Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование генетических особенностей вируса крымской-конго геморрагической лихорадки, циркулирующего на Юге России

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Исследование генетических особенностей вируса крымской-конго геморрагической лихорадки, циркулирующего на Юге России"

На правах рукописи

ПЕТРОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ, * ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО НА ЮГЕ РОССЙИ

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Научный руководитель: к.б.н. Петров Владимир Семенович

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор Покровский Андрей Георгиевич

к.б.н. Беклемишев Александр Борисович

Ведущая организация: >

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ (Москва)

Защита состоится «26» сентября 2003 года в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: ГН1Д ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан « ЛС » августа 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

2.007 172¿6

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка - острое вирусное природно-очаговое заболевание человека с высокой степенью (10-50%) летальности. Географическое распространение вируса довольно широкое. Число стран в Европе, Азии и Африке, где выявлена циркуляция возбудителя ККГЛ, достигает четырех десятков.

Вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки относится к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae. Геном вируса ККГЛ представлен тремя фрагментами одноцепочечной, кольцевой (за счет наличия комплементарных концов, связанных водородными связями) РНК отрицательной полярности. Фрагменты генома вируса ККГЛ имеют размеры около 12200 (L-сегмент), 5360 (М-сегмент), и 1670 нуклеотидов (S-сегмент), и кодируют соответственно транскриптазу, белок предшественник оболочечных гликопротеинов G1 и G2 и нуклеокапсидный белок N. В молекулярно-биологическом плане вирус ККГЛ ещё недостаточно исследован. Нуклеотидная последовательность всего генома пока не определена, но для ряда штаммов, изолированных в Китае, Греции, Нигерии, Пакистане, Уганде, Косово и Сенегале известны полные или частичные последовательности М- и S-сегментов генома.

Активизация очагов ККГЛ, начавшаяся в 1999 г. на территории юга России, требует с одной стороны выяснения причин данной ситуации, с другой стороны -выявления ведущих генотипов вируса.

Данные по строению части генома вируса ККГЛ (S-сегмент РНК), циркулирующего в России, были получены только для одного штамма Drozdov, выделенного в 1967 году в Астраханской области. До начала исследования структура среднего сегмента этого и других российских вирусов не были известны.

Широкое географическое распространение и высокая опасность заболевания ККГЛ для человека делают изучение природных популяций вируса актуальным в плане получения новых данных по генетической вариабельности циркулирующего на юге России вируса, изучения путей эволюции вируса ККГЛ и усовершенствования методов лабораторной диагностики.

Цель и задачи исследования. Целями настоящего исследования являлись во-первых, генетическая характеризация полевых и клинических образцов, выделенных от клещей Hyalomma marginatum, выживших и умерших больных ККГЛ из Ставропольского края, Ростовской, Волгоградской и Астраханской областей России, коллекционных штаммов вируса ККГЛ, во-вторых, - разработка метода индикации РНК вируса для ранней диагностики ККГЛ на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

В задачи работы входило:

сбор и иммунохимическая характеризация образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, от больных и различных видов клещей;

дизайн праймеров и индикация РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР);

определение нуклеотидных последовательностей фрагментов S- и М-сегментов генома полевых образцов и коллекционных штаммов вируса ККГЛ;

сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с опубликованными и установление филогенетических взаимоотношений между штаммами вируса ККГЛ, циркулирующего в различных регионах мира.

Научная новизна работы.

Впервые исследована генетическая вариабельность вируса ККГЛ, циркулирующего на территории южных регионов России, на основании изучения частичных нуклеотидных последовательностей S- и М- сегментов генома.

Определена полная нуклеотидная последовательность S-сегмента трех коллекционных штаммов вируса ККГЛ: LEIV 29223 Ст. от больного ККГЛ из Ставропольского края (структура зарегистрирована в GenBank как STV/HU29223), LEIV 28044 Рос. от клеща H.marginatum из Ростовской области (структура зарегистрирована как RC)S/TI28044)h LEIV 10145 Уз. от клеща Н. asiaticum из Узбекистана (структура зарегистрирована как UZBEK/TI10145).

' Впервые показано, что. на территории России циркулируют генетически близкие варианты вируса ККГЛ, существенно отличающиеся по нуклеотидной последовательности S- и М- сегментов генома от штаммов из других регионов мира.

На основании данных по генетической вариабельности вируса ККГЛ, циркулирующего в южных регионах России, создан набор праймеров для диагностической ПЦР-системы для индикации вируса ККГЛ в клинических образцах.

Практическая ценность.

На основе созданного нами набора праймеров и отработанных условий индикации РНК вируса с помощью ОТ-ПЦР выпущена экспериментальная серия диагностических наборов для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах. Полученна заявка на изобретение № 2001 123408/13, "Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса ККГЛ" приоритет от 20.08.01, решение о выдаче патента от 11.02.2003.

По результатам работы в базе данных GenBank зарегистрированы 52 нуклеотидные последовательности.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 5 опубликованных статей и были представлены на следующих международных конференциях: Европейское Совещание по вирусным зоонозач, Сан Рафаэль, Франция, 2001 г.; 10-я Международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы», 2002 ., Санкт-Петербург; ХН-ый Международный конгресс Вирусологии, Париж, Франция 2002 г.; Совместная программа научных исследований в области биозащиты, Серпухов, 2002 г.; Конгресс по РНК-негативным вирусам, Пиза, Италия, 2003г.

Структура н объём работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, введения, выводов и списка литературы (Г22 ссылки), содержит 12 рисунков и 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал для исследования и основные методы. В работе использовали четыре коллекционных штамма вируса ККГЛ из музея Института вирусологии имени Д.И.Ивановского, РАМН, Москва и полевой и клинический материал, собранный на юге России.

Сбор клещей осуществляли в течение 2000-го года в Волгоградской, Астраханской, Ростовской областях и Ставропольском крае. Пробы от больных и умерших с диагнозом ККГЛ были получены во время локальных вспышек заболевания в южных регионах России в 2000-2001 годах (Волгоградская и Ростовская области, Ставропольский край). В данной работе было проанализировано 180 сывороток крови, 17 образцов клинического материала от 6 погибших и более 7000 клещей.

Для выявления антигена вируса ККГЛ в полевом и клиническом материале использовали иммуноферментную тест-систему (вариант прямого сэндвича) производства лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН. Для выявления специфических IgM-антител использовали вариант ловушки М антител MAC-ELISA. Для выявления IgG-антител в сыворотках крови больных - иммуноферментную тест-систему, вариант непрямого сэндвича. Все антигенположительные образцы были проанализированы методом биопробы на мышах-сосунках или культуре клеток SW-13 и, частично, с помощью ОТ-ПЦР.

Происхождение ККГЛ вируссодержащего материала, использованного в данном исследовании, приведено ниже.

Коллекционные штаммы: LEIV 10145 Уз.- Н. asiaticum, Узбекистан , 1985 г.; LEIV 8966 Тад,- больной ККГЛ, Таджикистан, 1990 г.; LEIV 29223 Ст.- больной ККГЛ, Ставропольский край, 2000 г.; LE1V 28044 Рос,- H.marginatum, Ростовская область, 2000 г.

Полевой и клинический материал (выделен в 2000 году). Ставропольский край (STV): T1279Ó0, TI28985, HU29223, HU29219, HU29209; Астраханская область (ASTR): TI28832. TI28870; Волгоградская область (VLG): TI29414, TI29453, TI29323, HU29175, HU29176, *HU29662. *HU29664, Ростовская область (ROS): TI28017, TI28019, TI28044, *HU29901. (В обозначении полевого и клинического материала: TI - клещ H.marginatum; HU - больной; * - выделен в 2001-м году; жирным шрифтом выделены образцы, из которых не удалось изолировать вирус; подчеркнуты клинические образцы от погибших больных).

Для проведения ОТ-ПЦР использовался в основном исходный полевой и клинический материал. При определении полной структуры S сегмента геномной РНК использовали первый пассаж вируса на культуре клеток SW-13.

Для образцов применяли как однораундовую ПЦР, так и двураундовую. Расчет праймеров и подбор условий амплификации проводился при помощи компьютерной программы OLIGO. Очищенные ПЦР-продукты и клонированные последовательности (в случае полных структур S-сегмента генома) секвенировали на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Нуклеотидная последовательность всех фрагментов была определена по обеим цепям.

Нуклеотидные последовательности фрагментов S- и М-сегментов генома вируса ККГЛ, определенные в настоящей работе, сравнивали при помощи компьютерных программ CLUSTALW и Salix с соответствующими последовательностями других штаммов вируса ККГЛ, полученными из базы данных GenBank. При построении филогенетических деревьев сравнение последовательностей осуществляли при помощи программы MEGA методом объединения соседних последовательностей. Использовали алгоритм Kimura, основанный на оценке частот встречаемости различных нуклеотидов в анализируемых последовательностях и различиях в скоростях транзиций и трансверсий. Вычисления проводили для 1 ООО итераций.

Структура генома вируса ККГЛ.

Все полученные в работе нуклеотидные последовательности участков генома вируса ККГЛ мы сравнивали с соответствующими структурами вирусов из других регионов мира. Результаты сравнения в диссертации представлены в виде: 1) таблиц попарного сравнения вирусов по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям, 2) множественных выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, 3) филогенетических деревьев, построенных по нуклеотидным последовательностям участков генома. Для сравнения брались все известные нуклеотидные и аминокислотные последовательности.

Структура S-сегмента генома вируса ККГЛ.

Для исследования были выбраны 2 участка S-сегмента: I - 310-529, II - 8251290. Праймеры и условия ПЦР для I участка были опубликованы ранее. Для участка II был осуществлен дизайн праймеров (PS), которые фланкироровали консервативный участок гена нуклеокапсидного белка (N белка), не образующий выраженных вторичных структур.

Сравнение вновь полученных нами структур по нуклеотидной последовательности I участка показало, что различия не превышают 2.3%, а аминокислотные последовательности - идентичны. Было отмечено деление вирусов на 2 подгруппы: первая - «Волгоград-Ростов» (ROS/TI28Ü44, ROS/TI28017, VLG/TI29323, VLG/HU29176, STV/HU29209), вторая - «Астрахань-Ставрополь» (STV/HU29223, STV/TI27960, ASTIVTI28832, ASTR/TI28870). Различия по нуклеотидным последовательностям внутри подгрупп составляли 00.5% и 0-1.5% соответственно, между подгруппами - 1.4 - 2.3%. Далее в процентах приведено сравнение анализируемых образцов с другими штаммами по нуклеотидным / аминокислотным последовательностям: Drosdov (Россия) - 2.33.2 / 1.3; 9553/01 (Косово) - 1.8-2.7 / 0; АР92 (Греция) - 18.8-20.5 / 12.3; 10200 (Нигерия) - 17.1-18.1 / 6.8; JD206 (Пакистан) - 11.2-13.2 / 6.8; HU2015 (Казахстан) - 12.2-13.6 / 8.2; UG3010 (Уганда) - 14.1-16.9 / 5.5; 79121 (Китай)-9.1-11.4 /12.3; DAK8194 (Сенегал) - 13.1-13.8 / 6.8; HU8966 (Таджикистан) - 10.8-12.3 / 6.8; TI 10145 (Узбекистан) - 9.7-10.7 / 8.2. Приведенные данные демонстрируют, что популяция циркулирующего в настоящее время на юге России вируса ККГЛ близка штамму Drosdov, выделенному в Астраханской области в 1967 году.

На филогенетическом дереве (рисунок 1), построенном по нуклеотидной последовательности этого участка S-сегмента, российские вир\сы формируют

Т129323-Волгоград Т128017-РОСГОВ Н1й9176-Волгоград НИ29209-Ставрополь

Т128044-РОСГОВ

Т127960-Ставрополь —> Н1'29223-Стэврополь I I Т128832-Астрахань | ' Т128870-Аетрахань _} 19553/2001-Косово 96 9717/01-Косово

— Ого5<1оу-Астрахань ___'

_3010-Уганда

96 | НУ13-Китай

72 А С68031-Китай 18402-Китай

- 66019-Китай

-ТП0145-Узбе»1сган

-79121-Китай

Н18966-Тэджикист

г- ¿шу-гч,

- 2015-Ю

95 ||

I Т101П

2019-Казахстан Казахстан

[-Казахстан " Н119447547-ОАЭ

- АРМС951-Мадагаскар Т19538889-ОАЭ Т19538886-ОАЭ

JD206-Пaкиcтaн Ни9509853-ОАЭ

е9 , 1ЬАг10200-Нигерия "

89 "

Г-

1-АгйКП.

~ Ни9509854-ОАЭ - АгВ604

- ЯБА-ЮАР

_ Аг057268-Сенегал

99 Аг039554-Мавритан1*я _АШ15786-Сенегал -

АР08194-Сенегал

ОАК8194-Сенегал Н049199-Мааритания

ч

- АР92-Греция

^ТЕН193-3-Иран

- ОидЬе

Филогенетическое дерево, построенное по фрагменту (310-529) Б-сегмента вируса ККГЛ. Рисунок 1

отдельную генетическую группу вместе с вирусами из Косова. Остальные вирусы из других регионов делятся на 6 генетических групп, причем греческий штамм (АР92) формирует отдельную группу.

Аналогичные исследования, проведенные по II участку малого сегмента генома вируса ККГЛ, показали, что этот участок более консервативен, процент идентичности структур выше. Исследуемые нами вирусные образцы из европейской части России отличаются друг от друга по нуклеотидным последовательностям на 0-1.5% и на 0-1.2% - по аминокислотным. Их можно подразделить на 2 подгруппы: 1 подгруппа «Волгоград-Ростов»-Т128044, TI28017, TI29323, HU29176; 2 подгруппа «Астрахань-Ставрополь»:-НЩ9223, TI27960, TI28832, TI28870. Различия по нуклеотидным последовательностям внутри групп: 1 - 0-1.1%, 2 - 0.6-0.9%; между 1 и 2: 1.3 - 2.2%.

Отличие исследуемых нами вирусов по нуклеотидной последовательности РНК от таковой вирусов из других регионов мира варьирует от 9.7 до 16.5%, а по выведенной аминокислотной последовательности - от 3.2 до 5.8%.

Проведенное выравнивание аминокислотных последовательностей (258-412 ак N белка), кодируемых II участком малого сегмента, показало, что 4 вирусных материала ROS/TI28017, STV/HU29223, ASHVTI28832, ASTR/TI28870, выделенных из разных источников и в разных областях, идентичны штамму Drosdov. Кроме этого, два образца от клеща и больного из Волгоградской области (VLG/TI29323 и VLG/HU29176) имеют одинаковую и аминокислотную и нуклеотидную последовательность данного участка. В позиции 70 аминокислотного выравнивания у российских вирусов находится уникальная аминокислота изолейцин, у всех остальных штаммов - валин. Установленный аминокислотный фрагмент (riymhpavltagrisemgvcfg) в 22 аминокислоты является общим для всех вирусов ККГЛ, зарегистрированных в базе данных GenBank.

Построенное по структурам II участка малого сегмента генома вируса ККГЛ филогенетическое дерево приведено ниже на рисунке 2.

На этом и последующих деревьях жирным шрифтом выделены вирусы, структура которых определена в данной работе.

На филогенетическом дереве вирусы из южных регионов России образуют отдельную генетическую группу. На этом дереве штамм из Греции объединяется в одну генетическую группу со штаммом из Сенегала. В остальном филогенетические деревья, построенные по 2-м участкам S-сегмента одинаково отражают филогенетические отношения. Всего формируется 7 генетических групп, одна из которых - группа российских вирусов.

Для определения полной нуклеотидной последовательности S-сегмента нами были выбраны 2 вирусных штамма (ROS/TI28044 и STV/HU29223), изолированных на юге России в 2000 году во время последней вспышки заболевания ККГЛ и относящиеся к разным подгруппам, и для сравнения коллекционный штамм UZBEK/TI10145 из Узбекистана (здесь и далее названия штаммов приведены такие, как в GenBank при регистрации нуклеотидных последовательностей).

Установленная длина S-сегмента составила 1674 нуклеотида для штаммов STV/HU29223 и ROS/TI28Q44 и 1672 нуклеотида для штамма UZBEK/TI10145. Как

78

49

С68031-Китай — 7803-Китай НУ13-Китай 75024-Китай

-8402-Китай

-66019-Китай

100

Т110145-Узбекистан — Ни8966-Таджикистан" г— 2015-Казахстан «1-2019-Казахстан —

79121-Китай"

юо Ь 7001-Китай

_I— ^206-Пакистан

• Майп-Пакистан I

100 I

93

63

100

— Т127960-Ставрополь Н1)29223-Ставрополь *пТ128832-Астрахань I Т128870-Астражань г Оговёоу-Астрахань Т128017-Ростов ~ Ни29176-Ростов Т129323-Ростов Т128044-Ростов

10200-Нигерия - 8Р1)415/85-ЮАР.

-ОАК8194-Сенег.

-АР92-Греция

-1Ю3010-Уганда

"Л

69

У

Филогенетическое дерево по участк\ II Б-сегчента генома вир\са ККГЛ.

Рисунок 2

и для большинства известных штаммов, инициирующий кодон (метионин) находится в позиции 56-58, протяженность рамки трансляции (нуклеокапсидный белок) - 482 аминокислотных остатка. Различия в длине Б-сегмента по сравнению с другими штаммами (1640-1686) касаются 5'- и З'-некодирующих областей. Отличия в нуклеотидной последовательности Б-сегмента генома разных штаммов вируса ККГЛ более выражены, нежели в предсказанной аминокислотной последовательности кодируемого им нуклеокапсидного белка.

Проведенное сравнение полученных нами структур малого сегмента генома вируса ККГЛ, циркулирующего в настоящее время на юге России, с выделенным

ранее на этой же территории штаммом вируса Drosdov и штаммами из других регионов мира, показало, что генетически штаммы STV/HU29223 и ROS/TI28044 наиболее близки к российскому же штамму Drosdov. Нуклеотидные отличия между ними не превышают 4.7% по полной структуре. Различия в структуре N белка не превышают 0.8%. При сравнении со штаммом Drosdov для штамма STV/HU29223 отмечены замены аминокислот в положениях 23, 111 и 187: глютаминовой кислоты на глицин, треонина на аланин, пролина на лейцин соответственно. Штамм ROS/TI28044 имеет 2 аналогичные замены в положениях 23 и 111, а также в позиции 223 - серин на пролин и в позиции 278 - треонин на аланин. Последние две замены отличают штамм ROS/TI28044 и от штамма STV/HU29223. Между собой исследуемые штаммы отличаются по 3 аминокислотам. Все три российских штамма имеют 4 уникальные аминокислоты в положениях 27 (метионин), 100 (серин), 109 (аспарагин), 327 (изолейцин). У всех остальных вирусов в этих положениях находятся валин, аланин, серин и валин соответственно.

Группа российских вирусов отличается от вирусов ККГЛ из других регионов мира как по нуклеотидной последовательности S-сегмента (10.0-19.9%), так и по структуре нуклеокапсидного белка (3.5-8.3%).

Также было построено филогенетическое дерево по полным структурам S-сегмента генома вируса ККГЛ (рисунок 3).

Штаммы вируса из России образуют отдельную генетическую группу, причем клещевой штамм из Ростова (ROS/T128044) кластеризуется вместе со штаммом Drosdov. Индекс поддержки такого объединения - 78.

Вирусы из других регионов образуют еще 5 генетических групп, вирус из Уганды образует отдельную ветвь на дереве.

Таким образом, приведенные в этой работе данные по структуре S-сегмента исследуемых образцов вируса ККГЛ, циркулирующего на юге России на ограниченной территории между Волгой и Доном, позволяют утверждать, что это - близкородственные варианты вируса ККГЛ. Генетически эти вирусы близки штамму Drosdov, выделенному в России на этой же территории ранее, и изолятам вируса из Косова (GenBank AF428144-AF42S145).

Необходимо отметить, что данные, приведенные в двух филограммах. составленных как по частичным (II участок), так и полным последовательностям консервативного малого сегмента РНК, свидетельств) ют, что штамм Drosdov наиболее генетически близок вирусам, циркулирующим в настоящее время на территории Ростовской и Волгоградской областей, а не вирусам Астраханско -Ставропольской группы. С учетом того обстоятельства, что штамм Drosdov был выделен 35 лет назад в Астраханской области, можно предположить, что за прошедшее время произошло проникновение вируса с юга (Астрахань -Ставрополь) на более северные территории (Ростов - Волгоград), либо штамм Drosdov являлся нехарактерным для данной территории.

Интересен тот факт, что на удаленных друг от друга более чем на 2 тысячи километров территориях (юг России и Косово) циркулируют генетически близкие варианты вируса ККГЛ. Это позволяет нам предполагать, что родственные вирусы ККГЛ могут быть обнаружены на территории Украины,

К

100

8402-Китай 88166-Китай - 7803-Китай 1 75024-Китай г НУ13-Китай '•С68031 -Китай

]

С

]

юо

— 66019-Китай Т110145 -Узбекистан

г 7001-Китай 79121-Китай и0206-Пакистан МАТ1Ы-Пакистан

5ТУ/Ни29223-Россия г Р08/Т128044-Россия ОРЮЗОСЛЛРоссия 5Ри415/85-ЮАР " 10200-Нигерия J 3010-Уганда I] " АР92-Греция

"ТооЬ—Г I 7в1_ г

}

0АК8194-Сенегал

Рисунок 3

Филогенетическое дерево по Структ\ре 5-сегмента генома вируса ККГЛ.

Молдавии и Болгарии, являющихся ареалом распространения клещей Н.тагатаШт. Данные по структуре циркулирующих на упомянутых территориях вирусов отсутствуют, а они могли бы прояснить ситуацию о путях формирования инфекционного очага и на юге России и в Косово.

Структура М-сегмента генома вируса ККГЛ.

Учитывая то обстоятельство, что малый сегмент РНК вируса ККГЛ является консервативным, и изменения в структуре данного сегмента не столь значительны как в вариабельном среднем сегменте, кодирующем оболочечные гликопротеины вируса ККГЛ, мы поставили себе цель изучить эволюционные взаимоотношения вирусов на основе изучения частичных нуклеотидных структур среднего сегмента. Изучение структуры М-сегмента представляло интерес и в силу того, что для российских вирусов данные по структуре этой части генома до настоящего исследования не были известны. Для этого мы осуществили дизайн праймеров, фланкирующих вариабельные участки на 5'- (77-387) и 3'- (46415072) концевых областях среднего сегмента и относительно консервативный участок (2607-2929) в центре М-сегмента.

Для исследования структуры среднего участка М-сегмента генома было взято 5 клещевых образцов, 5 клинических материалов от погибших, 1 образец от выжившего больного и 2 коллекционных штамма: TAJ/HU8966, UZBEK/TI10145. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей среднего участка (2606-2932 н. и 845-950 ак) М-сегмента исследуемых вирусов из южных регионов России показал, что эти вирусные образцы различаются по нуклеотидным последовательностям на 0.6-4.7%, по аминокислотным - на 0-2.8%. Приведенные величины больше аналогичных для исследованных участков S-сегмента, особенно это касается аминокислотных различий. Четыре вируса: VLG/HU29176, '

VLG/HU29664, ROS/TI28017, ROS/TI28019 имеют идентичную аминокислотную последовательность указанного участка, а также 2 пары вирусов: VLG/HU29662 и VLG/TI29323, STV/TI27960 и STV/HU29219 также не отличаются по последовательности аминокислот. От штамма HU8966 из Таджикистана российские вирусы отличаются по нуклеотидной последовательности на 14.418.1% и по аминокислотной - на 14.0-15.9%. Сравнение вирусов из южных регионов России с узбекским штаммом вируса TI10145 показало значительное различие: 27.5-28.4% по нуклеотидной последовательности и 26.2-28.0% - по аминокислотной. Различия нуклеотидных последовательностей российских вирусов и штаммов из других регионов следующие: 21.6-24.7% с нигерийским JbArl0200, 16.3-19.1% с пакистанским Matin, 15.9-27.7% с китайскими, а различия в последовательности аминокислот с этими же вирусами - 14.0-16.8%, 12.1-14.0% и 9.3-29.0%, соответственно. Максимальное отличие от вирусов из Китая приходится на штамм 79121. Этот штамм выделен из длинноухого тушканчика. Генетически вирус ККГЛ 79121 близок выделенному от больного в Китае штамму 7001: 1.0% различий в аминокислотных последовательностях и 0.3% - в нуклеотидных. От других, выделенных в Китае вирусов ККГЛ, штамм 79121 отличается значительно: 26.7-33.4% по нуклеотидной и 16.8-34.6% по ,

аминокислотной последовательностям. Приведенные цифры значительно выше таковых для S-сегмента, и нуклеотидные замены чаще приводят к замене аминокислот. \

Филогенетическое дерево, построенное на основе попарного сравнения нуклеотидных последовательностей 2607-2929 участка М-сегмента (рисунок 4), показало, что российские вирусы формируют отдельную ветвь на филогенетическом дереве (индекс поддержки 100).

Причем происходит достоверное деление на две отдельные подгруппы, в состав которых входят образцы вируса ККГЛ из Ростовской и Волгоградской областей, с одной стороны, и из Ставропольского края - с другой. Уровни поддержки этого деления - 87 и 99, соответственно. Подобное деление российских вирусов на 2 подгруппы было показано нами и при анализе структур участков и полных S-сегментов генома вируса ККГЛ.

Также отдельную ветвь (уровень поддержки 100) на дереве образуют два китайских штамма (79121 и 7001) и коллекционный штамм из Узбекистана TI10145, структура которого получена нами. Внутри этой группы различия по нуклеотидным и аминокислотным последовательностям достигают 21.6% и

и

100

|Ни29176-Волгоград -s ни29664-Волгоп>ад - Т128017-Волгофад • TI28019-POCTOB TI28044-POCTOB

у

t

Г TI29323-Волгоград

Ни29662-Волгоград . HU29175-Волгоград

99

99

79

Ï

HU29901-Ростов Т127960-Ставрополь HU29219-Ставрополь 100

67

'5024-Китай

L 7603-Кктай Н118966-Таджикистан

- 10200-Нигерия

- 66019-Китай

- Matin-Пакист

99

100

18402-Китай I— 88166-Китай

~ Т110145-Узбекистан - 79121-Китай

100

100

I 7001-Китай

0 0S PIICVHOK4

Филогенетическое дерево по среднему участку М-сегмента генома вируса ККГЛ.

22.7%, соответственно. Третью генетическую группу формируют 2 вирусных штамма из Китая (7803 и 75024) и вирусы из Нигерии и Таджикистана. Рахтичия между представителями этой группы по нуклеотидной и аминокислотной структурам достигают 13%. Еще одну, четвертую группу, образуют китайские штаммы S402 и 88166 и пакистанский вирус Matin (индекс поддержки 98). Отличия по нуклеотидной последовательности и последовательности аминокислот внутри этой группы достигают 8% и 6.5%, соответственно. Две упомянутые выше генетические группы вирусов вместе с китайским штаммом 66019 формируют на филогенетическом дереве большую ветвь с поддержкой 67. Таким образом, полученное филогенетическое дерево показывает наличие четырех генетических групп вируса ККГЛ.

Особый интерес представляло исследование генетической вариабельности концевых участков М-сегмента вирусного генома, поскольку по литературным

данным средний сегмент генома вируса ККГЛ обладает как протяженным гипервариабельным участком в N-концевом районе открытой рамки трансляции, так и вариабельным З'-некодирующим участком.

Анализ 5'-концевого участка (77-387) М-РНК шести вирусных образцов показал, что три вируса, изолированные от клещей из Астраханской области (ASTR/TI28870) и Ставропольского края (STV/TI28985) и от погибшего больного из Волгоградской области (VLG/HU29662), имеют идентичную нуклеотидную последовательность в рамках данного участка.

Исследуемые вирусные образцы из южных регионов России различаются не более чем на 2.8% по нуклеотидным последовательностям и не более 6.5% - по аминокислотным. Ниже приведено сравнение (% отличий) с вирусами из других регионов мира (по нуклеотидной последовательности / по аминокислотной): таджикский HU8966 - 32.2-35.6 / 41.5-43.4; Matin из Пакистана - 37.0 / 50.0-50.9; 10200 из Нигерии - 33.5-34.2 / 50.9; 66019 из Китая - 33.2-33.9 / 46.2-49.3; 75024 и 7803 из Китая - 30.7-31.3 / 55.6-58.5; 88166 и 8402 из Китая - 37.3-37.9 / 54.7-55.6; 79121 и 7001 из Китая - 53.9-54.9 / 68.9-69.8. Максимальные различия по последовательности нуклеотидов: между 79121 и Matin - 56.1%, аминокислот: 79121 и 66019-76.4%.

Очевидно, приведенные выше дифры значительно превышают таковые по среднему участку М-сегмента.

Было проведено аминокислотное выравнивание (1-103 ак), показавшее, что варианты вируса ККГЛ из России имеют 12 отличающих их от других штаммов аминокислот. Кроме того, для этих вирусов отмечена делеция аминокислоты в позиции 83. У штаммов Matin, 8402 и 88166 в этой позиции - аспарагиновая кислота, а у всех остальных - глютаминовая кислота. Общими для всех имеющихся в базе данных GenBank вирусов являются 10.4% аминокислот. Однако для образцов вируса ККГЛ из России эта величина составляет 93.%, что говорит о консервативности этого участка М-сегмента для российских вирусов.

Для выяснения филогенетических отношений между вариантами вируса ККГЛ на основе нуклеотидных последовательностей изучаемого 5'-концсвого участка М-сегмента было построено филогенетическое дерево (приведено на рисунке 5). На филогенетическом дереве видно, что российские вирусы формируют отдельную ветвь (индекс поддержки 100). При этом отмечается тенденция к делению вирусов на 2 подгруппы: Волгоградскую и Астраханско-Ставропольскую (индекс поддержки 70).

Все остальные вирусные штаммы делятся на 3 генетические гр>ппы. Самой отдаленной из них является группа двух китайских вирусов 7001 и 79121. В следующую группу входят штаммы 75024 и 7803 (Китай), HU8966 (Таджикистан) и 10200 (Нигерия). Третью группу формируют пакистанский штамм Matin и китайские 8402, 88166 и 66019.

Подобные исследования были проведены нами и для З'-концевого ччастка М-сегмента (4641-5072). Сравнение вновь полученных нами структур исследуемого участка генома российских вирусов между собой показало, что они различаются по последовательностям нуклеотидов на 0.2-6.0%, а аминокислот - 0.7-6.9%. Образцов с одинаковыми структурами не установлено, что говорит о большей

90

94

_г

- Н1129223-СтавропольГ| Т128870-Астрахань Т128985-Ставрополь Н U 29662-Волгоград TI29414-Волгоград L Т129453-Волгоград

-66019-Китай —

-Matin-Пакистан

Пю|_18402-Китай

юо L 88166-Китай

— 10200-Нигерия '

- Н118966-Таджикистан 7803-Китай

99' 75024-Китай

loot

-7001-Китай 79121-Китай

0.1

Рисунок 5

Филогенетическое дерево по 5'-кониевому участку М-сегмента генома вируса ККГЛ.

вариабельности этого участка для вирусов из южных областей России по сравнению с 5'-концевым участком М-сегмента.

Различия между полученными нами структурами и структурами, взятыми из GenBank по нуклеотидным последовательностям исследуемого участка составляют 16.2-25.2% и по аминокислотным - 9.7-24.3%. Как и для других участков М-сегмента, максимальное отличие приходится на китайские штаммы 79121 и 7001, неразличимые по структуре 4641-5072 фрагмента М-сегмента генома вируса ККГЛ.

Выравнивание аминокислот, кодируемых исследуемым участком генома, показало, что данный участок белка (1524-1666 ак) довольно консервативен: гомология для всех указанных вирусов ККГЛ равна 69,2% . Для вирусов из России гомология по данному участку аминокислотной последовательности -90.9%, а для китайских - 74.8%.

Восемь аминокислот из 143 являются уникальными для российских вирусов. Причем три из них в виде триплета (GSV) расположены в позиции 71-73 данного участка. У всех остальных штаммов в этом положении находится аминокислотный триплет SGI.

Для выяснения филогенетических отношений вирусов ККГЛ на основе стр\ ктур участка 4641-5072 М-сегмента нами было построено филогенетическое дерево (рисунок 6). Также как и при анализе стр\ ктур двух других участков М-сегмента генома вируса ККГЛ российские вирусы образуют на дереве отдельную ветвь. На этом дереве видно четкое деление виру сов на 2

99

99

100

100

TI29414-POCTOB

- Т12Э453-Волгоград I

- Н1129664-Волгоград Г Н1)29662-Волгоград -J

Т128870-Астрахань -i I—Ни29223-Ставрополь U

L Т128985-Ставрополь

"66019-Китай _ -10200- Нигерия

Н118966-Таджикистан Г 7803-Китай

f,

100 75024-Китай Майп-Пакистан ■ 8402-Китай

10°188166-Китай

17001-Китай

loo 179121-Китай

0 05

Рисунок 6

Филогенетическое дерево по 3'-концевому участку М-сегмента генома вируса ККГЛ

подгруппы (индексы поддержки 100): «Астрахань-Ставрополь» и «Волгоград». Различия по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям среди вирусов первой группы не превышает 1.9 и.2.8%, между вирусами второй - 0.7 и 2.1%, соответственно. Аналогичные различия между группами выше более чем в 2 раза и составляют 6.0 и 6.9%.

Все остальные вирусы образовали 3 генетические группы. Самая удаленная группа - это два китайских вируса 7001 и 79121. Во вторую гр\ ппу входят китайские вирусы 7803 и 75024, таджикский HU8966 и нигерийский 10200. к ним примыкает вирус из Китая 66019. Штамм Matin вместе с вирусами 8402 и 88166 из Китая образуют третью группу.

Хотя короткие геномные последовательности часто используются для популяционного изучения арбовирусов, мы решили исследовать более протяженный фрагмент З'-концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ. Были получены ампликоны участка М-РНК (4185-5340 по штамму 66019) для двух российский вирусов и коллекционного штамма из Таджикистана. Этот участок включает в себя открытую рамку трансляции (4185-5145) и З'-концевую некодирующую область.

Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей показало, что российские вирусы (STV/HU29223, VLG/TI29414) различаются на 4.5% по

нуклеотидной последовательности и на 4.1% - по аминокислотной. От других штаммов эти различия варьируют 14. до 22% и от 7.5-19 %, соответственно.

Если сравнить эти цифры с аналогичными, полученными по более короткому З'-концевому участку (16.2-25.2% и 9.7-24.3%), входящему в исследуемый, то видно, что уровень гомологии по более протяженному участку выше.

Проведенное аминокислотное выравнивание показало наличие 10 уникальных аминокислот (из 320), отличающих вирусы из южных областей России от всех остальных. В позиции 31-53 данного элайнмента выявлен протяженный участок аминокислот (fhfhskrvtahgdtpqldlarp) , гомологичный для всех без исключения вирусов. Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank показал, что этот участок является уникальным и определяющим для всех вирусов ККГЛ, так как отсутствует в аминокислотных последовательностях других зарегистрированных структур.

Проведенное филогенетическое сравнение полученных для трех структур достаточно протяженного З'-концевого участка М-сегмента (4185-5340 по штамму 66019) с уже известными представлено в виде филогенетического дерева (рисунок 7).

При сравнении приведенного выше филогенетического дерева с деревом, построенным по более короткому З'-концевому участку, обнаруживается схожесть характера ветвления с максимальными уровнями поддержки.

Два российских вируса формируют отдельную ветвь дерева. Отдельную, самую удаленную, генетическую группу образуют вирусы 7001 и 79121. Таджикский штамм HUS966 входит в одну группу с нигерийским 10200 и китайскими 7803 и 75024 штаммами. В четвертую группу кроме штаммов из Китая 8402 и 88166 попадает пакистанский вирус Matin. Вместе со штаммом 66019 две последние генетические группы объединяются в одну большую группу с уровнем поддержки 70. Подобная картина имела место на филогенетическом дереве по среднему участку М-сегмента.

Сравнивая приведенные выше результаты анализа структур короткого и более протяженного З'-концевых участков М-сегмента генома вируса ККГЛ, мы пришли к выводу о том, что для выявления генетических групп вируса достаточно исследования короткого участка.

Несомненно, для более точного установления эволюционных взаимоотношений необходимо расширение базы данных по структуре различных сегментов генома для достаточно большого количества вариантов вируса из различных регионов мира. В дальнейшем это позволит выяснить: происходит ли процесс реассортации фрагментов генома в природных очагах, имеет ли он существенное значение для эволюции вируса ККГЛ и влияет ли этот процесс на эпидемическою обстановку во время вспышек заболевания ККГЛ.

Таким образом, нами впервые получены данные по структуре трех участков М-сегмента генома вируса ККГЛ из России и установлено, что все известные вирусы по нуклеотидной последовательности участков М-сегмента генома можно разделить на четыре генетические группы. Вирусы из южных регионов России формируют отдельную генетическую группу.

100

зз

70

100 Г 74024-Китай 7803-Китай

— Ни8966-Таджикист

— 10200-Нигерия

1001

— МаИп-Пакистан • 88166-Китай

- 8402-Китай -66019-Китай

-Ни29223-Ставрополь

-Т129414-Волгоград

_17001-Китай

I 79121-Китай

100 I

0.05

Филогенетическое дерево по участку 4185-5340 М-сегмента генома вируса ККГЛ

Дизайн праймеров для диагностической ПЦР-тест-системы на РНК вируса ККГЛ в образцах.

Нами был выбран консервативный участок Б-сегмента, ограниченный праймерами РБ (участок II), и установлена структура этой области для многих образцов и штаммов вируса ККГЛ из европейской части России, Таджикистана и Узбекистана. Ранее с использованием этих праймеров нами были проанализированы сыворотки крови лихорадящих больных из Казахстана и суспензии клещей, собранных в Казахстане во время вспышки заболевания ККГЛ в 2000 году.

Ниже на рисунке 8 приведена электрофореграмма продуктов ПЦР, проведенной с праймерами РБЗ, РБ4 при анализе сывороток крови.

- * * а

дор. 1 - Маркер Р1ГС19/М5р1 дор. 2 - отрицательный контроль дор. 3-7 - сыворотки крови лихорадящих больных (№1-№5) с неподтвержденным диагнозом ККГЛ.

Сыворотки №1 и №4- положительные, а №2.

№3 и №5- отрицательные.

дор 8 - положительный контроль

Электрофореграмма с праймерами РЭ4. РБ5

Рисунок 8

В двух исследуемых образцах присутствует целевой фрагмент (506 п.о.), а в трех — в небольшом количестве неспецифические продукты. С целью ускорения проведения анализа за счет уменьшения размера специфического продукта амплификации и повышения специфичности реакции была предпринята попытка модернизации праймеров.

Подробный анализ полученных нами данных, а также анализ имеющихся в Банке Генов структур других изолятов, позволил нам усовершенствовать имеющиеся праймеры, а также расположить еще один прямой праймер в этой области (РБ5). Ниже приведена схема (рисунок 9) локализации всех праймеров на последовательности Б сегмента вирусного генома. Цифрами обозначены позиции 5'-концевых нуклеотидов праймеров.

PS1 PS3 PS5

PS4 PS2

772 800 959 1308 1346

Рисунок 9

Схема локализации праймеров на последовательности S-сегмента генома.

Для отработки режимов ОТ-ПЦР мы использовали различные комбинации прямых и обратных праймеров. Наиболее воспроизводимые и однозначные результаты получены нами при использовании праймера PS3 для получения кДНК и праймеров PS3+PS2 для первого раунда ПЦР, праймеров PS5+PS4 для второго раунда. Электрофореграмма приведена на рисунке 10.

Целевой фрагмент имеет длину 350 п.о. и легко детектируется в 1.5-2% агарозном геле. В большинстве положительных на вирус ККГЛ образцов дополнительные фрагменты отсутствуют, однако, иногда наблюдается наличие минорной полосы, соответствующей по подвижности продукту первого раунда ПЦР.

123456789 10 II

дор.1 - отрицательный контроль дор.2 - Маркер PUC19.'MspI дор.3-11 - содержащие вирус ККГЛ образцы.

Рис\нок 10

В дальнейшем была проведена оптимизацию условий проведения ПЦР с целью получения только одного специфического ПЦР-фрагмента ДНК и отсутствия каких-либо фрагментов в отрицательных образцах.

Для проверки специфичности и чувствительности метода индикации РНК вируса ККГЛ с помощью ОТ-ПЦР с набором модернизированных праймеров было исследованы как разные географические биоварианты вируса ККГЛ, так и различные вируссодержащие материалы (кровь больных, ткани органов умерших, клещи, культура клеток, зараженная вирусом). Всего проанализировано 56 образцов: 10 клинических проб от больных, 6 проб от клещей из Таджикистана и Казахстана, 3 вирусных штамма из Таджикистана, Туркменистана и Болгарии и вирусные изоляты с юга России. Только в 2 пробах от клещей, имеющих незначительное (немного выше фона) превышение экстинции (метод АгИФА) над отрицательными образцами результаты ОТ-ПЦР были отрицательными. Во всех остальных - положительный.

Проведенное сравнение полученных данных с данными АгИФА и метода изоляции вируса на культуре клеток показало, что наивысшей чувствительностью обладал метод ОТ-ПЦР, который превышал по чувствительности метод ИФА на четыре порядка и метод биопробы - на два порядка.

В настоящее время на основе разработанного нами набора праймеров и отработанных условий индикации вируса 6 помощью ОТ-ПЦР выпущена экспериментальная серия диагностических наборов для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на юге России, представлена близкородственными вариантами вируса ККГЛ (гомология не менее 93.5%), формирующими отдельную генетическую группу, которую можно разделить на две географические подгруппы: Волгоградско-Ростовскую и Астраханско-Ставропольскую.

2. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность малого сегмента генома вируса ККГЛ для двух современных российских штаммов, выделенных в 2000 году (ЬЕ1У 29223 Ст. и ЬЕ1У 28044 Рос.), а также коллекционного штамма вируса из Узбекистана (ЬЕГУ 10145 Уз).

3. Сравнительным анализом полных и частичных структур Б-сегмента генома показано, что популяция циркулирующего в настоящее время на юге России вируса ККГЛ генетически близка штамму ОгоБёоУ (гомология - 96-97%), выделенному в России на этой же территории в 1967 году, что говорит о стабильности популяции вируса ККГЛ, циркулирующего на юге России.

4. Впервые получены данные по структуре трех участков М-сегмента генома вируса ККГЛ из России. Показано, что все известные штаммы по нуклеотидной последовательности участков М-сегмента генома можно разделить на четыре генетические группы, причем вирусы из России формируют отдельную группу. Различия по нуклеотидным последовательностям с представителями других генетических групп находится в пределах от 15 до 55%.

5. По результатам сравнительного анализа всех известных нуклеотидных последовательностей малого сегмента генома предложен набор праймеров для проведения ОТ-ПЦР, на основе которого в настояшее время разрабатывается

диагностическая тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Петрова И.Д., Серегин С.В., Петров B.C., Вышемирский О.И., Кузина И.И., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Тюнников Г.И., Гуторов В.В., Яшина Л.Н., Нетесов С.В. Генетическая характеристика S-сегмента РНК двух штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, изолированных на юге России и в Узбекистане. Вопр. вирусол., 2003, N2, с.8-11.

2. Lydmila Yashina, Irina Petrova, Sergei Seregin, Oleg Vyshemirskii, Dmitrii Lvov, Valeriya Aristova, Jens Kunh, Sergei Morzunov, Valery Gutorov, Irina Kuzina, Georgii Tyunnikov, Sergei Netesov and Vladimir Petrov. Genetic variability of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in Russia and Central Asia. Journal of General Virology, 2003, v.84, p. 1199-1206.

3. Lyudmila Yashina , Oleg Vyshemirskii, Sergei Seregin, Irina Petrova, Evgeny Samokhvalov, Dmitry Lvov, Valery Gutorov, Irina Kuzina, Georgy Tyunnikov, Yi-Wei Tang, Sergey Netesov, and Vladimir Petrov. Genetic Analysis of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus in Russia. Journal of Clinical Microbiology, 2003, v. 41, N.2, p.860-862.

4. Яшина Л.Н., Петров B.C., Петрова И.Д., Гуторов B.B., Казаков С.В., Оспанов К.С., Каримов С.К., Тюнников Г.И., Серегин С.В., Кузина И.И., Бабкин И.В., Нетесов С.В. Генетическая идентификация вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки во время эпидемической вспышки в Казахстане в 2000 г. Молекул, генетика, микробиол. и вирусол., 2002, N.4, с.31-35.

5. Яшина Л.Н., Петров B.C., Вышемирский О.И., Аристова В.А., Москвина Т.М., Львов Д.К., Петрова И.Д., Гуторов В.В., Тюнников Г.И.. Кузина И.И., Самохвалов Е.И., Серегин С.В., Нетесов С.В. Характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, циркулирующего в России и республиках Средней Азии. Вопр. вирусол. 2002, Т.47, N.3, с.11-15.

ГНЦ ВБ «Вектор» Зак.48,т. 100 2003 г.

ИЗ2 ее

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Ирина Дмитриевна

Список сокращений. ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Открытие и эпидемиология ККГЛ (исторический аспект).

1.2. Эпидемиологическая ситуация по ККГЛ в России в настоящее время

1.3. Таксономия найровирусов.

1.4. Молекулярно-биологическое исследование вируса ККГЛ.

1.5. S-сегмент геномной РНК и нуклеокапсидный белок.

1.6. М-сегмент геномной РНК и оболочечные гликопротеины.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал для исследований.

2.2. Обратная транскрипция полимеразная цепная реакция.

2.3. Секвенирование и филогенетический анализ.

Глава 3. СОСТОЯНИЕ ПРИРОДНОГО ОЧАГА ККГЛ НА ЮГЕ ф РОССИИ.

3.1. Вирусофорность клещей.

3.2. Результаты ИФА клинических образцов.

Глава 4. СТРУКТУРА ГЕНОМА ВИРУСА.

4.1. Структура S-PHK вируса ККГЛ.

4.1.1. Структура участка 310-529 S-сегмента генома вируса ККГЛ.

4.1.2. Структура 825-1290 участка S-сегмента генома вируса ККГЛ.

4.1.3. Полная структура S-сегмента генома вируса ККГЛ.

4.2. Структура М-сегмента генома вируса ККГЛ.

4.2.1. Структура среднего участка М-сегмента генома вируса ККГЛ

4.2.2. Структура 5'-концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ

4.2.3. Структура З'-концевого участка М-сегмента генома вируса ККГЛ

Глава 5. ДИЗАЙН ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ

ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА РНК ВИРУСА ККГЛ В ОБРАЗЦАХ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование генетических особенностей вируса крымской-конго геморрагической лихорадки, циркулирующего на Юге России"

Крымская-Конго геморрагическая лихорадка - острое вирусное природно-очаговое заболевание человека с высокой степенью летальности. Вирусная этиология ККГЛ была установлена М.П.Чумаковым при изучении в 1944-45 гг. в Крыму вспышки неизвестного заболевания с геморрагическим синдромом. Этиологический агент был охарактеризован антигенно, физико-химически и морфологически лишь в 1967 году, когда для выделения вируса отечественными исследователями была использована общепринятая методика выделения вируса на белых мышах-сосунках. (Чумаков М.П. и др., 1968). Совместными исследованиями советских (Чумаков М.П. и др., 1969) и американских (Casals J. et al., 1969) экспертов, проведенных в конце 60-х годов, было продемонстрировано, что штаммы вируса Крымской геморрагической лихорадки в антигенном и биологическом отношении очень близки к вирусу лихорадки Конго, впервые выделенного в 1956 году в Заире из крови больного ребенка (Simpson D.L.H. et al., 1967). Этиологический агент, вызывающий то и другое заболевание, получил общее название - вируса конго-крымской гемморагической лихорадки (ККГЛ). В настоящее время он называется вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки.

Географическое распространение вируса довольно широкое. Число стран в Европе, Азии и Африке, где выявлена циркуляция возбудителя ККГЛ, достигло четырех десятков (Hoogstraal Н. 1979, Swanepoel R. 1987).

В молекулярно-биологическом плане вирус ККГЛ ещё недостаточно исследован. Нуклеотидная последовательность всего генома вируса ККГЛ пока не определена, однако, для ряда штаммов ККГЛ, изолированных в Китае, Греции, Нигерии, Пакистане, Уганде, Косово и Сенегале известны полные или частичные последовательности М- и S-сегментов генома.

Филогенетический анализ, проведенный на основе имеющихся частичных нуклеотидных последовательностей (220 нуклеотидов) S-сегмента генома 26 вариантов вируса ККГЛ из различных регионов мира, показал, что все вирусы делятся на 3 большие группы (Rodriguez L.L. et al.,1997). Немногим ранее аналогичная картина была получена при сравнении фрагментов S-сегментов длиной 499 нуклеотидов 13 вирусов ККГЛ (Marriott А.С. et al., 1996). Полученные в этих работах филогенетические деревья не выявляли корреляцию между генетическими группами, местом и источником выделения вируса (человек, клещ, животное). Что касается Российской Федерации и бывшего СССР, то, несмотря на приоритет в открытии данного вируса какие либо данные по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу этого вируса отсутствуют. Следовательно, какой-либо возможности оценить преобладающие генетические варианты вируса и генетическое разнообразие его на территории до сих пор не было.

Активизация очагов ККГЛ, начавшаяся в 1999 г. на территории юга России, требует с одной стороны выяснения причин данной ситуации, с другой стороны - выявления ведущих генотипов вируса, циркулирующего на указанных территориях.

Данные по строению части генома вируса ККГЛ (S-сегмент РНК), циркулирующего в России, были получены только для одного штамма Drozdov, выделенного в 1967 году в Астраханской области ( Butenko А. М. et al., 1968). Структура среднего (М) сегмента этого и других российских вирусов не были известны.

Широкое географическое распространение и высокая опасность заболевания ККГЛ для человека делают изучение природных популяций вируса актуальным в плане получения новых данных по генетической вариабельности циркулирующего на юге России вируса, изучения путей эволюции вируса и в плане усовершенствования методов лабораторной диагностики.

Целями настоящего исследования являлись генетическая характеризация полевых и лабораторных образцов вируса ККГЛ, выделенных от клещей Hyalomma marginatum, выживших и умерших больных из Ставропольского края,

• Ростовской, Волгоградской и Астраханской областей России и разработка метода индикации РНК вируса для ранней диагностики ККГЛ на основе обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Для выполнения намеченной программы требовалось решить следующие задачи: сбор и иммунохимическая характеризация образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, от больных и различных видов клещей; выявление наличия в образцах вируса с помощью ИФА", дизайн праймеров и индикация РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР); определение нуклеотидных последовательностей фрагментов S- и М-сегментов генома полевых образцов и коллекционных штаммов вируса ККГЛ; сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с опубликованными и установление филогенетических взаимоотношений между штаммами вируса ККГЛ, циркулирующего в различных регионах мира.

Научная новизна работы

Впервые исследована генетическая вариабельность вируса ККГЛ, циркулирующего на территории южных регионов России на основании изучения частичных нуклеотидных последовательности S- и М- сегментов генома.

Определена полная нуклеотидная последовательность S-сегмента трех коллекционных штаммов вируса ККГЛ: LEIV 29223 Ст. от больного из Ставропольского края, LEIV 28044 Рос. от клеща H.marginatum из Ростовской области и LEIV 10145 Уз. от клеща Н. asiaticum из Узбекистана.

Впервые показано, что на территории России циркулируют генетически близкие варианты вируса ККГЛ, существенно отличающиеся по нуклеотидной последовательности S- и М- сегментов генома от штаммов из других регионов мира.

На основании данных по генетической вариабельности вируса ККГЛ, циркулирующего в южных регионах России, создан набор праймеров для диагностической ПЦР-системы для индикации вируса ККГЛ в клинических образцах.

Практическая ценность

На основе созданного нами набора праймеров и отработанных условий индикации РНК вируса с помощью ОТ-ПЦР выпущена экспериментальная серия диагностических наборов для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах.

Получена заявка на изобретение № 2001123408/13, "Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса ККГЛ" приоритет от 20.08.01, решение о выдаче патента от 11.02.2003. Авторы заявки: 1) Петров B.C., 2) Петрова И.Д., 3) Тюнников Г.И., 4) Серегин С.В., 5) Яшина Л.Н., 6) Кузина И.И.

По результатам работы в базе данных GenBank зарегистрированы 52 нуклеотидные последовательности.

Основные положения, выносимые на защиту

- Популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на территории юга Росси в 2000-2001 представлена доминирующим генотипом вируса, имеющим значительные отличия в нуклеотидной структуре от зарубежных аналогов.

- Популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на территории России, стабильна.

- Вирусы ККГЛ, циркулирующие на территории России разделяются географически на Волгоградско-Ростовскую и Астраханско-Ставропольскую подгруппы.

Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю кандидату биологических наук Петрову Владимиру Семеновичу за постоянное внимание и заботу при выполнении данной работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта МНТЦ 1291.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Петрова, Ирина Дмитриевна

выводы

1. Установлено, что популяция вируса ККГЛ, циркулирующего на юге

России, представлена близкородственными вариантами вируса ККГЛ (гомология не менее 93.5%), формирующими отдельную генетическую группу, которую можно разделить на две географические подгруппы: Волгоградско-Ростовскую и Астраханско-Ставропольскую.

2. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность малого сегмента генома вируса ККГЛ для двух современных российских штаммов, выделенных в 2000 году (LEIV 29223 Ст. и LEIV 28044 Рос.), а также коллекционного штамма вируса из Узбекистана (LEIV 10145 Уз).

3. Сравнительным анализом полных и частичных структур S-сегмента генома показано, что популяция циркулирующего в настоящее время на юге России вируса ККГЛ генетически близка штамму Drosdov (гомология - 9697%), выделенному в России на этой же территории в 1967 году, что говорит о

Ф стабильности популяции вируса ККГЛ, циркулирующего на юге России.

4. Впервые получены данные по структуре трех участков М-сегмента генома вируса ККГЛ из России. Показано, что все известные штаммы по нуклеотидной последовательности участков М-сегмента генома можно разделить на четыре генетические группы, причем вирусы из России формируют отдельную группу. Различия по нуклеотидным последовательностям с представителями других генетических групп находится

Ф в пределах от 15 до 55%.

5. По результатам сравнительного анализа всех известных нуклеотидных последовательностей малого сегмента генома предложен набор праймеров для проведения ОТ-ПЦР, на основе которого в настоящее время разрабатывается диагностическая тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ в клинических образцах.

Заключение

Судя по данным, представленным в литературе, вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки, на молекулярно- биологическом уровне изучен недостаточно. Полная структура генома до сих пор не определена. Не до конца уточнен процессинг структурных гликопротеинов и не определена стратегия кодирования L сегмента РНК. Проведенные филогенетические исследования на основании полной и частичной нуклеотидной последовательности малого сегмента РНК генома не выявляли корреляцию между генетическими группами и такими факторами как географическое место выделения вируса, время (год) выделения и сам источник (человек, клещ, животное и т.д.). То же самое было показано и на основании сравнения немногочисленных нуклеотидных последовательностей М-сегментов генома вирусов ККГЛ (генетическое разнообразие китайских штаммов). Вирусные популяции Европы и России, в том числе, изучены недостаточно. Сравнительные исследования методов диагностики ККГЛ показали, что ОТ-ПЦР является хорошим диагностическим методом особенно для ранней диагностики, но для эффективного его применения необходимо иметь данные по первичной структуре генетических вариантов вируса, циркулирующих на конкретной территории. Поэтому целью нашего исследования являлась генетическая характеризация полевых и клинических образцов и коллекционных штаммов вируса ККГЛ, выделенных от больных, умерших и клещей Hyalomma marginatum из Ставропольского края, Ростовской, Волгоградской и Астраханской областей России и в качестве дополнения к основному направлению исследований была разработка метода индикации РНК вируса ККГЛ в пробах с помощью ОТ-ПЦР.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2Л. Материал для исследований

Вирус. В работе использовали 4 колекционных штамма вируса ККГЛ из музея Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН, Москва: штамм LEIV 10145 Уз., выделенный из клещей Hyalomma asiaticum в 1985 г. в Узбекистане (прошел 36 пассажей на мышах-сосунках и 3 пассажа на культуре клеток SW-13); штамм LEIV 29223 Ст., выделенный в 2000 г. от больного в Ставрополе (прошел 1 пассаж на культуре клеток SW-13); штамм LEIV 8966 Тадж., выделенный от больного в 1990 г. в Таджикистане (прошел 15 пассажей на мозгах мышей-сосунков и 1 пассаж на культуре клеток SW-13); штамм LEIV 28044 Рос., выделенный от клещей Н. marginatum в Ростовской области в 2000 г (прошел 1 пассаж на культуре клеток SW-13).

Клинические образцы. В данной работе было проанализировано 180 сывороток крови, 17 образцов клинического материала от 6 погибших и 7167 клещей. Пробы от больных и умерших с диагнозом ККГЛ были получены во время локальных вспышек заболевания в Ростовской и Волгоградской областях и в Ставропольском крае в 2000-2001 гг. Пробы представляли собой цельную кровь, сыворотку крови или 20% суспензию секционного материала. Предварительная диагностика заболевания проводилась по совокупности клинических проявлений, а окончательный диагноз ККГЛ ставился на основании данных лабораторных методов исследований. При этом для выявления антигена вируса ККГЛ в клиническом материале от больных или в секционных образцах от умерших использовали иммуноферментную тест-систему (вариант прямого сэндвича) производства лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Для выявления специфических IgM-антител использовали вариант ловушки М антител МАС-ELISA (Вышемирский О.И. 1993), для выявления IgG-антител в сыворотках крови больных и реконвалесцентов - вариант непрямого сэндвича, как описано в работе (Лаврова Н.А. 1986). До дальнейших исследований пробы хранились в виде замороженных при минус 70°С аликвот.

Сбор клещей рода Н. marginatum осуществляли в течение 2000 г. в южных регионах европейской части России, включающих 5 административных образования (Калмыкия, Волгоградская, Астраханская, Ростовская области и Ставропольский край). В каждом регионе сбор проводили не менее чем в четырех районах. Клещей для анализа собирали живыми, сортировали по стадиям развития, полу и месту сбора, замораживали в жидком азоте и сохраняли замороженными при минус 70°С.

Протокол обследования клещей на наличие вируса (антигена) ККГЛ состоял в следующем. Замороженные пулы (по 10-12 экз.) клещей растирали, добавляли на один пул 2 мл культуральной среды, суспензию центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость обследовали в варианте ИФА прямой сэндвич в разведении 1:2 с помощью вышеназванной иммуноферментной тест-системы. Положительные пробы переставляли до # конечного разведения.

Все антигенположительные образцы (клинические и суспензии клещей) были проанализированы методом биопробы на мышах-сосунках или культуре клеток SW-13 и часть из них с помощью ОТ-ПЦР. Происхождение лабораторных и полевых штаммов вируса ККГЛ, использованных в данном исследовании, приведено в таблице 4.

Как видно из таблицы 4 для исследования взяты изоляты вируса ККГЛ с ф различной географической локализацией и источником выделения (клещи, люди).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Ирина Дмитриевна, Кольцово

1. Александров А.А., Александров Н.Н., Бородовский М.Ю. и др.(1999).

2. Компьютерный анализ генетических текстов. М., Наука.

3. Аристова В.А., Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю. и др. (2001). Экологиявируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки и особенности ее клиники на территории России и сопредельных стран. Вопр. вирусол., т.45(4), с.7-15.

4. Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусныхинфекций на территории Российской Федерации. Под ред. Львова Д.К. и др. (1995) М.,

5. Василенко С.М., Кацаров Т., Михайлов А. и др. (1971). Изучение КГЛ в

6. Болгарии. Вирусные и геморрагические лихорадки. Труды ИПВЭ АМН СССР, М., т.19, с.100-101.

7. Возжаева А.П., Аваков А.Л., Жигульская И.Ф. и др. (1955). О случаях0 геморрагической лихорадки в Астраханской области. Тезисы докл. 32ой научной сессии Астраханского мед.инст. Астрахань, с.28.

8. Вышемирский О.И. (1993). Анализ антигенной структуры штаммоввируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител. Диссертация на соиск уч.ст.канд.мед.н., Москва.

9. Гайдамович С .Я., Львова А.И., Обухова В.Р. и др. (1969). Антитела кф арбовирусам в асците иммунизированных мышей. Вопр. вирусол., №6,с.676-683.

10. Гайдамович С.Я., Мельнткова Е.Э., Шуткова Т.М. и др. (1989).

11. Характеристика моноклональных антител, индуцированных вирусом крымской геморрагической лихорадки. Вопр.вирусол., №2, с. 201-204.

12. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Шаноян Н.К. и др. (1974). Реакциянепрямой гемагглютинации с вирусами КГЛ-Конго. Вопр. вирусол., # №6,705с.

13. Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э.,.Шуткова Т.М и др. (1989). Характеристика моноклональных антител, индуцированных вирусом крымской геморрагической лихорадки. Вопр. вирусол., №3, с.201-204.

14. Евченко Ю.М., Львов Д.К., Сысолятина Г.В. и др.(2001). Зараженность клещей Hyalomma marginatum Koch. 1844 вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в эпидемический сезон 2000г. Вопр.вирусол., №45(4), с. 18-19.

15. Жарких А.А. (1985). Методы филогенетического анализа генов и белков. Молек.биология. Итоги науки и техники. ВИНИТИ; М.

16. Карапетян P.M., Воробьев А.Т., Семашко И.В. и др. (1971 ).Случай КГЛ в Армянской ССР. Вирусные геморрагические лихорадки. Труды ИПВЭ АМН СССР, М., т. 19, с.260-265.

17. Карась Ф.Р., Герштейн В.И., Чиров П.А. и др. (1980) Материалы изучения кровососущих клещей и хранителей арбовирусов в природных очагах Киргизии. Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, с. 10-14.

18. Каримов С.К., Кирющенко Г.В., Реформацкая А.Ф. (1975). Случаи лабораторного заражения вирусом крымской геморрагической лихорадки. Журн.Микробиол., №5, с. 136-137.

19. Каримов С.К., Генис Д.Е., Бекзатов К.Н. и др. (1988). Текущее положение и перспективы изучения Крымской лихорадки. Вирусы и вирусная инфекция. Труды НИИ ЕМИБ №35, с. 129-133. Алма-Ата, министерство здравоохранения Казахской советской Республики.

20. Каримов С.К., Дерновой А.Г., Дурумбетов Е.Е. (2001) Арбовирусы и арбовирусные заболевания республики Казахстан. Алматы, с.74-77.

21. Кимура М. Молекулярная эволюция (1985). Теория нейтральности. М.: Мир.

22. Ковальский Г.Н., Рыбкина Л.Г. (1957). Заболевания из группы геморрагических лихорадок в степном районе Краснодарского края. Труды Кубанского медицинского института, Краснодар, т. 15, с.204-209.

23. Колобухина Jl.В., Евченко Ю.М., Вышемирский О.И. и др. (2001). Изоляция трех штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки от больных в Ставропольском крае во время эпидемической вспышки в 2000г. Вопр.вирусол., №45(4), с. 15-19.

24. Куйма А.У., Пак Т.П. (1975). Биоеценотические взаимоотношения вируса КГ Л, иксодовых клещей и их прокормителей. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ АМН СССР. М., т.22, вып.З, с.107-113.

25. Кучин В.В.(1973). Распространение крымской геморрагической лихорадки. Арбовирусные инфекции на Юго-Востоке Европейской части РСФСР. Ленинград, с.3-13.

26. Лаврова Н.А., Наволокин О.В. (1986). Твердофазный иммуноферментный метод для выявления арбовирусов и антител к ним. Арбовирусы. М., с. 146-153.

27. Лебедев А.Д., Пак Т.П., Бируля Н.Б. (1977). Экологическая география вирусов Крымской геморрагической лихорадки. ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Медицинская география. М., т.8, с.122-169.

28. Мазрухо Т.В., Громашевский В.Л., Говорухина М.Ю. и др. (2001). Зараженность клещей Hyalomma marginatum Koch. 1844 вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ростовской области в эпидемический сезон 2000г. Вопр.вирусол., т.45(4), с.20-21.

29. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д.(1984). Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир.

30. Мелиев А., Шермухамедов Д.А., Максумов С.С. и др.(1980). Изучение Крымской геморрагической лихорадки в Кашкадарьинской области Узбекской ССР. Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, с.30-35.

31. Мирзоева Н.М. (1978). Итоги изучения арбовирусных инфекций в Азербайджане. Арбовирусы. Труды НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского АМН СССР. М.,с.27-31.

32. Москвитина Э.А., Водяницкая С.Ю., Ломов Ю.М. и др. (2002). Крымская геморрагическая лихорадка в Ростовской области: эпидемиологическое районирование и активность природного очага. Жур. Микробиол., №6, с.26-30.

33. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Ломов Ю.М. и др. (2000). Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, №80, с.3-13.

34. Онищенко Г.Г., Тихонов Н.Г., Смирнова С.Е. и др. (1999). Результаты исследования сывороток крови больных из станицы Обливской Ростовской области. В: Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Сб. Тез., 23-25 ноября 1999г., Москва, с.76.

35. Онищенко Г.Г.(2001). Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природноочаговыми инфекциями а Российской Федерации и мерах по их профилактике. Журн.микробиол., №3, с.22-28.

36. Онищенко Г.Г., Марков В.И., Меркулов В.А. и др. (2001). Выделение и идентификация вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ставропольском крае. Журн.микробиол., №6, с.6-11.

37. Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., Ковалев Н.Г. и др.(2001). Эпидемиологические особенности крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 1999-2000гг.

38. Пак Т.П., Михайлова Л.И. (1973). Крымская геморрагическая лихорадка в Таджикистане. Душанбе, «Ифрон», -154с.

39. Пак Т.П. (1977). Экология вируса крымской геморрагической лихорадки. Автореф. дисс. соиск. учен. степ. докт. мед. наук. М., 36 с.

40. Пак Т.Щ1980). Обзор контактных заражений Крымской геморрагической лихорадкой и лихорадкой Конго. Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, с.26-29.

41. Платонов А.Е., Карань Л.С., Тялина Ю.Ю. и др. (2002). ГГТТР-диагностика крымской геморрагической лихорадки. Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сб. тезисов, Москва, с.291-292.

42. Смирнова С.Е., Караванов А.С. (1985). Индикация антигена вируса крымской геморрагической лихорадки твердофазным энзимным иммуносорбентным методом. Acta virologyca,, т.29, №1, с.87-90.

43. Смирнова С.Е., Караванов А.С., Зимина Ю.В. и др. (1991). Изучение вирусофорности клещей-переносчиков возбудителя крымской геморрагической лихорадки. Мед.параз. и параз. бол-ни, №1, с.32-34.

44. Смирнова С.Е., Караванов А.С., Гмыль JI.B. (1997). Адаптация вируса Крымской-Конголезской геморрагической лихорадки к культуре клеток Vero-E6 . Вопросы вирусологии, № , с.280-283.

45. Сомов Г.П., Беседнова Н.Н. (1981). Геморрагические лихорадки. М., Медицина, -199 с.

46. Темирбеков Ж.Т., Добрица П.Г., Контарук В.М. и др. (1971). Исследование крымской геморрагической лихорадки в Чимкентской области Казахской ССР. Сообщение 1. Эпидемиологическая характеристика. Труды ИПВЭ АМН СССР. М., т. 19, с. 160-166.

47. Ходукин Н.И. Хозинский В.И. (1949). Исследования при геморрагической лихорадке в Узбекистане. Тезисы докл. 4-ой научной сессии Института неврологии АМН СССР, М.

48. Цилинский Я. Я. (1988). Популяционная структура и эволюция вируса. М.,

49. Чумаков М.П., Бутенко A.M., Шалунова Н.В. (1968). Новые данные о вирусе возбудителе крымской геморрагической лихорадки. Вопр. вирусол., №13, -377 с.

50. Чумаков М.П., Башкирцев В.Н., Голгер Э.И. и др. (1974) Изоляция вирусов крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила из клещей, собранных в Молдавии. Сб. Медицинская вирусология. М., т.22, вып.2, с.45-49.

51. Шуткова Т.М., Мельникова Е.Э., Гайдамович С.Я. и др.(1989). Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу крымской геморрагической лихорадки. Журн.микробиол., т.6, с. 102106.

52. Яровой J1.B.(1965). Клинико-эпидемиологическая характеристика геморрагической лихорадки в Ставропольском крае. Труды ИПВЭ АМН СССР. М., т.7, с.31-34.

53. El-Azazy ОМЕ , Scrimgeour Е.М. (1997) Crimean-Congo haemorrhagic fever virus infection in the western province of Saudi Arabia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, N91, p.275 278.

54. Antoniadis A., Casals J.(1982). Serological evidence of human infection with Congo-Crimean hemorrhagic fever virus in Greece . Am. J.Trop. Med.

55. Hyg., v.31, N 5. p.1066 -1067.

56. Baskerville A, Satti A, Murphy FA, Simpson DI (1981). Congo-Crimean haemorrhagic fever in Dubai: histopathological studies. J. Clin. Pathol., v.34, N.8, p.871-874

57. Beaty D.J, Bishop D.H. (1988). Bunyavirus vector interaction. Virus Res., N19, p.289-302.

58. Buckley S.M. (1974). Cross plaque neutralization test with cloned Crimean Hemorrhagic Congo (CHFC) and Hazara virus. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., v.146, p. 594-600.Ф

59. Burney M.I., Ghafoor A., Saleen M. et al. (1980). Nosocomial outbreak of viral hemorrhagic fever caused by Crimean homorrhagic fever-Congo virus in Pakistan, January 1976. Am.J.Trop.Med.Hyg., v.29, p.941-947.

60. Burt F.J, Leman P.A, Smith J.F, Swanepoel R. (1998). The use of a reverse transcription-polymerase chain reaction for the detection of viral nucleic acid in the diagnosis of Crimean-Congo haemorrhagic fever. J Virol Methods v.70, N2, p.129-137.

61. Casals J. (1969). Antigenic similarity between the virus cansing Crimeanhemorrhagic fever and Congo virus .Proc.Soc. Exp. Biol. Med. v. 131, N1. p. 233 236.

62. Casals J., Tignor G.H. (1974). Neutralization and haemagglutination-inhibition test with Crimean Haemorrhagic fever-Congo virus. Pros. Soc. Biol. Med., N145, p.960-966.

63. Clerx J.P, Casals J, Bishop D.H. (1981). Structural characteristics of

64. A nairoviruses (genus Nairovirus, Bunyaviridae). J Gen. Virol., v.55, N 1,p.165-78

65. Darwish MA, Hoogstraal H, Roberts TJ. et al. (1983). A sero-epidemiological survey for Bunyaviridae and certain other arboviruses in Pakistan. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.,v.77, N4, p.446-50.

66. Digoutte J.P., Saluzzo J.F., Adam F. et al. (1985). Recent data on hemorrhagic fevers in West Africa. Bull Soc Pathol Exot Filiales ,v.78, N.52., p.874-878.

67. Drosten, С., Minnak D., Emmerich P., Schmitz H. (2002). Crimean-Congo hemorrhagic fever in Kosovo. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, p.l 122-1123.

68. Hjelle В., Spiropoulou C.F., Torrez-Martinez N. et al. (1994). Detection Of Muerto Canyon virus RNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with hantavirus pulmonary syndrome. J.Infect.Dis., v. 170, p. 10131017.

69. Hodgson, L. 1992. The sequence, genomic organization, and expression of the small genomic segment of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus for the potential use as a diagnostic antigen. M.S. thesis. Hood College, Frederick.

70. Horling J., Lundguist A., Persson K. et al. (1995). Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human speciment by PCR. J. Clin. Microbiol., v.33, p.277-282.

71. Hoogstraal H. (1979). The epidemiology of tick-borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia, Europa, and Africa. J.med. Entomol., v. 15, N4. p. 307-417.

72. Gear JH, Thomson PD, Hopp M, et al. (1982). Congo-Crimean haemorrhagic fever in South Africa. Report of a fatal case in the Transvaal. S. Afr. Med. J.v.62, N16, p.576-580.

73. Gligic A., Stamatovich L., Obradovich M. et al. (1977). The first isolation of Crimean hemorragic fever virus in Yugoslavia. Vojnosanit Pregl., v.34, p. 318-321.

74. Gordon S.W., Linthicum K.J., Moulton J.R. (1993). Transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in two species of Hyalomma ticks from infected adults to cofeeding immature forms. Am. J. Trop. Med. Hyg., v.48, N4, p.576-580.

75. Kumar S., Tamura K., Nei M.(1993). MEGA: molecular evolutionary genetics analysis. Version 1.02 (computer program). University Park, PA: Penn. State Univ.

76. Logan T.M., Linthicum K.J., Bailey C.L. et al. (1989). Experimental transmission of Crimean Congo hemorrhagic fever virus by Hyalomma truncatum Koch. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 40, N2. p. 207 -212.

77. Ma В., Hang C., Papa A. (2001). Sequencing and comparative analysis of the complete glicoprotein gene of three Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Chinese isolates (in Chinese). Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, v. 15, p. 195-111.

78. Maxam A.M., Gilbert W.G. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, v.74, N2, p.560-564.

79. Marriott A.C., Ward V.K., Higgs S., Nuttall P.A. (1990). RNA probes detect nucleotide sequence homology between members of two different nairovirus serogroups. Virus Res., v. 16, N1, p.77 81.

80. Marriott A. C., Nuttall P. A. (1992). Comparison of the S RNA segments and nucleoprotein sequences of Crimean-Congo haemorrhagic fever, Hazara and Dugbe viruses. Virology, v. 189, p.795-799.

81. Marriott А. С., Polyzoni Т., Antoniadis A. et al. (1994). Detection of human antibodies to Crimean-Congo haemorrhagic fever virus using expressed viral nucleocapsid protein. Journal of General Virology, v.75, p.2157-2116.

82. Marriott A. C., Nuttall P. A. (1996). Molecular biology of nairoviruses. The Bunyaviridae, p. 91-104. Edited by R. M. Elliott., New York: Plenum Press.

83. Mathiot C.C., Fontenille D., Digoute J.P. et al. (1988). First isolation of Congo-Crimean haemorrhagic fever virus in Madagascar. Ann. Pasteur. Virol., v.139, N2, p. 239-241.

84. Morikawa S., Qing Т., Xinqin Z. et al. (2002). Genetic diversity of M RNA segment among Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus isolates in China. Virology, v.296, p. 159-164.

85. Morrill JC, Johnson BK, Hyams C. et al. (1991). Serological evidence of arboviral infections among humans of coastal Kenya. J. Trop. Med. Hyg., v.94, N.3, p.166-168.

86. Morrill J.C, Soliman A.K, Imam I.Z. et al. (1990). Serological evidence of Crimean-Congo haemorrhagic fever viral infection among camels imported into Egypt. J. Trop. Med. Hyg., v.93, N3, p.201-204.

87. Al-Nakib W., Lloyd G., El-Mekki A. et al. (1984). Preliminary report on arbovirus -antibody prevalence among patients in Kuwait: evidence of Congo/Crimean virus infection. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.,v.78, p. 474476.

88. Oldfield, E. С., M. R. Wallace, К. C. Hyams, et al. (1991). Endemic infectious diseases of the Middle East. Rev. Infect. Dis., v. 13, N.3, p. 199217.

89. Papa A., Bino S., Llagami A. et al. (2002). Crimean-congo hemorrhagic Fever in Albania, 2001. Eur J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., v.21, N8, p.603-606.

90. Papa A., Ma В., Kouidou S. et al. (2002). Genetic characterization of the M RNA segment of Crimean Congo hemorrhagic fever virus strains, China. Emerging Infectious Diseases, v.8, p. 50-53.

91. Anna Papa, Bojana Bozovic, Vassiliki Pavlidou, et al. (2002). Genetic Detection and Isolation of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Kosovo, Yugoslavia. Emerging Infectious Diseases, v.8, p. 852-854.

92. Roderic D.M. Page and Edvard C.Holmes (1998). Molecular Evolution. Blackwell Science Ltd a Blackwell Publishing company.96. "RNA methodologies " Robert E., Farrell. Jr. (1998). Academic Press., p.67-68.

93. Rodrigues FM, Padbidri VS, Ghalsasi GR. Et al. (1986). Prevalence of Crimean haemorrhagic fever—Congo virus in Jammu & Kashmir state. Indian J. Med. Res., v.84, p. 134-8.

94. Rodriguez L.L., Maupin G.O., Ksiazek T.G. et al. (1997). Molecular investigation of a multisource outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates. American Journal of Tropical Medicine• and Hygiene, v. 57, p.512 518.

95. Rychlik W., Rhoads R.E. (1989). A computer program for choosingoptimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids Res., v. 17, p. 8543.

96. Salluzo J.F., Digoute J,, Cornet M. (1984). Isolation of Crimean-Congo haemorrhagic fever and Rift Vallery fever virus in Upper Volta. Lancet, v. 1. 119 p.

97. Salluzo J.F, Aurby P., Aubert H., Digoute J. (1985). Crimean-Congo i. hemmorrhagic fever in Africa. Apropos of case with hemorragicmanifestation in Mauritania . Bull. Soc. Pathol. Exot.Filiales., v. 78, N 2, p. 164-169.

98. Salluzo J.F., Le-Gueno B. (1987). Rapid diagnosis of human Crimean -Congo hemorraghic fever and detection of the vims in naturally infected ticks . J. Clin microbiol., v. 25, N 5, p. 922-924.

99. Saluzzo J.F., Leguenno В., Van der Groen G. (1988). Use of heat inactivatidviral haemorrhagic fever antigens in serological assays. J.Virol.Methods, v. 22, N2-3, p. 165-172.

100. Scrimgeour E.M, Zaki A, Mehta F.R. et al. (1996). Crimean-Congo haemorrhagic fever in Oman. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.90, p.290- 291.

101. Shepherd A.J., Swanepoel R., Leman P.A., Sheferd S.P. (1987). Field and laboratory investigation of Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (Nairovirus, family Bunyaviridae) infection in birds. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., v. 81, N6, p. 1004-1007.

102. Simpson D.L.H., Knight E.M., Courtois G. et al. (1967). Congo virus:a hitherto undescribed virus occurring in Africa. Part 1. Human isolations-clinical notes. East Afr.Med.J., v.44, p.87-92.

103. Smith J.F., Pesik N.T., Hodgson L.A. and R.Bethke (1989). Epytope anlysisjof CCHF virus and related Nairoviruses. Abstr. 2 simposium on Arboviruses in the Mediterranean Countries, 24-29 September, Dubrovnik, p.10.

104. Suleiman MNEN, Muscar-Baron J.M., Harries J.R. et al. (1980). Congo/Crimean hemorrhagic fever in Dubai An outbreak at the Rashid hospital. Lancet ii, p.939-941.

105. Sureau P., Klein J.M. et al. (1980). Arboviruses in Iran. Med. Trop. (Mars). V.40, N.5, p.549-554.

106. Swanepoel R, Struthers JK, Shepherd AJ. et al. (1983). Crimean-congo hemorrhagic fever in South Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg.,v.32, N6, p.1407-1415.

107. Swanepoel R., Shepherd A.J., Leman P.A. et al. (1987). Epidemiologic and clinical features of Crimean-Congo hemorrhagic fever in southern Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 36, N1, p. 120-132.

108. Tantawi H.H., Al-Moslin M.U., Al-Janabi N Y. et al. (1980). Крымско-Конголезская гемморагическая лихорадка в Ираке: выделение, идентификация и электронно-микроскопическое изучение вируса . Acta Virol., v. 24, N 6, р.464-467.

109. Tikriti SK, Hassan FK, Moslih IM. et.al. (1980). Congo/Crimean haemorrhagic fever in Iraq: a seroepidemiological survey. J. Trop. Med. Hyg., v.84, N.3,p.l 17-120.

110. Tignor G.H., .Smith A.L, 4 Casals J. et.al. (1980). Close relationship of Crimean hemorrhagic fever-Congo (CHF-C) virus strain by neutralizing antibody assay. Am.J.Trop.Med.Hyg., v.29, N4, p.676-685.

111. Vesenjak-Hiijan J., Punda-Polic V., Dobe M. (1991). Geographical distribution of arboviruses in Yugoslavia. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol., v.35, N2, p. 129-140.

112. Ward V.K., Marriot A.C., El-ghorr A.A. et al. (1990). Coding strategy of the S RNA segment of Dugbe virus (nairovirus, Bunyaviridae). Virology, v. 175, N2, p. 518-524.

113. Yen Y.C., Kong L.X., Lee L. et al. (1985). Characteristics of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (Xinjiang strain) in China . Am. J. Trop. Med. Hyg. v. 34, N 6, p.l 179-1182.

114. Zeller H.G., Karabatsos N., Calisher С.Щ1989). Electron microscopic and antigenic studies of uncharacterized viruses that place viruses in the family Bunyaviridae. Arch. Virol., v. 108, N 2., p.211-227.