Эпизоотологический мониторинг и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза

Чернов, Альберт Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Эпизоотологический мониторинг и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотологический мониторинг и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза"

На правах рукописи

ЧЕРНОВ АЛЬБЕРТ НИКОЛАЕВИЧ

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА, БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И БРУЦЕЛЛЕЗА

.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 г сен диз

Уфа-2013

005533030

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЩТБ-ВНИВИ», г. Казань)

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Иванов Аркадий Васильевич -доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН.

Андреева Альфия Васильевна -

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»;

Алимов Азат Миргасимович -

доктор ветеринарных наук, профессор, проректор по научной работе, заведующий кафедрой биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»;

Соколова Надежда Львовна -доктор биологических наук, заместитель директора по инновационной работе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко».

ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Защита диссертации состоится « 04 « октября 2013 года в \2Ш часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу: 450001, Россия, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34 (325/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайте университета: www.bsau.ru и Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru. п

Автореферат разослан ОЖШслчЛ 2013 года.

Ведущая организация:

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

М.Г. Гиниятуллин

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. По данным международных организаций МЭБ и ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется свыше 500 тыс. очагов инфекционных заболеваний, экономические потери от болезней животных составляют до 20% стоимости продукции в промышленно развитых странах и до 40% - в развивающихся. Несмотря на достигнутые успехи в профилактике инфекционных болезней, в том числе бешенства, болезни Ауески (БА) и бруцеллеза, эпизоотическая обстановка по данным инфекционным заболеваниям в Российской Федерации остается напряженной.

Последнее диктует необходимость разработки и внедрения в широкую практику эффективной научно обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств диагностики и специфической профилактики.

Большой вклад в изучение указанных инфекционных болезней внесли многие отечественные и зарубежные ученые (Сочнев В.В., 1987; Груздев К.Н. и др., 2000; Иванов A.B., Юсупов Р.Х. и др., 2000; Непоколонов Е.А., 2000; Хисматуллина H.A., 2000; Макаров В.В. и др., 2004; Сергеев В.А. и др., 2007; Гулюкин М.И. и др., 2008; Смирнов A.M., 2009; Донник И.М., 2009; Самуйленко А.Я., Федоров Ю.Н., Клюкина В.И., 2010; Beran G.W., Davies P.V., 1980; Lustofson D.P., 1986; Corbel M.J., 1997, Boschiroli M.L. e.a., 2001; Sauret I.M. e.a., 2002; Ts. Zakaria e.a., 2003; Ergonul O. e.a., 2004; Karabay O. e.a., 2004; Getinkaua Z. e.a., 2005; Alim A., Tomul Z.D., 2005).

В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди диких плотоядных, домашних и сельскохозяйственных животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом. Научно обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемические мероприятия, должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии этого зооноза, своевременном выявлении возбудителя бешенства и изучении его биологических свойств, а также контроле за иммунным состоянием животных, вакцинированных против бешенства (Авилов В.М. и соавт., 1998; Полюшкина Г.С. и соавт., 1998).

Среди инфекционных болезней домашних и диких свиней важное экономическое значение имеет болезнь Ауески (БА). Международный опыт показывает, что искоренение заболевания возможно при применении стратегии борьбы, включающую выявление инфицированных животных и их выбраковку, а также реализацию комплекса санитарно-эпидемиологических и других мер. Выявление инфицированных животных проводится с использованием маркированных вакцинных штаммов вируса БА и дискриминирующих тестов, позволяющих дифференцировать поствакцинальный и постинфекционный иммунитет (Моренков О.С., 2002; Komaromi М., 2005). При этом

дискриминирующие тесты основаны на использовании гликопротеинов или моноклональных антител, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований.

Бруцеллез представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки. В 90-е годы истекшего столетия резко обострилась эпизоотическая и эпидемическая ситуация по бруцеллезу в странах СНГ и России. Актуальными остаются вопросы профилактики и дифференциальной диагностики данного заболевания (Салмаков K.M. и др. 2010; Скляров О.Д., 2010 и др.).

1.2 Цель и задачи исследований. Цель исследований - анализ эпизоотический ситуации и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию в Российской Федерации по заболеваемости животных бешенством, болезнью Ауески и бруцеллезу, в том числе по рабической инфекции в Республике Татарстан (РТ);

2. Изучить иммунобиологические свойства эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Республики Татарстан, эффективность вакцинопрофилактики сельскохозяйственных животных против бешенства;

3. Разработать и внедрить высокоэффективные средства диагностики бешенства на основе МФА и ИФА;

4. Изучить чувствительность культур клеток к штаммам вируса болезни Ауески, эффективность вакцинопрофилактики в свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан;

5. Разработать диагностические наборы на основе штаммов «ВГНКИ» и делеционного по гликопротеину gE штамма «ВК» вируса болезни Ауески;

6. Изучить антигенные и иммуногенные свойства живых, гамма-инактивированных и гамма-инактивированных в сочетании с иммуномодулятором тиосульфатом натрия противобруцеллезных вакцин из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 и агглютиногенного штамма В. melitensis Рев-1;

7. Разработать и внедрить тест-систему для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В. abortus 82.

1.3 Научная новизна. Представлена эпизоотологическая характеристика по бешенству, болезни Ауески, бруцеллезу в РФ; проведен анализ распространения рабической инфекции на территории Республики Татарстан за 1970-2012 гг.; установлен уровень заболеваемости сельскохозяйственных, диких и домашних животных в разрезе муниципальных районов; разработаны

карты эпизоотологического районирования территории; изучена периодичность и сезонность проявления рабической инфекции; изучены некоторые биологические свойства изолятов вируса бешенства, выделенных на территории республики и установлено их антигенное сходство с вакцинным штаммом. Изучена чувствительность культур клеток к штаммам вируса болезни Ауески, эффективность вакцинопрофилактики в свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан. Впервые разработана технология изготовления эритроцитарного диагностикума на основе делеционного по гликопротеину ^ вируса болезни Ауески, обеспечивающий дифференцированное выявление поствакцинальных и постинфекционных антител при указанной инфекции. Изучены антигенные и иммуногенные свойства живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин, разработан метод оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл, усовершенствована система специфической профилактики и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота с применением живых вакцин из штаммов слабоагглютинногенного В.аЬоЛиэ 82 и инагглютинногенного В.аЬоЛш Л-1096.

Новизна полученных данных подтверждена Патентами РФ на изобретения: «Препарат против бешенства» (№2420309 от 10.06.2011 г.); «Способ оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов» (№2419096 от 20.05.2011 г.).

1.4 Теоретическая и практическая ценность работы заключается в том, что на основе проведенных научных исследований, разработаны и усовершенствованы средства эпизоотологического и иммунологического мониторинга бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза, которые зарегистрированы в РФ, внедрены и востребованы производством: «Флуоресцирующий антирабический глобулин»; «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)»; «Набор препаратов для определения в РИГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески»; «Набор препаратов для дифференциальной диагностики в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески маркированной вакциной из штамма «ВК»; «Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллёза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.аЬогШБ 82».

Разработаны и внедрены в производство 11 нормативных документов, в том числе методические указания по лабораторной диагностике бешенства, рекомендации по диагностике и профилактике бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза животных, утвержденных в установленном порядке.

Результаты исследований используются на курсах повышения квалификации по специальности ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и иммунология в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

1.5 Основные положения, выносимые на защиту:

- характеристика эпизоотической ситуации по бешенству, болезни Ауески и

бруцеллезу в РФ;

- характеристика эпизоотической ситуации по заболеваемости бешенством в Республике Татарстан за 1970-2012 гг. и биологические свойства эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории республики;

- разработка на основе МФА и ИФА усовершенствованных средств диагностики бешенства;

- характеристика чувствительности культур клеток к вирусу болезни Ауески;

- разработка диагностических наборов на основе штаммов «ВГНКИ» и делеционного по гликопротеину gE штамма «ВК» вируса болезни Ауески;

- характеристика антигенных и иммуногенных свойств живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин;

- разработка набора препаратов для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В. abortus 82.

1.6 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2012 гг.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы здоровья скота, завозимого в Россию в рамках национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса»» (Казань, 2008); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Международной научно-практической конференции «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино,

2008); Международной научно-практической конференции «Роль неправительственных научно-общественных организаций в решении проблем, связанных с разработкой и внедрением инновационных технологий» (Казань,

2009); Международной научно-практической конференции «Инновации РАН» (Казань, 2010); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней» (Екатеринбург, 2010); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность», посвященной 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ (Казань, 2010); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012); Научно-практической конференции «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2013).

1.7 Публикация результатов исследований. По теме диссертации

опубликовано 68 научных работ, в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получено два патента РФ, в которых отражены основные положения и выводы диссертации.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 318 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 398 источников, в том числе — 112 зарубежных авторов.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2006-2012 гг. в отделах биобезопасности и бионанотехнологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» Минсельхоза России в соответствии с тематическим планом НИР (№ госрегистрации 01200202602 и 01201150931). Общая схема исследований представлена в таблице 1.

В опытах использовали производственный штамм «Овечий» ГНКИ и стандартный - CVS и эпизоотический - «Соб 2580» вируса бешенства; вакцинный авирулентный штамм ВГНКИ вируса болезни Ауески (вирусвакцина ВГНКИ сухая культуральная против болезни Ауески производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов»); маркированный (делеционный по гликопротеину gE) штамм «ВК» вируса болезни Ауески, полученный из ВНИИЗЖ (г. Владимир); а также штаммы возбудителя бруцеллеза: В. abortus 82, В. melitensis Рев-1и B.abortus R-1096.

Экспериментальные исследования проведены на 2000 беспородных белых мышах, 6-7 г; 30 котятах; 60 белых крысах, 180-200 г; 20 кроликах, 1,5-2 кг; 6 баранах, породы «Прекос», 75 - 90 кг; 160 подсвинках, 20-100 кг и 100 морских свинках, 350-400 г.

В работе использовали перевиваемые линии культур клеток: невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1); почек эмбрионов свиней (СПЭВ); почек золотистого хомячка (ВНК-21), а также первичнотрипсинизированные клетки куриных фибробластов (ККФ).

В исследованиях применяли следующее оборудование: спектрофотометр СФ-16; сканирующий спектрофотометр «Titertek multiskan» (Швейцария); центрифуги (различные); холодильные установки; световой микроскоп (биолам); люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-И2, рН-метр; аналитические весы, вакуум - сушильная установка «Edwards», микроскоп биологический МБИ-3, микротитратор системы «Takachi», термостаты, водяную баню, пипетки 8-12 канальные автоматические «Flow laboratories».

Таблица 1 Общая схема исследований

Эпизоотологический мониторинг и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза

Эпизоотологический мониторинг

бешенства • Динамика эпизоотического процесса в РФ • Характеристика эпизоотического процесса в Федеральных • округах РФ и субъектах Приволжского Федерального округа РФ • Динамика эпизоотического процесса в РТ • Сезонность в РТ • Удельная заболеваемость в РТ • Эпизоотологическое районирование и картографирование

болезни Ауески • Динамика эпизоотического процесса в РФ

бруцеллеза • Динамика эпизоотического процесса бруцеллеза крупного рогатого скота в РФ • Динамика эпизоотического процесса бруцеллеза мелкого рогатого скота в РФ

Направления экспериментальных исследований

бешенства • Изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории РТ - Индекс инвазивности и продолжительность жизни белых мышей - Серологические свойства - Антигенное соответствие эпизоотических изолятов вакцинным штаммам - Серологический мониторинг эффективности вакцинопрофилактики • Изучение антирабического эффекта эндонуклеазы Serratia marcescens • Совершенствование системы противоэпизоотических мероприятий в РТ

болезни Ауески • Серологический мониторинг эффективности вакцинопрофилактики

бруцеллеза • Изучение антигенных и иммуногенных свойств живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин на морских свинках - Активность сывороток крови животных, ммунизированных однократно различными противобруцеллезными вакцинами, в РА, РСК с R- и S- антигенами в динамике иммуногенеза - Иммуногенные свойства различных противобруцеллезных вакцин после первичной иммунизации

продолжение таблицы 1

бруцеллеза - Активность сывороток крови животных, ревакцинированных различными противобруцеллезными вакцинами, в РА, РСК с К- и Б- антигенами в динамике иммуногенеза - Иммуногенные свойства различных противобруцеллезных вакцин после ревакцинации • Разработка метода оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов по уровню цитокинов

Разработка средств диагностики

бешенства на основе МФА и ИФА • Соответствие качества производственного фиксированного штамма «Овечий» ГНКИ вируса бешенства требованиям СТО 00492374-003-2008 • Активность антирабической сыворотки крови овец, иммунизированных вирусом бешенства в сочетании с различными иммуномодуляторами • Активность антирабического флуоресцирующего глобулина • Активность антирабического пероксидазного конъюгата

болезни Ауески на основе РНГА • Оценка чувствительности различных культур клеток к возбудителю болезни Ауески, штаммы «ВК» и «ВГНКИ», в динамике инфекционного процесса • Активность эритроцитарных препаратов при различных условиях сенсибилизации эритроцитов • Активность и специфичность эритроцитарных диагностикумов на основе штаммов «ВГНКИ» и «ВК» вируса болезни Ауески

бруцеллеза на основе РСК • Разработка препаратов для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В. abortus 82

Метод флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), реакцию связывания комплимента (РСК) ставили в соответствии с инструкциями по применению соответствующих диагностических наборов, разработанных в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и утвержденных в установленном порядке.

Реакцию нейтрализации (РН) проводили по P.Atanasiu (1975) на белых беспородных мышах, 14-16 г, с использованием вируса бешенства, штамм CVS, в дозах от 30 до 300 LDJO/0,03 мл.

Для получения и очистки антигена использовали метод накопления вирусного материала путем интрацеребрального введения белым мышам 10% вируссодержащей суспензии. Для получения культурального вируса бешенства, штамм «Овечий» ГИКИ, проводили заражение культуры клеток НГУК-1 путем

внесения 10%-ной вируссодержащей суспензии мозга белых мышей в суспензию клеточной культуры в концентрации 5x105 кл/мл в соотношении 1:1. Освобождение вирусного материала от клеточного баласта проводили по методу Н.А. Хисматуллиной, Р.Х. Юсупова (1988), с последующей очисткой и фракционированием в линейном градиенте плотности сахарозы (15-50%) - по В. Dietzschold (1996).

Степень очистки рабического вируса и его белковых фракций изучали методом диск-электрофореза в 12,5%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по U.K. Laemmle (1970) и В. Dietzschold (1996). Контролем служил набор белков стандартной молекулярной массы (94.0, 67.0, 43.0, 30.0, 20.1, 14.4 кД). Специфичность белковых фракций определяли иммуноблоттингом по H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon (1979).

При выращивании вируса болезни Ауески, монослой культур клеток в стационарных условиях заражали вирусом БА, штаммы «ВК» и «ВГНКИ», в разведении 1:30 к исходному объему кулыуральной среды в титре 7,75 Ig ТЦД50/см5. Инфекционную активность вируса оценивали по методу Рида и Менча (1938) и выражали в культуральных инфекционных дозах lg ТЦД50/см3.

Очистку и концентрирование вируса болезни Ауески, штаммы «ВК» и «ВГНКИ», выращенных на культуре клеток НГУК-1, проводили согласно общепринятой схеме очистки герпесвирусов.

Реакцию вируснейтрализации (РВН) ставили по общепринятой методике на культуре клеток НГУК-1 при постоянной дозе вируса болезни Ауески, равной 100 ТЦД30/ см3.

Для решения отдельных вопросов краевой эпизоотологии бешенства (распространение, эпизоотичность, сезонность, источник и факторы передачи возбудителя инфекции, математическая обработка материалов) применяли различные приемы и способы, описанные в «Рекомендациях по методике эпизоотологического исследования», под редакцией И.А. Бакулова (1975).

Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2000. Все опыты ставили с числом повторности (не менее пяти), обеспечивающих получение достоверных результатов.

При выполнении отдельных этапов работ принимали участие зав. лабораторией иммунологии, профессор Хисматуллина Н.А., зав. лабораторией культуры клеток, д-р ветеринар, наук Плотникова Э.М., ведущий научный сотрудник лаборатории по изучению бруцеллеза, профессор Фомин А.М., за что выражаю им искреннюю признательность.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации и совершенствование мер борьбы с бешенством в Российской Федерации и

Республике Татарстан 3.1.1 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации в Российской Федерации по бешенству

В Российской Федерации сохраняется сложная эпизоотическая обстановка по заболеванию животных бешенством и высок риск заболевания людей. За 2005-2012 гг. заболевание животных бешенством в России регистрировалось у 31525 животных, при этом количество случаев заболевания было различным, от минимального в 2006 г. - 1506 случаев, до максимального - в 2007 г. - 5502.

Удельная заболеваемость животных бешенством составила у диких - 49,5%, домашних - 31,1% и сельскохозяйственных -19,4%.

За период 2005-2012 гг. наиболее сложная эпизоотическая обстановка по бешенству была в 2007 г., когда рабическая инфекция охватила территории 61 субъекта РФ с общим количеством заболевших животных 5502 головы. Следует отметить, что в 2007 г. зарегистрировано 8 случаев гидрофобии - в Ростовской, Мурманской, Саратовской, Курской, Воронежской (2) областях, в Удмуртии и Чечне. Источниками заражения людей были собаки (3 случая), кошки (2), лисицы (2) и енотовидная собака.

В Российской Федерации количество случаев заболевания животных регистрируется во всех Федеральных округах. Наибольшее количество выявленных эпизоотических очагов и число заболеваний бешенством животных, как и в прежние годы, регистрируется на территории субъектов Центрального, Приволжского, Уральского, Южного и Сибирского Федеральных округов РФ. На субъекты Центрального, Приволжского и Уральского Федеральных округов приходится 77% от всех зарегистрированных случаев бешенства животных по стране и 76% от выявленных эпизоотических очагов. В Приволжском Федеральном округе бешенство регистрируется на территории всех субъектов.

На протяжении последних лет, с 2008 года, в общей заболеваемости бешенством животных отмечается снижение удельного веса сельскохозяйственных животных до 12,7% в 2011 году, в то время как удельный вес заболевших бешенством собак и кошек увеличился до 33%. Практически повсеместно на территории населенных пунктов страны не снижается численность безнадзорных собак и кошек, беспрепятственное размножение которых приводит к распространению бешенства в их популяции.

В 2011 г. в РФ зарегистрировано 14 случаев гидрофобии, в том числе в Тверской и Астраханской областях - по 3 случая; в г. Москва - 2 случая; в Республике Калмыкия, Ставропольском, Краснодарском и Хабаровском краях, Московской и Оренбургской областях - по 1 случаю. Источниками заражения в

6-ти случаях явились дикие животные, лисицы и енотовидные собаки - по 2, волк и дикий кабан - по 1, в 5 случаях - безнадзорные собаки, в 2-х случаях -безнадзорные кошки в 1-ом случае - домашняя собака.

По данным Роспотребнадзора, решения и рекомендации, направленные на борьбу с бешенством, не выполняются в полном объеме. Финансовые средства, выделяемые органами исполнительной власти и местного самоуправления на обустройство площадок для выгула домашних животных; строительство приютов для временного содержания домашних и безнадзорных животных, в том числе животных с подозрением на заболевание бешенством, не достаточны; не налажен учет всего поголовья домашних животных; не все домашние животные получают профилактические прививки против бешенства. Не эффективна работа бригад по отлову безнадзорных животных. Недостаточным остается охват вакцинацией сельскохозяйственных животных. На этом фоне число лиц, получающих различные повреждения от животных, в последние годы составляет более 425 тыс. человек, из них более ста тысяч это дети в возрасте до 14 лет. Показатель обращаемости за антирабической помощью в среднем по стране составляет 300,0 на 100 тыс. населения. Ежегодно более 250 тыс. человек подвергаются риску заражения вирусом бешенства и нуждаются в проведении им специфического лечения с использованием антирабической вакцины, в то же время около 40 тыс. человек должны получать дополнительно антирабический иммуноглобулин.

Следует отметить, что на основании проведенного анализа основным источником и распространителем бешенства в России продолжают оставаться лисицы, на долю которых среди заболевших диких животных приходится 81,0%. Однако нельзя не учитывать эпизоотологическое и эпидемиологическое значение бешенства енотовидных собак и волков, заболеваемость среди которых, по-видимому, была связана с ростом их численности. Однако, несмотря на снижение числа заболевших животных, сохраняется высокий уровень заболеваемости, а также отмечается распространение эпизоотии на территории ранее свободные от бешенства. Полученные данные свидетельствуют о том, что резервуаром инфекции на всей территории России являются дикие плотоядные животные и эпизоотию бешенства следует отнести к природному типу. Активные природные очаги приводят к вовлечению в эпизоотический процесс домашних и сельскохозяйственных животных.

Таким образом, результаты проведенного анализа доступной оперативной и официальной статистической информации свидетельствуют о сложной и очень опасной эпизоотической и эпидемиологической обстановке в РФ.

3.1.2 Характеристика эпизоотической ситуации, заболеваемость и территориальная приуроченность по бешенству в Республике Татарстан

В Республике Татарстан за 1970-2012 гг. зарегистрировано 3616 случаев заболевания животных бешенством в 2871 неблагополучном пункте.

В эпизоотии бешенства наблюдается тесная взаимосвязь между количеством заболевших бешенством и неблагополучных пунктов. Так, за указанный период очаговая инцидентность составила 1,3: бешенством заболело - 1284 (35,5%) сельскохозяйственных, 611 (16,9%) - домашних и 1721 (47,6%) -диких животных.

Анализ двух десятилетних периодов - 1993-2002 гг. и 2003-2012 гг., свидетельствует о подъеме заболеваемости в 3,4 раза. При этом количество случаев бешенства у сельскохозяйственных животных возросло в 2,2, домашних - 4,1, у диких - 4,4 раза.

Анализ динамики и статистические данные по заболеваемости животных бешенством в РТ за 1970-2012 гг. указывают на закономерное проявление эпизоотии, характеризующееся 3-5 летней периодичностью. Закономерность заболеваемости животных бешенством, проявляется и в отношении отдельных видов как сельскохозяйственных и диких, так и домашних животных, при этом увеличение заболеваемости среди лис сопровождается подъемом заболеваемости у собак и кошек (рисунок 1).

Установлено, что в годы подъема заболеваемости животных бешенством в целом, постоянно отмечается значительное повышение заболеваемости среди диких животных. Например, в 1976 г. диких животных заболело 11,5 раза больше по сравнению с 1975 годом. Такой рост заболеваемости среди диких животных, главным образом лисиц, совпал с подъемом эпизоотии среди крупного и мелкого рогатого скота. Кроме того, анализ данных показал, что увеличение заболеваемости среди лис сопровождалось подъемом заболеваемости в 2-10 раз у собак и кошек.

400

-•-всего случаев бешенства -•*» домашние животные

годы

-^сельскохозяйственные животные дикие животные

Рисунок 1 Динамика заболеваемости животных бешенством в Республике Татарстан за 1970 - 2012 гг.

Анализ данных по заболеваемости среди животных бешенством показал, что в РТ имеют место сезонные колебания проявления бешенства у животных. Заболеваемость в разные сезоны года может изменяться и в зависимости от вида заболевших животных. За 2009-2012 гг. максимальное количество больных бешенством животных регистрировалось в осенние месяцы — 37,2%, зимние - 29,6%, весенние - 20,5%, в летние месяцы количество случаев заболевания было минимально и составило 12,8%.

За 2000-2012 гг. бешенство у животных установлено в 2505 случаях, из них 661 случай - у сельскохозяйственных животных, в том числе 602 - у крупного рогатого скота, что составило 91,1% от общего количества заболевших с.-х. животных. У мелкого рогатого скота зарегистрировано 35 случаев (5,3%); лошадей - 23 (3,5%); свиней - 1 (0,1%); домашних животных - 483 случая, в том числе у 244 собак (50,5%) и 239 кошек (49,5%). У диких животных бешенство отмечалось в 1361 случае, в том числе у лисиц - 1331 (97,8%) и 30 (2,2%) -других диких животных. При этом удельная заболеваемость у сельскохозяйственных животных составила 26,4%, домашних - 19,3% и диких -54,3%. Наибольшее количество случаев заболевания бешенством за указанный период установлено у лисиц - 53,1%, далее - у крупного рогатого скота -24,0%, собак - 9,7%, кошек - 9,5%, мелкого рогатого скота - 1,4%, лошадей -0,9%, свиней - 0,1%. На долю других диких животных приходится 1,2%.

Основным источником и распространителем бешенства в республике являются лисицы.

В системе противоэпизоотических мероприятий Управлением по охране и использованию объектов животного мира РТ проводится регулирование численности дикой фауны и отстрелу безнадзорных собак и кошек в лесных угодьях. Анализ данных по численности лисиц в районах РТ за 2008-2010 гг. показал, что плотность популяции лисиц варьировала в различных районах от 0,02 до 0,32 особей и в среднем по РТ 0,1-0,2 гол/км2.

По данным территориального управления Роспотребнадзора, по РТ ежегодно регистрируют 13-15 тыс. случаев обращения людей из-за укусов, наносимых животными. Более половины всех обращений регистрируются в 4 городах - Казань, Набережные Челны, Альметьевск и Нижнекамск.

Особо напряженная эпизоотическая ситуация по бешенству складывается в г.Казани. Число зарегистрированных укусов и других повреждений, нанесенных населению животными, на протяжении ряда лет находится на высоком уровне, ежегодно регистрируется до 4000 случаев укусов и других повреждений от животных, 60% из которых нанесены населению дикими, неизвестными и бродячими животными.

Для оценки степени риска, прогноза возникновения бешенства, проведен анализ территориальной приуроченности за 2007-2012 гг.

На основе полученных данных разработана эпизоотическая карта териториальной приуроченности заболевания животных бешенством в РТ за 2007- 2012 гг., в которой муниципальные районы РТ по уровню заболеваемости

■ ■ ■ ' ' ' ' ,. ' : .. : : '

:'.' "■:.:'. ..... . , . . . ..... .........1 ■ •

ц , . . , ... . ( V .

: К... ...... ' ' : :

.....

.. ' > - с

° ' . О

- - о - ■ С)

( ) ( ) • ■ ■ . О -а - ч ' ■ '

:,Ч • Ч/ ^■ О . , , '

/-Ч : о '. - о Л- '

, . ... . О —

■ ■ ^П. """' _......:,чч/:;Ч- ■ ~ ; ■ ^ а;.;ч;„

. - ..... ; .....ч . , ,. ..

Рисунок 2 Эпизоотическая карта територнальной приуроченности заболевания животных бешенством в Республике

Татарстан за 2007 - 2012 гг.

Примечание: ЩЦ - районы I группы — наивысший уровень заболеваемости, от 3,1 н выше случаев заболевания на 1000 кв. км.;

- районы 2 группы — высокая степень заболеваемости от 2,1 до 3%.

- районы 3 труппы - средняя степень заболеваемости от 1.1 до СНУ - районы 4 группы — низкая степень заболеваемости от 0Л до 1%.

животных бешенством разделены на 4 условные группы (рисунок 2).

Первая группа - наивысшей уровень заболеваемости бешенством, от 3,1% и выше случаев заболевания на 1000 кв. км (Азнакаевский, Балтасинский, Бугульминский, К.-Устьинский, Лениногорский, Сабинский, Спасский, Тукаевский, Тюлячинский, Чистопольский и Ютазинский);

Вторая группа - высокой уровень заболеваемости от 2,1 до 3% (Аксубаев-ский, Алексеевский, Алькеевский, Апастовский, Бавлинский, Высокогорский, Мензелинский, Муслюмовский, Пестречинский и Тетюшский);

Третья группа - средней уровень заболеваемости от 1,1 до 2% (Актаныш-ский, Альметьевский, Арский, Атнинский, Верхнеуслонский, Елабужский, Заинский, Кайбицкий, Кукморский, Лаишевский, Нижнекамский, Р.-Слободский и Сармановский);

Четвертая группа - низкий уровень заболеваемости от 0,1 до 1% (Агрыз-ский, Буинский, Дрожжановский, Зеленодольский, Мамадышский, Менделеевский, Новошешминский, Нурлатский и Черемшанский).

В целях улучшения эпизоотической ситуации по бешенству в 2007 г. и 2008 г., а также 2011-12 гг. в районах республики была проведена пероральная иммунизация диких плотоядных животных путем раскладки антирабической вакцины вручную, соответственно, 70 тыс., 360 тыс., 600,1 тыс. и 900 тыс. доз приманок, заправленных антирабической вакциной «Рабивак-О/333» и «Оралрабивак».

3.1.3 Изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Республики Татарстан

Для идентификации и изучения биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства проведено исследование 239 проб патологического материала от различных видов животных из неблагополучных районов РТ (Лаишевский, Сабинский, Арский, Кукморский, Мамадышский и др.).

Патологический материал от различных видов животных исследовали методом ИФА и МФА, а также биопробой на белых мышах и в культуре клеток НГУК-1. Из 239 исследований выявлено 80 положительных проб патологического материала биопробой на белых мышах, а также в культуре клеток НГУК-1. С помощью ИФА положительные результаты получены в 78 случаях (97,5%), МФА - в 74 случаях (92,5%). Эти данные убедительно показывают на необходимость подтверждения предварительного диагноза, поставленного на основании клинико-эпизоотологических показателей комплексными лабораторными исследованиями. Необходимо отметить, что уличный рабический вирус в культуре клеток НГУК-1 выделялся в более ранние сроки (24-72 ч), чем при интрацеребральной инокуляции мышей (до 30 суток). Цитопатическое действие изучаемых штаммов не обнаружено. Антиген вируса бешенства по МФА выявлялся в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 16

15-20 мкм в диаметре. В контроле, где клетки НГУК-1 инкубировали с мозговой взвесью от клинически здоровых животных, при окрашивании их флюоресцирующим антирабическим глобулином, специфических гранул не обнаруживали.

Метод ИФА также является высокочувствительным методом диагностики бешенства, и на заранее сенсибилизированном иммуноглобулином планшете результат был получен спустя 3-4 ч после внесения исследуемого антигена. При этом специфический антиген вируса бешенства выявляется в титрах от 1:10 до 1:320 при Ken равным 2,1 и более. Метод ИФА позволяет выявлять рабический антиген в разложившемся и хранившемся в глицерине патматериале, то есть в тех случаях, когда МФА и РДП не могут быть использованы.

На следующем этапе экспериментов изучали патогенные свойства эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих в регионе. Экспериментальным заражением была установлена патогенность изучаемых изолятов для лабораторных животных - белых мышей, морских свинок и кроликов. Эпизоотические изоляты вызывали заболевание белых мышей с летальным исходом при интрацеребральном и подкожном способах заражения. Специфичность клинических проявлений бешенства у животных была подтверждена методом ИФА и МФА.

Установлено, что выделенные изоляты вируса бешенства из неблагополучных районов РТ имеют ярко выраженные преципитирующие свойства, с активностью в реакции РДП и РДСК 1:2 - 1:8, при этом активность вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, в РДП составляла 1:8.

Продолжительность видимых проявлений болезни, обычно составляла менее суток. Изучение степени патогенности проведено с изолятами вируса бешенства, выделенных на территории РТ. В результате исследований установлено различие эпизоотических штаммов рабического вируса по степени патогенности для лабораторных животных. Индекс инвазивности варьировал от 0,9 до 2,4. При этом инкубационный период уличных изолятов вируса бешенства варьировал в среднем от 12 до 27 суток (таблица 2).

Следовательно, в РТ циркулируют как высоко-, так и слабопатогенные изоляты вируса бешенства.

Необходимо отметить, что эпизоотические изоляты вируса бешенства в серологических реакциях давали положительную реакцию с сывороткой, полученной на вакцинный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства, что указывает на их антигенное родство.

В дальнейших исследованиях вакцинировали котят 3-месячного возраста (30 голов) антирабической инакгивированной культуральной вакциной из штамма «Щелково-51» согласно Наставлению по ее применению. Через 14 сут после 2-го введения вакцины животных подвергали контрольному заражению эпизоотическими изолятами рабического вируса - эксп. 4848, 1582, 4090, 2155 и 3524 и наблюдали в течение 45 суток. По истечении срока наблюдения вакцинированные животные оставались здоровыми после заражения, а

контрольные (не иммунизированные) - заболевали и погибали.' Полученные результаты указывают на антигенное соответствие циркулирующих в РТ эпизоотических изолятов вируса бешенства вакцинным штаммам «Овечий» ГНКИ и «Щелково-51», что имеет определенное значение при проведении противоэпизоотических мероприятий (диагностика, профилактика).

Таблица 2 Индекс инвазивности и продолжительность жизни белых мышей после заражения в мозг изолятами вируса бешенства, циркулирующими в Татарстане (2-ой пассаж)

Источник выделения вируса, мозг, № экспертизы Индекс инвазивности Титр вируса, lg ДЦ 5 0/мл Продолжительность

и/ц п/к инкубационного периода, сут.

Лиса, эксп. 4848 0,9 4,5 3,6 14... 17

Лиса, эксп. 1582 1,7 3,7 2,0 17...20

Лиса, эксп. 4090 2,3 4,5 2,2 20...25

Собака, эксп. 2155 1,5 4,0 2,5 12...15

КРС, эксп. 3524 2,4 4,2 1,8 16...26

КРС, эксп. 810 1,5 3,8 2,3 15...23

Лиса, эксп. 4167 1,1 4,3 3,2 17...25

Лиса. эксп. 3168 1.6 3,4 1.8 14...21

Лиса, эксп. 2461 1,5 3,6 2,1 18...27

Примечание: «и/ц» - интрацеребрально; «п/к» - подкожно

3.1.4 Разработка и усовершенствование высокоэффективных средств диагностики бешенства на основе МФА и ИФА

Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки крови овец и проведен анализ ее диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов. Для иммунизации овец использовали штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства.

Перед началом экспериментов проводили контроль качества штамма «Овечий» ГНКИ вируса бешенства на соответствие требованиям СТО 00492374-003-2008 по следующим показателям: внешний вид, наличие посторонних примесей, плесени, трещин флаконов, контаминации бактериальной, грибной микрофлорой, микоплазмами, инфекционная активность и антигенная специфичность. В результате исследований установлено, что производственный фиксированный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства 8-го пассажа от 5.11.2008 г. (Master seed) соответствует требованиям СТО 00492374-003-2008, что позволило нам применить его в дальнейших экспериментах. Для иммунизации овец использовали очищенный и концентрированный антиген вируса бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, в виде суспензии мозга зараженных овец.

Иммунизирующий антиген вируса бешенства соединяли с масляным

адъювантом, в состав которого входила кремнеорганическая жидкость -полиэтилсилоксан (ПЭС-3). В качестве контроля использовали неполный адъювант Фрейнда (НАФ).

Активность специфических антител определяли в РДСК, ИФА и РН. В результате исследований установлено, что наиболее выраженная стимуляция антителогенеза происходит при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с масляным адъювантом и ПЭС-3. При этом уровень комплементсвязывающих и вируснейтрализующих антител в 4 раза превосходит таковой при иммунизации овец вирусом бешенства в сочетании с НАФ.

Из активной антирабической сыворотки крови овец выделяли глобулиновую фракцию путем двукратного осаждения 50%-ным раствором сульфата аммония. Для сравнения диагностической ценности антирабических глобулинов из сывороток крови овец, иммунизированных с применением различных иммуномодуляторов, были приготовлены флуоресцирующий антирабический глобулин (ФАГ) и антирабический пероксидазный конъюгат.

При этом была установлена прямая зависимость красящего титра ФАГ от титра комплементсвязывающих антител в исходных антирабических глобулинах, чем выше активность антирабического глобулина, тем выше красящий титр ФАГ. Максимальный красящий титр был характерен для конъюгата, изготовленного на основе сыворотки крови овец, полученной при иммунизации с использованием масляного адъюванта с ПЭС-3 и составил от 1:16 до 1:64, минимальный - с использованием НАФ - от 1:8 до 1:16, что повышало чувствительность метода ИФ. При окрашивании контрольных положительных препаратов самым активным конъюгатом отмечена более выраженная флуоресценция (++++) с характерным, ярким, сверкающим жёлто-зелёным свечением антигена вируса бешенства по сравнению с ФАГ, активность которого была ниже и составила от 1:8 до 1:16 (+++), при отсутствии свечения в отрицательных контролях.

На следующем этапе сравнивали активность пероксидазных конъюгатов, приготовленных из антирабических глобулинов с различной активностью. В результате была установлена прямая зависимость активности конъюгатов от комплементсвязывающей активности антирабического глобулина. Так, активность пероксидазного конъюгата, изготовленного на основе антирабического глобулина с активностью в РДСК 1:160 составила 1:400, а с активностью 1:640 - 1:1600. Эффективность антирабических ПХ КГ оценивали при идентификации 10 эпизоотических изолятов вируса бешенства, положительных по биопробе. В результате исследований установлена прямая зависимость уровня титров антигена вируса бешенства от активности конъюгата. Так, титры антигена ВБ в ИФА, с использованием пероксидазного конъюгата, активность которого составляла 1:1600 в 4 раза превышали таковые при использовании конъюгата, активность которого составляла 1:400, что свидетельствует о повышении чувствительности метода ИФА.

В следующей серии экспериментов определили чувствительность метода ИФА и МФА с применением ФАГ и пероксидазного конъюгата, определяя титр вируса в динамике инфекционного процесса. Эксперименты показали, что порог чувствительности метода ИФА и МФА с применением конъюгатов на основе масляного адъюванта и ПЭС-3 повысился с 3,4 Ig 1ЛЭ50/мл до 3,3 lg ЬО50/мл и с 3,9 lg 1ЛЭ50/мл до 3,8 lg LD ,/мл, соответственно.

Результаты исследований вошли в нормативные документы: «Флуоресцирующий антирабический глобулин» и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)», утвержденные Россельхознадзором 03.03.2008 г.

3.1.5 Определение антирабического эффекта эндонуклеазы

Как известно, эндонуклеаза Serratia marcescens ингибирует размножение ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов (Панфилова З.И., Салганик Р.И., 1983; Агтикин Ю.С. и др., 1998). В этой связи представляло интерес изучение антирабической активности эндонуклеазы Serratia marcescens.

Для определения антирабической активности использовали эндонуклеазу Serratia marcescens, которая была получена в Казанском (Приволжском) Федеральном университете. Антирабический эффект эндонуклеазы в физиологическом растворе анализировали, предварительно инфицируя животных внутримышечно вирусом бешенства (ВБ), штамм «Соб-2580» и производственным ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в дозах 4 LDJ(>/0,1 мл и 6 LDJO/0,l мл, соответственно.

Эндонуклеазу вводили внутримышечно в место инфицирования через 2 часа. При этом фермент не проявил защитного действия. Смертность животных до и после применения эндонуклеазы была на одном и том- же уровне, независимо от штамма вируса.

В связи с тем, что по данным И.Б. Лещинской и соавт.(1974), эндонуклеаза -это фермент, активируемый катионами магния, в последующих экспериментах к раствору эндонуклеазы добавили Mg2+ в виде соли MgS04, а также «Гемодез-Н» один из компонентов которого способствует прохождению веществ через цитоплазматичёские мембраны (Robinson B.V., 1990). В предварительных экспериментах были подобраны концентрации растворов MgS04 и «Гемодез-Н», не вызывающие изменения жизнеспособности мышей.

Изучение зависимости токсического эффекта Mg S04x7H20 и «Гемодез-Н» от их концентраций при интрацеребральном введении белым мышам установлено, что магния сульфат 7-водный в концентрации 2-25 весовых %, что соответствует 200-80 ммоль/л, а также 100%-ный «Гемодез-Н» вызывали снижение жизнеспособности мышей, а в концентрациях 0,125 - 1% (5-40 ммоль/л) магния сульфата 7-водного и 45-50% «Гемодез-Н» не оказывали влияния на жизнеспособность животных при их внутримышечном или интрацеребральном введении, следовательно, эти концентрации растворов не

токсичны и были использованы нами для инъекции.

Отдельно взятые препараты и введенные внутримышечно инфицированным животным не оказывали антирабического эффекта. Установлено, что одноразовое введение эндонуклеазы в дозе 0,8 мг на кг веса животного (с активностью не менее 248x103 Ед/мл) в комплексе с 45-50%-ным «Гемодез-Н» и 0,125-1,0%-ным сульфатом магния 7-водного обеспечивает 31% - ную защиту животных от бешенства.

При исследовании зависимости защитного антирабического эффекта комбинированного препарата от способа его введения, защитное действие было установлено лишь при его введении в место заражения. При других способах введения защитный антирабический эффект препарата отсутствовал.

Таким образом, установлен защитный антирабический эффект эндонуклеазы с активностью не менее 248x103 Ед/мл (доза 0,8 мг/кг) в комбинации с катионами магния и «Гемадез-Н» (2:1:1) при однократном введении в место инфицирования через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.

Новизна полученных данных подтверждена Патентом РФ на изобретение: «Препарат против бешенства» (№2420309 от 10.06.2011 г.).

3.1.6 Серологический контроль эффективности вакцино-ирофилактики бешенства крупного рогатого скота

Для контроля и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства в РТ проведены исследования 301 пробы сывороток крови крупного рогатого скота (КРС), через 20 сут, 3, 3,5, 4, 5 и 12 месяцев, вакцинированного антирабической вакциной «Рабиков» из штамма «Щелково-51», изготовленной Щелковской биофабрикой.

Исследования по оценке эффективности вакцинопрофилактики бешенства проводили с использованием «Набора препаратов для выявления антирабичес ких антител методом иммуноферментного анализа (ИФА)», разработанного в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Анализ сывороток крови проводили согласно «Инструкции по применению набора препаратов для выявления антирабических антител методом иммуноферментного анализа (ИФА)», утвержденной в установленном порядке. Критерием оценки служили следующие показатели: иммунитет, обеспечивающий защиту животных от бешенства, считался сформированным при наличии в сыворотках крови КРС титров антител в ИФА 1:100 и выше. В качестве контрольной положительной сыворотки использовали отраслевую сыворотку ВГНКИ с титром антител 20 МЕ.

Проведенными исследованиями установлено, что специфические к вирусу бешенства антитела в сыворотках крови КРС через 20 сут, 3, 3,5, 4, 5, 12 мес после вакцинации обнаружены в титрах от 1:2560 до 1:20480 (Ксп=2,1 и более), что соответствует активности 1-20 МЕ/мл и более. Как известно, защитный от

бешенства титр антител составляет 0,5 МЕ/мл. Следовательно, уровень антител в 301 исследованной пробе сывороток крови крупного рогатого скота в неблагополучных по заболеваемости бешенством хозяйствах Азнакаевского, Балтасинского, Лениногорского, Мамадышского, Сабинского, Тукаевского районов РТ, обеспечивал 100%-ную защиту животных от бешенства.

3.1.7 Усовершенствование системы противоэпизоотических мероприятий в Республике Татарстан при бешенстве

Результаты проведенных исследований по оценке эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бешенству в РТ за последние годы и мер борьбы с этой болезнью, а также анализ данных литературы свидетельствует о том, что пути усовершенствования противоэпизоотических мероприятий на современном этапе должны предусматривать решение следующих задач:

-для разработки прогноза ситуации по бешенству и принятия оперативных мер целесообразно систематически проводить картографирование неблагополучных пунктов по данному заболеванию;

-с целью создания устойчивой иммунологической защиты к вирусу бешенства у сельскохозяйственных и домашних животных в стационарно неблагополучных районах рекомендуется проводить вакцинацию всего поголовья в течение 2-3-х лет с учетом сезонности проявления эпизоотии бешенства;

-в природных очагах рабической инфекции проводить оральную иммунизацию лисиц в сочетании с регулированием их численности;

изучать биологические свойства изолятов вируса бешенства, циркулирующих в эпизоотических очагах, на антигенное соответствие применяемым вакцинным штаммам;

внедрять высокочувствительные экспресс-методы лабораторной диагностики бешенства и серологического контроля при антирабической вакцинации животных и людей;

-усилить контроль и ответственность за соблюдением правил содержания собак и кошек в городах и других населенных пунктах, по их учету, регистрации и иммунизации, а также улучшить работу коммунальных служб по отлову безнадзорных животных;

-привлекать владельцев животных к административной ответственности при нарушении правил содержания и выгула собак в общественных местах (намордник, поводок и т.д.), за несвоевременную вакцинацию животных и нанесение укусов людям, повлекших за собой физический ущерб, осложнения в связи с постинфекционной иммунизацией или смерти от гидрофобии в соответствии с действующим ветеринарным законодательством;

- систематически проводить медицинскими и ветеринарными работниками широкое оповещение населения о мерах профилактики заболевания гидрофобией людей, издавать популярную литературу и плакаты.

Для выполнения программ профилактики бешенства необходимо сотрудничество специалистов разного профиля: ветеринаров, охотников, медиков, зоологов, представителей коммунальной службы. Особое внимание должно быть уделено обеспечению информацией охотников и местного населения о проблеме бешенства.

Учитывая стационарное неблагополучие районов Татарстана по заболеванию бешенством, нами, совместно с Главным управлением ветеринарии КМ РТ, подготовлены предложения для включения в «Комплексный план мероприятий по профилактике бешенства на 2011-2015 гг.», который утвержден распоряжением Кабинета Министров РТ (№208-р от 17.02.2011 г.).

3.2 Анализ эпизоотической ситуации и совершенствование мер борьбы с болезнью Ауески в Российской Федерации 3.2.1 Анализ эпизоотической обстановки по болезни Ауески в России

С целью профилактики болезни Ауески в России используют живые и инактивированные вакцины. Несмотря на проводимые мероприятия, болезнь Ауески регистрируется в РФ ежегодно, нанося значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам.

Проведен анализ эпизоотической обстановки по болезни Ауески у свиней на территории РФ за 1996-2012 гг. и установлено, что БА у свиней регистрировали ежегодно от 1 до 19 неблагополучных пунктов. За указанный период БА была зарегистрирована в 130 неблагополучных пунктах. За 1996 -2012 гг. максимальное количество неблагополучных пунктов - 19, зарегистрировано в 1997 г., а минимальное - 1 - в 2011 и 2012 гг. При этом за указанный период установлено 9116 случаев заболевания свиней БА.

За последние годы (2008-2012 гг.) зарегистрировано 1016 случаев заболевания свиней БА в 12 неблагополучных пунктах, в частности, в 2008 году - 259 (Ставропольский край, Пермский край), в 2009 г. - 416 (Ивановкая область, Республиках Удмуртия и Татарстан), в 2010 г. - 25 (Ивановская область, Республика Удмуртия, Саратовская область), в 2011 г. - 315 (Пермский край), в 2012 г. - 1 (Саратовская область), что свидетельствует о постоянной биологической опасности БА для свиноводства России.

В настоящее время в стране отсутствует государственная программа мониторинга и искоренения болезни Ауески, а большинство используемых вакцин изготовлены из немаркированных штаммов вируса. Доля маркированных препаратов в отечественных хозяйствах в общем объеме иммунизаций пока незначительна. Проведение серологического мониторинга по болезни Ауески на основе дискриминирующих серологических тестов и использование только маркированных вакцин - основа искоренения болезни в России.

3.2.2 Иммунологический мониторинг эффективности вакцино-профилактики болезни Ауески в Республике Татарстан

Исследованиями 280 проб сывороток крови свиней из 9 свиноводческих хозяйств 7 районов РТ установлено, что степень защищенности свинопо-головья при определении эффективности вакинопрофилактики против БА в отдельных случаях достигает 100% при титрах 1:256 и выше в РНГА и 1:2560 и выше - в ИФА. Однако имелся ряд хозяйств, где в отдельных технологических группах процент положительно реагирующих в РНГА и ИФА был не высок. В частности, выявлена низкая защищенность в группах поросят 3-4 мес возраста (34%) и подсвинков группы откорма в возрасте 4-6 мес (56%). На основании полученных результатов указанные группы животных можно отнести к группе риска, вследствие возможности их инфицирования возбудителями БА и угрозе возникновения заболевания.

В целом, в исследованных хозяйствах степень защищенности колебалась в пределах 79-87% от общего поголовья животных.

В связи с вышеизложенным, следующим этапом наших исследований явилась разработка тест-системы для дифференциации поствакцинальных и постинфекционных антител в сыворотках крови вакцинированных свиней на основе РНГА с использованием антигена делеционного по гликопротеину цЕ вируса болезни Ауески.

3.2.3 Изучения репродукции вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «ВГНКИ» на культурах клеток

Важнейшим условием изготовления качественных диагностикумов при вирусных болезнях, в том числе при БА, является получение вируса с высоким титром инфекционности. Нами проведены исследования по изучению репродукции вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «ВГНКИ» на культурах клеток СПЭВ, НГУК-1, ВНК-21 и ККФ. Оценку эффективности цитопатического действия (ЦПД) проводили по четырех крестовой системе, где один плюс означает ЦПД с хорошо различимыми очагами, примерно на 25% всего монослоя клеток, два плюса - около 50%, а четыре плюса соответствует полному изменению всех клеток. При этом дополнительным показателем наличия вируса болезни Ауески в исследуемом материале являлось наличие гигантских многоядерных клеток - симпластов, образующихся в результате нарушения процесса деления клеток или растворения оболочек клеток ферментом лецитиназой вируса. Установлено, что вакцинный штамм «ВК» вируса болезни Ауески способен размножаться в культуре клеток НГУК-1. С характерным ЦПД (++++) наблюдали через 18-24 ч после заражения культуры данным штаммом вируса БА. При этом ЦПД вируса через 24 ч после заражения культуры клеток ВНК-21 было незначительным (+), а на культурах клеток СПЭВ и ККФ к этому сроку ЦПД отсутствовало.

В последующих экспериментах были проведены многократные пассажи для оценки чувствительности различных культур клеток к вирусу болезни Ауески. Вирус в культуре клеток НГУК-1 накапливался к 18-24 ч после заражения в титре 6,25 ^ ТЦЦ50/ см3, а в культуре клеток ВНК-21, ККФ и СПЭВ вирус достигал титра 4,50-5,25 ^ ТЦЦ50/ см3 лишь к 72 ч инкубации. Репродукция и накопление вируса в первые часы после инфицирования позволяют сделать заключение о высокой чувствительности культуры клеток НГУК-1 к нейротропному герпесвирусу болезни Ауески по сравнению с другими испытанными нами культурами клеток. Установлена перспективность культуры клеток НГУК-1 для первичного выделения вируса из экспертизных проб за 18-24 ч против 72 ч на исследованных культурах клеток, а также репродукции его с высоким титром вирусной биомассы (6,25 ^ ТЦЦ50), что обеспечивает достаточное количество при производстве средств диагностики.

Очистку культурального вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «ВГНКИ» от клеточного детрита осуществляли центрифугированием при 800д в течение 20-30 минут. При этом активность вируса сохранялась на уровне исходного.

Таким образом, в результате исследований показано, что из всех, использованных культур клеток лучшая адаптация вируса болезни Ауески, штамм «ВК» «маркированный» по гликопротеину происходит на культуре клеток НГУК-1, что позволяет получить культуральный вирус с наибольшим титром инфекционности.

3.2.4 Разработка технологии изготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для РНГА на основе штаммов «ВГНКИ» и «ВК» вируса болезни Ауески

Одним из наиболее чувствительных и экспрессных серологических методов обнаружения и титрования специфических антител при многих инфекционных заболеваниях сельскохозяйственных животных и человека является реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Процесс изготовления эритроцитарного диагностикума для РНГА для определения антител к вирусу БА в сыворотке крови животных включает 3 этапа:

1 этап. Подготовка формалинизированных эритроцитов:

-получение эритроцитов барана;

-формалинизация эритроцитов;

-контроль формалинизированных эритроцитов.

2 этап. Танизация формалинизированных эритроцитов:

-приготовление рабочего раствора танина;

-обработка эритроцитов танином;

-контроль танизированных эритроцитов.

3 этап. Сенсибилизация антигеном формалинизированных танизированных эритроцитов.

Для приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума исходным материалом служили эритроциты барана.

При изготовлении антигенных эритроцитарных диагностикумов сенсибилизацию эритроцитов проводили вирусом БА, штаммы «ВК» и «ВГНКИ» при температуре среды от 20 до 56°С; концентрации антигенного белка 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мг на 1 мл эритроцитарной суспензии и экспозиции с 30 до 90 минут. Активность изготовленных антигенных эритроцитарных диагностикумов определяли по выявлению антител в РИГА со специфической иммунной сывороткой крови кроликов, иммунизированных двукратно вирусвакциной ВГНКИ против БА, производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов». Установлено, что повышение температуры среды ускоряет процесс сенсибилизации эритроцитов и приводит к увеличению активности препаратов, что подтверждается нарастанием титра антител, улавливаемых в РНГА. Однако увеличение температуры с 37°С до 56°С вызывало снижение активности эритроцитарных антигенных препаратов. В то же время увеличение времени экспозиции и концентрации белка в реагирующей смеси оказывало благоприятное действие на процесс связывания эритроцитов с белком вируса болезни Ауески, о чем свидетельствует нарастание титра антител, выявляемых в РНГА с помощью эритроцитарных диагностикумов. Так, наиболее оптимальным оказалось время связывания в течение 60 мин при концентрации белка 1,0 мг/мл 3%-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов.

В процессе исследований проведено также определение оптимальной концентрации вносимого в реагирующую смесь хлорного хрома и длительности его контакта. На стабилизацию эритроцитов благоприятное воздействие оказывает хлорный хром при внесении его в количестве 0,01% к основному объему реагирующей смеси, при экспозиции в течение 5 минут.

В ходе исследований была показана принципиальная возможность изменения условий в процессе приготовления эритроцитарных препаратов, что было использовано при разработке технологического режима создания диагностических наборов на основе РНГА при БА.

3.2.5 Определение активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов на основе штаммов «ВГНКИ» и «ВК» вируса болезни Ауески

Определение активности и специфичности изготовленных антигенных эритроцитарных диагностикумов проводили в РНГА с использованием сывороток крови крыс и кроликов, иммунизированных против болезни Ауески различными антигенами.

Получение специфических сывороток крови кроликов и крыс осуществляли путем иммунизации их различными вакцинами против болезни Ауески. Для этого животных по принципу аналогов разделили на 4 группы по 10 голов в

каждой.

- I группа животных получала вирусвакцину ВГНКИ против болезни Ауески, производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов»;

- II группа животных получала эпизоотический радиоинактивированный вирус БА, штамм «Производственный»;

- III группа животных получала маркированный (делеционный по гликопротеину gE) штамм «ВК» вируса БА;

- IV группа - интактные животные (контроль).

Лиофилизированный вирусный антиген ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе и вводили подопытным животным (крысам и кроликам) по 0,5 см3 подкожно в область спины, иммунизирующая доза составляла 30 мг/кг. Иммунизацию животных проводили двукратно с интервалом 14 дней.

В качестве отрицательного контроля использовали интактную сыворотку крови свиней, не содержащую антитела к вирусу БА.

Учет результатов проводили при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной и гетерологичными сыворотками крови в виде компактной точки на дне лунки.

Установлено, что эритроцитарный диагностикум, изготовленный на основе вируса БА из штамма «ВГНКИ», выявлял наличие антител в сыворотках крови животных, иммунизированных вирусвакциной ВГНКИ против БА, производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» и радиоинакгивированным вирусом БА, штамм «Производственный», в титрах 1:32 и выше, тогда как титр антител в сыворотках крови животных, иммунизированных маркированным (делеционным по гликопротеину gE) штаммом «ВК» вируса БА, не превышал 1:4.

Одновременно с этим, эритроцитарный диагностикум, изготовленный нами на основе маркированного штамма «ВК» вируса БА, выявлял наличие антител в сыворотках крови всех вакцинированных животных в титрах 1:32, при отсутствии агглютинации с сывороткой интактных животных.

Для комиссионных испытаний с целью определения чувствительности и специфичности изготовленного нами эритроцитарного диагностикума на основе маркированного штамма «ВК» вируса БА были исследованы в РИГА:

- сыворотки крови крыс, иммунизированных двукратно с интервалом 21 день подкожно с использованием маркированной вакцины против вируса БА, делеционной по gE (ВНИИЗЖ, г.Владимир).

- сыворотки крови крыс, неиммунных к вирусу БА;

- сыворотки крови, специфические к вирусу КЧС и инфекционного ринотрахеита (гетерологичные контроли).

Апробация чувствительности и специфичности эритроцитарного диагностикума, изготовленного на основе маркированного штамма вируса БА, делеционного по гликопротеину gE показала, что РНГА позволяет проводить оценку эффективности противовирусной вакцинации при болезни Ауески с

использованием маркированной вакцины против вируса БА, и не реагирует с неиммунными и гетерологичными контролями.

Сыворотки крови крыс, вакцинированных ^-негативной вакциной, давали отрицательные результаты в РНГА с использованием эритроцитарного диагностикума на основе штамма «ВГНКИ», но были положительными в тестах с использованием эритроцитарных диагностикумов на основе маркерного антигена. Эти результаты свидетельствуют о возможности выявления антител, направленных против что позволяет дифференцировать поствакцинальный и постинфекционный иммунитет.

3.2.6 Сравнительная оценка эффективности РВН и РНГА с

использованием диагностических наборов на основе маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески при определении антител в сыворотках крови иммунизированных животных

Для определения активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов использовали 120 поросят 2-6 мес возраста из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. Поросята были получены от свиноматок, вакцинированных вирусвакциной ВГНКИ против БА.

Перед проведением иммунизации маркированной вакциной против вируса БА, делеционной по (ВНИИЗЖ, г.Владимир), у поросят брали кровь для исследования сыворотки на наличие антител к вирусу БА.

Все пробы показали отрицательный результат на наличие антител в сыворотке крови, т.е. титр антител не превышал 1:4.

Далее животных по принципу аналогов разделили на 3 группы по 40 голов в каждой.

- I группа - животных иммунизировали вирусвакциной ВГНКИ против болезни Ауески, производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов»;

- П группа - животных иммунизировали вирусвакциной против болезни Ауески свиней сухой купыуральной из маркированного штамма «ВК»;

- Ш группа - интактные животные (контроль).

Схема иммунизации включала двукратное введение вакцины с интервалом 14-дней. Клиническое наблюдение и определение антител в крови вели в течение 3-14 дней после I иммунизации и 3-180 дней - после П иммунизации животных. Поросят 1-й и 2-й групп иммунизировали внутримышечно вирусвакцинами согласно наставлениям по их применению.

Результаты испытаний показали, что титры антител в РНГА у поросят, иммунизированных вирусвакциной ВГНКИ против БА, находились в пределах 1:8 и выше при использовании эритроцитарного диагностикума на основе вируса БА штамма «ВГНКИ», так и диагностического набора, изготовленного на основе маркированного штамма «ВК» вируса БА.

Научно обосновано, что поголовье свиней может быть защищено от возникновения БА при наличии в стаде 84% и более вакцинированных

животных, положительно реагирующих в РИГА в титре 1:8 и выше.

Однако сыворотки крови поросят, иммунизированных ¡»Е-негативной вакциной, давали отрицательные результаты в РНГА, с использованием эритроцитарного диагностикума на основе вируса БА штамм «ВГНКИ», но давали титры 1:8 и выше в тестах с использованием эритроцитарного диагностикума на основе маркерного антигена, что свидетельствует о возможности выявления антител, направленных против цЕ, и позволяет дифференцировать поствакцинальный и постинфекционный иммунитет.

3.2.7 Контроль эффективности вакцинопрофилактики болезни Ауески с помощью эритроцитарных диагностикумов для дифференциации поствакцинальных от постинфекционных антител

РВН ставили на культуре клеток НГУК-1, выращенных в пенициллиновых флаконах (первоначальный рассев во флаконы был 1,2 мл суспензии клеток во флакон) при постоянной дозе вируса болезни Ауески, равной 100 ТЦД50/ см3 по ГОСТу 257.53.

В качестве специфических сывороток использовали сыворотки крови двукратно иммунизированных поросят 2-6 мес. возраста:

- вирусвакциной ВГНКИ против болезни Ауески производства ФГУП «Покровский завод биопрепаратов»;

- вирусвакциной против болезни Ауески свиней и овец сухую культуральную из маркированного штамма «ВК»;

В качестве контроля использовали сыворотки крови интактных животных.

Разведения сывороток крови готовили на поддерживающей среде для культуры клеток НГУК-1 (1:2,1:4, 1:8, 1:16, 1:32).

Для постановки реакции вируснейтрализации брали 100 ТЦД50/0,1 см3 доз вируса, штамм «Производственный» (первоначальный титр вируса составлял 6,25 1ёТЦЦ50/см3).

В качестве контроля использовали культуру клеток, в которую вносили поддерживающую среду; а также культуру клеток, в которую вносили постоянную дозу вируса (0,1 мл вируса на 0,9 мл поддерживающей среды).

Параллельно с постановкой РВН сыворотки крови подвергали исследованию на определение антител с помощью диагностических наборов, изготовленных на основе маркированного штамма «ВК» (делеционного по гликопротеину §Е) и штамма «ВГНКИ» вируса БА. Сравнительный анализ эффективности эритроцитарных диагностикумов и РВН показал, что сыворотки крови иммунизированных как традиционной, так и маркированной вакцинами животных содержат антитела против вируса БА в титрах 19,2±7,2 и 18,9±7,2, что обеспечивает защиту от заболевания БА. Научно обосновано, что минимальный титр антител в сыворотке крови, определяемый в РВН, предохраняющий от заражения вирусом болезни Ауески, составляет 1:8.

При этом в контрольной культуре клеток, зараженной вирусом БА, штамм

«Производственный», ЦПД на 4 креста (++++) наблюдался через 24-48 ч, тогда как в контрольной культуре клеток, не зараженной вирусом, монослой полностью сохранился.

Титры же антител в сыворотках крови, иммунизированных как традиционной, так и маркированной вакцинами, при исследовании с помощью диагностического набора, изготовленного на основе маркированного (делеционного по гликопротеину ^Е) штамма «ВК» вируса БА, составляют 46,5±1,8 и выше (таблица 3).

Таблица 3 Сравнительные показатели титра антител в сыворотке крови свиней, иммунизированных против болезни Ауески в РИГА и РВН

Наименование реакции Титры антител в сыворотках крови животных

иммунизированных вакциной против БА из штаммов: интактных

ВГНКИ ВК

РВН 19,2±7,2 18,9±7,2 -

РНГА с использованием «Набора препаратов для определения в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески» 46,7±2,4 3,8±1,4 -

РНГА с использованием диагностического набора, изготовленного на основе маркированного (делеционного по гликопротеину цЕ) штамма «ВК» вируса БА 46,5±1,8 46,9±2,3

Таким образом, результаты испытания набора препаратов для дифференциальной диагностики в РИГА специфических антител у свиней при БА на основе делеционного штамма «ВК» по гликопротеину и анализ данных РВН показывают его эффективность и, что с помощью диагностического набора, изготовленного на основе маркированного штамма «ВК» вируса БА, можно дифференцировать вакцинированное маркированной вакциной поголовье от вакцинированного традиционной вакциной или инфицированного полевым вирусом. В тех хозяйствах, где проводят вакцинацию традиционными вакцинами, применение скрининговых тестов не позволяет дифференцировать вакцинированных и инфицированных животных. В хозяйствах, где применяются gE негативные вакцины, целесообразным является использование дискриминирующих тестов, которые такие отличия выявляют. Одним из таких тестов и является разработанный нами диагностический набор для РНГА на основе маркированного штамма «ВК» вируса БА, зарегистрированный в установленном порядке. 30

3.3 Анализ эпизоотической ситуации и совершенствование мер борьбы с бруцеллезом в Российской Федерации 3.3.1 Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу в России

Проблема бруцеллеза сельскохозяйственных животных по настоящее время сохраняет свою актуальность. Об этом свидетельствуют данные анализа эпизоотической ситуации по бруцеллезу в РФ. За 1997-2012 гг. бруцеллез крупного рогатого скота установлен в 1864 неблагополучных пунктах, где заболело свыше 121,6 тыс. голов крупного рогатого скота. За указанный период подвергнуто вакцинации 121 млн. голов крупного рогатого скота. Начиная с 2002 г., имеется определенная тенденция к ухудшению эпизоотической ситуации в РФ по бруцеллезу крупного рогатого скота. В 2012 г. выявлен 361 неблагополучный пункт по бруцеллезу крупного рогатого скота в 25 субъектах РФ: Астраханской (47), Саратовской (9), Ростовской (7), Новосибирской (3), Оренбургской (2), Амурской (2), Иркутской (2), Волгоградской (1), Свердловской (1), Воронежской (1), Липецкой (1), Мурманской (1) областях; Республиках: Калмыкия (99), Карачаево-Черкессия (14), Северная Осетия (11), Дагестан (7), Ингушетия (6), Хакассия (3), Кабардино-Балкария (2), Адыгея (1) и Бурятия (1), а также Ставропольском (86), Краснодарском (17), Приморском (7), Алтайском (2) краях.

Пики регистрации неблагополучия по бруцеллезу приходятся ежегодно на второй квартал, который связан с выгоном скота на пастбища и проведением массовых исследований.

В 2010 - 2011 гг. иммунизировано против бруцеллеза крупного рогатого скота вакциной из штамма В.abortus 82 соответственно 1722,303-, 1608,476 тыс. гол. В 2009 - 2010 гг. иммунизировано вакциной из штамма B.abortus 75 и B.abortus 79-АВ соответственно 151,13- и 134,593 тыс.гол., из штамма B.abortus 19 соответственно 12,533-, 11,239 тыс. гол. данного вида животных.

Характерно, что применяемая в США живая вакцина B.abortus RB-51, согласно результатам комиссионного испытания, выполненного в рамках американо-российского проекта «Изучение иммунобиологических свойств вакцинных штаммов бруцелл», уступает по иммуногенным свойствам вакцине из штамма B.abortus 82.

Проведен анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу мелкого рогатого скота, сложившейся в РФ за 1997 - 2012 гг. За 2007-2012 гг. бруцеллез мелкого рогатого скота в РФ установлен в 345 неблагополучных пунктах, где заболело 20,9 тыс. голов мелкого рогатого скота. За указанный период подвергнуто вакцинации 62,9 млн. голов мелкого рогатого скота. Начиная с 2002 г. до 2009 г. наблюдается увеличение количества неблагополучных пунктов, а с 2010 г. имеется определенная тенденция к их снижению. Так, за 12 мес 2012 г. выявлено 28 новых неблагополучных пунктов. В 2012 г. бруцеллез мелкого рогатого скота был зарегистрирован в 14 субъектах РФ: Волгоградской (2), Саратовской (2), Астраханской (1), Ростовской (1), Свердловской (1),

Московской (1), Смоленской (1) областях, Республиках: Дагестан (6), Хакасия (4), Адыгея (2), Калмыкия (2), Тыва (1), а также Ставропольском (2) и Красноярском (1) краях.

Для профилактики бруцеллеза мелкого рогатого скота в ряде субъектов страны по-прежнему используют вакцины из штаммов B.melitensis Rev-1, которой в 2010 - 2011 гг. иммунизировано соответственно 3959,003-, 3153,001 тыс. гол. и B.abortus 19 соответственно 1694,585-, 1662,322 тыс. гол., несмотря на то, что это затрудняет определение эпизоотического статуса стад и отар по бруцеллезу. Следует отметить, что вакцину из штамма B.abortus 19 ни в одной стране мира для специфической профилактики бруцеллеза мелкого рогатого скота не применяют.

Основными причинами распространения бруцеллеза являются вывоз животных, продукции из неблагополучных по бруцеллезу пунктов, неорганизованная и неконтролируемая деятельность личных подсобных хозяйств, мелких боен и мясоперерабатывающих цехов и др.

Таким образом очевидно, что эпизоотическая ситуация по бруцеллезу в РФ остается напряженной. С целью повышения эффективности противоэпизоотических мероприятий целесообразно осуществлять и постоянно совершенствовать ветеринарный контроль за передвижением поголовья из одного субъекта РФ в другой, владеть эпизоотической обстановкой в конкретном хозяйстве, так как несанкционированное перемещение животных и отсутствие ограничений на торговлю животными, вакцинированными против бруцеллеза, делают невозможным его искоренение. Актуален и несвоевременный убой больных бруцеллезом животных, обусловленный отсутствием в большинстве субъектов РФ предназначенных для этого мясокомбинатов и боен.

Приоритетным направлением для совершенствования борьбы с бруцеллезом является знание современной эпизоотической ситуации, совершенствование нормативно-правовых документов и создание высокоэффективных средств для проведения противоэпизоотических мероприятий.

3.3.2 Изучение антигенных и иммуногенных свойств живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин

Проведено изучение антигенных и иммуногенных свойств живых, гамма-инактивированных и гамма-инактивированных в сочетании с иммуномоду-лятором тиосульфатом натрия противобруцеллезных вакцин из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 и агппотиногенного штамма В. melitensis Рев-1 при вакцинации и ревакцинации морских свинок. Всего в эксперименте использовано 110 морских свинок.

Для выполнения поставленной цели морских свинок иммунизировали подкожно в область паха по схеме с использованием:

1 группа - живой вакцины из штамма В. abortus 82 в дозе 1 млрд. м.к. в объеме 1 см3 на фосфатном забуференном физрастворе;

2 группа - гамма-инактивированной вакцины из штамма В. abortus 82 в дозе 5 млрд.м.к.;

3 группа - гамма-инактивированной вакцины из штамма В. abortus 82 в дозе 5 млрд.м.к. сочетанно с тиосульфатом натрия в дозе 150 мг;

4 группа - живой вакцины из штамма В. melitensis Рев-1 в дозе 500 тыс. м.к.;

5 группа - гамма-инактивированной вакцины из штамма В. melitensis Рев-1 в дозе 100 млн. м.к.;

6 группа - гамма-инактивированной вакцины из штамма В. melitensis Рев-1 в дозе 100 млн. м.к. сочетанно с тиосульфатом натрия в дозе 150 мг;

7 группа - интактные, для контроля заражения.

Через 15 сут, 1 и 2 мес после иммунизации у животных брали кровь из ушной вены для проведения серологических исследований в PA, PCK-S и PCK.-R до предельных титров антител.

Спустя 2 мес. со дня иммунизации, первую половину морских свинок заражали вирулентной культурой штамма В. melitensis 16-М в дозе 50 м.к., подкожно, в объеме 1 см3, в области паха со стороны противоположной месту введения вакцины.

Вторую половину морских свинок в этот же срок ревакцинировали вышеуказанными вакцинами в тех же дозах, со стороны, противоположной месту вакцинации.

У ревакцинированных животных брали кровь из ушной вены для проведения серологического исследования через 15 сут, 1, 2 и 4 мес в тех же реакциях.

Спустя 4 мес ревакцинированных животных заражали культурой вирулентного штамма В. melitensis 16-М в дозе 50 м.к., подкожно, в объеме 1 см3, со стороны, противоположной месту ревакцинации.

Через 25-30 сут вакцинированных и зараженных через 2 мес, а также ревакцинированных и зараженных через 4 мес морских свинок подвергали эвтаназии с проведением серологических и бактериологических исследований, по результатам которых определяли процент иммунных животных.

В результате проведенных исследований установлено, что наиболее выраженный иммунный ответ наблюдается при введении живых вакцин из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 и агглютиногенного штамма В. melitensis Рев-1, по сравнению с гамма-инактивированными вакцинами из этих штаммов, в т.ч. и с иммуномодулятором (таблица 4).

При этом у морских свинок, привитых вакциной из штамма В. abortus 82, как живой, так и инактивированной, РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном были отрицательными во все сроки исследований при положительной РСК с R-антигеном. У животных, привитых живой вакциной из штамма В. abortus 82, R-антитела выявлялись более длительно, чем при

Таблица 4 Иммуногенные свойства различных противобруцеллезных вакцин на морских свинках после их ревакцинации (М±ш)

Наименование вакцины Кол-во голов иве Результаты серол. исследований Результаты бак. исследований Заразилось (голов) Иммунных (голов)

Единый бруц. (S) антиген R-аптиген РСК Выделено культур бруцелл ИИ (%) вирул. культурой Генарал. Локально Регионарно Всего Стерильн. Нестсрильн. Всего %

PA (ME) РСК Вакц. шт. Вирул. шт.

В. abortus 82 живая 3 1,34±0,12 1-20 2-отр. б,7±1,7 16,7 ±3,3 - - 0,0±0,0 - - - - 3 - 3 100,0

82-у 6 1,77±0,33 Отр. Отр. 1-1:5 2-сомн. 3-отр. - 6 10,0±8,2 1 - 1 2 4 - 4 66,6

82-у + тиос. натрия 5 1,57±0,13 33,0±31,8 9,0±7,8 2.-1:10 1-сомн. 2-отр. - 16 32,0±18,3 2 1 - 3 2 - 2 40,0

В. melitensis Рев-1 живая 6 1,61±0,19 28,3±11,4 20,0±6,3 Отр. - - 0,0±0,0 - - - - 6 - 6 100,0

Рев-1-у 3 2,23± 0,73 1-40 2-отр. 1-1:20 2-отр. Отр. - 9 30,0±25,2 1 - 1 2 1 - 1 33,3

Рев-1-у + тиос. 3 2,33±0,58 1-20 2-отр. 1-1:40 2-отр. Отр. - 8 26,7+26,7 1 - - « 2 - 2 66,6

Контроль В. melitensis 16-М 50 м.к. 6 2,26±0,25 1-10 5-отр. Отр. Отр. - 21 35,0±10,0 4 - 2 6 - - 0 0,0

введении гамма-инактивированной вакцины.

Ревакцинация морских свинок живой вакциной из штамма В. abortus 82 индуцировала непродолжительный синтез S-антител, улавливаемых единым бруцеллезным антигеном. РА была положительной только через 15 сут после ревакцинации, РСК - через 15 и 30 суток.

У животных, ревакцинированных гамма-инактивированной вакциной из штамма В. abortus 82, S-антитела выявлялись лишь через 15 суток.

Установлено, что чем выше иммуногенность противобруцеллезной вакцины, тем меньший положительный эффект оказывает иммуномодулятор тиосульфат натрия, вплоть до отрицательного - у первично привитых морских свинок.

В результате исследований показано, что при выработке противо-бруцеллезного иммунитета антитела не играют решающую роль.

Исследованиями установлено также довольно высокие иммуногенные и инагглютиногенные свойства у-инактивированной вакцины из штамма В. abortus 82 на морских свинках.

Это служит основанием для испытания ее на сельскохозяйственных животных и в перспективе использования для специфической профилактики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота.

3.3.3 Разработка метода оценки иммуногенности противо-бруцеллезных вакцинных штаммов

До проведения ИФА по определению цитокинов в супернатантах инкубированных клеток, проводили исследования по адаптации мононуклеаров (моноциты, лимфоциты, нейтрофилы) периферической крови к условиям работы in vitro - культивированию их в С02 - инкубаторе на специальной питательной среде Игла с содержанием 2мМ глютамина и 80 мкг/мл гентамицина. Прежде всего были определены оптимальные временные параметры стимуляции синтеза цитокинов клетками крови, позволяющие завершить первую фазу эксперимента (инкубацию) в течение 6-8 часов. Ранее нами было показано, что при стимуляции клеток ЛПС бруцелл in vivo увеличение концентрации фактора некроза опухоли (ФНО-а) в крови происходит как минимум через 3 ч, имея значение 0,35 нг/мл. Результаты использованного метода показали, что за 6 ч инкубации клетки способны секретировать существенное количество ФНО-<х с тенденцией к нарастанию. Синтез ФНО-а за данный временной период не достигает своего максимума, но имеет достоверную (Р<0,001) разницу между стимулированным и спонтанным синтезом цитокина. Выбранное время инкубации является достаточным для определения синтеза цитокинов, что позволяет сравнить степень ответа иммунокомпетентных клеток у иммунизированных и неиммунизированных животных до наступления динамического равновесия между секрецией и инактивацией цитокинов.

Перед проведением ИФА по определению содержания цитокинов в супернатантах, первоначально провели опыты по определению калибровочной кривой на содержание ФНО-а с использованием стандартных цитокинов, приложенных к наборам.

После установления чувствительности тест-системы ИФА по способности обнаруживать цитокины в исследуемых пробах, были проведены основные опыты по изучению способности испытуемых индукторов цитокинов -различных антигенов бруцелл синтезировать медиаторы иммуногенеза в используемой клеточной модели - инкубируемых клетках периферической крови in vitro.

Результаты параллельного определения спонтанной и стимулированной изученными антигенами секреции мононуклеарами периферической крови in vitro других не менее важных цитокинов: интерлейкина-ip (ИЛ-ip) и колониестимулирующеш фактора (КСФ), входящих в состав суперсемейства иммуноглобулин-подобных молекул, осуществляющих первичную (раннюю, экстренную) реакцию организма на патогенной агент, включая роль активаторов клеток-киллеров, макрофагов, уничтожающих патогенов с помощью высокоактивных метаболитов кислорода и азота, показали, что инкубация мононуклеаров за указанный оптимальный период времени в вышеописанных условиях сопровождалась секрецией в инкубационную среду (супернатант) важнейших цитокинов иммунной системы: интерлейкина ИЛ-1(3 и колониестимулирующего фактора КСФ 6,5 и 9,7 пг/мл соответственно.

Исследования проб - супернатантов из нестимулированных и стимулированных антигенами клеток по определению уровня цитокинов методом ИФА показали, что совместное инкубирование лимфоцитов с испытуемыми индукторами вызывало образование цитокинов в условиях vitro. При этом установлено также, что способность стимулированных антигенами бруцелл клеток периферической крови синтезировать вышеуказанные цитокины иммунной системы оказались намного выше по сравнению с таковой интактных (нестимулированных индукторами-антигенами) клеток крови.

Показано также, что наиболее активными индукторами всех 3 классов цитокинов оказались бруцеллезные антигены из штаммов 54,82,82-Пч и 82-ц. При этом отмечается, что антигены из шт. 82, 82 Пч и 82 - ц отличаются высокой активностью индукции всех 3 классов цитокинов 1-й (экстренной) фазы иммунного реагирования: ФНО-а, ИЛ-1 р и КСФ.

Вместе с тем, антиген из шт. 54, в отличие от первых 3 вышеуказанных антигенов, обладает сравнительно низкой активностью по способности синтезировать ФНО-а.

При этом наиболее активным индуктором всех исследованных классов цитокинов является антиген из шт. В. abortus 82, который вызывал усиление спонтанной продукции ФНО-а в 3,7 раза (Р<0,05), ИЛ-1р -3,9 раза (Р<0,01) и КСФ - в 6,3 раза (Р<0,001). Антиген из шт. В. abortus 82 по цитокининду-цирующей активности обладал почти идентичной активностью, незначительно

(в 1,1 раза, Р>0,05) уступая по интерлейкин -ip -индуцирующей активности антигену из шт. В. abortus 82-ц, имея равную степень активности по способности синтезировать цитокины ФНО-а и КСФ. Антиген из шт. В. abortus 82 -ц имел аналогичную активность по способности усиливать продукцию цитокинов всех 3 классов, отличаясь от предыдущих двух штаммов весьма незначительно, уступая по КСФ - стимулирующий активности предыдущим антигенам только в 1,04 раза (Р>0,05), уступая по интерлейкин -ip-индуцирующей активности антигену из шт. В. abortus 82, имея равную степень активности по способности синтезировать цитокины ФНО-а и КСФ. В отличие от вышеуказанных антигенов бруцелл, антигены В. abortus из штаммов 19, 19 США и R-1096, оказались наименее активными усилителями отдельных цитокинов. В то же время установлено, что ни один из них не является активатором всех 3 классов цитокинов, поскольку они являются усилителями только одного класса цитокинов. Так, антиген из шт. В. abortus 19 является усилителем цитокина КСФ - (138,8±7,3 пг/мл), антиген из шт. В. abortus 19 США - ФНО-а (31,8±3,3 пг/мл), a из шт. В. abortus R-1096 - цитокина ИЛ-ip (125,3±10,3 пг/мл). Указанные антигены бруцелл по способности синтезировать остальные классы цитокинов значительно (в 2,5 раза) уступали антигенам из других штаммов бруцелл.

По способности усиливать синтез иммунорегулирующих цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip, КСФ) в модельной in vitro тест - системе (инкубирование цитокининдуцирующих клеток периферической крови) испытанные антигены из штаммов бруцелл образуют следующей убывающий ряд: шт.82<АГ шт. 82 Пч <АГ шт.82ц< АГ шт. 19 < АГ шт. R1096 < АГ шт. 19 США.

Результаты иммунохимических исследований по определению концентрации цитокинов в сыворотке крови иммунизированных различными вакцинами животных показали, что полученные в in vitro тест-системе данные полностью подтвердили данные опытов in vivo: в сыворотке крови животных, иммунизированных шт.82 и 82-Пч, обнаружены наибольшее содержание исследованных цитокинов.

Полученные данные являются основанием для продолжения исследований по определению цитокининдуцирующей активности использованных антигенов и оценки превентивной активности антисывороток в начальные этапы после иммунизации антигенами живых и инактивированных бруцелл.

Новизна полученных данных подтверждена Патентом РФ на изобрете-ние: «Способ оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов» (№2419096 от 20.05.2011 г.).

3.3.4 Разработка набора препаратов для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма

В. abortus 82

С целью получения бруцеллезного R-антигена для РСК использовали культуру инагглютиногенного штамма В. abortus R-1096.

Наиболее оптимальным способом получения бруцеллезного R-антигена является метод ультразвуковой дезинтеграции и последующего центрифугирования дезинтеграта. Характерной особенностью R-антигена является его способность улавливать в РСК только R-антитела, образующиеся в ответ на введение вакцины из штамма В. abortus 82. С S-антителами, циркулирующими в крови больных бруцеллезом животных, он не взаимодействует.

Далее для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза в стадах скота, привитого вакциной из штамма В. abortus 82, провели испытания R-антигена в РСК и установили, что он специфичен в РСК и показывал отрицательные результаты с сыворотками крови здоровых, не привитых против бруцеллеза животных. Отрицательно реагировали также животные, больные паратифом, хламидиозом и иерсиниозом и, что особенно важно, больные бруцеллезом, не привитые против данной инфекции животные. Не взаимодействовал этот антиген и с сыворотками крови от коров и нетелей, абортировавших на почве бруцеллеза.

На основании результатов изучения иммуногенеза животных, привитых вакциной из штамма В. abortus 82, и патогенеза при экспериментальном заражении вакцинированного поголовья, а также итогов исследований больных бруцеллезом животных в стадах крупного рогатого скота привитого и не привитого против бруцеллеза, были сформулированы принципы дифференциальной серологической диагностики. Суть принципа заключается в нижеследующем.

R- бруцеллезный антиген взаимодействует в РСК со специфическими R-антителами сыворотки крови животных, иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82, и не взаимодействует с S-антителами сыворотки крови животных, иммунизированных вакциной из штаммма B.abortus 19 или больных бруцеллезом. R- бруцеллезная сыворотка содержит специфические R-антитела, дающие положительную РСК с R- бруцеллезным антигеном. S- бруцеллезная сыворотка содержит специфические S-антитела, дающие положительную РСК с антигеном бруцеллезным единым для РА, РСК и РДСК. На основе результатов проведенных исследований в соавторстве разработан набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82, зарегистрированный в установленном порядке.

выводы

1. Впервые разработаны и внедрены в производство высокоэффективные средства для проведения эпизоотологического и иммунологического мониторинга бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза сельскохозяйственных животных: «Флуоресцирующий антирабический глобулин (ФАГ) для обнаружения антигена вируса бешенства»; «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА»; «Набор препаратов для определения в РИГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески»; «Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллёза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82» и Инструкции по их применению.

2. Проанализирована эпизоотическая обстановка по бешенству, болезни Ауески и бруцеллезу в Российской Федерации, которая характеризуется стационарным неблагополучием по указанным инфекционным заболеваниям и напряженной эпизоотической ситуацией.

3. На основании эпизоотологического и иммунологического мониторинга впервые представлена комплексная характеристика эпизоотической ситуации по рабической инфекции в Республике Татарстан за период 1970-2012 гг.: бешенство зарегистрировано в городах и районах республики, где заболело 3616 животных, в том числе 1284 (35,5%) сельскохозяйственных, 611(16,9%) -домашних и 1721(47,6%) - диких. Основным источником и распространителем бешенства в Республике Татарстан являются лисицы, на долю которых среди заболевших диких животных за указанный период приходится 97,8%. Очаговая инцидентность составила 1,3. Ретроспективным анализом десятилетних периодов - 1993-2002 гг. и 2003-2012 гг. в Татарстане установлен рост заболеваемости животных бешенством в 3,4, у сельскохозяйственных — 2,2, домашних - 4,1 и диких - 4,4 раза.

4. Закономерность проявления эпизоотии бешенства в Республике Татарстан характеризуется трех - пятилетней периодичностью и сезонностью. Максимальное количество больных бешенством животных регистрируется в осенние месяцы. При этом установлено, что показатели заболеваемости в разные сезоны года могут изменяться в зависимости от количества заболевших бешенством видов животных.

5. Выявлены стационарные природные очаги бешенства и разработаны эпизоотические карты с территориальной приуроченностью распространения рабической инфекции в Республике Татарстан за 2007-2012 гг., с разделением неблагополучных районов республики на 4 группы по количеству случаев заболевания всех видов животных в расчете на 1000 км2.

6. Показано антигенное родство уличного рабического вируса с вакцинными штаммами вируса бешенства «Щелково-51» и «Овечий» ГНКИ. Эпизоотические изоляты не оказывали цитопатического действия и выделялись

в культуре клеток НГУК-1 с последующим анализом по МФА на вторые-третьи сут после заражения, обладали ярко выраженными преципитирующими и комплементсвязывающими свойствами. Индекс инвазивности эпизоотических изолятов вируса бешенства варьировал от 0,9 до 2,4; инкубационный период составил от 12 до 24 суток.

7. Установлена антирабическая активность эндонуклеазы Serratia marcescens в комбинации с катионами магния и «Гемодез-Н», обеспечивающая не менее 30%-ную защиту через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.

8. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки при иммунизации овец, заключающийся в использовании иммуномодулятора полиэтилсилоксана в составе масляного адъюванта, вместо неполного адъюванта Фрейнда, позволяющий повысить её вируснейтрализующую и комплементсвязывающую активности в 4 раза.

9. Показана эффективность вакцинопрофилактики крупного рогатого скота культуральной антирабической вакциной из штамма «Щелково-51». Методом ИФА показан высокий уровень специфических антител в сыворотках крови через 12 мес. после вакцинации, обеспечивающий 100%-ную защиту животных от бешенства.

10. Перевиваемая культура клеток НГУК-1 обеспечивает ускоренную репродукцию вируса болезни Ауески, штамм «ВК», в течение 24 ч, вместо 48-72 ч на культурах клеток СПЭВ, ВНК-21 и ККФ с конечной концентрацией вируса 6,25 ТЦД5о/см3; определены оптимальные условия культивирования вакцинных штаммов вируса болезни Ауески и отработана технология сенсибилизации формалинизированных эритроцитов делеционным по гликопротеину gE вирусом болезни Ауески для изготовления эритроцитарного реагента.

11. Разработан метод оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцин по цитокининдуцирующей активности антигенов в in vitro тест-системе. Установлено, что объективным критерием оценки иммуногенности испытуемых потенциальных вакцинных препаратов является антиген-индуцированный синтез иммунорегуляторных цитокинов классов ФНО-а, ИЛ-Iß и КСФ при оптимальном соотношении их концентраций 1-1,25:2-2,25:33,70 соответственно.

12. Наиболее выраженный иммунный ответ наблюдается при введении живых вакцин из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 и агглютиногенного штамма В. melitensis Рев-1, по сравнению с гамма-инактивированными вакцинами из этих штаммов, в т.ч. и при применении их в сочетании с иммуномодулятором.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для внедрения в производство предложены:

1. «Инструкция по применению Флуоресцирующего антирабического глобулина (ФАГ) для обнаружения антигена вируса бешенства», утв. Россельхознадзором 3.03.2008 г., №ПВР-1-4.9/00196. 5с.

2. Технические условия на флуоресцирующий антирабический глобулин (ТУ 9388-02700492374-2007, утв. Россельхознадзором 3.03.2008 г. 14с.

3. «Инструкция по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА», утв. Россельхознадзором 3.03.2008 г., №ПВР-1-1.9/00261. 5с.

4. Технические условия на «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)», ТУ 9388-025-00492374-2007, утв. Россельхознадзором 3.03.2008 г. 17с.

5. «Инструкция по применению набора препаратов для определения в РИГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески», утв. Россельхознадзором 25.04.2008 г., №ПВР-1-1.8/02106. 5с.

6. Технические условия на набор препаратов для определения в РИГА специфических антител у свиней вакцинированных против болезни Ауески, ТУ 9388-007-00492374-2007, утв. Россельхознадзором 25.04.2008 г. 12 с.

7. СТО 00492374-003-2008 на производственный фиксированный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства, утв. директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 08.12.2008

8. «Инструкция по применению набора препаратов для дифференциальной диагностики в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески маркированной вакциной из штамма «ВК», утв. директором ФГБУ « ФЦТРБ-ВНИВИ» 22.10.2009 г. 5с.

9. «Инструкция по применению набора для дифференциальной серологической диагностики бруцеллёза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82», утв. Россельхознадзором 8.07.2010 г., №ПВР-1-6.0/02622. 6с.

10. Технические условия на набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82., ТУ 9388-005-00492374-2009, утв. Россельхознадзором 8.07.2010 г. 17с.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

1. Хисматуллина, H.A. Комплексное изучение бешенства животных и меры борьбы с ним /H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, A.B. Иванов, Л.В. Королева, Р.К. Рафиков // Ветеринария. - 2000. - № 6. - С.21-26.

2. Хисматуллина, H.A. Изучение противовирусной активности

антирабического глобулина и РНКазы Bacillus intermedius при экспериментальном заражении / H.A. Хисматуллина, А.Н. Миронов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - 2008. - Т.191. - С.140-147.

3. Чернов, А.Н. Разработка диагностического набора на основе маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески /А.Н. Чернов, Н.Р. Мифтахов // Ветеринария Кубани. - 2009. - № 6. - С.10-12.

4. Иванов, A.B. Состояние и перспективы изыскания нового поколения вакцин при бруцеллезе животных /A.B. Иванов, K.M. Салмаков, A.M. Фомин, А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. -2009. - № 6. - С.9-12.

5. Плотникова, Э.М. Диагностика бруцеллеза методом иммуноферментного анализа (ИФА) /Э.М. Плотникова, K.M. Салмаков, А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. - 2009. - № 5. - С.30-32.

6. Иванов, A.B. Современные аспекты биобезопасности /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. - 2010. - №5,- С.37-40.

7. Чернов, А.Н. Разработка средства диагностики на основе маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески /А.Н. Чернов, Н.Р. Мифтахов//Ветеринарный врач. - 2010. -№1. - С. 31-32.

8. Плотникова, Э.М. Создание тест - системы для оценки противобруцеллезного иммунитета /Э.М. Плотникова, А.В.Иванов, А.Н. Чернов // Ветеринария. - 2011. - №. 2. - С.29-32.

9. Салмаков, K.M. Усовершенствованная система специфической профилактики и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота с применением живых вакцин из штаммов слабоагглютинногенного В. abortus 82 и инагппотинногенного В. abortus R-1096 / K.M. Салмаков, A.M. Фомин, A.B. Иванов, А.Н. Чернов, Г.М. Сафина, A.B. Салмакова, М.А. Косарев, Н.Ю. Федорова, P.P. Хабибуллин //Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана, 2012. - Т. 211. - С.130-134.

10. Фомин, А.М. Сравнительное изучение антигенных и иммуногенных свойств живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин при вакцинации морских свинок / A.M. Фомин, Г.М. Сафина, М.А. Косарев, Н.Ю.Федорова, А.Н. Чернов, P.P. Хабибуллин //Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. -2012. - Т. 211. - С.170-174.

11. Чернов, А.Н. Особенности эпизоотической ситуации и оценка эффективности вакцинопрофилакгики при болезни Ауески / А.Н. Чернов // Учёные записки: Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - 2013. - Т.213. - С.314-317.

12. Чернов А.Н. Особенности проявления и территориальная приуроченность бешенства в Республике Татарстан /А.Н. Чернов //Ветеринарный врач. - 2013. - №1. - С.31-34 .

Патенты

1. Патент РФ на изобретение №2419096 от 20.05.2011 г. Способ оценки

иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов. Иванов A.B., Плотникова Э.М., Салмаков K.M., Низамов Р.Н., Чернов А.Н.

2. Патент РФ на изобретение №2420309 от 10.06.2011 г. Препарат против бешенства. Иванов A.B., Хисматуллина H.A., Чернов А.Н., Юсупов Р.Х., Миронов А.Н., Гулюкин A.M., Филимонова М.Н.

Публикации в других изданиях

1. Методические указания по лабораторной диагностике бешенства. Утв. Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 14.05.1997 г. H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, С.Р. Янбарисова, Ш.А. Тятигачев, М.А. Селимов, А.Г. Татаров, В .Я. Кармышева, Л.И. Кондакова.

- 11с.

2. Хисматуллина, H.A. Организация проведения оральной иммунизации лисиц / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Ш.А. Тятигачев, И.А. Курбанова // Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: Матер, научно-производ. конф. - Казань, 1997. - С.58-60.

3. Хисматуллина, H.A. Выделение и изучение патогенных и антигенных свойств эпизоотических штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Татарстана и Башкортостана / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, С.Р. Янбарисова, P.A. Тятигачев, Р.К. Рафиков, И.А. Курбанова, A.C. Гизатуллина // Матер. Междунар. координационного совещания.

- Воронеж, 1997. - С.146.

4. Хисматуллина, H.A. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства /H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Матер. Междунар. координационного совещания.

- Воронеж, 1997. - С.77-78.

5. Хисматуллина, H.A. Эпизоотическая ситуация по бешенству в РТ и внедрение рекомендаций по борьбе с этой инфекцией / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, Э.Г. Бурганов // Современные проблемы рабиологии: Матер, науч. конф. посвящ., 80-летию со дня рожд. и 58-летию практич. и науч. деятельности проф. Селимова М.А. - М., 1998. - С.14-15.

6. Хисматуллина, H.A. Взаимосвязь заболеваемости бешенством и плотности популяций дикой фауны в Республике Татарстан /H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, И.А. Курбанова // Матер. Междун. конф., посвящ. 125-летию КГАВМ. - Казань, 1998. - 4.1. - С.107-108.

7. Чернов, А.Н. Изучение патогенных свойств изолятов вируса бешенства, выделенных в эпизоотических очагах Республики Татарстан /А.Н. Чернов // Молодые ученые агропромышленному комплексу: Матер, первой респуб. научно-практ. конф. - Казань, 1998. - С.59.

8. Юсупов, Р.Х. Характеристика изолятов вируса бешенства, циркулирующих в эпизоотических очагах Республики Татарстан /Р.Х, Юсупов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов // Матер, науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С.407-408.

9. Хисматуллина, H.A. Эпизоотолого-эпидемиологическая характеристика бешенства в Республике Татарстан и совершенствование мер борьбы с этой инфекцией / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, A.B. Иванов, Э.Г. Бурганов, М.Ш. Зайдуллин, Р.К. Рафиков, Э.В. Горловская, И.И. Баранчук - Казань: ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 1999. - 59с.

10. Шур алев, Э.А Иммуноферментный анализ гуморального иммунитета у животных при сочетанной иммунизации бруцеллезной вакциной с иммуномодулятором /Э.А. Шуралев, А.Н. Чернов, H.A. Хисматуллина // Диагностика, лечение и профилактика инфекцион. заболеваний: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 50-летию Центра военно-технич. проблем биол. защиты НИИ микробиологии МО РФ. - Екатеринбург, 1999. - С.298-299.

11. Юсупов, Р.Х. Характеристика эпизоотической ситуации по бешенству и меры борьбы в Республике Татарстан /Р.Х. Юсупов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов //Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии: Матер, науч. конф. - Казань, 1999. - С.59.

12. Юсупов, Р.Х. Оценка иммунного статуса у вакцинированных против бешенства животных /Р.Х. Юсупов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов // Актуальные проблемы животноводства и ветеринарии: Матер, науч. конф. -Казань, 1999. - С.58.

13. Иванов, A.B. Эпизоотическая ситуация по инфекционным заболеваниям в Республике Татарстан /A.B. Иванов, А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. -2000.-№3.-С.21-26.

14. Хисматуллина, H.A. Эпизоотолого-эпидемиологическая характерис-тика и надзор за бешенством в Республике Татарстан / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, A.B. Иванов, А.Н. Чернов // Матер. Второго съезда ветеринарных врачей Республики Татарстан (23-25 мая 2000 г.). - Казань, 2000. - С.139-150.

15. Чернов, А.Н., Королева JI.B. Разорвать эпизоотическую цепь /А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. - 2000. -№ 4. - С.35-36.

16. Никитин, А.И. Контроль за безопасностью и качеством продукции / А.И Никитин, А.Н. Чернов // Ветеринарный врач. - 2002. -№ 2. - С.11-12.

17. Хисматуллина, H.A. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор и прогнозирование бешенства в Республике Татарстан / H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, Т.А. Савицкая, М.М. Каримов, A.B. Иванов, А.Н. Чернов,// Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Матер. Междунар. научно-практич. конф., посвящ. 45-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. -С. 107-114.

18. Хисматуллина, H.A. Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изсшятов вируса бешенства / H.A. Хисматуллина, М.М. Каримов, Т.А. Савицкая, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. -2004. -Т.178. - С.156-162.

19. Иванов, A.B. Эпизоотологический и серологический анализ некоторых инфекционных заболеваний свиней на территории РТ и РФ / A.B. Иванов,

Г.Х. Ильясова, Р.Х. Юсупов, Н.В. Роньшина, А.Н. Чернов, Ш.М. Насыров, Д.Н. Латфуллин // Ветеринарный врач. - 2005. - № 1. - С.53-58.

20. Хисматуллина, H.A. Эпизоотическая ситуация и профилактика бешенства лисиц на территории Татарстана /H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов,

A.Н. Чернов, A.B. Иванов, М.Ш. Зайдуллин // Ветеринарный врач. - 2005. -№ 1. - С.53-58.

21. Иванов, A.B. Изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенств /A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, М.Н. Соколов // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей инфекц. заболеваний: Матер. Междунар. симпозиума. - Казань, 2005. - Ч.З. - С.90-92.

22. Иванов, A.B. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор за бешенством: методическое руководство /A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов,

B.В. Морозов, Ф.Ф. Хисамутдинов, А.Н. Чернов, М.М. Каримов, Т.А. Савицкая, В.А. Бирюков, М.Ш. Зайдуллин, Р.К. Рафиков. - Казань: ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2006. - 95с.

23. Иванов, A.B. Диагностика и профилактика бешенства животных /A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2007. - 60с.

24. Хисматуллина, H.A. Бешенство. Этиология. Эпизоотология. Диагностика. Эпизоотологический надзор: Учебно-методическое пособие / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, А.Н. Миронов. - Казань: ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2008. - 56с.

25. Миронов, А.Н. Получение и изучение противовирусной активности антирабического глобулина при экспериментальном заражении белых мышей уличным вирусом бешенством /А.Н. Миронов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008. - Т. 1. - 169-171.

26. Иванов, A.B. Методические рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации болезни Ауески /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, Г.Х. Ильясова, А.Н. Чернов, Ш.М. Насыров, Д.Н. Латфуллин. - Казань: ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 2008. - 17с.

27. Ильясова, Г.Х. Сравнительный анализ способности адаптации делеционного штамма вируса болезни Ауески к перевиваемым клеткам различного происхождения / Г.Х. Ильясова, Т.З. Байбиков, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов, Д.Н. Латфуплин, Н.Р. Мифтахов, Р.Я. Гильмутдинов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008. -Т. 1. -С.157-160.

28. Чернов, А.Н. Заболеваемость животных бешенством в Республике

Татарстан /А.Н. Чернов //Достижения молодых ученых в производство: Матер, научно-практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Х.Х. Абдугшина. - Казань, 2008. - С.181-182.

29. Юсупов, Р.Х. . Возможность дифференциации постинфекционных и поствакцинальных антител при болезни Ауески / Р.Х. Юсупов, Т.З. Байбиков, Г.Х. Ильясова, А.Н. Чернов, Ш.М. Насыров, Д.Н. Латфуллин, Н.Р. Мифтахов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Матер. Междунар. научно - практ. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008. - Т.1. - С.129-132.

30. Иванов, A.B. Обеспечение биологической и токсикологической безопасности свиноводческих предприятий России /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Роль неправительственных научно- общественных организаций в решении проблем, связанных с разработкой и внедрением инновационных технологий: Матер. Междунар. научно-практ. конф. - Казань,

2009.-4.1. - С.244-248.

31. Гулюкин, A.M. Оценка эффективности вакцинопрофилакгики бешенства с помощью иммуноферментной тест-системы /А.М. Гулюкин, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Н.И. Ермакова, В.В. Сабирова // Биотехнология: экология крупных городов: Матер. Московской Междунар. научно-практ. конф. - М., 2010. - С.465-466.

32. Иванов, A.B. Бешенство. Этиология. Эпизоотология. Диагностика: учебно-методическое пособие в иллюстрациях. / A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, A.M. Гулюкин. - М.: «Колос», 2010. - 50 с.

33. Иванов, A.B. Биотехнологические основы изготовления инакгивированной вакцины против болезни Ауески /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Природоохранные биотехнологии: Матер.науч.конф., посвящ. 70-летию Морозова Н.В. - Казань, 2010. - С.76-83.

34. Иванов, A.B. Бруцеллез животных и перспективы его специфической профилактики /A.B. Иванов, K.M. Салмаков, Р.Х. Юсупов, A.M. Фомин, А.Н. Чернов // Инновации РАН: Матер, ежегодной научно-практ. конф.-Казань, 2010. - С.359-363.

35. Иванов, A.B. Иммунологический и эпизооголого-эпидемиологический мониторинг бешенства в Республике Татарстан / A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50- летаю ФЦТРБ-ВНИВИ. - Казань,

2010. - С.382-388.

36. Иванов, A.B. Агауальные проблемы биологической безопасности / A.B. Иванов, A.A. Иванов, А.Н. Чернов // Ветеринарна медицина 94: М1жвщомчий тематичний науковий збфник. - Харюв, 2010. - С.28-30.

37. Мифтахов, Н.Р. Разработка диагностикума нового поколения на основе маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески для

дифференциации постинфекционных и поствакцинальных антител / Н.Р. Мифтахов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50- летию ФЦТРБ-ВНИВИ. - Казань, 2010. - С.419-421.

38. Плотникова, Э.М. Иммуноферментная тест-система для индикации бруцеллезного токсического антигена / Э.М. Плотникова, K.M. Салмаков, A.A. Иванов, А.Н. Чернов // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Матер. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ. - Казань, 2010. - С.455-461.

39. Хисматуллина, H.A. Оценка гуморального иммунитета у поголовья свиней, вакцинированных против болезни Ауески и классической чумы свиней в различных хозяйствах Республики Татарстан / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Ш.М. Насыров, А.З. Гафарова, Д.Н. Латфуллин, Н.Р. Мифтахов // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней: Матер, ведущих ученых России и Зарубежья. Вып. 3. - Екатеринбург, 2010. -С.258- 261.

40. Хисматуллина, H.A. Оптимизация условий постановки метода иммуноферментного анализа для обнаружения специфических антител к вирусу болезни Ауески / H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, А.З. Гафарова, Ш.М. Насыров, Н.Р. Мифтахов // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Матер. Междунар. научно- практ. конф., посвящ. 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ. - Казань, 2010. - С.343-345.

41. Хисматуллина, H.A. Изучение биологических и молекулярно-генетических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Татарстана /H.A. Хисматуллина, Т.Х. Фаизов, А.Н. Чернов, Н.И. Ермакова // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Матер. Междунар. научно- практ. конф., посвящ. 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ. - Казань, 2010. - С.497-499.

42. Иванов, A.A. Приоритеты для обеспечения биологической безопасности /A.A. Иванов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций: Матер, научно-практ. конф. - Казань, 2011. -С.41-42.

43. Иванов, A.B. Болезнь Ауески: совершенствование средств диагностики /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, А.Н. Чернов // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. Московской Междунар. научно-практ. конф. - М., 2011. - 4.1. - С.205-206.

44. Иванов, A.B. Бешенство. Этиология. Эпизоотология. /A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, A.M. Гулюкин //Диагностика и меры борьбы: плакат. - М., 2011. -1 с.

45. Иванов, A.B. Биологические свойства штаммов вируса бешенства / A.B. Иванов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов //Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. Московской

Междунар. научно-пракг. конф. - М., 2011. - 4.1. - С.204- 205.

46. Плотникова, Э.М. Определение чувствительности первично-трипсинизированной культуры клеток ЛЭК к вирусам /Э.М. Плотникова, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, А.Н. Чернов // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. Московской Междунар. научно-пракг. конф. - М., 2011. - 4.1. - С.216-217.

47. Юсупов, Р.Х. Ветеринарное благополучие свиноводческих хозяйств и защита от инфекций в рамках ВТО / Р.Х. Юсупов, Г.Р. Юсупова, А.И. Гиндуллин, А.Н. Чернов // Современные направления совершенствования экономики субъектов Российской Федерации в условиях деятельности ВТО на примере Республики Татарстан: Матер. Междунар. научно-практ. конф. - Казань, 2012. - С.208-212.

48. Иванов, А.В. Федеральный центр в области биотехнологий /А.В. Иванов, Чернов А.Н. // Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Матер. Междунар. научно-практ. конф. - М., 2012. - С. 300-301.

49. Хисматуллина, Н.А. Разработка и применение средств и методов диагностики бешенства / Н.А. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов, A.M. Гулюкин, В.В. Сабирова, А.З. Гафарова, М.Ш. Насыров, М.И. Маркова, Т.П. Петрова, Г.М. Яруллина // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: Матер. Междунар. научно- практ. конф. - Щелково, 2012. - С.146-152.

50. Чернов, А.Н. Изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Республики Татарстан / А.Н. Чернов //Микробиология в современной медицине: Матер, научно- практ. конф. - Казань, 2013. - С.34-37.

51. Khismatullina, N.A. Prognostic modeling of rabies epizootics in Tatarstan accoding to biotic and abiotic factors /N.A. Khismatullina, T.A. Savitskya, I.D. Sitdikova, R.H. Yusupov, A.V. Ivanov, A.N. Chernov // Rabies in Europe: First International Conference . 15-18 June 2005. - Kiev, 2005. - P.23-24.

52. Khismatullina, N.A. Elaboration of an immuno-enzyme assay test system for control of abies vaccinoprophylaxis efficacy /N.A. Khismatullina, T.A. Savitskya, R.H. Yusupov, A.N. Chernov, V.G. Gumerov // Rabies in Europe: First International Conference. 15-18 June 2005. - Kiev, 2005. - P.70-71.

53. Khismatullina, N.A. Epizootic situation and fox rabies prophylaxis in Tatarstan /N.A. Khismatullina, R.H. Yusupov, A.V. Ivanov, A.N. Chernov, M.Sh. Zaydullin // Rabies in Europe: First International Conference. 15-18 June. -Kiev,2005. - P.27-28.

54. Khismatullina, N.A. Epizootic situation and fox rabies prophylaxis in Tatarstan /N.A. Khismatullina, RH. Yusupov, A.V. Ivanov, A.N. Chernov, M. Sh. Zaydullin // Dev.Biol. Basel, Karger. - 2006. - V.125. - P.41-49.

Подписано в печать 06.06.2013 г. Заказ № 116. Тираж 120. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать-ризография. Печл. 2,9 Отпечатано в типографии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань, Научный городок - 2

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Чернов, Альберт Николаевич, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОНОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

05201351544

На правах рукописи

ЧЕРНОВ АЛЬБЕРТ НИКОЛАЕВИЧ

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА, БОЛЕЗНИ АУЕСКИ И БРУЦЕЛЛЕЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: Член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор Иванов A.B.

Казань-2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АГ - антиген;

AT - антитела;

AB - антирабическая вакцина;

АГ-ИФА - антиген для ИФА;

А.О. - автономный округ;

АГГ - антирабический гамма-глобулин;

БА - болезнь Ауески (псевдобешенство);

БСА - бычий сывороточный альбумин;

БУК-628 - вакцинный штамм вируса болезни Ауески;

ВБ - вирус бешенства;

ВБА - вирус болезни Ауески;

ВНА - вируснейтрализующие антитела;

ВНИВИ - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт;

ВНИТИБП - Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности;

ВНК-21 - перевиваемые клетки почек сирийского хомячка;

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ВП - ветеринарные правила;

ГП - гликопротеин;

ИВС - индекс веса селезенки;

ИИ - индекс инфицированности;

ИФ - иммунофлуоресценция;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер;

КГ - конъюгат;

кД - килодальтон;

КДТЛ - коэффициент дифференцировки Т-лимфоцитов;

КК - культура клеток;

ККФ - культура клеток куриных фибробластов;

КРС - крупный рогатый скот;

КС - комплементсвязывающий;

КСА - комплементсвязывающие антитела;

Ксп - коэффициент специфичности;

м.м. - молекулярная масса;

мАТ - моноклональные антитела;

МЕ - международная единица;

МКА - моноклональные антитела;

МО - муниципальное образование

МРС - мелкий рогатый скот;

МФА - метод флуоресцирующих антител;

МЭБ - международное эпизоотическое бюро;

НАФ - неполный адъювант Фрейнда;

НБ - нейробластома;

НГУК- 1 - культура клеток невриномы Гассерова узла крысы;

НИФА - непрямой иммуноферментный анализ;

НК - нуклеокапсидный комплекс;

НМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител;

НПО - научно-производственное объединение;

нтд - нормативно-техническая документация;

01Т490 - оптическая плотность при 490 нм;

ОСО - отраслевой стандартный образец;

П/В - дни после вакцинации;

им - дни после иммунизации;

ПА - преципитирующие антитела;

ПАФ - полный адъювант Фрейнда;

ШИ I А - печеночно-пептонный глюкозо-глицериновый агар;

ПТТГГБ - печеночно-пептонный глюкозо-глицериновый бульон;

ПХ - пероксидаза хрена;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЧ - пенициллин-чувствительный;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РА - реакция агглютинации;

РБП - Роз-бенгал проба;

РВН - реакция вируснейтрализации;

РДП - реакция диффузной преципитации;

РДСК - реакция длительного связывания комплемента;

РИД с О-ПС - реакция иммунодиффузии с олиго-полисахаридным

антигеном антигеном;

РИФ - реакция иммунофлюоресценции;

РК-15 - перевиваемые клетки почек поросят;

РН - реакция нейтрализации;

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации;

РСК - реакция связывания комплемента;

РСК-8 - реакция связывания комплемента с единым бруцеллёзным

антигеном;

РТ - Республика Татарстан;

РФ - Российская Федерация;

С.-Х. - сельскохозяйственный;

СКГЖ - сыворотка крови плода коров;

СП - санитарные правила;

СПФ морские - СПФ морские свинки - морские свинки, свободные от

свинки патогенной (микро-)флоры;

СПЭВ - перевиваемые клетки почек эмбрионов свиней;

ТУ - технические условия;

ТЦЦ - тканевая цитопатическая доза;

ФА - непрямой метод флюоресцирующих антител;

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение;

ФИТЦ - флюоресцеинизоционат;

ФНО-Р - фактор некроза опухолей - (3.

ЦНС - центральная нервная система;

ЦПД - цитопатогенное действие;

ЧСА - сывороточный альбумин человека;

ЭД - эритроцитарный диагностикум;

ЭМ - электронная микроскопия;

60Со - радиоактивный изотоп кобальта;

CVS - стандартный штамм вируса бешенства «challenge virus standard»;

Dot-ELISA - точечный иммуноферментный анализ;

G - белок G гликопротеина;

RABV - rabies virus;

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 9

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

1.1 Распространение бешенства в странах мира, СНГ и РФ 15

1.2 Распространение болезни Ауески в странах мира, СНГ и РФ 32

1.3 Распространение бруцеллеза в странах мира, СНГ и РФ 38

1.4 Морфология и основные свойства вируса бешенства 49

1.5 Возбудитель болезни Ауески и его характеристика 53

1.6 Краткая характеристика бруцелл и их изменчивость 58

1.7 Методы лабораторной диагностики бешенства 63

1.8 Методы лабораторной диагностики болезни Ауески 75

1.9 Методы лабораторной диагностики бруцеллеза 78

1.10 Профилактика и меры борьбы с бешенством 82

1.11 Профилактика и меры борьбы с болезнью Ауески 88

1.12 Профилактика и меры борьбы с бруцеллезом 97

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 106 2.1 Материалы и методы исследований 106

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 111 3.1 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации и совершенствование мер борьбы с бешенством в Российской Федерации и Республике Татарстан 111

3.1.1 Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации в Российской Федерации по бешенству 111

3.1.2 Характеристика эпизоотической ситуации, заболеваемости и территориальной приуроченности по бешенству в Республике Татарстан 116

3.1.3 Изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства 130

3.1.4 Разработка и усовершенствование высокоэффективных

средств диагностики бешенства на основе МФА и ИФА 134

3.1.5 Определение антирабического эффекта эндонуклеазы 137

3.1.6 Серологический контроль эффективности вакцинопрофилактики бешенства крупного рогатого скота 141

3.1.7 Усовершенствование системы противоэпизоотических мероприятий в Республике Татарстан при бешенстве 143

3.2 Анализ эпизоотической ситуации и совершенствование мер борьбы с болезнью Ауески в Российской Федерации 147

3.2.1 Анализ эпизоотической обстановки по болезни Ауески в России 147

3.2.2 Серологический мониторинг эффективности вакцинопрофилактики болезни Ауески в Республике Татарстан 151

3.2.3 Изучения репродукции вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «ВГНКИ» на культурах клеток 154

3.2.4 Разработка технологии изготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для РИГА на основе штаммов «ВГНКИ» и «ВК» вируса болезни Ауески 160

3.2.5 Определение активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов на основе штаммов «ВГНКИ» и «ВК» вируса болезни Ауески 166

3.2.6 Сравнительная оценка эффективности РВН и РНГА с использованием маркированного штамма «ВК» вируса болезни Ауески при определении антител в сыворотках крови иммунизированных животных 169

3.2.7 Определение активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов, с целью дифференциации поствакцинальных антител вируса болезни Ауески 173

3.3 Анализ эпизоотической ситуации и совершенствование мер борьбы с бруцеллезом в Российской Федерации 176

3.3.1 Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу в России 176

3.3.2 Изучение антигенных и иммуногенных свойств живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин 184

3.3.3 Разработка метода оценки иммуногенности противобруцеллезных вакцинных штаммов 194 3.3.4. Разработка набора препаратов для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной

из штамма В. abortus 82 199

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 201

ВЫВОДЫ 246

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 250

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 252

ПРИЛОЖЕНИЯ 301

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. По данным международных организаций МЭБ и ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется свыше 500 тыс. очагов инфекционных заболеваний, экономические потери от болезней животных составляют до 20% стоимости продукции в промышленно развитых странах и до 40% - в развивающихся. Несмотря на достигнутые успехи в профилактике инфекционных болезней, в том числе бешенства, болезни Ауески (БА) и бруцеллеза, эпизоотическая обстановка по данным инфекционным заболеваниям в Российской Федерации остается напряженной.

возбудителя бешенства и изучении его биологических свойств, а также контроле за иммунным состоянием животных, вакцинированных против бешенства (Авилов В.М. и соавт., 1998; Полюшкина Г.С. и соавт., 1998).

Цель и задачи исследований. Цель исследований - анализ эпизоотический ситуации и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

3. Разработать и внедрить высокоэффективные средства диагностики бешенства на основе МФА и ИФА;

4. Изучить чувствйтельность культур клеток к штаммам вируса болезни Ауески, эффективность вакцинопрофилактики в свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан;

5. Разработать диагностические наборы на основе штаммов «ВГНКИ» и делеционнош по гликопротеину gE штамма "ВК" вируса болезни Ауески;

7. Разработать и внедрить тест- Систему для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В. abortus 82.

Научная новизна. Представлена эпизоотологическая характеристика по бешенству, болезни Ауески, бруцеллезу в РФ; проведен анализ распространения рабической инфекции на территории Республики Татарстан за 1970-2012 гг.; установлен уровень заболеваемости сельскохозяйственных, диких и домашних животных в разрезе муниципальных районов; разработаны карты эпизоотологического районирования территории; изучена периодичность и сезонность проявления рабической инфекции; изучены некоторые биологические свойства изолятов вируса бешенства, выделенных на территории республики и установлено их антигенное сходство с вакцинным штаммом. Изучена чувствительность культур клеток к штаммам вируса болезни Ауески, эффективность вакцинопрофилактики в свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан. Впервые разработана технология изготовления эритроцитарного

диагностикума на основе делеционного по гликопротеину gE вируса болезни Ауески, обеспечивающий дифференцированное выявление поствакцинальных и постинфекционных антител при указанной инфекции. Изучены антигенные и иммуногенные свойства живых и гамма-инактивированных противобруцеллезных вакцин, разработан метод оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл, усовершенствована система специфической профилактики и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота с применением живых вакцин из штаммов слабоагглютинногенного B.abortus 82 и инагглютинногенного B.abortus R-1096.

Теоретическая и практическая ценность работы заключается в том, что на основе проведенных научных исследований, разработаны и усовершенствованы средства эпизоотологического и иммунологического мониторинга бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза, которые зарегистрированы в РФ, внедрены и востребованы производством: «Флуоресцирующий антирабический глобулин»; «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)»; «Набор препаратов для определения в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески»; «Набор препаратов для дифференциальной диагностики в РНГА специфических антител у свиней, вакцинированных против болезни Ауески маркированной вакциной из штамма «ВК»; «Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллёза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82».

Результаты исследований используются на курсах повышения квалификации

по специальности ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и иммунология в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Основные положения, выносимые на защиту:

- характеристика эпизоотической ситуации по бешенству, болезни Ауески и бруцеллезу в РФ;

- разработка на основе МФА и ИФА усовершенствованных средств диагностики бешенства; '

- характеристика чувствительности культур клеток к вирусу болезни Ауески;

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2012 гг.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы здоровья скота, завозимого в Россию в рамках национального проекта «Разв�

Информация о работе

Чернов, Альберт Николаевич
доктора биологических наук
Казань, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Эпизоотологический мониторинг и разработка средств диагностики бешенства, болезни Ауески и бруцеллеза - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы