Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей патофизиологических процессов, развивающихся у кроликов и морских свинок при введении вируса Эбола

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей патофизиологических процессов, развивающихся у кроликов и морских свинок при введении вируса Эбола"

5 ОД

На правах рукописи

2 7 ОКТ 1998

Дадаева Александра Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ. РАЗВИВАЮЩИХСЯ У КРОЛИКОВ И МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ВВЕДЕНИИ ВИРУСА ЭБОЛА

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1998 г.

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздрава РФ.

Научные руководители: кандидат биологических наук A.A. Чепурнов доктор медицинских наук К.В. Гайдуль

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.Н. Евстропов кандидат медицинских наук Г.Ы. Игнатьев

Ведущая организация:

Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Ыинздрава РФ

Защита состоится igge г в " " часов

на заседании диссертационного совета Л 074.20.01 в НИИ молекулярной биологии ГВЦ ВВ "Вектор" по адресу: 633159 Кольцово Новосибирской области.

С диссертацией ыояно ознакомиться в библиотеке ГНП ВБ "Вектор".

Автореферат разослан " <? " okZ-a^J0*- 1998 г Ученый секретарь

диссертационного совета

Т.Н. Шубина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Вирус Эбола (ВЭ) является высокопатогенным агентом, вызывающим тяжелую лихорадку с высокой (до 88%) степенью летальности [WHO. 1978а; 1978b; 1995а; 1995b]. Вирусная лихорадка Эбола отличается выраженной контагиозностью, развитием геморрагического и гепаторенального синдромов и глубоким поражением иммунной системы. Эффективные средства специфической профилактики и лечения этой лихорадки в настоящее время отсутствуют. Участившиеся случаи возникновения лихорадки Эбола в Африканском регионе, неизвестные природные резервуары ВЭ и расширяющиеся мировые связи, способствующие возможности заноса заболевания в неэндемичные районы, делают разработку средств специфической профилактики этого заболевания крайне необходимой. Очевидно, что успех в терапии и профилактике инфекции Эбола может быть достигнут при детальном исследовании всех звеньев патогенеза этого заболевания. включая иммунологические, биохимические и коагуляци-оннке процессы, развивающиеся в инфицированном вирусом Эбола организме.

Известно, что некоторые животные (например, кролики) нечувствительны к ВЭ и при инокулировании вирусом не проявляют клинических признаков заболевания. Другие животные (к ним относятся морские свинки) являются условночувствительными к ВЭ, т.е. на введение вируса отвечают повышениея температуры тела, снижением веса, но все клинические проявления заболевания заканчиваются выздоровлением, в отличие от высокочувствительных животных (приматы), у которых заболевание стремительно переходит в летальную стадию. Понятно, что чувствительные и нечувствительные к ВЭ животные обладают разной выраженностью иммунологических процессов, развивающихся у них при инокуляции ВЭ. Проследить и охарактеризовать эту разницу иммунологических реакций (в том числе реакций неспецифического иммунитета), а также изменение ряда гомеостатических параметров организма в цепочке возрастания

чувствительности животных к ВЭ при однократном и повторных введениях этого агента представляет интерес, поскольку причины различной восприимчивости животных к ВЭ не ясны.

Устойчивость организма к чужеродным агентам выражается не только в активации иммунных реакций организма, но также в изменениях различных параметров биохимической и гемостатической систем организма, взаимосвязанных с иммунитетом. Эти изменения несут в себе информацию о процессах, сопровождающих развитие иммунологических реакций организма или же, напротив, об их недостаточной активации. В случае заражения чувствительного к ВЭ ор-■ганизма этим вирусом, изменения биохимических и гемостатических параметров являются наглядным примером полной неспособности иммунной системы противостоять инфекционному агенту. Именно поэтому параллельное изучение биохимических и гемостатических параметров наряду с иммунологическими при иммунизации или инфицировании различных по чувствительности к ВЭ организмов данным агентом представляет интерес. Такое изучение позволит оценить развитие иммунологических реакций организма со стороны взаимосвязанных с иммунитетом систем.

Суммируя вышеизложенное представляется актуальным получение разносторонних данных, позволяющих дать комплексную оценку патофизиологических процессов, развивающихся у различных по восприимчивости к ВЭ животных при взаимодействии с этим вирусом, т.к. получение таких данных позволит расширить имеющиеся представления о патогенетической картине лихорадки Эбола и, следовательно, способствовать разработке новых путей получения средств специфической профилактики этой инфекции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение патофизиологических процессов, развивающихся у чувствительных (морские свинки) и нечувствительных (кролики) к ВЭ животных, при введении им различных штаммов ВЭ и инактивированного препарата ВЭ.

В рамках этой цели решались следующие задачи:

1. Изучить динамику ряда иммунологических, биохимических, коа-гуляционных и гематологических показателей у кроликов и морских свинок при введении ВЭ.

2. Охарактеризовать влияние однократного и повторных введений ВЭ на показатели гомеостаза у кроликов и морских свинок.

3. Оценить влияние инактивированного препарата ВЭ на комплекс гомеостатических параметров у кроликов и морских свинок.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые проведена комплексная оценка ряда иммунологических, биохимических, коагуляционных и гематологических показателей у животных, отличающихся степенью чувствительности к ВЭ при введении различных штаммов данного вируса и его инактивированного препарата, что позволило получить ряд новых данных, расширяющих современные представления о патогенезе этого заболевания.

При исследовании факторов неспецифического иммунитета показано, что после введения ВЭ у нечувствительных к данному вирусу животных (кролики) наблюдается высокий уровнь реакции нейтро-фильного фагоцитоза по сравнению с чувствительными животными (морские свинки), у которых отмечается низкий уровень реакции фагоцитоза нейтрофилов. При этом, процентное содержание нейтрофи-лов у кроликов уменьшается, а у морских свинок возрастает. Абсолютное количество нейтрофилов имеет одинаковую динамику изменения как у кроликов, так и морских свинок.

Впервые исследовано и проанализировано влияние повторных введений ВЭ на показатели иммунитета у кроликов и морских свинок. При многократном введении ВЭ у кроликов и морских свинок отмечаются диаметрально противоположные отклонения численного количества Т-лимфоцитов крови. У кроликов при всех введениях вируса наблюдается повышение числа циркулируОщих Т-лимфоцитов.

тогда как у морских свинок отмечается уменьшение количества Т-лимфоцитов в крови после каждого введения указанных препаратов.

Впервые показано, что при развитии летальной инфекции Эбола у морских свинок отмечается элиминация ЦИК кровотока. В крови этих животных также появляются единичные пролимфоциты, лимфоб-ласты и делящиеся клетки лимфоидного ряда. В предтерминальную и терминальную стадии инфекции Эбола у морских свинок наблюдается появление в крови ювенильнцх форм нейтрофилов, эозинофилов и тромбоцитов, что свидетельствует о нарушении барьерной функции костного мозга.

Впервые продемонстрировано, что и живой ВЭ, и его инактиви-рованный препарат, вызывают дисбаланс коагуляционных показателей как у кроликов, так и у морских свинок. У кроликов наблюдаемый дисбаланс коагуляционных показателей не сопровождается изменениями биохимических параметров крови и компенсируется к концу наблюдения, тогда как у морских свинок развитие летальной инфекции сопровождается дальнейшим дисбалансом показателей свертывающей системы и возникновением гепато-ренального синдрома.

Результаты настоящего исследования могут послужить теоретической основой для решения практических вопросов, связанных с . разработкой специфических средств профилактики и лечения лихорадки Эбола.

Методический подход для изучения патофизиологических процессов, основанный на сравнении различных биологических показателей у животных с различным уровнем чувствительности к инфекционному агенту, позволяет получить базу разносторонних данных и может быть рекомендован для дальнейшего изучения патогенеза фи-ловирусных инфекций.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Иммунологические реакции нечувствительных к ВЭ животных (кролики) в отличие от чувствительных (морские свинки) характеризуются активацией функций нейтрофилов и увеличением количества Т-лимфоцитов. Выраженность указанных процессов наиболее проявляется при повторных введениях ВЭ.

2. Увеличение чувствительности организма к ВЭ связано с возникновением выраженной коагулопатии, которая сопровождается развитием гепато-ренального синдрома.

3. Активация гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков кроветворения в костном мозге и образование иммунных комплексов являются звеньями патогенеза лихорадки Эбола, изучаемой на модели морских свинок.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" (п. Кольцово, 1993), на Всероссийской научной конференции ."Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993), на X международном вирусологическом конгрессе (Иерусалим, 1996), на русско-германском коллоквиуме по филовирусным инфекциям (Кольцово, 1997) и на X международной вирусологической конференции (Дублин,1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 153 источника, в том числе 57 работ отечественных и 96 работ иностранных авторов.

Список сокращений, используемых в автореферате:

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза БОЕ - бляшкообразующая единица ВЭ - вирус Эбола инВЭ - инактивированный ВЭ

лВЭ - адаптированный штамм ВЭ, вызывающий летальную

инфекцию у морских свинок нВЭ - "дикий" штамм ВЭ, вызывающий нелетальную

инфекцию у морских свинок ЛДзо - 50%-ная летальная доза ВДА - малоновый диальдегид ПА - пролиферативная активность ПДФ - продукты деградации фибрина и фибриногена

(продукты паракоагуляции) ПТИ - протромбиновый индекс Тс - Т-супрессоры ФС - фагоцитарная способность ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы ЭП - этаноловая проба бСР - секреторный гликопротеин ВЭ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Схематическое изображение методического подхода для изучения патогенеза лихорадки Эбола представлено на рис.1. Как видно из схемы в работе использовали 2 штамма ВЭ (нВЭ, лВЭ), инактивированный препарат ВЭ и 2 лабораторные модели животных (кролики и морские свинки).

Для решения поставленных задач по сравнительному изучению патофизиологических процессов у различных по чувствительности к ВЭ животных было проведено 2 серии комплексных экспериментов, в которых, с одной стороны, действие каждого индивидуального штам-

Методический подход к изучению патогенеза лихорадки Эбола, используемый в проведенном исследовании

Инактивированный препарат нВЭ

Рис. 1.

ма ВЭ оценивали на различных лабораторных моделях, а с другой стороны, действие различных штаммов ВЭ оценивали на одной лабораторной модели.

Патофизиологические процессы, развивающиеся при введении ВЭ у экспериментальных животных характеризовали по динамике снимаемых иммунологических, биохимических, коагуляционных и гематологических показателей. Основное количество указанных гомеостати-ческих показателей крови экспериментальных животных определяли стандартными клиническими методами (в небольшой модификации), описанными в [КостЕ.А.. 1975; Колб В.Г. и Камышников B.C., 1976; Новиков Д. К. и Новикова В. Н., 1979; Балуда В. П. и др., 1980. Никитин В.М.. 1982].

Сводные данные по проведенной экспериментальной работе представлены в табл.1. В 1-й серии экспериментов использовали 3 группы кроликов по 2 особи в группе и 3 группы морских свинок по 10 особей в группе. Кроликам и морским свинкам 1-х групп вводили внутримышечно троекратно с интервалом в 16 суток по 100 и 30 мкл соответственно нВЭ (биологический титр составлял 6-8x10® БОЕ/мл). Кроликам и морским свинкам 2-х групп вводили в те же сроки равноценное количество инВЭ. Кроликам и морским свинкам 3-х групп (контрольные группы животных) вводили в те же сроки равноценное количество контрольного белка, представляющего собой детрит клеток Vero с содержанием белка 1 мг/мл. Взятие крови у экспериментальных животных производили однократно (исходные значения) перед началом работы и затем два раза в неделю в течение всего эксперимента до 51-х суток. У каждого кролика кровь забирали отдельно (из ушной вены), а у морских свинок (из сердца) выборочно у нескольких особей из группы.

Во П-й серии экспериментов использовали 4 группы морских свинок по 10 особей в группе. Морским свинкам 1-й группы внут-рибрюшинно вводили по 1 мл нВЭ с титром 104 БОЕ/мл, 2-й группы -равноценное количество инВЭ. 3-й группы - по 1 мл лВЭ с титром 104 ЛДзо для морских свинок. Морские свинки 4-й группы служили

Таблица l.

Сводные данные по схеме проведенных экспериментов

Серия экспериментов I II

Вид животных кролики морские свинки морские свинки

Группа 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4

Число особей в группе г 2 2 10 10 10 10 9 10 10

Вес животных 1,5 - 2,0 кг 200 - 300 г 150 - 180 г

Вводимый материал НВЭ инВЭ контрольный белок нВЭ инВЭ контрольный белок НВЭ инВЭ лВЭ раствор Nací

Количество материала 100 мкл 100 мкл 100 мкл 30 мкл 30 мкл 30 мкл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл

Титр или концентрация 6-8x10® вое/мл 6-8x10® ВОВ/мл* 1МГ/МЛ 6-8x10® БОЕ/МЛ 6-0x10® БОЕ/мл* 1МГ/МЛ 104 БОЕ/мл ю4 БОЕ/мл* Ю4ДД50 ** 0,852

Кратность введения 3-Х кратно 3-х кратно 3-х кратно 3-Х кратно 3-х кратно 3-х кратно 1-но кратно 1-но кратно 1-но кратно 1-но кратно

Цуть введения в.м. в.м. в.м. В.М. в.м. в.м. в.б. в.б. в.б. в.б.

Срок наблюдения до 51-х суток ДО 51-х суток ДО 51-х суток ДО 51-х суток ДО 51-х суток ДО 51-х суток до 20-х суток до 20-х суток до 9-х суток до 20-х суток

Примечание. * обозначает титр инфекционяого материала до термоинактивации, ** обозначает летальную доау для морских свинок, в.м - внутримышечный, в.О - внутрибрппинный.

контролем влияния взятия крови на динамику исследуемых показателей. Вместо вирусного материала им вводили по 1 мл физиологического раствора. Взятие крови (из сердца) у экспериментальных животных производили перед началом эксперимента и затем 2 раза в неделю до 20-х суток. Каждую группу животных делили на 2 подгруппы и исследовали объединенную пробу крови от каждой подгруппы.

Развитие инфекции оценивали по температурной реакции, наличию виремии (на 7-е сутки от момента введения препаратов ВЭ) и гибели морских свинок. Развитие тромбогеморрагического синдрома у экспериментальных животных определяли при вскрытии по наличию геморрагии на внутренних органах, проявлений некроза (глинистая печень) и др.

Статистическую обработку данных, полученных в 1-й серии экспериментов проводили при помощи t-критерия Стьюдента-Фишера [Ашмарин И.П. и Воробьев Л.А., 1962], во Н-й серии экспериментов - методом дисперсионного анализа по схеме- двухфакторного эксперимента с повторам}! [Пугачев B.C., 1979].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Температурная реакция, выживаемость и уровень виремии у экспериментальных животных.

В 1-й серии экспериментов температурной реакции на введения нВЭ, инВЭ и контрольного белка у кроликов не регистрировали. При 1-м введении нВЭ у 50% морских свинок наблюдали повышение ректальной температуры на 0,5-1°С, при повторных введениях нВЭ температурную реакцию фиксировали лишь у отдельных особей. При введении инВЭ и контрольного материала морским свинкам температурную реакцию у них не наблюдали. На 51-е сутки все животные были выведены из эксперимента эфирным наркозом. Во Il-й серии экспериментов у 60% морских свинок, которым вводили нВЭ, был отмечен

подъем ректальной температуры на 0.5-1°С с 5-х по 9-е сутки с момента введения нВЭ. Развития клинических признаков инфекции не последовало, к 12-14-м суткам температура нормализовалась. У морских свинок, инокулированных инВЭ, температурной реакции не было отмечено. У всех морских свинок, которых инфицировали лВЭ, на 4-7-е сутки был отмечен подъем ректальной температуры до 40°С с последующим развитием типичного для этих животных течения болезни, характеризующегося наличием периода разгара и терминальной стадии. К исходу 9-х суток в этой группе погибли все животные. Температурная реакция у морских свинок контрольной группы оставалась в пределах нормы на протяжении эксперимента.

• У кроликов, инокулированных нВЭ, виремия не выявлялась используемым способом определения. У морских свинок, которым вводили нВЭ, виремия достигала 0,8-1,0 х 103 БОЕ/мл. У морских свинок, инфицированных лВЭ, уровень виремии доходил до 2-3 х 104 БОЕ/мл.

Исследование патофизиологических процессов у кроликов и морских свинок при введении нВЭ и инВЭ.

Полученные данные показывают, что невосприимчивые к ВЭ животные после введения данного вируса (живого и инактивированно-го) демонстрировали гораздо более выраженную активацию нейтро-фильного фагоцитоза, чем восприимчивые к вирусу животные, которые при 1-м введении нВЭ не проявляли активацию фагоцитоза (рис.2). Из рисунка видно, что ФС нейтрофилов кроликов возрастала в 8-12 раз при всех введениях нВЭ, в то время как ФС нейтрофилов морских свинок достоверно увеличивалась в 2,5-4 раза лишь при повторных инокуляциях нВЭ.

Возможно, что отсутствие активации нейтрофилов при инфицировании ВЭ чувствительного к нему организма связано с адсорбцией на нейтрофилах sGP [Yang Z.-у. et al., 1998]. По предположению этих авторов sGP, обладающий способностью связываться с нейтро-филами крови, препятствует ранней активации этих клеток. Это

Рис. 2. Индекс ФС нейтрофилов крови у кроликов (а) и морских свинок (б), инокулированных нВЭ (1), ииВЭ (2) и контрольным белком (3).

Римскими цифрами обозначены дни введения вирусного материала. Представлены средние значения. Стандартные отклонения не превышали 15-20% от средних значений. * обозначает значение показателей, имеющих достоверные отличия от исходных при р < 0,03. По осям абсцисс - сроки наблюдения (сутки). По осям ординат - показатели приведены на рисунке.

предупреждает развитие каких-либо воспалительных реакций, являющихся элементом врожденного иммунитета, что б конечном счете обеспечивает"беспрепятственную репликацию ВЭ в клетках-мишенях.

Интересно, что инВЭ вызывает повышение ФС нейтрофилов морских свинок уже после 1-го введения. Возможно, температурная инактивация приводит к конформационному изменению вирусных белков, в силу чего изменяются либо супрессивные свойства ВЭ для нейтрофилов морских свинок, дабо его узнаваемость для иммунной системы и она начинает воспринимать инВЭ как чужеродный агент. Известно, что практически любой инактивированный вирус (или бактерия) являются иммуностимуляторами. Процесс фагоцитирования

Рис.3. Динамика индекса Т-розеткообразования у кроликов (а) и морских свинок (б), трехкратно инокулированных ВЭ. Римскими цифрами обозначены инокуляции вирусного материала. Каждый столбик диаграмм представляет среднее значение показателя за период наблюдения (16 суток) после введения вирусного материала. Пунктирная линия обозначает исходный уровень значений индексов, равный 100%. По осям ординат -%.* обозначает значения показателей, имеющих достоверные различия с исходными при р < 0,05.

инактивированных агентов имеет отличные механизмы от фагоцитирования живых объектов. Поэтому отличие ФС нейтрофилов у морских свинок и кроликов при введении инВЭ от таковой при введении нВЭ можно объяснить различием механизмов фагоцитоза. Тем не менее, численные значения ФС после повторных инокуляций инВЭ у морских свинок значительно уступают таковым у кроликов. Следовательно, и в инактивированном виде ВЭ сохраняет некоторое супрессивное действие на ФС нейтрофилов морских свинок.

Из представленных на рис. 3 данных видно, что количество Т-лимфоцитов у кроликов имело динамику повышения после каждой инокуляции нВЭ и инВЭ, тогда как их содержание у морских свинок, напротив, имело динамику снижения после введений данного вирусного материала. Учитывая активацию нейтрофильцого фагоцитоза у кроликов и отсутствие таковой у морских свинок при введении ана-

логичного вирусного материала, можно заключить, что клеточ-но-опосредованные механизмы иммунитета в значительной- мере определяют степень устойчивости организма к вирусу Збола.

Исследование патофизиологических процессов и морских свинок при введении нВЭ, инВЭ и лВЭ.

При анализе биохимических данных обращает на себя внимание заметное отличие динамики показателей группы морских свинок, зараженных лВЭ, от таковой в других группах животных (рис.4). С развитием температурной реакции отмечено резкое повышение активности АлАТ с последующим снижением к моменту гибели животных. Активность АсАТ с началом заболевания снижается, а затем, в ходе развития инфекции возрастает до момента гибели. Таким образом, активность АсАТ преобладает над активностью АлАТ, т.е. у морских свинок наблюдается та же закономерность в поведении аминотранс-фераз, что и у инфицированных вирусом Эбола приматов [Fisher-Hoch S.P. etal., 1983b; 1985]. С учетом повышенной активности аминотрансфераз повышение уровня мочевины а'также ß-ли-гюпротеидов в ходе инфекции у этой группы животных служит подт-верждениём выраженной гепаторенальной патологии.

Из полученных данных также видно, что в опытных группах животных синхронно в первые дни после введения вирусного материала происходит снижение уровня МДА, что свидетельствует об угнетении перекисного окисления липидов. Причем более сильное подавление этого показателя наблюдается в группе морских свинок, инфицированных лВЭ. Исходя из этого, можно предположить, что лВЭ активирует системы антиоксидантной защиты, истощает их, что приводит к последующему выраженному повышению уровня перекисного окисления липидов.

Динамика появления специфических антител к ВЭ у различных групп морских свинок выглядела следующим образом (табл.2). Морские свинки, инокулированные нВЭ, к концу эксперимента имели небольшое повышение титров антител. Морские свинки, иммунизирован-

Рнс.4. Изменение биохимических показателей у морских свинок, инокулированных 11ВЭ (1), ннВЭ (2), лВЭ (3) и контрольных морских свинок (4).

а - активность АлАТ, б - активность АсАТ, в - количество Р-липопротендов, г - количество МДА, д - уровень мочевины.Представлены средние значения. Величины стандартных отклонений средних равняются: для а - 0,13; б - 0,16; в - 0,64; г - 4,76; д - 0,Еб. Согласно результатам дисперсионного анализа, динамика представленных показателей значимо отличается друг от друга для всех пар групп животных. По осям абсцисс - сроки наблюдения (сутки). По осям ордкнат - показатели приведены на рисунке

119,8

Й

С

Ы 14 I

нвэ инвэ явэ

Рис. 5. Содержание ЦИК у морских свинок, иннокулированных ВЭ на 9-е сутки после инокуляции. Содержание ЦИК приведено в % от исходного уровня, выраженного 100% и обозначенного пунктирной линией.

ные инВЭ, показали быстрое увеличение уровня антител до высоких титров. Титры антител у животных, инфицированных лВЭ, оставались на уровне фона до гибели.

Таблица 2.

Титры суммарных антител к ВЭ у морских свинок, инокулированных этим вирусом.

I Срок наблюдения, сутки .

Морские свинки, |-\-1-1-1-:—i-

инокулированные: |3-и |7-е |9-е I12-е |15-е |20-е

нВЭ 1:40 1: 80 1: 80 i: 160 1:160 1:320

инВЭ 1:40 1: : 80 1: : 160 1: 320 1:640 1:1280

ЛВЭ 1:40 1: : 40 1: : 40 н Н Н

Примечание, "н" обозначает отсутствие определения показателя в связи с гибелью животных в группе. Титры антител определяли иммуноферментным.анализом [Мерзликин Н.В.<и др., 1995].

При этом на 9-е сутки уровень ЦИК в этой' группе морских свинок снизился до 14% от исходных значений в отличие от других групп (рис.5).

Таблица 3.

Закономерности развития патофизиологических реакций организма при введении ВЭ на примере различных лабораторных моделей

Вид лабораторной модели

Наблюдаемая закономерность Нечувствительные к ВЭ животные (кролики) Условно-чувствительные к ВЭ животные (морские свинки) Чувствительные , к ВЭ животные (морские свинки) Чувствительные к ВЭ животные (приматы, иноку-лированные ВЭ)

нВЭ инВЭ нВЭ* инВЗ* лВЭ * **

Увеличение 7. неитрофилов - - + ± ++ ++ +4

Появление молоды? форм гранулоцитов н н + + ++ н н

Появление молодых форм лимфоцитов н н + ++ ++ н н

Увеличение % эозинофилов - - +. + ++ н н

Уменьшение числа моноцитов - - ± - ++ н н

Угнетение ФС неитрофилов - - ± + ++ + н

Уменьшение числа Т-лшфоцитов - - + + ++ + н

Уменьшение числа В-лимфоцитов - ± + + ++ + н

Увеличение X Тс-лимфоцитов ++ ++ ++ ++ н н н

Элиминация ЦИК н H - - ++ + H

Появление титра антител к ВЭ ++ ++ + ++ - - -

Увеличение ПТИ + + + + + + +

Полонительная ЭП + + + + + + H

Рост количества фибриногена н H + + 4+ - H

Появление ПДФ в сыворотке крови + + H H H ++ +

Увеличение/снижение числа тромбоцитов H H +/± ++/++ +/+ +/+

Рост % молодых тромбоцитов H H + + ++ H H

Рост активности АсАТ - - + + ++ ++ ++

Рост активности АлАТ - - + + + ++ +

Снижение/повышение количества ВДА -/- +/- H

Рост количества мочевины - - + + ++ ++ ++

Рост количества В-липопротеидов - - - - ++ ++ H

Примечание. - отсутствие указанных изменений, ± слабовыраженное наличие изменений, + умеренное наличие изменении, ++ выраженное наличие изменений, н - нет данных, * - данные взяты из [Лучко C.B. и др.. 1995], использованы приматы Papio Hamadryas; ** - данные взяты из [Flsher-Hoch S.P. et al., 1903b, 1985], использованы приматы Macaque Rhesus; # - приведены средние данные из двух серий экспериментов.

Обобщая полученные результаты исследования патофизиологических процессов у экспериментальных животных при введении ВЭ была получена сводная таблица данных (см. табл.3). В последней графе таблицы представлены данные из источников литературы об изменении соответствующих параметров у приматов при инфицировании ВЭ. Как видно из этой графы многие показатели недостаточно изучены у приматов, что показывает актуальность проведенной работы.

Приведенные результаты показывают, что изменения основного количества снимаемых показателей имели наиболее выраженный характер у чувствительных к ВЭ животных и наименее выраженный характер у нечувствительных животных. Но как у восприимчивых, так и невосприимчивых животных при введении ВЭ увеличивался ПТИ И ЭП становилась положительной. Это указывало на развитие дисбаланса в их свертывающей системе.

Однако, в случае нечувствительных к ВЭ животных коагуляци-онные реакции имели лимитирующие звенья, позволившие показателям гемостаза вернуться к норме, в то время как у чувствительных животных имелся мощный источник "подпитки" коагуляционного каскада, приведшего в конечном итоге к развитию летального коагулопа-тического синдрома.

Большинство имеющихся в настоящее время концепций патогенетического развития лихорадки Эбола (ТеИтапп Н еЬ а1., 1996а; 1996Ь; ТПбоп М.Б., 1996] пытаются так или иначе объяснить механизм возникновения неконтролируемого каскада коагуляционных процессов в инфицированном ВЭ организме.

Мы предполагаем, в свою очередь, что источником "подпитки" коагуляционного каскада при лихорадке Эбола могут служить иммунные комплексы, состоящие из антигена ВЭ и специфических к нему антител. Участие иммунных комплексов в патогенезе некоторых геморрагических лихорадок, таких как корейская геморрагическая лихорадка [РепШпеп К., 1981], лихорадка денге [НаШеас1 Б.В., 1981; РоПегГ1е1с1 ,1.3., 1982] и геморрагическая лихорадка с почечным синдромом [Раг1уеуа й.М. еЬ а1., 1997] считается основной причиной геморрагического течения этих заболеваний.

Fisher-Hoch S.P. (1983a) предполагает сходство большинства геморрагических лихорадок по механизму образования геморрагий и шока. Исходя из такого предположения об общности механизмов развития геморрагического синдрома при различных геморрагических лихорадках, возможно рассмотреть полученные нами данные с точки зрения появления в ходе патологического процесса в инфицированом ВЭ организме иммунных комплексов, как то имеет место при других геморрагических лихорадках.

По уже приведенным выше данным, в первые дни после инокуляции лВЭ, у морских свинок развилось подавление перекисного окисления липидов, которое на 5-е сутки сменилось резким подъемом, что характеризовало наличие обширных мембранных повреждений. С 5-х же суток в крови этих морских свинок стали появляться юве-нильные формы тромбоцитов и возрос уровень фибриногена (см. табл.3) хотя классическая динамика коагулопатии потребления должна была сопровождаться его снижением. В терминальную стадию помимо появления в крови молодых форм нейтрофильных гранулоцитов у этих животных возрос процент эозинофилов (см.табл.3) и наблюдалась элиминация ЦИК из кровотока. Все эти факты показывают, что в организме морских свинок, инфицированных лВЭ, развился процесс, отсутствующий у животных других групп. Такой процесс вполне мог быть вызван отложением иммунных комплексов в интиме сосудов и тканях.

При такой трактовке процессов, развивающихся у морских свинок, зараженных лВЭ, требует объяснения факт отсутствия специфических антител к ВЭ в сыворотках этих животных.

По данным Васильева Н.В. (1975) бластическая реакция опережает на 2-3 дня появле;- ле антител в крови. У морских свинок, ин-фицировашых лВЭ (табл.4), на 3-й сутки в крови появились единичные пролимфоциты и единичные делящиеся клетки лимфоидного ряда, что можно расценнить как результат наличия бластической реакции в лимфоидных органах с попаданием единичных бластных форм

Таблица 4.

Взаимосвязь гематологических показателей, характеризующих наличие бластической реакции в лимфоидных органах, с титром специфических антител к ВЭ у морских свинок, инокулированных данным вирусом

Т I

Титр специфических антител к ВЭ

Морские свинки, которым вводили:

Гематологические данные

Появление клеток в I Сутки мазках крови I

инВЭ

нВЭ

лВЭ

Пролимфоциты Пролимфоциты Лимфобласты Пролимфоциты

++ | 3-7-е + | 9-е + I 3-й, ++ | 9-е _i_

1280

320

40

Примечание. + обозначает наличие указанной клетки при подсчете 200 лейкоцитов крови.

через лимфу в кровь. Учитывая то, что подобные единичные пролимфоциты появлялись в крови и у морских свинок, инокулированных инВЭ на 3-7-е сутки и то. что уровень антител к ВЭ в этой группе животных был достаточно высоким, можно предположить, что специфические антитела к ВЭ у морских свинок, инфицированных лВЭ, нарабатывались. но полностью уходили на образование иммунных комплексов и осаждались в тканях.

Известно, что макрофагам отводится основная роль в удалении поврежденных клеток, микроорганизмов и иммунных комплексов. Поэтому элиминацию ЦИК из кровотока у морских свинок, инфицированных лВЭ, можно было бы объяснить поглощением их активированными макрофагами. Однако известно, что заражение филовирусами приводит к генерализованному разрушению макрофагов морских свинок и обезьян [Рябчикова Е.И., 1997]. Поскольку моноциты крови

являются предшественниками тканевых макрофагов, то исчезновение моноцитов из кровотока морских свинок, зараженных лВЭ, в наших экспериментах, служит подтверждением процесса разрушения макрофагов в ходе инфекции (см.табл.3).

При поражении и разрушении макрофагов, вызываемых ВЭ, маловероятной является возможность поглощения ими иммунных комплексов. Поглощать иммунные комплексы способны и нейтрофилы. Однако, учитывая снижение ФС нейтрофилов у морских свинок, инфицированных лВЭ, до 15% от исходного уровня в терминальную стадию инфекции и то, что количество ЦИК в эти же сроки снизилось до 14% от исходных значений, более вероятно, что исчезновение ЦИК из кровотока этих морских свинок происходило за счет осаждения их в тканях.

Суммируя сказанное, необходимо отметить, что представленные данные показывают наличие глубоких патологических нарушений, развивающихся у морских свинок, инфицированных адаптированным штаммом ВЭ, которые отсутствуют у животных, инокулированных "диким" штаммом ВЭ. Очевидно, что это связано не только, с относительно высоким уровнем вирусной репродукции при инфицировании данным штаммом. Возможно, важнейшей причиной вызываемых нарушений является повреждающее действие иммунных комплексов на сосудистый эндотелий, форменные элементы крови и различные ткани.

Подводя итоги проведенной работы в целом можно заключить, что совокупность полученных данных свидетельствует о сложной взаимосвязи биохимических и гемостатических процессов организма с его иммунологическими реакциями, развивающимися при введении ВЭ. Имеющиеся в литературных источниках данные показывают, что проблема патогенеза лихорадки Эбола имеет много нерешенных и неизученных вопросов. Полученные в данной работе результаты позволяют осветить некоторые из них, способствуя расширению современных представлений о патогенезе этой сложной инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное исследование динамики иммунологических, биохимических. коагуляционных и гематологических показателей у животных с различным уровнем чувствительности к вирусу Эбола при введении им различных штаммов данного вируса показало значительные количественные и качественные отличия исследуемых параметров:

а) Среди иммунологических показателей чувствительных к вирусу Эбола животных (морские свинки) в отличие от нечувствительных (кролики) при введении "дикого" штамма вируса Эбола наблюдается крайне низкий уровень реакции нейтрофильного фагоцитоза, уменьшение числа циркулирующих Т- и В-лимфоцитов и снижение их проли-феративной активности. После введения адаптированного штамма вируса Эбола у морских свинок наряду с перечисленными закономерностями отмечается также выраженная элиминация циркулирующих иммунных комплексов из кровотока.

б) При исследовании биохимических показателей было выявлено, что у морских свинок, инфицированных адаптированным штаммом вируса Эбола, в отличие от кроликов и морских свинок, инокулиро-ванных "диким" штаммом вируса Эбола, наблюдается повышение количества малонового диальдегида и р-липопротеидов в предтерминаль-ную стадию инфекции. Высокий уровень активности аминотрансфераз наряду с высокими значениями мочевины у этих животных позволяет говорить о развитии выраженного гепато-ренального синдрома в этой- стадии заболевания.

в) Исследование системы гемостаза показало, что после введения "дикого" штамма вируса Эбола, как у кроликов, так и у морских свинок отмечается повышение протромбинового индекса и этаноловая проба становится положительной. Наблюдаемые изменения коагуляци-онных показателей у кроликов компенсируются к концу наблюдения. У морских свинок указанные сдвиги в системе гемостаза при введении адаптированного штамма вируса Эбола приводят к развитию коа-гулопатического синдрома.

г) Гематологические тесты показали, что в периферической крови у морских свинок, инфицированных адаптированным штаммом вируса Эбола, в отличие от кроликов и морских свинок, инокулированных "диким" штаммом вируса Эбола в предтерминальную и терминальную стадии инфекции появляются ювенильные формы тромбоцитов и грану-лоцитов. При этом отмечается одновременное наличие грубой зернистости в нейтрофилах и вакуолизация их цитоплазмы.

2. Впервые установлено, что инактивированный цельновирионньш препарат вируса Эбола обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами, которые при введении данного препарата чувствительным и нечувствительным к вирусу животным проявляются, в частности, в относительном подавлении фагоцитарной способности нейтро-филов у морских свинок по сравнению с кроликами, увеличении числа Т-супрессоров как у морских свинок, так и у кроликов и высоком уровне пролиферативной активности лимфоцитов у морских свинок по сравнению с введением живого вируса Эбола. Это данные указывают на определенную роль белков вируса Эбола в патогенезе лихорадки Эбола.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лучко С.В., Дадаева А.А. Влияние комплекса специфической и симптоматической терапии на течение геморрагической лихорадки Эбола у приматов. // Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций. Тезисы докладов межведомственной конференции. -Кольцово, Новосиб. р-н. Россия, 7-8 апреля, 1993. - С.32.

2. Чепурнов А. А.. Волчков В. Е., Кудоярова Н. М., Сизикова Л. П., Дадаева А.А. Иммунопатогенез лихорадки Эбола и перспективн создания вакцины против неб. // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. - Саратов. 1993. - С.211.

3. Luchko S. V.. Ustlnova Е. N., Dadaeva А. А. Rassadkln Ju. N., Ryabchlkova E.I. Clinical Investigation of Ebola Infection in Paplo Hamadryas. // Abstracts of 9th International Conference on Negative Strand Viruses. - Estoril, Portugal, 2-7 Oct, 1994. - P. 180.

4. Лучко С.В., Дадаева А.А., Устинова E.H., Сизикова Л.П., Рябчикова Е.И., Сандахчиев Л. С. Экспериментальное изучение геморрагической лихорадки Эбола на модели павианов-гамадрилов. // Билл, экспер. биол. мед. - 1995. - Т. СХХ. - N 9. - С. 302-304.

5. Chepurnov А.А., Chernukhln I.V.. Dadaeva A.A., Slzlkova L.P. То studying of lmmunomodulate properties of Ebola virus antigen. // Abstracts of 10th International Congress of Virology. - Jerusalem, Israel, 11-16 Aug, 1996. - P.259.

6. Чепурнов А.А., Терновой В.А., Дадаева А.А., Сизикова Л.П. Изучение протективных и иммунобиологических свойств белков vp24 и vp30 вируса Эбола в составе рекомбинантного вируса осповакци-ны. // Дальневосточный медицинский журнал: - 1996. - N4.- С. 88-89. (Приложение). Вакцинопрофилактика (к 200 летию первой вакцинации). Актуальные вопросы вакцинопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Материалы научно-практической конференции. - Хабаровск, 4-5 декабря, 1996.

7. Дадаева А.А.. Сизикова Л.П.. Бакулина Л.Ф., Чепурнов А.А. Исследование фагоцитарной способности полиморфноядерных лейкоцитов крови кроликов и морских свинок при введении вируса Эбола. // Вопр. вирусол. - 1997. - Т. 42. - N 2. - С. 56-59.

8. Чепурнов А. А., Дадаева А. А., Сизикова Л. П., Писанко В. А. Изменение некоторых показателей гемостаза у кроликов при введении препаратов вируса Эбола. // Вопр. вирусол. - 1997. - Т.42. -N 3. - С.140-143.

9. Чепурнов А. А., Дадаева А. А., Жуков В. А.. Сизикова Л. П., Мерзликин В.Н. Изменение биохимических и гемостатических показателей у морских свинок при введении препаратов вируса Эбола. // Вопр. вирусол. - 1997. - Т.42. - N 4. - С. 171-175.

10. Чепурнов А.А., Терновой В.А., Дадаева А.А., Дмитриев И.П.. ' Сизикова Л.П., Волчков В.Е., Кудоярова Н.М.. Рудзевич Т.Н., Нетесов С.В. Изучение иммунобиологических свойств белка vp24 вируса Эбола в составе рекомбинантного вируса осповакцины. // Вопр. вирусол. - 1997.- N 3. - С. 115-120.

И. Dadaeva A.A., Slzlkova L.P., Chepurnov A.A. A comparison of hemostatic changes In guinea pigs challenged with Ebola virus preparations. // The modern state of Problem. Abstracts of Russian-German colloquium on fllovlruses. - Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 28 Jan.-2 Feb. 1997. - P.19.

12. Dadaeva AA, Slzlkova LP, Chepurnov AA. Phagocytic capacity of polymorphonuclear leucocytes In the blood of rabbits and guinea pigs Inoculated with Ebola virus. // Abstracts of 10th International Conference on Negative Strand Viruses. -Dublin, Ireland, 21-26 Sep, 1997. - P.206.

13. Dadaeva AA, Slzlkova LP, Chepurnov AA. Dynamics of some biochemical parameters in guinea pigs Inoculated with different Ebola virus preparations. // Abstracts of 10th International Conference on Negative Strand Viruses. - Dublin, Ireland, 21-26 Sep, 1997. - P. 205.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дадаева, Александра Анатольевна, Кольцово

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" НИИ молекулярной биологии

Дадаева Александра Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, РАЗВИВАЮЩИХСЯ У КРОЛИКОВ И МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ВВЕДЕНИИ

ВИРУСА ЭБОЛА

03.00.06. -вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: А. А. Чепурнов,

кандидат биологических наук

К.В. Гайдуль

доктор медицинских наук

На правах рукописи

Кольцово - 1998 г.

- г -

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список используемых сокращений.............................. 4

Введение ................................................... 6

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о лихорадке Эбола.................. 13

1.2. Патофизиологические аспекты патогенеза лихорадки Эбола.............................................. 20

1.3. Патогенетические теории развития лихорадки Эбола... 24

1.4. Иммунопрофилактика лихорадки Эбола................ -27

1.5 Некоторые сведения о противовирусном иммунитете в приложении к лихорадке Эбола....................... 34

1.6 Заключение по обзору литературы ................... 37

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Вирус.............................................. 38

2.2. Животные........................................... 40

2.3. Титрование вируса.................................. 40

2.4. Схема экспериментов................................ 43

2.5. Гематологические методы ........................... 45

2.6. Иммунологические методы ........................... 46

2.7. Биохимические методы............................... 50

2.8. Методы исследования системы гемостаза.............. 52

2.9. Статистическая обработка результатов .............. 54

Глава 3. Результаты и обсуждение ........................... 56

3.1. Исследование фагоцитарной способности нейтрофилов крови у кроликов и морских свинок при введении вируса Эбола....................................... 59

3.2. Влияние повторных введений вируса Эбола на динамику иммунологических показателей у кроликов и морских свинок............................................. 70

3.3. Изменения некоторых коагуляционных и биохимических показателей у кроликов при введении вируса Эбола... 77

3.4. Исследование ряда коагуляционных и биохимических параметров у морских свинок, инокулированных вирусом Эбола.............................................. 85

3.5. Динамика иммунологических и гематологических показателей у морских свинок при введении вируса Эбола. -92

3.6. Обобщающее обсуждение полученных результатов....... 109

Выводы ..................................................... 123

Список используемой литературы ........................... 125

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость

рВОВ - рекомбинантный вирус осповакцины

ВЭ - вирус Эбола

инВЭ - инактивированный ВЭ

лВЭ - адаптированный штамм ВЭ, вызывающий летальную

инфекцию у морских свинок нВЭ - "дикий" штамм ВЭ, вызывающий нелетальную

инфекцию у морских свинок ГНЦ ВБ - Государственный научный центр вирусологии

и биотехнологии ИД50 - 50%-ная инфекционная доза ИФА - иммуноферментный анализ КРС - крупный рогатый скот ЛД50 - 50%-ная летальная доза МДА - малоновый диальдегид ОП - оптическая плотность ПА - пролиферативная активность ПДФ - продукты деградации фибрина и фибриногена

(продукты паракоагуляции) ПОЛ - перекисное окисление липидов ПТИ - протромбиновый индекс ПФС - показатель фагоцитарной способности ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

Тс - Т-супрессоры

ФНО - фактор некроза опухоли

ФС - фагоцитарная способность

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер с твином

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭП - этаноловая проба

СР - поверхностный гликопротеин ВЭ

эйР - неполноразмерный (секреторный) СР ВЭ

ВВЕДЕНИЕ

Вирус Эбола (ВЭ) является высокопатогенным агентом, вызывающим тяжелую лихорадку с высокой (до 88%) степенью летальности [WHO, 1978а; 1978b; 1995а; 1995b]. Вирусная лихорадка Эбола отличается выраженной контагиозностью, развитием геморрагического и гепаторенального синдромов и глубоким поражением иммунной системы. Эффективные средства специфической профилактики и лечения этой лихорадки в настоящее время отсутствуют. Участившиеся случаи возникновения лихорадки Эбола в Африканском регионе, неизвестные природные резервуары ВЭ и расширяющиеся мировые связи, способствующие возможности заноса заболевания в неэндемичные районы, делают разработку средств специфической профилактики этого заболевания крайне необходимой. Очевидно, что успех в терапии и профилактике инфекции Эбола может быть достигнут при детальном исследовании всех звеньев патогенеза этого заболевания, включая иммунологические, биохимические и коагуляционные процессы, развивающиеся в инфицированном вирусом Эбола организме.

Известно, что некоторые животные (например, кролики) нечувствительны к ВЭ и при инокулировании вирусом не проявляют клинических признаков заболевания. Другие животные (к ним относятся морские свинки) являются условночувствительными к ВЭ, т.е. на введение вируса отвечают повышением температуры тела, снижением веса, но все клинические проявления заболевания заканчиваются выздоровлением, в отличие от высокочувствительных животных (приматы), у которых заболевание стремительно переходит в

летальную стадию. Понятно, что чувствительные и нечувствительные к ВЭ животные обладают разной выраженностью иммунологических процессов, развивающихся у них при инокуляции ВЭ. Проследить и охарактеризовать эту разницу иммунологических реакций (в том числе реакций неспецифического иммунитета), а также изменение ряда гомеостатических параметров организма в цепочке возрастания чувствительности животных к ВЭ при однократном и повторных введениях этого агента представляет интерес, поскольку причины различной восприимчивости животных к ВЭ не ясны.

Устойчивость организма к чужеродным агентам выражается • не только в активации иммунных реакций организма, но также в изменениях различных параметров биохимической и гемостатической систем организма, взаимосвязанных с иммунитетом. Эти изменения несут в себе информацию о процессах, сопровождающих развитие иммунологических реакций организма или же, напротив, об их недостаточной активации. В случае заражения чувствительного к ВЭ организма этим вирусом, изменения биохимических и гемостатических параметров являются наглядным примером полной неспособности иммунной системы противостоять инфекционному агенту. Именно поэтому параллельное изучение биохимических и гемостатических параметров наряду с иммунологическими при иммунизации или инфицировании различных по чувствительности к ВЭ организмов данным агентом представляет интерес. Такое изучение позволит оценить развитие иммунологических реакций организма со стороны взаимосвязанных с иммунитетом систем.

Суммируя вышеизложенное представляется актуальным получение разносторонних данных, позволяющих дать комплексную оценку патофизиологических процессов, развивающихся у различных по воспри-

имчивости к ВЭ животных при взаимодействии с этим вирусом, т.к. получение таких данных позволит расширить имеющиеся представления о патогенетической картине лихорадки Эбола и, следовательно, способствовать разработке новых путей получения средств специфической профилактики этой инфекции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение патофизиологических процессов, развивающихся у чувствительных (морские свинки) и нечувствительных (кролики) к ВЭ животных, при введении им различных штаммов ВЭ и инактивированного препарата ВЭ.

В рамках этой цели решались следующие задачи:

1. Изучить динамику ряда иммунологических, биохимических, коа-гуляционных и гематологических показателей у кроликов и морских сванок при введении ВЭ.

2. Охарактеризовать влияние однократного и повторных введений ВЭ на показатели гомеостаза у кроликов и морских свинок.

3. Оценить влияние инактивированного препарата ВЭ на комплекс гомеостатических параметров у кроликов и морских свинок.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые проведена комплексная оценка ряда иммунологических, биохимических, коагуляционных и гематологических показателей у животных, отличающихся степенью чувствительности к ВЭ при введении различных штаммов данного вируса и его инактивированного

препарата, что позволило получить ряд новых данных, расширяющих современные представления о патогенезе этого заболевания.

При исследовании факторов неспецифического иммунитета показано, что после введения ВЭ у нечувствительных к данному вирусу животных (кролики) наблюдается высокий уровнь реакции нейтро-фильного фагоцитоза по сравнению с чувствительными животными (морские свинки), у которых отмечается низкий уровень реакции фагоцитоза нейтрофилов. При этом процентное содержание нейтрофи-лов у кроликов уменьшается, а у морских свинок возрастает. Абсолютное количество нейтрофилов имеет одинаковую динамику изменения как у кроликов, так и морских свинок.

Впервые исследовано и проанализировано влияние повторных введений ВЭ на показатели иммунитета у кроликов и морских свинок. При многократном введении ВЭ у кроликов и морских свинок отмечаются диаметрально противоположные отклонения численного количества Т-лимфоцитов крови. У кроликов при всех введениях вируса наблюдается повышение числа циркулирующих Т-лимфоцитов, тогда как у морских свинок отмечается уменьшение количества Т-лимфоцитов в крови после каждого введения вируса.

Впервые показано, что при развитии летальной инфекции Эбола у морских свинок отмечается элиминация циркулирующих иммунных комплексов из кровотока. В крови этих животных также появляются единичные пролимфоциты, лимфобласты и делящиеся клетки лимфоид-ного ряда. В предтерминальную и терминальную стадии инфекции Эбола у морских свинок наблюдается появление в крови ювенильных форм нейтрофилов, эозинофилов и тромбоцитов, что свидетельствует о нарушении барьерной функции костного мозга.

Впервые продемонстрировано, что и живой ВЭ, и его инактиви-рованный препарат, вызывают дисбаланс коагуляционных показателей как у кроликов, так и у морских свинок. У кроликов наблюдаемый дисбаланс коагуляционных показателей не сопровождается изменениями биохимических параметров крови и компенсируется к концу наблюдения, тогда как у морских свинок развитие летальной инфекции сопровождается дальнейшим дисбалансом показателей, свертывающей системы и возникновением гепато-ренального синдрома.

Результаты настоящего исследования могут послужить теоретической основой для решения практических вопросов, связанных с разработкой специфических средств профилактики и лечения лихорадки Эбола.

Методический подход для изучения патофизиологических процессов, основанный на сравнении различных биологических показателей у животных с различным уровнем чувствительности к инфекционному агенту, позволяет получить базу разносторонних данных и может быть рекомендован для дальнейшего изучения патогенеза фи-ловирусных инфекций.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Иммунологические реакции нечувствительных к ВЭ животных (кролики) в отличие от чувствительных (морские свинки) характеризуются активацией функций нейтрофилов и увеличением количества Т-лимфоцитов. Выраженность указанных процессов наиболее проявляется при повторных введениях ВЭ.

2. Увеличение чувствительности организма к ВЭ связано с возникновением выраженной коагулопатии, которая сопровождается развитием гепато-ренального синдрома.

3. Активация гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков кроветворения в костном мозге и образование иммунных комплексов являются звеньями патогенеза лихорадки Эбола, изучаемой на модели морских свинок.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения работы доложены на межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций" (п.Кольцово, 1993), на Всероссийской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993), на X международном вирусологическом конгрессе (Иерусалим, 1996), на русско-германском коллоквиуме по фи-ловирусным инфекциям (Кольцово, 1997) и на X международной вирусологической конференции (Дублин,1997).

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Настоящая работа выполнена в лаборатории особо опасных вирусных инфекций ГНЦ ВБ "Вектор".

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям - к. б.н. Чепурнову A.A. и д.м.н. Гайдулю К. В. за помощь в ходе выполнения диссертационной работы и критический анализ полученных экспериментальных данных.

Весьма признательна к. б.н. Шишкиной Л.Н. за ценную помощь в

приобретении необходимых навыков для написания научной работы, к.мат.н. Жукову В.А. за помощь в проведении статистической обработки полученных результатов, к.тех.н. Генералову В.М. и Писанко В.А. за помощь в техническом оформлении работы.

Также признательна член-корр. РАЕН, д.м.н. Локтеву В.Б., д.м.н. Бочарову Е. Ф., к.м.н. Игнатьеву Г. М., к. б.н. Разумову И.А. и Шумаковой 0.В. за редакционные правки в тексте диссертации.

Благодарю научных сотрудников Сизикову Л.П., Зубавичене Н.М., к. б.н. Мерзликина К.В., к.м.н. Тюнникова Г.И., Бакулину Л. П., к. б.н. МаховуН.М., Устинову Е. Н., Ефимову И. В., Преснякову А.В. и коллектив лаборатории за консультативную и практическую помощь в повседневной работе.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общие сведения о лихорадке Эбола.

Лихорадка Эбола - тяжелое инфекционное заболевание, протекающее с развитием геморрагического синдрома и в большинстве случаев заканчивающееся летально. Впервые лихорадка Эбола была зарегистрирована в 1976 году одновременно в Судане и Заире, где произошли крупные вспышки этого заболевания. Выделенный возбудитель этой инфекции получил название вируса Эбола (ВЭ) по названию небольшой реки в Заире недалеко от деревни Ямбуку [Johnson K.M. et al., 1977].

Дальнейшее появление ВЭ в виде отдельных эпизодических заболеваний и вспышек представлено в табл.1. Как видно из таблицы летальность инфекции, вызываемой ВЭ, варьирует в различных пределах, достигая 88%. Помимо приведенных в таблице данных, имеются сведения об обнаружении антител против ВЭ у людей в Либерии [Knobloch J. et al., 1982], Камеруне [Bergmann J.F., 1981], Центрально-Африканской Республике [Georges A.J. et al., 1989], Уганде, Северной Родезии и Республике Конго [van der Groen G.,1984]. Это свидетельствует о возможной циркуляции в этих районах непатогенных штаммов ВЭ. Изучение сывороток людей, собранных в Заире в 1972 году, показывает, что некоторые штаммы ВЭ циркулировали в Заире еще за 4 года до регистрации первой масштабной вспышки [Иванов А.П. и др.,1986; van der Groen G., 1984]. Идентичные результаты получены при исследовании сывороток людей, собранных в Эфиопии в 1961-1962 годах [Tignor G.H. et al, 1993]. Таким образом, можно предположить достаточно широкое распростра-

Таблица 1.

Вспышки и отдельные эпизодические случаи лихорадки Эбола

-1-1-1-—

Местоположение! Год | Вирус/субтип| Случаи

| | |(летальность)

_I_I_I_

Кения 1972 Эбола/? *

Южный Судан 1976 Эбола/Судан 284 (53%)

Северный Заир 1976 Эбола/Заир 318 (88%)

Англия 1976 Эбола/Судан 1 (0%)

Тандала, Заир 1977 Эбола/Заир 1 (100%)

Южный Судан 1979 Эбола/Судан 34 (65%)

Габон 1982 Эбола/? *

США 1989- Эбола/Рестон 4 (0%)

1990

Италия 1992 Эбола/Рестон 0 (0%)

Берег Слоновой 1994 Эбола/Берег 1 (0%)

Кости Слоновой Кости

Киквит, Заир 1995 Эбола/Заир 315 (77%)

Габон 1996 Эбола/? 50 (25%)

Габон 1996 Эбола/? 54 (77%)

Примечание. Большинство представленных в таблице данных взяты из [Feldmann Н. et al., 1996с; Peters C.J. et al.,1994]. Под * приведены данные, носящие дискуссионный характер.

нение нелетальных штаммов ВЭ, вызывающих только 'субклиническую форму заболевания. Эти штаммы ВЭ, вероятно, способны мутировать под воздействием окружающей среды и приводить к развитию летальной инфекции.

По своей структуре ВЭ почти идентичен ранее открытому вирусу Марбург, который также вызывает тяжелую геморрагическую лихорадку. Согласно данным электронной микроскопии [Ellls D.S. et al., 1978; Murphy F. A. et al., 1978; Geisbert T.W et al., 1995] частицы ВЭ плеоморфны, имеют длинные филаментозные формы, иногда с ветвлениям, а также "U''-образные формы, в виде цифры 6 или циркулярные. Диаметр ВЭ составляет около 80 нм. Длина частиц ВЭ может достигать 14000 нм.

Вирионы как ВЭ, так и вируса Марбург содержат одну молекулу неинфекционной, линейной, негативной одноцепочечной РНК с Мг=4, 2x106, составляющей 1,1% вирусной массы [Regnery R.L. et al.,1980]. ВЭ, по видимому, реплицируется подобно другим вирусам с негативным геномом. Инфицированные ВЭ клетки содержат видимые цитоплазматические включения, состоящие из массы вирусных нукле-окапсидов. Окончательно вирус почкуется на клеточных мембранах [Kiley М.Р. et al., 1982].

ВЭ имеет 7 структурных белков. Свойства и функции этих белков приведены в табл.2. Из структурных белков