Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ антигенной структуры штаммов вируса крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Анализ антигенной структуры штаммов вируса крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител"

РГ6 од

и И^ад,СКАЯ ЛКАДЕЛШЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК I ',!'ЧпОГб11РУСОЛОГИИ ИЛ\ЕНИ Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

В Ы III Е М И Р С к и И

Олег Иванович

анализ антигенной структуры штаммов вируса крымской-конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител

03.00.06 — вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Таджикском НИИ эпидемиологии и гигиены МЗ Таджикистана.

Научный руководитель

Почетный академик АЕН РФ, заслуженный деятель науки России, профессор, доктор медицинских наук

С. Я. Гайдамович.

Официальные оппоненты:

академик РАМН М. П. Чумаков,

профессор, доктор медицинских наук Н. В. Логинова.

Ведущая организация — Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича МЗ России.

Защита состоится « » . . 1993 года

и « » часов на заседании специализированного совета (Д.001.20.02) при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16.

Автореферат разослан « Р/. » . 1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета канд. мед. наук, ст. н. с.

А. М. Жуковский

Актуальность работа. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка -остров вирусное природно-очаговое заболевание человека с высокой степенью летальности. Вирусная этиология заболевания была установлена М.П.Чумаковым при изучении в 1944-1945 гг. в Крыму вспышки новой для науки геморрагической клещевой лихорадки.

В 1967 г. штаммы вируса крымской геморрагической лихорадки чЛ'Л) были ввделены из крови больных КГЛ (Чумаков М.П., Бутенко A.M. и соавторы 1968 г.). В 1969 г. доктор CasaCs J. обнаружил единство вируса КГЛ и вируса Конго, выделенного в 1956 г. в Заире из крови больного ребенка, на основании чего М.П.Чумаковым было предложено, а позднее и принято, общее международное название "вирус КГЛ-Конго? Дальнейшие исследования позволили отнести возбудитель КГЛ-Конго к семейству Bunyavmdae роду NanovizaS.

До настоящего времени антигенные варианты вируса КГЛ-Конго не бы ли обнаружены, хотя сегментированность генома представителей семейства ?unya.vit idae не исключает высокую вариабильность штаммов. Возможной причиной ятого являлось отсутствие адекватных методов изучения антигенной структуры. Новые возможности в изучении фундаментальных свойств вирусов открывают моноклональные антитела (МКА) и высоко -чувствительные и специфичные методы, такие как иммуно^арментный анализ (ИФА) и лантанвдныЯ имцунофлюоресцентный анализ Ш№.\).

Широкое географическое распространение i высокая опасность заболевания для человека делают более глубокое изучение свойств вируса КГЛ-Конго актуальным как в плане получения новых данных гб антигенной структуре, дифференциаци" штаммов, так и в плане усовершенствования лабораторной диагностики. Изучение антигенной структуры штаммов ввдится нам важным также и в плане изучения экологии вируса КГЛ-Koi. о, отбора наиболее перспективных штаммов для производства диаг-ностихумов и вакцин.

Цель и задачи исследования; Целью m тоящей работы /шлялось изучение антигенной структуры штаммов вируса КГЛ-Конго и сопоршенствова-ние лабораторной диагностики на основе чоноклоналышх антител.

Для выполнения намеченной программы требовалось решение еле,дую-

щих задач:

I. Выделение новых штаммов вируса КГЛ-Конго на территории Таджикистана от источников природы и от больных, изучение их биологических свойств.

2; Анализ антигенной структуры коллекционных штаммов с помощью моноклональных и поликлональных антител методами иммунофлпоресценци! имыуноферментного анализа, лантанедного имцунофлюоресцентного анализа и иммуноблотинга.

3. Получение новых высокочувствительных и специфичных диагност] ческих тест-систем на основе применения моноклональных антител и да] танидного иммунофлюоресцентного анализа для выявления антигенов вир; са КГЛ-Конго.

Научная новизна работы.

1. Пополнена научная коллекция вирусов оригинальными штаммами вируса КГЛ-Конго, выделенными в Таджикистане.

2. Впервые использованы моноклональные антитела, индуцировании к штамму КГЛ-Конго УЗ 10145, для изучения антигенной структуры азиа ских, европейских и африканских штаммов вируса. Впервые с помощью М типа Н.31.12 к вирусу Дугбе показано наличие общего эпнтопа на белк

У вирусов Дугбе и КГЛ-Ко^о.

3. Выявлено не менее двух антигенных вариантов вируса КГЛ-Конг

4. Впервые показана высокая чувствительность и специфичность метода ЛИФА для выявления антигенов вируса КГЛ-Конго.

Практическая ценность.

1. В Государственную коллекцию вирусов НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН депонированы семь оригинальных штаммов вируса КГЛ-Конго. Депонированные штаммы используются для получения диагностику мор в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН и в Таджикском НИИ эя демиологии и гигиены МЗ Таджикистана.

2. На уровне лабораторных разработок получена новая зысокочувс вительная тест-система на основе метода ЛИФА для выявления антигене вируса КГЛ-Конго.

Основные положения выносимые на защиту.

1. С покощьс ионоклонгльных антител к штампу УЗ I0I45 выявлено не менее двух антигенных вариантов вируса КГЛ-Конго.

2. ЛИФА тест-система Hti основе ыоноклональных и поликлоналышх антител для выявления антигенов вируса KTJ!-Конго более чем на порядок чувствительнее аналогичных ИФА тест-систем. Метод ЛИФА является перспективный в плане усовершенствования лабораторной диагностики Крым-ской-Конго геморрагической лихорадки.

Апробация работы. Апробация работы состоялась на засег^нии Апро-бационного Совета НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН 3 февраля 1993 года. Материалы работы доложены на Всесоюзной конференции по яр-бовярусным инфекциям в Москве, май 1991 года; на конференции молодых ученых в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского, январь 1991 г.

Публикации. По теме диссертации опублиновано 2 печатных работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литоратуры, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 181 работу, из которых 40 - отечественных авторов, 141 - зарубежных. Экспериментальные данные иллюстрированы I рисунком я 25 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы

В рабств было использовано 16 штаммов вируса КГЛ-Конго. Штаммы 8966 Тадж, 8973 Тадж, 8975 Тед*, 8976 Тадж, 8978 Тадж, 9102 Тадж,9П2 Tig,;, 9115 Тадж ввделены диссертантом с соаьторами от больных в Таджикистане в I990-I99I гг. Штамм УЗ 10т15 выделен в I9P5 г. от клещей в Узбекистане доктором А.Мелиевым. Штамм ЬА? 10200 и China С любезно предоставлены нам из коллекции вирусов Польского университета (США) доктором fl.E.Shope . Штамм lig 30т0 псяучен из лабора-. jpm музей них штаммов НИИ вирусологии ш.Д.И.Ивановского РАМН. Штамм 1Е1У 22261 и 1Е1У 22463 лг.безно предоставлены В.Л.Громашевскш иэ коллекция чирусов отдела экологии вирусов НИИ вирусологии. Штаммы 517 и 42 выделены доктором С.М.Василенко от больных в Болгарии и получет, из НПО "Вектор" (г.Кольцово, Новосибирской области).

Вцделение штаммов от больных проводилось на 1-3 дневных белых

мышах путем интраперебрального заражения по 0,01 мл цельной крови, взятой в остром периоде болезни, комбинируемого с подкожным введением такого же количества крови. Пассированием добивались сокращения срока инкубационного периода и полной поражаемости мышей-сосунков. Слепых пассажей не провопили. Идентификацию выделенных штаммов проводили с набором эталонных антител в РСК и иммунофлюоресценции.

Из вируссодержащего мозга мышей-сосунков получали антигены штаммов вируса КГЛ-Конго методом сахарозо-ацетоновой экстракции (сахаро-зо-ацетоновый антиген-САА) и методом экстракции трис-буфером (суспензионный антиген)(Е.Э.Мельникова,1986). Получение культурального ан-. тигена штаммов вируса КГЛ-Конго осуществляли путем приготовления лизала зараженной культуры клеток VçïO Eli на трис-буфере.

Иммуноглобулины выделяли из иммунных асцитных жидкостей (ИАЖ) мышей осаждением насыщенным раствором сульфата аммония. Выделение из глобулиновой фракции осуществляли хроматографией на колонке с се-фадексом G -200., а также афинной хроматографией на сорбенте "Протеин А - Сефароза 4В" ( StephönSon J. et а£. 1984). Коныогаты иммуноглобулина с пероксидазой готовил.i методом перийодатного окисления ( N(X-kane Р. 1974) в модификации ( TljSSe.n f? ei. ai. 1984; WlESon M. 1978), а коныогата иммуноглобулинов с ионами европия - по методу Hemmifa I. ( "984 ).

Для изучения антигенной структуры штаммов использовали как поли-клональные и моноклональные антитела серии ГЕМА (ГЕМА 9, ГЕМА 10, ГЕМА 12 и ГШ 24) к вирусу КГЛ-Конго (Гайдамович С.Я. с соавт. ,1989),так и моноклональные антитела к вирусу Дугбе (EC-Ghoïl A. ei a£. 1990).

Анализ антигенной структуры штаммов проводили методами непрямой иммунофлюоресценции (И5) (Свешникова H.A.,1986), иммуноферментного анализа, иммунофлюоресцентного анализа и иммуноблотингом (ИБ) (Tov/-6in H. ei aC. 1979). Для постановки MA и Л*М применяли схему двойных антител "сэндвич" (Лаврова H.A., Наволокин О.В., 1986; Помелова Ь.Г. с соавт., 1992). В качестве твердой фазы использовали отечественны" полистирол^вые 96-луночные планшеты с плоским дном или 12-лу-ночные стрипы.

Определение вирусспецифических антител в сыворотках крови боль-

пых и реконвалесцентов КГЛ-Конго проводили методами РСК и ИИ.Поиси специфических IgG в ИФА проводили методом непрямого "сэндвича", т Ig АЛ - непрямым "перевернутом" вариантом с анти- IgM человека на твердой фазе ( MAC-ELISA ) (Лаврова H.A., Наволокин О.В., IS86).

РЕЗУЛЬТАТЫ И 0БОДЦЛ1ИЕ

В южных районах республики Таджикистан существуют стойкие очаги КГЛ-Конго, где ежегодно регистрируются заболевпния людей нередко име»> дне летальный исход. В 1990-199I гг. выделено 14 штаммов КГЛ-Конго,из которых 8 были включены в исследования по анализу антигенной структуры. Все штаммы выделяли из крови больных, взятой в лихорадочном перио цв. В одном случае (штамм 8975 Тадж) вирус выделили из трупной крови, взятой сразу посла гибели больного.

История выделения штаммов не эависила сгстепени тяжести заболевания, сроков инкубационного периода. Уже на 2-3 пассаже удавалось побить ся полной поражаемости мышей-сосунков.

Штаммы SII2 Тадж и 9115 Тадж изолированы от больных во время вспышки КГЛ-Конго, имевшей место в Шаартузском районе в 1991 году.Люди заразились при убое больной коровы (семь человек), а также некоторые из тех, кто контактировал со свежим мясом этой коровы (два челове ка).

Для расшифровки вспышки в Шаартузском районе был успешно применен метод ИФА как для выявления антигена вируса КГЛ-Конго в '..;анях зараженных мышей, так и специфических антител в сыворотках крови больных. Попытки выявить антиген непосредственно в крови больных не увенчались успехом, что видимо было связано с низким уровнем вирусемии.Поре овый уровень концентрации вируса КГЛ-Конго, улавливаемый И5А, состяв ляет 2,5-3,0 2g Д^50/0 02 мл» ВИДИМ0 4 нашем случае уровень вирусемии у больных в момент взятия крови был менг порогового уровня. Между тем присутствие вируса в крови подтверждено не только выделенном штаммов, но и выявлением антигена в суспензиях мозговой ткани мышеР »сходного заражения на 6-7 день инкубации. Таким образом, сочетанное применение методов биопробы и И5А позволило резко сократить сроки постанови диагноза. Данные по выявлению антител в РСК и определение специфических

loG методом ИФА. в сыворотках крови больных совпадали, однако в ИФА определяемые титры были значительно выше (см.табл.1). Методом MAC" ELISA в сыворотках крови 5 реконвалесцентов выявлены специфические IgM в титрах от 1:2700 до 1:24300. Присутствие вирусспецифических Ig класса М в сыворотках крови, взятой на 12-19 день от начала заболевания, в высоких титрах говорит о долгом циркулировании антител и о возможном более ранном их выявлении. По данным зарубежных авторо IgM к вирусу КГЛ-Конго выявляются уже на 5-7 день болезни, таким об разом, определение Ig класса М может служить еще одним дополнител ным высокочувствительным и специфичным (схема MAC-EUSA исключает ложно-полокительные результаты за счет ревматоидного фактора:) лабора торным методом постановки диагноза КГЛ-Конго.

Таблица I.

Исследование сывороток крови больных на наличие специфических антител к вирусу КГЛ-Конго

Б Инициалы День взятия крови больного от начала болечни

т Гд. Куд. 1 2 сыв. сыв. 6 19

2. Эл. Ис. I сыв. 18

3. Бк. Хк. I сыв. 16

4. Бер.Шом. I сыв. 4

2 сыв. 17

5. Гоз.Сан. 1 2 сыв. сыв. I 12

н.и. - не исследовали

РСК Ш MAC-ELISA

Ig6 IgM

(величина обратная титру разведения)

100 ни*'

40 ' 1600 s 24300

20 400 24300

80 400 24300

- - ни

80 400 2700

_ _ ни

40 800 8100

С цельп усс эршенствования лабораторной диагностики КГЛ-Конго был избран недавно предложенный финским! исследователями ( 5о!Л1 Е.(

Нешгтибй I. 1979) метод ЛИФА. Ранее Российские исследователи (Гяй-даыович С.Я. с соавтор, 1951, Помелова В.Г. с соавтор.,1992) разряд тали на основе метода ЛИФА тест-системы для выявления вирусов комплексов клещевого энцефалита и венесуэльского энцефаломиелита лоаацйй. Показана большая чувствительность и специфичность ЛИФА тест-систом по сравнению с методом ИФА для индикации ь.'леназ ¡пнных вирусов.

В настоящих исследованиях для формировшгия ЛИФА тест-систем пи выявлению антигенов вируса КГЛ-Коцго использовали различные сочетании поликлональных антител из ИАД и МКА Гл.ЧА 12. Как.и ожидалось, нпиболь шую чувствительность анализа обеспечивало применение в кач стве улавливающих антител МКА ГЕМА 12, вместе с тем, вклпченне в состав системы этих же антител в качестве проявляющих не только не повышало чувствительность анализа по сравнению с использованием в качестве индикаторных антител поликлональных а даже снижало. Это, на наш взгляд, объясняется тем, что фиксирование вирусных белков !.!КА Г."1МА 12 дэлае; оставшиеся свободные сайты менее доступными конъюгату пнтиг'зл ГйАА 12. Вариант ЛИФА тест-системы Ги1'.'А 12 - КП;-Конго выявлял суспеи зионные антигены штаммов в титрах от 1:0x10^ до 1:3,2x10°, таким образом, уровень пороговой чувствительности в пврерчсчете ня ЛДг-о/о 02 мл составил около 1,5

При анализе антигенной структуры 16 штаммов вируса ИГЛ-Комго были применены гетоды ИФ, ИФА, ЛИЛА и ИБ. Такое разнообразие методов, на Н8В взгляд, позволяло провести исследования более полно и -чубоко. Использовали как поликлональные и монокломяльные антитела к вирусу КГЛ-Конго, так и Ш к вирус. Дугбе (род Истсллгиг ).

МКА сории ГЬМА полнены авторским коллективом во главе с С.Я. Гайдаыович в лаборатории биологии и индикации арбоьирусов НИИ вирусологии им Л.И,Ивановского РАМН. Учитывая характер ИФ, выявл эмый в цитоплазме инфицированных клеток с поморю МКА серии ТЕМА, отсутствие у них нейтрализующей активности, и то, ч'ю белок Н лрдяет я основным иммуногеном у наировирусов ( ВбаскбиЛП N ё. аР. 19и7; ЕС-бЫт е( а?. 1990), можно предположить, чте УЛСА серии Гл.'М индуцированы против нуклеокапсидного белка N вируса КГЛ-Конго.

Но данным доктора боибй Е. (персональное сообщение) в Н5 К.^А

серии ГЫА (r¿MA 9, ГьМА 10, ГШ 12, ГЕМА 24) не взаимодействовали с внтигенами вирусов из серогруппы КГЛ-Конго (Хазара и Хасан) и представителями других серогрупп рода WaiTOVUUS: Дугбе, Дера-Гхази-Кхан и Кальюб. Этим показано, что эпитопы на белке W к MIÍA серии ГЕМА являются видоспецифичными.

Из всех МКА к вирусу Дугбе, полученных от доктора Gou(?d. Е. в Ш с антигенами вируса КГЛ-Конго взаимодействовали только МКА H.3I.I2, которые индуцированы к белку Gi вируса Дугбе. Индекс нейтрализующей активности этих МКА на мшюх-сосунках по отношению к вирусу КГЛ-Конгс составил 2,4 Cg ЛД50» а титр нейтрализующего разведения по редукции фокусов иммунсфлюоресцинции на культуре клеток - 1:20. Таким образом, показано наличие общего эпитопа на белке Gi у вирусов КГЛ-Конго и Дугбе.

В ИФ поликлональные и моноклональные антитела исследованные штаи мы не дифференцировали. Разброс титров антител был в пределах одного порядка, наибольшей активностью обладали МКА ГЕМА 12.

На первом этапе исследований методом И8А проводили выявление тт ров CAA штакмов УЗ I0I45, 42 и ЗОЮ. В качестве улавливающих антител, сорбированных на твердую фазу, использовали МКА ГЕМА 9, ГЬМА 10, ГЕМА 12, Г£АА 24 и поликлональные антитела из ЯШ ( ) к штаммам УЗ 1014 и ЗОЮ. В качестве индикаторных антител, кэньюгированных с пероксида-зой хрена, применяли поликлональные антитела из ИАЖ и МКА типов ГЕМА и i'iii.lA 12.

Во всех вариантах тест-систем, в которых проявляющими антителами были поликлональные антитела и МКА ГЕМА 9 разница в титрах антигенов Сила невысокой и не аависила от вида антител на подложке. В этих тест системах штаммы не отличались по титрам СМ.

Иные результаты были получены в вариантах тест-систем, в которых проявляющими антителами были ГИДА 12. В этэм случае обнаруживалась четкая дифференциация штаммов УЗ I0I45 и 42 от штамма ILg ЗОЮ по титрам антигенов независимо от- вида антител на подложке; титры CAA штамме Ug ЗОЮ не превышали 1:10, тогда как титры CAA шт. УЗ 10145 и 42 оставались высокими и не отличались от величины титров в вариантах си стем с проявляющим поликлональными и моноклональными антителами

ГЕМА 9.

Для дальнейших исследований было отобрано два варианта ИФА тест систем. В первой тест-системе в качестве улавливающих антител исполь зовали МКА ШЛА 12, а в качестве проявляющих - поликлональные антите ла из ИАЖ, конъюгированные с пероксидаэой хрена. Условное обозначении этой системы: ГЕМА - КГЛХ. Во втором, дифференцирующем, варианте в качестве улавливающих антител использовали поликлональные антитела иэ ИМ, а в качество проявляющих - МКА типа ГИЛА 12. Условное обозначен!* этого варианта системы: КГЛ-П2МЛ*. Возможно было предположить, что дифференциация штаммов по титрам CAA происходит из-за искусственно ня веденных различий в структуре антигенов во время сахарозо-ацетоновой экстракции. Поэтому на следующем отапе проводили анализ 16 штаммов в двух системах (КГЛ-ГЕМАХ и ГЕМА-КГЛХ) не только по CAA, но и суспензионным, и культуральным антигенам. В исследованиях применяли две серии культуральных и суспензионных антигенов и одну серию CAA. Кажпчт серия исследовалась в двух повторениях опытов.

Вариант ИФА тест-системы ГЕМА-КГЛХ не отличал исследованные 16 штаммов по титрам всех видов антигенов (данные представлены в табл.21 Колебания титров по каждому виду антигенов были незначительными.

Дифференцирующий вариант ИФА тест-системы КГЛ-ГЕМАХ по титрам CAA, культальных и суспензионных антигенов позволил выделить две группы штаммов. В первую грушу определили штаммы из Узбекистана (УЗ I0I45), Китая (China С ), Таджикистана (8966, ЭЭ73, 8975, 8976,8978, 9102, 9112, 9115 Тадж), Болгарии (42 и 517) и Астраханской области России (Í.FIV 22261 и 1EIV 22463). Штаммы этой группы имели высокие титры всех видов антигенов с незначительными колебаниями. Во вторую группу были отнесены африканские штаммы IbÁt 10200 и llg ЗОЮ. Штаммы второй группы резко отличались по титрам антигенов от первой группы, титры их антигенов были на порядок меньше (см.табл.2).

Обсуждая проблему дифференциации в ИФА африканских штаммов,предложили, что это происходит за счет следующего явления; фиксация антигенов штаммов Ug ЗОЮ и IbAt 10200 как поликлональными, так и мзтю клональными антителами, вызывает информационные изменения белка М и делает недоступным соответствующий сайт пероксидазному конъпгату

Таблица »2.

АНАЛИЗ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ШТАММОВ ВИРУСА КГЛ-КОНГО МЕТОДОМ ИФА.

ТИТРЫ АНТИГЕНОВ (величина обратная разведению) X 10:

I) СУСПЕНЗИОННЫХ 2) КУЛЬТУРАЛЬНЫХ 3) САА

в системах: в системах: в системах:

ШТАММЫ КГЛ-ГЕМА* ГЕМА-КГЛХ КГЛ-ГЕМА* ГЕМА-КГЛ* КГЛ-ГЕМА* ГШ-КГЛ3

УЗ I0I45 64 128 16 128 256 256

China С 128 128 и и+ н и н и н и

8966 Тадж 64 128 8 16 256 512

8973 Тадж 128 256 16 32 64 256

8975 Тадж 64 128 8 16 н в н и

8976 Тадж 128 • 256 16 32 128 256

FW8 Тадж 128 256 16 . 32 128 256

9102 Твдж 256 512 16 64 н и н в

9112 Тпдж 128 512 16 16 к к н в

9115 Тадж 128 512 16 32 н и н в

42 н и н в 16 32 64 128

517 256 512 16 64 512 512

1Е1У 22261 64 128 8 32 64 256

1Е1У 22463 32 64 16 64 64 128

IbAt 10200 32 128 I 16 н и н в

Ug30I0 I 128 I 16 I 128

+ - не исследовали.

ГЕ.МА 12.

Как уже отмечалось ранее, для создания ЛИФА тест-систем в качества улавливающих и проявляющих антител использовали поликлональные антитела ( lg ) из ИАЖ и МКА ГЕ.МА 12. Из четырех тест-систем были отобраны две, обладающие наибольшей чувствительно; ыо и дифференцирующей способностью. В системе, обладающей наибольшей чувствительностью, в качестве улавливающих антител использовали МКА ГЕМА 12,а в качестве проявляющих - поликлональные антитела из ИАЖ, меченные ионами европия. Условное обозначение этой тест-системы: Г2МА-КГЛХ. Во втором, дифференцирующем, варианте тест-системы в качестве улавливаю щих антител использовали поликлональные антитела из ИАЖ, а проявляющих - МКА ГЕМА 12, меченные ионами европия.

В этих двух вариантах ЛИФА систем проводили антигенный анализ 16 штаммов вируса КГЛ-Конго (данные представлены в табл.3). Для получения более полной картины, по аналогии с методом иммуноферментно-го анализа, использовали CAA, культуральше и суспензионные антигены

Вариант ЛИФА тест-спстеш ГЕМА-КГЛХ выявлял в высоком титре суспензионные антигены всех 16 штаммов. Разброс в титрах этих антигенов был в пределах одного порядка. Величины титров культуральше антигенов были в пределах от 1:1x10^ до 1:4x10^, однако титры культу-ральных антигенов четырех штаммов (ItlV 22261, ШУ 22463, IbAt 10200 и Ug ЗОЮ) выделялись из общего ряда и были на порядок меныпе.

В дифференцирующем варианте ЛИФА системы КГЛ-ГЕМАХ выявлено четкое отличие по титрам культуральных и суспензионных антигенов (они были значительно меньше) штаммов £EIV 22261, LFIV 22463, IbAг 10200 и Ug ЗОЮ.

На основе анализа данных по выявлению различных антигенов в двух вариантах ЛИФА тест-систем исследованные штаммы разделили на две группы. В первую вошли штаммы из Азии и Болгарии, а во вторую -штаммы из Африки и Астраханской области России. Интересно, что отличие штаммов второй группы по культуральным антигенам выявлялось m только в дифференцирующем варианте ЛИФА системы КГЛ-ГЕМАХ, но и в наиболее чувствительном - ГЕМА-КГЛХ. Эти результаты, вероятно, оРКяс

тисллца ira.

АНАЛИЗ АНТИГЕН! ОЙ СТРУКТУРЫ ШТАММОВ ВИРУСА КГЛ-КОНГО МЕТОДОМ ЛИФА.

ТИТРЫ АНтаГЕИОВ ! величина обратная разведению) X 10

I) СУСПЕНЗИОННЫХ 2) КУЛЬТУРАЛЬНЫХ 3) CAA

в системах: в системах: в системах:

ШТАММЫ КГЛ-ГЕМАХ ГЕМА-КГЛХ КГЛ-ГШ* ГЕМА-КГЛХ КГЛ-ГШ* 7Ш-НГЛХ

I0I45 512 8192 64 4096 512 8192

Clima С 256 4096 н и+. н и н и н и

8966 Тадж 512 4096 64 2048 512 8192

8973 Тадж 512 8192 64 4096 128 4096

(W5 Тадж 512 4096 32 1024 н и н и

8976 Тадж 256 8192 32 1024 128 4096

8978 Тадж 256 4096 32 1024 128 2048

9102 Тадж 512 8192 -А 2048 н и н и

9112 Тадж 512 16384 64 2048 н и н и

9115 Тадж 512 16384 64 1024 н и н и

42 н и н и 64 2048 64 4096

517 512 32768 32 2048 256 4096

1Е1У 22261 32 4096 I 128 64 4096

ШУ 22463 32 4096 I 256 64 40%

1ЬДг 10200 16 8192 I 128 н и н и

üg ЗОЮ . I 8192 I 128 I 128

+ - не исследовали.

готся большей чувствительностью метода ЛИФА по сравнению с ИВА и зньшей репликативной активностью штаммов второй группы в культуре четок Vero Е6. Наиболее чувствительней вариант ЛИФА тест-системы гличал так же по титрам CAA штамм (lg ЗОЮ, что скорее всего объяс-иется лабильностью конформационной структуры бел- з вышеназванного гамма, проявившейся при сахарозо-ацетоновой экстракции.

Учитывая, что в данном исследовании метод ЛИФА впервые применен пя выявления антигенов вируса КГЛ-Конго особый интерес представляло равнительное изучение чувствительности методов ЛИФА и ИФА. Вариант ЁМА-КГЛХ метода ЛИФА был в 32-64 раза чувствительнее аналогичного арианта метода ИФА при выявлении суспензионных антигенов; в 4-32 ра а - при выявлении культуральных антигенов; в 16-32 раза - при выяв-ении CAA. !.Непмтнба с соавт. (1986) считают, 4ío одной из причин олее высокой чувствительности ЛИФА по сравнению с ИФК при испольэо-ании поликлональных коньюгатов может являться то, что низкомолекуляр зя метка европием менее, чем ферментная, препятствует связыванию пиите л низкой аффиности с фиксированным антигеном.

При анализе в ИБ антигенной структуры штаммов УЗ I0I45,Ug30I0 9112 Тадж поликлональными антителами из ИМ. выявили взаимодействие пецифических lg только с нуклеокапсидным белком N исследованных тамыов. Аналогичные результаты были получены при изучении иммунного гвата реконвалесцентов К-КГЛ с белками штамма 9112 Тадж, выделенно-d во время . пышки в Таджикистане в 199I году. Сыворотки крови 3 ре-знвалесцентов реагировали только с белком 50-52К С// ). МКА серии 2íA и Н.31.12 не реагировали в ИБ с вирусными белками.

Вероятно, вирусные белки при постановке ИВ претерпевают некотп-ае конформационные изменения. Изменение нативной конформации белкой аще всего происходит при обработке препаратов дитиотреитолом, допр-илсульфатом натрия и при их сорбции на нитроцеллюлозные фильтры.

выводы

1. Создана коллекция из штаммов вируса КГЛ-Конго, выделенных от сильных в Таджикистане, изучены их биологические и антигенные свойства. Семь оригинальных штаммов депонированы в Государственную коллекций вирусов НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

2. Расшифрована вспышка КГЛ-Конго в Шаартузском районе и проведены диагностические исследования спорадичных случаев в других районах Республики Таджикистан с использованием биологических методов исследования, поиска антигена ш VIIго и по накоплению специфических антител о крови у роконвалесцентов.

3. В реакции непрямой иммунофлюоресценции с применением монокло-нильных антител исследованные штаммы не дифференцировались.

4. Анализ антигенной структуры штаммов с помощью МКА ГЕЫА 12 и методов ИМ и ЛИФА дал возможность различить не менее двух антигенных вариантов вируса КГЛ-Конго, к одному из которых отнесли штаммы из Китая (СЫпаС ), Узбекистана (УЗ 1С145), Таджикистана (8966 Тадж,8Э73 Тадк, о Тада, 8976 Тадж, 8978 Тадж, 9102 Тадж, 9112 Тадж, 9115 Тадж) и Болгарии (42 и 517); а " другйму - штаммы из Астраханской области России ( «IV 22261 и 1Ы 22463), Нигерии ( 1ЬАь 10200) и

Заира (а§ ЗОЮ).

5. Разделение исследованных штаммов МКА Г^МА 12 на две группы и отсутствие дифференциации при использовании МКА П£МА 9 свидетельствует о существовании на о^лке вируса КГЛ-Конго не менее двух различных эпитопов.

6. Впервые разработана и предложена высокочувствительная и специфичная тест-система на основе метода лантаницного иммунофлюоресцем него анализа для выявления антигенов вируса КГЛ-Конго. Показано, что метод Л1Ш более чем на порядок чувствительнее метода И5А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вышемирский О.И., Костиков U.A., Гордеева З.Е., Мельникова Е.Э., Свешникова H.A., Гайдамович С.Я./ Выделение и идентификация шести штаммов вируса Крымской геморрагг icitod лихорадки от больных в Таджикистане.// ВИНИТИ, т.27 "Вирусология, М., 1992, с.53-57.

2. Вышемирский О.И., Гордеева З.Е., Булычев В.П. и др./ Вспышка Крымской-Конго геморрагической лихорадки (КГЛ-Конго) в Швартузском районе Таджикистана.// Здравоохранение Таджикистана. - 1992. - № 2. - с.54-56.