Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные аспекты патогенеза филовирусных геморрагических лихорадок

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные аспекты патогенеза филовирусных геморрагических лихорадок"

г г в од

На правах рукописи

Рябчикова Елена Ивановна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ФИЛОВИРУСНЫХ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК

03.00.06 - вирусология 03.00.11 - гистология, эмбриология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцово,1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Научный консультант: доктор биологических наук

профессор Виноградова М.С.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Новиков В.Д.

доктор биологических наук Локтев В.Б.

доктор медицинских наук Максимов В.Ф.

Ведущая организация: Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Защита состоится 2 октября 1997 г. в 9.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 074.20.01 в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор". 633159 Новосибирская обл. п.г.т. Кольцово

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек . осударственного научного центра вирусологии и биотехнологи "Вектор".

Автореферат разослан — -------------------1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного сов

[убина Т.Н.

ОВЦА Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность иссдедования. Геморрагические лихорадки Царбург и Эбола - особо опасные вирусные инфекции, требующие постоянной эпидемиологической настороженности. В последние годы опасность новых вспышек повышается, о чей свидетельствуют данные ВОВ за 1995-1995 гг. Случаи филовирусных геморрагических лихорадок локализованы главным образом в Африке, однако их "завоз" с обезьянами в Европу и США показывает, что ни одна страна не гарантирована от "импорта" атих инфекций [Buchmeier M.J., 1984; Gelsbert T.W. et al., 1992; Georges A.J. et al., 19961. Высокая опасность филовирусных инфекции требует создания надежных и эффективных средств специфической профилактики и лечения, разработка которых невозможна без знания механизмов патогенеза заболевания. Сведения о развертывании патогенетического процесса в организме на органном, тканевом и клеточном уровне необходимы для поиска и разработки эффективных лечебных и профилактических препаратов. Необходимость исследования патологических процессов на этих уровнях, диктуется прежде всего самим характером взаимодействия вирус-организм, -характером облигатного генетического паразитизма. Для выздоровления необходимо уничтожить зараженные клетки, соответственно, нудно правильно их идентифицировать. Тканевой и клеточный уровень исследования позволяют не только идентифицировать зараженные клетки, но. и дифференцировать первичные изменения, вызываемые инфицированием клеток вирусами от вторичных, развивающихся вследствие интоксикации организма и нарушений регуляции. Субмикроскопические размеры вирусов, в свою очередь, диктуют необходимость широкого применения методов электронной микроскопии. Электронная микроскопия - единственный метод, позволяющий визуализировать ви-русны и точно идентифицировать зараженные клетки.

Цель иссдедования: изучение патогенеза экспериментальных инфекции у морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Марбург и Эбола.

Задачи иссдедования:

1. Изучение морфогенеза вирусов Марбург и Эбола.

2. Изучение репродукции вируса Эбола и патологических изменений внутренних органов у зараженных неадаптированным штаммом морских свинок.

3. Анализ механизмов изменения вирулентности вируса Эбола для морских свинок в ходе последовательных пассажей.

4. Изучение особенностей поражения внутренних органов и репродукции вируса Ыарбург у морских свинок при различных способах заражения.

5. Изучение патологических изменений внутренних органов в динамике филовирусных инфекции у морских свинок и обезьян.

6. Идентификация клеток-мишеней, поддергивающих репродукции вирусов Ыарбург и Эбола у морских свинок и обезьян.

7. Изучение динамики вовлечения органов и клеточных систем в репродукцию вирусов Ыарбург и Эбола у зараженных морских свинок и обезьян.

8. Изучение патологических изменений кроветворения, крови и кровоснабжения при экспериментальных филовирусных инфекциях.

9. Изучение изменений органов и клеток лимфоидной системы у заракенных вирусами Ыарбург и Эбола морских свинок и обезьян.

Научная новизна исследования.

В данной работе впервые применены методы световой и электронной микроскопии для системного изучения динамики инфекционного процесса 1п vivo. Диссертация является первым исследованием структурных аспектов патогенеза геморрагических лихорадок Ыарбург и Эбола, проведенным на различных экспериментальных моделях. Впервые дана комплексная оценка деструктивных изменений органов н репродукции вирусов, выявлена роль различных клеточных систем организма в развитии инфекционного процесса.

Впервые установлено, что:

- рецептивный эндоцитоз является основным путем проникновения вируса Ыарбург в клетки, тогда как вирус Эбола проникает в клетки посредством слияния с плазыалеммой; вироплазма имеет разную структурную организацию у вирусов Ыарбург и Эбола;

- у морских свинок, зараженных неадаптированным штаммом вируса Эбола, развивается острое гранулемоподобное воспаление печени, повреждения других внутренних органов незначительны. Репродукция вируса ограничена клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СЫЭ);

- существует гетерогенность неадаптированного к морским свинкам вируса Эбола по характеру взаимодействия с клетками Ш> этих животных;

- в ходе последовательных пассажей на морских свинках в репродукции вируса Эбола, помимо клеток СЮ, вовлекаются гепатоциты, клетки коры надпочечников, фибробласты и зндотелиоциты. Повышение

вирулентности вируса Эбола в ходе пассажей сопровождается нарас-таниеы степени патологических изменений внутренних органов и исчезновением воспалительной реакции'в печени;

- при аэрозольном,заражении морских свинок вирусом Марбург, в отличие от внуприбртаинного, развивается реакция лейкоцитов на зараженные гепатоциты, однако не приводящая к их деструкции;

- первыми клетками-мишенями, репродуцируюсзми вирусы Марбург и Эбола, у морских свинок и обезьян являются клетки CMS, независимо от способа заражения;

- набор клеток, репродуцирующих филовирусы, и последовательность их вовлечения в размножение вирусов одинаковы у морских свинок и обезьян (1. клетки СНФ; 2. гепатоциты и клетки коры надпочечников; 3. эндотелиоциты и фибробласты);

- до выявления вируса в крови наблюдаются патологические изменения в системе микроциркуляторного русла внутренних органов и в строении лимфоидных органов зараженных вирусами Марбург и Эбола обезьян и морских свинок;

- существуют видовые различия в характере деструктивных изменений кровеносного русла у обезьян, зараженных вирусом Эбола: генерализованное выпадение фибрина в кровеносном русле происходит у зеленых мартышек и макак резус. Геморрагии развиваются у павианов гамадрилов. У циномольгусов эти явления не обнаружены;

- при заражении вирусами Марбург и Эбола у всех исследованных видов животных развиваются выраженные повреждения системы микроциркуляторного русла, свидетельствующие о нарушении кровоснабжения внутренних органов;,

- на терминальных стадиях филовирусных инфекций наблюдаются деструктивные, изменения в легких, указывающие на нарушение газообмена и не связанные с воспалительной реакцией;

- у морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Марбург и Эбола, разрушается строма красного костного мозга, отсутствуют признаки лимфо- и моноцитопозза, нет формирования структурно полноценных кровяных пластинок;

- у экспериментальных животных, зараженных филовирусами, наблюдаются морфологические признаки нарушения функций иммунитета: нет реакции лейкоцитов на инфицированные клетки; во всех местах анатомической локализации лимфоидной ткани отсутствуют митозы и признаки плаамацитогенеза; разрушаются клетки стромы СДО и, в том числе, дендритные (антиген-представляющие) клетки;

- заражение филовирусаыи приводит к генерализованному разрушению клеток СУФ морских свинок и обезьян.

Теоретическая и практическая значимость.

Данная работа является первым исследованием динамики размножения вируса и патологических изменений у зараженных вирусами Марбург и Эбола разных видов экспериментальных животных. В работе идентифицированы клетки-мишени для филовирусов, дана детальная характеристика процесса размножения вирусов в организме и развития деструктивных изменений. Показана ведущая роль клеток СМФ в патогенезе филовирусных инфекций. Полученные сведения не только проясняют механизмы развития филовирусных геморрагических лихорадок, но и полезны для понимания механизмов патогенеза вирусных инфекций в целом. Результаты данного исследования могут быть ис-пользоваш в курсах вирусологии и медицинской вирусологии в учебных ааведениях; при составлении учебников и лабораторных методик. Установленные звенья патогенеза и видовые различия в характере поражения органов у животных, зараженных филовирусами, позволят адекватно выбирать экспериментальные модели, в зависимости от поставленных задач. Это дает возможность оптимизировать проведение экспериментов и снизить их стоимость. Полученные в работе сведения о наборе клеток-мишеней для филовирусов использованы при математическом моделировании инфекционного процесса у зараженных филовирусами животных для теоретической оценки эффективности противовирусных препаратов [Чермааенцев В.Н. и др., 1993].

Полученные данные о наборе клеток-мишеней и последовательности их вовлечения в репродукцию филовирусов могут быть применены при разработке лекарственных препаратов направленного действия, блокирующих размножение вирусов Иарбург и Эбола. Данные о последовательности вовлечения внутренних органов в инфекционный процесс и о характере их патологических изменений ютут быть использованы при проведении лечебных мероприятий в клинике.

Положения, выносимые на защиту.

1. При заражении экспериментальных животных вирусами Ыарбург и Эбола первичными кяетками-мишенями являются метки СШ, Вторым звеном, обеспечивающим наработку вирусных частиц, являются гепа-тоциты и паренхиматозные клетки коры надпочечников. Зараженные фибробласты и эндотелиоциты немногочисленны и не вносят заметного вклада в наработку вируса. Диесеминация вируса происходит посредством вирусных частиц и зараженных клеток СШ>, мигрирующих в

- 7 -

паренхиму.и интерстиций внутренних органов.

2. У морских свинок, зараженных неадаптированным птаммом вируса Эбола, раамнсшение вируса ограничено клетками СМФ и вызывает острое гранулемоподобное воспаление печени. Популяция неадаптированного к морским свинкам вируса ЗОода гетерогенна по характеру взаимодействия с клетками С!® этих, животных. Адаптация вируса Збола к морским свинка» посредством последовательных пассадей сопровождается а), вовлечением в репродукции вируса гепатоцитов, клеток коры надпочечников, фибробластов и клеток эндотелия; б), нарастанием степени патологических изменений внутренних органов; в). исчезновением реакции лейкоцитов на зараженные клетки.

3. Повреждения микроциркуляторного русла внутренних органов, ведущие к нарушению кровоснабжения, являются опережающими по отношению к изменениям паренхиматозных клеток и стромы при летальной форме филовирусных инфекций. Деструктивные'изменения паренхиматозных клеток индуцируются главным образом гуморальными токсическими факторами, а не размножением вируса. Наиболее выраженные деструктивные изменения происходят в печени, селезенке, почках, надпочечниках, красном костном мозге и легких.

А. Филовирусы вызывают выраженные повреждения строш красного костного ыозга, блокирование люфу- и ионоцнтошзза, и нарушение формирования структурно полноценных кровяных пластинок.

5. У морских свинок и обеаьян^ заратанных вирусами Марбург и Збола, наблюдаются морфологические признаки генерализованного поражения иммунной системы: отсутствует реакция лейкоцитов на зараженные клетки, во всех местах анатомической локализации лкьй&оид-ной ткани отсутствуют митозы лимфоидных клеток и плазмацитогевез, разрушаются клетки строш и клетки СУФ, в том числе дендритные.

6. Генерализованное заражение клеток СМФ вирусами Марбург и Збола играет ключевую роль в патогенезе экспериментальных филовирусных инфекций, обусловленную ведущей ролью этих клеток в регуляции различных физиологических, иммунных и патофизиологических реакций. По своей сути филовирусные геморрагические лихорадки являются болезнью макрофагальной системы.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения проведенного исследования доложены и обсуждены на международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и проблемам СЗВДа (Ленинград, 1991); на конференции "Микроскопические аспекты патогенеза вирусных инфекций"

(Новосибирск, 1391); на Х1У конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1992 г); на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); на конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии" (Покров, 1992); на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" (Кольцово, 1993); на конференции "Проблемы экспериментальной и клинической лшфологии" (Новосибирск, 1994); на III съезде анатомов, гистологов, эмбриологов Российской федерации (Тюмень, 1994); на Ninth International Conference of Negative Strand Viruses (Estoril, Portugal; 1994).; на 7th International Conference of Comparative and Applied Virology (Montreal, Quebec, Canada; 1994); на I Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Medical Treatment (Splez, Switzerland, 1994); на ' Xth International Congress "Aerosols in Medicine" (Hamilton, Canada, 1995); на II Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Medical Treatment (Spies, Switzerland, 1996); на International Colloquium on Ebola virus research (Antwerp, Belgium; 1996); на Russian-German Colloquium on Fllovlruses: the Modern State of Problem (Koltsovo, 1997).

Публикации. Автором опубликовано по теме диссертации 39 научных работ, из них 13 статей и глава в сборнике "Current Topics In Microbiology and Immunology".

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из двух томов. Первый том содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, шесть глав результатов собственных исследований и обсуждений, десять таблиц, две схемы, заключение и вывода (171 страница), а также список использованной литературы, включающий 63 отечественных и 238 зарубежных источников. Второй том со-. держит иллюстрации (98 микрофотографий).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Вирусы Ыарбург (штамм Рорр) и Эбола (штамм Заир) применяли в виде lOZ-й суспензии печени морских свинок (седьмого или восьмого пассажа) и зеленых мартышек (третий пассаж), соответственно.

Культура клеток Vero, нелинейные морские свинки весом 180-200 г и 250-300 г; беспородные шши сосунки и куриные эмбрионы четырех-пяти сут развития были получены из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ "Вектор". Зеленые мартышки (Cercopitecus

aethíops); макаки резусы (Macaca mulatta); павианы гамадрилы (Paplo hamadryas) и яванские макаки (циномольгусы) (Macaca fasclcularls) были получены из Сухумского заповедника и питомника лабораторных животных ГВД ВБ "Вектор".

Инфекционную активность вирусов Ыарбург и Эбола определяли in vltrc методом негативных колоний на культуре клеток Vero под полужидким агаровым покрытием, внося по 0,2 ил исследуемого препарата. In vivo инфекционную активность вируса Марбург определяли при внутрибршинном (в/б) заражении морских свинок по 0,5 мл препарата, а вируса Эбола - при интрацеребральном заражении мышей-сосунков и при в/б заражении морских свинок, вводя им по 0,05 и 0,5 мл исследуемого препарата, соответственно. Величину ЛД50. ИД50 (по изменению температуры) и БОЕ для обоих вирусов рассчитывали по методу Спирмана-Кербера.

Исследование репродукции вирусов Марбург и Эбола In vitro.

Перитонеальные макрофаги морских свинок получали и культивировали по общепринятой методике, мононуклеарные клетки крови выделяли в градиенте фиколл-верографин [Никитин В.М., 1982]. Адсорбцию вируса Ыарбург проводили при множественности заражения (ЫЗ) 1:1, 1:10, 1:100 (вирус/макрофаг) при 20°С. Пробы брали через 24 часа на протяжении 9 сут, определяли активность вируса методом бляшек и проводили ультраструктурное исследование.

Морфогенез вирусов Марбург и Эбола в клетках культуры Vero изучали через 24, 48 и 72 ч после заражения с множественностью 100 БОЕ/клетку.

Исследование филовирусной инфекции In vivo.

Опыт 1. Куриных эмбрионов заражали в тело вирусом Эбола в дозе 100 БОЕ. Ежедневно, с пятых по восьмые сут после заражения, 3-5 эмбрионов фиксировали для микроскопического изучения.

Опыт 2. Морских свинок заражали в/б по 106,5ДЦ5о для мышей-сосунков неадаптированным вирусом Эбола. Забивали по 3-4 свинки ежедневно со второго по девятый дни после заражения, а также на двенадцатый, пятнадцатый и двадцатый дни. Контроль: 3 свинки, которым в/б вводили 0,5 мл гомогената печени интактных морских свинок, а также 3 свинки, которым вводили разводящую жидкость. Контрольные животные забиты через 7 сут после заражения. Образцы печени, селезенки, легких, почек и брыжеечных лимфоузлов фиксировали для микроскопического изучения.

Опыт 3. Последовательное пассирование вируса Эбола проводили

на морских свинках весом 180-200 г. Животным в/б вводили по 1 мл 101-ого гомогената печени свинок предыдущего пассажа. На каждом пассаже определяли инфекционную активность вируса в печени. Для микроскопического исследования отбирали образцы органов (как в опыте 2) в течение семи последовательных пассажей.

Опыт 4. Динамику патологических изменений и репродукции вируса Марбург при в/б заражении изучали на взрослых морских свинках, зараженных в дозе 100 ДЦ50 (для данного вида). Ежедневно, начиная со вторых суток после заражения, отбирали кровь и образцы печени для определения инфекционной активности вируса, а также кусочки печени, селезенки, почек, легких и брыжеечных лимфоузлов для микроскопического исследования.

Опыт 5. Репродукцию вируса Ыарбург и патологические изменения печени и селезенки морских свинок изучали с восьмого по двенадцатый пассаж, вводя животным в/б по 1 мл 10%-ого гомогената печени животных предыдущего пассажа.

Опыт 5. Ыорских свинок аэрозольно (а/з) заражали вирусом МарОург в дозе 2-5 респираторных ЛДбо- Инфекционную активность вируса в крови, носоглоточных и бронхоальвеолярных смывах, и во внутренних органах определяли через 16, 24, 32, 40, 48 и 56 ч, и через 3, 4, 6 и 9 сут после заражения. Образцы бронхоальвеолярных смывов для микроскопического изучения фиксировали через 40, 48, 56 и 72 ч, а внутренних органов - через 3, 4, 6 и 9 сут.

Опыт 7. Место введения вируса Эбола на наружной поверхности бедра задней ноги морских свинок выбривали и метили пикриновой кислотой. На глубину 1 см вводили 0,2 мл 101 гомогената печени свинок (200 ЛД50 для морских свинок). Животных забивали через 1,2,4,12,24,36 и 48 ч. Ыесто введения, подкожные и паховые лимфоузлы фиксировали для микроскопического изучения.

Опыт 8. Динамику патологических изменений внутренних органов и репродукцию вируса Ыарбург изучали на зеленых мартышках, зараженных е/6 в дозе 100 ЛД50 для морских свинок. Ежедневно (со вторых по восьмые сут) отбирали образцы печени и крови для определения инфекционной активности вируса, а также кусочки печени, почек, селезенки, легких и брыжеечных лимфоузлов для микроскопического исследования.

Опыт 9. Динамику патологических изменений внутренних органов и репродукцию вируса Эбола изучали на зеленых мартышках, зараженных подкожно (а/к) по 100 ЛДбо для данного вида. Животных забива-

ли ежедневно,, со вторых по восьмые сут. В данном и нижеперечисленных опытах для микроскопического исследования фиксировали образцы печени, селезенки, брыжеечных и паховых лимфоузлов, почек, легких, надпочечников, сердца, тонкого и толстого кишечника, поджелудочной и слюнных делеа.

Опыт 10. Характер патологических изменений внутренних органов и размножение вируса Эбола при разных способах заражения изучали на зеленых мартышках, которых заражали п/к, в/б, интратрахе-ально и внутрижелудочно по 100 ДЦ50. Немедленно после гибели обезьян вскрывали и образцы внутренних органов фиксировали для микроскопического исследования.

Опыт 11. Биохимические и коагуляционные параметры крови изучали у зараженных вирусом Эбола (20-50 ДЦ50) павианов гамадрилов, пробы отбирали ежедневно. Подсчитывали содержание форменных элементов крови. В сыворотке определяли: содержание обцего белка и белковых фракций; -липопротеидов, билирубина,.креатинина, мочевины, С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов, активность аланинаыинотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и тимоловую пробу, а также тромбиновый и протромбиновый индекс, этано-ловый тест, содержание фибриногена и продуктов деградации фибрина. Образцы для микроскопического исследования отбирали немедленно после гибели животных.

Опыт 12. Характер патологических изменений внутренних органов и размножение вируса Эбола исследовали у зараженных 1-10 ДЦ50 вируса Эбола зеленых мартышек, макак резусов, павианов гамадрилов и макак циномольгусов. Образцы органов немедленно после гибели фиксировали для микроскопического исследования.

Всего микроскопическими методами были изучены образцы внутренних органов от 161 морской свинки и 66 обезьян.

Микроскопическое исследование. Морских свинок умерщвляли эфиром или хлороформом, обезьян - в/в введением 3 мг/кг кадлипсо-ла, вскрывали сразу после наступления смерти.

Монослой клеток механически снимали со стекла, переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин.

Образцы фиксировали в 42-ом растворе параформальдегида (Serva) или в его смеси с 2,5Х-ым глутаровым альдегидом (Serva) в соотношении 1:1 при рН-7,2-7,4 при 4°С в течение 48-96 ч. В качестве буфера служили растворы Хенкса и Эрла. Дофиксировали в 1Х-ом растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в спирте и ацетоне,

заливали в смесь эпона с аралдитом. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротомах фирмы LKB (Швеция) и Reichert-Jung (Австрия). Полутонкие срезы окрашивали lZ-ым раствором толуидинового синего или азура 2. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронных микроскопах JEM-100S (Джеол, Япония) и Н-600 (Хитачи, Япония).

Для изучения методом негативного контрастирования сыворотку крови и культуральную жидкость фиксировали добавлением эквивалентного объема 8Х-го параформа в течение суток при +4°С. Каплю суспензии наносили на сеточки с формваровой подложкой, контрастировали lZ-ым водным раствором уранилацетата.

В ходе исследования было отснято и изучено более 60 ООО негативов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфогенез вирусов Марбург и Эбола Изучение вирусов Марбург и Эбола методом негативного контрастирования и на срезах показало, что первый содержит большое (соличество булавовидных и кольцевых форм, тогда как второй представлен в основном филаментозными. Вирус Марбург проникает в клетки путем рецептивного эндоцитоза, который идентифицируется под электронным микроскопом по клатриновой "опушке". Вирус Эбола проникает в клетки посредством слияния с плаамалеммой.

Первым ультраструктурным свидетельством репродукции филовиру-сов в клетках является вироплазма, на начальных стадиях морфогенеза образованная спиральными структурами, на основе которых формируются нуклеокапсиды. Нуклеокапсиды филовирусов имеют трубчатую форму и не ветвятся. Нуклеокапсиды вируса Марбург в клетке лежат хаотично, переплетаются друг с другом, формируя разные варианты структурной организации вироплазмы. Нуклеокапсиды вируса Эбола лежат более рыхло, обычно параллельны друг другу. Вирионы формируются при почковании нуклеокапсидов на поверхности зараженной клетки. Анализ ультратонких срезов показывает, что все многообразие форм филовирусов образуется именно в процессе почкования. Нуклеокапсиды при почковании ориентированы перпендикулярно, под углом, или параллельно плазиадемме, при этом формируются палочковидные частицы и разные варианты булавовидных. Иногда почкуются "пустые" вирионы, без нуклеокапсида. Разветвленные формы образуются при одновременном почковании нескольких нуклеокапсидов.

Кольцевидные Форш вируса Ыарбург формируются при параллельной ориентации нуклеокалсида относительно плазмалемш: сначала происходит выпячивание средней части нуклеокалсида, увлекающей за собой участок плазмалемш, а периферические конца отстают и сикаются. По завершении почкования формируется диск с очень тонкой центральной частью, образованной мембраной клетки. В последующем диск трансформируется в кольцо. Репродукцию вируса обола часто сопровождает формирование складчатых разрастаний плазыале^аи в виде "сетчатых шаров", которые образуются при почковании дефектных вирионов, не содержащих нуклеоида.

Репродукция вируса Збола и динамика патологических изменений внутренних органов морских свинок, внутрибршинно зараженных неадаптированным штаммом.

Неадаптированный штамм вируса Эбола вызывает у морских свинок острое гранулеыоподобное воспаление печени, очаги которого выявляются на срезах через пять сут. На начальных стадиях очаги состоят из монокуклеарных лейкоцитов, затем в них мигрируют нейтро-филы, а моноциты дифференцируются в макрофаги. Морфология лейкоцитарных клеток свидетельствует об их высокой функциональной активности. Количество очагов в печени морских свинок велико, они имеют разные размеры и расположены диффузно. Репродукция вируса Эбола выявляется с седьмых сут в клетках СШ> воспалительных очагов, а также в единичных клетках Купфера вне очагов. В клетках других типов вирус не размножается. На седьмые-двадцатые сут инфекции в печени моршшх свинок происходит лизис воспалительных очагов и формирование новых, однако в целом количество очагов уменьшается. Вокруг очагов и между их клетками наблюдается выпадение волокон фибрина, которые отграничивают очаг от окружающей ткани. Таким образом прослеживается два разных варианта репродукции неадаптированного штамма вируса Эбола в клетках СМФ печени морских свинок: с развитием воспалительной реакции и формированием гранулемоподобных очагов; и без них, что указывает на гетерогенность популяции вируса по характеру взаимодействия с клетками СМФ. В селезенке морских свинок, зараженных неадаптированным штаммом вируса Эбола, выраженные деструютивные изменения отсутствуют, наблюдается лишь отек клеток стромы и макрофагов и накопление лейкоцитов в красной пульпе. Размножение вируса удалось обнаружить лишь на седьмой день после заражения, в клетках СМФ красной пульпы. На протяжении всего периода инфекции в селезенке

отсутствовали митозы и признаки бласт-трансформации. В брыжеечных лимфоузлах в течение трех недель не наблюдалась репродукция вируса 35ала и признаки активации лимфоидной ткани: формирование плазматических клеток и митозы. С четвертых-пятых сут наблюдали явления отека стромалышх клеток. На двенадцатый, пятнадцатый, и двадцатый дни на обширных участках лимфоузлов выявлена деструкция строш, стенки капилляров и мелких кровеносных сосудов, редкие диапедезныз кровоизлияния. В сосудах легких на седьмые сут после заражения накапливались нейтрофшш и крупные макрофаги.

Репродукция вируса и патологические изменения внутренних органов морских свинок в ходе адаптации вируса Збола.

В ходе последовательных пассажей вируса Збола на морских ' свинках растет вирулентность для этого вида животных, а для кы-п-ей-сосунков - падает (табл. 1). Гибель взрослых свинок регистрируется с четвертого пассажа вируса Збола (пало 407. животных). На пятой пассаЕэ пало около 50%, а на седьмоы-восьмои пассатах наблюдалась гибель всех заболевших животных (-1е ДЦео - 6,25-7.0).

. Таблица 1

Активность вируса Збола в печени морских свинок при пассировании

Титр вируса в 103;-ой суспензии печени

титрование на .Титрование на Титрование на

Нонзр ыорских свинках 1-2-х-дневных ^льтуре

пассата (180-200 г.) шаах-сосунках клеток

-1СГЛД50 - 1$Щ50 -1ВЯД50 -1£Б0£/ия

ОА 1,25 3,2 7,5 1,1x105

1 2,4 3,7 2,9 0,9х103

2 3,5 4,5 1,6 1,0х103

3 4,0 7,25 0 2,6х104

4 3,9 4,5 и.о. 1,2х105

5 не определялось

6 . 5,5 6,75 0 1,2х105

7 5,25 7,0 н.о. 1,0х105

8 5,5 7,0 0 1,1х105

9 5,6 6,9 0 1,1х105

л Неадаптированный оташ

Репродукция вируса Збола и характер деструктивных изменений внутренних органов морских свинок менялись в ходе пассгкей. На первом и втором строение печени в целом было близко к коргАзльио-му, мелкие воспалительные очаги били единичны. Репродуга^аз вируса Эбола выявить не удалось, что соответствует его ннзкгау содержанию в печени (табл. 1). В лимфоузлах и селезенке было обнаружено увеличение размеров и количества вторичных фолликулов, отек и разрушение редких клеток строги и зрелых иакрофагов; очагозая деструкция зндотелиоцитов.

На втором пассате структурные признаки активации ныуунной системы отсутствовали. В .селезенке и в брнхвечных лкифоуздах нарастала деструкция клеток стропы и иакрофагоз.

На последующих пассадая в печени нарастало количество зараженных клеток С® и вирионов. Резкое изменение характера поручения печени морских свинок наблюдалось с четвертого пассата, когда впервые удалось выявить зараженные гепатоцитн. Степень деструктивных изменений органов нарастала по ходу пассажей, особенно - в печени. При максимальной выраженности деструктивного процесса балочное строение органа было нарушено, в диффузно расположенных крупных некротичесгаи очагах находились макрофаги, нейтрофзды на разных стадиях дегенерации, клеточный детрит и многочисленные ви-риокы. Разрушались многие клетки вистнлки синусоидсв, выявлялся гемостаз. Признаки воспаления в печени отсутствовали со второго пассата, не выявлялась реакция лейкоцитов на зараженные клетки.

С третьего пассажа в белой и красной пульпе селезенки нарастало разрушение меток стрсны и мйкрофагов, накапливались нейтро-филы, наблюдался гемостаз, развивалось л1а«фоидное нсто^ние. К седьмому пассажу деструктивные изменения достигали наибольсего уровня: ткань содержала многочисленные некротизированные клетки стромы и макрофаги, большое число дегранулировавших и лизирова-кых нейтрофилов. Разложение вируса Збола в селезенке на третьем- пятом пассажах выявлялось только в клетках СИФ. Число зарияен-ных клеток и вирионов нарастало по мере пассирования, а на шес-том-седьмом пассажах в репродукцию вируса были вовлечены также редкие зндотелиоциты и фибробласты.

В брыжеечных лимфоузлах морских свинок морфологическую картину в ходе пассажей определяли в основном два процесса: а. появление на третьем пассаже и нарастание на последующих лимфоидного истощения; и б. усиливающаяся деструкция клеток стромы и СМФ. На

седьмом пассгше в лимфоузлах наблюдались отек, застойное полнокровие, гипоплазия ликфоидной ткани, преимущественно В-зависимой зоны. Вторичные фолликулы были мелкие й немногочисленные, без выраженных центров размножения. Отмечалось значительное, местами полное, разрушение клеток строш, прямо не связанное с размножением вируса. Вирус Збола размножался в клетках СШ.

В почках деструктивные изменения усиливались с третьего пассажа. Они носили токсический характер, вирус в клетках почечного эпителия не размножался. Деструктивные изменения были наиболее выражены на седьмом пассаже, когда на срезах регистрировалось резкое полнокровие капилляров клубочков и, особенно, канальцев.

В надпочечниках к седьмому пассату развивалась деструкция отдельных паренхиматозных и стромальных клеток, снижалось содержание лшюсом в спонгиоцитах пучковой зоны. Вирус Эбола ' размножался в паренхиматозных клетках пучковой и сетчатой зон, в клетках СМ®, редких фиброблаетах и эндотелиоцитах капилляров.

Полученные данные позволяют заключить, что пассирование обеспечивает селекция и накопление вирионов, способных размнссгаться в клетках морских свинок, не вызывая воспалительной реакции. Очевидно, эти вирионы продуцируются одиночными клетками Купфера, лежащими вне гранулеыоподобных очагов в печени свинок, зараженных неадаптированным штаммом вируса ЕЗола. Пассирование приводит к накоплению этих частиц, расширению спектра выявляемых клеток-мишеней, нарастания деструктивных изменений органов, исчезновению - воспалительно-клеточной реакции, а на уровне целого организма - к росту вирулентности вируса Збола для морских свинок.

Репродукция вируса и патологические изменения внутренних органов морских свинок при заражвнии вирусом Ыарбург.

Вирус Ыарбург выявлялся в крови морских свинок в титре 1,03 lg ЛД50/ЫЛ через одни сут после в/б заражения, и <0 1еДД5о/мл -через трое сут после а/з заражения. Через шесть сут концентрация вируса достигала 8,2 и 4,9 lg ДДбо/мл, соответственно. Первыми клетками-мишенями для вируса Ыарбург при в/б заражении были пери-тонеальныэ макрофаги, обнаруженные через ДЕое сут после инокуляции в перитонеавьном экссудате. Вирус Ыарбург активно репродуцировался в перитонеальных макрофагах и в системе In vitro,, уровень вируспродукщш достигал 5,51 lg БСЕ/мл. При а/з заражении репродукция вируса Ыарбург была выявлена в клетках СИ бронхо-легочных смывов вирусологическими и электронно-микроскопическими методами

- 17 -

на вторые и третьи сут, соответственно.

В первые трое сут после в/б и а/з заражения вирусом Марбург в печени отмечается незначительный гемостаз, нарастающий в последующем, "сладж" эритроцитов. С четвертых сут обнаруживались некрозы отдельных гепатоцитов и клеток Купфера, небольшие диапедез-ные кровоизлияния, накопление нейтрофилов в синусоидах. Первые зараженные клетки <ЭЮ и гепатоциты выявлены в печени на четвертые сут при обоих способах заражения. На шестые-седьмые сут степень деструктивных изменений печени возрастала. Как и в более ранние сроки, наблюдались нарушения кровоснабжения, гемостаз, однако выстилка синусоидов и сосудов сохраняла целостность. Степень деструктивных изменений печени морских свинок выше на терминальных стадиях при а/з заражении. В ходе заболевания в обоих случаях нарастало содержание вирионов и зараженных клеток. Реакция лейкоцитов на зараженные клетки при в/б заражении отсутствовала, а при а/з заражении она была отчетливо выражена через шесть-девять сут. Нейтрофилы и мононуклеарные лейкоциты мигрировали в перисинусои-дальное пространство и в паренхиму органа; появлялась и нарастала инфильтрация перипортальных зон. Клетки С2® и лимфоциты тесно контактировали с зараженными гепатоцитами, но признаков повреждения структуры последних не наблюдалось. У а/з зараженных морских свинок степень деструктивных изменений и уровень "инфицированнос-ти" (содержание зараженных клеток и вирусных частиц) печени к концу заболевания существенно выше, чем при в/б заражении.

В селезенке морских свинок, зараженных вирусом Марбург в/б, уже через сутки в красной пульпе накапливались нейтрофилы, . через трое сут в них появлялись электронно-прозрачные зоны лизиса, в последующем продолжалось накопление нейтрофилов, развивались явления гемостаза, отек эндотелиоцитов. На терминальных стадиях инфекции просветы сосудов содержали фибрин, дегранулирующие кровяные пластинки, нейтрофилы и клеточный детрит, наблюдался некроз многих эндотелиоцитов. При а/з заражении характер поражения красной пульпы селезенки был аналогичен, но события разивались на сутки-двое позднее, а к концу заболевания степень деструктивных изменений была выше, чем при в/б. В белой пульпе селезенки заметные изменения при в/б и а/з заражении появлялись с пятых сут: мелкоочаговые некрозы стромаяьных, макрофагальных и дендритных клеток, зритродиапедезные кровоизлияния. Репродукция вируса Марбург в красной и белой пульпе выявлялась в редких клетках СЬЮ.

У морских свинок, зараженных в/б, в паховых и брыжеечных лимфоузлах заметные деструктивные изменения регистрировались с пятых сут: отек и разрушение макрофагов, дендритных клеток и клеток стромы, стаз капилляров, сладж эритроцитов, плазморрагия и редкие мелкие диапедезные кровоизлияния. С четвертых сут в корковом вещэстве лимфоузла выявлялись митозы. С пятых сут в лимфоузлах локализовались зараженные клетки СМФ.

При а/а заражении в лимфоидной ткани белой пульпы селезенки, лимфоузлов и миндалин, начиная с четвертых сут, уменьшались размеры и количество клеток в фолликулах, некротизировались клетки стромы и СМФ. На девятые сут в белой пульпе селезенки и в лимфоузлах герминативные центры практически не выявлялись, отсутствовали митозы и дифференцирующиеся лимфобласты.

В легких морских свинок при обоих способах заражения в последние сутки-двое заболевания наблюдались стаз капилляров, сладж эритроцитов, накопление в альвеолярных капиллярах нейтрофилов и кровяных пластинок. Репродукция вируса Ыарбург обнаружена на пятые-седьмые сут после заражения в редких клетках СМФ альвеолярных капилляров, а при а/з заражении - и в клетках СМФ интерстиция.

В почках с четвертых сут после в/б и а/з заражения наблюдались нарушения кровотока, нараставшие в ходе инфекции. Выявлялся стаз капилляров, диапедез эритроцитов, сморщивание части клубочков. В капиллярах накапливались нейтрофилы, набухали базальные мембраны, вакуолизировались клетки эндотелия. На терминальных стадиях инфекции усиливались повреждения сосудов, развивались некрозы в интерстициальной ткани и в эпителии канальцев.

В надпочечниках на четвертые-девятые сут после а/з заражения, выявлялся стаз капилляров, их просветы содержали многочисленные нейтрофилы. В паренхиме и интерстиции находились редкие небольшие некрозы и мелкие диапедезные кровоизлияния. Наблюдался контакт мононуклеарных лейкоцитов с инфицированными клетками коры надпочечников, не сопровождающийся повреждением клеточных структур.

В эпителиальной выстилке как тонкого, так и толстого кишечника морских свинок, зараженных а/з вирусом Ыарбург, не обнаружено заметных деструктивных изменений. В капиллярах собственного слоя прослеживались застойные явления, накопление нейтрофилов.

Проведенное исследование показывает, что у морских свинок вирус Ыарбург при в/б и а/з заражении в первую очередь инфицировал клетки СМФ, затем - гепатоциты, клетки коры надпочечников,

эндотелиоциты и фибробласты. На ранних стадиях заболевания при обоих способах заражения у морских свинок регистрировались нарушения микроциркуляции во внутренних органах, отек стромальных клеток и клеток СМФ лимфоидной ткани. В поздние сроки инфекции наблюдались деструктивные изменения всех исследованных внутренних органов, наиболее выраженные в печени и селезенке. Особенностью а/з формы инфекции является развертывание в печени лейкоцитарной атаки на зараженные клетки, не приводящей, однако к деструкции последних.

Динамика патологических изменений внутренних органов обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола.

У павианов гамадрилов, зараженных вирусом Эбола, выявлено достоверное возрастание уровня билирубина и тимоловой пробы на третьи сут (до появления вируса в крови). Содержание общего белка, циркулирующих иммунных комплексов и малонового диальдегида заметно не изменялось в течение первых 5 сут инфекции. Изменения уровня тралсфераз, креатинина и мочевины на пятый-шестой день указывали на поражение печени и почек, появление белков острой фазы, и активацию системы комплемента. Возрастали уровни С-реактивного белка (с 0,2+0,1 усл.ед. до 0,8+0,1 на вторые, и до 0,9+0,2 - на седьмые сут) на фоне увеличения с^ 1, сИг- и ¿'-фракции глобулинов (с 5,1+0,5 до 15,8+4,6%; с 9,5+0,4 до 23,3+4,6%; с 16,0+0,9 до 22,8+2,3% на девятые сут, соответственно) и умеренной ^-липопротеидемии (с 42,1+4,1 до 131,4+29,8 усл.ед на восьмые сут). Соотношение альбумины/глобулины снижалось с 1,2+0,1 до 0,8+0,1 на пятые сут, и до 0,2+0,1 - на девятые сут.

В динамике инфекции у зеленых мартышек, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола, деструктивные изменения печени носили сходный характер. Уже на вторые сут наблюдались застойные явления в синусоидах,- отек ряда клеток Купфера. С третьих-четвертых сут выявлялись отек эндотелия синусоидов и мелких сосудов, редкие некрозы гепатоцитов. С четвертых сут регистрировалось активное размножение вирусов в клетках СЫФ и гепатоцитах. В последующем деструктивные изменения нарастали лавинообразно. На пятые-седьмые сут разрушалась выстилка синусоидов и мелких сосудов, появлялись волокон фибрина в просвете синусоидов и некрозы гепатоцитов.

На терминальных стадиях печень содержала многочисленные зараженные гепатоцнты, клетки СЮ и вирусные частицы. Зараженные фиб-робласты и эндотелиоциты были единичны. Наблюдались диффузные

мелкие некрозы. Разрушались не только зараженные клетки, но и значительное число незараженных. В зависимости от вида вируса, различался характер поражения кровеносной системы печени. У зараженных вирусом Эбола обезьян просветы сосудов содержали фибрино-вые и фибриново-эритроцитарные тромбы, отложения фибрина локализовались, также в пространстве Диссе и интерстициальной ткани. Синусоиды были расширены, забиты эритроцитами. При заражении вирусом Марбург отложения были фибрина незначительны и ассоциированы с зонами некроза. Воспаление в печени 'зараженных филовирусами обезьян отсутствует: нет инфильтрации портальных трактов и миграции лейкоцитов к зараженным клеткам.

Деструктивные изменения красной пульпы селезенки у зараженных филовирусами обезьян выглядели наиболее тяжелыми на фоне всех изученных органов. В динамике Марбург-инфекции заметные изменения в красной пульпе появлялись на четвертые-пятые сут: застойные явления в кровотоке, отек макрофагов, редкие некрозы клеток стромы и макрофагов. На пятые сут в просвете кровеносных сосудов обнаружены первые зараженные клетки СШ>, число которых в ходе инфекции нарастало. На шестые-седьмые сут патологические изменения резко усиливались: почти полностью разрушался эндотелий синусов, ткань пропитывалась плазмой, в просвете сосудов и в межклеточных пространствах выпадали мелкие сгустки фибрина. Не были видны границы синусов, забитых клетками крови, волокнами фибрина и клеточным детритом. Зараженные клетки была представлены в основном клетками СЫФ, инфицированные фибробласты и эндотелиоциты были единичны.

Поражение красной пульпы селезенки мартышек, зараженных вирусом Эбола, начиналось на вторые сут с отека и деструкции клеток СШ и стромы, застоя крови в синусах. В последующем эти изменения усиливались. Через 3 сут обнаруживались первые зараженные клетки СУФ в просвете сосудов. С четвертых сут появлялись некрозы, отложения фибрина в просвете и вокруг сосудов, интенсивный диапедез эритроцитов, разрушение выстилки синусов. На шестые-седьмые сут, перед гибелью животных, наблюдались массивные некрозы красной пульпы, полностью нарушалась архитектоника селезенки. Наиболее яркой чертой поражения (фасной пульпы являлись полости, заполненные фибриновыми массами и лишенные клеток. На срезах они имели вид протяженных полей, содержащих пучки фибриновых волокон. Между полями лежали скопления разрушенных клеток, с трудом поддающиеся идентификации, вирионы и нейтрофилы.

Течение филовирусных инфекций сопряжено с развитием тяжелой интоксикации, в которую вносят свой "вклад" и почки. Достоверное повышение содержания креатинина и мочевины в крови павианов гамадрилов, зараженных вирусом Эбола, наблюдалось с седьмого дня. Деструктивные изменения почек в динамике Ыарбург- и Эбола-инфек-ции у зеленых мартышек развивались по аналогичному пути. Повреждения канальцев опережали таковые в клубочках и выявлялись на третьи сут. Наблюдались отек клеток дистальных канальцев и межканальце вых капилляров; дезорганизация базальных складок в эпителии проксимальных канальцев. В последующем изменения нарастали, к ним присоединялся отек подоцитов и меаангиальных клеток. На пятый* седьмой день регистрировались тромбоз капилляров, гемостаз, некрозы отдельных клеток эпителия канальцев, повреждение клеток клубочков. К моменту гибели животного разрушался эндотелий капилляров, наблюдался отек перикапиллярных пространств и некроз части клубочков. Некоторые клубочки сохраняли морфологически нормальную, структуру. Воспалительные изменения в почках отсутствовали. При заражении вирусом Эбола повреждения кровеносных сосудов более выражены, на срезах выявлялись фибриновые тромбы, диапедез эритроцитов, интерстициальные геморрагии. Деструктивные процессы в почках прямо не связаны с размножением вируса, в клетках почечного эпителия филовирусы не размножались. Репродукция вирусов Ыарбург и Эбола выявлялась в редких внутрисосудистых клетках СИФ почек с пятых и четвертых сут, соответственно. На терминальных стадиях наблюдались единичные зараженные фибробласты и эндотелиоциты.

Деструктивные изменения в легких прямо не связаны с размножением филовирусов. Вирусы Ыарбург и Эбола в легочном эпителии зеленых мартышек не размножались. Признаки вирусной инфекции выявлялись через пять сут в клетках (3® крови, позднее - в клетках -СЫФ интерстиция и в альвеолярных макрофагах. Редкие инфицированные фибробласты и эндотелиоциты встречались на терминальных стадиях инфекции. В легких зеленых мартышек, зараженных филовируса-ми, отсутствовали изменения, свойственные респираторным заболеваниям. В динамике инфекции патоморфологическую картину легких у зеленых мартышек определяли главным образом нарушения в системе кровоснабжения. На пятый-шестой день наблюдались полнокровие крупных и мелких сосудов, периваекулярный отек, небольшие скопления нейтрофилов и тромбоцитов в мелких сосудах, преимущественно -в альвеолярных капиллярах. У мартышек, зараженных вирусом Мар-

бург, эти изменения, заметно не нарастая, прослеживались до гибели животных. При заражении вирусом Эбола в сосудах легких накапливались нейтрофилы и моноциты, наблюдались отложения фибрина, тромбы, состоящие из фибрина, клеточного детрита и эритроцитов. ' Диапедезные явления достигали значительной интенсивности. К концу заболевания развивались деструктивные изменения эндотелия альвеолярных капилляров, уменьшалось количество альвеолярных макрофагов. У всех животных на терминальных стадиях и Марбург-, и Эбола- инфекции наблюдались выраженные застойные явления в кровотоке, альвеолярные капилляры были перерастянуты эритроцитами, их просветы содержали большое количество нейтрофилов с лизированой цитоплазмой, лишенной гранул.

В динамике заболевания у зеленых мартышек, зараженных фило-вирусами, не обнаружено заметных деструктивных и воспалительных изменений эпителия и других составляющих стенки тонкого и толстого кишечника. В собственном слое слизистой и в подслизистом слое кишечника в последние сутки-двое встречались зараженные клетки СШ> и фибробласты. В кровеносных сосудах кишечника зараженных вирусом иарбург обезьян наблюдался сладж эритроцитов и стаз некоторых капилляров. При заражении вирусом Эбола эти изменения сочетались с выпадением волокон фибрина и тромбозе»! ряда капилляров.

У зараженных филовирусами обезьян не выявлено заметных деструктивных изменений поджелудочной и слюнных желез, лишь на терминальных стадиях наблюдались нарушения в системе микроциркуляции. Выявлялись единичные зараженные клетки СМФ и фибробласты в ин-терстициальной ткани железы.

В надпочечниках мартышек, зараженных вирусом Эбола, в первые двое сут в корковом веществе увеличивалось кровенаполнение, появлялись мелкие очаги диапедезных кровоизлияний. Через пять сут выявлялись отек цитоплазмы и разрушение органоидов в клетках клу-бочковой, пучковой и сетчатой зон, некроз некоторых клеток. Размножение вируса Эбола регистрировалось во всех типах паренхиматозных клеток коры надпочечников с пятых сут. На шестые-седьмые сут степень деструктивных изменении надпочечников нарастала, появлялись многочисленные геморрагии, увеличивались количество и размеры некрозов паренхимы. На терминальной стадии в цитоплазме адре-налоцитов практически не было лилосом, митохондриальные кристы вместо типичного для пучковой зоны везикулярного строения имели тубулярное. Эти изменения наблюдались как в зараженных клетках,

так и в неаараженных. Б мозговом веществе надпочечника не выявлено заметных деструктивных изменений, лишь на терминальных стадиях наблюдались нарушения в системе микроциркуляции.

Деструктивные изменения надпочечников обезьян, зараженных вирусом Ыарбург, на терминальных стадиях заболевания были аналогичны таковым при Эбола-инфекции. Вирус Марбург размножался во всех типах паренхиматозных клеток коры надпочечника.

В миокарде, зеленых мартышек, зараженных вирусом Эбола, не выявлено выраженных изменений кардиомиоцитов, в ходе инфекции развивались нарушения в системе микроциркуляторного русла, на терминальных стадиях появлялись фибриновые микротромбы. Зараженные клетки С® и вирионы обнаружены в кровотоке и интерстиции миокарда через пять-шестъ сут, а эндотелиоциты - лишь на терминальных стадиях. При Ыарбург-инфекции сердце не исследовали.

Таким образом, заражение зеленых мартышек вирусами Ыарбург и Эбола приводит к нарушению микроциркуляции во внутренних органах уже в первые трое сут. В ходе заболевания в печени, надпочечниках и красной пульпе селезенки развиваются деструктивные изменения, обусловленные размножением филовирусов в клетках этих органов, и нарушением кровоснабжения. Изменения в строении почек, легких, сердца и желудочно-кишечного тракта, наблюдаемые у обезьян, связаны главным образом с нарушением кровоснабжения. Во всех исследованных органах обезьян отсутствует воспалительно-клеточная инфильтрация. • 4 -

Идентификация клеток-мишеней и диссеминация вирусов Ыарбург и Эбола при экспериментальном заражении животных.

Изучение места в/м введения вируса Эбола морским свинкам не выявило зараженных клеток и вирионов через 1,2,4,12,24,36 и 48 ч, хотя фагоцитоз клеточного детрита, содержащегося во введенном го-могенате наблюдался отчетливо. Полученные результаты свидетельствуют, что вирус Эбола не задерживается в месте введения. Повреждение лимфатических и кровеносных сосудов во время укола создает возможность быстрого попадания вирионов в лимфо- и кровоток.

Первичной клеткой-мишенью для филовируеов у обезьян являются клетки СЫФ, как и у морских свинок. При Ыарбург-икфекции первыми у обезьян были выявлены через 3 сут зараженные клетки Купфера. В случае вируса Эбола первые зараженные клетки СМФ удалось обнаружить в просвете портальных вен через 2 сут, затем в репродукцию вовлекались клетки Купфера. Не все клетки ШЭ вовлекались в реп-

родукцию филовирусов: не было признаков инфекции в макрофагах мозговой зоны лимфоузлов; не все макрофаги заражались в красной пульпе селезенки. Это говорит о гетерогенности популяции клеток СШ по способности поддерживать репродукцию филовирусов.

Вслед за клетками СМФ, на четвертые сут инфекции,- в размножение вирусов Ыарбург и Эбола у зеленых мартышек вовлекались ге-патоциты. В них филовирусы формируют крупные локусы вироплазмы и криетадлоподобкые скопления нуклеокапсидов, достигающие размеров нескольких микрон и видимые в световой микроскоп. Репликативный цикл в-гепатоцитах может быть абортивным. Репродукцию вируса Эбола в гепатоцитах часто сопровождает образование разрастаний плаз-малеммы в виде "сетчатого" шара.

С пятых сут Ыарбург- и Эбола-инфекции зараженные клетки СМФ и вирионы выявлялись в просвете кровеносных и лимфатических сосудов всех исследованных органов зеленых мартышек (печень, селезенка, почки, легкие, лимфоузлы, тонкий и толстый кишечник, надпочечники, поджелудочная и слюнные железы). На 6-7-е сут зараженные клетки О® регистрировали в интерстициальной ткани исследованных органов. Эти данные показывают, что диссёминация филовирусной инфекции происходит как за счет транспорта вирионов, так и путем переноса зараженных клеток СЫФ током крови и лимфы.

Включение клеток в инфекционный процесс связано как с их способностью поддерживать репродукцию вирусов, так и с их доступностью для вируса. Филовирусы, продуцируемые клетками СМФ, доставляются кровью и лимфой во все органы, контактируя в первую очередь с эндотелием. Однако у зеленых мартышек инфицированные зндотелиоциты удалось обнаружить лишь на шестые-седьмые сут. Зараженные клетки локализовались в выстилке синусоидов печени и синусов селезенки, в венулах и венах мелкого калибра, а также в лимфатических сосудах мелкого калибра. Часто зндотелиоциты содержали лишь вироплазцу.

Помимо клеток СМФ, гепатоцитов и зндотелиоцитов у всех зараженных обезьян в последние 1-2 сут перед гибелью репродукция вирусов Ыарбург и .Эбола выявлялась также в паренхиматозных клетках коры всех зон надпочечников и фибробластах. Ддреналоциты ССДОрти ли хорошо развитую вироплазму, нуклеокапсиды, продуцировали многочисленные вирусные частицы. Инфицированные фибробласты локализовались в интерстициальной ткани всех исследованных органов зараженных филовирусами зеленых мартышек. Они содержали мелкие ло-

кусы вироплазмн и редкие нуклеокапсиды. Почкование филовирусов на поверхности протяженных отростков фибробластов создает дополнительные возможности для распространения инфекции в толще органов.

Вирусы Марбург и Эбола не размножаются в лимфоидных, шшеч-ных, нервных клетках, и в зпителии желудочно-кишечного тракта.

Исследование органов обезьян разных видов на тергданальных стадиях Эбола-инфекции показало, что набор кгэток-мкяэкей у них одинаков, но содержание инфицированных клеток и вирусных частиц различается. Наиболее высокий уровень репродукции вируса наблюдался у циноыольгусов. Срезы их внутренних органов содержали огромное количество заратениых ¡теток и аирпонов. Так, в печени практически все гепатоциты были заражены. У зеленых картишек, макак резусов и павианов гамадрилов в это же время вироплазиа и нуклеокапсиды регистрировались в одном-двуз из 100 гепатоцитов. Помимо- обычного для вируса Эбола набора клеток-шспеной, у цино-мольгусов признаки инфекции наблюдались в клетках ?.:элчныя канальцев, эндотелии кровеносных и лимфатических сосудов и эндокарда.

Продолжительность периода от момента заражения до проникновения вируса в кровь имеет важное значение для проведения экстренной иммуно1фофилактики. Вирус Ыарбург прошагает в кровь морских свинок и зеленых мартышек в течение первых сут после в/б заражения в дозе ICO ЛД50. Уменьшение инфицйрукцей дозы приводит к увеличению периода проникновения вируса в кровь до нескольких суток: у а/з зараженных в дозе 2-6 ЛД50 свинок вирус Карбург выявлялся в крови через 72 ч. У п/к зараженных в дозе 20-50 ЛД50 павианов гамадрилов вирус Эбола выявлялся в крови методом бкотитро-вания ка мышах-сосунках на четвертые сут (2,9+0,4 1гДЦ50'ил крови) , а методом бляшек на культуре клеток Vero - на пятые сут (3,8+0,4 lgBGE/мл крови). По ходу инфекции содержанке вируса в крови павианов нарастало до 6,0+0,4 lg BCS/Mn крови на седьмые-девятые сут. Выявление вируса Эбола в крови павианов опережает начало лихорадочного периода на 1,0-1,5 сут в 50Z случаев.

. Полученные результаты показывают, что очередность вовлечения клеток в репродукцию вирусов Марбург и Эбола одинакова у морских свинок и обезьян: клетки С®, гепатоциты, клетки коры надпочечников, фибробласты и эндотелиоциты. Клетки СШ) являются первичной мишенью для вирусов Марбург и Эбола у всех исследованных экспериментальных животных. Они не только репродуцируют фнловнрусы, но и принимают участие в диссеминации инфекции.

Патологические изменения крови и кровоснабжения при экспериментальных филовирусных-инфекциях.

У павианов, зараженных вирусом Збола, к концу заболевания развивались лейкопения и шшфопения. В красном костном мозге павианов и морских свинок, зараженных вирусом Марбург, выявлены значительные деструктивные изменения: обширные некрозы миелоидной ткани, запустеваниэ, эритродиапедез, резкое сокращение количества делящихся к дифференцирующихся гемопоэтических клеток, разрушение выстилки синусов, строыы и макрофагов. У павианов ткань содержала многочисленные кровоизлияния. На срезах красного костного мозга •отсутствовали признаки формирования лимфоцитов и моноцитов, эти клетки и их предшественники встречались исключительно редко. Клетки граиулопозгл*ческого и зритропозтичеекого ряда на срезах присутствовали, что указывает'на продолжение формирования грану-лоцнтов и эритроцитов. В мегакариовдтах павианов и морских свинок наблюдались отек цитоплазш и митохондрий, фрагментация ЗПР и аппарата Гольдош. Часть мегакариоцитов имела ровную поверхность и вообще не продуцировала кровяных пластинок, а на поверхности других шло формирование пластинок, "лишенных специфических гранул. Репродукция филовирусов выявлялась только в редких сохранившихся клетках С&Э красного костного мозга, в гемопоэтических клетках признаки разыноазния вирусов Марбург и Эбола не найдены.

Вшгвленше деструктивные изменения красного костного мозга позволяют заключить, что наблюдаемая при филовирусных инфекциях лиифо- и тромбоцитопекия не связана с разрушением лимфоцитов и тронбоцотоз, а, по-видимому, обусловлена главным образом блокированием икфо- и тро^боцитопоэза гуморальными факторами.

У павианов гамадрилов в течение первых двух сут после заражения вирусом Збола развивалась гиперкоагуляция, достигавшая ыак--сщума к четвертым сут. Затем, свертываемость уменьшалась, развивалась гкпокоагуляция, в крови появлялись продукты деградации фибрина. Динамика параметров системы свертывания свидетельствует о развитии синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) у зараженных вирусом Эбсша павианов гамадрилов по биохимическим критериям, с этой точки зрения нагнаны являются адекватной моделью для изучения механизмов нарушения системы свертывания и юс коррекции при геморрагической лихорадке Эбола.

У всех исследованных видов обезьян, зараженных вирусом Эбола, выявлялось поражение микроциркуляторного русла внутренних орга-

нов. На срезах наблюдались тронбоз и стаз капилляров, переполнение их кровью, слада эритроцитов, отек зндотелиоцитов. В альвеолярных капиллярах накапливались и дегранулнровали нейтрофили. Наиболее выракенныу изменениям подвергались капилляры синусондного типа печени и селезенки, а такте капилляры -почек.

На фоне нарушений микроциркуляторного русла были обнаружены видовые различия в характере поранения кроззиоскых сосудов обезьян. У зеленых мартшек и макак резусов происходило выпадение волокон фибрина и образование многочисленных ф*.'.брино2ых тромбов в мелких сосудах внутренних органов,, в той числе сердца, тонкого и толстого ккшэчника, сланных и поджелудочной -кдоз. Оикшения фибрина выявлялись и вдоль наружной оболочки мэлшк- сосудов. В составе фибриновых тромбов нередко содержались вкрускнэ частицы, но основная часть фибриновых отдакений не была ассоциирована с вирусными частицаш. Это говорит о том, что вириозш, как таковыэ, по-видимому, не являются "затравият:'.'. для полимеризации фибрина.

В 1фовеноскьи сосудах пазканоз гкладрнлоз на терминальных стадиях ЗЗола-шфекции не выявлено фибршюшх тромбоз и Еоаснса .фибрина. Внутренние органы павианов содержали многочислеиннэ геморрагии, особенно крупные в печени и селезенка. Цэлкке дкапедэг-ные кровоизлияния наблюдались во всех исследованных оргалах.

У циноиодьгусов в кровеносных сосуда:: на было обнаружено заметного выпадения ф"лбр!ша, формирования тромбов и кровоизлияний на терминальной стадии Эбола-инфекции.

Изучение кровеносных сосудов внутренних органов обезьян, за-разаэнных • вирусом Ыарбург, не выявило заметного выпадения фибриновых масс и формирования фибриновых тромбов. Таким образом, заражение вирусам» Марбург и Збола приводит к различным игкэнентц со стороны системы свертывания крови: у одного и того вида обезьян. первый Не вызывает выпадения фибрина, тогда как заражение вторым приводит к интенсивному фибринообразозанкя.

При экспериментальных филовирусных икфэкцкях степень геморрагических проявлений варьирует в зависимости от вида аивотиых. У морских свинок, зараженных филоЕируса».ги, не зарэгкстрцровгкю видимых геморрагий на поверхности внутренних органов и слиепстнх. Заболевание, вызываемое вирусам Марбург у обезьян, такгз обычно не сопровождается появлением геморрогкй. При заркгенки птфусси Збола у некоторых павианов наблюдалась мелена, кровотечения носа, а геморрагии на коке и слизистых развивались у 60% шест-

ных. Единичные случаи появления геморрагии отмечены у зараженных этим вирусом зеленых мартышек и макак резус.

При микроскопическом изучении органов диапедезные кровоизлияния и эмиграция эритроцитов за пределы сосудов регистрировались у всех экспериментальных животных, однако степень их выраженности была различна. У ыорских свинок, зараженных филовирусами, на срезах внутренних органов отмечались незначительные диапедезные явления, кровоизлияния отсутствовали. У зеленых мартышек, зараженных вирусом Ыарбург, в последние двое-трое сут инфекции наблюдались диаяедез эритроцитов и небольшие кровоизлияния во всех исследованных органах. При Збола-инфекции у всех видов обезьян, за исключением вдно&ольгусоз, наблюдался диапедез эритроцитов, к концу заболевания развивались эритродиапедезные кровоизлияния, однако значительных размеров они достигали лишь у павианов.

Изучение зон геморрагии на коже и в стенке кишечника у павианов гамадрилов не выявило воспаления и разрушения стенки сосудов, а также усиленной, по сравнению с соседними участками, деструкции эндотелиоцитов. Формирование геыоррагий происходило путем диапе-деза. Репродукция вируса Эбола в области геыоррагий выявлялась в клетках С1Я> кровотока и редких эндотелиоцитах, локализация которых не была связана с местами выхода эритроцитов из сосудов. Единичные инфицированные клетки С1й>, также не связанные с зонами ди-апедеза, встречались в соединительной ткани.

Таким образом, у исследованных экспериментальных животных заражение филовирусами вызывает нарушения микроциркуляции, прогрессирующие в ходе заболевания. Генерализованное выпадение фибрина в сосудах и развитие геморрагии являются видовыми особенностями заболевания, вызванного вирусом Эбола, у зеленых мартышек, макак резусов и павианов гамадрилов. Аналиа полученных результатов позволяет заключить, что индуктором патологических изменений в системе ¡фови и кровоснабжения у зараженных вирусами Ыарбург и Збола экспериментальных животных являются гуморальные факторы, по-видимому, связанные главным образом с клетками СИФ.

Изшнения органов и клеток лимфоидной системы у зараженных вирусами Царбург и Эбола обезьян.

Изшнения лимфоидной ткани одинаковы в различных местах анатомической локализации (белая пульпа селезенки, паховые, брыжеечные, перитрахеалькые и перибронхиальные лимфоузлы; лимфоидные фолликулы респираторного и желудочно-кишечного тракта) во все

сроки и у всех изученных ввдов обезьян, зараженных вирусами Ыар-бург и Эбола. Со вторых-третьих сут и на протяжении всего заболевания отсутствовали митозы. Деление других тицов клеток (кишечного эпителия и клеток зритроидного ряда красного костного мозга) продолжалось на протяжении всего заболевания, что говорит о специфичности блокирующего фактора по отношению к лимфоидным клеткам. В лимфоидной ткани обезьян не наблюдалось признаков плазма-цитогенеэа, отсутствовали властные элементы.

В ходе филовирусных инфекций происходила инволюция лиыфоид-ных фолликулов во всех исследованных органах. С третьих-четвертых сут наблюдалось нарастающее лиьфоидное обеднение фолликулов, не связанное с некрозами лимфоидных клеток. В ходе заболевания не происходило заметного разрушения лимфоцитов. Картину поражения лимфоидной ткани дополняли повреждения эндотелия кровеносных сосудов (наиболее выраженные в белой пульпе селезенки), диапедезные явления, тромбоз сосудов.

Со вторых суток заболевания у обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола, выявлялись отек клеток СЫФ и стромы лимфоидной ткани, их единичные некрозы, не связанные с размножением филови-русов в этих клетках.- Первые зараженные вирусом Ыарбург клетки СОД удалось обнаружить в кровеносном русле лимфоидной ткани белой пульпы селезенки и брыжеечных лимфоузлов лишь через пять сут после заражения, У мартышек, зараженных вирусе« Эбола, в селезенке репродукция вируса в клетках СШ была найдена через трое сут, а в брыжеечных лимфоузлах - через четверо. В остальных местах локализации лимфоидной ткани единичные зараженные клетки С%№ регистрировались лишь в последние сутки-двое заболевания. В ходе инфекции число инфицированных клеток нарастало, усиливались деструктивные изменения клеток стромы и СМФ, а на терминальных стадиях неповрежденные клетки этих типов отсутствовали. На терминальных стадиях инфекции размножение вирусов Ыарбург и Эбола регистрировалось также в редких зндотелиоцитах и фибробластах.

Дендритные клетки у" зараженных вирусами Ыарбург и Эбола обезьян в первые двое сут сохраняли нормальную структуру. На третьи-четвертые сут в этих клетках обнаруживались отек цитоплазмы, никноз. ядер и апоптоз, а с пятых сут дендритные клетки на срезах не удавалось обнаружить вовсе. Места их локализации содержали клеточный детрит, не поддающийся идентификации. Как и в случае клеток стромы и. макрофагов, деструкция дендритных клеток про-

исходила повсеместно. Не наблюдалось связи разрушенных дендритных клеток с локализацией зараженных клеток СЫФ.

Проведенное исследование показало, что морфологические параметры поражения органов и клеток лиыфоидной системы одинаковы у морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола при летальной форме заболевания, когда гибель наступает в течение шести-семи, а при малых инфицирующих дозах - девяти-десяти сут после заражения. Наблюдаются лимфоидное истощение, отсутствие митозов и плазмацитогенеза, разрушение стропы, макрофагов и дендритных клеток лимфоидной ткани, нет реакции лейкоцитов на зараженные клетки. Анализ полученных результатов позволяет предположить , что начальным звеном в цепи патологических изменений лимфоидной ткани (а стало быть и функций иммунной системы) является заражение клеток СЫФ вирусами Ыарбург и Збола.

Исследование структурных аспектов патогенеза заболеваний, вызываемых вирусами Ыарбург и Эбола, позволило установить его основные звенья у чувствительных животных. Независимо от способа заражения и вида экспериментальных животных, при летальной форме заболевания наблюдаются:

- первичная репродукция вирусов Ыарбург и Эбола в клетках СЫФ;

- размножение вирусов Ыарбург и Эбола "в гепатоцитах, клетках коры надпочечников, фибробластах и эндотелиоцитах;

- диссеминация инфекции в организме посредством вирионов и зараженных клеток СШ;

- раннее повреждение системы микроциркуляторного русла внутренних органов, нарастающее в ходе инфекции;

- выраженные деструктивные изменения печени, селезенки, надпочечников, почек и красного костного мозга;

- повреждение системы детоксикации организма;

- отсутствие заметных деструктивных изменений сердечной мышцы; эпителиальной выстилки кишечника, слюнных и поджелудочных желез; -

- нарушение лимфо-, ыоноцито- и тромбоцитопоэза;

- отсутствие признаков реакции лейкоцитов на зараженные клетки и признаков воспаления во всех исследованных внутренних органах;

- отсутствие признаков развертывания гуморального иммунного ответа в ходе инфекции;

- генерализованное разрушение клеток СЗИ.

Подученные данные показывают, что способность филовирусов

размножаться в клетках СМ® обуславливает чувствительность организма к заражении. Именно клетки Clffi являются первичными мишенями для филовирусов и поддерживают их репродукцию в ходе заболевания у морских свинок и обезьян- Изучение органов морских свинок в ходе адаптации вируса Эбола показало, что взаимодействие вирус-клетка СМФ может носить различный характер, который в конечном счете и определяет развитие и исход инфекции.

Заражение филовирусами клеток СМФ, принимающих участие в регуляции многочисленных иммунных, физиологических и патологических процессов, не может не нарушать их функций. Признаками этого нарушения являются обнаруженные у всех животных ранние повреждения микроциркулягорного русла, разрушение клеток СМФ и стромы лимфо-идной ткани, прямо не связанные с размножением вирусов. Полученные данные в целом свидетельствуют о ведущей роли гуморальных факторов в развитии патологических процессов в организме животных, зараженных филовирусами, а сам характер этих изменений позволяет предполагать триггерную роль медиаторов клеток СМ® в их индукции. На основании проведенного исследования маяно построить вероятную схему основных стадий патогенеза летальной филовирусной инфекции (схема 1).

Патологические реакции, индуцированные размножением филовирусов в клетках СШ>, разворачиваются в виде многомерного каскада, звенья которого взаимосвязаны и способны усиливать друг друга. Идентификация субтипов клеток СМФ, ответственных за развитие тех или иных патологических изменений, является сложной задачей, поскольку в настоящее время не установлена взаимосвязь различных популяций клеток СМФ и их функций. Характер наблюдаемых патологических изменений позволяет предположить, что в их индукции принимают участие интерлейкины 1 и 6, гамма-интерферон и фактор некроза опухолей альфа. Влияние этих медиаторов на микроциркуляцию, реологическое состояние крови, проницаемость сосудов и состояние иммунитета показано в многочисленных работах CBendtzen К., 1988; Heller R.A., Kronke М., 1994; Le J.M., Vilcek J., 1989 и др.]. Опубликованы также сведения о корреляции уровня вышеперечисленных веществ с тяжестью течения геморрагической лихорадки Денге [Hober D. et al., 1993; Yang K.D. et al., 1995].

Исследование на разных моделях экспериментальных животных показало, что генерализованное выпадение фибрина и образование геморрагий не являются критическими звеньями патогенеза терми-

Схема 1.

Вероятная схема основных стадий патогенеза летальных филовирусных инфекций

Заражение клеток СЫФ

"Наработка" вируса

V

Заражение новых клеток СМ®

Заражение клеток других типов

"Наработка" вируса

Нарушение микроциркуляции Нарушение функций иммунной системы и кроветворения

Деструктивные изменения печени, селезенки, почек, надпочечников красного костного мозга, легких Развитие интоксикации

Нарушение кровотока в легких

Шок, смерть

нальных стадий филовирусных инфекций. Эти. тяжелые нарушения в системе кровоснабжения, несомненно, осложняют течение заболевания и могут приводить к гибели, но их' отсутствие у животных, зараженных вирусом Марбург, а также у морских свинок и циномольгусов, зараженных вирусом Эбола, позволяют исключить генерализованное выпадение фибрина и образование геморрагий из перечня непосредственных причин развития терминального шока и наступления смерти.

Отсутствие воспалительной реакции, признаков отека легких и симптомов респираторного заболевания отодвигало этот орган на второй план при анализе экспериментальных'и клинических данных. Исследование динамики филовирусных инфекций выявило отек эндотелия, гемостаз и накопление нейтрофилов в,альвеолярных капиллярах экспериментальных животных на терминальных стадиях. Нейтрофилы, являясь эффекторными клетками неспецифического звена .иммунитета, принимают участие в.реализации,большого числа патологических процессов в организме [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995; Murohara Т. et al., 1994; Sralth J.А;, 19943. Накопление и деструкция нейтрофилов в просвете кровеносных сосудов является главной причиной тяжелых нарушений кровоснабжения, ведущих к респираторному дистресс-синдрому (РДС), обычно имеющему фатальный исход Шаянский А.Н., 1995; Bone R.C. 1996; Leaver.Н.A. et al. 19953. РДС, связанный с пневмонией и обструкцией мелких бронхов, наблюдается у больных геморрагической лихорадкой Ласса И у морских свинок, за-раяенных вирусом Пичинде [Schaeffer R.C. et. al., 1993]. Наблюдаемые, у экспериментальных животных изменения альвеолярного эпителия и капилляров указывают на выраженное нарушение газообмена, способного привести к кислородной недостаточности внутренних органов и головного мозга. Прогрессирующая гшоксия на фоне нарастающей интоксикации и может служить непосредственной причиной развития терминального шока и смерти при филовирусных инфекциях.

Анализ комплекса полученных данных позволяют заключить, что летальная-форма филовирусных инфекций развивается как результат ■ неадекватных реакций организма на внедрившийся патоген, а не как прямое следствие- размножения вируса в организме. Выявленные на ранних стадиях инфекции стаз и тромбоз капилляров и мелких кровеносных сосудов, сладж эритроцитов и отек эндотелиоцитов являются .признаками повреждения микроциркуляции во внутренних органах. Нарастающие в ходе инфекции нарушения в системе микроцир^ляторного русла ведут к усилению нарушений кровоснабжения органов, что, в

свою очередь, углубляет их патологические изменения, особенно в печени и почках. Нарушение детоксикационных функций печени усиливается вовлечением гепатоцитов в репродукцию филовирусов. В целом прогрессирующее повреждение детоксикационных функций печени и почек усугубляет нарушения кровоснабжения и ведет к накоплению токсических продуктов в крови. Свой "вклад" в патогенез филовнрусных инфекции, несомненно, вносит и поражение надпочечников, гор-мон-продуцирующие • функции которых нарушаются репродукцией вируса в их клетках. Поражение- кровеносной системы, надпочечников, систем иммунитета и детоксикации в ходе инфекции становится необратимым и ведет к гибели животных. Патологический процесс развертывается на фоне отсутствия защитных реакций со стороны иммунной системы, что создает благоприятные условия для размножения и дис-семинации вируса.

Проведенное исследование позволяет заключить, что по существу экспериментальные филовирусные геморрагические лихорадки являются острым заболеванием макрофагальной системы, вирусное поражение клеток которой индуцирует поражение кровеносной и иммунной системы.

ВЫВОДЫ

1. При электронно-микроскопическом исследовании морфогенеза филовирусов установлено, что рецептивный эндоцитоз является основным путем проникновения вируса Марбург в клетки. Вирус Эбола проникает в клетки главным образом путем слияния с плазмалеммой. Форшрование структурных разновидностей вирусов Марбург и Збола обусловлено ориентацией нуклеокапсидов относительно плазмалеымы.

2. Неадаптированный к морским свинкам вирус Эбола' размножается только в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, индуцируя очаги острого гранулемоподобного воспаления печени вокруг инфицированных клеток. Единичные зараженные клетки Купфера, лежааще вне воспалительных очагов, свидетельствуют о гетерогенности популяции неадаптированного вируса Эбола по характеру взаимодействия с клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Патологические изменения селезенки, легких, почек и лимфоузлов морских свинок, зараженных неадаптированным вирусом Эбола, незначительны.

3. В процессе адаптации вируса Эбола к морским свинкам путем последовательных пассажей расширяется набор чувствительных клеток. В репродукцию вируса вовлекаются гепатоциты, клетки коры надпочечников; фибробласты и клетки эндотелия. В ходе пассажей

наблюдается нарастание степени патологических изменений внутренних органов и исчезает воспалительная реакция.

4. Для вирусов Марбург и Эбола первой клеткой-мишенью являются .клетки системы мононуклеарных фагоцитов, независимо ог способа заражения и вида экспериментального животного. На последующих стадиях инфекции в размножение филовирусов пермиссивные клетки вовлекаются в следующей последовательности: 1. гепатоцигы и клетки коры надпочечников; 2. фибробласты и клетки эндотелия. Диссеминация филовирусной инфекции происходит посредством переноса вирусных частиц и зараженных клеток системы мононуклеарных фагоцитов током крови и лимфы, а также путем миграции зараженных клеток этого типа в паренхиму и интерстиций внутренних органов.

5. В динамике филовирусных инфекций у обезьян и морских свинок первыми развивзются патологические изменения в системе микро-циркуляторного русла и лшфощпоп ткани (на вторые-третьи сутки после заражения). Наиболее выраженные деструктивные изменения в ходе инфекции происходят в печени, селезенке, красно;/ костном мозге, почках, надпочечниках и легких. Деструктивные изменения внутренних органов не сопровождаются воспалительно-клеточной инфильтрацией.

6. У морских свинок и обезьян, заракенных вирусами Ыарбург и Эбола происходит глубокое поражение кроветворения: блокирован лимфо- и моноцитопозз, отсутствуют, признаки формирования структурно полноценных кровяных пластинок, разрушается строма красного костного мозга.

7. Поражение кровеносных сосудов является.ведущим кошонеи-том комплекса деструктивных изменений внутренних органов -морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола. У всех животных прйисходит повреждение ыикроциркуля торнсго русла. У зеленых мартышек и макак резус, зараженных вирусом Эбола, формируются фибриновые и фибриново-клеточныэ трсмбы; у павианов гамадрилов -геморрагии. У животных, зараженных вирусом Марбург, не выявляется занятного выпадения фибрина и формирования геморрагии.

9. У морских свинок и обезьян, зараженных вирусами Ыарбург и Эбола наблюдаются отчетливые морфологические признаки поражения . иммунной системы: генерализованное разрушение клеток системы но-нонузглеарных фагоцитов, б той числе дендритных (антиген-представ-ляющих) и кпеток стромы лммфоидной ткани; отсутствие реакции лейкоцитов на зараженные клетки; отсутствие митозов и плазмацитоге-

■ . - 36 -неза.во всех местах анатомической локализации лимфоидной ткани.

9. Заражение клеток системы мононуклеарных фагоцитов вирусами Ыарбург и Эбола играет ключевую роль в патогенезе экспериментальных филовирусных инфекций, обусловленную участием этих клеток в регуляции различных физиологических, иммунных и патофизиологических реакций.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рябчикова Е.И., Баранова С.Г., Ткачев В.К., Грааданцева А.А.- Морфологическое изучение Эбола-инфекции у морских, свинок// Вопросы вирусол.- 1993. - N 4. - с,176-179.

2. Перебоева Л.А., Ткачев В.К., Колесникова Л.В., Крендёлева Л.Я., Рябчикова Е.И., Смолина Ц.П. Ультраструктурное изучение органов морских свинок при последовательном пассировании вируса Збола// Вопр. вирусол. - 1993. - N 4. - с.179-182. .

3. Рябчикова Е.И., Воронцова Л.А,, Скрипченко А.А., Шестопа-лов A.M., Сандахчиев Л.С. Поражение внутренних органов экспериментальных животных, зараженных вирусом болезни Ыарбурга. Билл, экспер. биол. мед. - 1994. - т. СХУП. - N 4. - с. 430-434.

4. Ryabchlkova Е. I., Kolesnikova L.V., Tkachev V.K., Pereboeva L.A., Baranova S.6., Rassadkln Yu.N.. Investigation of Ebola Infection, pathogenesis In monkeys// Proc. CB Medical Treatment Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Medical Treatment. 5-8 December 1994, Splez, Switzerland. Splez, Switzerland, 1994. p. 9.16-9.28.

5. Скрипченко А.А., Рябчикова Е.И., Воронцова Л.A., Шестопа-лов A.M., Вавунов С.А. Вирус Марбург и мононуклеарные фагоциты: изучение взаимодействия// Вопр. вирусол. - 1994.. - N 5. -с.215-219.

6. Никифоров В.В., Туровский Ю.И., Калинин П.П., Акинфеёва Л.А., Каткова Л.Р., Бармин B.C., Рябчикова Е.И., Попкова Н.И., Шестопалов A.M., Назаров В.П., Ведищев С.В., Нетесов С.В. Случай лабораторного заражения лихорадкой Ыарбург// X. микробиол. эпиде-миол. иымунол. - 1994. - N 3. - с.104-106.

7. Чепурнов А.А., Мераликин Н.В., Рябчикова Е.И, Чепурнова Т.С., Волчков В.Е., Истомина Н.Н., Кузьмин В.А., Воробьева U.C. Получение очищенного вируса Эбола// Вопр. вирусол. - 1994. - N6. - с.254-256.

8. Лучко С.В., Дадаева А. А., Устинова Е.Н., Сиаикова Л.П.,

Рябчикова Е.И., Сандахчиев JLC.. Экспериментальное изучение геморрагической лихорадки Эбола на модели павианов-гамадрилов. Билл, экспер. биол. мед.// 1905. - т.СХХ. - N 9. - с.302-304.

9. Ryabchikova Е., Kolesnlkova L., Snollna М., Tkachev V., Pereboeva L., Baranova S., Grazhdantseva A., Rassadkln Yu. Ebola virus Infection In guine pigs: presumable role of granulomatous Inflammation In pathogenesis. Aroh. Virol. - 1996. - v.141. - N5. - p.909-922.

10. Ryabchikova E., Kolesnlkova L., Sergeev A. Specific features of fllovirus Infection In respiratory challenged experlemntal animals. The ASA Newsletter// 19S5. - N 4. -p. 10-13.

11. Ryabchikova E., StreletsL., Kolesnlkova L., Pyankov 0., Sergeev A. Respiratory Warburg virus Infection In guinea pigs. Arch. Virol.// 1998. - v.141. - N11. - p.2177-2190.

12. Ryabchikova E., Kolesnlkova L., Sergeev A. Specific features of fllovirus Infection In respiratory challenged experlemntal animals// Proc. of II CB Modleal Treatment Symposium: An Exploration of Present Capabilities and Future Requirements for Chemical and Biological Modlcal Treatment. 7-12 July 1995. Ed.B.Price. Portland". - 1997. - p.235-233.

13. Ryabchikova E.I., Kolesnlkova L.V., Notesov S.V. Animal pathology of flloviral Infections. In: "Filovlrusas: Marburg end Ebola viruses". Current Topics In Microbiology 2nd Irmunology. Ed. Klenk H.-F. - Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 1Q97. -p.57-72.

14. Колесникова Л.В., Рябчикова Е.И., Рвссздккн Ю.Н., Граз-данцева А.А. Ульграсгруктурный стереологическнй анализ легких у обезьян при экспериментальной лихорадке Эбола// Ешш. зкепер. биол. мед. - 1997. - т.123. - N2. - с.205-203,

Соискатель Е.И.Рябчикова

ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" з. 58 т. 100 1997г.