с-х науки Казахстана, 1990,Т 3,-с 69-72

42. Черкасский Б.Л. Типологическая классификация природных очагов иструктура мирового ареала природного бешенства. Журн. микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 1984; № 9 -С. 16-21• / *

43. Чернов С.М. и др. Результаты использования прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки специфической активности антирабических вакцин. ЖМЭИ, «Медицина»,М 1991, №5-С. 30-33

44. Шафеева Р.С.,Фролова А.В. репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero. //Цитология, 1994/Г.36,№6,-С. 587-588

45. Шашенько А.С. Распределение вируса бешенства и прижизненное обнаружение его с помощью исследования отпечатков роговицы. Автореферат дис. кан. вет. наук. Минск. 1971, 21с.

46. Шестопалов A.M. Дисурина М.И.; Груздев К.Н. Бешенство и его распространение в мире. //Вопр. вирусологии, 2001; T.46,N 2, -С. 7-12

47. Информационный бюллетень по бешенству. //ФГУ «Центр ветеринарии»., Лаборатория эпизоотологии ВИЭВ, 20005г, 41с.

48. Хисматуллина Н.А.; Разработка средств и методов иммунологического мониторинга и мер борьбы при бешенстве и лихорадке Ку животных. Автореферат дис. доктора биол. наук. -Казань, 2000, -С.48

49. Хисматуллина Н.А.; Савицкая Т.А. и др., Прижизненая диагностика гиброфобии. Междунар.науч.практ.конф." Ветеринарные и медицинские91

50. Цыбанов Я.С. Разработка тест-системы для идентификации вируса арк- • тического бешенства на основе методов анализа генома: Автореферат дис. кан. биол. наук.-Покров, 2001. —24с.

51. Цвиль JI.А.,Родина JI.A. Эпидемическая ситуация и меры профилактики бешенства в г. Москве. Междунар.науч.практ.конф." Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Покров ,2003,4.1.-С 146-151.

52. Alvarez Peralta Е. Rabia transmitida рог vamphos,distribution,frecuencia е importancia // Tecn.pec.en Mexico, 1997; Vol.35,N 2\ -P. 93-104

53. Aubert M. F. A. Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs.//Rev. Sci. Tech. Off int. Epis ,1992, №11, -P 735-760

54. Arai Y.T.; YamadaK.; Kameoka Y.; Horimoto Т.; Yamamoto K.; Yabe S.; Nakayama M.; TashiroM. Nucleoprotein gene analysis of fixed and street rabies virus variants using RT-PCR //Arch.Virol., 1997; Vol. 142,N 9; -P. 17871796

55. Artois M:; Cliquet F.; Barrat J.; Schumacher C.L. Effectiveness of SAG1 oral vaccine for the long-term protection of red foxes (Vulpes vulpes) against rabies //Veter.Rec, 1997; Vol. 140,N 3 ,P. 57-59

56. Atanasiu P., Perrin P., Delegneau J. E., Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. // Proc. 3-d Gen. Meet. Eur. Soc. Anim. Cell Technol., 1979,-P 207-215

57. Albas A.; Pardo P.E.; Rinaldi P.L.F.; Tarumoto M.H. Avaliacao do metodo de contra-imunoeletroforese para titular soros de bovinos vacinados contra a raiva Veter.Zootecn., 1995; Vol.7, -P. 141-145

58. Artois M.; Charlton K.M.; Tolson N.D. Vaccinia recombinant virus expressing the rabies virus glycoprotein: safety and efficacy trials in Canadian

59. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА1. Щелково-2008г1. УТВЕРЖДАЮ:1. ВНЩИБП Я. Самуйленко2006г

60. Акт межлабораторных комиссионных испытаний метода определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА

61. Разработанная иммуноферментная тест-система пригодна для серологического мониторинга вакцинированных против бешенства кошек и собак.1. Заключение.

62. Комиссия рекомендует одобрить Ученым советом ВНИТИБП настоящий акт комиссионных испытаний и утвердить «Методические рекомендации по применению метода ИФА для

63. Председатель комиссии И,И.Кочиш /

64. Члены комиссии: Г.Л.Молчанова1. УфбГ П-В.Рахманинук),„^А-ЪЛРоничев

65. Акт рассмотрен на ученом совете ВНИТИБП, одобрен и рекомендован для утверждения директором института.

66. Протокол заседания ученого совета № /Г от 03. 2008г Ученый секретарь ^(^A&jT&ft Ю.Д.Фролов