Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции"

На правах рукописи

□030573Б7'

Найденова Екатерина Владимировна

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово-2007

003057367

Работа выполнена в ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Щербакова Светлана Анатольевна Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич кандидат биологических на>к Петров Владимир Семенович

Ведущая организация

ГУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва

Защита состоится 18 мая 2007 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28, К.таЛ: chaldina@vector.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан 17 апреля 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э Г. Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В Российской Федерации в последние годы отмечается ухудшение эпидемиологической ситуации по арбовирусным природно-очаговым инфекциям, что обусловлено резкой активизацией эпизоотического процесса в природных очагах, вторжением человека в неосвоенные или малоосвоенные регионы, а также уровнем организации и эффективности эпидемиологического надзора (Онищенко Г.Г. и др. 2000, 2005).

Глубокие экологические трансформации (потепление климата, сокращение лесного фонда и земель сельскохозяйственного назначения, восстановление степных ландшафтов в Северо-Западном Прикаспии и т.д.), наблюдавшиеся в течение последних лет на юге России, в том числе в регионе Нижнего Поволжья, привели к изменению видового состава и удельного веса отдельных носителей и переносчиков арбовирусов Это послужило предпосылкой для расширения ареала возбудителей ряда арбовирусных инфекций и формирования новых природных очагов При этом произошло особенно резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке (КГЛ) Возникновение вспышек этого заболевания в 1999-2006 гг было отмечено не только на эндемичных территориях, но и в тех районах, где циркуляция вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) ранее не наблюдалась (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Ингушетия, Дагестан) (Бутенко A.M., Ларичев В Ф , 2004, Онищенко Г.Г и др., 2005). За эти годы на юге европейской части России (в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском крае и других регионах) было зарегистрировано 769 случаев заболеваний людей КГЛ. Высокая легальность, тяжелое клиническое течение, социальная значимость болезни определяют необходимость совершенствования методов ее лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов КГЛ.

В настоящее время для лабораторной диагностики КГЛ используются методы, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющие проводить анализ большого количества образцов за непродолжительное время (Карань Л С. и др., 2003). В первую очередь это различные модификации иммуноферментного анализа (ИФА) Существенным недостатком ИФА является необходимость исследования парных сывороток крови взятых у больного в динамике заболевания, что значительно снижает диагностическую ценность метода. Кроме этого,

чувствительность и специфичность ИФА ниже, чем методов генодиагностики, и. в частности, Г1ЦР. Создание и практическое внедрение ПЦР-тест-системы. предназначенной для выявления РНК вируса ККГЛ, будет способствовать решению многих актуальных задач - быстрой постановке предварительного диагноза, эффективной детекции возб\дигелей в биологическом материале и объектах внешней среды, чго позволит адекватно оценить сложившуюся эпидемиологическую ситуацию и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия.

Цель работы - разработка и внедрение в практик} эпидемиологического обследования тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

Основные задачи исследования:

1. Разработать тест-систему для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-

ПЦР.

2. Провести апробацию гест-системы на полевом и клиническом материалах.

3 Разработать нормативную документацию к тесг-системе (фармакопейная стагья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

4 Провести Государственные испытания тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ.

5. Сконструировать рекомбинантный положительный контрольный образец к созданной тест-системе

6. Изучить возможность использования ПЦР-анализа при обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ.

Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР \<ГенКонго/>. Чуьс1ви1сиьность тест-системы - 5х103 I Э/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость резулыатов -100% Проведена ее апробация на полевом и клиническом материалах, определена диагностическая ценность в сравнении с ИФА и вирусологическими методами. Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в ходе зпизоотологического обследования природных очагов КГЛ для детекции вируса ККГЛ у основных носителей и переносчиков (клещей родов Нуа1отта, ШирюеркаЫя, ОетгасеШог и др.).

Практическая значимость работы

Проведены Государственные приемочные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР Результаты Государственных испытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. Л А. Тарасевича (протокол № 14 от 19.10.04). Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препарата «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской- Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР» в Российской Федерации и внедрении его в практику здравоохранения (протокол № 5 от 28.07.05).

На тест-систему для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (г. Саратов) депонирован генетически модифицированный штамм Ecoh TGI (pCCHF), на основе которого был сконструирован положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+), используемый при контроле чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства.

ПЦР-тест-система апробирована при обследовании территории Саратовской области с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ, а также при мониторинге природных очагов 1СГЛ в Волгоградской и Астраханской областях.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов».

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, по договорам с ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ПЦР-тсст-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки

и лихорадки Западного Нила. Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила».

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе праймеров Wkgl и Wkg2, фланкирующих фрагмент размером 138 н.п гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента, разработана гест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

2 Разработанная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ характеризуется чувствительностью 5х103 ГЭ/мл, специфичностью - 100 %. воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудителя КГЛ в биологическом материале и объектах внешней среды.

3 На основе рекомбинантной плазмиды pCCHF штамма Е coli TGI (pCCHF) разработан положительный контроль к тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+).

4. ПЦР-анализ может быть использован при эпидемиологическом обследовании территорий с целью изучения циркуляции вируса ККГЛ и для мониторинга природных очагов КГЛ

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000, 2001, 2002, 2004, 2005, 2006 гг.) и на научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» -Астрахань, 2006 г., а также представлены на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций», Саратов, 2000 г; научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посвященной 80 - летию Омского НИИПИ - Омск, 2001.. Юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ. — Ставрополь, 2002.; VIII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2002 г.; 5-ой Всероссийской научно - практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». - Москва, 2004 г..; VI Межгосударственной научно - практической конференции государств - участников

СНГ «Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» - Волгоград, 2005 г.: VII Российском съезде инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». - Нижний Новгород, 2006 г.

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 8 опубликованных научных работах, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, и 4 - в сборниках материалов Международных и Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 110 отечественных и 45 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 114 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 9 таблицами и 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В качестве исследуемого материала использовали 25 вирусных штаммов, относящихся к семействам Togaviridae, Flavmridae Bunyaviridae, Reoviridae и Orth о тух o viridae: вирус Восточного энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Синдбис, 3 штамма вируса Западного Нила, вирус клещевого энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирусы Тягиня, Инко, Неаполитанской и Сицилийской москитных лихорадок, 10 штаммов вируса ККГЛ, вирус Дугбе, Бханджа, Кемерово и Дхори (штаммы вирусов, использованные в работе, были получены из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им Д. И. Ивановского РАМН (г. Москва)), 667 проб клещей 8 видов (Hyalomma marginatum. Hyalloma scupense, Dermacentor marginatus, Dermaccntor reticulatus, Rhipicephalus schulzei, Rhiptcephalus rossicus, Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus), собранных в эндемичных и неэндемичных по КГЛ регионах Российской Федерации, а также суспензии клещей, искусственно инфицированных вирусом ККГЛ, 268 сывороток крови людей с подтвержденным диагнозом «КГЛ>ч и другими заболеваниями вирусной природы.

При исследовании материала использовали вирусологические методы (заражение новорожденных белых мышей), иммуноферментный анализ, направленный на выявление антигенов и ангител классам и G, и ПЦР.

Для выделения РНК вируса ККГЛ из различного материала применяли методы фенол-хлороформовой экстракции и нуклеосорбцию на поверхности силикагеля в присутствии 6М гуанщшнтиоционата.

После выделения РНК проводили реакцию обратной транскрипции с Random-праймерами («Promega», США) Амплификацию осуществляли по следующей программе: предварительная денатурация при 95°С в течение 15 минут: затем 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 94° С в течение 40 секунд: отжиг праймеров при температуре 56° С в течение 40 секунд; синтез комплементарной цепи при температуре 72° С в течение 40 секунд. На заключительном этапе в программу амплификации вводили 1 цикл, который проводили при температуре 72° С в течение 5 минут. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле с этидием бромида

Положительный контрольный образец к тест-системе «ГенКонго» был получен путем клонирования фрагмента ДНК размером 138 нп, гомологичного нуклеотидной последовательности РНК вируса ККГЛ в вектор pGEM-T («Promega», США), с последующей трансформацией штамма Е coli TGI реконструированной плазмидой. Полученный штамм Е coli TGI (pCCHF) содержит рекомбинантную илазмиду pCCHF, которая определяет его устойчивость к ампициллину в концентрации 50 мкг/мл. Штамм депонирован в Государст венной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Определение диагностической ценности сконструированной ПЦР тест-системы осуществляли в процессе Государственных приемочных испытаний на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН г. Москва с участием специалистов лаборатории стандартизации и контроля препарагов против арбовирусных инфекций, риккетсиозов и СПИДа ГИСК им. Л А. Гарасевича. Исследования проводили по программе, утвержденной комитетом медицинских иммунобиологических препаратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для подбора праймеров выбрали наиболее изученную и генетически расшифрованную область РНК вируса ККГЛ - S -сегмент (Benjiang М А et al, 2001). В соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклеотидным затравкам, с

помощью компьютерной базы данных GenBank и компьютерной программы Gen Runner были подобраны праймеры Wkgl и Wkg2, фланкирующие фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав н)клеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента РНК вируса ККГЛ. Используя компьютерную программу VectorNTI 9.0.0, праймеры протестировали на отсутствие внутри - и межпраймерной гомологии.

Чувствительность ПЦР с выбранными праймсрами определяли с использованием разведениий ш гамма IbR 10200 вируса ККГЛ от 10"1 до 10~5 Инфекционный титр данного вируса в опытах предварительного титрования составлял 6 lg ЦПД5о „л, т.е. в 1 мл вирусной суспензии в разведении 10"6 содержалось минимальная доза вируса (условно 1 вирусная Í частица), способная вызывать ЦПД 50 % зараженных клеточных культур. Если принять во внимание то, что одна вирусная частица несет одну копию вирусного генома, использованные в опытах концентрации вируса 10 "8, 10 7, 10 ~б, 10 "5, 10 ~4, 10 "3, 10 "2 ЦГ1Д50/мл соответствуют lxlO7, lxlO6, 1х105, lxlO4. lxlO3, lxIO2, 1x10 (геномэквивалентов (ГЭ)/мл) Положительный результат был зарегистрирован с пробами, содержащими вирус ККГЛ в разведении 10 , что соответствует 1х103 ГЭ/мл.

Специфичность проверяли с препаратами кДНК различных штаммов вируса ККГЛ, выделенных в Таджикистане (штаммы Тадж 8973. 8976, 8966), Узбекистане (Уз 10145), Китае (China Q, Нигерии (IbAr 10200), Конго (ЗОЮ), а также со штаммами гетерологичных вирусов, относящихся к семействам: Flaviviridae и Togaviridae - вирус Западного Нила (штаммы 1628 и 986), вирус клещевого энцефалита (штамм 7555), вирус Синдбис (штамм 574). Положительные результаты ПЦР получены только со штаммами вируса ККГЛ, что свидетельствовало о высокой специфичности праймеров

Полученные данные по специфичности и чувствительности ПЦР с выбранными нами праймерами послужили основанием для их использования при разработке ПЦР-тест-системы.

В последующих экспериментах были оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК. Метод нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата, хорошо зарекомендовавший себя при выделении ДНК из бактериальных клеток, оказался приемлемым и для работы с РНК-содержащим материалом. По сравнению с методом фенол-хлороформовой экстракции этот способ отличается простотой выполнения и меньшим временем выполнения данного этапа

работы. Использование ДНК-полимеразы для горячего старта при постановке ПЦР позволило значительно повысить специфичность реакции В работе также применяли буферы для Тац-полимеразы с различным рН. В ходе исследования наиболее высокая чувствительность была достигнута с 10-кратным буфером, рН которого 8,3.

В соответствии с данными компьютерного анализа расчетная температура отжига праймеров \Vkgl и \Vkg2 составила 56 °С. Отжиг праймеров осуществляли в интервале температур от 50 °С до 60 °С с шагом в 1 °С. Визуально наибольший выход продукта амплификации наблюдали при расчетной температуре. Далее установлено, что при изменении содержания праймеров в рабочей смеси, оптимальной является концентрация 12 пМ/мкл. Программу амплификации определяли эмпирически. Количество циклов изменяли от 30 до 40, продолжительность предварительной денатурации - от 10 до 15 мин. время каждого цикла - от 30 до 60 с. Наилучшие результаты были достигнуты при амплификации по программе, описанной в разделе «Материалы и методы».

Для обеспечения максимальной безопасности при работе с тест-системой разработан положительный контроль, представленный рекомбинантной плазмидой, содержащей специфичный фрагмент кДНК вируса ККГЛ. Использование такого контрольного препарата позволяет исключить вирусологическую часть работы при производстве тест-системы, повышает ее стабильность. На основе полученной рекомбинантной плазмиды рССНГ был разработан стандартный образец предприятия (СОПк+), который применяется для контроля чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства

В результате проделанной работы была разработана тест-система «ГенКонго», состоящая из четырех комплектов: для выделения РНК; для постановки реакции обратной транскрипции, для постановки ПЦР; для электрофоретической детекции продуктов ПЦР Тест-система предназначена для проведения 100 определений, включая контрольные образцы.

Три экспериментально-производственные серии разработанного диагностического препарата лТест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции» были представлены в ГИСК им. Л А Тарасевича для проведения контроля и определения его диагностической ценности.

Разработанную тест-систему оценивали по следующим параметрам'

-чувствительность.

-специфичность;

-продолжительность анализа по времени;

-воспроизводимость результатов;

-стабильность препарата

В качестве препарата сравнения использовали ИФА-тест-систему для определения антигенов вируса ККГЛ. разработанную в лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д И. Ивановского РАМН.

Контроль серий препарата проводили с использованием положительных контрольных образцов: СОПк+ в концентрациях от 5х102 до 5x10s ГЭ/мл и водного раствора кДНК вируса ККГЛ (штамм IbAr 10200). Отрицательным контролем служили препараты ДНК плаценты человека, суспензия мозга здоровых мышей, суспензия клещей (Н marginatum), не содержащие антигена и РНК вируса ККГЛ.

При лабораторном контроле установили, что аналитическая чувствительность представленных серий препарата с использованием СОПк-1 составляла 5x103 ГЭ/мл и соответствовала заявленным показателям.

Для определения чувствительность ПЦР-анализа с использованием разработанной тест-сиегемой готовили суспензии мозга белых беспородных мышей, инфицированных таджикским штаммом 8973 вируса ККГЛ. В качестве среды разведения использовали сыворотку (плазму) людей, физиологический раствор и суспензию клещей Н marginatum. Тестировали различные разведения вируса ККГЛ от 10"1 до КГ8.

Методом ОТ-ПЦР в тест-системе «ГенКонго» специфический фрагмент кДНК вируса ККГЛ (штамм Тадж 8973) выявлялся при разведении вируса 10"5 и 10"6, в зависимости от среды разведения, что составило 1х102 и lxlO1 ГЭ/мл соответственно. Все пробы, используемые в качестве отрицательных контролей в ПЦР, были негативными.

Результаты исследований приведены в таблице 1

Таблица 1.

Изучение чувствительности тесг-системы «ГенКонго» в сравнении с ИФА. методом биологической пробы в экспериментальных материалах (в расчете на 1 мл вируссодержащей жидкости)

Разведения вируса Инфекционная активность вируса при заражении нбм Выявление антигенов вируса в ИФА Выявление РНК методом ОТ-ПЦР

Используемая среда разведения

фнз. раствор плазма суспензия клещей

10"' - + -t- + -f

ю-2 + + + -г- +

10" + 4 + + +

ю-4 + + л. + +

10"5 + + + + +

10'6 + - -г f +

Ю-' - - - - -

ю8 - - - - -

Примечание- (+)- положительный результат в ПЦР; (-)- отрицательный результат в ПЦР

Для определения специфичности тест-системы использовали ш гаммы ККГЛ, выделенные в различных регионах мира, включая территорию Российской Федерации, а также штаммы гетерологичных вирусов, относящихся к семейс!вам Toga-, Flavi-, Bunya-,

Reo- и Orthomyxoviridae.

Было показано, что тест-система «ГенКонго» выявляет РНК всех штаммов вируса ККГЛ, использованных в данной работе Кроме того, положительный результат был получен с РНК вируса Дугбе (штамм Ar 1792), который, как и вирус ККГЛ, является представителем сем Bunyaviridae рода Nairovirus и имеет с ним антигенное родство (Bridgen A. el. al, 2002) С остальными гетерологичными вирусами получены отрицательные результаты ПЦР (габл. 2).

Для оценки воспроизводимости результатов реакции при применении разработанной тест-системы использовали три отрицательных образца и три пробы, заведомо содержащие РНК вируса ККГЛ (штамм Тадж. 8973) в разведениях 10~3, 104 и 10"5, которые исследовали в десяти повторах. Воспроизводимость результатов составила 100%.

Таблица 2.

Изучение специфичности тест-системы «ГенКонго»

Семейство, род Вирусы, штаммы Год выделения Место выделения Результат ПЦР

Togaviridae Alphavirus Синдбис (Аз 574) 1967 | Азербайджан -

ВЭЛ (230) нет данных нет данных -

17laviviridae Flavivirus Западного Нила (Лет. 901) 2001 Астраханская обл. -

Bunyaviridae Bunyavirus Тягиня (Бардош 92) 1958 Чехословакия -

Инко (KN 364Х) 1984 Финляндия -

Bunyaviridae Phlebovirus Москитной лихорадки, Неаполь (Сэбин) 1944 Италия -

Москитной лихорадки, Сицилия (Сэбин) 1943 Италия -

Bunyaviridae Nairovirus ККГЛ (ЗОЮ) 1956 Конго +

ККГЛ (IbAr 10200) 1966 Нигерия +

ККГЛ (Уз 10145) 1983 Узбекистан +

ККГЛ (Аст 22261) 1990 Астраханская обл. +

ККГЛ (Лет 22265) 1990 Астраханская обл. +

ККГЛ (Тадж.8976) 1990 Таджикистан +

ККГЛ (Тадж.8973) 1990 Таджикистан +

ККГЛ (517) нет данных Болгария +

ККГЛ (С68031 China С) 1968 Китай +

Дугбе (Ar 1792) 1964 Нигерия +

Bunyaviridae Nairovirus комплекс Бханджа Бханджа (Ig 690) 1954 Индия

Reoviridae Orbivirus Кемерово (К-10) 1964 Кемеровская обл. -

Orthomyxoviridae комплекс Тогото Дхори (lg 611313) 1961 Индия

При изучении стабильности ПЦР-тест-системы установлено, чго в условиях низкотемпературного холодильника (минус 20±2 °С) она не снижала свою эффективность в течение 6 месяцев и обеспечивала 100 % воспроизводимость результатов.

На втором этапе испытаний определяли возможность использования ПЦР-тест-системы при исследовании полевого и клинического материала

Бьпи исследованы 34 пула клещей Н marginatum и I. persulcatus (340 экземпляров), собранных на территории эндемичных (32 пула) и неэндемичных (2 пула) по КГЛ областей России.

Из 32 проб -15 были сформированы из клещей вида II marginatum, собранных на территории Астраханской области в 2003 г., а 17 пулов - из клещей Н. marginatum,

доставленных с территории Ростовской области весной 2004 г Эктопаразиты, полученные с территории, неэндемичной по КГЛ, были представлены клещами вида I persulcatus .

Методом ОТ-ПЦР РНК вируса ККГЛ выявлена в 7 (20,6 %) пулах клещей. При исследовании этого же материала методом иммуноферментного анализа специфический антиген обнаружен в 6 пробах (17,6 %) Все положительные в Г1ЦР образцы были положительными в ИФА и сформированы из клещей, собранных на территории Астраханской области

В качестве клинического материала были исследованы 225 сывороток крови, взятых от людей с заболеваниями вирусной природы (СПИД, гепатиты В и С, ВГ1Г, ЦМВ), из которых 10 образцов были иск>сственно контаминированы СОПк^ в концентрации 5х102 ГЭ/мл. В ПЦР с 215 сыворотками был получен отрицательный результат, а в 10 пробах зарегистрирован положительный ответ. Данные эксперимента совпали с материалами по шифрованию проб, что еще раз подтвердило специфичность сконструированной тест-системы.

Для определения возможности использования разработанной ПЦР-тест-системы для диагностики случаев заболевания КГЛ были исследованы сыворотки крови больных с диагнозом «КГЛ», взятые па 2-20 день заболевания. Материал был полечен из Ростовской, Астраханской областей и Ставропольского края.

Сыворотки одновременно тестировались в ПЦР и трех вариантах ИФА (для выявления антигенов, IgM-, IgG-антител). Методом ОТ-Г1ЦР РНК вируса ККГЛ детектирована в 11 образцах (39,3 %). антиген вируса обнаружен в 14 сыворотках (50,0 %), М-антитела выявлены в 11 (64,7 %) из 17 исследованных сыворотках, а G-антитела в 2 (7,7 %) из 26.

Таким образом, бьпо показано, что сконструированная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокую точность анализа и может быть использована при проведении мониторинга природных очагов КГЛ

Отчет о проведенных Государственных приемочных испытаниях рассмотрен на Ученом Совете ГИСК им. Тарасевича (протокол №14 от 19.10.04) и утвержден Комитетом МИБП (протокол №5 от 28.07 05).

Апробацию разработанной ПЦР-тест-системы и изучение возможности использования ПЦР-анализа при мониторинге природных очагов КГЛ проводили при

исследовании материала с эндемичных по КГЛ территорий (Волгоградской и Астраханской областях).

При исследовании методом ОТ-ПЦР 369 экземпляров клещей, собранных на территории Волгоградской области и объединенных в 49 пулов, было выявлено 14 положительных (28,6±6,5 %) проб, содержащих РНК вируса ККГЛ Тестирование этого же материала в ИФА позволило в 11 образцах выявить антиген вируса ККГЛ (22,4±6,0 %). Всего при использовании ПЦР и ИФА было выявлено 17 (34,7%) позитивных проб. Антиген и РНК одновременно были обнаружены в 8 образцах (16,3 % от общего количества проб) В 3 случаях (6,2 %) был выявлен только антиген, а в 6 (12,5 %) - только РНК вируса. Все положительные пробы были представлены только клещами Н. marginatum.

В материале от клещей, полученном из Астраханской области, в 5 (1,9±0,8 %) пробах методом ИФА был выявлен антиген вируса ККГЛ. Такое же количество положительных проб было получено и в ОТ-ПЦР. При этом совпадение результатов ИФА и ПЦР составило 100 % Маркеры вируса ККГЛ были обнаружены в клещах Н. marginatum.

Таким образом, было показано, что разработанная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокую точность анализа и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ. Однако, для получения наиболее достоверных результатов необходимо использовать оба метода диагностики.

Следующим этапом апробации ПЦР-тест-сист емы «ГенКонго» было использование этого препарата при лабораторной диагностике КГЛ. Методами ОТ-ПЦР с тест-системой «ГенКонго» и ИФА с тест-системой для выявления антигена вируса ККГЛ (производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) исследовали сыворотки крови людей, полученные из детского отделения Астраханской областной клинической больницы.

Всего было исследовано 12 сывороток крови больных с подозрением на арбовирусные инфекции, собранные в 2000 г. и 3 сыворотки крови людей с диагнозом «КГЛ», заболевших весной-летом 2003 г. Забор клинического материала осуществлялся на 3-8 дни 01 начала болезни.

При исследовании 12 сывороток крови от больных в ИФА и в ОТ-ПЦР были получены отрицательные результаты. Тестирование в ПЦР сывороток крови больных,

собранных в 2003 г., показало наличие вирусной РНК во всех трех образцах. Эти же пробы были положительными и в ИФА.

Таким образом, была подтверждена диагностическая ценность ПЦР при исследовании сывороток крови, людей с подозрением на КГЛ

В дальнейшем была изучена возможность использования разработанной тест-системы для выявления циркуляции вируса ККГЛ, когда при обследовании территории Саратовской области, наряду с методом ИФА, нами был апробирован ПЦР-анализ с использованием тест-системы <>ГенКонго» при исследовании суспензий клешей. В разных районах Саратовской области было собрано 2890 экземпляров иксодовых клещей, которых объединили в 316 проб. Клещей исследовали методами ИФА (тест-система производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН г. Москва) и ОТ-ПЦР (тест-система «ГенКонго»). Вирусный антиген был выявлен в 13 (4,1 %) случаях, а РНК вируса ККГЛ - в 12 (3,8 %) И антиген, и РНК вируса ККГЛ одновременно были обнаружены в 10 (3,8±1,2 %) пробах. В 2 (0,8±0.6 %) пробах была детектирована только вирусная РНК. Все результаты ИФА были подтверждены в ПЦР. Всего обоими методами было выявлено 15 (5,7+1,4 %) положительных результатов. Наиболее зараженными вирусом ККГЛ оказались клещи О таг^таШв и КИ хсИиЬа.

Таким образом, в результате проведенной работы на основе предложенных нами праймеров была сконструирована тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР «ГенКонго», которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью Показана ее эффективность при исследовании полевого и клинического материала. Разработанная тест-система может быть использована при мониторинге природных очагов КГЛ и при изучении ареала вируса ККГЛ.

ВЫВОДЫ

1. На основе праймеров \Vkgl и \Vkg2 сконструирована тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго». Оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность реакции при детекции РНК вируса ККГЛ.

2. Разработана нормативная документация на тест-систему для выявления РНК вируса Крымской - Конго геморрагической лихорадки методом ОТ - ПЦР' фармакопейная

статья предприятия, экспериментально-производственный регламент и инструкция по применению. Получен паспорт на сконструированный стандартный образец предприятия (СОПкД

3. Проведенные Государственные комиссионные испытания подтвердили диагносшческую ценность тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ — ПЦР: чувствительность 5x103 ГЭ/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов - 100 % при исследовании штаммов вируса, а также инфицированного материала и проб, доставленных с эндемичных по КГЛ территорий Предложенная тест-система сохраняет чувствительность и специфичность в течение 6 месяцев хранения.

4 Показано, что ПЦР - анализ может быть использован при проведении эпидемиологического обследования эндемичных территорий с целью изучения ареалов вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ. Продемонстрирована эффективность разработанной ПЦР-тест-системы при исследовании материала, собранного на территориях Саратовской, Волгоградской и Астраханской областей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаранина С.Б. Рогаткин А.К., Щербакова С.А. Журавлев В.И, Клюева Е.В., Мальков П.М., Путилина Н Г., Куличенко А.Н. Сравнительное изучение эффективности ПЦР-анализа и ИФА при детекции вирусов Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки е полевом и клиническом материале // Матер 1-ой Всероссийск. науч.-практ. конф «Генная диагностика особо опасных инфекций». - Саратов, 2000. - С. 56-57.

2 Клюева Е В., Щербакова С.А., Головинская О Н., Гаранина С.Б., Чекашов В.Н , Попова Э.З , Попов Н В., Куктев Е.В., Куличенко А.Н. Изучение циркуляции некоторых арбовирусов на территории Саратовской области// Научно-праюгич. конф «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посвящ. 80-летию Омского Г1ИИПИ. - Омск, 2001. -С.39-40

3. Клюева Е.В., Шарова И.Н., Щербакова С.А., Добло А.Д., Чекашов В.Н., Удовиков А.И., Слудский А А, Дмитриева J1.H , Ерофеев А В., Пристанский Р.В., Коломеец В.В., Куличенко А.Н. Изучение зараженности клещей вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки, собранных на территории Саратовской, Волгоградской и Ростовской областей'/ Матер Юбилейной научно-практич конф. «Эпидем. безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвящ. 50-летию Ставропольского НИГ1ЧИ. -

Ставрополь, 2002. - С 125-126

4 Клюева Е..В , Щсрбакоьа С.А.. Головинская О Н . Гаранина С.Б , Савицкая Л В . Чекашов В.Н . Слудский A.A.. Удовиков АИ, Князева Г.В., Колнобрицкая О.А, Попов Н.В., К>клев Е.В, Куличенко АН Изучение циркуляции вирусов Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки в южных районах Саратовской области// Материалы VIII сьезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М , 2002 . - С 336-337.

5. Манзенкж И.Н.. Карань Л.С., Шарова И Н, Клюева Е В.. Хуторсцкая Н.В , Саркисян К.А., Ладыженская И П., Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Куличенко А.Н, Ларичев В Ф . Воробьева М.С., Б>тенко AMO результатх клинических испытаний ПЦР-тест-систем, используемых в диагностике Крымской-Кошо геморрагической лихорадки// Мат. 5-й Всеросс. науч.-практ. конф. (-'Генодиагностика инфекционных болезней)'' - М., 2004. -Т I -С. 336-340.

6. Найденова Е В., Шарова И Н., Щербакова С.Д., Яшечкин К).И., Куличенко А Н. Разработка и апробация ПЦР-тес(-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР// Мат. VI Мех;государ науч.-практ конф. Государств - у част СНГ «Санитарная охрана территорий юсударств участников содружества независимых государств' проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». - Волгоград, 2005. - С. 270271.

7 Найденова Е.В., Шарова И.Н , Щербакова С.А., Яшечкин Ю И . Ларичев В Ф , Воробьева М С , Б>тенко А М , Куличенко АН , Львов Д.К , Кутырев В В Тест-система для выявления РНК вируса Крымсксй-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР// Пробл особо опасн. пнф. 2006 - Вын 2 (92), - С. 54-56.

8. Найденова Е.В , Яшечкин Ю.И.. Щербакова С.А., Шарова И Н , Куличенко А И. Конструирование положительного контрольного обраща к тест-системе для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР// Мат. VII съезда врачей- инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». - Н.Новгород, 2006. -С 169-170.

Подписано к печати 12.04.07 г. Объем - 1 печатный лист. Тираж 110. Заказ № 189 Отпечатано в типографии Техно-Декор 410012, г.Саратов, ул. Московская 160.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Найденова, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

1.2. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирусные штаммы, используемые в работе

2.2. Сбор, учет, хранение и доставка полевого материала 33 2.2.1. Сбор доставка и хранение проб клещей

2.3. Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей

2.4. Исследование материала методом ИФА

2.4.1. Подготовка проб для исследований

2.4.2. ИФА на выявление вирусных антигенов

2.5. Исследование материала с помощью полимеразной цепной реакции

2.5.1. Подготовка проб для исследований

2.5.2. Проведение ПЦР

2.5.3. Получение рекомбинантного положительного контрольного образца

2.6. Методы статистической обработки результатов

Глава 3. СОЗДАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР

ЗЛ. Выбор олигонуклеотидных праймеров на основе анализа генома вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

3.2. Разработка оптимальных условий ПЦР

3.3. Разработка схемы подготовки проб для ОТ-ПЦР

3.4. Создание положительного контрольного образца

3.5. Характеристика тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

4.1. Программа комиссионных испытаний

4.2. Лабораторных контроль серий препарата и исследование вирусных штаммов и материала, искусственно инфицированного вирусом ККГЛ

4.3. Обследование полевого материала

4.4. Исследование сывороток крови больных КГЛ

4.5. Оценка тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР

Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР ПРИ

МОНИТОРИНГЕ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КГЛ

5.1. Апробация тест-системы в ходе мониторинга природных очагов КГЛ

5.2. Использование тест-системы для изучения циркуляции вируса ККГЛ 79 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84 ВЫВОДЫ 88 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ гэ - геномэквивалент

БСА - бычий сывороточный альбумин

Вирус ККГЛ - вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки ттг 1ПТЛ 1 yiv^iv - Государственный инс 1 и 1 у 1 сшндар шпации и контроля медицинских биологических препаратов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК -комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидфосфат

ИФА - иммуноферментный анализ

КГЛ - Крымская геморрагическая лихорадка

КРС - крупный рогатый скот

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

РА - реакция агглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РНГА - реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота нбм - новорожденные белые мыши н.о. - нуклеотидные основания

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА буфер

Трис - (гидроксиметил) аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетроуксусной кислоты натриевая соль

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции"

Актуальность проблемы. В Российской Федерации в последние годы отмечается ухудшение эпидемиологической ситуации по арбовирусным природно-очаговым инфекциям, что обусловлено резкой активизацией эпизоотического процесса в природных очагах, вторжением человека в неосвоенные или малоосвоенные регионы, а также уровнем организации и эффективности эпидемиологического надзора (Онищенко Г.Г. и др., 2000, 2005).

Глубокие экологические трансформации (потепление климата, сокращение лесного фонда и земель сельскохозяйственного назначения, восстановление степных ландшафтов в Северо-Западном Прикаспии и т.д.), наблюдавшиеся в течение последних лет на юге России, в том числе в регионе Нижнего Поволжья, привели к изменению видового состава и удельного веса отдельных носителей и переносчиков арбовирусов (Платонов А.Е., 2006). Это послужило предпосылкой для расширения ареала возбудителей ряда арбовирусных инфекций и формирования новых природных очагов. При этом произошло особенно резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке (КГЛ). Возникновение вспышек этого заболевания в 1999-2006 гг. было отмечено не только на эндемичных территориях, но и в тех районах, где циркуляция вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) ранее не наблюдалась (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Ингушетия, Дагестан) (Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., 2004, Онищенко Г.Г. и др., 2005). За эти годы на юге европейской части России (в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском крае и других регионах) было зарегистрировано 769 случаев заболеваний людей КГЛ. Высокая летальность, тяжелое клиническое течение, социальная значимость болезни определяют необходимость совершенствования методов ее лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов КГЛ.

В настоящее время для лабораторной диагностики КГЛ используются методы, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющие проводить анализ большого количества образцов за непродолжительное время (Карань Л.С. и др., 2003, Смирнова С.Е., 2003). В первую очередь это различные модификации ИФА. Существенным недостатком ИФА является необходимость исследования парных сывороток крови взятых у больного в динамике заболевания, что значительно снижает диагностическую ценность метода. Кроме этого, чувствительность и специфичность ИФА ниже, чем методов генодиагностики, и, в частности, ПЦР. Создание и практическое внедрение ПЦР-тест-системы, предназначенной для выявления РНК вируса ККГЛ, будет способствовать решению многих актуальных задач - быстрой постановке предварительного диагноза, эффективной детекции возбудителей в биологическом материале и объектах внешней среды, что позволит адекватно оценить сложившуюся эпидемиологическую ситуацию и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия.

Цель работы - разработка и внедрение в практику эпидемиологического обследования тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

Основные задачи исследования:

1. Разработать тест-систему для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

2. Провести апробацию тест-системы на полевом и клиническом материалах.

3. Разработать нормативную документацию к тест-системе (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

4. Провести Государственные испытания тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ.

5. Сконструировать рекомбинантный положительный контрольный образец к созданной тест-системе.

6. Изучить возможность использования ПЦР-анализа при обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ.

Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР «ГенКонго». Чувствительность тест-системы 5x103 ГЭ/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов -100%. Проведена ее апробация на полевом и клиническом материалах, определена диагностическая ценность в сравнении с ИФА и вирусологическими методами. Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в ходе эпизоотологического обследования природных очагов КГЛ для детекции вируса ККГЛ у основных носителей и переносчиков (клещей родов Hyalomma, Rhipicephalus, Dermacentor и др.).

Практическая значимость работы

Проведены Государственные приемочные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР. Результаты Государственных испытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол № 14 от 19.10.04). Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препарата «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской- Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР» в Российской Федерации и внедрении его в практику здравоохранения (протокол № 5 от 28.07.05).

На тест-систему для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (г. Саратов) депонирован генетически модифицированный штамм E.coli TGI (pCCHF), на основе которого был сконструирован положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+), используемый при контроле чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства.

ПЦР-тест-система апробирована при обследовании территории Саратовской области с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ, а также при мониторинге природных очагов КГЛ в Волгоградской и Астраханской областях.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов».

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, по договорам с ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ПЦР-тест-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила. Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила».

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе праймеров Wkgl и Wkg2, фланкирующих фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

2. Разработанная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ характеризуется чувствительностью 5х103 ГЭ/мл, специфичностью - 100 %, воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудителя КГЛ в биологическом материале и объектах внешней среды.

3. На основе рекомбинантной плазмиды pCCHF штамма Е. coli TGI (pCCHF) разработан положительный контроль к тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+).

4. ПЦР-анализ может быть использован при эпидемиологическом обследовании территорий с целью изучения ареалов вируса ККГЛ и для мониторинга природных очагов КГЛ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных

1. - - - ТЛ . Т ТТ ГТ-ГТТТ Ж 1 f ^ /П ЛАПЛ ЛЛЛ1 лллл ллл л научных конференциях гишшпи «микрии» (^apaiuts, zuuu, zuui, zvvz, zuut, 2005, 2006 гг.) и на научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» - Астрахань, 2006 г., а также представлены на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций», Саратов, 2000 г.; научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посвященной 80 - летаю Омского НИИПИ.- Омск, 2001.; Юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ. - Ставрополь, 2002.; VIII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2002 г.; 5-ой Всероссийской научно - практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». - Москва, 2004 г.; VI Межгосударственной научно - практической конференции государств -участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». - Волгоград, 2005 г.; VII Российском съезде инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». - Нижний Новгород, 2006 г.

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 8 опубликованных научных работах, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 4 - в сборниках материалов Международных и Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 110 отечественных и 45 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 112 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 9 таблицами и 8 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Найденова, Екатерина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. На основе праймеров Wkgl и Wkg2 сконструирована тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго». Оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность реакции при детекции РНК вируса ККГЛ.

2. Разработана нормативная документация на тест-систему для выявления РНК вируса Крымской - Конго геморрагической лихорадки методом ОТ - ПЦР: фармакопейная статья предприятия, экспериментально-производственный регламент и инструкция по применению. Получен паспорт на сконструированный стандартный образец предприятия (СОПк+).

3. Проведенные Государственные комиссионные испытания подтвердили диагностическую ценность тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом л

ОТ - ПЦР: чувствительность 5x10 ГЭ/мл, специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов - 100 % при исследовании штаммов вируса, а также инфицированного материала и проб, доставленных с эндемичных по КГЛ территорий. Предложенная тест-система сохраняет чувствительность и специфичность в течение 6 месяцев хранения.

4. Показано, что ПЦР - анализ может быть использован при проведении эпидемиологического обследования эндемичных территорий с целью изучения циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ. Продемонстрирована эффективность разработанной ПЦР-тест-системы при исследовании материала, собранного на территориях Саратовской, Волгоградской и Астраханской областей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из актуальных направлений современной вирусологии в последние годы является изучение возникающих и вновь возвращающихся вирусных инфекций человека (emerging infection diseases). Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) -это острое вирусное природноочаговое лихорадочное заболевание человека, характеризующееся общей интоксикацией, наличием выраженного геморрагического синдрома и высокой летальностью - от 10 до 50% (в зависимости от пути передачи возбудителя).

Активизация природных очагов КГЛ (Ставропольский край, Ростовская и Астраханская области), распространение инфекции на новые территории (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Дагестан и Ингушетия) (Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., 2004, Онищенко Г.Г., 2005) определяют необходимость разработки высокочувствительных и специфичных средств лабораторной диагностики данного заболевания.

В последнее время для выявления вирусных геномов наиболее широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вирусов в клиническом материале в первые дни болезни, когда, по причине отсутствия специфических антител, серологические методы диагностики оказываются не достоверными. Доказана эффективность ПЦР для выявления РНК вируса в полевом материале и идентификации выделенных вирусных штаммов.

С помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0.0. и алгоритма BLAST на основе нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса ККГЛ, представленных в базе данных GenBank и в соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклеотидным затравкам, были выбраны праймеры Wkgl и

Wkg2, фланкирующие фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента РНК вируса ККГЛ. На основе этих праймеров была разработана ПЦР-тест-система «ГенКонго» для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), проведена оценка ее чувствительности, специфичности и воспроизводимое ш, оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК.

Для обеспечения максимальной безопасности при работе с тест-системой был разработан положительный контроль, представленный рекомбинантной плазмидой, содержащей специфичный фрагмент кДНК вируса ККГЛ. Использование такого контрольного препарата позволяет исключить вирусологическую часть работы при производстве тест-системы и повышает ее стабильность при хранении.

На основе полученной рекомбинантной плазмиды pCCHF был разработан стандартный образец предприятия (СОПк+), который применяется для контроля чувствительности и специфичности выпускаемого диагностического препарата в условиях производства.

Полученный генетически модифицированный штамм Е. coli TGI (pCCHF) депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Таким образом, в результате работы была предложена «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго», состоящая из 4 комплектов реагентов: для выделения РНК; для постановки реакции обратной транскрипции; для постановки ПЦР; для проведения электрофоретической детекции продуктов ПЦР.

Для определения диагностической ценности тест-системы были проведены Государственные приемочные испытания.

Оценку разработанной тест-системы осуществляли по следующим параметрам: -чувствительность (минимальное количество геномэквивалентов (ГЭ) вируса ККГЛ, выявляемых в ПЦР с помощью испытуемой тест-системы);

-специфичность (процент (%) неспецифических реакций при исследовании проб искусственно контаминированных гетерологичными штаммами);

-продолжительность анализа по времени (в часах, с учетом всех этапов подготовки);

- воспроизводимость (процент (%) совпадений результатов, полученных при постановке анализа с 10 положительными и 10 отрицательными пробами, приготовленными в разное время и разными исполнителями).

В связи с тем, что в качестве исследуемого материала в работе предполагалось использование вирусов, относящихся ко II группе патогенности, Государственные испытания и лабораторный контроль серий представленной тест-системы объединили и провели на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН.

В ходе Государственных испытаний была установлена высокая чувствительность

5x10 ГЭ/мл и специфичность препарата, что послужило основанием для рекомендаций Комитета МИБП внедрить тест-систему в практику здравоохранения и ее сертификацию.

В ходе ряда экспериментов было показано, что разработанная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокий уровень диагностических исследований и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ.

Отчет о проведенных Государственных приемочных испытаниях рассмотрен на Ученом Совете ГйСК им. Тарасевича (протокол jNVi4 от 19.10.04) и утвержден Комитетом МИБП (протокол №5 от 28.07.05).

В результате проделанной работы доказано, что одним из преимуществ тест-системы по сравнению с вирусологическими методами является скорость получения результатов при исследовании вируссодержащего материала. Продолжительность ПЦР-анализа составила 6 часов при работе с вирусными штаммами и 10 часов для проб биологического материала.

Диагностическую ценность тест-системы «ГенКонго» определяли при исследовании полевого и клинического материала, собранного на территории Астраханской и Волгоградской областей, эндемичных по КГЛ, а также в южных районах Саратовской области.

Полученные в результате этой работы данные указывают, что сконструированная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ обладает высокой надежностью, специфичностью и чувствительностью. Установлена целесообразность использования генодиагностического препарата «ГенКонго» на практике, в качестве эффективного теста при проведении эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Найденова, Екатерина Владимировна, Саратов

1. Аристова В.А., Колобухина Л.В. Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Экология вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки и особенности ее клиники на территории России и сопредельных стран Текст.// Вопр. вирусологии 2001 -№4-С. 7-15.

2. Асваров Б.М. Совершенствование эпиднадзора по арбовирусным инфекциям в Республике Дагестан Текст.// ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). -С.62-64.

3. Атшабар Б.Б., Айкимбаев A.M., Матаков М.И. Экологические аспекты существования эндемии Конго-Крымской геморрагической лихорадки на юге республики Казахстан Текст.// Пробл. особо опасн, инфекций. Саратов, 2002. -Вып. 84.-С.48-53.

4. Беклемишев В.Н. К изучению зараженности клещей переносчиков энцефалита методом биопробы Текст.// Вопр. вирусол. - 1963. - №2. - С. 240243.

5. Бутенко A.M. Материалы по изучению этиологии, лабораторной диагностики и иммунологии КГЛ: вопросы экологии вируса возбудителя Текст. Автореф. дис. докт. биол. наук.- М. 1970 г., 24 с.

6. Бутенко A.M. Циркуляция арбовирусов в Республике Гвинея Текст.// Мед. паразитол. 1996. - №2. - С. 40-45.

7. Бутенко A.M., Лещинская Е.В., Львов Д.К. Крымская геморрагическая лихорадка. Текст.// Вестник РАЕН.-2002.-№ 2.- С.41-49.

8. Василенко Н.Ф. Изучение распространения возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в отдельных регионах юга России Текст.// ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). - С. 23-27.

9. Василенко Н.Ф. Опыт применения ИФА и ОТ-ПЦР в диагностике Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 2002 г. Текст.// ЖМЭИ. 2005. 4 (приложение). -С.90-93.

10. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Вышемирский О.И., Марков В.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П. Лабораторная диагностика вспышки Крымской геморрагической лихорадки на юге России Текст.// ЖМЭИ. 2001. - №6 (приложение). - С.95-97.

11. Водяницкая С.Ю. Крымская геморрагическая лихорадка в современный период (на примере Ростовской области) Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук: Саратов, 2005 г., 26 с.

12. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов вируса ККГЛ с помощью моноканальных антител Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук., Москва, 1993 г., 22 с.

13. Галимзянов Х.М., Малеев В.В., Черенов И.В., Аршба Т.Е., Черенова Л.П. Дифференциальная диагностика Крымской геморрагической лихорадки иастраханской риккетсиозной лихорадки Текст.// Инфекционные болезни 2006 -т. 14. - №1 - с.67-70.

14. Галкина И.В. Распространение арбовирусов в Поволжье Текст. Автореф. дис. . канд. мед. наук, Москва, 1991г., 23 с.

15. Гмыль Л.В. Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки Текст. Автореф. дис. . канд. биол. наук, Москва 2003 г., 23 с.

16. Давидович В.Ф. Экологические факторы природной очаговости туляремии в Саратовской области Текст. Автореф. дис. . канд. биол. наук, Саратов, 1968., 25 с.

17. Денисов А.А., Савченко С.Т., Лазоренко В.В., Лобанов А.Н., Фролова Г.И., Фролов А.Ю., Русакова Н.В. Носители и переносчики Крымской геморрагической лихорадки в Волгоградской области Текст. // ЖМЭИ. 2005. -№ 4 (приложение). - С. 119 - 121.

18. Евченко Ю.М., Григорьев М.П., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И., Бейер

19. Евченко Ю.М., Львов Д.Л., Сысолятина Г.В., Громашевский В.Л., Ефременко

20. Еременко Е.И., Афанасьев Е.Н., Солодовников Б.В., Василенко Н.Ф. Диагностика методом ОТ-ПЦР Крымской геморрагической лихорадки в

21. Г-У --------- ------ Л Л А1 1ПЛ1 ГТли лтлл/Г^Т/Г лллс \Г™ Лшьршшлыжим крас в xuui-^uu^ и. licavij// /ivm^i. — ^kjvj. -г