Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам

Субботина, Екатерина Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам"

На правах рукописи

Субботина Екатерина Леонидовна

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСА ЭБОЛА В ПРОЦЕССЕ АДАПТАЦИИ К МОРСКИМ СВИНКАМ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009 003459385

003459385

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Чепурнов А.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Тикунова Нина Викторовна доктор биологических наук Морозова Ольга Владимировна

Ведущая организация: НИИ молекулярной биологии и биофизики (НИИМББ) СО РАМН (Новосибирск).

Защита состоится « 6» февраля 2009 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус Эбола (ВЭ), представитель семейства Flloviridae порядка \iononegavirales, является этиологическим агентом тяжелой геморрагической лихорадки человека и приматов, эпидемические вспышки и спорадические случаи которой периодически регистрируются на территории Центральноафриханского региона. Актуальность изучения ВЭ обусловлена его высокой вирулентностью для человека (уровни летальности при лихорадке Эбола достигают 88%), а также отсутствием средств специфической профилактики и терапии лихорадки Эбола.

Известно, что генетические особенности вирусных штаммов определяют их вирулентность для того или иного вида животных. Кроме того, незначительные изменения вирусных генов (в том числе и точечные мутации) могут изменять вирулентные свойства инфекционного агента в отношении его потенциальных хозяев. Выявление генов и мутаций, ассоциированных с изменением вирулентности ВЭ для различных, в том числе и нетипичных хозяев, является актуальной задачей, поскольку данные сведения позволили бы определить ключевые стадии патогенеза, определяющие форму течения и клинический исход лихорадки Эбола, и выработать эффективные методы лечения. Помимо этого, информация о факторах патогенносги применима в работах по создшшю вакцинных и терапевтических препаратов.

Было отмечено, что высоко вирулентные для человека изоляты ВЭ, выделенные во время эпидемических вспышек, проявляют низкую вирулентность для мышей и морских свинок. Наблюдения, сделанные при попытках создания лабораторной модели для изучения геморрагической лихорадки Эбола, показали, что в процессе последовательных пассажей ВЭ на животных его вирулентность для них может возрастать. Данное явление было названо адаптацией ВЭ к лабораторным животным. Экспериментальный подход на основе адаптации создает удобную модель для изучения причин и механизмов изменения вирулентности ВЭ. В одной из работ было показано, что изменение вирулентности ВЭ для мышей связано с точечными мутациями в вирусных генах ИР и УР24. Изучение изменчивости в!грусного генома, сопровождающей его адаптацию к морским свинкам, и возможное выявление генов и мутаций, ассоциированных с ростом вирулентности ВЭ для данного вида животных, позволит подтвердить значимость генов № и УР24 для изменения вирулентности ВЭ, либо выявить иные возможные механизмы ее изменения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение генетической изменчивости ВЭ в процессе адаптации к морским свинкам.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

а) клонирование ВЭ на культуре клеток;

б) генетическая характеристика одного из полученных клонов ВЭ;

в) проведение селективных пассажей генетически охарактеризованного клона на морских свинках до достижения им высоковирулентных для этих животных свойств;

г) генетическая характеристика адаптированного к морским свинкам варианта ВЭ, полученного в результате пассажей;

д) исследование изменчивости генома ВЭ в процессе его адаптации к морским свинкам;

е) теоретический анализ потенциального влияния аминокислотных замен на структуру, термодинамическую стабильность и участки посттрансляционных модификаций вирусных белков. Теоретическая оценка давления отбора и его влияния на изменчивость отдельных вирусных генов при проведении пассажей ВЭ на морских свинках.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен поэтапный генетический и фенотипический анализ вариантов ВЭ, полученных в процессе адаптации его индивидуального хлона к морским свинкам. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках № (Азп^Бег566) и \'Р24 (Ьеи->Рго147), возникновение которых сопровождалось проявлением ВЭ способности вызывать летальное заболевание у морских

свинок. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках VP24 (Met-Mle71 и и L (Val->Ile236), сопутствующие дальнейшему росту патогенности ВЭ для морских свинок. Впервые проведен теоретический анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков NP, VP24' и L, вариантов ВЭ, полученных при пассажах, сопровождающихся ростом вирулентности вируса для морских свинок.

. Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков полноразмерных геномов штаммов ВЭ-Заир. Последовательность нуклеотидных остатков полноразмерного адаптированного к морским свинкам варианта ВЭ GPA-P7 депонирована в базе данных GenBank под номером EU224440. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках, сопутствующие росту вирулентности ВЭ для морских свинок (гены VP24, NP и L). Результаты настоящего исследования вносят вклад как в изучение молекулярных основ патогенных свойств ВЭ, так и в определение роли белков VP24, NP и L в патогенезе лихорадки Эбола. Гены VP24 и NP, содержащие аминокислотные остатки, определяющие вирулентность ВЭ для морских свинок, могут служить мишенями для генной терапии, а также использоваться в разработке вакцин против лихорадки Эбола.

Публикации и апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Joint Meeting of the 3 Divisions of the International Union of Microbiological Societies" (Сан-Франциско, 2005), "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 2006).

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемом издании (журнал «Вопросы вирусологии») и 5 сообщений в сборниках трудов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (194 ссылки). Работа изложена на 161 страницах, содержит 26 рисунков, 22 таблицы.

Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением проведения пассажей ВЭ на морских свинках, получены непосредственно автором. Клонирование вируса на культуре клеток и пассажи на животных проведены при участии автора в режиме «под руководством».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1 Адаптация вируса Эбола к морским свинкам 1.1.1 Клонирование вируса Эбола

На первом этапе работы проводили клонирование ВЭ в культуре клеток Vero под твердым агаровым покрытием. Целью клонирования являлось получение индивидуального клона ВЭ, не вызывающего летального заболевания у морских свинок, для дальнейшей адаптации его к данному виду животных. Клонирование также исключало возможность присутствия в вирусном препарате неспецифического агента. В качестве исходного вирусного материала для клонирования использовали ВЭ-Заир, штамм Заир. Данный штамм ВЭ был получен из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

В результате клонирования были получены пять клонов ВЭ-Заир штамма Заир. Специфичность полученных вирусных препаратов оценивали методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР.

1.1.2 Пассажи клона вируса Эбола на морских свинках

Для адаптации ВЭ к морским свинкам проводили селективные последовательные пассажи вируса на данном виде животных. На первом этапе три группы морских свинок породы Hartley массой 200-250 г. (по шесть особей) инфицировали внутрибрюццпшо препаратами трех из пяти полученных на предыдущем этапе клонов ВЭ. Инфицирующая доза составляла 4 lg ИД50 для морских свинок

(около 4 lg БОЕ). Измерение ректальной Таблица 1. Вирусемия и температуры производили у животных ежедневно с содержание вируса в печени первого дня после инфицирования (п.и.). В морских свинок при пассажах результате заражения препаратами трех клонов ВЭ у вируса Эбола

морских свинок развивалось заболевание, сопровождающееся повышением температуры тела на четвертые - девятые сутки п.и. и заканчивающееся выздоровлением.

Характер температурных кривых и средние значения температур между группами животных, инфицировшшых различными клонами ВЭ, достоверно не различались. В связи с этим, выбор клона для проведения дальнейших пассажных экспериментов был произвольным. Группу животных, инфицированных выбранным клоном ВЭ в дальнейшем рассматривали, как группу первого пассажа, а клон был обозначен, как клон-предшественник адаптированного к морским свинкам ВЭ (preGPA-clone).

Далее, проводили серию селективных пассажей preGPA-clone на морских свинках. На каждом пассаже одно животное, проявившее к седьмым суткам п.и. наиболее выряженную температурную реакцию, использовалось в качестве донора вируса для следующего пассажа. На момент взятия вирусного материала у животных определяли уровень вирусемии и ряд гематологических показателей, характеризующих данную стадию инфекционного процесса. Вирусемию и инфекционный тигр вируса в печени животных определяли методом образования негативных колоний на монослое клеток линии Vero под полужидким агаровым покрытием [Устинова и др., 2003]. За течением заболевания у животных наблюдали до 21-х суток п.и.

На каждом пассаже стадия начала лихорадки (повышения температуры тела) у зараженных морских свинок приходилась в среднем на третьи-четвертые сутки п.и. Продолжительность лихорадки возрастала от пассажа к пассажу (от шести дней на первых двух пассажах до десяти-двенадцати дней у выживших животных на пятом и шестом пассажах). У животных к седьмым суткам п.и. наблюдался невысокий уровень вирусемии 3,99 - 4,67 lg БОЕ/мл (таблица 1). Способность вируса размножаться в печени морских свинок незначительно возрастала, на что указывали значения инфекционных титров вируса в печени животных на седьмые сутки п.и., колеблющиеся в пределах 6,32 - 7,08 lg БОЕ/r (таблица 1).

На первых двух пассажах ВЭ вызывал у морских свинок легкую форму заболевания, характеризующуюся повышением температуры до 40,0°С - 40,4°С на четвертые-девятые сутки п.и. и заканчивалось выздоровлением. Первый летальный исход был отмечен на третьем пассаже (на пятнадцатые сутки п.и.) (рисунок 1). На четвертом пассаже заболевание, вызванное ВЭ, не привело к летальным исходам в исследуемой группе животных. На пятом пассаже пали две особи (рисунок 1). При последующих пассажах летальность заболевания возрастала, а время течения летальной инфекции сокращалось (рисунок 1). На седьмом пассаже инфекция Эбола закончилась летально у всех животных в группе, при этом средняя продолжительность жизни инфицированных животных составила 11,6 суток. При летальном развитии болезни животные быстро

Пассаж Вирусемия, lg БОЕ/мл Содержание вируса в печени, lg БОЕ/г

1 4,22±0,09 6,32

2 4,21±0,07 6,49

3 4,I3±0,08 6,67

4 4,23±0,П 6,79

5 4,67±0ДЗ 7,12

6 4,45±0,И 7,06

7 4,50±0,16 7,08

-♦-Пассаж 1-е- Пассаж 2 Пассаж 3-к-Пассаж 4 -•«--Пассаж 5 Пассаж 6Пассаж 7

Рисунок 1. Выживаемость морских свинок при пассажах вируса Эбола

теряли в весе, отмечалась анорексия, координация движений нарушалась, в особенности на терминальной стадии. За двое-трое суток до гибели, у морских свинок появлялась диарея. Наблюдались признаки кишечного кровотечения.

Инфекция Эбола у морских свинок сопровождалась рядом гематологических сдвигов, характер которых изменялся с ростом вирулентности вируса от пассажа к пассажу. На диаграммах показаны средние значения гематологических показателей, полученных на седьмые сутки п и на каждом пассаже (рисунок 2).

В крови инфицированных животных число лейкоцитов на седьмые сутки п и. на седьмом пассаже достоверно (р<0,05) возрастало по сравнению с первым пассажем, при этом наблюдалась тенденция к развитию лейкоцитоза на четвертом-седьмом пассажах (рисунок 2). Лейкоцитоз развивался в основном за счет увеличения числа нейтрофилов крови, процентное и абсолютное количества которых на седьмом пассаже достоверно (р<0,05) превышали значения данных показателей на первом пассаже (рисунок 2).

Пассажи ВЭ на морских свинках приводили также к развитию у животных лимфоцитопении и моноцитопении, прогрессирующих с увеличением количества пассажей (рисунок 2).

Достоверное снижение числа тромбоцитов (р<0,05) в крови морских свинок отмечалось на шестом и седьмом пассажах (рисунок 2). Таким образом, заболевание, развивающееся у морских свинок вследствие первоначальной инфекции клоном ВЭ preGPA-clone, а в дальнейшем в результате пассажей, имело тенденцию к более тяжелому течению с ростом числа пассажей. При наблюдении животных до 21-х суток п и. на первых двух пассажах летальных исходов отмечено не было - заболевание заканчивалось выздоровлением. При этом большинство измеряемых показателей (рисунок 2) (за исключением фагоцитарной способности нейтрофилов крови) на первых двух пассажах оставалось относительно стабильным (межгрупповые средние значения достоверно не различались). Стабильный рост летальности при заболевании Эбола у морских свинок наблюдался с пятого пассажа Сравнение ключевых гематологических показателей, полученных на седьмые сутки п и. при пассажах ВЭ на морских свинках, с показателями на седьмые сутки п и. при инфекции адаптированным ВЭ [Connolly В.М. et al., 1999] выявило на седьмом пассаже наличие гематологических сдвигов, характерных для клинической картины заболевания Эбола у морских свинок, вызванного адаптированным для этих животных вариантом. Эти сдвиги включают лейкоцитоз, развивающийся за счет кейтрофилии, а также выраженную тробоцитопению и лимфоцитопению [Conolly В.М. et

al. 1999]. Указанные признаки прогрессируют с ростом летальности заболевания с пятого по седьмой пассажи. Кроме того, рост патогенное™ ВЭ для морских свинок сопровождается более выраженным подавлением фагоцитарной активное™ нейтрофилов крови (рисунок 2), что отмечалось ранее некоторыми авторами как важный фактор патогенное™ ВЭ [Дадаева A.A. и др., 1997].

Таким образом, в результате семи последовательных пассажей вирулентность

Рисунок 2. Динамика абсолютных и процентных количеств лейкоцитов крови, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, тромбоцитов при пассажах вируса Эбола на морских свинках. Фагоцитарная способность нейтрофилов крови при пассажах вируса Эбола на морских свинках (ПФС - показатель фагоцитарной способности).

ргеОРА-с1опе для морских свинок возросла. К пятому пассажу ВЭ приобрел способность вызывать летальное заболевание у морских свинок. К седьмому пассажу инфекция ВЭ вызывала у животных летальное заболевание, сопровождающееся характерными гематологическими сдвигами. Уровень летальности лихорадки Эбола у морских свинок на седьмом пассаже достаг 100% при дозе заражения около 4-4,5 ^ ИД50.

1.2 Генетический анализ вариантов вируса Эбола ргеСРА-с1опе и СРА-Р7

1.2.1 Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полиоразмерных последовательностей генома вируса Эбола

Для определения полных нуклеотидных последовательностей вирусных геномных РНК был произведен расчет олигонуклеотидных праймеров, позволяющих

амплифицировать геном ВЭ-Заир (18959 н.о.) в виде перекрывающихся фрагментов ДНК. Расчеты проводили на основе доступной в базе данных GenBank последовательности и.о. генома ВЭ-Заир штамма Mayinga (номер в базе данных GenBank AF086833). В результате, были рассчитаны последовательности и.о. 56 олягонуклеотидов. При использовании данных олигонуклеотидов в качестве праймеров для ПЦР полноразмерный геном ВЭ амллифицировали в виде 28-ми продуктов ПЦР. Последовательность н.о. полученных фрагментов ДНК определяли с использованием общепринятого метода Сэнгера [Sanger et al., 1973; Sanger et al., 1977]. Для увеличения точности определения были сконструированы 56 дополнительных олигонуклеотидных праймеров для определения последовательности н.о. по методу Сэнгера, разбивающие каждую цепь ДНК 28-ми ампликонов на две приблизительно равные части.

Концевые участки геномной РНК амплифицировали в виде единого продукта гнездовой ПЦР. В качестве матрицы в реакции амплификации использовали продукт двух последовательно проводимых реакций с участием геномной РНК: РНК-лигирования геномной РНК ВЭ на себя, в результате которой происходило лигирование 3'- и 5'-концов молекул РНК, и ОТ со специфическим прямым праймером в качестве затравки синтеза цепи кДНК. Последовательность н.о. данного продукта ПЦР определяли по методу Сэнгера с использованием рассчитанных ранее олигонуклеотидов.

1.2.2 Генетический анализ клона вируса Эбола preGPA-cIone

Поскольку целью настоящей работы являлось изучение генетической изменчивости ВЭ в процессе адаптации к морским свинкам, то одной из принципиально важных задач являлась генетическая характеристика клона ВЭ preGPA-clone, полученного in vitro, и использованного в качестве исходного материала для проведения пассажей на морских свинках.

1.2.2.1 Определение полной последовательности и.о. геномной РНК клона ВЭ-Заир preGPA-clone

В данном разделе описано определение и анализ полной нуклеотидной последовательности генома preGPA-clone. Геномную РНК preGPA-clone выделяли из культуральной жидкости, полученной после заражения монослоя культуры клеток Vero материалом отдельной вирусной бляшки. кДНК синтезировали в реакции ОТ, которую проводили, используя геномпую РНК preGPA-clone в качестве матрицы и статистический гексануклеотид в качестве затравки. Полученная кДНК была амплифицирована в виде 29-ти перекрывающихся фрагментов ДНК в соответствии со стратегией, описанной в разделе 1.2.1. Последовательность н.о. полученных 29-ти продуктов ПЦР определяли по методу Сэнгера [Sanger F. et al., 1973; Sanger F. et al., 1977] на автоматическом анализаторе ДНК Beckman CEQ2000XL (Beckman Coulter, США). Таким образом, была определена полная последовательность н.о. геномной РНК клона preGPA-clone.

Было проведено сравнение полученной последовательности н.о. геномной РНК preGPA-clone с последовательностью генома эталонного штамма Mayinga вида ВЭ-Заир (номер в базе данных GenBank AF086833). Результаты сравнения представлены в таблице 2.

Геном клона preGPA-clone, полученного на культуре клеток Vero, отличался от генома штамма Mayinga шестью н.о. Концевые нетранслируемые районы генома preGPA-clone (З'-лидер и 5'-трейлер) не содержали нуклеотидных замен. В транслируемой области гена NP были найдены замены четырех н.о. А-С 1781, G-A 2043, C-U 2409 и G-A 2456, приводящие к аминокислотным заменам в кодируемом белке: Asn-^His438, Arg-»Lys525, Ser»Phe647 и Asp-»Asn6a, соответственно. В З'-нетранслируемой области гена VP40 были обнаружены замены двух н.о. G-A 5576 и U-C 5597.

Таблица 2. Характеристика нуклеотндных замен, выявленных в геноме preGPA-cIone

№ Позиция 11.0. в геноме Ген Нуклеопщный остаток Кодируемый аминокислотный остаток (класс а.о.) Позиция замены а.о. в белке

Mayinga preGPA-clone Mayinga preGPA-clone

1 1781 Л С Asn (0.") His (+) 438

2 2043 NP G А Arg (+> Lys (+) 525

3 2409 С и Ser (0, п) Phe (0, гфб) 647

4 2456 G А Asp (-.п) Asn (0,n) 663

5 5576 VP40 G А - - -

6 5597 и С - - -

Примечание. Прочерк - нуклеотндная замена расположена в негранслируемой области; обозначения в скобках: 0 - незаряженный а.о.; + - положительно заряженный а.о.; - - отрицательно заряженный а.о.; п -полярный а.о ; гфб - гидрофобный а.о.

1.2.2.2 Анализ нуклеотндпой последовательности генома клопа preGPA-clone

В рамках данного раздела был проведен детальный анализ нуклеотидных замен, выявленных в геноме preGPA-clone по сравнению со штаммом Mayinga, включающий оценку консервативности мутшгшых районов, а также расчет возможного влияния некоторых мутаций на вторичную структуру содержащих их районов РНК.

Выявлено, что мутации А-С 1781, G-A 2043, C-U 2409, G-A 5576 и U-C 5597 входят в состав вариабельных районов генома ВЭ, а мутация G-A 2456 входит в состав консервативного в пределах рода Ebolavirus кластера геномной РНК. Две транзиции: G-A 5576 и U-C 5597, расположены в 3'-нетранслируемой области гена VP40 за пределами известных регуляторных областей. Компьютерное моделирование вторичной структуры данного район при помощи сервиса «GeneBee service» fhttp://www.genebee.msu.su/services/ma2 reduced.html) [Brodsky L.I. et al., 1992; Brodsky L.I. et al., 1995] показало, мутантные и.о. не входят в состав стеблей шпилек, что означает, что рассматриваемые мутации, предположительно, не оказывают существенного влияния на вторичную структуру З'-концевого района мРНК VP40. При моделировании вторичной структуры РНК при помощи «RNAalifold Webservep> fhttp://rna.tbi.iinivie.ac.at/cgi-bin/RNAalifold.cgil [Gruber A.R. et al., 2008; Hofacker I.L. et al., 2002] выявлено, что мутация U-C 5597 может затрагивать стебель одной из шпилех и таким образом может оказывать влияние на формирование одного из элемагтов вторичной структуры молекулы РНК.

1.2.2 J Анализ аминокислотных последовательностей белков клона preGPA-clone

В рамках данного раздела был проведен детальный анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков preGPA-clone и выявление в них аминокислотных замен по сравнению со штаммом Mayinga. Кроме того, была проведена оценка консервативности мутантных районов, расчет возможного влияния выявленных замен на гидрофобность белков, их вторичную структуру, потенциальные участки постгрансляционных модификаций и термодинамическую стабильность белковых глобул.

Обобщенные данные о влиянии аминокислотных замен, возникающих в структуре белков ргеОРА-с1опе, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние аминокислотных замен на структуру белков ргеСРА-с!опе

Влияние на свойства белка

№ Позиция и.о. в геноме Белок Поищи* а.о. в оодипешчдной цепи Расположение относительно известных функциональных доменов Консервативность содержащего мутацию района jíl lili ta® ¡ § i! lili ÜfUí í '¿i í

1 1711 431 В домене, отвечающем за структурную функцию Вариабельный н/в -

2 2043 NP 523 Не входят в состав известных функциональных доменов Консервативный для ВЭ (по заряду) - +

3 2409 647 В домене, отвечающем за Вариабельный -

4 2456 663 Консервативный для ВЭ (по заряду) • -

Примечание.«Н/в» - не оказывает шиши.

Вирусный кпон preGPA-clone эффективно размножался в культуре клеток Vero, следовательно, наличие четырех аминокислотных замен в белке NP и двух нуклеотидных замен в З'-нетранслируемой области гена VP40 не нарушает основных жизненно важных для вируса функций. Однако некоторые из выявленных мутаций в белке NP (а.о. 525, 647 и 663) приводят к разрушению четырех и возникновению одного дополнительного потенциального сайта фосфорилирования. Кроме того, мутация а.о. 438 затрагивает домен, отвечающий за выполнение белком NP его структурной функции. Мутации, выявленные в геноме preGPA-clone могут оказывать суммарное влияние на вторичную структуру белка NP. Таким образом, несмотря на сохранение низкого уровня вирулентности клона preGPA-clone для морских свинок, полученные в результате теоретического анализа сведения не исключают значимости найденных в его геноме мутаций для размножения вируса in vivo.

1.2.3 Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7

1.2.3.1 Определение полной последовательности н.о. геномной РНК адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола (GPA-P7) В данном разделе описано определение и анализ полной нуклеотидной последовательности генома варианта ВЭ GPA-P7. Геномную РНК адаптированного к морским свинкам варианта GPA-P7, характеризующегося высокой вирулентностью для этих животных, выделяли из печени морской свинки, находящейся в терминальной стадии заболевания, на последнем, седьмом, этапе пассирования. Полную нуклеотидную последовательность генома GPA-P7 определяли аналогично preGPA-clone (п. 1.3.1).

С целью поиска мутаций в геноме ВЭ, сопутствующих процессу адаптации ВЭ к морским свинкам было проведено сравнение последовательностей н.о. геномных РНК preGPA-clone и GPA-P7. Результаты сравнения представлены в таблице 4.

Геном варианта GPA-P7 отличался от генома клова preGPA-clone семнадцатью и.о. Концевые нетранслируемые районы генома GPA-P7 (З'-лидер и 5'-трейлер) не содержали отличий в последовательности н.о. по сравнению с геномом preGPA-clone.

Последовательность и.о. гена № СРА-Р7 содержала двенадцать нуклеотидных замен. Восемь из них являлись синонимичными, а четыре приводили к заменам а.о. в кодируемом белке ИР. В последовательности и.о. гена УР24 вРА-Р? были обнаружены три мутации, приводящие к аминокислотным заменам. Ген Ь (РНК-зависимая РНК-полимераза) ОРА-Р7 содержал две нуклеотидные замены: сшю1шмичную и несинонимичную (таблица 4).

Таблица 4. Характеристика нуклеотидных замен, выявленных в геноме варианта вируса Эбола СРА-Р7 по сравнению с клоном ргсСРА-с1опе.

№ Ген Позиция и.о. ш ге- Нукчсотидный остаток Кодируемый аминокислотами остаток Позиция а о. в соогоетв)ющсм

номе prcGPA-elone GPA-Р7 prcGPA-clone GPA-P7 белке

1 2092 и С Scr 541

2 2100 и С Uu (О.гфб) Рго (0, гфб) 544

3 2164 и С lie 565

4 2166 А G An (0.n) вег (О.п) 566

5 2188 С и Азр 573

6 2191 и С Аяр 574

7 2209 и с Бег 580

8 2222 и с Рго 585

9 2233 и с Азр 588

10 NP 2260 и с ТЬг 597

11 2261 и с Ser (О.п) Pro (О.гфб) 598

12 2456 А G Asn (»,n) А$|> {-) 663

13 10357 О А Met (0, гфб) Ile (О.'Фб) 71

14 VP24 10784 и С Leu (О.пЬб) Pro (О.гфб) 147

15 10805 G и Arg <+> Uu (О.гфб) 154

16 L 12286 G А Val (0, гфб) Ile (О.гфб) 236

17 16821 О А Яет • 1747

Примечание. Прочерк - нуклеотидная замена расположена в нетранслируемой области; обозначения в скобках: 0 - незаряженный а.о ; + - положительно заряженный а.о.; - ■ отрицательно заряженный а.о.; п -полярный а.о.; гфб - гидрофобный а.о.

1.23.2 Анализ нуклеотидпой последовательности генома варианта СРА-Р7

В рамках данного раздела был проведен анализ нуклеотидных замеп, выявленных в геноме ОРА-Р7 по сравнению с клоном-предшественником ргеОРА-с1опе.

Шестнадцать из семнадцати нуклеотидных замен, найденных в геноме СРА-Р7, принадлежали к типу транзиций. Девять из них были представлены транзициями 11-С, три в-А, три А-О, а также присутствовала одна транзиция С-1Г. Одна из найденных мутаций принадлежала к типу трансверсий (в-и). Преобладание мутаций, принадлежащих к типу транзиций в случае ВЭ, может объясняться особенностями строения и функционирования полнмеразного комплекса ВЭ, осуществляющего процессы репликации вирусной РНК.

В результате оценки консервативности содержащих мутации районов было обнаружено, что мутации в генах № (и-С 2092, А-в 2166 и А-в 2456), УР24 (О-А 10557, и-С 10784 и в-А 10805) расположены в консервативных среди представителей рода ЕЬо1спти районах генома.

1.2.33 Анализ аминокислотных последовательностей белков варианта СРА-Р7

В рамках данного раздела был проведен детальный анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков ОРА-Р7 и выявление в них аминокислотных замен по сравнению со штаммом Мауш§а. Кроме того, была проведена оценка консервативности мутантных районов, расчет возможного влияния выявленных

замен на гидрофобностъ белков, их вторичную структуру, потенциальные участки посттрансляционных модификаций и термодинамическую стабильность белковых глобул.

Обобщенные данные о потенциальном влиянии аминокислотных замен, возникающих в структуре белков вРА-Р? в результате проведения семи последовательных пассажей на морских свинках, на структуру вирусных белков представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние аминокислотных замен на структуру белков варианта GPA-P7

Позиция н о. в геноме Белок | Позиция а с. в , полипетидной цепи Расположение относительно известных функциональных доменов Консервативность содержащего мутацию района Влияние на свойства белка

1 " § _ о I 3 i 1 |з 'до 83 + •е- 1 " 1 ¿Iii llll 'а я а«' ill U ' термодинамически ю стабильность (-)-снижение, (+)-увеличение

1 2100 NP 544 Не входят » состав известных функциональных доменов Вариабельный + +

2 2166 566 Консервативный для ВЭ-Заир + + н/в -

3 2261 598 Вариабельный - н/в

4 2456* 663 В домене, отвечающем за антигенные свойства Консервативный для ВЭ (по заряду) + н/в -

5 10557 VP24 71 В домене, отвечающем за олитомеризацию Консервативный для ВЭ н/в н/в +

6 10784 147 Не входят в состав известных функциональных доменов. Вариабельный н/в н/в -

7 10805 154 Консервативный дляВЭ н/в н/в -

8 12286 L 236 Консервативный для ВЭ-Заир - и/в -

Примечание. «Н/в» - не оказывает влияния.

Теоретический анализ выявил, что в результате мутаций белки ВЭ GPA-P7 претерпевают ряд возможных изменений.

Белок NP GPA-P7 теряет один и приобретает четыре дополнительных потенциальных сайтов фосфорилирования; приобретает дополнительный потенциальный сайт О-гликозипирования; может изменяться вторичная структура белка NP; термодинамическая стабильность белковой глобулы может снижаться.

Выявленные мутации также могут оказывать влияние на вторичную структуру белка VP24; термодинамическая стабильность глобулярной структуры данного белка за счет двух мутаций может снижаться, а за счет одной - возрастать.

Белок L в результате мутаций может потерять один сайт фосфорилирования; вторичная структура данного белка, вероятно, не меняется; термодинамическая стабильность белковой глобулы может снижаться.

■ Сравнение потенциальных вторичных структур белков NP различных штаммов и вариантов Zaire ebolavirus, рассчитанных при помощи сервисов «NNPREDICT» fhttp://vmw.cmpliarm.\icsf.edu/~nonii/nnpredict.htmil [McClelland J. L.et al., 1988; Kneller D. G. et al., 1990] и «PSIPRED» ]http-.//Homf.cs.ucl.ac.uk/psipred/l [Jones, D.T. 1999; McGuffin, L.J. et al., 2000], показало, что для высоковирулентных для морских свинок штаммов и вариантов ВЭ (GPA-P7, а также полученных другими авторами штаммов 8МС и МА) возможно образования идентичных вторичных структур С-концевого района белка NP и полноразмерного белка VP24 (таблица 6, 7, рисунок 3, 4). Полученные данные указывают на вероятную значимость образуемых вторичных структур С-концевого района белка NP и белка VP24 для формирования высоковирулетного вирусного фенотипа.

Таким образом, выявленные аминокислотные замены могут затрагивать функционально значимые районы, а также оказывать влияние на расположение участков

нн-ннниНннн

•ШПНИН

¡11КН' Й НИН: 1Н НН-Н1 В39 :> НК

ВВн н нн ни н и н и н н нннннда|

нкиннпндйннннннИИВ!

Штамм Мауода, клон ргеОРА-с1опе

посттрансляционных модификаций и термодинамическую стабильность вирусных белков. Данные изменения могут быть значимы для формирования высоковирулентного вирусного фенотипа.

Таблица 6. Сравнение потенциальных вторичных структур белков рассчитанных при помощи сервиса «^РКЕР1СТ»__

ее*:-

¡griHfflj.HHHHHH.Hill

ННН1

ШНШШПНШШ!

ННННВНН^'пШШИННПНННННН ннщннннвшдеййщнн

Вариант ОРА-Р7, штаммы 8МС, МА,

Таблица 7. Сравнение потенциальных вторичных структур белков УР24, рассчитанных при помощи сервиса «ШР1*ЕР1СТ»_

«sso «7»

«so

Cone t

РЗГ^к*« ___ _

pt^ci« сосх^икссенкк^^ aa «

«?>« 700 7.3.0 *> а о

Fr&cii

P red i CCCCXTiCC^CCCCCCCC'^CCCCCCCCO^CCCCCCKBSmC M; NTQSSSH Ь-ГВШГРМI

«SO 6« О «70 «8«

-«ф-—gf».

Fred i ССССССССССШ?ЙШ<<ХСССССНШ<МНСССССЖЙЯСОСНН ДА» ЯХКЖКХТУР»«^^

«»О 700 7ЛО 720

Рисунок 3. Потенциальные вторичные структуры С-концевого района белка NP ВЭ-Заир штамма Mayinga (А), варианта GPA-P7, штаммов 8МС, МА (Б), рассчитанные при помощи сервиса «PSIPRED»

рхшз> сс<хгссссссс<зсмкш}11шгсинкга<к«»нйссссгхзт5а

^ и *» ->л > п а о

Pic*«» : _____________

р*»««. «»сягяистиасеся »»и«н 1зняпл;.с<х«и«н»»нивя«ян «н ЛАС VKAGZего^тпдаямльлальк»^»»«гагжкзжиг

Со*»Г j

so .».«и» *».<

Ргв'З > ШйннгпШсесс»г1Кгк^

rr«d: СССССЯИИ!

гоа

хго

12©

CmvEsУ

1зи> »¡и»

Aft < J S Ш OTBBWm

г»» »eo

ax<t »40

XJO XQ0 XfO 2(3 SI

md> гмм;cccccecccccct:«лкнынс

CCCCOiUM 21« :*ав. Я50 2<«

Рисунок 4. Потенциальные вторичные структуры белка VP24 штамма Mayinga (А), варианта GPA-P7, штаммов 8МС, МА (Б), рассчитанные при помощи сервиса «PSIPRED»

1.3 Анализ генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам

Для выявления стадий возникновения данных мутаций при пассажах ВЭ на морских свинках и их корреляции с ростом вирулентности вируса, на следующем этапе работы было проведено частичное определение нуклеотидных последовательностей промежуточных вариантов ВЭ, полученных на каждом из пассажей.

С этой целью вирусную РНК выделяли из гомогенатов печени, использованных при проведении пассажей. Фрагменты геномов, предположительно содержащие мутантные нуклеотидные остатки, были амплифицированы в виде 30-ти фрагментов ДНК методом ОТ-ПЦР. Нуклеотидные последовательности фрагментов определяли по методу Сэнгера на автоматической анализаторе ДНК.

Анализ полученных последовательностей но. позволил проследить динамику проявления мутаций в геноме клопа ВЭ ргеОРА-с1опе при последовательных пассажах на морских свинках (таблица 10).

Таблица 10. Проявление генетической изменчивости вируса Эбола при пассажах на морских свинках

№ Ген Позиция Аминокислотная Вариант ргеОРА- СРА-

в геноме замена |Р1 Р2 РЗ Р4 Iй. Р6 Р7

1 2092 син. + ЗИ! шг .' +

2 2100 Ьеи-^Рго544 + ЦК : +

3 2164 СИН. г

4 2166 Ая^ет*6 - +- г±~ ■в

5 2188 СИН. ВЦ 1

6 ЫР 2191 СИН. + ■ИИ

7 2209 СИН. + р'ШЙ +

8 2222 СИИ. + ш..... ..■г

9 2233 СИН. . + г + Г" "' ■ . ..X____

10 2260 СИН. + Л + ".......... Т ■

И 2261 Йсг^Рго™ + ■ ¥ +

12 2456 Аэд-Мбр'"1 -г -;; ¡¡И

13 10557 МЫ-»11е" - - - - - + г

14 УР24 10784 1.еи-»Рго"" - I +■ ■ - ш т

15 10805 Агя-»Ьеи'м - - - - -

16 12286 Уа1-»11еИЬ - - - -

17 16821 СИН. + + | + 1 ш № 1

Примечание. Жирным шрифтом выделены позиции несинонимичных нуклеотидных замен; «син.» -нуклеотедная замена является синонимичной; «-» обозначает отсутствие указанной мутации в геноме ВЭ; «+-» обозначает проявление указанной мутации в виде вырожденного пика на флуоресцентной электрофореграмме; «+» - проявление указанной мутации в виде невыровденного пика на флуоресцентной электрофореграмме.

Двенадцать из семнадцати нуклеотидных замен, приведенных в таблице 10: девять синонимичных (восемь в последовательности гена ИР и одна в последовательности гена Ь) и три несинонимичные нуклеотидные замены, расположенные в последовательности и.о. гена ЫР, были обнаружены в геноме ргеОРА-Р1. Данное наблюдение указывает на то, что к моменту забора вирусного материала (к седьмым суткам п. и.) двенадцать нуклеотидных замен закрепились в вирусной популяции.

Геном варианта ргеОРА-Р2 был идентичен варианту ргеСРА-Р1.

В геноме варианта ргевРА-РЗ при сравнении с ргеОРА-Р2 было отмечено появление гетерогенности вирусного пула по сайтам А-О 2166 и и-С 10784, входящим в последовательность н.о генов ЫР и УР24, соответственно. Гетерогенность вирусной популяции проявлялась в виде присутствия вырожденных сайтов на флуоресцентной электрофореграмме, полученной при определении последовательности н.о. по методу

Сэнгера ira автоматическом анализаторе ДНК. На третьем пассаже был отмечен первый летальный исход - одно животное пало на пятнадцатые сутки п.и. (рисунок 1).

Вариант preGPA-P4 характеризовался сохранением гетерогенности по двум мутантным позициям: A-G 2166 и U-C 10784. Тем не менее, на четвертом пассаже летальных исходов среди зараженных животных отмечено не было (рисунок 1).

На пятом пассаже, в результате анализа генома варианта preGPA-P5, была отмечена фиксация в вирусной популяции двух появившихся на предыдущем пассаже мутации A-G 2166 и U-C 10784, входящих в последовательности н.о. генов NP и VP24, соответственно. ВЭ с генотипом preGPA-P5 обладал повышенной вирулентностью для морских свинок и вызывал у них заболевание, приведшее к гибели двух из шести животных в группе так же, как и на третьем пассаже, на пятнадцатые сутки п.и. (рисунок 1).

В результате анализа генома варианта preGPA-P6, была выявлена мутация в структуре гена VP24 - G-A 10557. Данный пассаж сопровождался дальнейшим ростом вирулентности ВЭ для морских свинок, проявившимся в гибели четырех из пяти животных в экспериментальной группе: одного животного на десятые, одного - на одиннадцатые и двух животных - на двенадцатые сутки п.и. (рисунок 1).

На седьмом пассаже в геноме ВЭ была обнаружена мутация в последовательности и.о. гена VP24 G-U 10805 и возник гетерогенный сайт в последовательности н.о. гена L G-А 12286. Возникновение указанных мутаций коррелировало с дальнейшим ростом патогенности ВЭ для морских свинок, проявившимся в гибели всех животных в экспериментальной группе седьмого пассажа: одного - на восьмые, двух - на десятые и двух-на двенадцатые сутки п.и. (рисунок 1).

Фиксация большого числа нуклеотидных замен, в том числе и синонимичных (девять из двенадцати) на первом пассаже, указывает на действие жесткого отрицательного отбора со стороны организма хозяина. Выявленные на первом пассаже мутации могут давать варианту preGPA-Pl, вытеснившему исходный вариант preGPA-clone, выраженное преимущество при размножении в организме морских свинок, возможно связанное с адаптацией систем транскрипции/репликации ВЭ к молекулярному окружению, свойственному клеткам нового хозяина. В то же время, данные нуклеотидные и аминокислотные замены не приводили к росту вирулентности ВЭ для морских свинок.

Мутации, выявленные на последующих пассажах, вероятно, являются результатом искусственного отбора, направленного на обогащение вирусной популяции высоковирулентным для морских свинок вирусным вариантом. Проведение селективных пассажей приводило к фиксации в вирусном геноме мутаций A-G 2166 (в белке NP Asn->Ser566) и U-C 10784 (в белке VP24 Leu->Pro147), что сопровождалось ростом вирулентности ВЭ для морских свинок. Указанные мутации, согласно теоретическим расчетам (п. 1.4.3), могут оказывать влияние на термодинамическую стабильность глобулярных структур, а также на предполагаемые сайты постгрансляционных модификации вирусных белков. Дальнейшие селективные пассажи сопровождались ростом вирулентности ВЭ для морских свинок и возникновением в его геноме ряда мутаций: G-A 10557, G-U 10805 (в белке VP24 Metalle71, Arg-»Leum) и A-G 12286 (в белке L Val->Ile2iG). Выявленные мутации, суммарно, могут приводить к формированию характерных вторичных структур белка VP24 и С-концевой области белка NP.

Ранее во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» был получен высоковирулентный для морских свинок штамм 8МС, нуклеотидная последовательность генома которого была опубликована в работе Volchkov et al., 2000 (номер в базе данных GenBank AF272001). Указанный штамм был получен в результате проведения восьми пассажей на морских свинках ВЭ-Заир штамма Mayinga. Нуклеотидная последовательность геномной РНК данного вирусного штамма отличалась от исходного штамма Mayinga одиннадцатью и.о., приводящими к семи заменам а.о. в белках: NP (Ser-^Phe , Phe->LeuMS), GP (Asp-»Gly397), VP24 (Met-Hle71, Leu-*Pro'47, Thrille1'7) и L (Thr-^Ala'20), однако

информация о последовательностях геномов промежуточных вирусных вариантов, полученных на каждом из пассажей отсутствовала (таблица 11).

Таблица 11. Сравнение нуклеотидных замен, выявленных в геномах штаммов ВЭ-

Ген Позиция н.о. в геноме Штаммы/варианты ВЭ

Mayinga GPA-P7 8МС* MA**

NP 638 А А А 1ШМ№{

1781 А С (Asn-»His41") А A

1852 А А и A

2040 С С и (Sei-»Phen4) С

2043 G A (Arg->Lys525) G G

2092 и С (Leu->ProM) и U

2100 и С и и

2164 и С и и

2166 А G (,\»n-»Ser5aT А A

2188 С и С С

2191 и С и и

2209 и с и и

2222 и с и и

2233 и с и и

2260 и с и' и

2261 и С (Ser->Pros,!) и и

2409 с U (Ser-»Phe647) с с

2410 и и с и

2411 и и С (Pht^Leu"*) и

2425 и и и с

VP35 3163 с с с и (Ala-»Val12)

VP40 5219 А А А G

5576 G А G G

5597 и С и и

GP 6231 V и и С (Ser^Pro'^)

6774 и и и С (Ser-^Pro )

6924 - - А -

7228 А А G (Asp^Gly3'7) А

7668 и и и С (Пе^ТЬг5»")

VP30 9563 А А А .......

9595 и и и 1 А

10343 - - А

10493 С С С ! V (ТНг-»«ея\ .

VP24 10557 G *(Мц-»11е") А' 4tr»llc* > I G

10784 и ( tLfu-»!',,!') 1 lLeu-»Pi.i'* 1 и

10805 G 1 (\rfc-»Iru G G

10904 С С U (Thr-Hle1"7) С

L 12286 G А(\Я! ЙЙ53!^"" G G

14038 А А G (Thr-MIa82") А

14380 и и U О (РКе-»1-еи'и)

16174 А А A хО ЙЙУа]Ш4) 4

16755 и и U G

16821 G А G G

Прииечание. В таблице показаны нуклеотидные замены по сравнению с ВЭ-Заир штаммом Mayings. Цветом выделены мутации, коррелирующие с ростом вирулентности ВЭ для мышей/морских свинок. «-» обозначает отсутствие н.о. в данной позиции. * Данные согласно Volchkov et а!., 2000. ** Данные согласно Ebihara et al., 2006.

Сравнение мутаций, наиденных в нуклеотидных последовательностях геномов высоко патогенных для морских свинок штамма 8МС и варианта GPA-P7 ло сравнению со штаммом Mayinga, выявило совпадение двух нуклеотидных/аминокислотных замен (таблица 11) в структуре гена VP24 (G-A 10557 Met-MIe71 и U-C 10784 Leu-»Pro147). В

ходе проведенных нами пассажей две рассматриваемые иуклеотидные замены проявились на пятом и шестом пассажах, соответственно, которые характеризовались ростом вирулентности ВЭ для морских свинок. Приведенные факты свидетельствует в пользу значимости данных мутаций гена VP24 для изменения патогенных свойств ВЭ. В структуре белков NP GPA-P7 и 8МС мутациям подвергались рядом расположенные а.о. в позициях 524 и 525, а также 647 и 648, соответственно (по сравнению со штаммом Mayinga). Обе указанные мутации в белке NP GPA-P7 (а.о. 525 и 647) были выявлены в последовательности белка NP preGPA-clone и, по всей вероятности, возникли в вирусном геноме при клонировании ВЭ в культуре клеток и затем сохранились при пассажах ВЭ на морских свинках. Клон preGPA-clone, в белке NP которого присутствовали обе мутации, обладал низкой вирулентностью для морских свинок, следовательно, присутствие данных мутаций, не сказывалось на уровне патогенности ВЭ для морских свинок. Тем не менее, нельзя исключать, что мутации, найденные в геноме preGPA-clone, вносят вклад в способность вируса эффективно размножаться в организме морских свинок, а также вызывать у них летальное заболевание в сочетании с мутациями, возникающими в дальнейшем при селективных пассажах. Наличие аминокислотных замен в белках NP, VP24 и L как варианта GPA-P7, так и штамма 8МС, свидетельствует в пользу того, что изменения в указанных белках играют ключевую роль для изменения патогенных свойств ВЭ для морских свинок.

Согласно литературным данным, адаптированный к мышам штамм ВЭ, полученный в результате пассажей клона ВЭ-Заир на мышах линии BALB/c был способен вызывать летальное заболевание как у мышей BALB/c, так и у морских свинок [Bray et al., 2001], что, по всей вероятности, указывает на общность механизмов развития летального заболевания Эбола у этих видов животных. Мутации, ответственные за рост вирулентности ВЭ для мышей, были обнаружены в структуре генов NP и VP24 [Ebihara, Н. et al., 2006]. Эти данные указывают на ключевую роль белков NP и VP24 в изменении патогенных свойств ВЭ для мышей. Эксперименты, проведенные в рамках настоящей работы, подтверждают ключевую роль указанных белков в изменении патогенных свойств ВЭ и для морских свинок.

Из имеющихся литературных данных, а также из результатов представленных экспериментов, следует, что патогеиносп. филовирусов, в частности ВЭ, является мультифакгорным признаком, то есть определяется сочетанием нескольких мутаций в разных вирусных генах. Процесс адаптации вируса к новому хозяину, как правило, связан с приобретением вирусом способности эффективно реплицироваться, используя новое, неестественное, молекулярное окружение, что в рамках настоящего эксперименты привело к отбору минорного варианта, содержащего адаптивные мутации на первом пассаже. Для приобретения высоковирулентных свойств ВЭ необходимо распространяться внутри организма, преодолевая системы врожденного и адаптивного иммунного ответа, а также вызывая явление «цигокинового шторма». Вирусные белки, как правило, являются полифункциональными, следовательно, для приспособления к новому хозяину и приобретения высоковирулентных свойств вирус может использовать различные механизмы, обусловленные возникновением мутаций в различных вирусных белках.

Так, например, для белка NP известны, по меньшей мере, две функциональные роли: структурная (связывание вирусной РНК, образование нуклеокапсида) и неструктурная (образование транскрипционного/репликативного комплекса). Замены а.о. в белке NP, сказываясь на эффективности выполнения им одной из этих функций, могут оказывать влияние на скорость и эффективность транскрипции и репликации геномной РНК, эффективность сборки вирусных частиц, а также на эффективность защиты вирусной РНК от деградации. Таким образом, аминокислотные замены в структуре белка NP, а также иуклеотидные замены в последовательности данного гена, вероятно, имеют значение для адаптации вируса к новому хозяину на уровне индивидуальной клетки, что

могло реализоваться в проведенном нами эксперименте на первом пассаже. Также известно, что белок NP наряду с гликопротеином GP являются антигенами и иммуногенами [Hevey, M. et al., 1998]. Таким образом, мутации в белке NP также могут сказываться (в той или иной степени) на развитие гуморального иммунитета хозяина и, таким образом, влиять на патогенетический механизм развития лихорадки Эбола, приводя к росту вирулентности ВЭ.

Ранее в экспериментах in vitro было установлено, что белок VP24 является антагонистом ИФН-зависимой системы противовирусной защиты организма хозяина [Basler, С. et al., 2004; Halimann, P. et al., 2005]. Для адаптированного к мышам BALB/c ВЭ (штамм MA) была продемонстрирована корреляция между уровнем патогенности вируса и его способностью подавлять ИФН-зависимый противовирусный ответ [Ebihara, II. et al., 2006]. Авторы исследования связывают данное явление с возникновением точечной аминокислотной замены в белке VP24 [Ebihara, H. et al., 2006]. Показано, что способность ВЭ преодолевать ИФН-зависимую систему противовирусной защиты организма хозяина является критической стадией патогенеза инфекции Эбола для мышей [Bray M., 2001]. Таким образом, мутации в белке VP24, по всей вероятности, позволяют вирусу преодолевать механизмы противовирусной защиты организма-хозяина, придавая ему способность вызывать комплекс специфических симптомов геморрагической лихорадки Эбола.

Мутации белка L, найденные ранее в геномах адаптированных к мышам и морским свинкам штаммов, а также мутация белка L, описанная в настоящей работе, потенциально могут оказывать влияние на скорость репликации и транскрипции вирусной РНК, что в свою очередь может приводить к росту патогенности вируса.

Роль мутаций, возникающих в нетранслируемых районах генома при пассажах на животных, может заключаться в изменении вторичной структуры вирусных геномный/антигеномных РНК, мРНК или регуляторных районов, которые в свою очередь могут оказывать влияние на эффективность размножения вируса в организме хозяина.

Был проведен анализ филогенетических связей между штаммами ВЭ на основе нуклеотидных последовательностей генов NP и VP24 представителей рода Ebolavirus, доступных в базе данных GenBank, включающих адаптированные к мышам и морским свинкам штаммы. Реконструкцию филогенетических деревьев проводили при помощи программы Mega 4.0 по методу UPGMA. Матрицы генетических расстояний рассчитывали по методу Kimura с двумя параметрами.

На основе анализа матриц времени и генетических расстояний между штаммами были рассчитаны средние скорости накопления мутаций в генах NP и VP24 у ВЭ-Заир при естественной эволюции вируса, которые составили З,7х10"3 и 2,Зх10"3 замен на сайт в год, соответственно. Полученные нами значения скоростей накопления мутаций сравнимы со значениями скоростей, полученными в предыдущих работах: для гена GP 8,0x10"4 и для гена L 1,1х10'3 [Walsh et al., 2005; Biek et al., 2006]. Анализ модели молекулярных часов показал, что количество мутаций, возникших в последовательности гена NP за семь пассажей па морских свинках, могли бы быть накоплены приблизительно за 32 месяца эволюции вируса в естественной среде, а в последовательности гена VP24 - за 21 месяц. Таким образом, для указанных вирусных генов скорость накопления мутаций при пассажах на ВЭ на морских свинках возрастает в 20 и 13 раз, соответственно, по сравнению со скоростью молекулярной эволюции вируса в естественных условиях. При этом важно отметить, что в остальных вирусных генах за семь пассажей накапливается значительно меньшее число мутаций (либо они вообще отсутствуют). Из получешшх данных следует, что в процессе проведения селективных пассажей ВЭ на морских свинках вирусные гены NP и VP24 находились под воздействием селективного отбора. Ранее в одной из работ предполагалось, что при естественной эволюции ВЭ геи NP также подвергается селекции под давлением иммунной системы хозяина [Leroy et al., 2002].

Таким образом, по результатам настоящей работы можно сделать вывод, что в процессе адаптации к морским свинкам на первом пассаже мы наблюдали селекцию мутантного вирусного варианта ргеОРА-Р1 под давлением отрицательного отбора со стороны организма хозяина, вероятно, действующего на ген ОТ. Мутации, возникшие на первом пассаже, не привели к росту вирулентности ВЭ для морских свинок, однако, вероятно, являлись результатом адаптации вирусных систем РНК/ДНК-синтеза к функционированию в клетках нетипичного хозяина. При дальнейших пассажах, под воздействием искусственного отбора (позитивной селекции), направленного на обогащение вирусной популяции высоковирулеигным для морских свинок вариантом, давлению отбора в большей степени подвергался вирусный ген УР24. Мутации в генах № А-0 2166 (Авп-^ег566) и УР24 и-С 10784 (Ьеи-»Рго147), выявленные на пятом пассаже, вероятно, играют роль в изменении патогенных свойств ВЭ для морских свинок, и придают ему способность вызывать у них летальную инфекцию. Мутации в последовательностях н.о. генов УР24 в-А 10557 (Ме1->Ие71 и Л^->Ьеи154) и Ь О-А 12286 (Уа1-»11е236) вносят вклад в формирование высоковирулентного вирусного фенотипа, вызывающего у морских свинок лихорадочное заболевание с высоким уровнем летальности. Теоретически рассчитано, что мутации, ассоциированные с ростом вирулентности ВЭ, могут придавать белкам ЫР (С-концевой части) и полноразмерному УР24 характерные вторичные структуры. Вирулентность ВЭ для морских свинок, по всей вероятности, является мультифакторным признаком, поскольку с ростом патогенности ВЭ ассоциированы по меньшей мере два гена (ЫР и УР24).

Выводы

1. Определена нуклеотндная последовательность генома индивидуального вирусного клона, полученного в результате клонирования вируса Эбола, принадлежащего к виду Zaire ebolavirus, штамм Заир, на культуре клеток Vero (preGPA-clone). В геноме preGPA-clone выявлены четыре значимые нуклеотидные замены в структуре гена NP по сравнению с геномом эталонного штамма Mayinga данного вида вируса Эбола.

2. Проведены семь селективных пассажей индивидуального клона вируса Эбола preGPA-clone на белых морских свинках породы Hartley. В результате семи пассажей вирус Эбола приобрел способность вызывать летальное заболевание у морских свинок.

3. Показано, что с ростом числа пассажей инфекция Эбола у морских свинок сопровождалась развитием лейкоцитоза. При этом количество нейтрофилов (как процентное, так и абсолютное) в популяции лейкоцитов крови возрастало, а количество лимфоцитов (процентное) и моноцитов (как процентное, так и абсолютное) - снижалось. На пятом-седьмом пассажах было выявлено значительное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Шестой и седьмой пассажи сопровождались достоверным снижением числа тромбоцитов в крови.

4. Определена нуклеотндная последовательность генома варианта вируса Эбола, прошедшего семь пассажей на морских свинках (GPA-P7), а также фрагментов генома вариантов вируса, полученных на промежуточных пассажах. В геноме GPA-Р7 выявлены семнадцать нуклеотидных замен по сравнению с геномом исходного клона preGPA-clone, в том числе восемь значимых, расположенных в генах NP, VP24 и L. Двенадцать из юге, в том числе три значимых в последовательности гена NP, возникли в вирусном геноме на первом пассаже. Впервые показано, что возникновение пяти значимых нуклеотидных замен в последовательности генов NP (Asn-»Ser5"), VP24 (Met-»Ile71, Leu-»Pro147, Arg-»Leu'54) и L (Val-Mie236) коррелирует с ростом уровня летальности инфекции Эбола у морских свинок.

5. Теоретический анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков NP, VP24 и L адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7, показал:

а) аминокислотные замены в структуре белков NP (Leu-» Pro544, Asn-» Ser566, Ser-» Pro598) и VP24 (Met-» lie71, Leu-» Pro1", Arg-»Leu154) могут приводить к значимым изменениям вероятной вторичной структуры указанных белков;

б) аминокислотные замены в белке NP (Leu-» Pro , Asn-» Ser566, Ser-» Pro598, Arg-»LysS25, Ser-»PheM7), а также аминокислотная замена в белке L (Val-» Ile236), могут изменять расположение участков фосфорилирования и гли-козилировашм данных белков;

в) аминокислотная замена Met-» Ile71 в структуре белка VP24 может увеличивать термодинамическую стабильность глобулярной структуры VP24;

г) скорость накопления мутаций при пассажах вируса Эбола на морских свинках возросла для гена NP в 20 раз и для гена VP24 в 13 раз.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. A.A. Дадаева, Л.П. Сизикова, E.J1. Субботина, A.A. Чепурнов. Особенности гематологических и иммунологических показателей при пассажах вируса Эбола на морских свинках. //Вопросы вирусологии. 2006. №4. С. 32-37.

2. ЕЛ. Субботина, A.B. Качко, A.A. Чепурнов. Структурные и функциональные особенности белков вируса Эбола. //Вопросы вирусологии. 2006. №6. С. 4-10.

3. E.JI. Субботина, A.A. Чепурнов. Молекулярные механизмы репродукции вируса Эбола. //Вопросы вирусологии. 2007. №1. С. 10-16

Тезисы конференций:

1. Chepumov A.A. L. Sizikova, Е. Subbotina, A. Dadaeva. Hematological aspects of Ebola fever. - Joint Meeting of the 3 Divisions of the International Union of Micribiological Societies. -2005. SanFrancisco, USA. -V. 151. - P. 19.

2. E.L. Subbotina, A.V. Kachko, A.A. Dadaeva and A.A. Chepurnov. Genetic and physiological factors correlating with the alteration of virulence of ebola virus. - XIII International Conference Negative Strand Viruses. - 2006. Salamanca, Spain. - V.266. -P. 192.

3. E.JI. Субботина, A.B. Качко, A.A. Дадаева, A.A. Чепурнов. Экспериментальное исследование генетических факторов вирулентности вируса Эбола. Ш Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". - 2006. Новосибирск. - С.317-318.

4. Е. Subbotina, А. Kachko, A. Dadaeva, А. Chepumov. The experimental study of pathogenicity factors of Ebola virus. - Third European Congress of Virology. - 2007. Nürnberg. Germany. - P.l 16.

5. Субботина Е.Л., Дадаева A.A., Качко A.B., Чепурнов A.A. Молекулярные детерминанты адаптации вируса Эбола к морским свинкам. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - 2008. Новосибирск. - С. 109.

Благодарности.

Автор выражает благодарность к.б.н. А. В. Качко за научное консультирование, обсуждение работы и редактирование текста диссертации.

Также автор благодарит к.б.н. А. А. Дадаеву за помощь в статистической обработке гематологических данных; д.б.н., проф. В. Б. Локтева за внимательное рассмотрение работы и высказанные объективные замечания.

Автор благодарит к.б.н. А. А. Дадаеву, Л. П. Сизикову, Р. А. Никитину и | А. В. Преснякову | за техническую помощь при проведении работ с инфекционным агентом.

Субботина Екатерина Леонидовна ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСА ЭБОЛА В ПРОЦЕССЕ АДАПТАЦИИ К МОРСКИМ СВИНКАМ

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 15.12.2008. Заказ № 119. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Субботина, Екатерина Леонидовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Семейство Filoviridae: общие сведения и классификация.

1.2 Клиническая и патогенетическая характеристика геморрагической лихорадки

Эбола.

1.3 Строение генома вируса Эбола.

1.4 Генетическое разнообразие, происхождение и эволюция вируса Эбола.

1.5 Структура вириона и свойства белков вируса Эбола.

1.6 Эпидемиологическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола. Природные резервуары и переносчики.

1.7 Инфекция Эбола у лабораторных животных и получение адаптированных штаммов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам"

Вирус Эбола (ВЭ) - это общее название группы вирусов, принадлежащих к роду Ebolavirus семейства Filoviridae. ВЭ был впервые выделен в 1976 году, когда одновременно на юге Судана и на севере Заира (Демократической Республики Конго) были зафиксированы первые эпидемические вспышки геморрагической лихорадки Эбола (Jonhson К.М., et al., 1977). На сегодняшний день род Ebolavirus, объединяет пять выделенных в различное время вида ВЭ: Zaire ebolavirus (ВЭ-Заир), Sudan ebolavirus (ВЭ-Судан), Ivory Coast ebolavirus (ВЭ-Берег Слоновой Кости), Reslon ebolavirus (ВЭ-Рестон), Bundibugyo ebolavirus (ВЭ-Бундибугио).

В Центральноафриканском регионе периодически регистрируются вспышки лихорадки Эбола, уровни летальности при которых значительно варьируют (http://www.who.int/rnediacentre/factsheets/fsl03/eri/indexl.htmn. Средства специфической терапии и профилактики лихорадки Эбола в настоящее время отсутствуют. Наиболее тяжелые случаи заболевания с высокой вероятностью летального исхода (до 88%), как правило, ассоциированы с ВЭ-Заир, в то время как заболевание, ассоциированное с ВЭ-Судан, характеризуется более низким процентом летальности (до 65%). ВЭ-Рестон, единственный азиатский вид ВЭ, будучи высоковирулентным для приматов, не проявляет патогенности для человека (Peters, С. et al., 1994; Feldmann, Н. et al., 1996).

Еще на начальных этапах изучения филовирусных геморрагических лихорадок возник вопрос о выявлении характерных особенностей (факторов), присущих вирусным штаммам, детерминирующих форму (от бессимптомной до острой) и клинический исход вызываемого ими заболевания. Знания о факторах патогенности позволило бы выявить ключевые стадии патогенеза, определяющие исход лихорадки Эбола, прогнозировать вероятный исход заболевания и с учетом данного прогноза выработать эффективные методы лечения. Кроме того, знания о факторах патогенности применимы в работах по созданию вакцинных и терапевтических препаратов.

В результате первых работ, не включающих генетический анализ ВЭ, пониженную вирулентность для человека ВЭ-Судан по сравнению с ВЭ-Заир связывали с обнаружением большого количества дефектных вирусных частиц при его размножении в культуре клеток и в организме хозяина (Ellis D.S. et al., 1978; Ellis D.S. et al., 1979; Bowen E.T. et al., 1980; McCormick J.B. et al., 1983). Позже были определены нуклеотидные последовательности геномов ВЭ-Заир, ВЭ-Судан и ВЭ-Рестон. Высокие уровни различий между геномами ВЭ (межвидовые различия при попарном сравнении составляли около 40%) не позволили связать конкретные особенности генетической структуры с патогенными свойствами ВЭ. Дальнейшее изучение генетического разнообразия ВЭ, частичное определение нуклеотидных последовательностей геномов штаммов и изолятов, выделенных в течение одной вспышки (в Габоне в 1996 г.) от больных с различными формами лихорадки Эбола (от бессимптомной до тяжелой, в том числе, закончившейся летально), также не привели к выявлению специфических генетических характеристик вируса, ассоциированных с той или иной формой лихорадки Эбола (Leroy Е. et al., 2002).

Было отмечено, что природные высоковирулентные для человека изоляты ВЭ проявляют низкую вирулентность для мышей и морских свинок (van der Groen G. et al., 1979; Bowen E.T. et al., 1980). Наблюдения, сделанные при попытках создания лабораторной модели для изучения геморрагической лихорадки Эбола, показали, что в процессе последовательных пассажей ВЭ на животных его вирулентность может возрастать. Данное явление было названо адаптацией ВЭ к новому хозяину. Экспериментальный подход на основе адаптации создает удобную модель для изучения изменяющихся патогенных свойств ВЭ.

С использованием данного подхода в различных лабораториях на основе ВЭ штамма Mayinga были получены несколько адаптированных к мышам и морским свинкам б вариантов и штаммов ВЭ (Чепурнов А.А., и др., 1995; Bray М. et al., 1996; Ryabchikova Е., et al. 1996; Conolly B.M et al., 1999). В результате определения нуклеотидных последовательностей геномов двух адаптированных штаммов ВЭ: для мышей (штамм MA) (Hart М.К., 2003) и морских свинок (штамм 8МС) (Volchkov V. et al., 2000), был выявлен ряд нуклеотидных замен (как значимых, так и синонимичных) по сравнению с геномом штамма Mayinga, которые затрагивали большую часть вирусных генов. Следовательно, для выявления генов и мутаций, потенциально ассоциированных с патогенностью, вновь потребовались более детальные эксперименты. С использованием методов обратной генетики было показано, что рост патогенности ВЭ для мышей обусловлен появлением пары точечных мутаций в генах NP и VP24 (Ebihara et al., 2006). Также было показано, что в сочетании с ними точечные мутации в генах VP35 и L могут усиливать патогенные свойства ВЭ (Ebihara et al., 2006).

Изучение изменчивости вирусного генома, сопровождающей его адаптацию к морским свинкам, и возможное выявление генов и мутаций, ассоциированных с ростом вирулентности ВЭ для данного вида лабораторных животных, позволило бы подтвердить значимость генов NP и VP24 для изменения патогенности ВЭ, либо выявить иные возможные механизмы изменения его вирулентности. С этой целью нами был выбран подход поэтапной генетической характеристики вариантов ВЭ, полученных при проведении последовательных селективных пассажей на морских свинках полученного на культуре клеток клона ВЭ.

Целью настоящего исследования являлось изучение генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам. Задачами настоящего исследования являлись:

1. Адаптация вируса Эбола к морским свинкам: получение клона ВЭ в культуре клеток; проведение селективных пассажей полученного клона на морских свинках для достижения им высоковирулентных для этих животных свойств; анализ изменения 7 основных гематологических показателей, возникающих у животных в результате инфекции Эбола при проведении пассажей.

2. Генетический анализ исходного клона вируса Эбола, полученного в результате клонирования " в культуре клеток: определение полной нуклеотидной последовательности генома клона, сравнение полученной последовательности с последовательностями геномов штаммов вируса Эбола, доступными в базе данных GenBank; теоретическая оценка значимости выявленных нуклеотидных замен.

3. Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола: определение полной последовательности генома адаптированного варианта, сравнение полученной последовательности с последовательностями геномов клона-предшественника и штаммов вируса Эбола, доступными в базе данных GenBank; теоретическая оценка значимости выявленных нуклеотидных замен.

4. Анализ генетической изменчивости вируса Эбола в процессе его адаптации к морским свинкам: частичное определение нуклеотидных последовательностей геномов вариантов вируса Эбола, полученных на каждом пассаже; выявление корреляции возникновения нуклеотидных замен с ростом вирулентности ВЭ для морских свинок.

5. Теоретический анализ потенциального влияния аминокислотных замен, на структуру, термодинамическую стабильность и участки посттрансляционных модификаций вирусных белков. Теоретическая оценка влияния отбора на отдельные вирусные гены при проведении пассажей ВЭ на морских свинках.

Научная новизна работы. Впервые проведен поэтапный генетический и фенотипический анализ вариантов вируса Эбола, полученных в процессе адаптации его индивидуального клона к морским свинкам. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках NP (Asn->Ser566) и VP24 (Leu-^Pro147), возникновение которых сопровождалось проявлением вирусом Эбола способности вызывать летальное заболевание у морских свинок. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках VP24 (Met~>Ile71 и Arg-^Leu154) и L (VaI->Ile236), сопутствующие дальнейшему росту патогенности вируса Эбола для морских свинок. Впервые проведен теоретический анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков NP, VP24 и L, вариантов вируса Эбола, полученных при пассажах, сопровождающихся ростом вирулентности вируса для морских свинок.

Практическая значимость работы. Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков штаммов ВЭ-Заир. Последовательность нуклеотидных остатков полноразмерного адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7 задепонирована в базе данных GenBank под номером EU224440. Выявлены аминокислотные замены в вирусных белках, сопутствующие росту вирулентности вируса Эбола для морских свинок (гены VP24, NP и L). Результаты настоящего исследования вносят вклад как в изучение молекулярных основ патогенных свойств вируса Эбола, так и в определение роли белков VP24, NP и L в- патогенезе лихорадки Эбола. Гены VP24 и NP, содержащие аминокислотные остатки, определяющие вирулентность вируса Эбола для морских свинок, могут служить мишенями для генной терапии, а также использоваться в разработке вакцин против лихорадки Эбола.

Положения, выносимые на защиту.

1. В результате селективных пассажей индивидуального клона вируса Эбола на морских свинках вирус приобрел способность вызывать летальное заболевание у данного вида животных.

2. Охарактеризован процесс поэтапного возникновения мутаций в геноме вируса Эбола в ходе пассажей на морских свинках.

3. Выявлены аминокислотные замены в структуре вирусных белков NP, VP24 и L, сопутствующие росту уровня вирулентности вируса Эбола для морских свинок.

4. В результате теоретического анализа были выявлены аминокислотные замены, оказывающие потенциальное влияние на структуру и участки посттрансляционных модификаций вирусных белков.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Joint Meeting of the 3 Divisions of the International Union of Microbiological Societies" (Сан-Франциско, 2005), "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемом издании (журнал «Вопросы вирусологии») и 5 сообщениях в сборниках трудов конференций.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Субботина, Екатерина Леонидовна

6 выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность генома индивидуального вирусного клона, полученного в результате клонирования вируса Эбола, принадлежащего к виду Zaire ebolavirus, штамм Заир, в культуре клеток Vero (preGPA-clone). В геноме preGPA-clone выявлены четыре значимые нуклеотидные замены в структуре гена NP по сравнению с геномом эталонного штамма Mayinga данного вида вируса Эбола.

4. Определена нуклеотидная последовательность генома варианта вируса Эбола, прошедшего семь пассажей на морских свинках (GPA-P7), а также фрагментов генома вариантов вируса, полученных на промежуточных пассажах. В геноме GPA-P7 выявлены семнадцать нуклеотидных замен по сравнению с геномом исходного клона preGPA-clone, в том числе восемь значимых, расположенных в генах NP, VP24 и L. Двенадцать из них, в том числе три значимых в последовательности гена NP, возникли в вирусном геноме на первом пассаже. Впервые показано, что возникновение пяти значимых нуклеотидных замен в последовательности генов NP (Asn-^Ser566), VP24

Met-Mle71, Leu->Pro147, Arg^Leu154) и L (Val^De236) коррелирует с ростом уровня летальности инфекции Эбола у морских свинок.

5. Теоретический анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков NP, VP24 и L адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола GPA-P7, показал: а) аминокислотные замены в структуре белков NP (Leu-*Pro544, Asn-^Ser566, Ser-»Pro598) и VP24 (Met-»Ile71, Leu-»Pro147 Arg^Leu154) могут приводить к значимым изменениям вероятной вторичной структуры указанных белков; б) аминокислотные замены в белке NP (Leu->Pro544, Asn->Ser566, Ser->Pro598, Arg^Lys525, Ser^Phe647), а также аминокислотная замена в белке L (Val^Ue236), могут изменять расположение участков фосфорилирования и гликозилирования данных белков; в) аминокислотная замена Met-Mle71 в структуре белка VP24 может увеличивать термодинамическую стабильность глобулярной структуры VP24; г) скорость накопления мутаций при пассажах вируса Эбола на морских свинках возросла для гена NP в 20 раз и для гена VP24 в 13 раз.

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С момента открытия ВЭ (в 1976 г.) и до настоящего времени вопрос о патогенетических механизмах, лежащих в основе высокой летальности при геморрагической лихорадке Эбола остается до конца не решенным. На основе данных современных исследований сформирована точка зрения о том, что данный инфекционный агент вызывает развитие неадекватных реакций защитных систем организма, включающих подавление активации дендритных клеток, индукцию апоптоза лимфоцитов, супрессию ИФН-зависимого иммунного ответа, а также чрезмерный выброс провоспалительных цитокинов и ФНО (явление, называемое «цитокиновым штормом»), что в конечном итоге приводит к развитию геморрагического синдрома, гиповолемического шока и смертельному исходу. Индукцию подобных неадекватных реакций ВЭ реализует благодаря своей способности неудержимо распространяться внутри восприимчивого организма, избегая элиминации иммунной системой и реплицируясь практически во всех типах клеток (за исключением клеток лимфоидного ряда). Известно, что вирулентность ВЭ-Заир для человека выше, чем вирулентность ВЭ-Судан, что выражается в различиях уровней летальности при вспышках геморрагической лихорадки Эбола среди людей. Из данного наблюдения следует, что уровень патогенности вируса Эбола определяется не только восприимчивостью организма-хозяина к данному инфекционному агенту, но и его собственными генетическими особенностями.

У лабораторных животных, таких, как мыши и морские свинки, ВЭ способен вызывать заболевание, не являющееся летальным. Однако при проведении нескольких последовательных селективных пассажей вируса на лабораторных животных, возможно возрастание его вирулентности и получение адаптированных к мышам и морским свинкам штаммов. Изучение данного явления дает возможность выявления генетических факторов,

134 ответственных за изменение вирулентности ВЭ, знание о которых вносит вклад в разрешение вопроса о механизмах патогенеза летальной лихорадки Эбола. На примере адаптированного к мышам BALB/c штамма ВЭ было показано, что всего две аминокислотные замены в белках NP и VP24 придают ВЭ способность вызывать летальное заболевание у мышей. Были также найдены нуклеотидные замены в генах VP30 и L (в том числе и синонимичные) вызывающие дальнейший рост вирулентных свойств ВЭ для мышей

С целью изучения генетической изменчивости ВЭ в процессе адаптации к морским свинкам, а также выявления возможных генетических факторов вирулентности ВЭ для данного вида животных, в рамках настоящей работы был применен подход поэтапного генетического анализа вирусных вариантов, получаемых в ходе пассажей индивидуального, генетически охарактеризованного клона ВЭ (preGPA-clone), и выявления возникающих в его геноме нуклеотидных замен, сопутствующих адаптации вируса к нетипичному хозяину и прогрессивному росту его вирулентности. При проведении селективных пассажей клона ВЭ preGPA-clone на морских свинках на первом пассаже в вирусном геноме фиксировались двенадцать нуклеотидных замен, вероятно, являющихся результатом адаптации вирусных систем транскрипции/репликации к молекулярному окружению, свойственному клеткам нетипичного хозяина. Первый летальный исход в результате инфекции Эбола был отмечен на третьем пассаже, что совпало с появлением в геноме части вирусных частиц двух точечных мутаций в белках NP (Asn->Ser566) и VP24 (Leu~>Pro147) Закрепление указанных мутаций в вирусной популяции привело к приобретению вирусом стабильных вирулентных для морских свинок свойств, возрастающих с последовательным появлением мутаций Leu->Pro147, Arg->Leu154 в белке VP24 и Val->Ile236 в белке L

Теоретическая оценка влияния мутаций на структуру, термодинамические свойства, а также сайты пострансляционных модификаций (О-гликозилирование и фосфорилирование) белков NP, VP24 и L, показала, что аминокислотные замены, найденные в последовательности белка VP24, могут приводить к формированию определенной вторичной данного белка, характерной и для других высоко патогенных для морских свинок штаммов (8МС и МА). Мутации в генах NP и L могут приводить к изменению расположения сайтов фосфорилирования и гликозилирования в указанных белках. Вследствие мутации Met^Ile71 в белке VP24 ожидается увеличение термодинамической стабильности белковой глобулы. Рассчитано, что в условиях проводимого эксперимента (введение вируса в организм нетипичного хозяина и проведение селективных пассажей) скорость накопления нуклеотидных замен в генах NP и VP24 возрастает в 20 и 13 раз, соответственно.

В результате анализа литературных и экспериментальных данных можно сделать вывод, что вирулентность ВЭ является мультифакторным признаком. Данное свойство объясняется использованием вирусом одновременно нескольких стратегий, позволяющих ему не только эффективно реплицироваться в клетках организма, распространяясь во все органы и системы, но и вызывать каскад цитокиновых реакций, приводящих к развитию геморрагического синдрома. Мутации в белках NP и L, входящих в состав полимеразного комплекса, осуществляющего процессы транскрипции и репликации вирусной РНК, а также синонимичные нуклеотидные замены и замены в нетранслируемых областях, вероятно, делают размножение вируса в молекулярном окружении, свойственном для цитоплазмы клеток нового хозяина, более эффективным. Кроме того, белок NP выполняет структурную функцию (защита вирусной РНК от деградации, формирования нуклеокапсида), следовательно, аминокислотные замены в N-концевой части белка NP (обнаруженные, например, у адаптированного к мышам штамма ВЭ) могут делать вирусную РНК более устойчивой, а процесс сборки вирусных частиц более эффективным. В недавних исследованиях появились сведения о том, что белок VP24 обладает функциями антагониста ИФН (Halfmann P. et al., 2005). Для адаптированного к мышам штамма ВЭ показано, что при наличие пары мутаций в генах NP и VP24, ВЭ приобретает способность преодолевать ИФН-зависимый ответ (Ebihara Н. Et al., 2006). Таким образом, мутации в белке VP24, обнаруженные у адаптированного к морским свинкам варианта GPA-P7, возможно, придают ему характерную вторичную структуру и могут быть связаны с функционированием VP24 в качестве антагониста ИФН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Субботина, Екатерина Леонидовна, Кольцово

1. Ашмарин И.П., Воробьев JI.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград, 1962.

2. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д., Кузник Б.И., Лакин К.М. Лабораторные методы исследования системы гемостаза,- Томск, 1980. С. 169-171, 216-217.

3. Белокриницкий Д.В., Дудкина Л.Н., Тарасова Л.Р. Теофиллиновый тест в оценке состояния клеточного иммунитета у детей с различным клиническим течением системной красной волчанки. // Лаб. дело. 1989. -N9. - С. 54-56.

4. Дадаева А. А., Сизикова Л. П., Чепурнов А. А. Функциональная активность перитонеальных макрофагов при экспериментальной лихорадке Эбола // Вестн. Росс. акад. мед наук. 2004. - №8. - С. 7 - 11.

5. Дадаева А.А., Сизикова Л.П., Бакулина Л.Ф., Чепурнов А.А. Исследование фагоцитарной способности полиморфноядерных лейкоцитов крови кроликов и морских свинок при введении вируса Эбола. // Вопр. вирусол. 1997. - Т.42. - N 2,- С. 56-59.

6. Деменков П.С., Аман Е.Э., Иванисенко В.А. Предсказание изменения термодинамической стабильности белков при одиночных аминокислотных заменах // В печати.

7. Загоруйко Н.Г. Прикладные методы анализа данных и знаний. Новосибирск: Изд-во Инта математики, 1999. С. 158-165

8. Иванов А.П., Ткаченко Е.А., ван дер Гроен Г., Бутенко A.M., Константинов O.K. Непрямой иммуноферментный метод для лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Ласса и Эбола. //Вопр. вирусол. 1986. -N 2. - С. 186-190.

9. Игнатьев Г.М., Твердохлебов А.В., Калиберов С.А., Перебоева Л.А., Патрушева И.В., Кашенцева Е.А. Показатели иммунитета при заражении мышей различных линий вирусом Мачупо. //Вопр. вирусол. 1993. - Т.38, N4. - С.167-170.

10. П.Игнатьев Г.М., Чепурнов А.А., Прозоровский Н.С., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Влияние индуктора интерлейкина 2 диуцифона на течение геморрагической лихорадки, вызываемой вирусом Марбург. //Интерферон-92, М., 1992. - С. 160-164.

11. Рябчикова Е.И., Баранова С.Г., Ткачев В.К., Гражданцева А.А. Морфологические изменения при Эбола-инфекции у морских свинок. // Вопр. вирусол. 1993. - Т.38. - N4. -С.176-179.

12. Титенко А. М. Филовирусные геморрагичесие лихорадки: лихорадка Эбола // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2002. - №5. - С. 116-122.

13. Устинова Е.Н., Шестопалов А.М., Бакулина Л.Ф., Чепурнов А.А. Титрование вирусов Эбола и Марбург по бляшкообразованию под полужидким агаровым покрытием. // Вопросы вирусологии. 2003. - Т. 48. - N 1. - С. 43-44.

14. Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И., Воробьева М.С. Получение очищенного вируса Эбола. //Вопр. вирусол. 1994. - Т.39. - N6. - С.254-257.

15. Чепурнов А.А., Чернухин И.В., Терновой В.А., Кудоярова Н.М., Махова Н.М., Азаев М.Ш., Смолина М.П. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. // Вопр. вирусол,- 1995. Т.40. - N6.-C.257-260.

16. Adzhubei A.A., Sternberg M.J. Left-handed polyproline П helices commonly occur in globular proteins //JMol Biol. 1993. - Vol. 229(2). - P. 472-493.

17. Aman M. J., Bosio С. M., Panchal R. G. et al. Molecular mechanisms of filovirus cellular trafficking // Microbes Infect. 2003. - Vol. 5. - P. 639-649.

18. Ardouin С., Chevalier J.M., Algayres J.P. Less fevers hemorragiques virales de Marburg, Lassa et Ebola. //Med. Trop. Mars. -1981. Vol. 41. -P.191-199.

19. Badovinac V. P. & Harty J. T. Programming, demarcating, and manipulating CD8+ T-cell memory // Immunol. 2006. - Vol. 211. - P. 67-80.

20. Baize S, Leroy EM, Georges AJ, Georges-Courbot MC, Capron M, Bedjabaga I, Lansoud-Soukate J, Mavoungou E. Inflammatory responses in Ebola virus infected patients // Clin. Exp. Immunol. 2002. - Vol. 128. - P. 163-168 .

21. Baiter M. Emerging diseases. On the Trail of Ebola and Marburg Viruses // Science. 2000. -Vol. 290.-P. 923-925.

22. Baskerville A., Bowen E. T. W., Piatt G. S„ McArdell L. В., and Simpson D. I. H. The pathology of experimental Ebola virus infection in monkeys // J. Pathol. 1978. - Vol. 125. - P. 131-138

23. Baskerville A., Fisher-Hoch S. P., Neild G. H., and Dowsett A. B. Ultrastructural pathology of experimental Ebola haemorrhagic fever virus infection // J. Pathol. 1985. - Vol. 147. - P. 199209.

24. Basler C. F., Mikulasova A., Martinez-Sobrido L. et al. The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3 // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 7945-7956.

25. Basler C. F., Wang X., Muhlberger E., Volchkov V., Paragas J., Klenk H.-D., Garcia-Sastre A , and Palese P. The Ebola virus VP35 protein functions as a type 1 IFN antagonist // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. - Vol. 97. - P. 12289-12294.

26. Becker, S., Spiess, M. & Klenk, H. D. The asialoglycoprotein receptor is a potential liverspecific receptor for Marburg virus // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 393-399.

27. Bergmann J.F. These pour le Doktorat en Medicine. Cochin, Port-Royal, 1981.

28. Bermejo M., Rodriguez-Teijeiro J.D., Illera G., Barroso A., Vila C., Walsh P.D. Ebola outbreak killed 5000 gorillas// Science -2006. Vol. 8; 314(5805). - P. 1564.

29. Biek R, Walsh P. D., Leroy E. M., and Real L. A. Recent Common Ancestry of Ebola Zaire Virus Found in a Bat Reservoir // PLoS. Pathog. 2006. - Vol. 2(10). - P. 0885-0886.

30. Blom N., Gammeltoft S., and Brunak S. Sequence- and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites // Journal of Molecular Biology. 1999. - Vol. 294(5). - P. 13511362.

31. Blom N., Sicheritz-Ponten Т., Gupta R., Gammeltoft S., Brunak S. Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence. // Proteomics. 2004. - Vol.4(6). - P. 1633-1649.

32. Bobardt M.D., Saphire A.C., Hung H.C., Yu X., Van der Schueren В., Zhang Z., David G., Gallay P.A. Syndecan captures, protects, and transmits HIV to T lymphocytes // Immunity. -2003.-Vol. 18. P. 27-39.

33. Bowen E.T., Piatt G.S., Lloyd G., Raymond R.T., Simpson D.I. A comparative study of strains of Ebola virus isolated from southern Sudan and northern Zaire in 1976 // J. Med. Virol. 1980. -Vol. 6.-P. 129-138.

34. Bray M. The role of the type I interferon response in the resistance of mice to filovirus infection // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. -P. 1365-1373.

35. Bray M., Davis K., Geisbert Т., Schmal J., Huggins J. Mouse model for evaluation of Ebola prophylaxis and therapy. // Abstracts of International Colloqium "Ebola virus research". -Antwerp, Belgium, 4-7 Sep, 1996. P.83.

36. Bryson К, McGuffin L.J., Marsden R.L., Ward J J., Sodhi J.S. & Jones D.T. Protein structure prediction servers at University College London // Nucl. Acids Res. 2005. - Vol. 33. - P. W36-38.

37. Bukreyev A , Rollin P. E., Tate M K., Yang L., Zaki S. R., Shieh W.-J , Murphy В R., Collins P. L., and Sanchez A. Successful Topical Respiratory Tract Immunization of Primates against Ebola Virus//! Virol. 2007. - Vol. 81(12). - P. 6379-6388.

38. Chan S. Y., Ma M. C., Goldsmith M. A. Differential induction of cellular detachment by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola Zaire viruses // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. -P. 2155-2159.

39. Chepurnov A. A., Tuzova M. N., Ternovoy V. A. et al. Suppressive effect of Ebola virus on T cell proliferation in vitro is provided by a 125-kDa GP viral protein // Immunol. Lett. 1999. -Vol. 68.-P. 257-61.

40. Chepurnov A.A., Chernukhin I.Y. Lethal for guinea pigs strain of Ebola virus provides generation of antibody that reacts with host endovascular cells. // Abstracts of 10th International Congress of Virology. Jerusalem, Israel, 11-16 Aug, 1996. -P.259.

41. Colebunders R. and Borchert M. Ebola haemorrhagic fever a review // J. Infect. - 2000. - Vol. 40.-P. 16-20.

42. Connolly B.M., Steele K.E., Davis K.J., Geisbert T.W., Kell W.M., Jaax N.K., Jahrling P.B. Pathogenesis of experimental Ebola virus infection in guinea pigs // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179.-P. S203-S217.

43. Creamer T.P. Left-handed polyproline II helix formation is (very) locally driven. Proteins. 1998 Nov l;33(2):218-26.

44. Dessen A., Forest E., Volchkov V. et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the matrix protein from Ebola virus // Acta Ciystallogr. D Biol. Ciystallogr. 2000b. - Vol. 56. - P. 758-760.

45. Dessen A., Volchkov V., Dolnik O. et al. Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - P. 4228^1236.

46. Dolnik O., Volchkova V., Garten W. et al. Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus//EMBO J. -2004.-Vol. 23.-P. 2175-2184.

47. Drake J.W. and Holland J.J. Mutation rates among RNA viruses // Procl. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. Vol. 96(24). - P. 13910.

48. Ebihara H., Takada A, Kobasa D., Jones S., Neumann G., Theriault S., Bray M., Feldmann H., Kawaoka Y. Molecular determinants of Ebola virus virulence in mice // PLoS. Pathog. 2006. -Vol. 2(7).-P. e73.

49. Eckert D. M., Kim P. S. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition // Annu. Rev. Biochem. -2001. Vol. 70. - P. 777-810.

50. Elliott L. H., Kiley M. P., McCormick J. B. Descriptive analysis of Ebola virus proteins // Virology.- 1985.-Vol. 147.N1.-P. 169-176.

51. Elliott L. H., Sanchez A., Holloway B. P. et al. Ebola protein analyses for the determination of genetic organization // Arch. Virol. 1993. - Vol. 133. - P.423-436.

52. Ellis D.S., Bowen E.T., Simpson D.I., Stamford S. Ebola virus: a comparison, at ultrastructural level, of the behaviour of the Sudan and Zaire strains in monkeys // Br. J. Exp. Pathol. 1978. -Vol. 59.-P. 584-593.

53. Ellis D.S., Stamford S., Lloyd G., Bowen E.T., Piatt G.S., Way H., Simpson D.I. Ebola and Marburg viruses: I. Some ultrastructural differences between strains when grown in Vero cells // J. Med. Virol. 1979. - Vol. 4. - P. 201-211.

54. Feldman H., Slenczka W., Klenk H.-D. Emerging and reemerging of filoviruses // Arch. Virol. -1996c.-Vol. 11.-P. 77-100.

55. Feldmann H., Bugany H., Mahner F., Klenk H. D., Drenckhahn D., and Schnittler H. J. Filovirus-induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages // J. Virol. -1996,- Vol. 70. P. 2208-2214.

56. Feldmann H., Jones S., Klenk H. D. & Schnittler H. J. Ebola virus: from discovery to vaccine // Nature Rev. Immunol. 2003. - Vol. 3. - P. 677-685.

57. Feldmann H., Kiley M. P. Classification, structure, and replication of filoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 235 - P. 1-21.

58. Feldmann H., Nichol S. Т., Klenk, H. D. et al. Characterization of filoviruses based on differences in structure and antigenicity of the virion glycoprotein // Virology. 1994. - Vol. 199.-P. 469-473.

59. Feldmann H., Volchkov V. E., Volchkova V. A. et al. Biosynthesis and role of filoviral glycoproteins // J. Gen. Virol. 2001. - Vol 82. - P. 2839-2848.

60. Ferron F., Longhi S., Henrissat B. et al. Viral RNA-polymerases a predicted 2'-0-ribose methyltransferase domain shared by all Mononegavirales // Trends Biochem. Sci. - 2002. - Vol. 27.-P. 222-224.

61. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. -1985,-Vol. 39. P. 783-791.

62. Freed E.O. Viral late domains // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 4679^1687.

63. Garoff H., Hewson R., Opstelten D. J. Virus maturation by budding // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1171-1190.

64. Geisbert T.W., Hensley L.E., Gibb T.R., Steele K.E., JaaxN.K., Jahrling P.B. Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by Ebola and Marburg viruses // Lab. Invest. 2000. - Vol. 80.-P. 171-186.

65. Georges A.J., Gonzales J.P., Mathiot C.C. Epidemiological and epizoological investigations of Filoviruses in the Central African Republic. // Annu. Rep. Inst. Pasteur Bangui. 1989. - Vol.89, N 1. - P. 164.

66. Gibb T.R., Bray M., Geisbert T.W., Steele K.E., Kell W.M, et al. Pathogenesis of experimental Ebola Zaire virus infection in BALB/c mice // J. Сотр. Pathol. 2001. - Vol.125. - P. 233-242.

67. Gojobori Т., Moriyama E. N. & Kimura M. Molecular clock of viral evolution, and the neutral theory // Proceedings of the National Academy of Sciences, US. 1990. - Vol. 87. - P. 1001510018.

68. Gruber A.R., Lorenz R., Bernhart S.H., Neubock R., Hofacker I.L.The Vienna RNA Websuite // Nucleic Acids Res. 2008. - Vol. 36. - P. 70-74.

69. Gupta R. and Brunak S. Prediction of glycosylation across the human proteome and the correlation to protein function. Essays on the Pacific Symposium on Biocomputing. Lihue, 2002.-Vol. 7.-P. 310-322.

70. Gupta M., Mahanty S., Greer P., Towner J.S., Shieh W.J., Zaki S.R., Ahmed R., Rollin P.E. Persistent infection with Ebola virus under conditions of partial immunity // J. Virol. 2004. -Vol. 78.-P. 958-967.

71. Halfmann P., Kawaoka Y. Ebola VP24 inhibits type I interferon signaling // ХП1 International Congress of Virology. 2005, San Francisco, USA.

72. Han Z., Boshra H., Sunyer J. O. et al. Biochemical and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein: implications for a role in virus assembly and budding // J. Virol. 2003. -Vol.77. - P. 1793-1800.

73. Haring J. S., Badovinac V. P. & Harty J. T. Inflaming the CD8+ T cell response // Immunity. -2006.-Vol. 25.-P. 19-29.

74. Hart M.K. Vaccine research efforts for filoviruses // Int. J. Parasitol. 2003. - Vol. 33. - P. 583595.

75. Hartlieb В., Modrof J., Muhlberger E. et al. Oligomerization of Ebola virus VP30 is essential for viral transcription and can be inhibited by a synthetic peptide // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278.-P. 41830—41836.

76. Hercyk N., Horikami S. M., Moyer S. A. The vesicular stomatitis virus L protein possesses the mRNA methyltransferase activities // Virology. 1988. - Vol. 163. - P. 222-225.

77. Hevey M., Negley D., Pushko P., Smith J. & Schmaljohn A. Marburg virus vaccines based upon alphavirus replicons protect guinea pigs and nonhuman primates // Virology. 1998. - Vol. 251. -P. 28-37.

78. Hofacker I.L., Fekete M., Stadler P.F. Secondary Structure Prediction for Aligned RNA Sequences // J.Mol.Biol 2002. - Vol. 319. - P. 1059-1066.

79. Huang Y., Xu L., Sun Y. et al. The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein // Mol. Cell. -2002.-Vol. 10.-P. 307-316.

80. Hughes A.L., Nei M. Pattern of nucleotide substitution at major histocompatibility complex class I loci reveals overdominant selection // Nature. 1988. - Vol. 335(6186) - P. 167-170.

81. Ignatyev G. M. Immune response to filovirus infections // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1999.-Vol. 235.-P. 205-217.

82. Ito H., Watanabe S., Takada A. et al. Ebola virus glycoprotein: proteolytic processing, acylation, cell tropism, and detection of neutralizing antibodies // J. Virol. 2001. Vol. 75. - P. 1576-1580.

83. Jahrling P.B., Geisbert T.W., Jaax N.K., Hanes M.A., Ksiazek T.G., Peters C.J. Experimental infection of cynomolgus macaques with Ebola-Reston filoviruses from the 1989-1990 U.S. epizootic // Arch. Virol. Suppl. 1996. - Vol. 11,/ - P.l 15-134.

84. Jasenosky L. D., Neumann G., Lukashevich I. et al. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 5205-5214.

85. Johnson K.M., Lange J.V., Webb P.A., Murphy F.A. Isolation and partial characterisation of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire // Lancet. 1977. - Vol. 12,1(8011). - P. 569-571.

86. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 292. - P. 195-202.

87. Julenius K., Malgaard A., Gupta R. and Brunak S. Prediction, conservation analysis and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites // Glycobiology. -2005,-Vol. 15.-P. 153-164.

88. Kimura M A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // Journal of Molecular Evolution. 1980. - Vol. 16.-P. 111-120.

89. Klenk H. D., Feldmann H., Volchkov, V. E. et al. Structure and function of the proteins of Marburg and Ebola viruses // SGM symposium 60: New challenges to health: the threat of virus infection. Cambridge University Press, 2001. - P. 233-245.

90. Kneller D. G., Cohen F. E. and Langridge R. Improvements in Protein Secondary Structure Prediction by an Enhanced Neural Network // J. Mol. Biol. 1990. - Vol. 214. - P. 171-182.

91. Knobloch J., Albiez E.J., Schmitz H. A serological survey on viral haemorrhagic fevers in Liberia.//Ann. Virol. -1982. Vol.133E. - P. 125-128.

92. Kurata, Т., Aoyama Y., Tsai T.F., Bauer S. and McCormic G. B. Disseminated infection of suckling mice with Edola vims. // Abstracts of 6th International Congress of Virology. Sendai, Japan, 1-7 Sep., 1984. -P 2-73, 269 (CDC Atlanta, Univ. Tokio).

93. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein//J. Mol. Biol. 1982. - Vol. 157. - P. 105-132.

94. Lahm S.A., Kombila M., Swanepoel R., Barnes R.F. Morbidity and mortality of wild animals in relation to outbreaks of Ebola haemorrhagic fever in Gabon, 1994-2003 // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2007. - Vol 101. - P. 64-78.

95. Leroy E. M. et al. Human asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response // Lancet. -2000. Vol. 355. - P. 2210-2215.

96. Leroy E.M., Kumulungui В., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba P., ОёИса! A., Paweska J.T., Gonzalez J.P., Swanepoel R. Fmit bats as reservoirs of Ebola vims // Nature. -2005. Vol. 438. - P. 575-576.

97. Licata J. M., Johnson R. F., Han Z. et al. Contribution of ebola vims glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 vims-like particles // J. Virol. 2004. - Vol.78. -P. 7344-7351.

98. Lofts L. L., Ibrahim M. S., Negley D. L., Hevey M. C., Schmaljohn A. L. Genomic differences between guinea pig lethal and nonlethal Marburg virus variants // J. Infect. Dis. -2007,-Vol. 15(196).-P. S305-S312.

99. Mahanty S., Hutchinson K., Agarwal S., McRae M., Rollin P.E., Pulendran B. Cutting edge: impairment of dendritic cells and adaptive immunity by Ebola and Lassa viruses // J. Immunol. -2003. Vol. 170. - P. 2797-2801.

100. McClelland J. L. and Rumelhart D. E. Explorations in Parallel Distributed Processing // MIT Press, Cambridge MA. 1988. - Vol. 3. - P. 318-362.

101. McCormick J.B., Bauer S.P., Elliott L.H., Webb P.A., Johnson K.M. Biologic differences between strains of Ebola virus from Zaire and Sudan // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 147. - P. 264-267.

102. McGuffin L.J., Bryson K., Jones D.T. The PSIPRED protein structure prediction server. // Bioinformatics. 2000. - Vol. 16. - P. 404-405.

103. Modrof J., Becker S., Muhlberger E. Ebola virus transcription activator VP30 is a zinc-binding protein // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 3334-3338.

104. Modrof J., Muhlberger E., Klenk H. D. et al. Phosphorylation of VP30 impairs Ebola virus transcription // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 33099-33104.

105. Mohamadzadeh M., Chen L., and Schmaljohn A.L. How Ebola and Marburg viruses battle the immune system // Nat. Rev. Immunol. 2007. - Vol.7 (7). - P. 556-567.

106. Mohamadzadeh M., Mohamadzadeh H., Brammer M., Sestak K. & Luftig R. B. Identification of proteases employed by dendritic cells in the processing of protein purified derivative (PPD) // J. Immune Based Ther. Vaccines. 2004. - Vol. 2. - P. 8.

107. Muhlberger E., Weik M., Volchkov V. E. et al. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 2333-2342.

108. Neumann G., Feldmann H., Watanabe S. Reverse Genetics Demonstrates that Proteolytic Processing of the Ebola Virus Glycoprotein Is Not Essential for Replication in Cell Culture // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 406-410.

109. Noda Т., Sagara H., Suzuki E. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 4855^1865.

110. Pattyn S., van der Groen G., Courteille G., Jacob W., Piot P. Isolation of Marburg-like viais from a case of haemorrhagic fever in Zaire // Lancet. 1977. - Vol. 12. - P. 573-574

111. Peters C.J., Sanchez A., Feldmann A., Rollin P.E., Nichol S., Ksiazek T.G. Filoviruses as emerging pathogens// Semin. Virol. 1994. - Vol. 5. - P. 147-154.

112. Peterson A.T., Bauer J.T., Mills J.N. Ecologic and geographic distribution of filovirus disease // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 40-47.

113. Pinzon J.E., Wilson J.M., Tucker С .J., Arthur R., Jahrling P.B., Formenty P. Trigger events: enviroclimatic coupling of Ebola hemorrhagic fever outbreaks // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004. -Vol. 71.-P. 664-674.

114. Pourrut X., Kumulungui В., Wittmann Т., Moussavou G., Delicat A., Yaba P., Nkoghe D., Gonzalez J.P., Leroy E.M. The natural history of Ebola vims in Africa // Microbes Infect. -2005. Vol. 7. - P. 1005-1014.

115. Reed D. S„ Hensley L. E., Geisbert J. В., Jahrling P. B. & Geisbert T. W. Depletion of peripheral blood T lymphocytes and NK cells during the course of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques // Viral Immunol. 2004. - Vol. 17. - P. 390^400.

116. Reid S.P., Leung L.W., Hartman A.L., Martinez O., Shaw M L., Carbonnelle C., Volchkov V.E., Nichol S.T., Basler C.F. Ebola virus VP24 binds kaiyopherin al and blocks STAT1 nuclear accumulation // J. Virol. 2006. - Vol. 80. - P. 5156-5167.

117. Ruigrok R. W., Schoehn G., Dessen A. et al. Structural characterization and membrane binding properties of the matrix proteinVP40 of Ebola virus // J. Mol. Biol. 2000. - Vol. 300. -P. 103-112.

118. Ruthel G., Demmin G. L., Kallstrom G. et al. Association of ebola virus matrix protein VP40 with microtubules // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 4709-4719.

119. Ryabchikova, E. I., Kolesnikova, L. V. & Luchko, S. V. An analysis of features of pathogenesis in two animal models of Ebola virus infection. // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179 (Suppl. 1). - P. 199-202.

120. Saez-Cirion A., Gomara M. J., Agirre A. et al. Pretransmembrane sequence of Ebola glycoprotein interfacial hydrophobicity distribution and interaction with membranes // FEBS Lett. 2002. - Vol. 533. - P. 47-53.

121. Saijo M., Niikura M., Morikawa S. et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 1-7.

122. Sanchez A., Khan A.S., Zaki S.R., Nabel G.J., Ksiazek T.G., and Peters С J. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.). Fields virology. -Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. 2001. - P. 1279-1304.

123. Sanchez A., Kiley M. P., Holloway B. P. et al. Sequence analysis of the Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of Marburg virus // Virus Res. 1993. - Vol. 29. - P. 215-240.

124. Sanchez A., Trappier S. G., Mahy B. W. et al. The virion glycoprotein of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 3602-3607.

125. Sanchez A., Yang Z. Y., Xu L. et al. Biochemical analysis of the secreted and virion glycoproteins of Ebola virus // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 6442-6447.

126. Sanger F., J. E. Donelson A. R. Coulson H. K. and D. Fischer. Use of DNA polymerase I primed by a synthetic oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in phage fl DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - Vol. 70(4). - P. 1209.

127. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74(12). - P. 5463.

128. Sankararamakrishnan R., Vishveshwara S. Characterization of proline-containing alpha-helix (helix F model of bacteriorhodopsin) by molecular dynamics studies //Proteins. 1993. -Vol. 15(1).-P. 26-41.

129. Scianimanico S., Schoehn G., Timmins J. et al. Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein // EMBO J. 2000 - Vol. 19. - P. 6732-6741.

130. Simmons G., Wool-Lewis R. J., Baribaud F. et al. Ebola virus glycoproteins induce global surface protein down-modulation and loss of cell adherence // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 2518-2528.

131. Shackelton L.A., Parrish C.R., Truyen U., Holmes E.C. High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 -Vol. 102.-P. 379-384.

132. Sheridan I., Pybus O.G., Holmes E.C., Klenerman P. High-resolution phylogenetic analysis of hepatitis С virus adaptation and its relationship to disease progression // J. Virol. 2004,- Vol. 78.-P. 3447-3454.

133. Slenczka, W. G. The Marburg virus outbreak of 1967 and subsequent episodes. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 235. - P. 49-75.

134. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical Taxonomy. Freeman, San Francisco, 1973, 673 p.

135. Soukate P. Debre, S. P. Fisher-Hoch, J. B. McCormick, and A. J. Georges.Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients // Nat. Med. 1999. - Vol. 5. - P. 423-426.

136. Sullivan N., Yang Z.-Y., and Nabel G. J. Ebola Virus Pathogenesis: Implications for Vaccines and Therapies // J. Virol. 2003. - Vol. 77(18). - P. 9733-9737.

137. Sundar K., Boesen A., Coico R. Computational prediction and identification of HLA-A2.1-specific Ebola virus CTL epitopes // Virology. 2007. - Vol 360. - P. 257-263.

138. Tajima F. Simple methods for testing the molecular evolutionary clock hypothesis // Genetics 1993.- Vol. 135(2). - P. 599-607.

139. Takada A., Feldmann H., Stroeher U. et al. Identification of protective epitopes on ebola virus glycoprotein at the single amino acid level by using recombinant vesicular stomatitis viruses // J. Virol. 2003. - Vol. 77. -P. 1069-1074.

140. Takada A., Watanabe S., Ito H.et al. Downregulation of betal integrins by Ebola virus glycoprotein: implication for virus entry // Virology. 2000. - Vol. 278. - P. 20-26.

141. Takezaki N., Rzhetsky A. & Nei M. Phylogenetic test of the molecular clock and linearized trees // Molecular Biology and Evolution. 2004. - Vol. 12. - P. 823-833.

142. Tamura К., Dudley J., Nei M. & Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. -10.1093/molbev/msm092.

143. Theriault S., Groseth A., Neumann G. et al. Rescue of Ebola virus from cDNA using heterologous support proteins // Virus Res. 2004. - Vol. 106. - P. 43-50.

144. Tignor G.H., Casals G., Shope RE. The yellow fever epidemic in Ethiopia, 1961-1962: retrospective serological evidence for concominant Ebola or Ebola-like virus infection. // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg. 1993. - Vol. 87, N 2. -P.162.

145. Villinger F., Rollin P. E., Brar S. S., Chikkala N. F., Winter J., Sundstrom J., Zaki S. R„ Swanepoel R., Ansari A., and Peters C. J. Markedly elevated levels of interferon (IFN)-gamma,

146. N-alpha, interleukin (IL)-2, IL-10, and tumor necrosis factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179. - P. S188-S191.

147. Volchkov V. E., Becker S., Volchkova V. A. et al. GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases // Virology. 1995. - Vol. 214.-P. 421-430.

148. Volchkov V. E., Blinov V. M., Netesov S. V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses // FEBS Lett. -1992. Vol. 305. -P. 181-184.

149. Volchkov V. E., Chepurnov A. A., Volchkova V. A. et al. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus // Virology. 2000. - Vol. 277. - P. 147-155.

150. Volchkov V. E., Feldmann H., Volchkova V. A. et al. Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -P. 5762-5767.

151. Volchkov VE, Volchkova VA, Chepurnov AA, Blinov VM, Dolnik O, Netesov SV, Feldmann H. Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus // J. Gen. Virol. -1999.-Vol. 80.-P. 355-362.

152. Volchkov V. E., Volchkova V. A., Muhlberger E. et al. Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity // Science. 2001. -Vol. 291.-P. 1965-1969.

153. Volchkov V. E., Volchkova V. A., Slenczka W. et al. Release of viral glycoproteins during Ebola virus infection // Virology. 1998b. - Vol. 245. - P. 110-119.

154. Volchkova V. A., Feldmann H., Klenk H. D. et al. The nonstructural small glycoprotein of Ebola virus is secreted as an antiparallel-orientated homodimer // Virology. 1998. - Vol. 250. -P. 408-414.

155. Volchkova V., Klenk H. D., Volchkov V. D-peptide is the carboxy-terminal cleavage fragment of the nonstructural small glycoprotein sGP of Ebola virus // Virology. 1999. - Vol. 265.-P. 164-171.

156. Wahl-Jensen V., Kurz S. K., Hazelton P. R. et al. Role of Ebola virus secreted glycoproteins and virus-like particles in activation of human macrophages // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 2413-2419.

157. Walsh P.D., Biek R., Real L.A. Wave-like spread of Ebola Zaire // PLoS Biol. 2005. -Vol. 3(11).-P. e371.

158. Watanabe S, Noda T, Kawaoka Y. Functional mapping of the nucleoprotein of Ebola virus //J. Virol. -2006. Vol. 80(8). - P. 3743-3751.

159. Watanabe S., Watanabe Т., Noda T. et al. Production of novel Ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to Ebola virus generation by reverse genetics // J. Virol. 2004. -Vol. 78.-P. 999-1005.

160. Weik M., Modrof J., Klenk H. D. et al. Ebola virus VP30-mediated transcription is regulated by RNA secondary structure formation // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 8532-8539.

161. Weissenhorn W., Carfi A., Lee К. H. et. al. Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain //Mol. Cell. 1998. - Vol. 2. -P. 605-616.

162. Wilson J. A., Hevey M., Bakken R., Guest S., Bray M., Schmaljohn A. L., and Hart M. K. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus // Science. 2000. - Vol. 287.-P. 1664-1666.

163. Yang Z.Y., Delgado R., Xu L. et al. Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins // Science. 1998. - Vol. 279. - P. 1034-1037.

164. Yang Z., Nielsen R., Goldman N., Pedersen A.M. Codon-substitution models for heterogeneous selection pressure at amino acid sites // Genetics. 2000. - Vol. 155. - P. 431449.

165. Zhang J., Rosenberg H.F. & Nei M. Positive Darwinian selection after gene duplication in primate ribonuclease genes //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 3708-3713.

Информация о работе

Субботина, Екатерина Леонидовна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы