Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург"

1 5

На правах рукописи

а

АГАФОНОВ АЛЕКСАНДР ПЕТРОВИЧ

Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург.

03. 00. 06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово,1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Г.М.Игнатьев

Кандидат биологических наук В.Е. Волчков.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Маянский Д.Н. кандидат биологических наук Нечаева Е.А.

Ведущая организация: Институт иммунологии Минздрава РФ,

диссертационного совета Д 074.20.01 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: 633159, Кольцове, Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

г. Москва

Защита состоится " 1996 г. В часов на заседании

Автореферат разослан "20 " #<?* Я_ 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ■ Актуальность проблемы. Геморрагические заболевания вирусной этиологии играют значительную роль э инфекционной патологии человека. В настоящее время сохраняется постоянная угроза возникновения вспышек геморрагических лихорадок во многих странах. Вспышка заболевания лихорадки Эбола в 1995 - 96 годах подтверждает это. Хотя лихорадки, вызываемые возбудителями семейства РИочтйае -вирусами Марбург и Эбола, эндемичны для некоторых районов Африканского континента, развитие туризма и расширение . экономических связей делают эти инфекции потенциально опасными хтя территорий других стран.

О иммунопатогенезе лихорадки Марбург в настоящее время известно очень мало. Тем более для защиты медперсонала работников карантинных служб и лабораторий, проводящих работы с этими возбудителями, необходимо иметь эффективные средства профилактики. Для этого важно изучить механизмы взаимодействия иммунной системы организма'с инактивированным вирусом, препаратами вирусных белков, а также механизмы формирования специфического иммунного ответа и факторы, злияюпше на этот процесс.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение ' иммуногенных и протективных . свойств цельновирионных, субъединичных и рекомбинантных препаратов вируса Марбург, а также комбинации этих препаратов с веществами иммуностимулирующей природы. При решении поставленной цели решались следующие задачи:

- получение препаративных количеств очищенного вируса Марбург и изучение иммуногенных и протективных свойств инак-тивированного препарата вируса Марбург;

- исследование показателей неспецифического и специфического иммунного ответа при сочетанием использовании препарата вируса Марбург с иммуномодуляторами; .

- изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов белков МР, УР40, УР24 и ОР вируса Марбург с использованием двух видов лабораторных животных;

- изучение иммунобиологических свойств синтетических пептидов -аналогов участка белка ОР вирусов Эбола и Марбург.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы получены данные о развитии специфического клеточного, гуморального , и протективного ответов при иммунизации препаратами вируса Марбург. В результате выполненных исследований были изучены показатели иммунитета при сочетднном применении очищенного инактивированного вируса Марбург с иммуномодуляторами различной природы. При проведении исследований были впервые получены препараты белков УР40 и МР вируса Марбург. Впервые были получены данные о динамике таких показателей иммунного ответа, как интерферон, интерлейкины I и 2, фактор некроза опухоли и активности натуральных киллеров при иммунизации лабораторных животных препаратами белков КР, УР40, УР24 и вР вируса Марбург, а также препаратом инактивированного вируса Марбург. Показано, что препарат белка УР40 обладает низкой иммуногенной и протективной активностью. Иммунизация лабораторных животных препаратом белка КР приводила к формированию иммунного ответа, выражавшуюся в продукции вирусспецифичесхих антител и формировании клона лимфоцитов, способных пролиферировать при повторной встрече с антигеном. Препарат белка КР обладает протективными свойствами. Были изучены иммуногенные и протективные свойства белка УР24. Показано, что препарат белка ОР вируса Марбург в экспериментах т

vivo супрессирует пролиферативную активность спленоцитов при их стимуляции митогенами. С целью изучения механизма иммуносупрессии при иммунизации препаратом белка GP был изучен иммунный ответ на введение синтетических пептидов, аналогов участка белка GP вирусов Марбург и Эбола, имеющего высокий процент гомологии с иммуносупрессявным доменом белка р15Е ретровирусов. В экспериментах in vivo эти пептиды супрессировали активность натуральных киллеров и продукцию интерлейкина I.

Практическая ценность работы. Охарактеризован и депонирован в Государственную коллекцию вирусов при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН штамм "Popp" вируса Марбург ( номер депонента 946). В результате проведенных исследований был разработан и запатентован "Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протехтивной активностью" (номер патента RU 2029561 С1).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены или доложены на следующих конференциях: "IXth International Congress of Virology", Glasgow, Scotland, 1993; Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" Саратов, 1993 г; XXVth International Conference of Comparative and Applied Virology, Montreal, Canada, 1994; "III International Congress of Immunorehabilitation", Dagomis, Russia, 1994; "New approaches of vaccine Development", NAVD'95, Vienna, 1995: "Xth International Congress of Virology", Jerusalem, Israel, 1996.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, получен 1 патент.

~ Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения и трех глав: обзора литературных данных (глава 1), материалов и методов исследования

(глава 2), результатов и обсуждения (глава 3), а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы (234 ссылки). Работа изложена на 216 страницах машинописного текста, включая 28 рисунков и 19 таблиц.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при в соавторстве с сотрудниками ГНЦ ВБ "Вектор к.м.н. Игнатьевым Г.М., Стрельцовой М.А., Кашенцевой Е.А., Сабировым А.Н., к.х.н. Самуковым В.В., к.б.н. Ахименко З.А. и сотрудником Института Вирусологии г.Марбург д-ром Беккером С.

Использованные сокращения: БСА-бычий сывороточный альбумин; ВОВ-вирус осповакцины; ИАМ-инактивированный антиген Марбург; ИЛ-1, ИЛ-2-интерлейкины I и 2; ИНФ - интерферон; ИС-индекс стимуляции; ИФА-иммуноферментный анализ; ЛПС-липополисахарид; НК клетки- натуральные киллеры; РБТЛ-реакция бластной трансформации лимфоцитов; СПГВМ-синтеггический пеггтид -аналог участка гликопротеина вируса Марбург; участок имеет гомологию с иммуносупрессивным доменом белка р15Е регровирусов; СПГЮ-синтетический пептид - аналог участка гликопротеина вируса Эбола; участок имеет гомологию с иммуносупрессивным доменом белка р15Е ретровирусов; ФГА-фитогемагглютинин; ФНО-факгор некроза опухоли.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для выполнения исследований нами решалась' задача по получению препаративных количеств вируса Марбург. Нами были использованы три способа получения очищенного препарата вируса Марбург из культуральной вируссодержащей жидкости, из сыворотки крови и печени зараженных животных с использованием методов ультрафильтрации и ультрацентрифугирования. В наибольшей степени

отвечающим требованиям чистоты (70-80% по данным электрофореза) оказался препарат, получаемый из концентрата КВЖ. При разработке этого способа получения препарата вируса Марбург была сделана заявка на изобретение, получен патент и в дальнейшем все эксперименты проводились на препарате, полученном согласно этому патенту. Изучение полученного препарата в электрофорезе показало сходство молекулярных весов мажорных белков с молекулярными весами белков вируса Марбург, описанными в литературе. При изучении иммунохимических характеристик препарата вируса в иммуноблотгинге показано связывание белка № с сывороткой реконвалесцента, полученной из Атланты (№. сыворотки 700808).

Таким образом нами был" получен препарат очищенного вируса Марбург в количествах, необходимых для проведения работ по изучению его иммуногенных и протективных свойств в экспериментах на лабораторных животных. Морских свинок иммунизировали препаратом инактивированного формалином вируса Марбург подкожно в дозах 1, 5, 10, 25 и 50 мкг на животное. Введение животным препаратов приводило к активации гуморального и клеточного звена иммунитета. После иммунизации у животных формировался протективный иммунный ответ к введению летальных доз активного вируса Марбург ( Табл. 1.) Можно отметить, что доза 1 мкг/животное практически не вызывала формирования иммунитета у морских свинок. Иммунизация животных дозами инактивированного препарата вируса Марбург. превышающими 10 мкг на животное, не приводила к увеличению иммунного ответа ни по показателям клеточного и гуморального иммунного ответов, ни по протективности. Можно констатировать, что при введении препарата инактивированного вируса Марбург наблюдается отсутствие значимого роста иммунологических показателей при увеличении антигенной нагрузки на организм. Для усиления иммунного ответа нам

Таблица 1.

Изучение иммуногенных и протекгивных свойств препарата инактивированного вируса Марбург (ИАМ) и сочетанное применение препарата ИАМ с иммуномодуляторами

ПРЕПАРАТ и ДОМ АНТИГЕНА МАКСИМАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ ИММУНИТЕТА

Интерферон (ед/мл) ПК клетки . (%) РБТЛ/антнген ТВЕ НАМ (индекс стимуляции) Титры янтнгсл % зати гм при ппедепнн 50 ЛД5о/жнво1 ное

1. Препарат НАМ 1 мкг/живо гное 3 су г 4 ед/мл 5 су 1 30% 28 сут 1.02 1.29 21 суг 1:20 17%

2. Препарат ИАМ 5 мю/животное и.о. и.о. 28 сут 1.11 1.30 21 сут 1:165 24 %

3. Препарат ИАМ 10 мкг/живогпос 3 сут 32 ед/мл 5 сут 44% ' 28 сут 1.03 1.90 21 сут 1:210 69%

4. Препарат ИАМ 25 мкг/жнпотное 11.о. и.о. 28 сут 1.11 1.91 21 сут 1:210 73%

5. Препарат ИАМ 50 мкг/живо гное и.о. и.о. 28 суг 1.11 2.28 21 сут 1:253 86%

6. Препарат ИАМ 10 мкг/жнвотное + ридостин 1 сут 64 ед/мл 3 сут 46% - ( 28 сут 0.93 2.07 21 сут 1:256 50%

7. Препарат ИАМ 10 мкг/животное + инозиплекс 1 сут 128 ед/мл 5 сут 49% 28 сут 0.99 1.80 21 сут 1:512 67 %

8. Препарат ИАМ 10 мкг/жнвогное + полирибонат 5 сут 64 ед/мл 5 сут 44% 28 суг 1.12 1.85 21 сут 1:256 67%

9. Препарат ИАМ 1 ( мкг/жнпотнос) + диуцифон | 3 сут 16 ед/мл 5 сут 47% 28 сут 0.95, 1.59 21 сут 1:256 50% -1.1 П -иг-. Г, И!. -----—---

представилось целесообразным применять совместно с препаратом инактивированного вируса Марбург иммуностимуляторы ( Табл. 1.). В работу были взяты известные иммуностимуляторы - ридостин, полирибонат, инозиплекс и диуцифон, стимулирующие различные звенья иммунитета- и приводящие к активации этих звеньев в различные сроки. Препаратом очищенного инактивированного вируса Марбург в оптимальной иммунизирующей дозе 10 мхг, выбранной на основании результатов предварительных экспериментов, совместно с указанными иммуностимуляторами были иммунизированы морские свинки по схемам, рекомендуемым для этих препаратов. При сочетанном использовании препарата инактивированного вируса Марбург с иммуностимуляторами значимого повышения активности натуральных киллеров, пролиферативной активности мононуклеаров крови, титров антител и протективности зафиксировать не удалось (Табл.1).

Следующим этапом было проведено исследование показателей неспецифического и специфического иммунного ответа на введение препаратов белков МР и УР40 вируса Марбург. Белок МР является нуклеопротеином, а белок УР40- компонентом мембранного комплекса. Белки были фракционированы совместно с д-ром Акименко 3. А. методом обращенно-фазовой хроматографии. На Рис.1 показан профиль элюции и электрофорез полученных фракций. На Рис. 1 видно, что во фракциях, нанесенных на дорожку 1, находился белок МР, а во фракциях, нанесенных на дорожку 3. белок УР40.

Изучение свойств полученных белков вируса Марбург проводили на мышах линии ВАЬВ/с и на морских свинках. На Табл. 2 приведено сравнительное изучение неспецифических показателей иммунитета у мышей после введения препаратов белков МР и УР40. Как видно из результатов экспериментов белок МР стимулировал развитие всех исследуемых показателей неспецифического иммунного ответа:

А - профиль элюции белков вируса

Б - электрофореграмма фракций выделенных белков

Дорожка 1 - фракция, содержащая белок Дорожка 2 - фракция, содержащая белки ЫР и \/Р40 Дорожка 3 - фракция, содержащая \/Р40 Дорожха 4 - белки вируса Марбург

сывороточного интерферона, ИЛ 1 и 2, ФНО, активность НК клеток. Белок УР40 слабо стимулировал активность медиаторов иммунного ответа и НК клетки. Данные по определению пролиферативной активности лимфоцитов морских свинок, иммунизированных белком УР40, ( ТАБЛ. 2) показали, что достоверного повышения "Индекса стимуляции" зафиксировать не удалось. У животных, которым вводили белок ЫР, клеточный иммунный ответ регистрировался на 14 и 21 сут, на эта сроки "ИС" достоверно отличался от контрольных показателей. У иммунизированных белком УР40 мышей линии ВАЬВ/с и морских свинок вырабатываются специфические антитела в низких титрах.

Введение мышам препарата белка № вызвала активацию иммунного ответа: начиная с 14 сут в сыворотке крови животных методом ИФА обнаруживаются антитела к вирусу Марбург. - Вторичное введение препарата белка. ЫР на 14 сут привело к достоверному увеличению титров антител у морских свинок. Это, как и специфический клеточный иммунный ответ у морских свинок, который также фиксировался на 14 сут, свидетельствует о том, что к этому сроку происходит формирование полноценного иммунного ответа на белок ИР. Белок УР40 не обладал протективной активностью ( ТАБЛ. 2). Белок КР обладал более выраженными протективными свойствами и защищал животных от введения вируса Марбург в дозе 50 ЛД50 (процент защиты = 36%).

При получений данных об иммуногенных и протективных свойствах белков вР и УР24 вируса Марбург нами были использованы препараты белков УР24 и вР, любезно предосгавленые доктором С. Беккером ( Институт Вирусологии, г. Марбург). Белок вР является поверхностным гликопротеином, а белок УР24 - компонентом мембраны. При изучении иммуногенных свойств белков на модели мышей линии ВАЬВ/с было отмечено, что иммунизация препаратом белка УР24 вызывала у животных иммунологическую реакцию, проявляющийся в продукции интерферона, интерлейкинов 1 и 2, а также фактора некроза опухоли. Активность НК клеток не была зарегистрирована (Табл. 2). Введение белым мышам препарата белка вР вируса Марбург приводило снижению активности натуральных киллеров на 1 - 3 сут. Одновременно отмечалось снижение продукции интерлейкинов 1 и 2. Продукция интерферона, напротив, стимулировалась после введения этого белка. Следует отметшъ раннее появление этого цитокина в крови иммунизированных животных - 1-ые сутки и относительно высокий уровень последнего (16 МЕ/мл). Появление в ранние сроки и высокий

Таблица 2.

Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов белков вируса Марбург

ПРЕПАРАТ МАКСИМАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ ИММУНИТЕТА |

ИНФ (ед/мл) * ИЛ 1 (И.С.) * ИЛ 2 (И.С.) * ФИО (МЕ /мл) * НК клетки (%) * РБТЛ/антиген ТВЕ ИАМ/бе-лок (ИС) ** Титры антител ** % защиты I при введении 50 ЛД5о/ж»в. **

1.Препарат МАМ (10 мкг/живот.) 3 сут 32 3 сут 3 .5 5 сут 2.4 1 сут 16 3 сут 44% 28 сут 1.03 1.90 28 сут 1:256 69%

2.Препарат белка ^ (10 мкг/живот.) 3 сут 16 3 сут 2 .3 3 сут 1 .4 1 сут 8 3 сут 35% 21 сут 1.03 2.10 28сут 1:64 36%

3. Препарат белка УР40 (10 мкг/живот.) 5 сут 8 3 сут 1.3 5 сут 1.2 0 3 сут 31 % 28 сут 1.01 0.97 21 сут 1:8 0 %

4. Препарат белка вР (10 мкг/живот.) 1 сут 16 1 сут 3 сут 0.7 1 .5 3 сут 5 сут 0.6 1 .4 1 сут 8 1 3 5 3 6 29 21 сут 1.06 1.66 * 28 сут 1:86 20%

5. Рекомбннант-иый ВОВ, ген белка СР (5x105 ООЕ/жив) н.о н.о. н.о н.о н.о 28 сут 0.9 1.60 28 сут 1:10 0%

6. Препарат белка УР24 вируса Марбург ¡10 мкг/животпое 1 сут 8 3 сут 1.4 3 сут 1.6 1 сут 4 3 сут 29% 21 сут 1.01 1.17 21 сут 1:34 20 %

* Данные получены на мышах линии ВА1.В/С ** Данные получены на морских свинках

уровень активности характерны и для фактора некроза опухоли (Табл. 2).

Результаты постановки реакции бластной трансформации показали, что белок VP24 не обладал способностью вызывать формирование клона клеток памяти ни после введения мышам, ни после введения- морским свинкам. Подавления реакции на митогены в эксперименте in vivo зафиксировано не было. При изучении динамики клеточного ответа у мышей на введение белка GP было отмечено подавление клеточного иммунитета в первые 7 сут после иммунизации, которая выражается в снижении способности спленоцитов мыши реагировать на стимуляцию митогенами (Табл. 3).

Таблица 3.

Изучение специфического клеточного ответа у мышей линии ВА1.В/С после введения препарата белка вР вируса Марбург

СРОК от РБТЛ (ИС, ерш ) 1 используемый для стимуляции митоген или антиген

НАЧАЛА ИММУНИЗАЦИИ *

(сут) GP Кон А лпс ФГА Спонтанная пролиферация

0 1.00 + 0.12 7.03 + 0.68 2.08 + 0.22 5.51 + 0.46 4823-+ 549

1 0.99 + 0.20 1.33 + 0.24 1.06+ 0.18 1.11 + 0.21 4427+ 667

3 0.97 +0.19 1.68+ 0.34 0.94 + 0.15 1.44+ 0.24 2387 + 761

5 1.05+ 0.21 2.82 + 0.54 1.60 + 0.29 1.63+ 0.34 4257+ 561

7 1.03+ 0.14 3.91+ 0.68 2.22 + 0.36 2.82+ 0.55 5229+ 608

14 1.11 + 0.24 6.86+ 0.60 1.96 + 0.41 4.82+ 0.58 4228 + 704

28 1.66+ 0.28 6.24+ 0.55 2.28 + 0.43 5.05+ 0.62 4427 + 610

Это свидетельствует о том, что белок GP при введении мышам линии BALB/c обладает иммунодепрессивным действием. При летальной инфекции Марбург, смоделированной на обезьянах Macaca mulatia, нами наблюдалась подобная картина снижения способности лимфоцитов отвечать на стимулирование митогенами. Это также свидетельствует о иммуносупрессии и подтверждается в эксперименте на обезьянах уменьшением индекса CD4/CD8 ( Рис. 2).

А

Животные Антиген Срок после введения вируса Марбург (сут) 1 Индекс пролиферации / ерш

0 1 3 5 7 9

Обезьяны Марбург ТВН Кон А лпс Спонтан. 1.0+0.2 0.9+0.3 7.5±0.3 2.1 ±0.1 3396±279 1.0±0.1 1.0+0.3 7.5±0.3 2.1 ±0.1 3508±292 1.2+0.1 1.2±0.1 7.4±0.4 2.0±0.2 4326±328 1.2+0.1 1.1±0.1 6.8±0.2 1.8±0.2 6258+392 1.0±0.1 1.2±0.3 1.7±0.2 8633+586 1.0±0.1 1.0+0.1 5.8±03 1.7+0.2 8997±60 7

Сутки после заражения

Рис. 2. Показатели клеточного иммунитета у обезьян Macaca mulatta при летальнойинфекции Марбург.

□ — Животные пали после заражения q Животные выжили после заражения

А - Индекс пролиферации лимфоцитов у обезьян после заражения вирусом Марбург ( доза 200 ЯДя/животное)

Б - Отношение CD4/CD8 у обезьян после заражения вирусом Марбург ( доза 200 ЛД5о/животное)

Как видно из представленных результатов подавление начальных звеньев иммунного ответа было зафиксировано только у животных при летальной инфекции Марбург и у животных, которым вводили препараты белка GP. В то же самое время ни при введении препарата белка VP24, ни при ведении препаратов белков NP и VP40 такого

эффекта не наблюдали. После обнаружения в белке йР филовирусов области, имеющей высокий процент гомологии с иммуносупрессивным доменом белка р15Е ретровирусов появляется возможность интерпретации полученных результатов. Для связывания эффекта иммуносупрессии белка СР с наличием а белке последовательности, с потенциально супрессирующими свойствами, необходимы прямые подтверждения аналогичных супрессирующих свойств этого домена. С целью более детального изучения препарата белка йР вируса Марбург д-рами Самуковым В.В. я Сабировым А.К. были синтезированы пептиды, аналогичные участку 634-654 на белке ОР вируса Марбург и вируса Эбола, а также пептид СКБ-17, являющийся синтетическим аналогом иммуносупрессивного домена белка р15Е ретровирусов. Для удобства в последующем синтетические пептиды будут обозначаться как СПГВМ ( пептид - аналог участка гликопротеина вируса Марбург) и СПГВЭ (пептид - аналог участка гликопротеина вируса Эбола). Изучение пептидов СПГВМ и СПГВЭ проводили на мышах линии ВАЬВ/с. Исходя из литературных данных в работе были использованы дозы пептидов 20 и 40 мкг на животное. Пептиды вводили внутрибрюшинно. Введение дозы пептидов 20 мкг на животное стимулировало продукцию интерлейкина 1 (Рис.3). При использовании дозы 40 мкг на животное активность интерлейкина-1 у мышей, которым вводили пептиды СПГВМ и СПГВЭ, была снижена и не отличалась от таковой у животных, которым вводили пептид СКЗ-17. При изучении активности фактора некроза опухоли обнаружилось, что введение мышам пептида Марбург в дозе 20 мкг на животное происходит ранний выброс этого цитокина: максимальный показатель активности зарегистрирован на 1 сутки. При использовании дозы 40 мкг на животное происходит смещение динамики роста этого показателя к более поздним срокам: максимальная активность регистрируется на 5 сут. При введении животным дозы

А - доза пептидов- 20 мкг/животное Б - доза пептидов- 40 мкг/животное

интерлейкин 1

5 т

-I-

6-

и 4-

0 1 3 5 7 9 Дни после иммунизации (сут)

фактор некроза опухоли

30

0 1 3 5 7 9 Дни после иммунизации (сут)

ШСПГВМ ШСПГВЭ □скз-п

ШБСА

ЛЕ

О 13 5 7 Дни после иммунизации (сут)

0 1 3 > 7 Дни после иммунизации (сут)

Рис.3. Показатели неспецифического иммунного ответа у мышей линии ВА1_В/с, иммунизированных пептидами СПГВМ и СПГВЭ

А - доза пептидов- 20 мкг/животное натуральные киллеры

Б - доза пептидов- 40 мкг/животиое

От

0 1 3 5 7 9 Дни после иммунизации

О 1-3 5 7 9 Дни после иммунизации

фагоцитирующая

Пт

активность

0 1 3 5 7 9 Дни после иммунизации

моноцитов

И у 10 -9 -2 8—>

и о

2 б1 с.

Ё 5-| 4 -

се

Э 3 -2 1

: ШСПГВМ1 I вСПГВЭ |

¡□СКБ-П ;

; шБСА !

1 I

0 1 3 5 7 9 Дни после иммунизации

т

I

Рис.3. Показатели неспецифического иммунного ответа у мышей линии ВА1_В/с, иммунизированных пептидами СПГВМ и СПГВЭ

пептида Эбола 40 мкг на животное максимальная активности фиксируется на 1 сут, при дозе 20 мкг - регистрируется слабая активность этого показателя неспецифического иммунитета. При сравнении эффекта пептидов на натуральные киллеры была отмечена общность оказываемого на НК клетки действия (Рис.3). Изучаемые нами пептиды, также как пептид СКБ-17, имели способность ингибировать НК клетки. Супрессивный эффект был дозозависимым. БСА, взятый в качестве контроля, не ингибировал литическую активность НК клеток. Можно предположить, что пептиды СПГВМ и СПГВЭ оказывают на НК клетки эффект, аналогичный эффекту, оказываемому пептидом ОКБ-17. При постановке экспериментов по определению фагоцитирующей активности перитонеальных макрофагов было показано, что доза пептидов 20 мкг на животное стимулировала активность фагоцитоза, а доза 40 мкг - не влияла на этот показатель.

Исходя из полученных данных можно констатировать, что в наших работах показан выраженный супрессивный эффект синтетических пептидов - аналогов участков гликопротеинов вируса Марбург и вируса Эбола, имеющих гомологию с иммуносупрессивным . доменом белка р15Е ретровирусов. Иммуносупрессивное действие выражалось в ингибировании продукции интерлейкина-1, а также в снижении активности натуральных киллеров и было дозозависимым. Как видно из Табл. 2 и 3 аналогичный эффект оказывает и иммунизация животных белком вР. Из этого факта можно сделать допущение, что проявление способности гликопротеина вируса Марбург подавлять некоторые показатели иммунитета, может бьггь напрямую связано с наличие иммуносупрессивного домена.

Эксперименты по изучению протективных свойств препарата белка вР вируса Марбург проводились также на препарате рекомбинантного ВОВ, содержащим ген, кодирующий белок СР вируса

Марбург, (препарат "vSC-GP" также был любезно предоставлен доктором С. Беккером, Институт Вирусологии, г. Марбург). Как следует из Таблицы 2 рекомбинантный ВОВ "vSC-GP" не защищает морских свинок от введения дозы 50 ЛД 50 / животное активного вируса Марбург.

Таким образом, ' нами были изучены иммуногенные и протективные свойства цельновирионных, субъединичных и рекомбинантных препаратов вируса Марбург, а также сзойства синтетических пептидов - аналогов области гликопротеина вирусов Марбург и Эбола, имеющей гомологию с иммуносупрессивным доменом белка р15Е ретровирусов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и запатентован метод препаративной очистки вируса Марбург из культуральной вируссодержашей жидкости (Патент РФ RU 2029561 С1, Россия, 1995).

2. Проведено изучение иммуногенных и протективных свойств инактивированного вируса Марбург. В экспериментах in vivo показано, что препарат инактивированного вируса Марбург активирует продукцию цитокинов (ИНФ, ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО) и повышает активность натуральных киллеров. Иммунизация препаратом инактивированного вируса Марбург приводит к формированию специфического клеточного, гуморального и протективного иммунного ответа у лабораторных животных.

3. Показано, что сочетанное использование препарата инактивированного вируса Марбург в дозе 10 мкг/животное с иммуностимуляторами не приводит к усилению специфического иммунного ответа у морских свинок.

4. Впервые методом обращенно-фазовой хроматографии получен препарат белка NP вируса Марбург. При иммунизации лабораторных

животных показана индукция цитокинов ( ИНФ, ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО), активация натуральных киллеров и формирование специфического клеточного, гуморального и протективного иммунного ответа.

5. Впервые изучен неспецифический и специфический иммунный ответ на введение лабораторным животным препарата белка ОР вируса Марбург. Показано иммуносупрессирующее действие препарата белка ОР в экспериментах на мышах линии ВАЬВ/с, проявляющееся в снижении активности НК клеток и в снижении способности спленоцитов реагировать на стимуляцию митогенами.

6. Впервые показано, что синтетические пептиды СПГВМ и СПГВЭ при введении мышам линии ВАЬВ/с, обладают иммуносупрессивными свойствами, которые проявляются в ингибировании продукции интерлейкина-1 ( при использовании дозы 40 мкг/животное) и активности натуральных киллеров (при использовании доз 20 и 40 мкг/животное).

7. Показано, что иммунизация морских свинок рекомбинантным вирусом осповакцины, содержащем ген белка СР вируса Марбург, в дозе 5 х 106 БОЕ на животное не приводит к формированию протективного иммунитета при заражении активным вирусом Марбург.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А, Агафонов А.П., Манагарова Г.И.,Спирин Г.Н., Черный Н.Б. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам.// Вопросы вирусологии, 1991, N 2, с.421-423.

2. Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург.// Вопросы вирусологии, 1991, N 5, с. 437-438.

3. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Кузьмин В.А., Акименхо З.А. Иммуногенные свойства белков вируса Марбург.// Вопросы вирусологии, 1992, N 1, с.58-61.

4. Лавриненко И.А., Агафонов А.П. Изучение функциональной активности лимфоцитов у людей. вакцинированных против геморрагической лихорадки Марбург.// Иммунология, 1993, Ml, с.34-36.

5. Agafonov А.Р., G.M.Ignatyev, Z.A.Akimenko, V.E.Volchkov. Study of immunogenic and protective properties of Marburg virus GP, NP and VP40 protein.// Abstracts IXth International Congress of Virology, Glasgow, Scotland, 1993, P52-7, p.300.

6. G.M. Ignatyev, V.E.Volchkov, V.M.Blinov, V.V.Samukov. Agafonov A.P., M.A. Streltsova., Kashentseva E.A. Phenomenon of immunosupression caused by Filo viruses.// International Journal of Immunorehabilitation, N1, Supp., 1994. pi57.

7. Игнатьев Г.М., Стрельцова M.A., Агафонов А.П., Кашенцева E.A. Механизмы протективного иммунного ответа при моделировании лихорадки Марбург на обезьянах.// Вопр. вирусол., 1995, М.З, с.109-113. -

8. Патент РФ RU 2029561 С1 (Россия).(1995). Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью./НПО "Вектор"; авт. изобрет. Агафонов А.П., Стрельцова М.А., Игнатьев Г.М. и соавт. Заявл. 14.10.91 .N5004595/14.

9. Ignatyev G.M., Agafonov А.Р., Streltsova М.А., Kashentseva E.A. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys.//! of Biotechnology, 1996, № 44, p. 111-118.

10. Becker S„ Volchkov V. E., Muhlberge E., Klenk H.-D., Agafonov A.P., G.M.Ignatyev. A recombinant vaccina virus expressing the

surface protein of Marburg vims does not protected guinea pigs against Marburg-virus infection.// Abstracts Xth International Congress of Virology, Ierusalem, Israel, 1996, PW 60-40, p. 259.

/