Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноферментные тест-системы для изучения лихорадки Эбола

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноферментные тест-системы для изучения лихорадки Эбола"

ТВ ОД

" э ОПТ 1335

На правах рукописи

Мерзликин Николай Владиславович

ПММУНОФЕРМЕНТИЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЛИХОРАДКИ ЭБОЛА

03.00.06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1995 г

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздравмедпрома РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор М.С. Воробьева

кандидат биологических наук

А.А. Чепурнов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

А. Г. Покровский К.В. Гайдуль

Ведущая организация: Научно-производственное объединение

"Вирион", НИИ вакцин и сывороток Минздравмедпрома РФ

Защита состоится " 1995 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в НИИ молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" по адресу: 633159 Кольцово Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

Автореферат разослан " ^ " £¿¿„^995 г.

Ученый секретарь > «

диссертационного совет^ Т.Н.Шубина

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем современной вирусологии является всестороннее изучение инфекции, вызываемой вирусом Эбо-ла, и разработка методов её диагностики. Вирус Эбола относится к семейству РПоуЫёае и является одним из самых высокоматогемных для человека. Геморрагическая лихорадка, вызываемая этим возбудителем, эндемична для некоторых районов Центральной Африки, однако известны случаи завоза лихорадки Эбола и на другие территории. Расширение экономических связей с государствами Африки И 1ури-1ма делают ЗТу пт*ннии,1ьН1( «/наьнои и длл территории нашей страны. Одним из источников заболевания могут служить также обезьяны, ввозимые из стран Африки для научных исследований. Недавние сообщения об обнаружении в крови обезьян Сегсориесиэ аеШорэ антител к вирусу Эбола, выделение новых Эбола-подобных вирусов (Рестон) с неизвестным патогенным потенциалом от приматов, импортированных из Азии, а также разразившаяся в мае сего года тяжелая эпидемия лихорадки Эбола в Заире и связанные с нею международные эпидемиологические мероприятия заставляют более серьезно взглянуть на данную проблему. Раннее распознавание случаев жизненно необходимо для контроля вспышки и может быть выполнено только при наличии быстрого, специфичного и доступного метода. Этот метод должен быть применим также для обследования животных, завозимых в нашу страну.

Классическим методом детекции вируса Эбола является выделение в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией методом иммунофлюоресценции в сочетании с соответствующим клиническим анамнезом. Однако, несмотря на высокую чувствительность и специфичность, недостатком этого приема яв-

ляется длительность исследования — не менее 5-7 дней, что ограничивает его значение как диагностического. Кроме того, в случае клинических образцов интерпретация часто затруднена из-за неспецифической флюоресценции. Метод непрямой иммуноэлектронной микроскопии для обнаружения и идентификации филовирусов в жидких образцах, метод гибридизации нуклеиновых кислбт имеют лишь ограниченное лабораторное применение.

Сегодня метод иммуноферментного анализа является необходимым инструментом при изучении различных аспектов инфекционного процесса: обнаружения возбудителя в различных органах и физиологических жидкостях, времени его появления и концентрации, динамики появления и накопления специфических антител. Метод иммуноферментного анализа хорошо зарекомендовал себя при изучении репродукции вирусов в культуре клеток, при поиске и оценке противовирусных средств. К моменту начала наших исследований и до настоящего времени в стране отсутствуют иммуно-ферментные тест-системы для выявления антигена вируса Эбола и антител к нему.

Целью настоящего исследования было экспериментальное изучение инфекции, вызываемой вирусом Эбола, на моделях пер-миссивных культур клеток и лабораторных животных с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем.

В задачи исследования входило:

1. Изучить вопросы культивирования и оптимизировать технологию получения очищенного вируса Эбола в препаративных количествах.

2. Получить специфические антисыворотки к вирусу Эбола с высоким титром антител.

3. Разработать и апробировать иммуноферментные тест-системы для выявления антигена и антител к вирусу Эбола.

4. Получить набор контрольных отрицательных и положительных сывороток для оценки качества (чувствительности и специфичности) разработанных тест-систем.

5. Определить диагностические возможности разработанных иммуноферментных тест-систем в сравнении с традиционными методами диагностики.

6. Изучить динамику появления и накопления антигена вируса Эбола и шсЦйфпчсскпгс v, процессе ■ч^ш.мимгн.и^ппий инфекции у различных лабораторных животных.

Научная новизна.

Изучена динамика накопления вируса Эбола в перевиваемых культурах клеток Vero и Л-68; на этой основе разработан отъ-

емно-доливной способ культивирования с многократным (до 4-х раз) сбором вируссодержащей культуралыюй жидкости с высоким уровнем биологической активности — 2,3x105 - 1,6x106 БОЕ/мл.

Впервые разработана иммуноферментная тест-система для выявления антигена вируса Эбола. Проведены исследования по обнаружению вирусного антигена в крови и тканевых гомогенатах при экспериментальной инфекции вирусом Эбола; показана возможность постановки специфического диагноза на 5-6 сутки после инфицирования, до развития основных клинических симптомов заболевания.

Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для выявления антител в сыворотках лабораторных животных — морских свинок и обезьян павианов гамадрилов, инфици-

рованных вирусом Эбола. Изучены сроки появления и динамика титра антител, выявляемых в иммуноферментном анализе, в сыворотках экспериментальных животных, инфицированных вирусом Эбола; тест-система позволяет обнаруживать специфические антитела на 8-9 сутки после заражения; чувствительность ИФА выше чувствительности традиционных методов серологической диагностики РСК иРНИФ в 100-160 и 5-20 раз соответственно.

Разработаны методические подходы к получению панели положительных контрольных сывороток; получен и охарактеризован набор из 22 иммунных сывороток с низким титром специфических антител (1:100-1:800) для оценки чувствительности тест-системы на выявление антител к вирусу Эбола.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований отработана технология культивирования вируса Эбола в перевиваемых культурах клеток Vero и Л-68 и получения очищенного концентрированного препарата вируса с высоким биологическим и физическим титром (до 109 БОЕ/мл и 10" вирионов/мл соответственно) и минимальным содержанием балластных веществ для приготовления высокоактивного антигена с целью его использования в ИФА. Разработанная методика может быть использована также и для получения препаративных количеств вируса Эбола для приготовления инактивиро-ванной вакцины, иммунизации животных, выделения РНК и т.д.

Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления антител к вирусу Эбола и антигена вируса Эбола; оптимизированы условия постановки реакции; отработана оптимальная схема учета и интерпретации результатов. Обе тест-системы апробирова-

ны в экспериментальных условиях, показана их высокая чувствительность и хорошая воспроизводимость результатов. Наборы для определения антител к вирусу Эбола и антигена вируса Эбола освоены в условиях опытно-лабораторного производства и могут быть использованы для исследования лихорадки Эбола.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены:

1) на межведомственной конференции "Изучение и профилактика осооо чпясных вирусных ННфСКЦ"Я". П-Колн»"»«». 7«л реля 1993г.;

2) на Всероссийской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций", г.Саратов, 21-23 сентября 1993 г.;

3) на научной конференции РАМН "Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века", г.Москва, 25-27 мая 1994 г.

Результаты проведенных исследований отражены в 6 печатных работах.

Структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, включая 20 рисунков и 13 таблиц.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ "Вектор": А.А.Чепурновым, Н.Н.Истоминой, В.И.Офице-

ровым, В.Е.Волчковым, Е.И.Рябчиковой, С.В.Усовой, Л.П.Сизико-вой, С.А.Сороченко, Н.Н.Сергеевым.

Обсуждение результатов.

Для изучения вирусологических аспектов патогенеза лихорадки Эбола на экспериментальных биологических моделях необходимы современные методы детекции вируса и специфических антител. С этой целью нами была проведена разработка соответствующих иммуноферментных тест-систем. На начальном этапе исследования было необходимо решить два вопроса: получить иммуносор-бент и получить иммунную сыворотку к вирусу Эбола.

Была изучена динамика накопления вируса Эбола в культу-ральной жидкости инфицированных клеток Vero и J1-68 при различной множественности заражения в условиях стационарного культивирования (рис 1). Анализ результатов показал, что оптимальная множественность заражения при культивировании на клетках Vero составляла около 0,01 БОЕ/клетку. Установлено, что спустя 96-144 ч от момента заражения титр вируса Эбола в куль-туральной жидкости достигает 5,6x105-1,6x106 БОЕ/мл и сохраняется на таком уровне в течение 6-8 суток до редукции монослоя, причем при смене поддерживающей среды титр вируса Эбола в культу-ральной жидкости уже спустя сутки восстанавливался до такого же уровня. Анализ данных серии экспериментов позволил разработать отьемно-доливной способ культивирования вируса Эбола с многократным (до 4-х раз) сбором вируссодержащей культураль-ной жидкости; увеличение суммарного объема собранной вируссодержащей жидкости значительно повышало эффективность культивирования.

Увеличение множественности заражения до 0,1 БОЕ/клетку приводило к более быстрому нарастанию титра вируса на 3-4 сутки культивирования, но сопровождалось и более быстрой редукцией монослоя. При уменьшении множественности заражения до

0,001 БОЕ/клетку титр вируса Эбола в культуральной жидкости был более низким на протяжении всего времени культивирования н составлял 8,Ох 10<-5,Ох 105 БОЕ/мл.

Титр, lg БОЕ/мл

Время культивирования, сут

Рис. 1. Динамика накопления вируса Эбола в культуральной жидкости клеток Vero в зависимости от множественности заражения.

Кроме того, мы использовали культуру клеток Л-68, диплоидных фибробластов легкого человека, поскольку эта клеточная культура аттестована по кариологическим показателям и отсутст-

вию контаминантов и может быть использована для производства медицинских диагностических и вакцинных препаратов (рис. 2).

При использовании культуры клеток Л-68 при множественности заражения 0,01 БОЕ/клетку вирус Эбола накапливается в культуральной жидкости в достаточно высоком титре — 1,6-6,8x105 БОЕ/мл, и эта культура клеток также позволяет проводить многократный сбор вируссодержащей культуральной жидкости.

Титр,^ БОЕ/мл

Время культивирования, сут

Рис. 2. Динамика накопления вируса Эбола в культуральной жидкости клеток Vero и Л-68 при множественности заражения 0,01 БОЕ/клетку.

Таким образом, в качестве оптимальной нами была выбрана следующая схема культивирования вируса Эбола:

- культура клеток: Vero или Л-68;

- множественность заражения: 0,01 БОЕ/клетку;

- сбор культуральной жидкости на 5-, 7-, 9-, 11-й день культивирования.

Концентрирование собранной вируссодержащей культуральной жидкости проводили двумя способами: осаждением с помощью ПЭГ-6000 в присутствии хлористого натрия и методом ультрафильтрации на мембранных фильтрах; были подобраны оптимальные условия для обоих вариантов концентрирования. Очистку полученного препарата проводили путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы по стандартной методике.

Полученные препараты анализировали методами электрофореза в полиакриламидном геле и электронной микроскопии. Электрофорез в обоих вариантах концентрирования показал высокую (92-95%) чистоту препарата и наличие специфических для вируса Эбола белков (125; 104; 40; 35; 30; 24 кДа). При электронно-микроскопическом исследовании было установлено, что в процессе концентрирования с использованием ПЭГ-6000 происходит значительное повреждение вирусных частиц; в получаемом препарате содержалось большое количество вирионов с разрушенной оболочкой, фрагментированные частицы. Метод молекулярной фильтрации показал себя более технологичным, позволил получить препарат с лучшей сохранностью вирусных частиц и высоким физическим титром— до 10м частиц/мл.

Разработанная методика культивирования и очистки вируса Эбола позволили получить препаративные количества высокоочи-щенного препарата для приготовления иммуносорбента для ИФА, получения антигена для других иммунологических реакций (РСК, РНИФ), а также использовать его для иммунизации животных.

Для получения иммунных сывороток использовали кроликов породы "шиншилла"; были проведены эксперименты по оптимизации способов получения антисыворотки к вирусу Эбола на этих животных.

Иммунизацию животных проводили с использованием 10%-ного гомогената печени инфицированных зеленых мартышек (первая группа) и вируссодержащей культуральной жидкости (вторая группа). При наблюдении в течение 21 дня не обнаружили повышения температуры или каких-либо других клинических реакций. Анализ сывороток животных обеих групп по окончании иммунизации показал, что титры антител в них невысоки — 1:32 в реакции связывания комплемента (РСК) и 1:128 в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

Поскольку кролики не чувствительны к исходному штамму вируса Эбола, для достижения высокого титра сывороточных антител мы попробовали воздействовать на иммунную систему животного большими дозами антигена в сочетании с полным адъювантом Фрейнда. Третью группу кроликов иммунизировали концентрированным и очищенным препаратом вируса Эбола, инактивирован-ным 0,1%-ным формалином. Такой подход позволил получить иммунные сыворотки с более высоким титром специфических антител—до 1:128 в РСК и 1:1024 в РНИФ.

Получение очищенного антигена и иммунных сывороток с высоким титром антител к вирусу Эбола позволило перейти непосредственно к конструированию иммуноферментных диагностических тест-систем.

Иммуноферментная тест-система для определения антител к вирусу Эбола была разработана на основе классической схемы

непрямого варианта ИФА: сорбция антигена вируса Эбола на твердой фазе, внесение исследуемой сыворотки, содержащей антитела к вирусу Эбола, инкубация, выявление образовавшегося комплекса антиген-антитело с помощью конъюгата стафилококкового белка А с пероксидазой хрена или антивидового конъюгата.

Была проведена серия стандартных экспериментов по выбору оптимальной концентрации вирусного антигена для сорбции на планшете, определению температурных условий и продолжительности сорбции, способа блокирования остаточной активности ионерхносш иолиыиролй.; были определены также «птаиапним температура и время проведения всех этапов постановки ИФА, отработана система учета и интерпретации результатов.

Важная задача, возникающая при изготовлении и выпуске тест-системы, — оценка ее чувствительности и специфичности. В практике производства и контроля тест-систем для этой цели используют стандартные панели положительных и отрицательных сывороток. В нашем распоряжении имелись сыворотки ряда лабораторных животных, зараженных либо иммунизированных вирусом Эбола, но их разнородность и небольшие объемы не позволяли использовать их в качестве стандартной панели. Поэтому было признано целесообразным для оценки чувствительности получить набор положительных сывороток, взяв за основу имеющиеся сыворотки иммунизированных кроликов.

Анализ этих сывороток в ИФА показал, что они содержали антитела к вирусу Эбола в высоком титре и имели показатель ОП в пределах 2,200-3,100 (рис. 3). Для оценки чувствительности тест-системы рекомендуется использовать сыворотки с низкой концен-

трацией антител и, соответственно, с низкими показателями ОП, приближающимися К ОПкрит.

Оптическая плотность

Разведения сывороток

Рис. 3. Результаты титрования в ИФА сывороток иммунизированных кроликов.

Практически задача получения таких сывороток была решена путем разведения исходных сывороток нормальной кроличьей сывороткой так, чтобы показатели их оптической плотности находились в диапазоне 0,400-0,800. Таким образом из 5 исходных иммунных сывороток с высоким титром (1:16000-1:32000) и ОП (2,200-3,100) был приготовлен набор сывороток с низким титром антител (1:100-1:800) и невысоким значением ОП (рис. 4). Сформированный набор положительных сывороток был использован для контроля чувствительности экспериментальных серий диагно-

стикума; в трех испытанных сериях чувствительность составила 100%.

Количество сывороток

6 -

J 4 -

2 -

А

Количество сывороток

2-

%

—I-1-г

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 ОП 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 ОП

4

Рис. 4. Диаграмма распределения показателей оптической плотности исходных нативных сывороток (Л) и сывороток сформированной панели (Б). Пунктиром обозначена ОПкриг.

Для оценки специфичности работы тест-системы использовали широкий набор сывороток человека, как от здоровых лиц, так и от больных клещевым энцефалитом, гепатитом, корью, а также набор нормальных сывороток обезьян, кроликов и морских свинок. Отсутствие ложноположительных результатов свидетельствовало о высокой специфичности тест-системы (табл. 1). Специфичность тест-системы была также подтверждена в реакции с референс-сывороткой, полученной из CDC (Атланта, США).

Таблица 1

Результаты исследования в ИФА на выявление антител к вирусу Эбола сывороток людей и здоровых животных

Видовая принадлежность сывороток Количество исследованных сывороток Значение оптической плотности ОПкРит=ОПк-+ 2Б (Р<0,05)

Человек в том числе: - сыворотки доноров 229 35 0,136 + 0,036 (0,089-0,177) 0,119 ±0,013 0,208

- сыворотки больных клещевым энцефалитом, гепатитом, корью 86 0,149 ±0,022

- сыворотки сотрудников ГНЦ ВБ "Вектор" 103 0,128 ±0,016

- сыворотки персонала лаборатории осо-боопасных вирусных инфекций 23 0,0130 ±0,031

Приматы 26 0,141 ±0,028 (0,065-0,182) 0,197

Кролики 52 0,162 ±0,032 (0.076- 0.190) 0,226

Морские свинки 138 0,124 ±0,021 (0,093-0,158) 0,166

Референс-сыворотка - 2,168 ±0,016

В процессе разработки иммуноферментнон тест-системы для выявления антигена вируса Эбола первоначально мы использовали две схемы проведения анализа: 1) прямой вариант ("сэндвич") с использованием иммобилизованных на твердой фазе антител и

выявлением связываемого антигена с помощью специфического конъюгата; и 2) конкурентный вариант, в котором антиген в исследуемой пробе вступает в реакцию со стандартной дозой специфических антител и конкурирует с антигеном, сорбированным на поверхности планшета. При проведении предварительных экспериментов "TÍÍ ДГ!" 5ЯрЛ2!»ТЯ ПОКЯ7Н"" "пик ¡ нчп пп oünnákOiiriO ¿ViCT вительность — около 10 нг выявляемого вирусного белка. В дальнейших исследованиях мы использовали прямой вариант ИФА, поскольку он показался более удобным и технологичным в постановке. Были проведены исследования по выбору дозы сорбируемых антител, определению способа блокирования неспецифической активности поверхности планшет, отработке и оптимизации всех основных этапов постановки ИФА.

Эксперименты с использованием антигенов вирусов Мар-бург, Ласса, Мачупо, везикулярного стоматита, кори показали высокую специфичность метода; ложноположительных результатов не наблюдалось.

Разработанные иммуноферментные тест-системы для обнаружения антигена вируса Эбола и антител к нему использовали при проведении исследований по изучению вируса Эбола и вызываемой им инфекции на лабораторных животных и культуре клеток.

Была проведена серия экспериментов по обнаружению антигена вируса Эбола в культуралыюй жидкости клеток Vero, которые при проведении диагностических исследований могут быть исполь-

зованы для "подращивания" проб, не позволяющих получить четкий результат при обычной методике проведения ИФА (например, исследование проб, содержащих вирус в концентрации ниже порога чувствительности ИФА).

Принимая во внимание данные о репродукции вируса Эбо-ла в культуре клеток, мы попытались определить связь между накоплением инфекционного вируса в культуральной жидкости и появлением вирусного антигена, выявляемого в ИФА (рис.5). Установлено, что начиная с 3-их суток культивирования отмечалось увеличение ОП в лунках с исследуемыми пробами, а на 4-е сутки соотношение P/N достоверно превышало 2,1. Порог чувствительности метода иммуноферментного анализа в данных условиях составил ~103 БОЕ/мл.

Время культивирований, сут

Рис. 5. Накопление инфекционного вируса Эбола и вирусного антигена, выявляемого в ИФА, в культуральной жидкости клеток Vero.

Проведенные эксперименты подтвердили, что клеточная линия Vero может быть использована в диагностике для "обогащения"

проб, подозрительных на инфицирование вирусом Эбола. При этом время инкубации инфицированных клеток должно составлять 3-4 сут.

Возможность раннего обнаружения вирусного антигена и специфических антител изучали при воспроизведении экспериментальной инфекции у различных лабораторных животных: белых мышеи, морских свинок, павианов гамадрилов. С этой целью исследовали образцы крови и органов, полученные от зараженных животных.

В экспериментах с использованием в качестве лабораторной модели для 1»->1'и«»11ми 11|>«>11>мцк» .-¡Гюла йсымх мышей ш^пчаил возрастных групп было установлено, что новорожденные белые мыши высокочувствительны к вирусу Эбола; их заражение приводит к развитию инфекции без явных клинических симптомов, которая заканчивается гибелью животных на 7-9 сутки. Вирус накапливается в высоких концентрациях в мозговой и печеночной ткани и может быть выявлен методом ИФА на 5 сутки после заражения. Таким образом, новорожденные белые мыши могут служить для первичного выделения вируса.

Белые мыши более старших возрастных групп нечувствительны к заражению вирусом Эбола и не могут служить экспериментальной моделью для изучения данной инфекции.

Морские свинки являются одной из адекватных моделей для изучения лихорадки Эбола. Спустя 4-7 суток после инфицирования у 50-70% животных развивается заболевание с повышением температуры до 40,0-40,5°С, адинамией и снижением массы тела; 20-50% животных погибали ¡1а 9-11 сутки.

Исследования показали, что инфекционный вирус Эбола появляется в крови заболевших животных на 4-7 сут и его титр дос-

тигает 105-6 - 1060 БОЕ/мл; в 10%-ном гомогенате ткани печени вирус Эбола присутствует также в высоком титре — 1047-105'4 БОЕ/мл. Высокий уровень присутствия вируса в крови и ткани печени сохраняется до 8-10 дня инфекции, коме случаев с двухволно-вым течением лихорадки. В эти же сроки антиген вируса Эбола выявляется в ИФА в сыворотке крови (с 4-6 до 8-11 дня инфекции) и в гомогенате ткани печени (с 4-5 до 8-10 дня) (табл. 2).

Таблица 2

Биологическая активность вируса Эбола и содержание вирусного антигена/выявляемого в прямом варианте ИФА, в материалах от экспериментально инфицированных морских свинок

Срок от момента Титр антигена вируса Эбола в ИФА Биологическая активность БОЕ/мл

заражения, сут в сыворотке крови в гомогенате ткани печени в сыворотке крови в гомогенате ткани печени

0 н.о. н.о. н.о. н.о.

3 н.о. н.о. н.о. н.о.

4 н.о. н.о. н.о. 4,2x102

5 1:40 1:40 3,2x103 4,4x104

6 1:80 1:160 3,7x105 5,0x105

7 1:320 1:640 7,2x105 6,8x105

8 1:640 1:640 1,4x106 5,5x105

9 1:640 1:800 4,0x105 2,5x105

10 1:640 1:640 2,2x104 4,0x103

Примечание: н.о. - не обнаружено

При определении специфических антител к вирусу Эбола установлено, что они могут быть выявлены в РСК после 12 дня заболевания и к концу периода наблюдения (21 день) достигают титра 1:32-1:64. В ИФА специфические антитела в низких титрах

Таблица 3

Исследование в ИФА сывороток экспериментальных животных на выявление специфических антител

Вид Срок от момента Средние значения ОП в

ЖиВОТПЫТС ЧЧ(Чп№011|1в ■"Ч......-...... мгспсцугмых «.Кт(н?«> ■ Кал. 1

(иммунизации), (в разведении 1:100)

сут

Обезьяны Рарю 0 0,089 ± 0,036

Ьашаёгуаз 7 0,281+0,045

9 ... ■ = 0,402 ±0,129

10 0,438 + 0,107

11 0,5 40 ± 0,052

Морские свинки 0 0,108 ±0,024

7 0,343 ±0,021

9 0,371 ±0,045

10 0,407 ± 0,034

12 0,422 ±0,066

14 0,593 ±0,083

16..... 0,806 ±0,118

21 '1,137 ±0,072

Кролики 0 0,138 ±0,031

7 0,286 ±0,046

. 14 ;..':".';' . 0,544 ± 0,080

28 3,112 ± 0,191

Референс-сыво- Нет данных : 2,168 ± 0,016 : .

ротка

(1:80) выявлялись уже на 8-9 сут и к концу периода наблюдения титр антител достигал 1:320-1:640 (см. табл. 3).

Таким образом, использование иммуноферментных тест-систем для выявления антигена вируса Эбола позволяет обнаруживать вирусный антиген в сыворотке крови и ткани печени начиная с 4-6 дня инфекции (в день появления температуры и даже в день, предшествующий подъему температуры) и, следовательно, поставить специфический диагноз в ранние сроки заболевания. С помощью тест-системы для обнаружения антител к вирусу Эбола возможно определение специфических антител на 8-9 сут инфекции, что позволяет подтвердить диагноз и наблюдать динамику накопления антител.

Поскольку обезьяны филогенетически наиболее близки к человеку, то, вероятно, воспроизведение данной инфекции на этих животных наиболее точно отражает процессы, происходящие в организме человека при заражении лихорадкой Эбола. Среди этих животных наиболее адекватной моделью по клиническим проявлениям, биохимическим параметрам, срокам проявления симптомов показали себя павианы гамадрилы.

У инфицированных животных спустя 4-7 суток развивалось заболевание с повышением температуры до 40,0-41,0 °С, сопровождающееся вялостью животных, плохим аппетитом. Лихорадочное состояние продолжалось 2-3 сут, а за несколько часов до гибели температура снижалась до 34,0-36,0 °С. Смерть наступала на 7-10 сут при состоянии глубокого угнетения двигательной активности. У животных с относительно длительным периодом разгара заболевания (примерно у 40-50%) появлялись мелкоточечные геморрагические высыпания на коже верхних и нижних конечностей, груди,

животе, лицевой части головы. У 15-20% обезьян отмечались кровотечения из рта и носа, кровавый понос и мелена.

Выявление вируса Эбола и оценку его количества в крови и ткани печени инфицированных животных проводили с использованием метода бляшкообразования на культуре клеток Vero и метода иммуноферментного анализа. Обнаружение специфических антител в сыворотке крови проводили в РСК, РНИФ и ИФА. Результаты представлены в табл. 3, 4, 5.

Установлено, что вирус Эбола появляется в крови инфициро-ИЛННЫХ SCiiuGTliliX 1 Í сут И МО^еТ ОЧТЬ нкшниг-м н 11 и 1ЛХ.КН «i

ИФА и методом титрования на культуре клеток у 40-50% животных. Выявление вируса Эбола в крови опережает начало лихорадочного периода на 1,5-1 сут. В стадии разгара клинических проявлений вирус Эбола содержится в крови в высоком титре — 105 3-106-5 БОЕ/мл — и обнаруживается обоими методами у 100% животных. Высокий уровень вирусемии сохраняется на протяжении всего лихорадочного периода, но у агонирующих животных снижается в 10-15 раз по сравнению с предыдущим днем.

Анализ сывороток крови на наличие специфических антител показал, что антитела к вирусу Эбола выявляются в ИФА на 9-10 сут в титре 1:100-1:160, прослеживаются на 11 сут в титре 1:240. В РНИФ титр антител в эти сроки составил 1:10-1:40. Комплементс-вязывающие антитела выявить не удавалось. Провести более детальные исследования накопления антител в сыворотках обезьян не представилось возможным, так как на 8-11 сут наступала гибель животных.

Таким образом, при экспериментальном воспроизведении лихорадки Эбола на обезьянах применение метода иммунофермент-

ного анализа для обнаружения вирусного антигена при анализе образцов крови позволяет поставить специфический диагноз начиная с 5-х сут течения инфекции, до проявления основных клинических признаков.

Анализ сывороток на выявление антител в данных условиях не играет существенной роли, так как специфические антитела по-

Таблица 4

Биологическая активность вируса Эбола и содержание вирусного антигена, выявляемого в прямом варианте ИФА, в материалах от экспериментально инфицированных павианов гамадрилов

Срок от момента Титр антигена вируса Эбола в ИФА Биологическая активность БОЕ/мл

заражения, сут в сыворотке крови в гомогена-те ткани печени в сыворотке крови в гомоге-нате ткани печени

0 н.о. н.о. н.о. н.о.

3 н.о. н.о. н.о. н.о.

4 н.о. н.о. 4,2x102 н.о.

5 1:40 1:40 6,2x103 5,5x103

6 1:80 1:160 3,7x105 5,2x104

7 1:320 1:640 1,2x105 4,5x105

8 1:640 1:640 4,4x106 4,8x106

9 1:640 1:800 1,0x106 5,6x106

10 1:640 1:640 9,2x105 4,0х106

11 1:640 1:640 4,6x104 3,0x106

Примечание: н.о. - не обнаружено

являются лишь в терминальной стадии заболевания. По-видимому, этот анализ может иметь значение для подтверждения стертых форм заболевания у людей и приматов в эпидемических очагах.

Таблица 5

Сравнение результатов титрования сывороток экспериментальных животных в РСК, РНИФ и ИФА

Вид 1 Г» ГЧТ111 »V Срок от момента ттчиччшч ....... (иммунизации), сут Титр специфических антител

в РСК в ГППФ 1 в ИФА

Морские 8 Не выявл. Не выявл. 1:80-1:160

свинки 9 Не выявл. 1:10-1:20 1:80-1:160

10 Не выявл. 1:10-1:20 1:160-1:320

12 1:8 1:40 1:320

14 1:8 1:40 1:640

16 1:16 1:80 1:640

21 1:32- 1:64 1:160 1:1280

Обезьяны 8 Не выявл. Не выявл. 1:80

Рарш 9 Не выявл. 1:10-1:20 1:100-1:160

Ната<1гуаз 10 Не выявл. 1:10-1:20 1:100-1:160

11 Не выявл. 1:20-1:40 1:240

Кролики 10 Не выявл. 1:40 1:160

28 1:128 1:640 1:32000

Референс- Нет данных 1:32 1:256 1:5120

сыворотка

Разработанная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител была использована в экспериментальной работе для контроля накопления специфических антител в сыворотках иммунизированных кроликов (см. табл. 3,5). В сыворотках кроликов

антитела к вирусу Эбола обнаруживались на 10-12 сут после введения антигена в титре 1:80-1:320 и к концу срока иммунизации достигали 1:32 ООО. Сопоставление результатов титрования в ИФА сывороток иммунизированных кроликов и экспериментальных животных (обезьян и морских свинок) с результатами, полученными в РНИФ и РСК, свидетельствуют о том, что чувствительность ИФА в 5-20 раз выше чувствительности РНИФ и в 100-160 раз выше чувствительности РСК.

25

ВЫВОДЫ

1. Изучена динамика накопления вируса Эбола в культу-ральной жидкости клеток Vero и Л-68; отработан и оптимизирован отъемно-доливнби способ культивирования вируса Эбола с многократным (до 4-х раз) сбором вируссодержащей культураль-ной жидкости и высоким уровнем биологической активности — 2,3x1 ОМ ,6x104 БОЕ/мл.

2. Предложена технология концентрирования вируса Эбола путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке с последующим ультрацентрифугчрпиянием в i радиане плотности сагсйрсзь;, позволяющая получить очищенный препарат вируса с высоким физическим титром до 10" частиц/мл, наличием специфических вирусных белков (125; 104; 40; 35; 30; 24 кДа) и хорошей сохранностью вирусных частиц. Чистота препарата по данным электрофореза в полиакриламидном геле составила 92-95%, выход антигена по белку — около 1 мг с 1 л вируссодержащей культуральной жидкости.

3. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к вирусу Эбола, отличающаяся достаточно высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов, универсальностью в применении к сывороткам различных лабораторных животных и человека. Изучена динамика накопления специфических антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных животных; тест-система позволяет обнаруживать антитела к вирусу Эбола на 8-9 сутки после инфицирования. Иммуноферментный анализ на выявление антител может быть использован для постановки и подтверждения диагноза лихорадки Эбола.

4. Получен и охарактеризован набор иммунных сывороток лабораторных животных с низким титром специфических антител (1:100 - 1:800 по данным ИФА); данный набор может быть использован для контроля чувствительности выпускаемых тест-систем.

5. Разработана и опробована в условиях эксперимента тест-система для обнаружения антигена вируса Эбола, основанная на прямом методе ИФА. Показано, что тест-система обладает достаточно высокой чувствительностью и позволяет определять вирусный антиген как в нативных биологических препаратах - сыворотке крови, тканевых гомогенатах — в первые дни заболевания, так и в культуральной жидкости инфицированных клеток — спустя 3-4 дня культивирования. Метод выгодно отличается простотой постановки; время проведения анализа не превышает 2,5 ч. Минимальное количество выявляемого с помощью ИФА антигена составило 10 нг вирусного белка, или 5,0x103-1,0x104 БОЕ/мл для инфекционного материала.

6. Изучена динамика появления и накопления вирусного антигена в крови и важнейших органах у лабораторных животных -новорожденных белых мышей, морских свинок и обезьян павианов гамадрилов в процессе развития инфекции. Выявление вируса в крови с помощью иммуноферментного анализа сопутствует проявлению первых клинических симптомов заболевания (повышение температуры) и может быть рекомендовано для ранней специфической диагностики лихорадки Эбола.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Н.В.Мерзликин, А.А.Чепурнов. Разработка нммунофер-ментных тсст-систем для диагностики лихорадки Эбола П Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций. Сборник материалов межведомственной конференции. Тезисы докладов. -Кольцово. - 1993.-С.41.

2. Н.В.Мерзликин, А.А.Чепурнов. Иммуноферментная тест-система для определения антител к вирусу Эбола // Российская научная конференция "Пммунили!на а спсцпфпчсскзз ттрсф;;.""" тика особоопасных инфекций. Тезисы докладов. - Саратов. - 1993. -С. 283.

3. Н.В.Мерзликин, А.А.Чепурнов. Разработка иммунофер-ментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола И Российская научная конференция, посвященная 50-летию Академии Медицинских Наук. Тезисы докладов. - Москва. - 1994. - С. 341-342.

4. А.А.Чепурнов, Н.В.Мерзликин, М.С.Воробьева и др. Получение кроличьих антисывороток к вирусу Эбола // Вопросы вирусологии - 1994. - N 6. - С. 254-257.

5. А.А.Чепурнов, Н.В.Мерзликин, Е.И.Рябчикова и др. Получение очищенного вируса Эбола // Вопросы вирусологии. - 1994. -N6.-0. 286-289.

6. Н.В.Мерзликин, А.А.Чепурнов, Н.Н.Истомина и др. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола II Вопросы вирусологии. - 1995. - N 1. -С. 31-35.