Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные биологические свойства вируса Марбург (штамм Voege) и методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Основные биологические свойства вируса Марбург (штамм Voege) и методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург"

рГб од

" НОЯ 19.95

На правах рукописи

АНДАЕВ Евгений Иванович

ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА МАРБУРГ ( ШТАММ \oege ) И МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МАРБУРГ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск, 1995

Работа выполнена в лаборатории особо опасных вирусов Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Титенко А.М.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Федоров Ю.В. кандидат биологических наук Шутова Н.А.

Ведущее учреждение: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" ВНИИ молекулярной биологии

Защита состоится "_"_1995 г.

в "___" часов на заседании специализированного совета

К.098.11.01. по присуждению ученой степени кандидата наук при Томском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сывороток (634050, Томск, пр. Ленина,32).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского научно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан 'У^"' ¿м^ьб^А--1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Полещук Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус Марбург является возбудителем геморрагической лихорадки с высокой летальностью. Первые зарегистрированные вспышки экзотического заболевания, названного впоследствии геморрагической лихорадкой Марбург, возникли в 1967г. среди сотрудников исследовательских учреждений ФРГ и Югославии вследствие контакта с инфицированными зелеными мартышками, завезенными из Уганды.

До 1985 г. в мире зарегистрировано 37 случаев геморрагической лихорадки Марбург со средней летальностью 24%. Природные очаги геморрагической лихорадки Марбург существуют в ряде районов Африки. Предполагают, что первичное заражение происходило при контакте с кровью африканских зеленых мартышек. Выделить вирус от обезьян, живущих в природе, не удалось. Исключить обезьян из цепи возможных видов, поддерживающих циркуляцию вируса, представляется преждевременным, хотя утвердилось мнение об активной циркуляции вируса среди приматов. Имеющиеся к настоящему времени преимущественно косвенные данные не позволяют определить какие-либо виды животных, способные играть роль резервуара и переносчика инфекции в природных очагах лихорадки Марбург. Тяжесть протекания заболевания варьирует от стертых и бессимптомных форм до тяжелых летальных случаев. Возрастающая миграция населения, а также длительный инкубационный период, возможность бессимптомных форм, увеличивают вероятность заноса лихорадки Марбург на неэндемичные территории.

Специфические средства лечения и профилактики заболевания не разработаны. Лабораторная диагностика основана на использовании электронной микроскопии, метода флюоресцирующих антител, иммунофер-ментного анализа.

Недостаточно изучены биологические свойства вируса Марбург, работа с которым требует организации максимального уровня биологической защиты.

Тяжесть заболевания, высокая смертность и случаи завоза лихорадки Марбург на неэндемичные территории, отсутствие коммерческих диагностических тест-систем, а так же документов, регламентирующих диагностику, обусловило актуальность проведенного изучения возбудителя геморрагической лихорадки Марбург и совершенствования методов лабораторной диагностики.

Цель работы. Изучение биологических свойств штамма Voege вируса Марбург in vivo и in vitro, разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург.

Задачи исследования.

1. Подбор чувствительной клеточной культуры и изучение культураль-ных свойств, динамики репродукции вируса, экспрессии вирусспе-цифических антигенов в клетках Vero.

2. Отработка метода определения инфекционности вируса.

3. Адаптация вируса к морским свинкам и изучение их чувствительности. Разработка схем иммунизации морских свинок для получения иммунных сывороток к вирусу Марбург.

4. Совершенствование методов лабораторной диагностики лихорадки Марбург - метода флюоресцирующих антител и иммуноферментно-го анализа.

Научная новизна. Разработан метод титрования инфекционности вируса по бляшкам. С использованием этого метода проведена оценка инфекционной активности вируса по признаку формирования бляшек и репродукции в культуре клеток, что позволило получить клонированный пул вируса, отличающийся от исходного вируса степенью цитопа-тогенного действия на клетки и уровнем репродукции в клеточной культуре.

Изучена динамика репродукции вируса и экспрессии вирусспеци-фических антигенов в культуре клеток Vero. Определены оптимальные сроки размножения инфекционного вируса и наработки биомассы вируса in vitro.

Изучена динамика образования антител к вирусу Марбург у морских свинок. Полученные данные позволили разработать эффективные схемы иммунизации для получения высокоактивных специфических антисывороток с титром антител в НМФА 1:1024.

Впервые разработана тест-система для клеточного иммунофермент-ного анализа антител к вирусу Марбург. Методом клеточного ИФА выявлены специфические антитела к вирусу Марбург в сыворотках морских свинок.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут иметь практическое значение. Отмеченный цитопатический эффект вируса Марбург на клетках Vero позволяет титровать инфекционность вируса по цитопатогенному действию. С использованием метода бляшек возможно определять инфекционную активность при изучении процессов размножения вируса. Способность вируса формировать бляшки под агаровым покрытием может быть использована для получения клонированных пулов. Данные по гетерогенности популяции вируса по признаку

формирования бляшек позволяют изучать генетические различия клонов.

Данные по экспрессии вирусспецифических антигенов в культуре клеток Vero позволяют определить оптимальные сроки приготовления слайд-антигенов и правильно оценивать результаты выявления антигенов вируса Марбург в инфицированных клетках методом флюоресцирующих антител. Разработанный метод клеточного ИФА может быть применен для выявления антител к вирусу Марбург. Метод имеет преимущество перед твердофазным иммуноферментным анализом, в связи с тем, что для его постановки не требуется получения очищенного антигена.

Получены данные по чувствительности морских свинок различного возраста к заражению вирусом Марбург. Подобраны эффективные схемы иммунизации морских свинок, позволяющие получать специфические высокоактивные антисыворотки к вирусу Марбург.

Разработанный метод контроля на специфическую безопасность in vivo и in vitro позволяет проводить оценку полноты инактивации инфекционного материала, что является необходимым при выносе инактиви-рованного материала на чистую зону.

Разработана схема лабораторной диагностики лихорадки Марбург, позволяющая выявлять в исследуемом материале как вирулентные, так и слабо вирулентные варианты вируса и проводить его типирование. Схема отработана в лабораторных условиях и испытана на практике при обследовании больной М. из г. Корсаков с диагнозом "геморрагическая лихорадка Марбург".

Результаты исследований легли в основу составления следующих информационно-методических документов:

1. Руководство по диагностике и профилактике особо опасных вирусных геморрагических лихорадок. Иркутск, 1985, 40 с. Утверждено директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 2.03.83.

2. Методические рекомендации по проверке герметичности боксов биологической защиты и эффективности работы бактериальных фильтров в системе вентиляции. Иркутск, 1991, 9 с. Одобрены ученым советом и утверждены директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.05.91.

3. Руководство по противоэпидемическому режиму работы с особо опасными вирусами 1 группы. Иркутск, 1991, 22 с. Одобрено ученым советом и утверждено директором ИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.06.91.

4. Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Иркутск, 1993, 17 с. Одобрено ученым советом и утверждено директором ИПЧИ Сиби-

ри и Дальнего Востока 14.04.93.

Методическое пособие отправлено в Госкомсанэпиднадзора РФ для утверждения.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Разработка метода определения инфекционной активности вируса Марбург - метода бляшек.

2. Изучение динамики экспрессии вируса Марбург в клетках Vero при низкой и высокой множественности заражения.

3. Изучение динамики экспрессии антигенов вируса Марбург1 в клетках Vero методом иммунофлюоресценции.

4. Разработка метода клеточного ИФА для определения специфических антител к вирусу Марбург.

5. Разработка схемы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на:

- Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций"; Волгоград, 1992.

- Научной конференции, посвященной 70-летию образования сан-эпидслужбы Иркутской области; Иркутск, 1993.

Научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; Иркутск, 1994.

В окончательном варианте диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока 12.04.95г.

Объем и структура диссертации. Текст работы изложен на 100 листах машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 11 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 135 источников (35 отечественных и 100 зарубежных).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа с инфекционным материалом производилась в соответствии с требованиями, обеспечивающими необходимый уровень максимальной биологической защиты.

Вирус Марбург, штамм Voege (ГКВ № 886), получен в виде культу-ральной жидкости второго пассажа с титром 1.9х 105 БОЕ/мл из Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.

Для изучения чувствительности к вирусу Марбург использовали нелинейных морских свинок массой 200-250 и 350-400 г, полученных из питомника противочумного института. В экспериментах применяли по 4 животных. Иммунные сыворотки получали на морских свинках массой 350-400 г.

В качестве референс сыворотки и слайд-антигенов использовали ни-доспецифическую сыворотку к вирусу Марбург - сыворотку реконвалес-цента (CDC № 700808) и слайд-антигены (CDC № 805600),. приготовленные из суспензии клеток Vero, инфицированных вирусом Марбург.

Титрование инфекционности вируса по цитопатогенному действию проводили на клетках Vero или BGM, выращенных в лунках 96-луноч-ных планшетов "Linbro". Для титрования инфекционности вируса по бляшкообразованию клетки Vero или BGM выращивали во флаконах № 25 "Linbro". Клеточный монослой заражали десятикратными разведениями вируса. После адсорбции вируса вносили среду покрытия. Результаты учитывали на 5-7 сутки.

Для изучения динамики накопления вируса в культуральной жидкости при многоцикловой репродукции клетки заражали с множественностью 0.01 БОЕ/кл. Аликвоты культуральной жидкости забирали ежесуточно. При изучении одноцикловой репродукции вируса клетки заражали с множественностью 10 БОЕ/кл. Аликвоты забирали по часам.

Контроль на специфическую безопасность инактивированного инфекционного материала осуществляли параллельно в двух вариантах in vivo и in vitro. Сыворотки экспериментально зараженных морских свинок тестировали в НМФА и клеточном ИФА. Слайд-антигены готовили по общепринятой методике из инфицированных клеток Vero.

Для постановки клеточного ИФА, клетки Vero выращивали в лунках 96-луночных планшетов "Linbro". Сформировавшийся клеточный монослой заражали вирусом в дозе 0.01 БОЕ/кл. На третьи сутки после заражения клеточный монослой фиксировали смесью ацетона и этанола.

Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча. Данные, полученные в экспериментах по репродукции вируса, получения иммунных сывороток обрабатывали общепринятыми методами вариационного анализа с использованием критерия Стьюдента при Р=0.05.

Коэффициент корреляции определяли также общепринятым методом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Репродукция вируса Марбург в клеточных культурах. Цитопатогенное действие вируса в клеточных культурах. Для адаптации вируса на культуре клеток Vero провели три серийных пассажа. Проявление ЦПД наблюдали уже на первом пассаже. На третьем пассаже отметили хорошо различимое ЦПД. В зависимости от инфицирующей дозы через 5-7 суток после заражения погибает до 80% клеток, в последующие сутки инкубации инфицированных культур отмечается полный лизис монослоя. На основании способности вируса вызывать цитопатогенное действие в клеточных культурах, разработаны методы количественной оценки инфекционное™ вируса по ЦПД и бляшкообразованию.

Бляшкообразующая способность вируса. Оптимизация метода титрования вируса по бляшкообразованию. К моменту начала исследований в литературе отсутствовали публикации о методе титрования инфекционной активности вируса Марбург. Нами разработан состав покрытия, позволяющий в течение продолжительного времени сохранять жизнеспособность клеточного монослоя под агаровым покрытием. С целью оптимизации метода бляшек мы варьировали различными параметрами метода. Использовали различные клеточные культуры, типы подложек для выращивания клеточного монослоя (флаконы № 25 "Linbro" и "Falkon", 6-ти, 24-луночные планшеты "Linbro" и "Geiner"). Варьировали составом покрытия, в частности, по содержанию СПК или БСА. Испытали на токсичность на клетки различные гельобразующие вещества. В итоге, нами разработан вариант покрытия, подобраны оптимальные условия, позволившие с хорошей воспроизводимостью получать бляшки вируса Марбург и использовать этот метод для титрования инфекционной активности вируса. Нами показано, что вирус Марбург формирует отчетливые бляшки в клеточных линиях Vero и BGM. Точечные бляшки появляются на 5-6 сутки после инокуляции вируса. На 7-8 сутки размеры бляшек увеличиваются и составляют от 1 до 3 мм в диаметре в зависимости от состава и плотности агарового покрытия.

При определении стандартности метода бляшек показано, что количество бляшек находится в линейной зависимости от концентрации вируса (рис. 1). Высокая воспроизводимость предложенного метода позволяет использовать его как для титрования инфекционности вируса, так и для клонирования вируса Марбург.

ш 3 о; с; ю

Рис.1

200

150

100

50

0

0.25 0.5 0.75 1

Относительная концентрация вируса

Зависимость количества бляшек, образуемых вирусом Марбург, от инфицирующей дозы. Точки на кривой соответствуют среднему арифметическому количества бляшек в 6-ти флаконах.

Получение и характеристика клонированных пулов вируса. Нами показано, что популяция вируса Марбург, используемого в нашей работе, гетерогенна по типу бляшек, формируемых под агаровым покрытием в культуре клеток 1ЮМ. Бляшки различаются по размеру и по фенотипу -так называемые "красные" бляшки и негативные. Выделенные клоны вируса из негативной колонии и из "красной" бляшки исследованы на чувствительность к ним культуры клеток. Показано различие клонов вируса по степени цитопатогенного воздействия на клетки и уровню репродукции в культуре клеток. Полученные данные позволяют говорить о наличии в популяции вируса Марбург вариантов вируса, отличающихся по формированию гетерогенных по размерам и морфологии бляшек, а также по чувствительности к ним культуры клеток. В дальнейшем целесообразно провести более углубленное изучение вариантов вируса, клонированных из "красных" и негативных бляшек. При заражении культуры клеток вирусом, клонированным из "красной" бляшки, ЦПД развивалось на 7-8 сутки, а полный лизис монослоя наступал на 11-12 сутки с момента заражения. Титр вируса составил 6.0010.21 1ц БОЕ/мл. Титр вируса, клонированного из негативной бляшки, составил 7.43+0.14 БОЕ/мл на 7 сутки после заражения при более раннем развитии цитоде-струкции клеточного монослоя.

Динамика репродукции вируса Марбург в клеточных культурах. Изучение динамики репродукции вируса Марбург проводили в клетках Vero при различной множественности инфицирования.

Одноцикловая репродукция. Цикл размножения вируса Марбург в культуре клеток Vero можно разделить на три этапа:

1. Латентный период. Его продолжительность 4 часа. Продукцию вируса начинали регистрировать через 6 часов с начала адсорбции ви-

2. Период экспоненциального роста. Этот период равен 48 часам.

3. Стационарный период. Его продолжительность по нашим наблюдениям длится от 48 до 72 часов.

В более отдаленные сроки наблюдения не вели, так как наступал лизис клеточного монослоя.

Кривая накопления вируса в культуральной жидкости изображена на рис. 2. Максимальное размножение инфекционного вируса в культуральной жидкости отмечено через 6-48 часов, при этом титр вируса через 72 часа составил 7.54±0.11 ^ БОЕ/мл. Выход вируса в расчете на одну клетку составил 100-150 БОЕ.

руса.

8 7

с 6

5

ш 5

о

ш 4

и> н

/

♦

S

ь-

0

12 24 36 48 60 72

Время инкубации (часы)

Рис. 2 10

Кривая одноцикловой репродукции вируса Марбург в клетках Vero.

Многоцикловая репродукция вируса. Данные по динамике накопления вируса Марбург в культуральной жидкости при многоцикловой репродукции представлены на рис. 3. Экспоненциальная фаза, соответствующая увеличению инфекционности вируса, длится 2 суток. Следующее далее снижение скорости прироста инфекционности продолжается до 5 суток. Максимум наработки вируса отмечали на 6-7 сутки, инфекционный титр составил 7.13+0.13 БОЕ/мл. Максимальный выход вируса совпадал с началом цитодеструкции клеточного монослоя. Полученные данные позволяют определять сроки максимального выхода инфекционного вируса в культуральную жидкость, что соответствует пику инфекционной активности вируса - 7 суткам, а также оптимальное время сбора урожая вируса - 5-7 сутки.

с; 5 Ш

О

LQ СТ

03

о а

5

03

а. hs h-

Рис. 3

Восприимчивость морских свинок к заражению вирусом. Нами изучена восприимчивость морских свинок массой 200-250 и 350-400 г к штамму Уоеие вируса Марбург, адаптированному к культуре клеток. В экспериментах использовали группы морских свинок из четырех животных, а также группу контрольных животных. Животных заражали вируссодер-жащей культуральной жидкостью в дозе 2.5х 102 БОЕ подкожно и внут-

8;

1 2 3 4 5 6 7

Время инкубации (сутки)

Кривая многоцикловой репродукции вируса Марбург в клетках Vero.

рибрюшинно. На морских свинках массой 350-400 г проведено 3 серийных пассажа. На морских свинках массой 200 г проведено 7 серийных пассажей вируссодержащей культуральной жидкости при подкожном и внутрибрюшинном способах заражения.

Также изучена чувствительность морских свинок массой 200 г к заражению гепаринизированной кровью от животных, больных лихорадкой Марбург. Проведено шесть пассажей. Исследования показали, что адаптированный к культуре клеток штамм Voege вируса Марбург не вызывает заболевания у морских свинок массой 350-400 г на протяжении трех пассажей. Морские свинки не чувствительны к культуральному вирусу при подкожном и внутрибрюшинном способах заражения. Морские свинки массой 200-250 г являются восприимчивыми к вирусу. При сравнении двух способов заражения показано, что при внутрибрюшинном способе заражения животные заболевают начиная со второго пассажа, тогда как при подкожном заражении - с четвертого пассажа.

Морские свинки более восприимчивы к вирусу при внутрибрюшинном заражении, чем при подкожном. Морские свинки чувствительны к заражению гепаринизированной кровью, взятой от больных животных, при этом лихорадочное состояние развивается уже на первом пассаже.

Изменение чувствительности морских свинок к вирусу при серийных пассажах. Так как в работе мы использовали штамм вируса, адаптированный к культуре клеток, представляло интерес изучение изменения чувствительности морских свинок массой 200-250 г к заражению на протяжении семи серийных пассажей. При проведении серийных пассажей подкожным способом на протяжении трех пассажей происходила адаптация возбудителя к животным. Начиная с 4 пассажа, у животных на 7 сутки после заражения наблюдали подъем температуры тела до 39.8-40.5'С. На 5-7 пассажах животные заболевали на 4-5 сутки. При проведении серийных пассажей внутрибрюшинным способом отмечали развитие лихорадки во 2 пассаже у двух животных на 7 и 12 сутки.

На 3 пассаже на 6-7 сутки у всех животных наблюдали подъем температуры тела до 40-40.2° С. На 4 пассаже у животных появлялась лихорадка на 6 и 7 сутки, животные погибали на 8 и 9 сутки. На 5-6 пассажах инкубационный период сократился до 3 суток, гибель животных отмечалась на 6-7 сутки.

Таким образом, установлено, что на протяжении 3-4 пассажей происходит адаптация вируса и возрастает его вирулентность. С увеличением числа пассажей наблюдается сокращение инкубационного периода с 7 суток на 2-3 пассажах до 3 суток на 5-7 пассажах. Наши данные подтверждают ранее опубликованные сообщения.

Динамика антителообразования у инфицированных вирусом морских свинок. Для изучения динамики антителообразования группу морских сви-

нок из 6 особей иммунизировали вируссодержащей культуральной жидкостью в дозе 104 БОЕ на животное. Через 1.5 месяца провели реимму-низацию тем же культуральным вирусом с полным адьювантом Фрейн-да.

Через каждые 2 недели от начала иммунизации у животных производили пробные заборы крови из сердца по 1-1.5 мл. Титры специфических антител в сыворотках крови сравнивали в НМФА и клеточном ИФА. Для статистической обработки подсчитывали \о%2 средней геометрического титра (СГТ) и вычисляли средний титр. Результаты по динамике антителообразования представлены в табл. 1. Нами установлено, что уже через 2 недели после иммунизации у животных появляются специфические антитела в титрах от 1:32 до 1:1024 в НМФА и 1:3200-1:51200 в клеточном ИФА. У морских свинок, зараженных вирусом Марбург, через 16 дней после иммунизации выявляются антитела в довольно высоких тиграх в НМФА и клеточном ИФА. СГТ составила соответственно 7.00±0.68 и 12.78+0.58. Уровень антител, достигнутый при первичном иммунном ответе, удерживается в течение 2 недель, затем понижается. После реиммунизации наблюдается статистически достоверное (р<0.05) увеличение титра специфических антител, превышающее показатели после первой иммунизации. Высокие титры антител поддерживаются и даже несколько увеличиваются (33% животных) на протяжении еще 16 дней (срок наблюдения), СГТ составил в НМФА и клеточном ИФА 7.50±0.22 и 13.50+0,26.

Таблица 1. Динамика выработки антител к вирусу Марбург морскими свинками по данным НМФА и клеточного ИФА

Ыо Сроки забора крови (сутки) Ьод2 средней геоме — трической титра (СГТ), п =6 Средний титр

НМФА ИФА НМФА ИФА

1 16 7.00±0.68 12.78±0.58 1:128 1:6200

2 32 6.33±0.80 12.33±0.73 1:79 1:6000

3 46 5.50±0.34 11.43±0.44 1:56 1:3500

4 64 7.00±0.28 13.67±0.60 1:128 1:12600

5 76 7.50±0.22 ' 13.50±0.26 1:182 1:12000

Сравнительная характеристика антисывороток к вирусу Марбург при различных схемах иммунизации. Получение антисывороток включало изучение воздействия разных путей введения убитого и живого вируса Марбург на выработку специфических антител и подбор наиболее оптимальной схемы иммунизации. На основании анализа проведенных исследований по изучению динамики антителообразования у морских свинок, а также опубликованных ранее литературных данных, нами разработано 8 различных схем иммунизации вирусом Марбург (Табл. 2).

«

Таблица 2. Активность антисывороток морских свинок к

вирусу Марбург при различных схемах иммунизации

Номер схемы иммунизации Количество антисывороток с титрами антител в НМФА Всего сывороток (п) сгт Средний титр

1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024

1 3 5 4 2 0 0 14 6.36±0.27 1:72

2 0 2 5 0 1 2 10 7.60±0.48 1:194

3 0 2 4 4 5 0 15 7.80±0.28 1:223

4 0 1 4 . 4 6 0 15 8.02=4=0.26 1:256

5 0 1 1 8 3 2 15 8.27±0.27 1:315

6 0 7 2 1 0 0 10 6.40±0.22 1:84

7 0 1 2 6 2 2 13 8.15±0.32 1:294

8 0 0 4 8 0 0 12 7.67±0.14 1:194

Иммунизацию проводили вируссодержащей культуральной жидкостью. На каждую схему брали 12-15 животных. Забор крови производили через 10-12 дней после реиммунизации из сердца под эфирным наркозом. Титры специфических антител в сыворотках иммунизированных животных определяли в НМФА. Таким образом, для получения антисывороток к вирусу Марбург нами разработаны 8 схем иммунизации морских свинок. Установлено, что при иммунизации морских свинок вирусом Марбург у животных вырабатываются специфические антитела к вирусу с титром от 1:32 и выше. У отдельных животных наблюдается высокий титр антител через 2 недели после иммунизации. При двукратной иммунизации с интервалом 6 недель антисыворотки имеют титры не выше 1:128-1:256.

Из испытанных схем иммунизации можно выделить три: 5, 7 и 4. Антисыворотки, полученные при этих схемах имеют СГТ соответственно 8.27±0.27; 8.1510.32; 8.02±0.26. Эти показатели достоверно превыша-

ют (р<0.05) показатели других схем. Подобраны наиболее эффективные схемы. Оптимальные варианты иммунизации включают иммунизацию живым вирусом в дозе 104 БОЕ на животное как с полным адьювантом Фрейнда, так и без него и реиммунизацию через 3-4 недели тем же вирусом. Применение данных схем иммунизации позволяет получать высокоактивные специфические иммунные сыворотки к вирусу Марбург с титром в НМФА 1:1024. На слайд-антигенах, приготовленных из суспензии клеток Vero, инфицированных вирусом Марбург (CDC № 805600) они вызывали характерное яркое цитоплазматическое свечение. Антисыворотки не взаимодействуют с антигеном гетерологичного вируса -Эбола.

Применение серологических методов для лабораторной диагностики лихорадки Марбург. Отработка и оптимизация метода флюоресцирующих антител. По опубликованным данным НМФА остается основным методом серологической диагностики геморрагической лихорадки Марбург. В процессе работы над методом нами подобраны оптимальные условия для репродукции вируса в культуре клеток, позволяющие подобрать стандартные условия приготовления слайд-антигенов. В дальнейших исследованиях нами изучена возможность применения других клеточных линий - Vero Е-6 и BGM. Показано, что сроки репродукции вируса и этих линиях клеток соответствуют по времени с репродукцией в клетках Vero, и эти клетки можно использовать при приготовлении слайд-антигенов. МФА отработан нами и на инфицированных клеточных монослоях, выращенных на покровных стеклах, модифицирован в упрощенном варианте метод приготовления слайд-антигенов из суспензии клеток, выращенных в лунках 96, 24-луночных планшетов.

Изучение динамики экспрессии вирусспецифических антигенов вируса Марбург в культуре клеток. Нами впервые получены данные по динамике репродукции вирусспецифических антигенов в клетках Vero, зараженных с высокой множественностью инфекции - 10 БОЕ/кл. Установ-пено, что в клетках, зараженных с высокой множественностью, наблюдаются точечные очаги свечения через 6 часов. Через 24 часа выявляются светящиеся гранулы, которые сливаются в крупные конгломераты через 30-34 часа. Через 48-54 часа наблюдается деструкция клеток и свечение клеточного детрита. При анализе связи между накоплением инфекционного вируса в культуральной жидкости и репродукцией вирусспецифических антигенов в клетках, установлено, что при заражении клеток Vero юзой 10 БОЕ/кл, инфекционный вирус с максимальным титром обна-эуживается через 48 часов. В эти же сроки в клетках наблюдается точечное свечение, а через 48 часов цитодеструкция клеток.

Разработка и оптимизация метода клеточного иммуноферментного анализа. Нами разработан клеточный ИФА, не требующий получения

»

51200

m

О <

o.q 25600 s s:

£ 2 12800 ¡g

о 6400 « a

" 5 3200 9 ш

E § 1600 ce t=

vd £ 800 O ra

16 32 64 128 256 512 1024 Обратные значения титров антител в НМФА

Рис. 4 Сравнение титров антител к вирусу Марбург в клеточном ИФА и НМФА

очищенного антигена вируса. Клетки Vero выращивали в лунках 96-лу-ночных планшетов "Linbro" до образования сплошного монослоя. Клетки заражали вирусом в дозе 0.01 БОЕ/кл. Через 72 часа клетки фиксировали смесью ацетона и этанола. Планшеты с фиксированными клетками высушивали при комнатной температуре и хранили при температуре минус 20° С. Далее постановку клеточного ИФА осуществляли по общепринятой методике непрямого ТФ ИФА. Клеточный ИФА применили для выявления антител к вирусу Марбург в антисыворотках морских свинок, параллельно сыворотки исследовали и в НМФА. Результаты исследования 48 антисывороток представлены на рис. 4. Клеточный ИФА выявляет специфические антитела в титре 1:51200, он чувствительнее НМФА в 50-100 раз. При анализе результатов, полученных этими методами, наблюдалась корреляция (г=0.48). Клеточный ИФА специфичен - антитела к вирусу Марбург не взаимодействуют с антигеном вируса Эбола.

Контроль на специфическую безопасность инактивированного инфекционного материала. Для выноса на чистую зону лаборатории инфекционного материала, прошедшего термоинактивацию, необходимо осуществить проверку на специфическую безопасность (полноту инактивации). Ввиду отсутствия инструктивно-методических указаний, нами разработан метод контроля на специфическую безопасность in vivo и in vitro. В

х х

X X X

XXX XXX XXX

X X XXX X X

X X X X X X

х-х

X

«

основу разработки контроля in vitro легло ранее опубликованное сообщение Van der Groen G. (1982).

Контроль на специфическую безопасность in vivo проводили на морских свинках путем трех слепых пассажей исследуемого материала. Материал считали прошедшим контроль, если все опытные животные остались живы в период наблюдения и ни у одного не выявлены признаки заболевания. Контроль предназначен для вариантов вируса, патогенного для морских свинок.

Контроль на специфическую безопасность in vitro проводили на культуре клеток Vero путем трех слепых пассажей исследуемого материала с последующим исследованием клеток на наличие антигенов вируса с иммунной сывороткой к вирусу Марбург в НМФА. Используя методы контроля на специфическую безопасность инфекционного материала, прошедшего термоинактивацию, можно судить о полноте инактивации инфекционного вируса.

Схема лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург. Ввиду отсутствия документов, регламентирующих лабораторную диагностику геморрагической лихорадки Марбург, нами предлагается схема изоляции и типирования вируса Марбург, основанная на параллельном использовании биопробных животных и клеточных культур в комплексе с НМФА. Данная схема была отработана в условиях лаборатории и испытан на практике при анализе материала от больной М. из г. Корсаков с диагнозом "геморрагическая лихорадка Марбург" в 1992г.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирована методика определения инфекционной активности вируса Марбург методом бляшек. Показана гетерогенность лабораторных популяций вируса Марбург по морфологии бляшек. Получен клонированный вариант вируса, обладающий более высокой репродуктивной способностью in vitro, чем исходный штамм.

2. Изучена динамика репродукции штамма Voege вируса Марбург в культуре клеток Vero. При низкой множественности заражения максимальное накопление вируса в культуральной жидкости наблюдали на 7 сутки, инфекционный титр составил 7.13±0.13 lg БОЕ/мл. При высокой множественности заражения максимальный выход инфекционного вируса наблюдали через 48-72 часа, титр составил 7.54±0.11 lg БОЕ/мл.

3. Изучена чувствительность морских свинок различного возраста к заражению вирусом Марбург (штамм Voege). Наиболее чувствительны к вирусу морские свинки массой 200 г. Показано, что при серийных пассажах возрастает вирулентность вируса при сокращении инкубационного периода.

4. Впервые изучена динамика экспрессии специфических антигенов штамма Voege вируса Марбург в клетках Vero методом флюоресцирующих антител. Полученные данные послужили основанием для оптимизации непрямого метода флюоресцирующих антител, позволяющего производить диагностику в течение 6 часов и оценивать специфичность выявляемого свечения

5. Изучена динамика образования специфических антител у морских свинок, иммунизированных вирусом Марбург штамм (Voege). Получены специфические антисыворотки морских свинок с титром антител 1:1024 в НМФА и 1:51200 в клеточном ИФА.

6. Впервые разработан метод клеточного ИФА для определения специфических антител к вирусу Марбург.

7. В результате проведенных исследований предложена схема лабораторной диагностики геморрагической лихорадки Марбург.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Титенко A.M., Борисова Т.И., Андаев Е.И., Новожилов С. С., Куликова Е.В. Культивирование вируса Марбург в кленах Vero; Иркут. ин-т. - Иркутск, 1992. - 13 с. - ДЕП. в ВИНИТИ 08.06.92, № 1857-В92.

2. Андаев Е.И., Куликова Е.В., Новожилов С. С., Борисова Т.Н., Ишбаева Р.И., Титенко A.M. Получение и характеристика иммунных сывороток к вирусам Марбург и Эбола; Иркут. н-и противочум. ин-т. -Иркутск, 1992. - 12 с. - ДЕП. в ВИНИТИ 22.05.92, № 1697-В92.

3. Титенко А.М., Андаев Е.И., Борисова Т.Н., Новожилов С.С., Куликова Е.В. Клеточный иммуноферментный метод анализа специфических антител к вирусам Марбург И Эбола; Иркут. н-и противочум. ин-т. -Иркутск, 1992,- 10 с. - ДЕП. в ВИНИТИ 22.05.92, № 1698-В92.

4. Титенко A.M., Новожилов С.С., Андаев Е.И., Борисова Т.Н. Ишбаева Р.И., Куликова Е.В., Кононенко Е.В. Вирулентность филовирусов (Марбург и Эбола) в эксперименте и лабораторная диагностика этих инфекций// Генет. и биохимия вирулент. возбуд. особо опас. инфекций: Матер. Рос. науч. конф.: Тез. докл. - Волгоград, 1992. - С. 169170.

5. Новожилов С. С., Андаев Е.И., Борисова Т.И., Ишбаева Р.И., Титенко A.M. Стандартизация метода бляшкообразования для титрования ин-

«

фекционности вирусов Марбург и Эбола// Сб. науч. работ, поев. 70 летию образ, санэпидслужбы Ирк. обл.: Тез. докл. - Иркутск, 1993. -

6. Андаев Е.И., Новожилов С.С., Титенко A.M., Борисова Т.Н., Куликова Е.В., Ишбаева Р.И. Динамика антителообразования у морских свинок, инфицированных вирусами Марбург и Эбола// Сб. науч. работ, поев. 70 летию образ, санэпидслужбы Ирк. обл.: Тез. докл. -Иркутск, 1993. - С. 77-78.

7. Титенко A.M., Андаев Е.И., Новожилов С. С., Борисова Т.Н., Куликова Е.В., Ишбаева Р.И. Лабораторная диагностика инфекций, вызываемых вирусами Марбург и Эбола// Сб. науч. работ, поев. 70 летию образ, санэпидслужбы Ирк, обл.: Тез. докл. - Иркутск, 1993. - С. 7879.

8. Куликова Е.В., Андаев Е.И., Борисова Т.Н., Титенко A.M. Чувствительность морских свинок к вирусам Эбола и Марбург// Акт. проблемы проф. особо опас. природ, очаг, инфекц. болезней: Тез. докл. - Иркутск, 1994. - С. 85-86.

С. 75-77.

Заказ № 434, тираж 100 экз. Типография издательства ИНИКОМП.