Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение свойств козьих и овечьих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зубавичене, Наталья Маратовна

Перечень сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Краткая характеристика геморрагической лихорадки Эбола.

1.1.1. История открытия заболевания.

1.1.2. Клинические проявления болезни.

1.1.3. Лечение.

1.2. Вирус Эбола.

1.2.1. Электронная микроскопия и строение вирионов.

1.2.2. Биологические свойства вируса.

1.2.3. Иммуносупрессивные свойства вируса Эбола.

1.2.4. Инактивация вируса Эбола.

1.2.5. Лабораторные животные для изучения лихорадки Эбола.

1.3. Иммунопрофилактика и иммунотерапия.

1.3.1. Возможность активной иммунизации.

1.3.2. Эффективность иммунотерапевтических препаратов.

1.3.3. Механизм действия иммуноглобулинов.

1.3.4. Особенности применения гетегологичных иммуноглобулинов

1.4. Способы получения гипериммуных гетерологичных сывороток и их фракционирование.

1.4.1. Получение гетерологичных гипериммунных сывороток.

1.4.2. Способы фракционирования иммунной сыворотки (плазмы).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и изучение свойств козьих и овечьих лечебно-профилактических иммуноглобулинов против болезни Эбола"

Актуальность темы. В 1976 г в Африке, почти одновременно в Заире и Судане заявило о себе ранее неизвестное заболевание, сопровождающееся значительным подъемом температуры и обильными геморрагическими кровотечениями на терминальных стадиях, с высоким уровнем фатальных исходов (до 87%) [Siegert R., 1978; Isaacson М. et al., 1978; Baron R.C. et al., 1983; Bource p. et al., 1983; Отчет Международной комиссии, 1978]. Это заболевание получило название геморрагической лихорадки Эбола по имени реки, на берегах которой произошла первая идентифицированная вспышка. Возбудителем оказался вирус с морфологией, сходной с морфологией ранее открытого вируса Марбург. Высокая контагиозность лихорадки Эбола в сочетании с высочайшей летальностью среди заболевших заставили отнести возбудитель болезни к 1-й группе биологической опасности. Хотя вспышки были относительно быстро локализованы и подавлены, высокая опасность заболевания подтолкнула к началу проведения исследований возбудителя в нескольких мировых вирусологических центрах. Были проведены клинические, биохимические и патоморфологические исследования болезни, выявлен круг чувствительных животных [Bowen E.T.W. et al., 1977; Siegert R., 1988], описана морфология вируса, ряд его физико-химических свойств и молекулярно-биологическое строение [Johnson К.М. et al.,1977; lones В.М. et al., 1981; Buchmeir M.I. et al., 1983; Cox N.J. et al., 1983; Murphy F.A. et al., 1978], что позволило составить общие представления о данном заболевании и наметить пути поиска средств и способов борьбы с ним.

После открытия вируса Эбола имело место несколько спорадических и эпидемических случаев в Судане, Заире, Либерии, Береге слоновой кости, Габоне. Ретроспективный анализ банка сывороток с ряда вспышек желтой лихорадки и других заболеваний, позволяет предположить, что иногда лихорадка Эбола проходила под другими диагнозами [Salluzzo et al., 1982; Van Der Groen G. et al., 1978; Van Der Groen G. et al., 1979; Salluzzo J.F. et al., 1980; Bowen E.T.W. et al., 1978]. Лето 1995 года вновь ознаменовалось крупной вспышкой геморрагической лихорадки Эбола в Заире (г.Киквит), унесшей жизни 80% из 314 заболевших. За этим, в 1996 году последовала вспышка в Габоне, в которую было вовлечено 34 человека, из которых погибло 25.

Исследования по поиску средств профилактики и терапии лихорадки Эбола, проводящиеся во многих вирусологических центрах мира с момента выделения вируса - возбудителя заболевания до настоящего времени не дали убедительных результатов. В тоже время в связи с нарастанием миграции населения, массовым туризмом, экспортом животных, в том числе нелегальным, увеличивается риск переноса этой тяжелой инфекции с Африканского континента в страны Америки, Азии и Европы, в том числе и в нашу страну. Это усиливает актуальность создания средств защиты против этого заболевания. Поскольку вирус Эбола относится к 1-й группе вирусных инфекций, все операции с активным вирусным материалом проводятся в лабораториях с максимальным уровнем защиты. Однако это не дает полной гарантии от инфицирования персонала в результате лабораторных аварий. Это обстоятельство также требует наличия средств экстренной профилактики.

Эффективным средством экстренной профилактики вирусных заболеваний является пассивная иммунизация, основной принцип которой заключается в переносе антител (в виде сыворотки или гаммаглобулина) от иммунного хозяина к неиммунному. Противовирусное действие антисыворотки опосредовано механизмом нейтрализации вируса антителами. Включение этого процесса сразу после введения антител в организм позволяет использовать антисыворотку в качестве экстренной меры защиты, когда нет времени для получения активного иммунного ответа или когда отсутствует вакцина.

Большинство протективных сывороточных препаратов, применяемых в медицине, производится из плазмы или сыворотки человека. Однако, иногда возможности получения гомологичных иммунотерапевтических препаратов крайне ограничены. Например, сложно получить препараты против экзотических вирусных инфекций с высокой степенью летальности. В этих случаях целесообразно использовать гетерологичные сыворотки или глобулины.

В связи со сказанным нами была проделана работа по созданию гетерологичного лечебно-профилактического иммуноглобулина против болезни Эбола и оценке свойств полученного препарата. В данной работе описаны полученные результаты.

Цель и задачи исследования. Цель работы - посредством иммунизации коз (овец) получить иммуноглобулиновый препарат, обладающий протективными свойствами против болезни Эбола. В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

1. Подобрать условия иммунизации для получения сывороток крови овец и коз с высокими титрами нейтрализующих антител против болезни Эбола.

2. Изучить лечебно-профилактические и лабораторно-клинические свойства полученных иммуноглобулинов. Разработать методику их применения.

Научная новизна. Результаты исследований представляют собой разработку иммунологических аспектов получения иммуноглобулина, специфичного к вирусу Эбола.

Определено развитие гуморального ответа в ходе иммунизации коз, что существенно расширяет представление о механизмах патогенного действия вируса Эбола и реакции организма на вирусную инфекцию.

Получены новые данные об особенностях иммунного ответа у чувствительных и нечувствительных к вирусу Эбола видов животных (морские свинки, кролики, овцы, козы). Изучен спектр антител гипериммунной сыворотки у коз-продуцентов.

Установлено, что только иммунизация активным вирусом позволяет получить сыворотку с высокими нейтрализующими свойствами. Иммунизация инактивированным вирусом ведет к продукции сыворотки с высокими титрами антивирусных антител, диагностируемых в ИФА, но обладающих низкими вируснейтрализующими свойствами.

Показано, что наибольшей протективной (вируснейтрализующей) активностью обладает подкласс IgG2 козы. Именно этот подкласс преобладает в готовой форме препарата иммуноглобулина против болезни Эбола.

Практическая значимость.

Разработаны условия получения производственных количеств гипериммунной сыворотки коз и профилактического иммуноглобулина. Проведена оценка профилактических свойств иммуноглобулина против болезни Эбола на лабораторных животных. Разработаны практические рекомендации по схеме применения серопрепарата в комплексе мер экстренной профилактики болезни Эбола.

Разработаны нормативные документы на изготовление козьего (овечьего) иммуноглобулина против болезни Эбола и на его практическое использование: «Инструкция по изготовлению и контролю», «Проект Временной Фармакопейной статьи», «Инструкция по применению», «Программа испытаний на добровольцах», «Отчет о доклинических испытаниях». По решению научно-технического совета Института и действовавших в тот период контрольных инстанций были проведены ограниченные испытания козьего иммуноглобулина против болезни Эбола на добровольцах.

Козий иммуноглобулин неоднократно применялся для экстренной профилактики болезни у лиц, вовлеченных в аварию при работе с вирусом Эбола.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработаны условия получения производственных количеств гипериммунных козьих и овечьих сывороток. Исследование подклассов козьих гипериммунных сывороток показало, что IgG2 обладает максимальной вируснейтрализующей активностью и минимальной аллергенностью.

2. Изучены лабораторно-клинические характеристики препаратов козьего и овечьего иммуноглобулинов, определены их вируснейтрализующие и протективные свойства. Показано, что препараты оказывают максимальное защитное действие при однократном введении в первые 24 часа с момента предполагаемого инфицирования.

3. Испытание на добровольцах показало, что препараты козьих иммуноглобулинов безвредны, апирогенны, нетоксичны для печени и почек, не обладают выраженным иммуносупрессивным эффектом. Препарат применялся на людях в целях экстренной профилактики в 4-х случаях.

Апробация работы. Фрагменты настоящей работы доложены на 1 и 2 отраслевой конференции молодых ученых по проблемам вирусологии, биотехнологии и молекулярной биологии (Новосибирск, 1988 и 1990гг); отраслевом совещании в Кольцове (Новосибирск, 1993г), Всероссийской конференции по иммунологии и профилактике особо опасных инфекций (Саратов, 1993), X Международном вирусологическом конгрессе (Иерусалим, 1996г), Международном коллоквиуме по филовирусным

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Зубавичене, Наталья Маратовна

ВЫВОДЫ.

1. Подобраны эффективные условия получения производственных количеств гипериммунных сывороток овец и коз: иммунизация активным вирусом, количество циклов иммунизации - не менее 4-х, интервалы между введениями- 1 месяц. Необходимым показателем для производственного взятия крови животных-продуцентов является достижение продукции нейтрализующих антител с индексом нейтрализации не менее 2,5 lg ЛД50.

2. Впервые в мире получены профилактические препараты козьего и овечьего иммуноглобулинов, специфичных против болезни Эбола. Иммуноглобулины безвредны, нетоксичны, апирогенны, обладают слабой аллергизирующей активностью. Индекс нейтрализации - не менее 1000.

3. Исследование козьих гипериммунных сывороток показало, что подкласс IgG2 обладает максимальной вируснейтрализующей активностью и минимальной аллергенностью.

4. Показано, что препараты оказывают свое защитное действие при однократном введении в первые 48 часов с момента предполагаемого инфицирования с максимальным эффектом в первые 24 часа.

5. Показано, что при испытании на добровольцах препарат козьего иммуноглобулина безвреденный, апирогенный, не обладает выраженным иммуносупрессивным эффектом, не действует на ферментативную систему печени и выделительную систему почек. Однако, являясь гетерологичным белком, вызывает сенсибилизацию организма и повышает уровень аллергической настроенности. При применении в 4-х случаях для экстренной профилактики лабораторного заражения на людях, допустивших аварии при работе с вирусным материалом с высокой степенью вероятности инфицирования, заболевания геморрагической лихорадкой Эбола не наступило.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Нами была изучена возможность использования овец и коз в качестве продуцентов иммунной сыворотки против болезни Эбола. Оба этих вида животных нечувствительны к данной инфекции. Уже спустя 14 суток вирус не обнаруживается ни в крови, ни в физиологических выделениях (слюна, моча, кал), ни в пробах внутренних органов (печень, селезенка, кровь). Относительная простота в уходе и в обращении с этими животными в условиях работы в помещениях с максимальным уровнем защиты также является преимуществом. От одного животного в течение 8 месяцев возможно получить 3-4 л иммунной сыворотки, что эквивалентно 80-100 дозам препарата специфического иммуноглобулина.

Экспериментальные исследования по выбору наиболее эффективного и технологичного препарата для иммунизации животных-продуцентов показали, что для получения гипериммунных сывороток с высокой вируснейтрализующей активностью в отношении вируса Эбола необходимо использовать препараты, содержащие вирус в активной форме. Иммунизация инактивированным вирусом позволяет получать высокотитражные в ИФА сыворотки для диагностических целей, но обладающие низкой вируснейтрализующей активностью и в связи с этим не пригодные для получения лечебно-профилактических препаратов.

Среди препаратов, содержащих живой вирус, наиболее иммуногенным показал себя очищенный концентрированный вирус Эбола. Близкие результаты получены при иммунизации животных 10%-ным гомогенатом печени инфицированных морских свинок, не смотря на относительно низкое содержание специфического белка (0,001%) среди балластных растворимых антигенов печени. По видимому, не смотря на отсутствие клинических проявлений инфекционного процесса у коз и овец, имеет место абортивная бессимптомная инфекция с продукцией не полноценных вирионов, а отдельных вирусных белков.

Хотя при иммунизации коз 10%-ным гомогенатом печени инфицированных морских свинок в первые 2 месяца от начала иммунизации наблюдался мощный гуморальный ответ на растворимые антигены печени, то после 3-го цикла титры этих антител практически не увеличивались. Увеличение титров вирусспецифических антител шло медленнее, однако имело постоянную положительную динамику. К 4-м месяцам от начала иммунизации соотношение «антипеченочных» и «антивирусных» антител уравнялось и, в дальнейшем, титры противовирусных антител превысили значение титров антител на растворимые антигены печени морских свинок. Использование ВЭЖХ позволило определить принадлежность синтезируемых животными-продуцентами антител к разным подклассам иммуноглобулинов G. При этом противовирусные антитела были представлены, в основном, иммуноглобулинами подкласса IgG2 и, в небольшом количестве, IgGIA. Антитела к растворимым антигенам печени морской свинки, относятся преимущественно к иммуноглобулинам подкласса IgGIB и, частично, IgGIA. Методом иммуноблоттинга показано, что IgG2 представляет собой смесь антител к белкам нуклеокапсидного комплекса Npio7, поверхностному гликопротеиду Gp125 и к белкам вириона (Vp30 , Урз5 , Vp4o). Подкласс IgGIA взаимодействует с белками Урзо, Урз5, Vp40- В то же время, IgG2 обладает наибольшей вируснейтрализующей активностью. Все вышеизложенное позволяет предположить, что именно антитела к белкам Npio7 и Gpi25 в иммунных сыворотках определяют их способность нейтрализовать вирус Эбола.

Установлено, что кровопускание у животных-продуцентов для получения иммунной сыворотки и последующего производства иммуноглобулина следует проводить, когда индекс нейтрализации иммунной сыворотки достигнет значения не менее 2,5 lgJlflso, что достигается 4-5 циклами иммунизации.

Для получения профилактического препарата из сыворотки иммунных животных-продуцентов был использован наиболее часто употребляемый в практике производства гаммаглобулинов метод фракционорования спиртом на холоду по Кону. При этом в рабочую фракцию попадают, в основном, IgG2, содержащие преимущественно вируснейтрализующие антитела. Антитела к растворимым антигенам печени морской свинки, относящиеся к подклассу IgGIB, в процессе спиртового осаждения в основном уходят в побочную фракцию и в готовый препарат иммуноглобулина не попадают. Таким образом, не смотря на то, что в препарате для иммунизации содержится большое количество балластных белков, за счет эффекта наступления толерантности животных-продуцентов к ним и эффективного разделения при фракционировании сыворотки, в готовом препарате иммуноглобулина присутствуют, в основном, противовирусные антитела.

Иммуноглобулин против болезни Эбола из сыворотки коз (овец), выделенный методом Кона, представляет собой прозрачную бесцветную или розоватую, слегка опалесцирующую жидкость с содержанием белка 100-140 мг/мл, рН 7,4 нетоксичную, апирогенную. Все серии козьих и овечьих иммуноглобулинов, специфичных к вирусу Эбола, соответствуют требованиям к сывороточным препаратам, изложенным в приказе № 665 Минздрава СССР.

Иммуноглобулин оказывает профилактический эффект при введении в течение первых 48 часов с момента инфицирования с максимальным эффектом в 1-е сутки (ИТ- 2,0 lg ЛД50 для морских свинок). Многократное введение препарата не оказывает влияния на повышение его защитных свойств. При введении иммуноглобулина с профилактической целью защитный эффект наблюдается в течение 72-х часов до заражения с максимальными значениями в течение первых 24-х часов до заражения (срок наблюдения).

Изучение динамики вывода препарата из крови животных-рецепиентов показывает, что в крови низших приматов иммуноглобулин циркулирует, в среднем, 10-14 сут. Максимальные титры козьих иммуноглобулинов в крови этих животных составили в первые 2-е сут 1:5000 (в ИФА). На 7-е сутки их уровень понизился вдвое и на 14-21-е сутки определялся на уровне следов. Индекс нейтрализации образцов сывороток крови этих же животных был равен, в среднем, 1,0 lg ЛД50 в течение первых 7 суток с момента введения иммуноглобулина и снизился к 14-м суткам практически до нуля.

Доклинические испытания препарата на лабораторных животных и его испытания на добровольцах показали, что препарат обладает слабой аллергизирующей активностью, апирогенен, нетоксичен. Максимальные титры противовирусных антител в крови добровольцев наблюдали в первые 3 суток с момента введения и достигали, в среднем, 1:(170±110) в ИФА. На 7-е сутки уровень антител снизился, примерно, вдвое и на 14-е сутки определялся на уровне следов.

Индекс нейтрализации сывороток крови добровольцев в первые 3 суток, в среднем, составил (l,16±0,66)lg ЛД50 для морских свинок. Причем, отмечали индивидуальные колебания в скорости выведения козьих иммуноглобулинов из крови добровольцев от 3-х до 21 суток.

Из 4 случаев применения иммуноглобулина против болезни Эбола сотрудникам, допустившим аварию при работе с вирусным материалом, наибольшего внимания заслуживают 2 случая. В обоих случаях наблюдалось нарушение целостности кожных покровов иглой, контаминированной кровью больных животных. В одном из этих случаев расчетная доза инфицирующего материала оценивалась в 102-103 летальных доз для обезьян. В числе комплекса мер по экстренной профилактике и лечению важнейшим было своевременное введение иммуноглобулина в дозе 6,0 мл. Во всех случаях развития заболевания геморрагической лихорадкой Эбола не наступало, что позволяет предположить эффективность профилактики иммуноглобулином как высокую.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зубавичене, Наталья Маратовна, Кольцово

1. Анджапаридзе О.Г. Реактогенные свойства гетерологичных гаммаглобулинов. //В кн. «Серопрофилактика и серотерапия вирусных инфекций в эксперименте и клинике.», М., 1968 с. 149-170.

2. Ашмарин И.П., Воробьев Л.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. //Ленинград, 1962.

3. Безредка A.M. Анафилактогенность и антианафилактогенность. //Москва, 1928 с. 130.

4. Бейлинсон А.В. Антитоксические сыворотки высокой степени очистки и концентрации и разработка производственных методов их получения. //Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктор биологических наук. М., 1954 - 23 с.

5. Бургасов П.Н. Руководство по вакцинному и сывороточному делу //М., 1978 с. 315-321.

6. Вирусные геморрагические лихорадки. //Доклад комитета Экспертов ВОЗ Москва, 1986.

7. Вязов О.Е., Ходжаев Ш.Х. Руководство по иммунологии. //М., «Медицина» 1973.

8. Геморрагическая лихорадка Эбола в Судане в 1976г. Отчет международной комиссии. //Бюлл. ВОЗ 1978 - т. 56 - с. 272-376.

9. Геморрагическая лихорадка Эбола в Судане в 1976 году. Отчет международной комиссии. //Бюлл. ВОЗ 1978 - т. 56 - N 2 - стр. 247-255.

10. Грачева JI.A. Материалы по получению и очистке иммуноглобулина из плаценты человека. //Вир. и бакт. препараты. — 1981 т. 30 - с. 73-79.

11. Дедкова JI.M. Изучение состава, физико-химических и иммунохимических свойств иммуноглобулинов класса G гипериммунных сывороток животных. //Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Кольцово, 1996.

12. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. //МЗ СССР, Москва, 1989.

13. Иванов А.П., Ткаченко Е.А., Ван Дер Гроен Г., Бутенко A.M., Константинов O.K. Непрямой иммуноферментный метод длялабораторний диагностики геморрагических лихорадок Ласса и Эбола. //Вопр. вирусол. 1986 -N 2- с. 186-190.

14. Киселева И.А., Толок А.Я., Семенова Т.В. Сравнительное изучение фракций, обогащенных IgG, выделенных различными методами. //Препараты крови. Горький, 1981а - с. 24-30.

15. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Немов В.В. Структура и свойства препарата иммуноглобулина для внутривенного введения. //Препараты крови Горький, 1981 б -с. 17.

16. Колмакова М.В., Ставицкая Н.Х. Получение препаратов, обогащенных IgM и IgA. //Вир. и бакт. препараты 1983 - т. 32 - с. 57-59.

17. Краснянский В.П., Михайлов В.В., Борисевич И.В., Градобоев

18. B.Н., Евсеев А.А., Пшеничнов В.А. Получение гипериммунной лошадиной сыворотки к вирусу Эбола. //Вопр. вирусол. 1995 - т. 40 - N2 - стр. 91-92.

19. Мигунов В.Н., Позина И.М., Кутимова Л.В., Груднев М.А., Лобань

20. C.А. Экспериментальное изучение распределения специфических примесей во фракциях глобулинов, полученных с помощью полиэтиленгликоля. //Препараты крови. Горький, 1981 - с. 30-36.

21. Михайлов В.В., Борисевич И.В., Черникова Н.К., Потрываева Н.В., Краснянский В.П. Оценка на павианах-гамадрилах возможностиспецифической профилактики лихорадки Эбола. //Вопр. вирусол. 1994 -т. 39-N2-с. 82-84.

22. Моисеева В.Г., Никифорова Т.В., Харитонова Н.И. и др. Внутривенное применение иммуноглобулинов при стафилококковых заболеваниях у детей раннего возраста. //Проблемы гематологии и переливания крови. 1977 - N 26 - с. 35-38.

23. Никифоров В.Н., Перельман М.И., Киселева И.А. Результаты испытания терапевтической эффективности иммуноглобулина для внутривенного введения. //В «Иммуноглобулины и другие препараты крови», JI. 1976 - с. 62.

24. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клинические методы иммунодиагностики. //Минск, Беларусь 1979 - 223 с.

25. Новожилов С.С., Титенко A.M. Вируснейтрализующие антитела в сыворотках морских свинок, иммунизированных вирусом Эбола (шт. Заир). //Иркутск, НИИ п/чум. Инст. Сибири и Дальнего Востока. РЖ 92 -N9 Б 1223.

26. Основы иммунологии //Под ред. Ройт А. Москва, «Мир» - 1991 -стр. 29-35.

27. Отчёт Международной Комиссии по вирусной геморрагической лихорадке в Заире в 1976 г. CDC, Атланта.//1п «Ebola vims haemorrhagic fever» Ed. S.R. Pattyn - Elsevier /North Holland. Biomedical. Press. - 1978.

28. Оценка иммунного статуса человека. //Методические рекомендации. -Москва, МЗ СССР 1984.

29. Перипечкина Н.П., May А.Н., Келлер Г.Ю., Шульце Т.А., Гурьев И.С. Некоторые особенности ультрафильтрации иммунебиологических препаратов. //Журнал микробиологии 1986 - N 6 - с. 46-50.

30. Пилявская Е.А., Васильева О.А., Савельева Г.А., Никитина Л.Н., Способ получения антирабического иммуноглобулина. //Авт. свид. N 1156697 (СССР)-1981.

31. Помелова В.Г., Мельникова Е.Э., Гайдамович С.Я. Получение иммунных сывороток к штамму 230 вируса ВЭЛ при иммунизации концентрированным в водно-полимерной системе вирусом./ЛЗопр. вирусол. 1988 - № 4 — с. 490

32. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. //РД 42-28-10-90. М.: МЗ СССР, 1989 - с. 49.

33. Потемкина Е.Е., Хромецкая Т.М., Крылова Е.Е., Мухина Н.А. и соавт. Некоторые биологические свойства препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения. //Гематол. и трансфузиол,- Москва, 1987-с. 7.

34. Программа изучения безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности иммуноглобулина против болезни Эбола из сыворотки овец (коз), жидкого на добровольцах. //НПО «Вектор», Новосибирск, 1990.

35. Пушкарев В.В. Антиглобулины и пассивный иммунитет. //Иммунологическая реактивность организма при введении бактерийных препаратов. М.: 1970 - с.79-80.

36. Рябчикова Е.И., С.Г. Баранова, В.К. Ткачев, А.А. Гражданцева. Морфологические изменения в органах морских свинок, инфицированных вирусом Эбола. //Вопр. вирусол. N 38/4 (июль-авг.) 1993 - с. 176-179.

37. Савельева Т.А., Никитина Л.Н., Купрессова O.K., Пилявская Е.А. Дальнейшее наблюдение по гетерологичным антивирусным иммуноглобулинам, полученным риванол-спиртовым методом. //Вир. и бакт. препараты. 1983 - т. 31 - с. 80-84.

38. Сепиашвили Р.И. Введение в иммунологию. //Цхалтубо -Кутаиси,- 1987- с. 230.

39. Сбигнева Э.И. Нарастание антител, гасящих гемагглютинацию при иммунизации животных различными антигенами, содержащими вирус Венесуэльского энцефаломиелита. //Вопр. эпидем., микробиол. и иммунол. -Томск, 1969 -с. 181-194.

40. Софронов Б.Н., Шемеровская Т.Г. Иммунологическая толерантность, индуцированная у взрослых иммунореактивных организмов. //Иммунология 1990 - N2 - с. 4-7.

41. Степанова Л. А., Музафарова Н.Х. Сравнительная оценка некоторых свойств антирабического иммуноглобулина и сыворотки, очищенной методом ферментолиза. //Вир. и бакт. препараты. 1980 - т. 30 - с. 93-99.

42. Степанова Л.А., Менявцева Т.А. Изучение анафилактогенных свойств ферментированного антирабического иммуноглобулина методами in vivo и in vitro. //Вир. и бакт. препараты. Томск, 1983 - т. 31 - с. 85-89.

43. Хавкин Ю.А. Комбинированный метод очистки плазмы. //Вопросы производства лечебных сывороток. Московский НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова - 1965 - т. 17- с. 136-137.

44. Холчев Н.В. Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения. //Новые лекарственные препараты 1983 - N 9 -с. 2-4.

45. Чепурнов А.А. Перспективы создания вакцины против лихорадки Эбола. //«Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций.» Межведомственная конференция. Тезисы докладов. Кольцово., 1993а-с. 38

46. Чепурнов А.А., Чернухин И.В., Терновой В.А.ДСудоярова Н.М., Махова Н.М., Азаев М.Ш., Смолина М.П. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. //Вопр. вирусол,- 1995 N 6 - с. 257-260.

47. Шемеровская Т.Г., Немов В.В., Киселева И.А., Софронов Б.Н. Сравнительное изучение иммуногенных и толерогенных свойств препаратов иммуноглобулинов в зависимости от их молекулярного состава.//Иммунология 1982 - №4 - с. 60-63.

48. Щетинина И.Н., Тарасова И.М., Холчев Н.В. Опыт применения иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения в клинике инфекционных болезней взрослых. //Препараты крови -Горький, 1981 с. 98.

49. Ahrens V.E. Method for preparation of gamma-globulin solution suitable for intravenous use. //Pat. 4312949 (USA), 1983.

50. Baron R.C., McCormic J.B., Lubeir O.A. Заболевание, обусловленное вирусом Эбола в Южном Судане. Внутрибольничное распространение и внутрисемейная передача. //Bull. WHO CDC Atlanta, USA - 1983 - vol. 61 - N 6 - p. 997-1003.

51. Bellanti F.A., Robbins F.B. Immunotherapy: the use of passive immunisation. //In "Immunology III" Pr. Saunders Company - 1985 - p.533-546.

52. Berge, Trygve 0. et al. Studies on the virus of Venezuelan equine encephalomyelitis. II modification by specific immune serum of response ofcentral nervous system of mice. /Лп "J. Immunol." 1961 - vol. 87 - N 5 - p. 509-517.

53. Bergmann J.F. These pour le Doctorat en Medicine. //Cochin., Port-Royal. 1981.

54. Bjorling H. Plasma fractionation method used in Sweden. //Vox. sang., 1972-vol. 23 - p. 18-25.

55. Bjorling H. A new protein fractionation. //Vox. sang. 1985 - v. 49 - N. 3,-p. 240-243.

56. Bleecer W.K., Anterberg J., Rigter G., Bakker J.C. Key role of macrophages in hypotensive side effects of immunoglobulin preparations studies in an animal model. //Clin. Exp. Immunol. 1989 - vol. 77 - N 3 - p. 338-344.

57. Brede H.D. Virale Haemorrhagische Fieber. //Munch, med. Wscher., -1988 -J. 130 N 42 - s. 83-87.

58. Bource P., Bergan P.F. Ebola vims infection in man: a serological and epidemiological survey in the Cameroons. //Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1983 -vol. 32-N6-p. 1465-1467.

59. Bowen E.T.W., Lloyd G., Harris W.J., Piatt G.S., Baskerville A., Vella E.E. Virus haemorrhagic fever in Southen Sudan and Northen Zaire, preliminary studies on the aethiological agent. //Lancet 1977 - N 1 - p. 571-573.

60. Bowen E.T.W., Lloyd G. et al. Вирусологическое изучение инфекции Эбола на человеке и обезьянах. //In: "Ebola Vims Haemorrhagic Fever." Ed. S.R. Pattyn -Elsevier/North Holland.Biomedical Press. 1978a.

61. Bowen E.T.W., Piatt G.S. et al. Вирусная геморрагическая лихорадка в Судане. Вирусологическое и серологическое обследование людей. //In: "Ebola Virus Haemorrhagic Fever" Ed. S.R. Pattyn. -Elsevier/North Holland Biomedical Press 1978b-p. 143-151.

62. Bowen E.T.W., Piatt G.S., Simpson D.I.H., McArdell L.B., Raymon R.T. Ebola haemorrhagic fever: experimental infection of monkeys. //Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1978 - vol. 72 - p. 584-593.

63. Bowen E.T.W., Piatt G.S., Lloyd G., Raymond R.T., Simpson D.I.H. A comparative study of strains of Ebola virus, isolated from Southern Sudan and North Zaire in 1976. //J. of Med. Virol. 1980 - vol. 6 - p. 129-138.

64. Bucheir M.J., De Fries R.U., McCormic J.B., Kiley M.P. Comparative analysis of the structural polypeptides of Ebola viruses from Sudan and Zaire. //J. Infect. Dis. 1983-vol. 147 - p. 276-281.

65. Bwaka A., Callain P., Colenbunders R., De Roo A. Ebola haemorrhagic fever in Kikwit, Zaire, 1995: clinical observations. // Abstracts of Intern. Colloq. "Ebola Virus Research" 4-7 sept., 1996, Antwerp., Belgium - p. 40.

66. Canonico P.G. Efficacy, toxicology and clinical applications of ribavirin against virulent RNA viral infections. //Antiviral Res. 1985 - suppl. 1 -p. 75-81.

67. Chepurnov A.A., Smolina M.P., Chuev Y.P., Kudojarova N.M., Volchkov V.E., Netesov S.V. Studying of Ebola virus strains with modified properties. //Abstracts of 9th International Congress of Virology Glasgow, Scottland, 8-13 Aug., 1993 - p. 300.

68. Chepurnov A.A., Tuzova M.N., Ternovoy V.A., Chernukhin I.V. Supressive effect of Ebola vims on T cell proliferation in vivo is provided by a 125-kDa GP viral protein. //Immunol. Letters 1999 - vol. 68 - p. 257-261.

69. Cox N.J., McCormick J.B., Johnson K.M., Kiley M.P. Evidence for two subtypes of of Ebola virus based on oligonucleotide mapping of RNA. //J. Infect. Dis. 1983 - vol. 147 - p. 272-275.

70. De Boer C.J., Cadilek A.E., Walters S.R. The use of hyperimmune antiserum concentrates in experimental western equine encephalomyelitis. //J. Immunol. 1955 - vol.75 - N 4 - p. 308-314.

71. Elliott L.H., McCormick J.B., Johnson K.M. Inactivation of Lassa, Marburg and Ebola viruses by gamma-irradiation. //J. Clin. Microbiol. 1982 -vol. 16 - N 4 - p.704-708.

72. Ellis D.S., Bowen E.T.V., Simpson D.I.H., Stamford S. Ebola virus: a comparison at ultrasructural level of the behavior of the Sudan and Zaire strains in monkey. //Brit. J. Exp. Pathol. 1978 - vol. 59 - p. 584-593.

73. Emand R.T.D., Evans В., Bowen E.T.V., Lloid G. A case of Ebola virus infection. //Brit. Med. J. 1977 - vol. 2 - p. 541-544.

74. Emond R.T.D. Isolation monitoring and treatment of a case of Ebola virus infection. //In: "Ebola virus haemorrhagic fever." /Ed. Pattyn S.R., New-York- 1978- p. 27-33.

75. Feldman H., Nichol S.T., Klenk H.-D., Peters C.G., Sanchez A. Characterization of filoviruses based on differences in structure and antigenicity of the virion glycoprotein. //Virology 1994 - vol. 199 - N 4 - p.469- 473.

76. Filovirus infection among persons with occupational exposure to non-human primates. //Weekly Epidem Rec. 1990 - N 24 - p. 185-186.

77. Filoviruses infection in animal handlers. //M.M.W.R. 1992 - vol. 39 -N 13 -p.351.

78. Finberg R., Horn R. //Year of Immunology 1986 - vol. 2 - p. 267-278.

79. Fiset P. Serological techniques. //In: Techniques in experimental virology /Ed. Harris R. 1967 - N 7 - ch. 7.

80. Fisher-Hoch S.P., Piatt G. H., Neild G.H., Southee Т., Baskerville A., Raymond R.T., Lloid G., Simpson D.I.H. Pathophysiology of shock and haemorrhage in a fulminating viral infection (Ebola). //J.Inf. Dis. 1985 -vol.152-N5-p. 887-894.

81. Frame J.D., Verbrugge G.P., Gill R.G. The use of Lassa fever convalescent plasma in Nigeria. //Tranc. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1984 -vol. 78-N 3 - p.319-324.

82. Fritsche R., Chariatte N. Intravenous verabreichbaies humanes immunoglobulin and verfahen zu dessen herstellung. //Pat. 85747(EP) 1983.

83. Georges A.J., Gonzales J.P., Matiot C.C. Epidemiological and epizoogical investigation of Filoviruses in the Central African Republic. //Ann. Rep. Inst. Pasteur. -Bangui 1989 - vol. 89 - N 1 - p. 164.

84. Halstead S.B. Virus haemorrhagic Fevers. //J. Infect. Dis. 1981 - vol 143-p.l27 - 129.

85. Hooper I.A., Mankariais S., Liv-Rash C.R. Method for making gammaglobulin solution suitable for intravenous use. //Pat. 84/00891 (RCT/WO) -1984.

86. Inst. Pasteur., Dakar, Senegal Annual. Rep. -1981

87. Iones B.M., Lambert R.D., Lupton H.N. Plaque assay for Ebola virus. //J. Clin. Microbiol. -1981 vol. 13 - N 4 - p. 791.

88. Iones B.M., Lambert R.D., Lupton H.N. Plaque assay for Ebola virus. //J. Clin. Microbiol. -1981 vol. 13 - N 4 - p. 791.

89. Isaacson M., Sureau P., Courteille G., Pattyn S.R. Clinical aspect of Ebola virus disease of the Ngaliema hospital, Kinshasa. /Яn: "Ebola virus haemorrhagic fever" /Ed. Pattyn S.R. Elsevier (North Holland, Amsterdam and New-York) - 1978 - p. 15-20.

90. Jahrling P.B. Arenaviruses in manual of clinical microbiol. //1980, Washington, D.C., p. 884-890.

91. Jahrling P.B. Protection of Lassa virus-infected quinea pigs with Lassa-immune plasma of quinea pig, primate and human origin. //J. Med. Virol. 1983 -vol. 12-N2-p. 93-102.

92. Jahrling P.B., Peters С.I., Stephen E.L. Enhanced treatment of Lassa fever by immune plasma combined with Ribavirin in Cynomolgus Monceys. //J. Infect. Dis. 1984 - vol. 149 - N 3 - p. 420-427.

93. Jahrling P.B., Peters C.I. Passive antibody therapy of Lassa fever in Cynomolgus Monceys: importance of neutralizing antibody and Lassa virus strain. //Infect, and Immunol. 1984 - vol. 44 - N 2 - p. 528-533.

94. Johnson K.M., Webb P.A., Lange I.V., Murphy F.A. Isolatin and partipartial characterisation of new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. //Lancet 1977 -vol. 1 - N 8011 - p. 569-571.

95. Johnson K.M., Webb P. A., Heymann D.L. Evaluation of plasmaferesis program in Zaire. //In: "Ebola virus haemorrhagic Fever." /Ed. by S.R. Pattyn. Elsevier /Holland Biomedical Press - 1978 - p. 219-223.

96. Khan A.S., Mungala Kipassa. Epidemiologic features of the recent Ebola virus outbreaks: Epidemiologic and controll illness Kikwit, Zaire, 1995. //Abstracts of Intern. Colloq. "Ebola Virus Research" - 4-7 sept. 1996, -Antwerp., Belgium - p. 25.

97. Lange J.V., Johnson K.M., Kiley M.B. Inactivation of Ebola and Lassa viruses by chemicals. //Abstr. of the Annual. Meeting. 1979 - p. 280.

98. Lloid G., Bowen E.T.W., Slade H.R. Physical and chemical methods of inactivation Lassa virus. //Lancet 1982 - vol. 1 - N 8280 - p. 1048-1049.

99. Lupton H.W., Lambert R.D., Bumgardner D.L., Мое J.B., Eddy G.A. The effect of inactivated vaccine against Ebola fever in the investigation on guinea pigs. //Lancet-1980 vol. 13 - N 8207 - p. 1294-1295.

100. Lupton H.W., Lambert R.D., Beauchaup B.M., Мое J.B., Eddy G.A. Method plaque neutralization for Ebola virus. //Abstr. Meeting Amer. Soc. Microbiol. -1981 p. 251.

101. McCormick J.B., Baner S.P., Elliott L.H., Webb P.A., Johnson K.M. Biological differences between strain of Ebola virus from Zaire and Sudan. //J.Inf. Dis. 1983 - vol. 147 - N 2 - p. 264-267.

102. Melamed M.D. Classification of IgGl and IgG2 isotypes. //Immunochemistry 1976 - vol. 13 - N 3 - p. 281-283.

103. Meunier D.M.I., Dupon T.A. et al. Серологическое исследование геморрагических лихорадок в Габоне. //Ann. Inst. Pasteur. Virol. 1978 - vol. 138-N 2-p. 229-235.

104. Mitchell S.W., McCormic J.B. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola and Marburg viruses and effect of clinical laboratory analysis. //J. Clin. Microbiol. 1984 - vol. 20 - N 3 - p. 486-489.

105. Мое J.B., Lambert R.D., Lupton H.W. The plaque-forming test for Ebola virus. //J. Clin. Microbiol. 1984 - Vol. 13 - N 4 - p. 791-793.

106. Muhlberger E., Sanchez A., Randoff A. et al. The nucleotide sequences of the L-gene of Marburg virus, a Filovirus homologies with Paramixoviruses and Rhabdoviruses. //Virology 1992 - vol. 187 - N 2 - p. 534547.

107. Murphy F.A., Van der Groen G., Whitefield S.G., Lange I.V. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy. //In: "Ebola virus haemorrhagic fever". Ed. Pattyn S.R. Elsevier /North Holland Biomedical Press, Amsterdam, New-York - 1978 - p.- 61-84

108. Olitsky P.K., Schlisinger R.W., Morgan J.M. Induced resistence of the central nervous system to experimental infection with equine encephalomyelitis virus. II. Serotherapy in western virus infection. //J. Exp. Med. 1943 - vol. 77 -N4-p. 359-374.

109. Pereira M.S. Inactivation ofLassa, Marburg and Ebola viruses. //Lancet. 1982 - vol. 11 - N 8290 - p. 155.

110. Peters C.J., Sanhcez A., Feldman A., Rollin P.E., Nichol S., Ksiazek T.G. Filoviruses as emerging patogens. //Semin. Virol. 1994 - Vol. 5. - p. 147154.

111. Peters C.J., Sanhcez A., Rollin P.E., Ksiazek T.G.Murphy F.A. Filoviridae: Marburg and Ebola virus. //Eds B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley et al. Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia 1996 - p. 11611176.

112. Peterson G.L. Determination 6f total protein. //Methods in enzymol. -1983 vol.91 - p. 95-119.

113. Rabinowitz S.G., Adier W.H. Host defenses during primary Venezuelan equine encephalomyelitis virus infection in mice. Passive transfer of protection with immune serum and immune cells. //J. Immunol. 1973 - vol. 10- N 5 p. 1345-1353.

114. Regnery R.L., Johnson K.M., Kiley M.P. Virion nuclic acid of Ebola virus. //J. Virol. 1980 - vol. 36 - p. 465-469.

115. Richman D.D., Cleveland P.H., McCormick J.B., Johnson K.M. Antigenic analyses of strains of Ebola virus: identification of two Ebola serotypes. //J.Infect. Dis. 1983 - vol. 147- p. 268-271.

116. Ruggiero H.A. et al. Treatment of Argentine haemorrhagic fever with convalescents plasma 4.433 cases. //In: "Press, med." 1986 - vol. 15 - N 45 - p. 2239-2242.

117. Saluzzo J.F., Gonzalez J.P. et al. Выявление антител к геморрагической лихорадке Эбола у жителей ЦАР. //Bull. Soc. Pathol. Exot.- 1980-vol. 73 N. 3 - p. 238-241.

118. Salluzzo J.F., Gonzalez J.P. Эпидемиология геморрагических лихорадок: распространение арена- и филовирусов у людей , грызунов , домашних животных в ЦАР. //Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 1982 - vol. 133A - N 3 - p. 493.

119. Sanchez A., Trappier S.G., Mahy B.W.G., Peters C.H., Nichol S.T. The virion glycoprotein of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing. //Proc. National. Acad. Sci. USA.- 1996-Vol. 93-p. 347-357.

120. Siegert R. Marburg-Lassa-and-Ebola virus als erreger haemorrhagischer Fiever. //Dtsch. Med. Wschr. 1978 - J. 103 - N 29 - s. 11761181.

121. Skvaril F., Gardy A. Differences among available immunoglobulin preparation for intravenous use. //Pediat. Infect. Desease J. 1988 - vol. 7 - N 5 Suppl.- p. 43-48.

122. Sorensen R.V., Polmar S.H. Immunoglobulin replacement therapy. //Annals of Clin. Res. 1987 - vol. 19 - N 4 - p. 293-304.

123. Steihm E.R., Ashida E., Kim K.S. et al. Intravenous immunoglobulins as therapeutic agents. //Ann. Intern. Med. 1987 - vol.107 - N 3 - p. 367-383.

124. Steinbuch M., Auderan R. The isolation of IgG from mammalian sera with aid of caprilin acid. //Arch, of biochem. biophys. 1969 - v. 134 - N 2 - p. 279-284.

125. Tokusuka K., Fumio K. Method for preparing immunoglobulin suitable for intravenous administration using PEG. //Pat. 4379086 (USA) 1982.

126. Traub E., Friedel K. Uber die immunitat defweissen Maus gegenuber dem EEE-virus 6. Mitteilung. Bewegung des antihorperspiegles des serum nach Immunisierung mit Lebendvirus bzw formolvaccine. //Zeit. Immunitats Forsch.- 1961 -121(4)-p. 365-374.

127. Tsutsumi H., Ogra P.L. Antibodies: protective, destructive and regulatory role. //New York 1984 - p. 98-103.

128. Van der Groen G., Johnson K.M. et al. Обследование на наличие антител к вирусу Эбола в некоторых популяционных группах. //In: "Ebola Virus Haemorrhagic Fever." Elsevier /North-Holland Biomedial. Press. 1978.

129. Van der Groen G., Pattyn S.R. Определение антител в сыворотках людей из северо-западной части Заира. //Ann. Soc. Belg. Med. Trop. 1979 -vol. 59 - N 1 - p. 87-92.

130. Van der Groen G., Elliott L.H. Use of betapropiolactone inactivation Ebola, Marburg and Lassa intracellular antigens in immunofluorescent antibody assay. //Ann. Soc. Belg. Med. Trop. 1982 - vol. 62 - N. 1 - p. 49-51.

131. Van der Groen G., Flexner P.C. Вирусологическая лаборатория с уровнем защиты Р4. //Progr. Med. Virol. 1982 - N 28 - p. 198-207, "Экспресс-информация ВНИИМИ N 4", сер. "Вирус и вир. инф." - с. 14-25.

132. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. //FEBS Let. 1992 - vol. 305 - p. 181-184.

133. Volchkov V.E., Feldman H., Klenk H.-D. Full-length Ebola virusglycoprotein is secreted from cells in soluble and particulate forms. //Absracts ofth

134. International Congress of Virology. Jerusalem, Israel, 11-16-Aug. - 1996 -p. 37.

135. Volchkov V.E., Feldman H., Volchkova V.A., Slenczka W., Klenk H.-D. Expression strategy for Ebola virus glycoproteins (Gp). //Abstracts of 10th International Conference on Negative Strand Viruses. Dublin, Ireland, 22-27 Sept. - 1997-p. 207.

136. Waldrer J.C., Schulte I.R. HPLC. Chromatofocusing of human immunoglobulins. //J. Immunol. Meth. 1989 - vol. 118 - N 2 - p. 273-277.

137. Webb P.A. et al. Some observation on the properties of Ebola virus. /Яn: "Ebola Virus Haemorrhagic Fever". Ed. S.R. Pattyn Amsterdam, Elsevier, - 1978 -p. 91-94.

138. WHO International Study Team Report. 1976. Ebola haemorrhagic fever in Sudan. //Bull. WHO 1976 - vol. 56 - p. 247-270.

139. WHO. International Study Team Report. 1976. Ebola haemorrhagic fever in Zaire. //Bull. WHO 1976 - vol. 56 - p. 271-293.

140. Williams E.H. Сорок четыре контакта с инфекцией, вызванной вирусом Эбола. //Publ. Health. London - 1979 - vol. 93 - N 2 - p. 67-75.

141. Wilson J.A., Hevey M., Bakken R., Guest S., Bray M., Schmaljohn A.L., Hart M.K. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. //Science 2000 - vol. 287 - N 3 - p. 1664-1666.

142. Wuiff H., Johnson K.M. Определение с помощью метода иммунофлуоресценции иммуноглобулинов М и G у больных лихорадкой Ласса или Марбург. //Бюлл. ВОЗ 1979 - Т. 57 - N 4 - с.385-389.

143. Wyckoff R.W.G., Tesar W.C. Equine encephalomyelitis in monkeys. //J. Immunol. 1939 - vol. 37 - p. 329-343.

144. Zuffe R. Purified immune serum globulin. //Pat. 4272521 (USA) -1981.1. ГОССИ»С*АЯ