Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций"
На правах рукописи
Агафонов Александр Петрович
Л
Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций
03.01.06 - биотехнология 03.02.02 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
004615412
- 2 дек 2010
Кольцово, 2010
004615412
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научный консультант
доктор медицинских наук, профессор Дроздов Илья Геннадиевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Трунов Александр Николаевич
доктор биологических наук Аликин Юрий Серафимович
доктор биологических наук, Гаранина Светлана Борисовна
Ведущая организация Филиал Федерального Государственного Учреждения
«48 Центрального Научно-Исследовательского Института Министерства Обороны Российской Федерации» -«Вирусологический Центр», Московская область, г. Сергиев Посад-6
Защита состоится «24» декабря 2010 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан «14» октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного д.б.н. Г.П. Трошкова
с/ '
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Актуальность проблемы. Борьба с инфекционными заболеваниями - одна из наиболее актуальных и приоритетных задач современного здравоохранения. Болезни, вызываемые инфекционными агентами, во многих странах являются главной причиной преждевременной смерти. Смертность от инфекционных заболеваний характерна, главным образом, для населения развивающихся стран, однако и в странах с высоким уровнем здравоохранения мероприятия по снижению уровня инфекционных заболеваний входят во все национальные программы социальной и медицинской направленности (WHO, 2008; WHO, 2009).
Реализация программы искоренения натуральной оспы, успехи в борьбе с полиомиелитом и корью доказывают возможность эффективной борьбы и даже полной элиминации инфекционного заболевания. Проверенный практикой комплексный подход, включающий в себя сочетание профилактики и эпидемиологического контроля, становится условием борьбы с инфекционным заболеванием и залогом успеха. При этом крайне важно на первых этапах исследования получить сам этиологический агент и его антигенные компоненты и изучить их структурно функциональные и иммунобиологические свойства.
На сегодняшний день корь, наряду с малярией, туберкулезом, ВИЧ/СПИД, холерой, эпидемическим паротитом, краснухой, остается наиболее распространенным инфекционным заболеванием в мире (WHO, 2008; WHO, 2009). Программой ВОЗ определена задача усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори.
Приказами МЗ РФ от 19.08.2002 № 270 «Об утверждении программы ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 году» 21.03.2003 № 117 «О реализации "Программы ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году"» в рамках программы ВОЗ усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори была принята национальная программа элиминации кори. Для ее успешной реализации организованы работы по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу за инфекцией и разрабатываются эффективные тест-системы для подтверждения случаев заболевания и серомониторинга кори в России. В 2009 заболеваемость корью в РФ снизилась до уровня менее 1 случая на 1 млн. населения, что позволило 2010 году завершить национальную Программу ликвидации кори, и начать процедуру подготовки сертификации территорий для документального подтверждения статуса субъектов РФ как территорий, свободных от эндемичной кори
(Гос. доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2009 году», 2010; Приказ Роспотребнадзора №308, 2010).
С одной стороны это подтверждает эффективность мероприятий вакцинопрофилакгики в борьбе с инфекциями, с другой - указывает на незащищенность населения от других вирусных инфекций, средства профилактики для которых еще не разработаны. Неконтролируемые инфекции представляют биологическую опасность для России и с точки зрения возможного завоза на территорию эндемичных вирусов при расширяющихся экономических и туристических связях в мире, и с точки зрения умышленного использования инфекционного агента. Особую опасность для человека из-за своей высокой контагиозности и патогенности представляют возбудители вирусных геморрагических лихорадок. Вирусы, вызывающие заболевания с геморрагическим синдромом, относятся главным образом к четырем семействам: РИотлгМае,. Агепашпс1ае, Випуа\ппс1ае и Fla.vivirid.ae. К наиболее опасным, с точки зрения последствий для не эндемичных территорий, можно отнести представителей семейства П1отпс1ае — вирусы Марбург и Эбола, летальность от которых составляет 80-90 %. Если учесть увеличение скорости передвижение людей, использующих современные виды транспорта, расширяющиеся связи между государствами, а также высокую контагиозность вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, то опасность заноса инфекции на не эндемичные территории и возникновение там вспышек с серьезными последствиями становится вполне реальной. Следует учитывать, что для многих возбудителей геморрагических лихорадок четко не определены ни ареалы распространения, ни резервуары инфекции, ни переносчики и способ передачи. В настоящее время для борьбы с этими инфекциями не разработаны эффективные средства профилактики и лечения.
Цель работы — получение вирусных антигенов и изучение их иммунобиологических свойств для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций: геморрагической лихорадки Марбург, кори и эпидемического паротита.
Задачи исследования: 1. Разработка технологии получения очищенных вирусов из культуральной вируссодержащей жидкости с целью получения антигенов для изучения иммуногенных свойств или разработки современных ИФА-тест-систем в
соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.
2. Получение антигенов вируса Марбург, изучение их- иммуногенных и протективных свойств и определения антигенов, перспективных для создания вакцины против геморрагической лихорадки Марбург.
3. Оценка перспективности современных подходов к созданию профилактических препаратов против кори - изучение иммуногенности экспериментального препарата на основе живого вируса кори при пероральном его применении и ДНК-вакцины.
4. Выделение и изучение циркулирующих на территории России вирусов кори и паротита с целью слежения за их антигенной и генетической изменчивостью и создания на их основе диагностических ИФА-тест-систем.
Научная новизна и практическая значимость работы
Разработана и запатентована технология получения вирусных антигенов для создания профилактических и диагностических препаратов (патенты 11Ш029561С1, 1Ш2230785С2, 1Ш2348691С1). Получены и охарактеризованы по иммуногенным и протективным свойствам структурные белки вируса Марбург, которые могут быть использованы при разработке диагностических и профилактических препаратов против геморрагической лихорадки Марбург. Показана принципиальная возможность создания удобного в применении и более простого с точки зрения организации профилактических мероприятий варианта коревой вакцины - препарата для перорального применения. В рамках реализации программы глобальной ликвидации кори разработаны эффективные ИФА-тест-системы для диагностики кори и проведения мероприятий по серомониторингу заболевания, а также изучены антигенные свойства циркулирующих на территории Западной Сибири генотипов вируса. Впервые в РФ разработана и внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса в к вирусу кори, позволяющая оценить содержание антител класса в в международных единицах. Впервые в РФ разработана тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори. Исследования по серомониторингу заболевания позволили выявить возрастные группы населения, наиболее подверженные опасности заболевания корью. Подтверждено генетическое и антигенное родство новых генотипов вируса кори и вируса паротита с вакцинными штаммами, используемыми
для программы вакцинопрофилактики этих заболеваний. Впервые показана циркуляция генотипа Об вируса кори и генотипов С и Н вируса паротита на территории РФ.
Штамм Рорр вируса Марбург депонирован в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) под номером ГКВ N 946 от 20 января 1993 г. Штамм рекомендован для производства диагностических и вакцинных препаратов. Штаммы вирусов кори и паротита депонированы в коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор (штамм «НовО/96» вируса кори - УВ-04, штамм «Драгун» вируса паротита - УВ-05, штамм «ПетроНов» вируса паротита - У-330) и использованы для получения антигена - основного компонента ИФ А-тест-системы.
Апробация работы
Результаты исследований были доложены: на международной конференции "Медицина, биотехнология, иммунизация и СПИД" (Ленинград, 1991), международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (Москва, 1992), международной конференции 100-летие вирусологии (Санкт-Петербург, Россия, 1992), IX (Глазго, 1993), X (Иерусалим, 1996), XII (Париж, 2002) международных вирусологических конгрессах, 2-й, 3-й и 4-й международных конференциях «Новые направления в развитии вакцин» (Вена, Австрия, 1995,1997,1999 гг.), международной конференции «Вирусы Марбург и Эбола» (Марбург, Германия, 2000), 11-м международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Канкун, Мексика, 2004), IX международной конференции «Новые технологии в медицине и экологии» (Гурзуф-Ялта, 2001), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции по медико-биологическим исследованиям (Мюнхен, 2004), Азиатском конгрессе по аэрозолям (Гонконг, 2004), VI межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств: проблемы биобезопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2006), П и III Российских научных конференциях с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 и 2006), международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане:
проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Республика Казахстан, 2008).
Работа выполнена в 1990-2009 годах в ГНЦ ВБ "Вектор" в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ (1035В, 2168). Работы по оценке иммуногенности живой коревой вакцины при пероральной аппликации были проведены в лаборатории профессора А.Б.М.Е. С^егЬаш (Университет им. Э. Роттердамского, Роттердам, Нидерланды). Изучение штамма НовО/96 вируса кори было проведено в лаборатории кори и краснухи д-ра Е. Оепке (Институт им. Р. Коха, Берлин, Германия). Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании проблемно-тематической комиссии «Эпидемиология, вирусология и диагностика особо опасных вирусных инфекций» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2010).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Белок №> вируса Марбург обладает выраженными иммуногенными свойствами и вызывает образование вирусспецифических антител и развитие клеточного иммунитета, формируя протекгивный иммунный ответ при введении лабораторным животным.
2. Вакцинный штамм вируса кори способен вызывать формирование специфического гуморального и клеточного иммунного ответа у лабораторных животных при пероральном применении.
3. Введение лабораторным животным ДНК-вакцины на основе гемагглютинина вируса кори приводит к формированию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.
4. Наибольший процент лиц, не имеющих протективных антител к вирусу кори, входит в возрастную категорию населения РФ от 16 до 25 лет.
5. Циркулирующие на территории РФ в период с 1993 по 2001 гг. вирусы кори и паротита находятся в близком антигеном родстве с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики.
Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 31 научная статья, в том числе 23 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, 3 монографии, 1 методические указания. Получено 4 патента Российской Федерации.
Внедрение результатов исследований
Предложены и апробированы методы получения вирусных антигенов, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
Внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори с представлением содержания антител в международных единицах. Совместно с ЗАО «Медико-биологический союз» выпущено и поставлено потребителям 8 серий тест-системы «Kopb-IgG-ДС», достаточных для проведения более 80 ООО анализов.
Материалы диссертации используются, в том числе и в учебно-образовательном процессе при проведении курсов повышения квалификации специалистов микробиологических лабораторий Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Министерства сельского хозяйства РФ на базе в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 334 страницах машинописного текста, включает 46 таблиц и 57 рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 380 работ отечественных и зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использовали вирус Марбург (штамм Popp), полученный из БелНИИЭМ (Минск, Беларусь). В качестве референс-штаммов при работе с вирусом кори был использован штамм Эдмонстон (получен из АТСС, VR-24), при работе с вирусом паротита - штамм Эндерс (получен из АТСС, VR-106). При оценке антигенных свойств выделенных изолятов вирусов кори и паротита использовали вакцинные штаммы Л-16 и Л-3, полученные из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва). В качестве тест-вируса для титрования интерферона использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС), полученный из коллекции штаммов вирусов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).
Использовали клетки Л-68, ДК-58 (диплоидные фибробласты эмбриона человека), К-562 (клетки миелолейкоза человека), CV-1, Vero, GMK (клетки почки
обезьяны), клетки комара Aedes aegipty и L-929 (клетки мыши) получены из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовались питательные среды RPMI-1640, ПС-4, Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов производства ГНЦ ВБ «Вектор».
В исследованиях использовали аутбредных морских свинок (вес 250-300 г), кроликов (вес 1,5-2,5 кг), мышей линии BALB/c (вес 14-18 г), обезьян Macaca mulatto (самцы 5,2-6,6 кг) и Papio hamadrias (самцы 4,8-5,2 кг), полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды. Все манипуляции с животными при поведении эксперимента проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.
Для идентификации вируса Марбург использовали референс-сыворотку (сыворотка реконвалесцента N 700808), которая была получена из CDC (Атланта, США). Анализы по определению уровня специфических антител к вирусу кори стандартизовались относительно международного образца «1st International Standard, 1990, Anti-Measles antibody 66/202, 5 International Units per ampoule». Разработанные тест-системы были сравнены с коммерческими тест-системами, производства ЗАО "Биосервис" (Москва), Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия). Образцы с известным титром ревматоидного фактора (по латекс-тесту) для панели содержащей и не содержащей антитела класса М к вирусу кори были любезно предоставлены к.б.н. Т.Н. Юнасовой (лаборатория кори, паротита, краснухи и интерферонов, рук. проф. В.Ф. Попов, ГИСК имени JI.A. Тарасевича).
Препараты очищенных вирусов Марбург, кори, паротита анализировали с помощью электронной микроскопии, электрофореза в ПААГ по Лаемли (Laemly W.K, 1970), вестерн-блот анализа (Towbin Н. et al,, 1976), а концентрацию общего белка в препаратах определяли традиционным методом Лоури (Lowry О. Н. et al., 1951).
Оценку показателей гуморального иммунитета проводили: для вируса Марбург методом ИФА по ранее описанной методике (Becker S. et al., 1992), для вируса кори и паротита - методом РТГА, используя эритроциты обезьяны (Попов В.Ф. и др., 1985), методом ИФА, используя коммерческие тест-системы, и в реакции нейтрализации (CDC, 1996). Оценку клеточного звена иммунитета проводили с использованием реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), которую проводили по общепринятой методике (Ignatyev G.M. et al., 1995), методом ELISpot с использованием набора «ELISpot mouse INF-y» (R&D Systems Inc, США) и исследуя
активность CD3, CD4, CD69 и CD8 клеток (Stittelaar К. et al., 2000). Протективные свойства препарата оценивали по индексу резистентности, который вычисляли как разницу логарифмов ЛД50 в опыте и контроле. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов оценки: сравнение по у2 критерию, сравнение по U критерию Манна-Уитни (Закс Л., 1976). Значение ЛД50 находили по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).
Для разработки ИФА-тест-систем использовали выделенные от больных штамм NovO/96 вируса кори (патент RU № 2230785 С2) и штамм Драгун вируса паротита (патент RU 2348691 С1).
Исследования с участием людей проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 Т2288, Федеральные законы №30-Ф3 от 02.03.1998, № 214-ФЗ от 20.12.1999). Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом IRB00001360.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение препаратов антигенов вируса Марбург и изучение их иммуногенных и протективных свойств. На первом этапе исследования была проведена идентифицикация используемого для получения антигенов штамма Popp вируса Марбург: показана идентичность мол. весов белков исследуемого вируса белкам вируса Марбург. Показано также, что белок с мол. весом 96 кД реагировал с сывороткой реконвалесцента, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург (рис. 1).
Рис. 1. Электрофоретическое изучение белков вируса Марбург и вестерн-блот-анализ. Дорожка 1- маркер мол. весов, дорожка 2- белки вируса Марбург, дорожка 3- нормальная сыворотка козы, дорожка 4— иммунная сыворотка козы, дорожки 5 и 6 - фракции в козы, дорожка 7-нормальная сыворотка кролика, дорожка 8- иммунная сыворотка кролика, дорожка 9- сыворотка
реконвалесцента № 700808.
После этого выбирали культуры клеток для получения препаративных количеств вируса Марбург и определяли сроки сбора КВЖ (таблицы 1 и 2).
Таблица 1
Определение чувствительности культур клеток к вирусу Марбург
Культура клеток Титр вируса* (Ig ЛД5о/мл)
GMK 5,80 + 0,60
CV-1 6,17 + 0,62
ДК-58 6,40 + 0,60
Vero 6,67+0,62
Л-68 6,16 + 0,61
Клетки комара Aedes aegypti 6,50 + 0,60
* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок.
Таблица 2
Динамика накопления вируса Марбург в КВЖ при культивировании на монослойных культурах
клеток ДК-58 и Л-68
Срок культивирования (ч) Титр вируса* (lg ЛД50/мл)/ культура клеток
ДК-58 Л-68
24 2,85 + 0,12 4,92 + 0,27
48 5,19 + 0,15 6,74 + 0,32
72 5,91 + 0.17 7,58 + 0,33
144 6,45 + 0,26 6,16 ±0,41
* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок. Показано, что штамм Popp вируса Марбург эффективно нарабатывается на
использованных культурах клеток. Для дальнейшей работы была выбрана культура Л-
68, которая решением ГИСК им. Л.А. Тарасевича от 09.06.87г. была рекомендована как возможный субстрат для производства медицинских иммунобиологических препаратов. Максимальных значений титр вируса достигал на 3-й сут после заражения и составлял 7,58 + 0,33 lg ЛД50/МЛ. Проверка показала, что после смены питательной среды на 3 сут концентрация вируса в КВЖ на 5-й день вновь достигала высоких значений (7,2 lg ЛДзо/мл). После второй смены среды на 5-е сут и сбора КВЖ на 7-е сут вирус накапливается в КВЖ в меньших количествах (6,0 lg ЛДя/мл). Исходя из результатов исследования, дальнейшее накопление вируса проводили на монослое клеток Л-68 с множественностью заражения 0,1 ЛД50/КЛ., на однолитровых культуральных сосудах, используя двойной слив КВЖ.
Для получения препаратов белков NP и VP40 вируса Марбург использовали хроматографическое (ВГЖХ) фракционирование на колонке с носителем полисил-5ОО-ОДС (рис. 2). Препараты рекомбинантных белков GP и VP24 были любезно предоставлены д-ром S. Becker (Институт вирусологии, Марбург, Германия). В качестве препарата сравнения использован концентрированный очищенный инактивированный вирус Марбург, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2029561 С1.
Изучение гуморального ответа на введение препаратов показало, что рекомбинантный белок GP, полученный в бакуловирусной системе, вызывал индукцию специфических антител в наибольших титрах как при иммунизации мышей, так и при иммунизации морских свинок (рис. 3). Специфический клеточный ответ, изучаемый методом РБТЛ, регистрировался у животных только при введении белков NP и GP вируса Марбург. Иммунизация белком NP обеспечивала максимальную защиту морских свинок от введения летальных доз вируса Марбург -коэффициент защиты при введении дозы вируса Марбург 50 ЛД50 равнялся 70+14 %. Для препарата белка VP40 уровень защиты составлял 16+8 %, для препарата белка VP24 - 14+4 %, а для препарата белка GP -26+6 %.
Рис. 2. Профиль элюции белков вируса Марбург (А) и электрофореграммы фракций, выделенных в 12% ПААГ белков № и УР40 вируса Марбург (Б). Дорожка 1 - фракция, содержащая белок дорожка 2 - фракция, содержащая белки ЫР и УР40, дорожка 3 - фракция, содержащая УР40, дорожка 4 - электрофорез очищенного вируса Марбург.
¿Г ^'^т ~*'— ж
О 7 14 21 28
Срок после введения препарата (еут)
-.-и-. \/Р 24
—и— УРЛО
ЫР
орсб)
—чш-— ОР(о)
Контроль
О 7 14 21 28 46 С рок после введения препарата (сут)
Рис. 3. Формирования гуморального ответа у морских свинок после однократного (А) и двукратного на 0 и 14 сут (Б) введения препаратов белков вируса Марбург.
Таблица 3
Изучение протективной активности белков вируса Марбург при введении белка в дозе 20 мкг/ животное и дозе активного вируса Марбург для заражения 50 ЛД5о/животное
Препарат белка Кратность введения Коэффициент защиты (%)
№ 1-кратно 47+12
2-кратно* 70+14
УР40 1-кратно 0
2-кратно 16+8
УР24 1-кратно 14+4
2-кратно н.и.**
СР(б) 1-кратно 26+6
2-кратно н.и.
вР (ВОВ) 1-кратно 0
2-кратно н.и.
ИАМ 1-кратно 52+10
2-кратно 87+14
Контроль 1-кратно 0
2-кратно 0
* - введение с интервалом 16 сут, ** - не исследовали,
вР (б) - препарат рекомбинантного белка йР, полученный в бакуловирусной системе, вР (ВОВ) - рекомбинантный белок ЭР в составе осповакцины.
Таким образом, были получены и изучены иммунологические свойства
препаратов четырех структурных белков вируса Марбург. На основе полученных
экспериментальных данных может быть оценен возможный вклад каждого из
изученных белков в формирование иммунного ответа против геморрагической
лихорадки Марбург.
Разработка средств профилактики кори. Вакцина против кори в связи с
принятием программы по элиминации этого заболевания, остро востребована. В
настоящее время все производители выпускают живую вакцину для парентерального
использования. Стратегия вакцинации, позволяющая индуцировать формирование
барьерного иммунитета на слизистых оболочках, могла бы быть более эффективной
при защите от кори.
Работа по изучению возможности получения эффективной пероральной
формы вакцины проведена на двух видах животных - кроликах и обезьянах. У
животных после иммунизации оценивали показатели гуморального и клеточного
иммунитета. Иммунизированные обезьяны кроме этого были заражены диким
штаммом вируса кори. На модели кроликов показали принципиальную возможность
создания вакцины против кори для перорального применения, а на модели обезьян
подтвердили, что вирус при внесении в просвет кишечника, может вызвать формирование гуморального и клеточного иммунного ответов (табл. 4).
Таблица 4
Изучение иммуногенных и протективных свойств живой коревой вакцины при пероральном
применении в дозе 105'5 ТЦДд/животное
и * 1 * О § § й в-'гв-й И X со О я 3 и я Изучение иммуногенности Изучение
Модель Иммунизация Гуморальный ответ (количество животных с положительным ответом/общее Клеточный ответ (кол-во животных с положительным ответом/общее количество животных) протек- тивносги (количество животных, у которых появился
и Й а о £ О я г £ В 2 | е- о Я е; 5 о й о к | ч о. О ее а X »о о количество животных) Титр антител в ИФА Появлен ие специфи -ческих СОЗ'СО 8+ клеток ИЛ-4 вирус кори в крови/обще е кол-во животных)
Кролик перорально 1/6 4/6 1:16-1:32 н.и.* н.и н.и.
в/мышечно 1/4 2/4 1:32 н.и. н.и н.и.
перорально 0/2 0/2 0/2 2/2 2/2
Обезьяна в просвет тонкого кишечника 0/2 т (1:1250) 1/2 2/2 1/2
в/мышечно 1/2 2/2 (1:1250) 2/2 2/2 0/2
* - показатель не изучался.
При заражении иммунизированных обезьян диким штаммом В1Ь вируса кори обнаружено, что вирус в лаваже и мононуклеарных клетках крови определялся только у контрольной обезьяны и у трех обезьян, у которых согласно приведенным в таблице 3 данным не был сформирован иммунный ответ. Обе обезьяны, вакцинированные внутримышечно, и одна из обезьян, которым вирус был введен в просвет тонкого отдела кишечника, оказались защищены от заражения.
В другой серии экспериментов был сконструирован и проверен вариант кандидатной ДНК-вакцины против кори, представляющий собой рекомбинантную плазмиду, содержащую встройку гена гемагглютинина вируса кори и включенного в ВПЧ (рис. 4). Такого рода вакцина может быть востребована для иммунодефицитных пациентов, которым нельзя вводить аттенуированный вирус или для вакцинопрофилактики заболевания на поздних этапах выполнения программы элиминации кори.
а «
Срок после первой иммунизации (су1)
§Ц титр антител в мфа • инакшаированньа4* а г кори Щ титр антител в МФА - рекомбииантный белок СЗТ-НЫ | титр антител в ИФА - контроль инакшвированный аг Мзрбург титр антител е ИФА - контроль рекоыбинантный белок СЗТ-НЫ —А— титр знплел в РН - рекомбииантный белок СЭТ-НМ -в- титр антител в РТГА - рекомбииантный бепок оаТ-НН
Срок после первой иммунизации (су г)
Щ рекомбииантный белок GST-HN
инактивиротаяный аГ кори Ш К - (реиомбинантный белок - HW) Щ К-(инактивированныйаГ вирусашрбург)
Рнс. 4. Изучение гуморального (А) и клеточного (Б) ответа у мышей, 3-кратно иммунизированных вариантом кандидатной ДНК-вакциной против кори (стрелками обозначены
сроки иммунизации).
Как следует из рисунка 4А, трехкратное введение препарата приводило к появлению общих и нейтрализующих антител в сыворотке крови мышей. Формирование гуморального иммунитета в ответ на введение кандидатной ДНК-вакцины подтверждено Вестерн-блот анализом. У иммунизированных препаратом ДНК-вакцины животных формировался также специфический клеточный ответ (рис. 4Б), изученный с использование РБТЛ и метода ELISPot.
Таким образом, обоснована перспективность двух направлений в разработке новых вакцин против кори: первое - возможность создания более безопасного с точки зрения применения и экономически выгодного, с точки зрения обеспечения процесса вакцинации, препарата. Второе - возможность создания профилактического противокоревого препарата на основе реплицирующегося вектора, включенного в ВПЧ, альтернативного живой аттенуированной вакцине.
Получение антигена вируса кори и разработка средств диагностики на его основе. Тест-система для выявления антител класса М к вирусу кори необходима при ранней диагностики заболевания, а для антител класса G - для подтверждения диагноза, и для проведения серомониторинга.
Для разработки иммуноферментной тест-системы использовали референс-штамм Эдмонстон и штамм Nov096, выделенный во время вспышки кори в детском доме в Новосибирске. Проведение электронно-микроскопических исследований зараженных клеток Vero выявило репродукцию парамиксовируса. Инфицированные
клетки содержали типичные для парамиксовирусов скопления трубчатых нуклеокапсидов, а на поверхности цитоплазматических мембран наблюдалось формирование вирусных частиц. В целом ультраструктурное строение вируса кори соответствовало описанному в литературе для парамиксовирусов (Scheid А., 1987). Вирус кори был очищен центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (10-60 %). После ультрацентрифугирования собранные фракции были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta] показано наличие гемагглютинирующей активности в двух фракциях (рис. 5, А). При электронно-микроскопическом исследовании в очищенных препаратах обнаружены вирусные частицы и нуклеокапсиды с характерной для вируса кори структурой. Вирусные частицы различались по форме и размерам. Электрофоретический анализ препаратов в ПААГ (рис. 5, Б) выявил высокую степень очистки вируса - 70-75 %. Видовая принадлежность штамма подтверждена в иммуноблоте (рис. 5, В): антитела из сыворотки реконвалесцента (пациента с клиническим диагнозом «корь», подтвержденным лабораторными методами) связывались с белками NP и F вируса
В 1 2
SÍL
Номер фракции градиента
Рис. 5. Получение и изучение антигена вируса кори. (А) - Анализ фракций вируса кори после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в РГА. (Б) - Электрофорез белков вируса кори, шт. Эдмонстон. Дорожка 1- маркеры мол. весов. 205, 116, 97, 84,66, 55,45,36,29, 24,20,
14.2,6.5 кД. Дорожка 2 - белки вируса кори. (В) - Вестерн-блот-анализ. Дорожка 1 - стрип обработан сывороткой человека с клиническом диагнозом корь, подтвержденным лабораторно (разведение 1:500). Дорожка 2 - стрип обработан сывороткой человека, не имеющего антител к вирусу кори (разведение 1:100). Стрелками указаны: белок КР (верхняя) и Р (нижняя) вируса
кори.
Для получения антигена использовали смесь фракций, собранных с градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования. Фракции, содержащие
очищенный вирус, смешивали с фракциями, содержащими нуклеокапсиды вируса в пропорции 1:3. Используя полученный антиген, были подобраны условия проведения ИФА, оптимизированы концентрации основных компонентов тест-системы и сроки хранения. Оптимальная концентрация антигена составила 5 мкг/мл.
Проверка антигенных свойств штамма МоуО/96 выявила существенное сходство с референс-штаммом Эдмонстон и с вакцинным штаммом Л-16 вируса кори (табл. 5). Сыворотки, полученные от 6 иммунизированных очищенным вирусом кори, штамм Эдмонстон, мышей линии ВАЬВ/с, и сыворотки, полученные от 6 иммунизированных очищенным вирусом кори, штамм МоуО/96, мышей линии ВАЬВ/с, были исследованы в ИФА и РТГА. Сыворотки от всех иммунизированных вирусом кори, штамм Эдмонстон, мышей реагировали как со штаммами Эдмонстон и Л-16, так и со штаммом 1<оуО/96. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных штаммом МоуО/96, реагировали как с самим штаммом 1ЧоуО/96, так и со штаммами Эдмонстон и Л-16 (см. табл.5).
Таблица 5
Изучение антигенных свойств вируса кори штамм №>уО/96
Специфич-ность № Титр антител (обратные величины)/реакция для определения титра
сыворотки сыв антител/
оро антиген (штамм), используемый в реакции
тки РТГА ИФА
штамм штамм штамм штамм штамм Штамм
Эдмонстон Л-16 №УО/96 Эдмонстон Л-16 1МоуО/96
Сыворотка 1 32 16 32 640 320 640
против вируса 2 32 16 16 640 320 320
кори штамм 3 32 16 16 640 320 320
Эдмонстон 4 32 8 16 640 320 160
5 16 8 8 320 320 160
6 16 8 8 320 160 160
Среднее по группе 25,40 11,31 14,25 508,00 285,09 253,98
(17,44- (7,6- (8,24- (348,9- (211,84 (140,24-
36,98) 16,85) 24,65) 739,56) •383,66) 460,0)
Сыворотка 1 64 32 64 320 320 640
против 2 64 32 64 320 320 320
выделенного 3 64 32 64 320 160 320
штамма 4 64 32 32 160 160 320
Г4ОУО/96 5 32 16 32 160 160 320
6 32 16 16 160 160 320
Среднее по группе 50,8 25,4 40,32 226,27 201,59 359,19
(34,9- (17,44- (22,26- (151,92- (138,46 (266,9-
73,96) 36,98) 73,02) 337,03) 1-293,49) 483,38)
Таким образом, штамм 14оуО/96 по антигенным свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16. Исходя из более высокой
продуктивности штамма МоуО/96 и близости к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16 по антигенным свойствам, штамм ]\тоуО/96 был использован для получения антигена ИФА-тест-системы, которая позволила эффективно выявлять антитела к вирусу кори как у переболевших, так и у вакцинированных лиц.
Лабораторные варианты тест-системы использовали для изучения иммунного статуса различных возрастных групп населения Новосибирска в отношении вируса кори. В период с апреля по октябрь 2003 года с целью определения специфических антител к вирусу кори были собраны образцы сывороток крови 364 здоровых доноров, проживающих на территории Новосибирска и в РТГА, РН и методом ИФА изучено содержание в них антител к вирусу кори (рис. 6 и табл. 6).
Содержание антител в сыворотках
(ИФА)
■
□ □
>0.35 МЕ - положительные сыворотки
>0.16 МЕ - слабоположительные сыворотки
0-0.15 МЕ - отрицательные сывороток
Титр антител, определенный в РТГА
□
>8 - протективный титр антител >4 - положительные сыворотки 0-4 - отрицательные сыворотки
Титр антител, определенный в РН
I
О □
©
> 120 - протективный титр антител
> 8 - положительные сыворотки < 8 - отрицательные сыворотки
> 48 - расчетный уровень протективных антител
Э-Ю 56-18 20-И 30-35
Рис. 6. Изучение иммунного статуса у представителей различных возрастных групп населения
Новосибирска в отношении вируса кори. По оси абсцисс: Количество отрицательных и положительных сывороток в воз-растной группе, а также сывороток, содержащих протективные титры антител (%). По оси ординат: Возрастные группы (лет).
Таблица 6
Соотношение совпадения результатов определения антител к вирусу кори в сыворотках крови
доноров Новосибирска методами ИФА, РТГА и РН
Возрастная группа доноров Количество сывороток, положительных в ИФА, РТГА и РН, (%) Количество сывороток, отрицательных в ИФА, РТГА и РН, (%)
3-4 года 62,8 7,1
9 -10 лет 60,0 4,0
16-18 лет 45,0 13,3
20-25 лет 38,3 20,0
30 - 35 лет 71,4 15,3
старше 38 лет 77,8 1,4
В соответствии с рекомендациями ВОЗ, все доноры, принимавшие участие в исследовании, были разделены на следующие возрастные группы:
• дети 3-4 года - вакцинированы в возрасте 1 года живой коревой вакциной (70 сывороток);
• дети 9-10 лет - вакцинированы в возрасте 1 года и ревакцинированы в 6 лет живой коревой вакциной (50 сывороток);
• подростки 16-18 лет - вакцинированы в возрасте 1 года и ревакцинированы в 6 лет живой коревой вакциной (72 сыворотки);
• доноры возраста 20 - 25 лет - без учета сведений о прививочном анамнезе (71 сыворотка);
• доноры возраста 30 - 35 лет - без учета сведений о прививочном анамнезе (46 сывороток);
• доноры старше 38 лет - не вакцинированы, без учета сведений о заболевании корью в анамнезе (55 сывороток).
В результате проведенных исследований выявлена возрастная категория доноров с низкими или отрицательными значениями титров противокоревых антител - 20-25 лет. Кроме этого установлена не только выраженная корреляция между методами ИФА и РТГА, но и между методами ИФА и РН, что особенно важно, потому что ранее для доказательства наличия протективного иммунитета к кори проводили определение нейтрализующих антител в РН.
Известно, что РТГА является «золотым стандартом» определения антител к вирусу кори и давно используется для серомониторинга. Для доказательства возможности полноценной замены этого метода методом ИФА проведено их
сравнение. В эксперименте были исследованы сыворотки, полученные от детей, вакцинированных живой коревой вакциной. Для определение противокоревых антител использовали стандартную РТГА и 3 лабораторные серии ИФА-тест-системы для вьивления антител класса G к вирусу кори (табл. 7). Коэффициенты корреляции величин титров антител в исследуемых сыворотках, определенных с помощью ИФА для 1, 2 и 3 серии тест-системы, с РТГА составили соответственно +0,87, +0,86, +0,89. Такая корреляция свидетельствует о высокой степени связи между показателями (Рокицкий П.Ф., 1961). Таким образом, использование ИФА позволили с большей чувствительностью выявлять антитела к вирусу кори в сыворотках крови людей, чем это возможно в РТГА. Учитывая высокие значения коэффициента корреляции между методом ИФА и РТГА, тест-системы на основе иммуноферментного анализа могут успешно использоваться для серомониторинге кори.
Для оценки качества используемых в России тест-систем для определения антител класса G к вирусу кори была разработана и аттестована стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу кори «Стандарт AT-G(+/-)Kopb». Панель была сформирована таким образом, чтобы сыворотки, вошедшие в нее, не содержали белки ВИЧ и антитела к белкам ВИЧ, HBs-антиген, антитела к вирусу гепатита С. Шесть сывороток не содержали антитела класса G к белкам вируса кори, при этом две из них содержали антитела к основным специфическим белкам вируса краснухи, а две - аутоантитела, явившиеся причиной экзантемы их доноров. Одиннадцать сывороток содержали антитела к белкам вируса кори, их специфическая активность установлена в РТГА и РН. Для этих сывороток специфическая активность противокоревых IgG определена в международных единицах на мл (МЕ/мл). Замена понятия «титр» на понятие «специфическая активность, МЕ/мл» в широкой международной практике была предпринята ВОЗ для стандартизации серологических методов определения противокоревых антител. По заказу ВОЗ Национальным институтом биологических стандартов и контролен Великобритании в 1990 году был разработан первый Международный стандарт противокоревой сыворотки («1st International Standard, 1990, Anti-Measles antibody 66/202, 5 International Units per ampoule» (World Health Organization, WHO International Laboratory for biological standard, Hertfordshire, EN63QG, England). Каждая ампула с лиофильно высушенным пулом сывороток содержит 10 ME противокоревых антител.
Таблица 7
Сравнительные испытания трех лабораторных серий иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу кори в сыворотках крови людей
№ сыворотки Титр антител/ номер серии тест системы/реакция
1 серия 2 серия 3 серия
РТГА ИФА РТГА НФА РТГА ИФА
1 2 3 4 5 6 7
2 1:8 1:100 1:8 1:100 1:8 1:100
3 1:4 1:200 1:8 1:200 1:4 1:200
4 <1:4 <1:50 <1:4 <1:50 <1:4 <1:50
5 1:32 1:200 1:16 1:200 1:32 1:300
6 1:16 1:200 1:16 1:200 1:16 1:200
7 1:4 1:200 1:4 1:200 1:8 1:200
11 1:32 1:300 1:16 1:300 1:32 1:400
13 1:32 1:800 1:16 1:800 1:32 1:800
14 1:64 1:800 1:64 1:800 1:64 1:800
19 1:64 1:800 1:64 1:800 1:64 1:800
20 1:32 1:200 1:16 1:300 1:32 1:300
23 1:8 1:100 1:8 1:100 1:8 1:100
24 1:16 1:150 1:16 1:150 1:8 1:200
25 1:8 1:100 1:8 1:100 1:8 1:100
26 1:16 1:150 1:16 1:200 1:16 1:200
27 1:16 1:300 1:16 1:400 1:16 1:400
28 1:32 1:200 1:16 1:300 1:32 1:300
29 <1:4 1:50 <1:4 1:50 <1:4 1:100
30 1:64 1:400 1:64 1:400 1:64 1:800
31 1:64 1:300 1:64 1:400 1:64 1:400
32 1:64 1:400 1:64 1:400 1:64 1:400
33 1:32 1:200 1:16 1:200 1:32 1:200
35 1:64 1:800 1:64 1:800 1:64 1:800
36 1:16 1:100 1:16 1:100 1:16 1:200
40 1:16 1:300 1:16 1:300 1:16 1:300
49 <1:4 1:50 <1:4 1:50 <1:4 1:50
57 <1:4 <1:50 <1:4 <1:50 <1:4 <1:50
0316* 1:128 1:2000 1:128 1:2000 1:128 1:2000
0256* 1:64 1:1200 1:64 1:1400 1:64 1:1400
Коэффициент корреляции 0,87 0,86 0,89
* - сыворотки от переболевших пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом корь.
Приготовленная нами панель была откалибрована по этому стандарту при соблюдении условий рекомендованного ВОЗ и утвержденного национальным контрольным институтом ГИСК им. Л.А. Тарасевича теста на параллелизм и линейность для медицинских иммунобиологических препаратов. Панель была аттестована как «Отраслевой Стандартный Образец стандартной панели сывороток
крови человека, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к вирусу кори» (ОСО 42-28-394-07).
Первые опытно-промышленные серии тест-системы были использованы для оценки параметров серийного продукта. С помощью РТГА были отобраны 76 отрицательных (титр <1:2) и 236 положительных (титр >1:4) сывороток, среди которых 134 сыворотки имели протективный титр (титр >1:8). Результаты сравнительных постановок в ИФА показали, что чувствительность и специфичность тест-системы «Kopb-IgG-ДС» не уступает тест-системе «Enzygnost® Anti-Measles-Virus/IgG» (Dade Behring, ФРГ) и превышает аналогичные показатели тест-системы «Measles IgG ELISA» (Wampole Laboratories, США). Чувствительность тест-системы «Kopb-IgG-ДС» составила 98,7 %, специфичность - 96,2 %.
Европейское региональное бюро ВОЗ организовало тестирование тесг-системы «Kopb-IgG-ДС» в глобальной сети лабораторий Всемирной организации здравоохранения, которое было проведено в 2004-2005 гг. в НИИ эпидемиологии и микробиологии (Минск, Республика Беларусь) и Национальной лаборатории здравоохранения (Ньюфаундленд, Канада). В заключительном отчете показано соответствии результатов тестирования «Kopb-IgG-ДС» в сравнении с национальными эталонами при анализе охарактеризованных панелей сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу кори. Сделан вывод о полной пригодности тест-системы «Kopb-IgG-ДС» для оценки иммунитета к вирусу кори. Государственные испытания в ГИСК имени JI.A. Тарасевича подтвердили эффективность разработанной иммуноферментная тест-система «Корь - IgG-ДС» и она была разрешена для использования на территории Российской Федерации (ФСП 42-0155-7032-05).
Используя высокоспецифичный иммуносорбент, а также рабочую панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса М к вирусу кори, была разработана ИФА-тест-система для ранней диагностики заболевания. Для панели были отобраны положительные по наличию IgM образцы сывороток больных корью и краснухой с использованием рекомендованной ВОЗ и МЗ и CP РФ коммерческой ИФА тест-ситемы «Enzygnost Anti-MeasIes-Virus/IgM» (Dade-Behring, ФРГ). В результате отбора сывороток, подходящих по специфичности, качеству и объемам материала, была сформирована рабочая панель из 16 образцов. Оптимизация тест-системы проходила в 3 этапа: сначала было определено конечное разведение образцов в лунках иммуносорбента, затем была подобрана оптимальная концентрация
антигена. Оптимальный титр конъюгата анти-IgM человека с пероксидазой хрена в растворе конъюгата был определен, исходя из установленных первых двух параметров. На третьем этапе главным критерием было достижение 100 % специфичности тест-системы (отсутствие ложноположительного сигнала) с обязательным учетом параметра чувствительность (выявляемость положительных образцов). Примененный алгоритм оптимизации параметров тест-системы позволил добиться 100 % чувствительности и специфичности на охарактеризованной панели сывороток.
Таким образом, в результате проведенных исследований созданы два диагностических препарата, позволяющих выявлять антитела классов G и М к вирусу кори. Препараты успешно прошли испытания на национальном и международном уровнях и показали высокую чувствительность и специфичность в сравнении с лучшими зарубежными аналогами. Для корректного сравнительного испытания разработанных тест-систем была получена панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу кори «Стандарт AT-G(+/-)Kopb» (ОСО 42-28-394-07), специфическая активность сывороток в которой выражается в международных единицах. На базе ЗАО «МБС» было налажено производство промышленных серий тест-систем «Корь - IgG-ДС» и «Корь-IgM», которые были успешно применены для выполнения национальной программы элиминации кори.
Получение антигена вируса паротита и разработка средств диагностики на его основе. Для разработки иммуноферментной тест-системы были использованы референс-штамм Эндерс и штамм Драгун, выделенный при вспышке заболевания эпидемическим паротитом в р.п. Кольцово Новосибирской области в январе-июне 1994 года. Вирус паротита был очищен ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы из КВЖ и лизата зараженных клеток. Фракции, собранные с градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования, были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta. Вирус обладал типичной для паротита способностью агглютинировать эритроциты обезьяны. Результаты анализа фракций в РГА приведены на рисунке 7, А. Концентрирование вируса из культуральной вируссодержащей жидкости позволило получить вирус в препаративных количествах уже после однократного ультрацентрифугирования. Изучение препаратов методом электронной микроскопии показало, что в очищенных препаратах находятся вирионы и нуклеокапсиды с характерной для вируса паротита структурой.
s,
Q.
s Ш
50
t?
Рис. 7. Получение и изучение антигена вируса паротита. (А) - Анализ фракций вируса паротита
после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в РГА. (Б) - Электрофорез белков вируса паротита, шт. Эндерс. Дорожки 1 и 4- маркеры мол. весов: 66, 45,36, 18 кД. Дорожка 3 -белки вируса паротита. Стрелками указаны: белок № (верхняя полоса), М (нижняя полоса)
вируса паротита.
Для разработки ИФА-тест-системы выбрали штамма вируса паротита с такими характеристиками как высокая репродуктивность штамма, антигенное родство
Для подтверждения принадлежности выделенного изолята Драгун к вирусу паротита из КВЖ была выделена суммарная РНК, синтезирована кДНК и проведена ПЦР. Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы пары праймеров, перекрывающие районы генома в области, кодирующей участки генов F-и SH-белков (позиции 5276 - 5785 указаны для фрагмента кДНК вируса паротита, штамм SBL, изолят SBL-1). Расчетный размер данного участка с учетом включенных в праймеры сайтов для рестриктаз составляет 548 нуклеотидов, что соответствовал размеру ампликона. Первичная структура праймеров для фрагмента, соответствующего концу F-гена и SH-гену, приведена ниже:
F primer - TTGGATCCTTGTAGCAGCCTTAGTTTTGAG, R primer - CGGAATTCTGCTTTTTTCTTTATGTCTCATG. Секвенирование амплификационного фрагмента показало принадлежность штамма Драгун к вирусу паротита
123456789 10 Номер фракции градиента
(высокая серологическая перекрываемость) с другими штаммами вируса паротита, природное происхождение из географического региона проведения будущих исследований. Штаммы Эндерс, JI-3, Jeryl-Linn и Драгун вируса паротита использовали для получения препаративных количеств антигена. Штаммы культивировали на монослое культур клеток: ФЭК, Vero, CV-1, FRhK и Л-68. После культивирования собирали КВЖ и клеточный лизат для определения титра вируса. При получении урожая значительная часть вируса остается связанной с клеточными структурами, поэтому оставшиеся после слива КВЖ клетки разрушали замораживанием-оттаиванием, клеточный детрит осаждали низкоскоростным центрифугированием и надосадочную жидкость собирали. Результаты определения титра вируса паротита в КВЖ и клеточном лизате приведены в таблице 8. Как видно из данных таблицы 8 штаммы вируса паротита размножались во всех клеточных культурах. Максимальные титры вируса паротита достигались на 5-6 сут после заражения монослоя клеток Vero и для штамма Эндерс составляли 6,32 ± 0,29 lg ТЦД50/мл, а для штамма Драгун - 7,93 ± 0,49 lg ТЦД50/мл.
Таблица 8
Определения чувствительности культур клеток к вирусу паротита при стационарном способе
культивирования
Штамм вируса паротита Культура клеток Титр вируса/ образец
КВЖ Лизат клеток
ГАЕ/мл lg ТЦЩо/мл ГАЕ/мл lgTLWso/мл
Эндерс ФЭК 30,4+3,2 6,21 ±0,42 16,8+4,3 5,21 ±0,31
FRhK 4,3+0,8 6,63 ± 0,38 15,6+3,3 н.о.
ЛЭЧ 2,6+0,4 н.о. 4,0±0,5 н.о.
Л-68 2,1+0,8 н.о. 7,8+1,7 н.о.
Vero 34,9+3,1 6,32 + 0,29 31,1±3,6 5,39 ±0,28
Л-3 ФЭК 30,1+2,3 5,30 ±0,43 36,0±5,5 5,15 ±0,39
FRhK 2,2+0,3 6,30 ± 0,40 н.о. н.о.
Vero 15,6+2, 8 6,56 ± 0,54 8,5±2,0 5,23 + 0,41
Jeryl-Linn ФЭК 8,8+2,5 6,07 ± 0,38 30,4±2,6 5,88 ± 0,42
FRhK 1,9+0,2 6,90 ±0,43 1,7±0,3 н.о.
Vero 2,9+ 0,9 6,78 ±0,48 8,7±2,7 5,39 ±0,35
Драгун ФЭК 16,0+4,1 6,97 ±0,37 32,2±4,1 5,64 ±0,33
FRhK 8,1+2,8 6,90 ± 0,42 3,8+0,6 5,69 ±0,29
Vero 16,8+4,4 7,93 ± 0,49 32,9±4,6 6,46 ±0,53
н.о. - титр вируса не определяли.
Для выбора антигена были взяты сыворотки лабораторных животных, любезно предоставленные к.б.н. Т.Н. Юнасовой (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Использование для сорбции на планшет фракций с цельным вирусом штамма Эндерс, выделенным из
КВЖ, в отличие от использования фракций, выделенных из лизата клеток, инфицированных штаммом Эндерс (фракции, обогащенные нуклеокапсидами), повышает чувствительность реакции (табл. 9). Максимальные титры противокоревых антител выявлялись при использовании для сорбции на планшет антигена на основе штамма Драгун. По этой причине в качестве иммуносорбента для ИФА был выбран суммарный антиген на основе штамма Драгун, полученный смешиванием фракций, выделенных на градиенте плотности сахарозы при очистке КВЖ и лизата зараженных вирусом клеток, в пропорции 1:2 - 1:3.
Таблица 9
Определение титра антител в сыворотках крови лабораторных животных
Антиген Титр антител (Хер геом (195У серологическая реакция/ сыворотка
РТГА ИФА
1* 2* 3* 4* 1* 2* 4*
Штамм Эндерс
- фракция, 112,4 51,8 <1:4 5,8 529,8 1202,6 9,3
содержащая (92,2- (43,0- (2,2- (324,4- (931,1- (3,7-
цельный вирус 134,1) 71,2) 9,1) 848,7) 1458,4) 10,1)
-фракция,
содержащая 53 13,5 <1:4 243,4 881,7 5,8
нуклеокапсиды (44,4- (9,2- (192,2- (653,3- (2,9-
вируса 68,1) 19,5) 290,8) 1296,5) 8,2)
Штамм Л-3** 49,1 96,3 <1:4 <1:4 139,5 478,3 4,8
(30,5- (59,9- (111,7- (310,3- (0,4-
68,2) 124,6) 134,1) 634,1) 9,1)
Штамм 1егу1- 36,6 19,7 <1:4 <1:4 92,6 194,5 4,1
1лпп** (23,9- (8,7- (79,7- (173,8- (0,6-
49,4) 27,4) 105,8) 217,3) 7,8)
Штамм 295,3 165,3 <1:4 12,6 1007,4 1469,0 19,2
Драгун** (270,1- (148,7- (9,3- (944,6- (1273,3- (8,4-
319,3) 186,8) 14,7) 1165,2) 1585,7) 26,3)
* 1 - сыворотка кролика, иммунизированного цельным вирусом (получена из ГИСК им.Тарасевича);
2 - сыворотка кролика, иммунизированная очищенным нуклеокапсвдом из лизата клеток;
3 - нормальная кроличья сыворотка;
4 - сыворотка крысы, иммунизированной цельным вирусом (получена из ГИСК им. Тарасевича).
** - в качестве антигенов использованы суммарные (цельный вирус и нуклеокапсиды) фракции, собранные с градиента плотности сахарозы.
В препарате очищенного инакгивированного антигена определяли общий белок методом Лоури (Ьо\угу О.Н. еС а1., 1951). Исходя из концентрации белка, на карбонатно-бикарбонатном буфере (рН=9.6) готовили разведения препарата, содержащего 0,5; 1,0; 4,0 и 10,0 мкг/мл антигена вируса паротита, и вносили его по
100 мкл в лунки 96-луночных планшетов (Nunc, США). Показано, что 0,4 мкг препарата на лунку является оптимальной дозой антигена вируса паротита, обеспечивающей максимальные различия между положительными и отрицательными сыворотками (рис. 8).
Далее был проведен подбор оптимального разведения конъюгата и изучены сроки хранения тест-системы для определения антител класса G к вирусу паротита.
Разведем® сыворотки (1од2)
Рнс. 8. Определение оптимальной концентрации антигена вируса паротита для постановки ИФА.
По оси ординат показана разница соответствующих оптических плотностей положительного и
отрицательного образцов.
Для выявления корреляции при определении титров антител между методами ИФА и РТГА были использованы сыворотки мышей линии ВАЬВ/с, иммунизированных очищенным вирусом паротита. Очищенный вирус паротита штаммов Эндерс и Драгун вводили животным внутрикожно трехкратно с интервалом 16 сут в дозе 50 мкг/животное, используя при первой иммунизации полный адъювант Фрейда, а при повторных - неполный адъювант Фрейда. Определение титра антител проводили через 21 сут после последней иммунизации. Результаты экспериментов приведены в таблице 10. Использование разработанной ИФА-тест-системы позволяет выявлять антитела в сыворотках крови животных, в титрах более высоких, чем это возможно в РТГА. С помощью разработанной ИФА-тест-системы использовали для выявления антител класса О в сыворотках крови людей, вакцинированных живой паротитной вакциной или переболевших эпидемическим паротитом разной степени
тяжести. Всего в работу взяли сыворотки 41 пациента. Результаты анализа сывороток на содержание противопаротитных антител методом ИФА сравнивали с результатами, полученными в РТГА. Значения титров антител в исследуемых сыворотках крови людей, определенных с помощью тест-системы, коррелировало со значениями титров антител в этих сыворотках, определенных в РТГА.
Таблица 10
Сравнение эффективности выявления антител к вирусу паротита в сыворотках крови
иммунизированных животных
Специфичность N сыв- Титр антител (обратные величины)/ Реакция / Антиген
;ыворотки ки РТГА ИФА
штамм штамм штамм Эндер штамм
Эндерс Драгун Драгун
1 128 128 1280 640
Сыворотка против 2 128 64 640 320
вируса 3 128 32 640 320
паротита, 4 64 32 640 320
штамм Эндерс 5 64 32 320 320
6 64 32 320 160
Среднее по группе 90,51 45,25 570,18 320
(60,77- (24,62- (329,76- (202,0-
134,81) 83,17) 985,87) 506,93)
1 256 512 640 2560
Сыворотка 2 256 512 320 1280
против вируса 3 256 512 320 1280
паротита, 4 128 256 320 640
штамм Драгун 5 64 256 160 640
6 64 128 160 640
Среднее по группе 143,68 322,54 285,09 1015,94
(70,27- (178,09- (164,88- (560,95-
293,75) 584,15) 492,93) 1839,96)
Значения ОП контролей (положительный контроль, отрицательный контроль и контроль конъюгата) соответствовали требованиям, необходимым для учета результатов и указанным в проекте "Инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для определения титра антител к вирусу паротита". Определение коэффициента корреляции между методами показало высокую степень корреляционных связей: значения коэффициентов корреляции находились в интервале значений от 0,73 (для сывороток людей) до 0,90 (для сывороток животных).
Таким образом, полученный антиген вируса паротита был использован для разработки тест-системы, позволяющей выявлять антитела класса в к вирусу паротита в сыворотке крови человека. Результаты определения титра антител, полученные с использованием разработанной тест-системы, имели высокий
коэффициент корреляции с результатами определения титра антител, полученными с использованием «золотого» стандарта - реакции торможения гемагглютинации.
Изучение разнообразия вирусов кори и паротита, циркулирующих на территории Западной Сибири. Детальное изучение передачи инфекционного агента особенно важно в вирусологии и эпидемиологии. Анализ изолятов, выделенных в 5060-е годы XX столетия, показал, что циркуляция Эдмонстон-подобного генотипа А вируса кори, по-видимому, была достаточно широко распространена в мире (Takeda M. et al., 1999). Выделенные в России штаммы Buk 88, Gag 88 и II 88 (Tikhonova N.T. et al., 1992) и штамм Loss (Jin L. et al., 1996) также относились к генотипу А.
Начиная с 1996 года, проведена работа по сбору образцов от больных с клиническим диагнозом корь и генотипированию вируса кори, циркулирующего на территории Новосибирской области. В 1996 году при вспышке кори в детском доме у мальчиков 11 и 13 лет были получены образцы носоглоточных смывов и крови, из которых были выделены изоляты вируса кори Нов1/96 и Нов2/96. Фрагмент, включающий часть М- и F- генов (позиции 4725 - 5015) изолята Нов 1/96, был секвенирован. Проведено сравнение нуклеотидной последовательности этого изолята с последовательностями других изолятов вируса кори. Результаты анализа показали генетическое сходство выделенного изолята Нов1/96 с выделенным в России штаммом Buk88 и используемым для вакцинации в России штаммом JI-16 вируса кори (Haider A. et al., 1997). Изолят принадлежал к генотипу А. В 1997 году выделены еще два изолята, отнесенные к генотипу А и один изолят, принадлежащий к генотипу D6, ранее не выявляемый на территории России. Этот изолят был выделен при локальной вспышке заболевания в детском коллективе у мальчика 8 лет с клиническим диагнозом корь. Различий в клиническом проявлении кори у больных, от которых были выделены изоляты с генотипом А, и у больного, от которого был выделен изолят с генотипом D6, отмечено не было. Вирус, вызвавший заболевание у ребенка, был наиболее близок по нуклеотидной последовательности штамму New Jersey .US А/94/1, являющемуся референс-штаммом генотипа D6. В 1998 были генотипированы еще 2 штамма вируса кори, принадлежащие к генотипу А. После этого генотип А вируса кори более не обнаруживался. Слежение за вирусом кори показало, что генотип А был вытеснен генотипом D6. Все 8 штаммов вируса кори, обнаруженные на территории Западной Сибири в срок с 1998 по 2001 гг, относились к генотипу D6.
Циркуляция генотипа D6 в Западной Европе была показана ранее: этот генотип был найден в Великобритании в 1992-1995 годах (Jin L. et al., 1997) и в Испании в 1994 (Rima B.K. et al., 1995). Известно, что генотип D6 вызвал вспышку заболевания корью в Бразилии в1997 году, в Аргентине - в 1998 году и в Уругвае - в 1999 (Baumeister Е. et al., 2000). Есть предположение, что в РФ этот генотип попал из Европы, где он уже продолжительное время циркулирует.
Вирус паротита, как и вирус кори, в генетическом плане является стабильным вирусом с высокой степенью устойчивости к мутациям. Тем не менее, анализ последователькостей геномов различных изолятов, показал, что существует несколько различающихся вариантов вируса паротита - генотипов, которые циркулируют на определенных территориях. Ген SH (мРНК - 316 и.о., кодирует белок 57 а.о.) является самым вариабельным в геноме, и генотипирование штаммов вируса паротита проводится главным образом по этому гену. Филогенетический анализ, проведенный по генам HN и F, практически совпадает с данными, полученными по SH-гену.
Начиная с 1994 года, проведена работа по сбору образцов от больных эпидемическим паротитом н генотипированию вируса, циркулирующего на территории Западной Сибири.
В период с 12 января по 07 июня 1994 года в поселке Кольцово Новосибирской области была зарегистрирована вспышка заболевания эпидемическим паротитом. Всего за этот срок заболевание было диагностировано у 64 детей и 7 взрослых. Наибольший процент заболевших составили дети до 12 лет (35,8 % - дети 7-8-летнего возраста и 28,0 % - 11-12-летнего возраста). Течение инфекции было типичным: заболевание начиналось с повышения температуры тела до 38 °С, появления припухлости околоушной слюнной железы (как правило, с одной стороны), через 1-2 дня появлялась припухлость и другой околоушной железы, которая исчезала через 8-10 дней после начала заболевания. На основании клинических проявлений и по нарастанию титров противопаротитных антител в парных сыворотках, определенных с помощью РТГА и ИФА, больным был поставлен диагноз -эпидемический паротит. От двух больных были выделены изоляты вируса паротита (табл. 11).
Таким образом, был выделен и первично охарактеризован новый штамм вируса паротита, вызвавший вспышку заболевания эпидемическим паротитом в Новосибирской области в 1994 году. Штамм получил название "Драгун" (изоляты
"Драгун-1" и "Драгун-2") и был депонирован в коллекции вирусов ГНЦ ВБ РФ "Вектор" (номер - УВ-05). Секвенирование нуклеотидной последовательности показало принадлежность штамма к генотипу С. Полная нуклеотидная последовательность штамма была расшифрована в 2004 году и депонирована в базу данных ОепВапк (№ АУ669145).
Таблица 11
Получение и изучение свойств штамма «Драгун» вируса паротита
Идеентификационный номер Возраст, пол и вакцинальная история Срок забора образцов от появления клинических признаков Образцы Лабораторные исследования Штамм
ПЦР Серологическ ие исследования (титры антител) Биологические исследования (посев на культуру клеток Vero) Название изолята р I в и
IgM IgG Появлег ие симплас ов ПЦР с культур ой клеток
П-04/04 /03 8 л, м, в 1.5 год вакци ниров ан 72 ч Кровь Смыв + - 1:100 + + Драгун 1 С
11 сут Кровь Смыв - + 1:220 - -
14 сут Кровь Смыв н.и н.и + 1:410 - -
5,5 мес Кровь Смыв н.и н.и - 1:580 н.и. н.и. н.и. н.и.
П- 07/04 /03 7 л, Ж, в 1.5 год вакци ниро-вана 64 ч Кровь Смыв + - 1:50 + + Драгун 2 С
11 сут Кровь Смыв - + 1:110 - -
14 сут Кровь Смыв н.и н.и + 1:240 - -
н.и. - не исследовалось
Штамм ПетроНов был выделен от больного (возраст 17 лет) с клиническим диагнозом: эпидемический паротит, средней степени тяжести (табл. 12). Через 3 сут после появления температуры было зарегистрировано резкое увеличение околоушных слюнных желез, озноб, рвота, общая слабость, боли при глотании, головные боли. При осмотре зафиксировано увеличение подчелюстных лимфоузлов до 3,0 х 3,0 см, болезненность околоушных слюнных желез, ригидность затылочных мышц, повышение температуры тела до 39,9°С.
Таблица 12
Получение и изучение свойств штамма ПетроНов вируса паротита
« s S § sí S о М s •е-ё 1- X Лабораторные исследования Штамм
i 1 s 5 _ O ° 5 C-1 са ±2 о о tí U 8 я и о, в о о S * Z 3 з §• 3 я 2 а 3 о. >о ПЦР Серологическ ие исследования (титры антител) Биологические исследования (посев на культуру клеток Vero) «j 3 N с Е §
Г U 1> § S g o. a o ra 8 g * и as О IgM IgG Появлег ие симплас ПЦРс культур ой 1 s 3 к i—
О с ов клеток
П- 04/0 17 л, в 1.5 7 сут Кровь Смыв + - 1:28 0 + + Петро Нов Н
4 /03 год вакци 11 сут Кровь Смыв - + 1:33 0 - -
ниров 14 сут Кровь н.и + 1:37 - -
ана Смыв н.и 0 - -
5,5 Кровь н.и - 1:61 н.и. н.и.
мес. Смыв н.и 6 н.и. н.и.
н.и. - не исследовалось.
Для проведения работ по генотипированию выделенного изолята продукт ПЦР, полученный при использовании образца носоглоточного смыва, был секвенирован. Анализ генома вируса показал его принадлежность к генотипу Н (рис. 9).
0.00 > 0.0*1
- HRU03Pet
- ManchS1/UK95
- Fukuoka43/JPN00
- Glouc1/UK96 -Is!lp1/UK97
- DK8t/01(0MK81)
- Urb/Jap67
-WL21/CNA95
-Loug11/UK97
J(Гeнoтип Н)
]](Гвнотип |_) ^{Генотип б) ^(Генотип о) ^(Генотип К) ](Генотип С) ^{Генотип Е] ^(Генотип I) ^(Генотип В) |](Генотип Я) ^(Генотип ,/) -ЕпШиЗА45 З(ГанотипД)
-Ed2WK8B
Рис. 9А
-ХРШ621_31 0.051_
-сикэбвш
- вхххх875р
влр67ша
влетим
вдотцм
хххххяр
ВиР6711Кг — В^68М1У
I нкиозРЕТ
НиЗХХ881
-СЦЦ9401*А ]0
>
.АиБМЛ! "АЦвМЛ-З
Рис. 9Б
С1Ж9«31_0
-хкоазоо!
0.004_
В0Р6711ЯА
вхххх871р
В^бТШЗ
ВиР67иР12
ВОРбПЖ!
ххххх81р
вхххх875р
- стшоял
— ни5хх881 -В НЯиОЗРЕТ
- хииба.з1
>
1»
■ АивМЛ-Ч I АиЭ64Л-3
Рис. 9В
Рис. 9. Филогенетические деревья для изученных последовательностей вируса паротита, (А) - по ЭН-гену (сравнение с референс-штаммами), (Б) - по полным нуклеотидным последовательностям
генома вируса, (В) - по М-гену. Принятое обозначения штамма: АШ64Л2 = А- генотип, Ш- страна выделения (США), 64-год выделения, Л - сокращенное название штамма (.ГегуЬЬупл), 2 - номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), X - неизвестно. СМШОЯА - штамм Драгун, Н1Ш03Ре1 - штамм ПетроНов.
Для изучения возможных изменений в геноме вируса, вызвавших тяжелое течение инфекции и столь длительную циркуляцию вируса в организме больного, из зараженной культуры клеток Vero (3-й пассаж вируса от исходного, выделенного из носоглотки больного) была выделена РНК в достаточном для проведения работ по секвенированию количестве. После секвенирования было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей для 16 полных геномов относительно штамма ПетроНов и построен график плотности распределения в них мутаций (рис. 10). Изученные геномы распределились по последовательностям на три группы. В первую группу попал штамм ПетроНов и наиболее близкий к нему штамм HUSXX881, другая группа, наиболее далекая от названных, представлена тремя вакцинными штаммами Jeryl Lynn (AUS64J11, AUS64J12, AUS64J13), остальные 12 штаммов образуют третью, промежуточную группу. Следует отметить, что точки пересечения кривых для этих трех групп отсутствуют, что говорит об отсутствии явных рекомбинационных механизмов для исследованных штаммов вируса паротита.
Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена показал, что между дикими и вакцинными штамммами явных отличий нет (см. рис. 9). С незначительными перестановками внутри подгрупп, деревья для всех генов были схожи и практически повторяют дерево для полного генома (см. рис. 9, Б). Тем не менее, интересно отметить, что филогенетическое дерево отдельно для М-гена отличается от деревьев для всех других генов: штамм ПетроНов попадает в подгруппу вакцинных штаммов A-генотипа; а описанный ранее авторами штамм Драгун по М-гену наиболее близок к вакцинному штамму AUS64J12 (см. рис. 9, В). В настоящее время принято генотипировать изоляты вируса паротита по наиболее вариабельному фрагменту генома, включающему С-концевую часть гена F и SH-ген. Выделенный изолят относился к генотипу Н (см. рис. 9, А). Для отнесения выделенного изолята к этому генотипу были использованы референс-штаммы, предложенные в работе L. Jin и соавт. (2005).
В результате проведенной работы был выделен и первично охарактеризован новый штамм вируса паротита. Штамм получил название ПетроНов и был депонирован в коллекцию микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер - V-330). Полная нуклеотидная последовательность штамма была депонирована в базу данных GenBank (№ AY681495).
ДОЕб.иП
диаилч дигб4л:з
-ВиР58М|у —ВЛРв/Цга —хтизгии
—ХХХХХБф -
— ВХХХХВ71р -ШРвШН
— ШР6Ш12
— ШРЗТКгЗ
— ВХХХХ875(>
— СГиЫОга
— *Ко9г.0в1 СШкЭбСЬ
—низххсз!
-¡йсЕШ
тиОЗРе!
И г,--,
ГГ7 г .....и ' - ..... •■.... ... ' • ' ' . 1
!,............ Е7 :
и—. г" п ,„ ,г:, Г!: , -1 , ... -П1Ч■■ : ,.......*
N7 Р(У/1) М Р БН
Ь —> гены вируса
Рис. 10. Плотность вариабельности для 16 полных геномов вируса паротита относительно штамма ПетроНов. Окно расчета 1500 и.о., шаг - 20 н.о. Принятое обозначения штамма: АиБ64Л2 = А- генотип, Ш- страна выделения (США), 64-год выделения, Л - сокращенное название штамма (1егу1-Ьупп), 2 - номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), X - неизвестно.
В результате проведенных исследований впервые на территории России (Западная Сибирь) была показана циркуляция 2 генотипов вируса паротита - С и Н.
Таким образом, проведены молекулярно-эпидемиологические исследования, позволившие выявить основные генотипы вирусов кори и паротита, циркулирующие на территории Западной Сибири. Показана циркуляция генотипа В6 вируса кори в России и циркуляция генотипов С и Н вируса паротита. Выделенные изоляты этих генотипов позволили изучить основные свойства новых генотипов этих вирусов.
выводы
1. Разработана и запатентована технология получения концентрированных препаратов вируса Марбург из культурапьной вируссодержащей жидкости в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.
2. На экспериментальных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки) изучены иммуногенные и протективные свойства основных структурных белков вируса в сравнении с инактивированным препаратом вируса Марбург. При этом установлено:
а) препарат нативного белка полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (коэффициент защиты К.З. = 47 ± 12 %", 70 ± 14 %£),
б) препарат нативного белка УР40, полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 0 %¥, 16 + 8 %£),
в) препарат рекомбинантного белка вР, полученный в бакуловирусной системе,
вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 16 + 6 %)¥,
г) рекомбинантный белок йР в составе осповакцины вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета, но не защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 0 %)¥,
в) препарат рекомбинантного белка \Ф24, полученный в бакуловирусной системе, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 14 + 4 %)*,
£
при 2-х кратной иммунизации дозой 20 мкг/животное, доза вируса 50 ЛДзо/животное при 1-х кратной иммунизации дозой 20 мкг/животаое, доза вируса 50 ЛДзо/животное
3. Предложены и обоснованы новые способы доставки живой коревой вакцины и создания рекомбинантных препаратов. При этом установлено:
а) использование таблетированной и инкапсулированной форм живой коревой вакцины для перорального применения вызывает у кроликов появление специфических антител к вирусу кори,
б) введение живой коревой вакцины в просвет тонкого отдела кишечника обезьяны приводит к появлению специфических антител классов М, А и Б, а также нейтрализующих антител,
в) при введении кандидатной ДНК вакцины на основе белка Н вируса кори у мышей формируется специфический гуморальный и клеточный ответ.
4. На основе выделеного изолят вируса кори (штамм Нов096) разработана и после государственных испытаний и испытаний в сети лабораторий ВОЗ внедрена в практику здравоохранения «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса в к вирусу кори» с регистрацией результатов в МЕ.
5. В рамках программы элиминации кори проведены работы по изучению коллективного иммунитета в различных возрастных группах населения, выявлена группа (возраст 16-25 лет) с наибольшим количеством серонегативных лиц.
6. Разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори», использованием собранной и аттестованной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса М к вирусу кори, подтверждена ее эффективность.
7. На основе выделенного изолята вируса паротита (штамм Драгун) разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса в к вирусу паротита».
8. Показана циркуляция генотипа Б6 вируса кори и генотипов С и Н вируса паротита на территории РФ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов диссертации
1. Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург // Вопр. вирусол.- 1991- N. 5.-C.437-438.
2. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А, Агафонов А.П., Кузьмин В.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам // Вопр. вирусол,- 1991.-N. 2.-C.421-423.
3. Лавриненко И.А., Агафонов А.П. Изучение функциональной активности лимфоцитов у людей, вакцинированных против геморрагической лихорадки Марбург//Иммунология .- 1993-N. 1.-С.34-36.
4. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Жукова H.A., Кашенцева Е.А., Воробьева M.C. Некоторые показатели иммунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, после заражения гомологичным вирусом // Вопр. вирусол.- 1994.-N. 1- С. 13-17.
5. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Прозоровский H.C., Жукова H.A., Кашенцева Е.А., Воробьева M.C. Иммунологические показатели у морских свинок при моделировании геморрагической лихорадки Марбург // Вопр. вирусол. - 1994.-N. 5.-C.169-171.
6. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Кашенцева Е.А. Механизмы протективного иммунного ответа при моделировании лихорадки Марбург на обезьянах // Вопр. вирусол. - 1995.- N. 3.- С. 109-113.
7. Агафонов А.П., Калиберов С.А., Патрушева И.В., Ничеухина C.H., Перебоева Л.А., Игнатьев Г.М. Изучение иммуно-биологических свойств штаммов вируса паротита//Вопр. вирусол - 1995,-N. 3 - С. 115-119.
8. Ignatyev G.M., Agafonov А.Р., Streltsova М.А., Kashentseva Е.А. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys //J. BiotechnoL- 1996,- N. 44.- P. 111-118.
9. Игнатьев Г.М., Стрельцова M.A., Агафонов А.П., Кашенцева Е.А., Прозоровский Н.С. Экспериментальное изучение возможности лечения геморрагической лихорадки Марбург десфералом, рибавирином и гомологичным интерфероном // Вопр. вирусол - 1991.— N. 5 - C.206-209.
10. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Патрушев H.A., Ничеухина C.H., Рябчикова Е.И., Денисов С.И., Блинов В.М.. Выделение сибирского изолята вируса паротита//Вопр. вирусол - 1997.-N. 5,-C.222-226.
11. Агафонов А.П., Ничеухина C.H., Мерзликн Н.В., Кломакова Е.А., Гончаров А.Н., Майданюк А.Г., Игнатьев Г.М. Сравнительное изучение методов определения антител к вирусу кори //Вопр. вирусол - 1997.-N. 1,- С.44-47.
12. Santibanez S., Heider A., Gerike E., Agafonov A., Schreier E. Genotyping of measles virus isolates from Central Europe and Russia // J. Med. Virol. - 1999-Vol. 58.-N.3.-P313-320.
13. Полтавченко А.Г., Агафонов A.EL, Ничеухина C.H., Караваев B.C., Игнатьев Г.М. Использование иммуносуспензий на основе угля для определения антител к вирусу паротита методом дот-иммуноанализа // Биотехнология. -1999-N. 3.-С.86-91.
14. Ignatyev G., Steinkasser A., Streltsova М., Atrasheuskaya Е., Agafonov A., Lubitz W. Experimental study on the possibility of treatment of some hemorrhagic fevers // J. Biotechnol. - 2000,- N. 83.- P. 67-76.
15. Агафонов А.П., Стрельцова M.A., Суслопаров И.М., Игнатьев Г.М. Иммунологические показатели у больных эпидемическим паротитом // Вопр. вирусол. — 2001.- N. 4 - С.30-33.
16. Колокольцов А.А., Давидович И.А., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. Использование препаратов интерферона для экстренной профилактики геморрагической лихорадки Марбург на модели обезьян // Бюлл. экспер. биол. -2001.-N. 7.-С.88-91.
17. Stittelaar K.J., de Swart R.L., Vos H.W., van Amerongen G., Agafonov A.P., Nechaeva E.A., Osterhaus A.D. Enteric administration of a live attenuated measles vaccine does not induce protective immunity in a macaque model // Vaccine. -2002.-Vol. 20. -N. 23-24,- P.2906-2912.
18. Agranovsla I. E., Safatov A. S., Borodulin A. I., P'ankov О. V., Petrishchenko V. A., Sergeev A. N., Agafonov A. P., Ignatiev G. M., Grinshpun S.S. Agranovski V. New personal sampler for viable airborne viruses: feasibility study // J. Aerosol Science. -2003.-Vol. 34,-P.581-592.
19. Агафонов А.П., Каменева C.H., Агафонова О.А., Неверов А.А., Игнатьев Г.М. Изучение вирусологических и иммунологических показателей у больных рассеянным склерозом И Вестник РАМН. - 2004 - N. 8.- С.3-6.
20. Максимов H.JL, Букин Е.К., Агафонов А.П., Неверов А.А., Карпенко Л.И., Ильичев А. А., Игнатьев Г.М. Противокоревая ДНК-иммунизация в эксперименте: иммуногенность и безопасность // Вопр. вирусол. - 2005.- N. 1.-С.4-8.
21. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Свистов В.В., Смирнов И.В., Кривошеин Ю.С. Изучение in vitro антивирусных свойств Мирамистина в отношении вирусов кори и паротита //Антибиотики и химиотерапия. - 2005,- N. 5-6,- С. 17-19.
22. Агафонов А.П., Неверов А.А., Каменева С.Н., Сараев Д.В., Гинько З.И., Блинов В.М., Чумаков К.М., Игнатьев Г.М., Зверев В.В. Выделение, генотипирование и анализ полной нуклеотидной последовательности сибирского изолята вируса паротита // Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. — 2007.- N. 5,- С.34-41.
23. Agranovski I.E., Safatov A.S., Agafonov A.P. Pyankov O.V., Sergeev A.N. Monitoring of airborne mumps and measles viruses in a hospital // Clean. - 2008-Vol. 36. -N. 10-1!.- P.845-849.
Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях:
1. Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Твердохлебов А.В., Стрельцова М.А. и др. Изучение иммуногенности инактивированных вирусов Марбург и Мачупо// В кн: Итоги науки и техники. Серия "Вирусология", "Арбовирусы и арбовирусные инфекции". М. 1991 г, С.18-22.
2. Agafonov А.Р., G.M.Ignatyev, Z.A.Akimenko, V.E.Volchkov. Study of immunogenic and protective properties of Marburg virus GP, NP and VP40 protein// Abstracts IXth International congress of virology.- Glasgow Scotland.- 1993.- P52-7.-P.300.
3. Ignatyev G.M., Volchkov V.E, Blinov V.M., Samukov V.V., Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A. Phenomenon of immunosupression caused by Filovimses // Intern. J. Immunorehabilitat, - 1994,- N. l(Supp).- C.78-79.
4. Agafonov A.P., Streltsova M.A., Kashentseva E.A., Ignatyev G.M. Possible mechanism of immunosuppression for filoviruses infection // Intern. J. Immunorehabilitat,- 1994-N. l(Supp).-C.86-87.
5. Ignatyev G.M., Streltsova M.A., Agafonov A.P., Kashentseva E.A. Immunity indeces in the personnel involved in Marburg virus investigation // Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. - 1996- Vol. 90. -N. 5,-P.472.
6. Becker S., Volchkov V. E., Muhlberge E., Klenk H.-D., Agafonov A.P., G.M.Ignatyev. A recombinant vaccina virus expressing the surface protein of Marburg virus does not protected guinea pigs against Marburg-virus infection // Abstracts Xth International congress of virology.- Ierusalem, Israel.- 1996, PW 6040, P. 259
7. Nechaeva E.A., Varaksin N.A., Rjabicheva T.A., Kolokoltsova T.D., Ignatiev G.M., Agafonov A.P. Development of production technology of live measles vaccine for peroral administration. Animal Cell Technology: from Vaccine to Genetic Medicine, Kluwer Academic Publishers, M.J.T. Carrondo (eds), 1997, P.197-202.
8. Ignatyev G.M., Streltsova M.A., Kashentseva E.A., Patrushev N.A., Ginko S.I., Agafonov A.P. Immunity indexes in the personnel involved in haemorrhagic virus investigation. // In book: Proceedings of the 1996 ERDEC Scientific Conference on Chemical and Biological Defense Research. Ed. D.A.Berg, 1997., Aberdeen Proving Ground, MD 21010-5423, P. 323-330.
9. Nechaeva E.A., Kashentseva E.A., Agafonov A.P., Varaksin N.A., Bondarenko V.N., Konstantinov A.P., Kitz I.V., Senkina T.Y., Zhilina N.V. New form of the live measles vaccine for oral administration. Animal Cell Technology: New Developments-New Application, Kluwer Academic Publishers, 1998, P.573-575.
10. Агафонов А.П., Каменева C.H., Отрашевская К. А., Игнатьев Г.М. Молекулярно-эпидемиологическое изучение кори в Западно-Сибирском регионе в 1995-2001гг // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Вторая научная конференция с международным участием. Новосибирск, Россия, 2002. - С.228.
11. Ignatyev G., Agafonov A.P., Kameneva S., Atrasheuskaya A. Molecular epidemiological study of measles in Western Siberia (Russia) during 1995 - 2001: in Xllth International Congress of Virology. Poster Abstract 143V- #V1302. IUMS Paris, France; 2002.
12. Bukin E.K., Atrasheuskaja E.A., Kamaneva S.N., Maksimov N.L., Agafonov A.P., Ignatiev G.M. Evaluation of measles-specific immunity in a high-risk group // Clin. Microbiol. And Infection. - 2004,- Vol. 10. -N.3 (Supp.). P.340.
13. Agranovski I.E., Sergeev A.N., Pyankov O.V., Petrishchenko V.A., Agafonov A.P., Ignat'ev G.M., Borodulin A.I., Safatov A.S. Testing of a new personal sampler for detection of viable viruses in aerosol state // Atmos. Oceanic Opt — 2004. - Vol. 17, N. 5-6.-P. 429-432.
14. Agranovski I. E., Safatov A, S., Borodulin A. I., Pyankov О. V., Petrishchenko V. A., Sergeev A. N., Agafonov A. P., Ignatiev G. M., Sergeev A. A. and Agranovski V. Inactivation of viruses in bubbling processes utilized for personal bioaerosol monitoring // Appl. Environm. Microbiol. - 2004,- Vol. 70. -N. 12,- P.6963-6967.
15. Тихонова H.T., Журавлева Ю.Н., Мамаева T.A., Наумова М.А., Игнатьев Г.М., Неверов А., Агафонов А.П., Liffick S., Tashaev V., Rota P., Bellini W. Генотипы вируса кори, циркулирующего на территории РФ // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний: Междунар. конф. Новосибирск: ЦЭРИС, 2004. C.57.
16. Игнатьев Г.М., Неверов А.А., Отрашевская Е.В., Каменева C.H., Агафонов А.П., Максимов Н.Л., Тимошенко Л.А., Carbone К. Проблемы лабораторной диагностики кори и паротита. Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний: Междунар. конф. Новосибирск: ЦЭРИС,2004. С.249.
17. Дутов В.Н., Пьянков С.А., Демина O.K., Агафонов А.П., Сергеев А.Н., Дроздов И.Г. Изучение коллективного иммунитета к кори у детей Новосибирской и Смоленской областей в ходе реализации национальной программы элиминации кори //Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития: Междунар. науч.-пракгич. конф., посвящ. 50-летию науч.-исслед. ин-та пробл. биол. безопасности. Алматы. 2008. С.452.
Монографии:
1. Агафонов А.П., Пьянков С.А., Нечаева Е.А., Неверов А.А., Каменева С.Н., Рябчикова Е.И., Агафонова О.А., Сергеев А.Н., Нетесов С.В., Игнатьев Г.М., Лосев М.В. Корь: современные представления о возбудителе, клиника, диагностика, профилактика // Новосибирск, изд. «Полиада про», 2005,39 с.
2. Онищенко Г.Г., Ежлова Е.Б., Пакскина Н.Д., Братина И.В., Кутырев В.В.,
Куличенко А.Н., Топорков А.В.,........ Дроздов ИГ., Сергеев А.Н., Нетесов
С.В., Локтев В.Б., Агафонов А.П., и соавт. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред. Академика РАМН, проф. Г. Г. Онищенко, чл.-корр. РАМН, проф. В.В. Кутырева.- М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009.472 с.
3. Агафонов А.П., Агафонова O.A., Азаев М.Ш., Гинько З.И., Демина O.K., Дроздов И.Г., Дутов В.Н., Иванова Л.К., Козловский Л.И., Лосев М.В., Малкова Е.М., Нетесов С.В., Нечаева Е.А., Пьянков С.А., Рябчикова Е.И., Семенцова А.О., Сергеев А.Н., Сергеев A.A., Терновой В.А., Шиков А.Н. Вакциноуправляемые респираторные вирусные инфекции. Грипп, корь, эпидемический паротит, краснуха / Под ред. проф. И.Г. Дроздова / Новосибирск: Изд-во Типография N 1, 2008. - 210с.
Патенты:
1. Агафонов А.П., Стрельцова М.А., Игнатьев Г.М., Твердохлебов A.B.; Чепурнов A.A.; Калиберов С.А.; Кузьмин В.А.; Черный Н.Б. Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью. 1995. Патент РФ RU 2029561 С1.
2. Полтавченко А.Г., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Полтавченко А.Г. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом ДОТ-иммуноанализа на пористых стрипах.1999. Патент РФ № 2187121 (420).
3. Агафонов А.П., Каменева С.Н., Игнатьев Г.М. Штамм вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори. 2002. Патент RU № 2230785 С2.
4. Агафонов А.П., Пьянков С.А., Дутов В.Н., Демина О. К., Туманов Ю.В., Лосев М. В., Сергеев А.Н., Дроздов И.Г. Штамм вируса паротита Драгун для получения антигена - компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу паротита. 2007. Патент RU 2348691 С1.
Методические указания:
1. Покровский В.И., Шипулин Г.А., Манзенюк И.Н.; Кутырев В.В., Шарова И.Н., Осина H.A., Куклев В.Е., Щербакова С.А.; Куличенко А.Н.; Игнатьев Г.М.; Дроздов И.Г., Сергеев А.Н., Шиков А.Н., Семенцова А.О., Бабкина И.Н., Терновой В.А., Агафонов А.П.; Верещагин А.И., Зароченцев М.В., Воронцова Т.В., Опочинский Э.Ф. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности. Методические указания МУ 1.3. 256909. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. -17 с.
Список использованных сокращений:
БОЕ бляшкообразующая единица
ВГЖХ высокоэффективная газо-жидкостная хроматография
ВИЧ/СПИД вирус иммунодефицита человека, синдром приобретенного
иммунодефицита
ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения
ВПЧ вирусоподобная частица
ГИСК Государственный институт стандартизации и контроля
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
НАМ инактивированный антиген вируса Марбург
ИЛ интерлейкин
ИФА иммуноферментный анализ
КВЖ Культкральная вируссодержащая жидкость
ЛДзо 50%-ная, или средняя, летальная доза
ME международная единица (измерение активности препарата)
МЗ РФ Министерство здравоохранения Российской Федерации
МНТЦ Международный научно-технический центр
ОП оптическая плотность
ООВИ особо опасные вирусные инфекции
ПААГ полиакриламидный гель
РБТЛ реакция бластной трансформации лимфоцитов
РН реакция нейтрализации
РТГА реакция торможения гемагглютинации
ФСП Фармакопейная статья предприятия
АТСС Американская коллекция клеточных культур (American Туре
Cultures Collection)
CDC Центры по контролю и профилактике заболеваний США
(Centers for Disease Control and Prevention)
CD антигенраспознающий Т-клеточный рецептор
WHO Всемирная Организация Здравоохранения (World Health Organization)
Агафонов Александр Петрович Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций. Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук Усл. печ. л. 2. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров. П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул.Кропоткина, 555
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Агафонов, Александр Петрович
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ б
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Современные тенденции в подходах к созданию вакцин против геморрагических лихорадок.
1.1.1. Общие сведения и эпидемиология филовирусов.
1.1.2. Структурно-функциональные свойства филовирусов.
1.1.3. Факторы иммунной системы, определяющие эффективность вакцин против геморрагических лихорадок.
1.1.4. Рекомбинантные и ДНК-вакцины против филовирусных геморрагических лихорадок.
1.2. Программа ВОЗ ликвидации кори: задачи здравоохранения.
1.2.1. Контроль над заболеваниями корь и эпидемический паротит: профилактика вакцинными препаратами.
1.2.2. Альтернативные методы вакцинации.
1.2.3. Методы контроля эффективности вакцинации и серологическая диагностика кори и эпидемического паротита.
1.2.4. Молекулярно-эпидемиологический контроль. Генетический анализ штаммов вирусов кори и паротита.
Глава 2. ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ
2.1. Исходные материалы.
2.2. Основные методы.
Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВИРУСА МАРБУРГ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ
ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ
3.1. Идентификация штамма Popp вируса Марбург.
3.2. Видоспецифичность штамма Popp вируса Марбург.
3.3. Подбор условий культивирования вируса Марбург.
3.4. Способы и источники получения вируса Марбург.
3.5. Подбор условий концентрирования и очистки вируса Марбург.
3.6. Изучение иммуногенных свойств белков вируса Марбург.
3.7. Изучение протективных свойств белков вируса Марбург.
3.8. Изучение свойств синтетических пептидов - аналогов участка гликопротеинов вируса Марбург и вируса Эбола.„„„„,„,„„„„„„„„„„„„„■
Глава 4. РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ КОРИ
4.1. Препарат вакцины для перорального применения.
4.2. Препарат ДНК-вакцины для профилактики кори.
Глава 5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВИРУСА КОРИ И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ
ДИАГНОСТИКИ НА ИХ ОСНОВЕ
5.1. Актуальность диагностики коревой инфекции и серомониторинга противокоревой профилактики.
5.2. Иммуноферментная тест-система для определения антител класса G к вирусу кори.
5.2.1. Подбор условий культивирования, концентрирования и очистки вируса кори.
5.2.2. Выбор штамма вируса кори для создания ИФТС.
5.2.3. Оптимизация условий проведения ИФА.
5.2.4. Определение чувствительности и специфичности тест-системы.
5.3. Панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу кори.
5.3.1. Разработка сероконверсионной панели сывороток.
5.3.2. Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу кори «Стандарт AT-G(+/-) корь».
5.3.3. Разработка рабочей панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса M к вирусу кори.
5.4. Модернизация и испытания ИФТС для скрининга иммунитета к вирусу кори.
5.4.1. Дизайн тест-системы.
5.4.2. Производство ИФА тест-системы «Kopb-IgG-ДС».
5.4.3. Испытания «Тест-системы иммуноферментной для количественного определения антител класса G к вирусу кори»: полевые, в Глобальной сети лабораторий ВОЗ и Государственные испытания.
5.5. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител класса M к вирусу кори «Корь-IgM».
Глава 6. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ПАРОТИТА И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ НА ИХ ОСНОВЕ
6.1. Диагностика паротитной инфекции и оценка эффективности мероприятий по профилактике эпидемического паротита.
6.2. Иммуноферментная тест-система для определения антител класса к вирусу паротита.
6.2.1. Штамм Драгун вируса паротита.
6.2.2. Серологические свойства штамма Драгун вируса паротита.
6.2.3. Подбор условий культивирования вируса паротита.
6.2.4. Выбор штамма вируса паротита для использования в ИФТС.
6.2.5. Оптимизация условий проведения ИФА для определения антител класса G к вирусу паротита.
6.2.6. Изучение сроков хранения тест-системы для определения антител класса G к вирусу паротита.
6.2.7. Определение эффективности (чувствительности и специфичности) иммуноферментной тест-системы для определения антител класса G к вирусу паротита.
6.3. Разработка панели сывороток крови человека, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу паротита.
Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСОВ КОРИ И ПАРОТИТА, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
7.1. Выделение, изучение серологических свойств, определение нуклеотидной последовательности штаммов вируса кори, циркулирующих на территории Западной Сибири.
7.2. Выделение, изучение серологических свойств, определение первичной нуклеотидной последовательности штаммов вируса паротита, циркулирующих на территории Западной Сибири.
Благодарности
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций"
Борьба с инфекционными заболеваниями - одна из наиболее актуальных и приоритетных задач современного здравоохранения. Болезни, вызываемые инфекционными агентами, во многих странах являются главной причиной преждевременной смерти: в мире в целом на инфекционные заболевания приходится более 50% потерянных лет жизни (WHO, 2008; WHO, 2009). Смертность от инфекционных заболеваний характерна, главным образом, для населения развивающихся стран, однако и в странах с высоким уровнем здравоохранения мероприятия по снижению бремени инфекционных заболеваний входят вр все национальные программы социальной и медицинской направленности.
Реализация программы элиминации натуральной оспы, успехи в борьбе с полиомиелитом и корью доказывают возможность эффективной борьбы и даже полной эрадикации инфекционного заболевания. Несмотря на отсутствие таких важных с точки зрения борьбы с инфекцией данных, получение которых вполне достижимо при современном состоянии науки, как например, данные о свойствах белков вируса, струкчурно-функциональных связях генома с клиническими проявлениями заболевания, иммуносупрессивных потенциях вируса не помешали полностью искоренить опасное заболевание натуральная оспа. Проверенный практикой комплексный подход, включающий в себя сочетание профилактики и эпидемиологического контроля, становится алгоритмом программы борьбы с инфекционным заболеванием и залогом успеха. Для успешной реализации мероприятий по борьбе с инфекционным заболеванием на первых этапах исследования необходимо получить сам этиологический агент или его антигенные компоненты и провести изучение их структурно функциональных и иммунобиологических свойств.
Актуальность проблемы заключается в том, что на сегодняшний день корь, наряду с малярией, туберкулезом, ВИЧ/СПИД, холерой, эпидемическим паротитом, краснухой, остается наиболее распространенным инфекционным заболеванием в мире (WHO, 2008; WHO, 2009). Программой ВОЗ определена задача усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори. В настоящее время расположенные в 6 регионах 192 государства-члена ВОЗ выполняют программу ликвидации кори. Для 3 регионов (Европейский, Восточного Средиземноморья и Западной части Тихого океана) определены задачи по элиминации кори и сроки их решения. Двум регионам ВОЗ (для стран Африки и Юго-Восточной Азии) предстоит решить задачу по снижению смертности от кори.
Приказами МЗ РФ от 19.08.2002 № 270 «Об утверждении программы ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 году» 21.03.2003 № 117 «О реализации "Программы ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году"» в рамках программы ВОЗ усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори была принята национальная программа элиминации кори. Для ее успешной реализации необходимо было организовать работы по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу за инфекцией и разработать эффективные тест-системы для подтверждения случаев заболевания и оценки проведения серомониторинга кори в России. Программа в России была успешно реализована: в 2009 заболеваемость корыо снизилась до уровня менее 1 случая на 1 млн. населения, что позволило 2010 году завершить реализацию Программы ликвидации кори в Российской Федерации и начать процедуру подготовки сертификации территорий для документального подтверждения статуса субъектов РФ как территорий, свободных от эндемичной кори (Гос. доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2009 году, 2010; Приказ №308, 2010).
Тем не менее, в странах, в которых национальные программы вакцинации еще не приняты, корь и эпидемический паротит продолжают оставаться одними из наиболее распространенных респираторных вирусных инфекций человека и служат причиной заболевания около 700 тыс. (около 300 тыс. - корь и около ч
400 тыс. - эпидемический паротит) человек ежегодно (WHO, 2009). Зарегистрированное количество случаев заболевания корью в мире уменьшилось с 852937 в 2000 до 278358 в 2008 году (WHO/UNICEF, 2009). В 2008 году все государства-члены ООН подтвердили свою приверженность делу обеспечения 90% сокращения смертности от кори к 2010 году, и в этом случае ожидаемая смертность к 2010 году будет составлять менее 73 000 человек (Global М.М., 2009).
С одной стороны это подтверждает эффективность мероприятий вакцинопрофилактики в борьбе с инфекциями, с другой - указывает на незащищенность населения от других вирусных инфекций, средства профилактики для которых еще не разработаны. Неконтролируемые инфекции представляют биологическую опасность для России и с точки зрения возможного завоза на территорию эндемичных вирусов при расширяющихся экономических и туристических связях в мире, и с точки зрения умышленного использования инфекционного агента. В соответствии с "Основами государственной политики в области химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 г. и дальнейшую перспективу", утвержденными Президентом Российской Федерации 4 декабря 2003 г. №Пр-2194, Федеральным законом от 30 марта 1999 года № 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (Собрание законодательства РФ, 1999), Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 ноября 1995 г. №1113 "О единой государственной системе предупреждения и ликвидации чрезвычайных ситуаций", Указом Президента Российской Федерации от 13 сентября 2004 г. №1167 "О неотложных мерах по повышению эффективности борьбы с терроризмом" (Собрание законодательства РФ, 2004) ставится задача защиты от неконтролируемого или умышленного воза ООВИ на территорию нашего государства и разработки и осуществления мероприятий, направленных на недопущение распространения эндемичного заболевания. Особую опасность для человека из-за своей высокой контагиозности и патогенности представляют возбудители вирусных геморрагических лихорадок. Вирусы, вызывающие заболевания с геморрагическим синдромом, относятся главным образом к четырем семействам: Filoviridae, Arenaviriclae, Bunyaviridae и Flaviviridae. К наиболее опасным с точки зрения последствий для не эндемичных территорий можно отнести представителей семейства Filoviridae - вирусы Марбург и Эбола, летальность от которых составляет 80-90%. Последняя вспышка заболевания Марбург вовлекала в себя территории нескольких государств, длилась 1,5 года и унесла жизни 356 человек. При вспышке геморрагической лихорадки Эбола в Уганде в мае-ноябре 2007 г. заболевание было зарегистрировано у 149 человек, 37 человек погибло (Atlanta Journal-Constitution, 2007). По другим данным лихорадка унесла жизни 186 человек из 260 заболевших (Leroy Е.М., et al., 2009). Согласно данным ВОЗ с начала открытия геморрагической лихорадки Эбола этим заболеванием заболело более 1850 человек и более 1200 человек погибло.
Если учесть увеличение скорости передвижение людей, использующих современные виды транспорта, расширяющиеся деловые, экономические, туристические связи между государствами всего мира, а также высокую контагиозность вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, опасность заноса инфекции на не эндемичные территории и возникновение там вспышек с серьезными последствиями становится вполне реальной. Следует учитывать, что для многих возбудителей геморрагических лихорадок четко не определены ни ареалы распространения, ни резервуары инфекции, ни переносчики и способ передачи, и это делает проблему еще более острой. В настоящее время для борьбы с этими инфекциями не разработаны эффективные средства профилактики и лечения, и это является первоочередной задачей вирусологической науки.
Таким образом, целью данной работы являлась получение вирусных антигенов и изучение их иммунобиологических свойств для разработки средств диагностики и профилактики особо опасных (Марбург) и социально значимых (корь, паротит) вирусных инфекций.
Исследование проводилось по трем основным направлениям: первое включало в себя получение антигенов вируса Марбург, изучение их иммуногенных и протективных свойств и определения антигенов, перспективных для создания вакцины против геморрагической лихорадки Марбург. В рамках второго направления исследования необходимо было оценка перспективности современных подходов к созданию профилактических препаратов против социально значимой инфекции - корь. Третьим направлением работы являлось изучение изменчивости циркулирующих па * территории России вирусов кори и паротита и создаиие на основе выделенных штаммов этих вирусов диагностических ИФА тест-систем.
В связи с этим для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработка технологии получения очищенных вирусов из культуральной вируссодержащей жидкости с целью получения антигенов для изучения иммуногенных свойств или разработки современных ИФА-тесг-систем в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.
2. Получение антигенов вируса Марбург, изучение их иммуногенных и протективных свойств и определения антигенов, перспективных для создания вакцины против геморрагической лихорадки Марбург.
3. Оценка перспективности современных подходов к созданию профилактических препаратов против кори - изучение иммуногенности экспериментального препарата на основе живого вируса кори при пероралыюм его применении и ДНК-вакцины.
4. Выделение и изучение циркулирующих на территории России вирусов кори и паротита с целью слежения за их антигенной и генетической изменчивостью и создания на их основе диагностических ИФА-тест-сисгем.
Научная новизна.
Впервые разработана и применена для создания профилактических и диагностических препаратов уникальная технология получения очищенных препаратов вируса Марбург. В результате использования запатентованной технологии впервые получены препараты белков вируса Марбург и изучены их иммуногенные и протективные свойства. Данные проведенных исследований могут быть использованы при разработке диагностических и профилактических препаратов против геморрагической лихорадки Марбург.
Показана принципиальная возможность разработки пероральной вакцины против кори и ДНК-вакцина против кори.
Изучены антигенные и генетические особенности штаммов вирусов кори и паротита: показана антигенное сходство циркулирующих на территории России штаммов вируса кори и антигенное сходство циркулирующих на территории России штаммов вируса паротита. Впервые показана циркуляция генотипа Э6 вируса кори и генотипов С и Н вируса паротита на территории РФ.
Впервые в стране разработана и внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса к вирусу кори, позволяющая оценить содержание антител класса в международных единицах.
Впервые в стране разработана тест-система иммуноферментная для определения антител класса ^М к вирусу кори.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения антител класса IgG к вирусу паротита.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Отработана и запатентована технология получения вирусных антигенов, которые могут быть использованы для получения профилактических и диагностических препаратов (патенты RU2029561C1, RU2230785C2, RU2348691C1). В результате использования современных методов биотехнологии и вирусологии получены и охарактеризованы по иммуногенным и протективным свойствам структурные белки вируса Марбург, которые могут быть использованы для получения нового поколения вакцин - субъединичных или ДНК-вакцин. Данные но иммуногенности белков вируса Марбург могут быть использованы также при разработке диагностических препаратов.
В рамках проведенных исследований показана принципиальная возможность создания более удобного в применении и более простого с точки зрения организации профилактических мероприятий варианта коревой вакцины ' - препарата для перорального применения. В рамках реализации программы глобальной ликвидации кори разработаны эффективные ИФА-тест-системы для ,, диагностики кори и проведения мероприятий по серомониторингу заболевания, а также изучены антигенные свойства циркулирующих на территории Сибири генотипов вируса. Исследования по серомониторингу заболевания позволили выявить возрастные группы населения, наиболее подверженные опасности заболевания корью. Данные исследований по изучению антигенных свойств новых генотипов вируса кори и вируса паротита подтверждают отсутствие необходимости поиска новых вакцинных штаммов для продолжения программы вакцинопрофилактики этих заболеваний.
Штамм Popp вируса Марбург депонирован в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) под номером
ГКВ N 946 от 20 января 1993 г. Штамм рекомендован для производства диагностических и вакцинных препаратов. Штаммы вируса кори и паротита депонированы в коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор (штамм «НовО/96» вируса кори - № У-04, штамм «Драгун» вируса паротита - № У-06, штамм «ПетроНов» вируса паротита - № У-08) и использованы для получения антигена - основного компонента ИФА-тест-системы.
За период с получения разрешения на использование тест-системы «Корь-^в-ДС» (2004 г.) всего было выпущено и поставлено потребителям 8 серий тест-системы, достаточных для проведения 80 ООО анализов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Белок № вируса Марбург обладает выраженными иммуногенными свойствами и вызывает образование вирусспецифических антител и развитие клеточного иммунитета, формируя протективный иммунный ответ при введении лабораторным животным.
2. Вакцинный штамм вируса кори способен вызывать формирование специфического гуморального и клеточного иммунного ответа у лабораторных животных при пероральном применении.
3. Введение лабораторным животным ДНК-вакцины на основе гемагглютинина вируса кори приводит к формированию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.
4. Наибольший процент лиц, не имеющих протективных антител к вирусу кори, входит в возрастную категорию населения РФ от 1 б до 25 лет.
5. Циркулирующие на территории РФ в период с 1993 по 2001 гг. вирусы кори и паротита находятся в близком антигеном родстве с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики. Апробация работы. Результаты исследований были доложены: на международной конференции "Медицина, биотехнология, иммунизация и
СПИД" (Ленинград, 1991), международном симпозиуме "100 лет вирусологии"
Москва, 1992), международной конференции 100-летие вирусологии (Санкт
16
Петербург, Россия, 1992), IX (Глазго, 1993), X (Иерусалим, 1996), XII (Париж, 2002) международных вирусологических конгрессах, 2-й, 3-й и 4-й международных конференциях «Новые направления в развитии вакцин» (Вена, Австрия, 1995, 1997, 1999 гг.), международной конференции «Вирусы Марбург и Эбола» (Марбург, Германия, 2000), 11 -м международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Канкун, Мексика, 2004), IX международной конференции «Новые технологии в медицине и экологии» (Гурзуф-Ялта, 2001), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции по медико-биологическим исследованиям (Мюнхен, 2004), Азиатском конгрессе по аэрозолям (Гонконг, 2004), VI межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств -участников Содружества Независимых Государств: проблемы биобезопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2006), II и III Российских научных конференциях с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 и 2006), международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Республика Казахстан, 2008). Всего по результатам работы было опубликовано 14 статей в ведущих международных и 19 статей - в ведущих российских научных журналах (23 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК), 3 монографии, 4 патента, 1 методические указания, а также 46 тезисов.
Работа выполнена в 1990-2009 годах в ГНЦ ВБ "Вектор" в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ (1035В, 2168). Работы по оценке иммуногенности живой коревой вакцины при пероральной аппликации были проведены в лаборатории профессора А.Б.М.Е. СМегЬаш (Университет им. Э.
Роттердамского, Роттердам, Нидерланды). Изучение штамма НовО/96 вируса кори было проведено в лаборатории кори и краснухи д-ра Е. венке (Институт им. Р. Коха, Берлин, Германия). Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании проблемно-тематической комиссии «Эпидемиология, вирусология и диагностика особо опасных вирусных инфекций» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2010). ч
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Агафонов, Александр Петрович
выводы
1. Разработана и запатентована технология получения концентрированных препаратов вируса Марбург из культуральной вируссодержащей жидкости в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.
2. На экспериментальных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки) изучены иммуногенные и протективные свойства основных структурных белков вируса в сравнении с инактивированным препаратом вируса Марбург. При этом установлено: а) препарат нативного белка полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (коэффициент защиты К.З. = 47 + 12 %¥, 70+14 %£), б) препарат нативного белка УР40, полученный методом обращенно-фазовой хроматографии, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 0 %¥, 16 + 8 %£), в) препарат рекомбинантного белка вР, полученный в бакуловирусной системе, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 16 + 6 %)¥, г) рекомбинантный белок ИР в составе осповакцины вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует развитие специфического клеточного иммунитета, но не защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 0 %)¥, д) препарат рекомбинантного белка УР24, полученный в бакуловирусной системе, вызывает образование вирусспецифических антител, стимулирует
1 при 2-х кратной иммунизации дозой 20 мкг/животное, доза вируса 50 ЛДзо/животное у при 1-х кратной иммунизации дозой 20 мкг/животное, доза вируса 50 ЛД5о/животное развитие специфического клеточного иммунитета и защищает животных от введения летальных доз вируса Марбург (К.3.= 14 + 4 %)¥,
3. Предложены и обоснованы новые способы доставки живой коревой вакцины и создания рекомбинантных препаратов. При этом установлено: а) использование таблетированной и инкапсулированной форм живой коревой вакцины для перорального применения вызывает у кроликов появление специфических антител к вирусу кори, б) введение живой коревой вакцины в просвет тонкого отдела кишечника обезьяны приводит к появлению специфических антител классов М, А и в, а также нейтрализующих антител, в) при введении кандидатной ДНК вакцины на основе белка Н вируса кори у мышей формируется специфический гуморальный и клеточный ответ.
4. На основе выделеного изолят вируса кори (штамм Нов096) разработана и после государственных испытаний и испытаний в сети лабораторий ВОЗ внедрена в практику здравоохранения «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса в к вирусу кори» с регистрацией результатов в МЕ.
5. В рамках программы элиминации кори проведены работы по изучению коллективного иммунитета в различных возрастных группах населения, выявлена группа (возраст 16-25 лет) с наибольшим количеством серонегативных лиц.
6. Разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори», использованием собранной и аттестованной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса М к вирусу кори, подтверждена ее эффективность.
7. На основе выделенного изолята вируса паротита (штамм Драгун) разработана «Тест-система иммуноферментная для определения антител класса О к вирусу паротита».
8. Показана циркуляция генотипа Т)6 вируса кори и генотипов С и Н вируса паротита на территории РФ.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Агафонов, Александр Петрович, Новосибирск
1. Агафонов А.П., Калиберов С.А., Патрушев И.В. и др. Изучение иммунобиологических свойств вируса паротита // Вопр. вирусол. 1995. -№ 3. - С. 115-119.
2. Андреев А.П., Пилле Э.Р., Бабуева А.Д., Сарычева О.Ф. Изучение чувствительности методов определения антител к вирусу паротита // Вопр. вирусол. 1975. - № 4. - С. 463 - 466.
3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Гос. изд. Медицинской литературы. -Л., 1962.
4. Бессмертный Б.С., Ткачева М.Н. Статистические методы в эпидемиологии. -М., 1961.
5. Борисевич И. В., Михайлов В. В., Краснянский В. П. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола // Вопр. вирусол. 1995. - № 6. - С. 270-273.
6. Детские вирусные инфекции. Под редакцией Тототченко А.Н.- Л., 1979.
7. Дроздов С.Г., Сергиев В.П. Защита неэндемичных территорий от тропических вирусных геморрагических лихорадок. М, 1984.
8. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. -М, 1991.
9. Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Вирусология. М.: Медицина - 1966. Игнатьев Г.М. Иммуногенные и протективные свойства рекомбинантного белка NP вируса Ласса // Вопр. вирусол. - 2002. - № 2. - С. 28 - 31.
10. Игнатьев Г.М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. и соавторы. Иммунологические показатели у морских свинок при моделировании геморрагической лихорадки Марбург // Вопр. вирусол. 1994. - № 4. - С. 169-171.
11. Иммунопрофилактика и интерферонотерапия вирусных инфекций// Сб. Науч. Трудов. Труды инст. Им. Пастера, том 62. Ленинград. 1985 год.
12. Иммуноферментный анализ. Нго Т.Т., под ред. Г. Ленхофф. М.: Мир. -1988.
13. Информационный сборник за 1999 год. Центр Госсанэпиднадзора в Новосибирской области. 2000 г.
14. Колокольцов A.A. , Давидович И.А., Стрельцова М.А. и соавт. Использование препаратов интерферона для экстренной профилактики геморрагической лихорадки Марбург на модели обезьян //Бюлл. Экспер. Биол. Мед. -2001.-№7. -С. 88-91.
15. Кэтти Д. и др. Антитела. Методы: Кн. 2. М.: Мир. -1991.
16. Лебедев Л.Р., Ерошкин A.M., Гилёва И.П. // Биотехнология. -1997. № 7. -С. 38-42.
17. Ляшенко В.А., Юминова Н.В., Краснова В.П. Неинъекционные методы использования живой коревой вакцины // Вопр. вирусол. 1996. - № 4. - С. 84-86.
18. Максимова O.A., Попов В.Ф., Бектимиров Т.А. и соавторы. Сравнительная оценка нейровирулентности отечественной и зарубежных живых паротитных вакцин //http://www.bio.ru/lib2.htm 2008. - С. 1-8.
19. Материалы IX Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, РОСИНЭКС, 2006.
20. Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, РОСИНЭКС, 2002.
21. Медуницын Н.В. Вакцины для профилактики эпидемического паротита в России // Вакцинация. 2003. - № 1. - С. 4 - 5.
22. Новые методы иммуноанализа. Под ред. У.П. Коллинз. М.: Мир. - 1991.286
23. Поллекс Г., Герике И., Гордиенко Н.М. и соавт. Сравнительное исследование чувствительности серологических методов, используемых для выявления антител к вирусу паротита // Вопр. вирусол. 1986. - № 6. -С. 681 -685.
24. Попов В.Ф. Корь и коревая вакцина JI-16. М., 2002.
25. Попов В.Ф., Каплунова О.П., Юнасова Т.Н. К вопросу о качестве и эффективности отечественной живой паротитной вакцины // ЖМЭИ. -1997.-№2.-С. 51-53.
26. Приказ №308 от 11.08.2010 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «О проведении региональных совещаний «О реализации третьего этапа Программы ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году».
27. Рокицкий П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов. Минск, 1961.
28. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. -2000.
29. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и соавторы. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров // Иммунология. 1981. - № 3. - С. 506 - 509.
30. Сергеев В.А., Алипер Т.И., Рухадзе Г.Г., Бахуташвили Т.М. Иммунная система слизистых: концепция общности и механизмов функционирования // Вопр. вирусол. 1988. - № 4. - С. 393 - 401.
31. Смородинцев A.A. Острые вирусные инфекции у детей. Л., 1981.
32. Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, №14, ст. 1650.
33. Собрание законодательства Российской Федерации, 2004, №38, ст. 3779.
34. Стрельцова М.А., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М. Чувствительность культур клеток различных линий к вирусу Марбург // Вопр. вирусол. 1991. - № 5. -С. 437-438.
35. Тверских И.И., Данилов А.И., Щелков Г.И. и соавт. // Весн. АМН СССР. -1971.-№ 2.-С. 84-90.
36. Хенле В. Вирус паротита // В кн.: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. М.: Медицина. - 1974. - С. 366 - 384.
37. Хроника ВОЗ, 1984. Т. 38. - С. 95 - 98.
38. Шварц С.А., Букова В.Е. Корь: эпидемиология и иммунопрофилактика. -Кишинев: Штиинца. 1984.
39. Юминова Н.В. Научные основы совершенствования вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита // Автореф. док. дис. М., 1998.
40. Юминова Н.В. Современное состояние вакцинопрофилактики эпидемического паротита в России // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2002. - № 2. - С. 21.
41. Юминова Н.В., Краснова В.П., Ляшенко В.А., Ведунова С.Л. Специфическая активность и иммунологическая безопасность интраназального способа ревакцинации живой коревой вакциной из штамма Ленинград-16 // Вопр. вирусол. 1993. - № 3. - С. 111-113.
42. Afzal М.А., Buchanan J., Heath A.B., Minor P.D. Clustering of mumps virus isolates by SH gene sequence only partially reflects geographical origin // Arch. Virol. 1997.-Vol. 142.-N. 2.-P. 227-238.
43. Afzal M.A., Dussupt V., Minor P.D. et al. Assessment of mumps virus growth on various continuous cell lines by virological, immunological, molecular and morphological investigations // J. Virol. Meth. 2005. - Vol. 126. - P. 149 -156.
44. AllAfrica.com The Monitor (Kampala) edited., Sun 6 Jan 2008, http://allafrica.com/stories/200801060023 .html.
45. Alíela L., Bourry O., Pouillot R. et al. Ebola Virus Antibody Prevalence in Dogs and Human Risk//Emerg. Infect. Dis.-2005.-Vol. 11.-N. 3. P. 385 -390.
46. Almeida S.D., Waterson A.P., Simpson D.I.H. Morphology and morphogenesis of the Marburg agent // In: Marburg virus disease. Berlin ets. Springer, 1971. -P. 84 - 97.
47. Andrew M., Coupar B., Boyle D., Wunner W. Immunogenic properties immune response to recombinant vaccinia virus im mice // Immunol. Cell. Biol. 1989. -Vol. 67.-P. 331 -337.
48. Anjuére F., George-Chandy A., Audant F. et al. Transcutaneous immunization with cholera toxin B subunit adjuvant suppresses IgE antibody responses via selective induction of Thl immune responses // J. Immunol. 2003. - Vol. 170. -P. 1586- 1592.
49. Anonymous. Lassa fever imported to England // Commun. Dis. Rep. CDR Wkly. 2000. - Vol. 10. - P. 99.
50. Anonymous. Outbreak of Ebola haemorrhagic fever, Uganda, August 2000 -January 2001 // Wkly. Epidemiol. Rec. 2001. - Vol. 76. - P. 41-46.
51. Atlanta Journal-Constitution, ajc.com, 2007, hitp://w\v\% .aic.com/heaiih/ contcnt/heakh/stories/2007/11/30/cbola 1201 web.html.
52. Baca-Estrada M.E., Foldvari M., Ewen C. et al. Effects of IL-12 on immune responses induced by transcutaneous immunization with antigens formulated in a novel lipid-based biphasic delivery system //Vaccine. 2000. - Vol. 18. - P. 1847- 1854.
53. Baczko K., Brinckman U., Pardowitz I. et al. Nucleotide sequence of genes encoding the matrix protein of two wild-type measles virus strains // J. Gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - P. 2279 - 2282.
54. Baczko K., Pardowitz I., Rima B.K., ter Meulen V. Constant and variable regions of measles virus proteins strains encoded by the nucleocapsid and phosphoprotein genes derived from lytic and persistent viruses // Virology. -1992.-Vol. 190.-P. 469-474.
55. Barbers G.A., Marzes A.H., Bastmeijer M. et al. Blocking ELIZA for detection of mumps virus antibodies in human sera // J Virol. Meth. -1993. Vol. 42. - N. 2-3.-P. 155 - 168.
56. Barrero P.R., de Wolff C.D., Passeggi C.A., Mistchenko A.S. Sequence analysis of measles virus hemagglutinin isolated in Argentina during the 1997 1998 outbreak // J. Med. Virol. - 2000. - Vol. 60. - N. 1. - P. 91 - 96.
57. Basler C.F., Mikulasova A., Martinez-Sobrido L. et al. The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3 // J. Virol. 2003. -Vol. 77. - N. 14. - P. 7945 - 7956.
58. Basler C.F., Wang X., Muhlberger E. et al. The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -Vol. 97.-P. 12289- 12294.
59. Baumeister E., Siqueira M.M., Savy V., Friedrich F. Genetic characterization of wild-type measles viruses isolated during the 1998 measles epidemic in Argentina // Acta Virol. 2000. - Vol. 44. - N. 3. - P. 169 - 174.
60. Bausch D.G., Nichol S.T., Muyembe-Tamfum J.J. et al. Marburg hemorrhagic fever associated with multiple genetic lineages of virus // N. Engl. J. Med. -2006. Vol. 355. - P. 909 - 919.
61. Becker S., Feldman H., Will C., Slenczka W. Evidence for occurence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys do subclinical filovirus infections occur worldwide?// Med. Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 181. -P. 43 -55.
62. Bennett J., Whittle H., Samb B. et al. Seroconversions in unvaccinated infants: further evidence for subclinical measles from vaccine trials in Niakhar, Senegal // Int. J. Epidemiol. 1999. - Vol. 28. - P. 147 - 151.
63. Bienenstock J., Befus A.D. Mucosal immunology. Rav. Press, 1980.
64. Bishop D.H.L. Baculovirus expression vectors // Seminar in virology. 1992. -Vol. 3.-P. 253-264.
65. Bishop D.H.L. Molecular basis of virus attenuation // World Biotech. Rept. -1986.-Vol. l.-P. 255.
66. Bitnun A., Shannon P., Durward A. et al. Measles inclusion-body encephalitis caused by the vaccine strain of measles virus // Clin. Infect. Dis. 1999. - Vol. 29.-N. 4.-P. 855-861.
67. Blackburn N.K., Searle L., Taylor P. Antibody against haemorrhagic fevers in Central Africa human population // Trans, roy. Soc. trop. Med. Hyg. 1982. -Vol. 76.-P. 803-805.
68. Boriskin Yu.S., Booth J.C., Yamada A. Rapid detection of mumps virus by the polymerase chain reaction // J. Virol. Meth. 1993. - Vol. 42. - N. 1. - P. 23 -32.
69. Bowen E.T.W., Piatt G.S. A comparative study of strains of Ebola virus isolated from Southen Sudan and Northern Zaire in 1976 // J. Med. Viral. 1980. - Vol. 6.-N. 2.-P. 129.
70. Bowen E.T.W., Piatt G.S., Lloyd G et al. Viral haemorrhagic fever in Southern Sudan and Northern Zaire. Preliminary studies on the aetiological agent // Lancet. 1977.-Vol. 1. - P. 571 - 573.
71. Bowen E.T.W., Simpson D.I.H., Bright W.F. Vervet monkey disease: studies on some physical and chemical properties of the causative agent // Brit. J. exp. Path. 1969. - Vol. 50. - P. 400 - 407.
72. Bray M. The role of the type I interferon response in the resistance of mice to filovirus infection // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P. 1365 - 1373.
73. Buchmeier M.J., De Fries K.U., McCormick J.B. Comparative analysis of the structural polypeptides of Ebola virus from Sudan and Zair // J. Infect. Dis. -1983.-Vol. 147. -N. 2. P. 276-281.
74. Bukreyev A., Yang L., Zaki S.R. et al. A single intranasal inoculation with a Paramyxovirus-vectored vaccine protects guinea pigs against a lethal-dose Ebola virus challenge // J. Virol. 2006. - Vol. 80. - N. 5. - P. 2267 - 2279.
75. Bukreyev A., Skiadopoulos M.H., Murphy B.R., Collins P.L. Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors //J. Virol. 2006. - Vol. 80. - P. 10293 -10306.
76. Bukreyev A., Rollin P.E., Tate M.K. et al. Successful topical respiratory tract immunization of primates against Ebola virus //J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 6379-6388.
77. Bwaka M.A., Bonnet M.J., Calain P. et al. Ebola hemorrhagic fever in Kikwit, Democratic Republic of the Congo: clinical observations in 103 patients // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179 (Suppl. 1). - S.7.
78. Сапера E., Siqueira M.M., Hortal M., Friedrich F. Recent measles viral activity in Uruguai: serological and genetic approaches // Acta Virol. 2000. - Vol. 44. -N. l.-P. 35 -39.
79. Carbone K.M.,Wolinsky J.S. Mumps virus// In: Knipe D, Howley P, eds. Fields virology. 4th ed. Vol 1. Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins, 2001 -P. 1381-1400.
80. Cardoso A.I., Sixt N., Vallier A. et al. Measles virus DNA vaccination: antibody isotype is determined by the method of immunization and by the nature of both the antigen and the coimmunized antigen // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 2516 -2518.
81. Cauda R., Tumbarello M., Ortona L. et al. Inhibition of normal human natural killer cell activity by human immunodeficiency virus synthetic transmembrane peptides // Cell. Immunol. 1988. - Vol. 115. - P. 57 - 65.
82. CDC. Ebola virus infections in imported primates // Morbility and Mortality Weekly Report. Virginia, 1989. - Vol. 38. - P. 831 - 838.
83. CDC. Update. Filovirus infection associated with contact with nonhuman primates or their tissues // Morbility and Mortality Weekly Report. Virginia, 1990. - Vol. 39. - P. 404 - 405.
84. Chadwick N., Bruce I., Davies M. et al. A sensitive and robust method for measles RNA detection // J. Virol. Meth. 1998. - Vol. 70. -N. 1. - P. 59 - 70.
85. Chanh T.C., Kennedy R.C., Kanda P. Synthetic peptides homologous to HIV transmembrane glycoprotein suppress normal human lymphocyte blastogenic response // Cell. Immunol. 1988. - Vol. 111. - P. 77 - 86.
86. Chen R.T., Markowitz L.E., Albrecht P. Measles antibody: réévaluation of protective titers//J. Infect. Dis.- 1990.-Vol. 162.-P. 1036- 1042.
87. Chibo D., Birch C.J., Rota P.A., Catton M.G. Molecular characterization of measles viruses isolated in Victoria, Australia, between 1973 and 1998 // J. Gen. Virol. -2000. Vol. 81.-Pt. 10.-P. 2511 -2518.
88. Cianciolo G.J., Cope land T.O., Oroszlan S., Snyderman R. Inhibition of lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral envelope proteins // Science. 1985. - Vol. 230. - P. 453 - 455.
89. Clegg J.C.S. Vaccinia recombinant expressing Lassa virus internal nucleicapsid protein protect guinea pigs against Lassa fever // Lancet. 1987. - Vol. 8552. -P. 186- 188.
90. Cliff A.D., Haggett P. Statistical modelling of measles and influenza outbreaks// Stat. Methods in Med. Res. 1993. - Vol. 2. - P. 43 - 73.
91. Cohen B.J., Jin L., Brown D.W., Kitson M. Infection with wild-type mumps virus in army recruits temporally associated with MMR vaccine // Epidemiol. Infect.-1999.-Vol. 123. -N. 2. -P. 251 -255.
92. Cox N.J., McCormick J.B., Johnson K.M. Evidence for two subtypes of Ebola virus based on oligonucleotide mapping of RNA // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 147.-P. 272.
93. Damien B., Huiss S., Schneider F., Muller CP. Estimated susceptibility to asymptomatic secondary immune response against measles in late convalescent and vaccinated persons // J. Med. Virol. 1998. - Vol. 56. - P. 85 - 90.
94. Dobson A.P. What Links Bats to Emerging Infectious Diseases?// Science. -2005.-Vol. 310.-P. 628-629.
95. Easton A.J. Domachowske J.B., Rosenberg H. Animal pneumoviruses: molecular genetics and pathogenesis // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17. -N. 2. — P. 390 - 412.
96. Edmonson M. B., Addiss D.G., McPherson J. T. et al. Mild measles and secondary vaccine failure during a sustained outbreak in a highly vaccinated population // JAMA.- 1990. Vol. 263. - P. 2467 - 2471.
97. Emond R.I.D. A case of Ebola virus infection // Brit. Med. J. -1977. Vol. 2. -N. 6086.-P. 541.
98. Erdman D.D., Anderson L.J., Adams D.R. et al. Evaluation of monoclonal antibody-based enzyme immunoassays for detection of specific antibodies to measles virus // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29. - P. 1466 - 1471.
99. Eurosurveillance edition 2008, Volume 13/Issue 16 edited., http://www.eurosurveillance. org/edition/vl3nl6/0804174.asp.
100. Fedova D. Der Institutework fur Hygiene und Epidemiologie. Prag. - 1984.
101. Feldman H., Bugany H., Mahner F. et al. Filovirus-induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages // J. Virol. 1996. - Vol. 70. - P. 2208-2214.
102. Feldmann H, Klenk H-D, Sanchez A: Molecular biology and evolution of filoviruses. In Kaaden OR, Eichhorn W, Czerny CP, (eds.): Unconventional Agents and Unclassified Viruses, Arch. Virol. Supplementum 7:81, 1993.
103. Feldmann H, Mühlberger E, Randolf A, et al.: Marburg Virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle// Virus Res. 1992. - Vol. 24. - P. 1 - 8.
104. Feldmann H., Will C., Schikore M. et al. Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus // Virology. 1991. - Vol. 182. - P. 353 -356.
105. Feldmann H., Jones S.M., Daddario-DiCaprio K.M. et al. Effective postexposure treatment of Ebola infection // PLoS Pathog. 2007. - Vol. 3. - e2.
106. Finney D.J. Probit analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom. 1971.
107. Fisher-Hoch S.P. Stringent precautional are not advisable when caring for patients with viral haemorrhagic fevers // Rev. Med. Virol. 1993. - Vol. 3. - P. 7-13.
108. Fisher-Hoch S.P., Platt G.S., Neild G.H. et al. Pathophysiology of shock and hemorrhage in a fulminating viral infection (Ebola) // J. Infect. Dis. 1985. -Vol. 152.-P. 887-894.
109. Fooks A.R., Jeevarajah D., Warnes A. et al. Immunization of mice with plasmid DNA expressing the measles virus nucleoprotein gene // Viral. Immunol. 1996. -Vol. 9.-P. 65-71.
110. Frankova V., Holubova J., Grubhoffer L., Kasova V. Вклад в лабораторную диагностику паротита и парагриппа // Acta virol. -1988. Vol. 32. - P. 503 -514.
111. Friedman M. Radioimmunoassay for detection of virusspecific Ig A antibodies in saliva // J. Immunol. Meth. 1982. - Vol. 54. - P. 203 - 205.
112. Fruit Bats Serve as Ebola Reservoir //J. Watch Infect. Dis. -2005. -Vol. 2005. -P. 4.
113. Geisbert T.W., Geisbert J.B., Leung A. Single-injection vaccine protects nonhuman primates against infection with Marburg virus and three species of Ebola virus// J. Virol. 2009. - Vol. 83. - P. 7296 - 7304.
114. Gibb T.R., Norwood D.A., Woollen Jr. N., Henchal E.A. Development and evaluation of a fluorogenic 5 nuclease assay to detect and differentiate between Ebola virus subtypes Zaire and Sudan // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. -P. 4125-4130.
115. Giraudon P., Jacquier M.F., Wild T.E. Antigenic analysis of African measles virus field isolates: identification and localisation of one conserved and two variable epitope sites on the NP protein // Virus Res. 1988. - Vol. 18. - P. 137 - 152.
116. Glenn G.M., Kenney R.T., Ellingsworth L.R. et al. Transcutaneous immunization and immunostimulant strategies: capitalizing on the immunocompetence of the skin // Expert. Rev. Vaccines. 2003. - Vol. 2. - P. 253-267.
117. Global Measles Mortality, 2000-2008// Morb. Mort. Week. Rep. 2009. - Vol. 58.-N. 47.-P. 1321 -1326.
118. Gonzalez J.P., Josse R., Johnson E.D., Merlin M. et al. Antibody prelevance against haemorrhagic fever viruses in randomized representative central african populations//Res. Virol. 1989. - Vol. 140. - P. 319 - 331.
119. Güerena-Burgueno F., Hall E.R., Taylor D.N. et al. Safety and immunogenicity of a prototype Enterotoxigenic Escherichia coli vaccine administered transcutaneously // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 1874 - 1880.
120. Gunther S., Emmerich P., Laue T. et al. Imported Lassa fever in Germany: molecular characterization of a new Lassa virus strain // Emerg. Infect. Dis. -2000. Vol. 6. - P. 466 - 476.
121. Gunther S., Weisner B., Roth A. et al. Lassa fever encephalopathy: Lassa virus in cerebrospinal fluid but not in serum // J. Infect.Dis. 2001. —Vol. 184. - P. 345-349.
122. Haas R., Maas G. Experimental infection of monkey with Marburg virus // In: Marburg Virus Disease (Eds. Martini G.A. and Siegert R.) Springer, New York. 1971.-P. 136- 143.
123. Hahne S., te Wierik M.J., Mollema L. et al. Measles outbreak, the Netherlands, 2008 // Emerg. Infect. Dis. 2010. - Vol. 16. - P. 567 - 569.
124. Haider A., Santibanez S., Tischer A. et al. Comparative investigation of the long non-coding M-F genome region of wild-type and vaccine measles viruses // Arch. Virol. 1997. -Vol. 142. - P. 2521 - 2528.
125. Han Z., Boshra H., Sunyer J.O. et al. Biochemical and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein: implications for a role in virus assembly and budding // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 1793 - 1800.
126. Hanses F., Truong A.T., Ammerlaan W. et al. Molecular epidemiology of Nigerian and Ghanaian measles virus isolates reveals a genotype circulating widely in western and central Africa //J. Gen. Virol. 1999. - Vol. 80. - Pt. 4. -P. 871 - 877.
127. Hanses F., van Binnendijk R., Ammerlaan W. et al. Genetic variability of measles viruses circulating in the Benelux // Arch. Virol. 2000. - Vol. 145. -N.3.-P. 541 -551.
128. Harcourt B.H., Sanchez A., Offermann M.K. Ebola virus selectively inhibits responses to interferons, but not to interleukin-1, in endothelial cells // J. Virol. -1999. Vol. 73. - P. 3491 - 3496.
129. Harcourt B.H., Sanchez A., Offermann M.K. Ebola virus inhibits induction of genes by double-stranded RNA in endothelial cells // Virology. 1998. - Vol. 252.-P. 179- 188.
130. Harris D.T., Cianciolo G.J., Snyderman R. et al. Inhibition of human natural killer activity by a synthetic peptide homologous to a conserved region in the retroviral protein, pl5E // J. Immunol. -1987. Vol. 138. - P. 889 - 890.
131. Hebebrand L.C., Mathes L.E., Olsen R.S. Inhibition of Conconavalin A stimulation of feline lymphocytes by inactivated feline leukemia virus // Cancer Res. 1977. - Vol. 37. - P. 4532 - 4539.
132. Henderson B.E., Kissling R.E., Williams M.C. et al. Epidemiological studies in Uganda relating to the "Marburg" agent // In: Marburg Virus Disease (Eds. Martini, G.A. and Siegert, R.) Springer, New York. 1971. - P. 166 - 176.
133. Hensley L.E., Mulangu S., Asiedu C. et al. Demonstration of cross-protective vaccine immunity against an emerging pathogenic Ebolavirus species// PLoS Pathogens.-2010.-Vol. 6.-N. 5.-P. el000904.
134. Hesketh L., Charlett A., Farrington P. et al. An evaluation of nine commercial EIA kits for detection of measles specific IgG // J. Virol. Meth. 1997. - Vol. 66.-?. 51-59.
135. Hevey M., Negley D., Pushko P. et al. Marburg virus vaccines based upon alphavirus replicons protect guinea pigs and nonhuman primates // Virology -1998.-Vol. 251.-P. 28-37.
136. Hirabayashi Y., Oka S., Goto H. et al. An imported case of Lassa fever with lateappearance of polyserositis // J. Infect. Dis. 1988. - Vol. 158. - P. 872 - 875.300
137. Hofman H., Kunz C.H. Kompliment bindende Antikorpet nach Infektion mit dem "Marburg-Virus" (Rhabdovirus simae) beim Menschen // Zentralblatt fur bakteriologie parasitenkuna Infektions kran-kheiten und Hygiene. 1969. - Vol. 209.-N. 3.-S. 288.
138. Holman D.H., Penn-Nicholson A., Wang D. A complex adenovirus-vectored vaccine against Rift Valley Fever virus protects mice against lethal infection in the presence of preexisting vector immunity// Clin. Vaccine Immunol. 2009. -Vol. 16.-P. 1624-1632.
139. Hoover E.A., Perryman L.E., Kociba G.J. Early lesion in cats inoculated with feline leukemia virus// Cancer Res. 1973. - Vol. 33. - P. 145.
140. Hu A., Norrby E. Role of individual cysteine residues in the processing and antigenicity of the measles virus haemagglutinin protein // J. Gen. Virol. 1994. -Vol. 75.-P. 2173-2181.
141. Huang Y., Xu L., Sun Y., Nabel G.J. The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein // Mol. Cell.-2002.-Vol. 10.-P. 307-316.
142. Huang Z., Dry I., Webster D. et al. Plant-derived measles virus hemagglutinin protein induces neutralizing antibodies in mice // Vaccine. 2001. - Vol. 19. -N. 15 - 16. - P. 2163 — 2171.
143. Imler J.-L. Adenovirus vectors as recombinant viral vaccines // Vaccine. 1995. -Vol. 13.-N. 13.-P. 1143-1151.
144. Isa M.B., Martinez L.C., Giordano M.O. et al. Resurgence of measles in the province of Cordoba, Argentina, in 2000 // Rev. Argent. Microbiol. 2001. -Vol. 33.-P. 229-234.
145. Ito H., Watanabe S., Sanchez A. et al. Mutational analysis of the putative fusion domain of Ebola virus glycoprotein // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 8907 -8912.
146. Jahring R.B., Geisbert T.V., Dalgard D.W. et al. Preliminary report: isolation of Ebola virus from monkeys imported to USA // Lancet. -1990. Vol. 335. - P. 502-505.
147. Jain S.L., Barone K.S., Michael J.G. Activation patterns of murine T cells after oral administration of an enteric-coated soluble antigen //Cell Immunol. 1996. -Vol. 167.-P. 170-175.
148. Janaszek W., Slusarczyk J. Immunity against measles in populations of women and infants in Poland // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 2948 - 2953.
149. Jasenosky L.D., Neumann G., Lukashevich I., Kawaoka Y. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer // J. Virol. -2001. Vol. 75. - P. 5205 - 5214.
150. Jin L., Brown D.W.G., Ramsay M.E.B. et al. The diversity of measles virus in the United Kingdom, 1992-1995 // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P. 1287 -1294.
151. Jin L., Richards A., Brown D.W.G. Development of a dual target-PCR for detection and characterization of measles virus in clinical specimens // Molecular and Cellular Probes. 1996. - Vol. 10. - P. 191 - 200.
152. Jin L., Sun Y.J., Ge L., Brown D.W. Characterization of a new genotype of measles virus detected in China and England // Epidemiol. Infect. 1998. - Vol. 121.-N. 3.-P. 691 -697.
153. Johnson B.K., Gitau L.G., Gichogo A. et al. Marburg, Ebola and Rift Valley fever virus antibodies in East African primates // Soc. trop. Med. Hyg. 1982. -Vol. 76.-P. 307-310.
154. Johnson B.K., Ocheng D., Gichogo A. et al. Antibody against Marburg haemorrhagic fever in randomized representative Kenya's population // Soc. trop. Med. Hyg. 1983.-Vol. 77. - P. 731 -733.
155. Jones S. M., Feldmann H., Stroher U. et al. Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses // Nat. Med. -2005.-Vol. 11.-P. 786-790.
156. Julkunen I. Serological diagnosis of parainfluenza virus infection with special emphasis on purity of viral antigens // J. Med. Virol. -1984. Vol. 14. - P. 177 - 187.
157. Katayama K., Oy a A., Tanabayashi K. et al. Differentiation of mumps vaccine strains from wild viruses by single-strand conformation polymorphism of the P gene// Vaccine. 1993.- Vol. 11.-N. 6. - P. 621 - 623.
158. Kenny M.T., Schell K. Serologic response to mumps virus // J. biol. Stand. -1975.-Vol.3.-P. 291 -306.
159. Khan A.S., Maupin G.O., Rollin P.E. et al. An outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates, 1994-1995 //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 57. - P. 519 - 525.
160. Khobloch J., Albiez E., Schmitz H. A serological survey on viral haemorrhagic fevers in Liberia // Ann. Virol. 1982. - Vol. 133. - P. 125 - 128.
161. Li J.T. The immune response: basic and clinical principles // Ann. Virol. 2006. -Vol. 295.-P. 1456- 1497.
162. Kievits T., van Gemen B., van Strijp D. et al. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimised for diagnosis of HIV-1 infection // J. Virol. Meth. 1991. - Vol. 35. - N. 2. - P. 273 - 286.
163. Kiley M.P., Cox N.J., Elliott L.IT. et al. Physicochemical properties of Marburg virus: Evidence for three distinct virus strains and their relationship to Ebola virus//J. Gen. Virol. 1988.-Vol. 69.-P. 1957- 1967.
164. Kim S.H., Song K.J., Shin Y.K. et al. Phylogenetic analysis of the small hydrophobic (SH) gene of mumps virus in Korea: identification of a new genotype//Microbiol. Immunol. -2000. Vol. 44. -N. 3. - P. 173 - 177.
165. King A.M., Scoff E.J., Langer S.J. et al. Recombinant vaccinia viruses earring the N gene of human respiratory syncytial virus: studies of gene expression in cell culture and immune response in mice // J.Virol. 1987. - Vol. 61. - N. 9. -P. 2885.
166. Klatzmann D., Champagne E., Chamaret S. et al. T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV // Nature. 1984. - Vol. 312. -P. 767.
167. Kleinerman E.S., Lachman L.B., Knowles R.D., Snyderman R. A synthetic peptide homologous to the envelope proteins of retroviruses inhibits monocyte-mediated killing by inactivating interleukin 1 // J. Immunol. 1987. - Vol. 139. -P. 2329-2334.
168. Knobloch J., McCormick J.B., Webb P.A. et al. Clinical observations in 42 patients with Lassa fever // Tropenmed. Parasitol. 1980. - Vol. 31. - P. 389 -398.
169. Koch G., van Roozelaar D.J., Varschueren C.A.J, et al. Immunogenic and protective properties of chicken anemia virus protein expression by baculovirus //Vaccine. 1995. -Vol. 13.-N. 8.-P. 763-770.
170. Komase K., Rima B.K., Pardowitz I. et al. A comparison of the nucleotide sequences of measles virus L genes derived from wild type viruses and SSPE brains tissue // Virology. 1995. - Vol. 208. - P. 795 - 799.
171. Kozak M. Possible role of flanking nucleotides in recognition of the AUG initiator codon by eukaryotic ribosomes// Nucl. Acid. Res. 1981. - Vol. 9. - P. 5233-5252.
172. Kraehenbuhl J.P., Neutra M.R. Molecular and cellular basis of immune protection of mucosal surfaces // Physiol. Rev. 1992. - Vol. 72. - P. 851 - 879.
173. Kreis S.5 Vardas E., Whistler T. Sequence analysis of the nucleocapside gene of measles virus isolates from South Africa identifies a new genotype // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P. 1581 - 1587.
174. Kunkel U., Schreier E., Siegl G., Schultze D. Molecular characterization of mumps virus strains circulating during an epidemic in eastern Switzerland 1992/93 //Arch. Virol. 1994. - Vol. 136. - P. 433 - 438.
175. Laemly W.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 // Nature. -1970. -Vol. 227. P. 680 - 685.
176. Le Guenno B. Emerging viruses // Sci. Am. 1995. - Vol. 273. - P. 56 - 64.
177. Leinikki P. Mumps// In: Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR, Griffiths PD, Schoub BD, eds. Principles and practice of clinical virology. 4th ed. Chichester: Wiley, 2004.- P. 459-466.
178. Leroy E.M., B. Kumulungui, X. Pourrut et al. Fruit bats as reservoirs of Ebola virus // Nature. 2005. - Vol. 438. - P. 575 - 576.
179. Leroy E.M., Epelboin A., Mondonge V. et al. Human Ebola Outbreak Resulting from Direct Exposure to Fruit Bats in Luebo, Democratic Republic of Congo, 2007 //Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 2009. - Vol. 9. - P.723-728.
180. Leung D.W., Ginder N.D., Fulton D.B. et al. Structure of the Ebola VP35 interferon inhibitory domain// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. - Vol. 106. -P.411^116.
181. Libert U.G., Flanagan S.G., Loffler et al. Antigenic determinants of measles virus hemagglutinin associated with neurovirulence // J. Virol. 1994. - Vol. 68. -P. 1486- 1493.
182. Longhi S. Nucleocapsid structure and function // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009. - Vol. 329. - P. 103 - 128.
183. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951 . Vol. 193. -P. 265-275.
184. Lupton H.W., Lambert R.D., Beauchaup B.M. et al. Method plaque neutralization for Ebola virus // Abst. Ann. Meeting Amer. Soc. Microbiol. -1981.-Vol. 4.-P. 251.
185. Marinova L., Muscat M., Mihneva Z., Kojouharova M. An update on an ongoing measles outbreak in Bulgaria, April-November 2009 // Euro Surveill. 2009. -Vol. 14.-N. 50.-Pii. 19442.
186. Marshall R.D. Glycoproteins // Ann. Rev. Biochem. 1972. - Vol. 41. - P. 673.
187. Martinez X., Brandt C., Saddallah F. et al. DNA immunization circumvents deficient induction of T helper type 1 and cytotoxic T lymphocyte responses in neonates and during early life // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1997. - Vol. 94. -P. 8726-8731.
188. Martini G., Siegert R. Marburg Virus Disease // Springer, New York. 1971.
189. Masae Itoh, Yoshinobu Okuno, Hak Hotta. Comparative analysis of titers of antibody against measles virus in sera of vaccinated and naturally infected Japanese individuals of different age groups // J. of Clin. Microbiol. 2002. - V. 40.-P. 1733 - 1738.
190. Mavrakis M., Kolesnikova L., Schoehn G et al. Morphology of Marburg Virus NP-RNA// Virology 2002. - Vol. 296. - P. 300 - 307.
191. Maurer A.M., Muhlemann K. Measles outbreaks in the Bern canton // Schweiz. Med. Wochenschr. 1998. - Vol. 128. - P. 317 - 322.
192. Mavrakis M., Kolesnikova L., Schoehn G. et al. Morphology of Marburg Virus NP-RNA // Virology. 2002. - Vol. 296. - P. 300 - 307.
193. Mazanac M.B., Nedrug J.G., Kaetzel C.S., Lamm M.E. A three-tiered view of the role of IgA in mucosal Defense // Immunil. Today. 1993. - Vol. 14. - P. 430-434.
194. McCormick J.B., Bauer S.P., Elliot L.N. Biologic differences between strains of Ebola virus from Zaire and Sudan // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 147. - N. 2. -P. 264.
195. Meager A., Leunf H., Woolley J. Assays for tumor necrosis factor and related cytokines // J. Immunol. Meth. 1989. - Vol. 116. - P. 1 - 17.
196. Measles epidemic attributed to inadequate vaccination coverage-Campania, Italy, 2002 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2003. - Vol. 31. - P. 1044 -1047.
197. Meissner H.C., Strebel P.M., Orenstein W.A. Measles Vaccines and the Potential for Worldwide Eradication of Measles // Pediatrics, 2004. - Vol. 114. -P. 1065-1069.
198. Meunier D.M.J., Johnson E.D., Gonzalez J.P. Serologycal evidence for Marburg virus antibodies in human of Central Africa // Bull. Soc. Path. Exot. 1987. -Vol. 80.-P. 51-61.
199. Meurman O., Hanninen P., Krishna R.V., Ziegler T. Determination of IgG and IgM class antibodies to mumps virus by solid-phase enzyme immunoassay // J. Virol. Meth. 1982. - Vol. 4. - P. 249 - 257.
200. Michael G. Landen, Beller M., Funk E. et al. Measles outbreak in Juneau, Alaska, 1996: implications for future outbreak control strategies // Pediatrics.1998.-Vol. 102.-P. 71-78.
201. Miller E., Hill A., Morgan-Capner R. et al. Antibodies to measles, mumps and rubella in UK children 4 years after vaccination with different MMR vaccines // Vaccine. 1995,-Vol. 13. -N. 9.-P. 799-802.
202. Misra A., Ganga S., Upadhyay P. Needle-free, non-adjuvanted skin immunization by electroporation-enhanced transdermal delivery of diphtheria toxoid and a candidate peptide vaccine against hepatitis B virus // Vaccine.1999.-Vol. 18.-P. 517-523.
203. Mitani M., Cianciolo G.J., Snyderman R. et al. Suppressive effect on polyclonal B-cell activation of a synthetic peptide homologous to a transmembrane component of oncogenic retroviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. — Vol. 84.-P. 237-245.
204. Modlin J.F., Jabbour J.R., Witte J.J., Halsey N.A. Epidemiologic studies of measles; measles vaccines and subacute sclerosing panencephalitis // Pediatrics. 1977.-Vol. 59.-P. 505-512.
205. Mossong J., O'Callaghan C.J., Ratnam S. Modelling antibody response to measles vaccine and subsequent waning of immunity in a low exposure population // Vaccine. 2000. - Vol. 19. - P. 523 - 529.
206. Mudur G. Indian scientists warn of "mutant measles" virus // BMJ. 2001- Vol. 322.-N. 7288.-P. 693.
207. Muhlberger E., Weile M., Volchkov V.E. et al. Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 2333 - 2342.
208. Muller C.P.; Beauverger P.; Schneider F. et al. Cholera toxin B stimulates systemic neutralizing antibodies after intranasal co-immunization with measles virus // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - Pt. 6. - P. 1371 - 1380.
209. Murphy F.A., Kiley M.P., Fisher-Hoch S.P. Filoviridae Marburg and Ebola viruses // In: Fields, B.N. and Knipe D.M. (Eds.), Virology. Raven Press, New York. - 1990.
210. Nancy S.J., Geisbert T.W., Geisbert J.B. et al. Accelerated vaccination for Ebolavirus haemorrhagic fever in non-human primates // Nature. 2003. - Vol. 424.-P. 681-684.
211. Nathans on N. Epidemiology // In: Virology 2nd Edition. Eds: Fields B.N., Knipe D.M., Chanock R.M. et al. Raven Press, New York. - 1990. - Vol. 1. -P. 267-291.
212. New@NATURE.COM, MONDAY 7 MARCH 2005, (Published online: 4 March 2005; doi:10.1038/Khamsi, htlp://wvvw.natiire.coni/ncws/2005/050228/ full/050228- 16.html)
213. Noda T., Sagara H., Suzuki E. et al. Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 4855-4865.
214. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update) // Wkly. Epidemiol. Rec. 2001. - Vol. 76. - N. 33. - P. 249 -251.
215. Norrby E. Measles vaccination, today and tomorrow // Ann. Inst. Pasteur. Virol. 1997. - 136 E. - P. 561 -570.
216. Novotny J. Свойства и использование антигена вируса паротита для определения специфических IgG и IgM антител с помощью иммуноферментного анализа // Acta virol. -1990. Vol. 34. - P. 568 - 571.
217. Olsen R.G., Hoover E.A., Schaller J.P. et al. Abrogation of resistance to feline oncornavirus disease by immunization with killed feline leukemia virus // Cancer Res. 1977. - Vol. 37. - P. 2082 - 2085.
218. Outlaw M.C., Pringle C.R. Sequence variation within an outbreak of measles virus in the Coventry area during spring/summer 1993 // Virus Res. 1995. -Vol. 39.-P. 3-11.
219. Packet Newspapers online edited., Mon 28 Apr 2008, http:/A\^vv\.falmouthpackel.co.uk/mostpopular.var.2230509.mosiviewcd.measlc s outbreak in camborne.php.
220. Paddington L., Bevan M.J., Rose J.K. et al. N protein is the predominant antigen recordnised by vesicular stomatitis virus specific cytixic T-cell // Virology. -1986.-Vol. 60.-P. 7-8.
221. Partidos C.D. Antigens onto bare skin: a 'painless' paradigm shift in vaccine delivery // Expert. Opin. Biol. Ther. 2003. - Vol. 3. - P. 895 - 902.
222. Paterson A.T., Bauer J.T., Mills J.N. Ecologic and geographic distribution of Filovirus disease // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 42 - 47.
223. Peltola H.; Heinonen O.P.; Valle M. et al. The elimination of indigenous measles, mumps, and rubella from Finland by a 12-year, two-dose vaccination program //N. Engl. J. Med. 1994. - Vol. 331. -N. 21. - P. 1446 - 1447.
224. Perryman L.E., Hoover E.A., Yohn D.S. Immunosuppression in experimental feline leukemia I IJNCI. 1972. - Vol. 43. - P. 1357 - 1364.
225. Peters C.J., Liu C.T., Anderson G.W. et al. Pathogenesis of viral hemorrhagic fevers: Rift Valley fever and Lassa fever contrasted // Rev. Infect. Dis. 1989. -Vol. 11 (Suppl. 4). - S. 743 - S. 749.
226. Peters C.J. Marburg and Ebola arming ourselves against the deadly Filoviruses//N. Engl. J. Med.- 2005. - Vol. 352. - P. 2571 - 2573.
227. Peters D., Muller G., Slenczka W. Morphology, development and classification of the Marburg virus // In: Marburg virus disease (eds. Martini, G.A. and Siegert, R.), Springer, New York, 1971. - P. 68 - 83.
228. Peterson A.T., Carroll D.S., Mills J.N., Johnson K.M. Potential mammalian filovirus reservoirs // Emerg. Infect. Diseases. 2004. - Vol. 10. - N. 2. - P. 2073-2081.
229. Peterson A.T., Lash R.R., Carroll D.S., Johnson K.M. Geographic potential for outbreaks of Marburg hemorrhagic fever // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006. -Vol. 75.-N. 1.-P. 9-15.
230. Phalen M.A., Cohen K.A. Gradient optimization principles in reverse-phase high performance liquid chromatography and the separation of influenza virus components // J. Chromatogr, 1983. - Vol. 266. - P. 55-66.
231. Pitt M.L.M., Anderson A.O. Oral infectivity of Rift valley fever virus (RVFV) in A/J mice // Immunol. Invest. 1989. - Vol. 18. - N. 1. - P. 44-2 .
232. Preblud S.R., Katz S.L. Measles vaccine// In: Plotkin SA, Mortimer EA Jr, eds. Vaccines. Philadelphia, Pa: - WB Saunders Co, 1988. - P. 182-222.
233. Porporatto C., Bianco I.D., Correa S.G. Local and systemic activity of the polysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration // J. Leukocyte Biol. 2005. - Vol. 78. - P. 62 - 69.
234. Public health dispatch: measles epidemic-Majuro Atoll, Republic of the Marshall Islands, July 13-September 13, 2003 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. -2003. Vol. 19. - P. 888 - 889.
235. Pushko P., Bray M., Ludwig G.V. et al. Recombinant RNA replicons derived from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus protect guinea pigs and mice from Ebola hemorrhagic fever virus // Vaccine. 2000. - Vol. 19. - P. 142 -153.
236. Qiu X., Fernando L., Alimonti J.B.et al. Mucosal immunization of Cynomolgus Macaques with the VSVDG/ZEBOVGP vaccine stimulates strong Ebola GP-specific immune responses // PLoS ONE- 2009. Vol. 4. - N. 5. - P. e5547.
237. Ratnam S., Gadag V., West R. et al. Comparison of commercial enzyme immunoassay kits with plaque reduction neutralization test for detection of measles virus antibody //J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - N. 4. - P. 811 -816.
238. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating 50% endpoints // Am. J. Hygiene. 1938. - Vol. 27. - P. 493 - 497.
239. Regnery R.L., Johnson R.M., Kiley M.P. Virion nucleic acid of Ebola virus // J. Virol. 1980. - Vol. 36. - P. 465 - 469.
240. Richard J.L., Masserey S.V. Large measles epidemic in Switzerland from 2006 to 2009: consequences for the elimination of measles in Europe // Euro Surveill. -2009.-Vol. 14.-N. 50. Pii. 19443.
241. Rima B.K. Paramyxoviruses and Chronic Human Diseases //Bone. 1999. -Vol. 24.-N. 5.-26S.
242. Rima B.K., Earle J.A.P., Yeo R.P. et al. Temporal and geographical distribution of measles virus genotypes // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1173 - 1180.
243. Rima B.K., Duprex W.P. The measles virus replication cycle //C urr. Top . Microbiol. Immunol. 2009. - Vol. 329. - P. 77 - 102.
244. Rota J.S., Hammel K.B., Rota P.A., Bellini W.J. Genetic variability of the glycoprotein genes of current wild-type measles isolates // Virology. 1992. -Vol. 188.-P. 135-142.
245. Rota J.S., Heath J., Rota P.A. et al. Molecular epidemiology of measles virus: Identification of pathways of transmission and the implication for measles elimination // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 173.-P. 121 - 128.
246. Rota P.A., Featherstone D.A., Bellini W.J. Molecular epidemiology of measles virus // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009. - Vol. 330. - P. 129 - 150.
247. Rubin S., Mauldin J., Chumakov K. et al. Serological and phylogenetic evidence of monotypic immune responses to different mumps virus strains // Vaccine. -2006. Vol. 24. - P. 2662 - 2668.
248. Rup B.J., Spence J.L., Ploelzer J.D. et al. Immunosupression induced by avian reliculoendotheliosis virus; mechanism of induction of the suppressor cell // J. Immunol. 1989. - Vol. 123. - P. 1362 - 1370.
249. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F.A. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anaemia//Science.- 1985.-Vol. 230.-P. 1350- 1354.
250. Saito H., Sato PI., Abe M. et al. Isolation and characterization of measles virus strains with low hemagglutination activity // Intervirology. 1992. - Vol. 33. -P. 57-60.
251. Sakaguchi S., Wing K., Onishi Y. et al. Regulatory T cells: how do they suppress immune responses? // Intern. Immunol. 2009. - Vol. 21. - P. 1105 -1111.
252. Sakata H., Kobune F., Sato T.A. et al. Variation of field isolates of measles virus during 8-year period in Japan // Microbiol. Immunol. 1993. - Vol. 37. - P. 233 -237.
253. Salisbury D., Begg N: Immunisation Against Infectious Disease. London. -HMSO, 1996.
254. Sanchez A., Khan A.S., Zaki S.R. et al. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // In: D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.). Fields virology, 4th ed. -Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. - 2001. - P. 1279 - 1304.
255. Sanchez A, Kiley MP, Ilolloway BP, Auperin DD: Sequence analysis of the Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of Marburg virus// Virus Res. 1993. - Vol. 29. - P. 215 - 224.
256. Santibanez S., Heider A., Gerike E. et al. Genotyping of measles virus isolates from Central Europe and Russia // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 58. - N. 3. - P. 313-320.
257. Schaffeier M.P., Brokenshire J.S., Snider D.P. Detection of precursor Th cells in mesenteric lymph nodes after oral immunization with protein antigen and cholera toxin // Int. Immunol. 1997. -Vol. 9. - P. 1555 - 1562.
258. Scheid A. Paramyxoviridae // In: Animal Virus Structure. Perspectives in Med. Virol., Eds. M.N. Nermut, A.C. Steven. Elsevier, Amsterdam, NY, Oxford. -1987.-Vol.3.
259. Schmitz H. Virological and epidemiological aspects of Dengue fever // Nova Acta Leopoldina. 2000. - Vol. 80. - P. 153 - 161.
260. Schmitz H., Emmerich P., ter Meulen J. Imported tropical virus infections in Germany // Arch Virol. 1996. - Vol. 11. - P. 67 - 74.
261. Schrag S.J., Rota P.A., Bellini W.J. Spontaneous mutation rate of measles virus: direct estimation based on mutations conferring monoclonal antibody resistance //J. Virol. 1999.-Vol. 73.-N. l.-P. 51-54.
262. Schumann M., Gantke T., Muhlberger E. Ebola virus VP35 antagonizes PKR activity through its C-terminal interferon inhibitory domain // J. Virol. 2009. -Vol. 83.-P. 8993-8997.
263. Scudiero D., Shoemaker R.H., Paull K.D. et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other cell lines // Cancer. Res. 1988. -Vol. 48. - P. 4827 - 4833.
264. Sen A., Zhao Y.L., Hui S.W. Saturated anionic phospholipids enhance transdermal transport by electroporation // Biophys. J. — 2002. Vol. 83. - P. 2064-2073.
265. Shibahara K., Hotta H., Katayama Y., Homma M. Increased binding activity of measles virus to monkey red blood cells after long-term passage in Vero cell cultures// J. Gen. Virol., 1994. - Vol. 75. - P. 3511 - 3516.
266. Siegert R. Marburg virus. // Virol. Monogr. 11, Wien. 1972.- New York, P. 97153.
267. Siegert R., Shu H.L., Slenczka W. et al. Detection of the so-called green monkey agent // Proc.IV Congreso Latinamericano de Microbiología. 1967. - Lima, Peru. - P. 4.
268. Simpson D.I.H. Vervet monkey disease, transmission to the hamster // Brit. J. exp. Path. 1969. - Vol. 50. - P. 389 - 392.
269. Simpson D.I.H. Viral haemorrhagic fevers // Bull. Wld. Hith. Org. 1978. -Vol. 56.-N. 6.-P. 819-832.
270. Slenezka W., Muller Th., Becker St. Serological evidence of filovirus-infections in importted malarii // In: IX International Congress of virology. Glasgow. -1993.-P. 299.
271. Smith C.E.G., Simpson D.I.H., Bowen E.T.W., Zlotnik I. Fetal human disease from vervet monkeys // Lancet. 1967. - Vol. 2. - P. 1119 - 1121.
272. Stephenson J. Marburg Virus Linked to Bats // JAMA. 2007. - Vol. 298. - P. 1268.
273. Stittelaar K.J., Wyatt L.S., de Swart R.L. et al. Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus Ankara-based measles vaccine in the presence of passively acquired antibodies // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 4236 -4243.
274. Sugerman D.E., Barskey A.E., Delea M.G. et al. Measles outbreak in a highly vaccinated population, San Diego, 2008: role of the intentionally undervaccinated// Pediatrics. 2010. - Vol. 125. - P. 747 - 755.
275. Suleiman M.N., Muscat-Baron J.M., Harries' J.R. et al. Congo/Crimean haemorrhagic fever in Dubai. An outbreak at the Rashid Hospital // Lancet. -1980,-Vol. 45.-P. 939-941.
276. Sullivan N.J., Geisbert T.W., Geisbert J.B. et al. Immune protection of nonhuman primates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modified GPs // PLoS Med. -2006. Vol. 3. - P el77.
277. Sullivan N J., Geisbert T W., Geisbert J B. et al. Accelerated vaccination for Ebola virus haemorrhagic fever in non-human primates // Nature, 2003. - Vol. 424.-P. 681-684.
278. Sullivan N.J., Sanchez A., Rollin P.E. et al. Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates // Nature 2000. - Vol. 408. - P 605-609.
279. Swanepoel R., Leman F.J. Burt N.A. et al. Experimental inoculation of plants and animals with Ebola virus // Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol. 2. - P. 321 -325.
280. Swenson D.L., Warfild K.L., Larsen T. et al. Monovalent virus-like particle vaccine protects guinea pigs and nonhuman primates against infection with multiple Marburg viruses // Expert Rev. Vaccines. 2008. - Vol. 7. - N. 4. - P. 417-429.
281. Swenson D.L., Wang D., Luo M. et al. Complete protection of nonhuman primates against multistrain Ebola and Marburg virus infections // Clin. Vaccine Immunol. 2008. - Vol. 15. - P. 460 - 467.
282. Takada A., Robison C., Goto H. et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 14764 -14769.
283. Takahashi M., Nakayama T., Kashiwagi Y. et al. Single genotype of measles virus is dominant whereas several genotypes of mumps virus are co-circulating // J. Med. Virol. 2000. - Vol. 62. - N. 2. - P. 278 - 285.
284. Takeda M., Kato A., Kobune F. et al. Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase andaccessory proteins // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - N. 11. - P. 8690 - 9696.
285. Takeda M., Sakaguchi T., Li Y. et al. The genome nucleotide sequence of a contemporary wild strain of measles virus and its comparison with the classical Edmonston strain genome // Virology. 1999. - Vol. 256. - N. 2. - P. 340 -350.
286. Takimoto T., Portner A. Molecular mechanism of paramyxovirus budding // Virus Res. 2004. - Vol. 106. - P. 133 - 145.
287. Tamin A., Rota P.A., Wang Z. et al. Antigenic analysis of current wild-type and vaccine strains of measles virus // J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170. - P. 795 -801.
288. Tanabayashi K., Takeuchi K., Hishiyama M., Yamada A. Effect on fusion induction of point mutations introduced into the F protein of mumps virus // Virology. 1994. - Vol. 204. - N. 2. - P. 851 - 853.
289. Taylor M.J., Godfrey E., Baczko K. et al. Identification of several different lineages of measles virus // J. Gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - P. 83 - 88.
290. Tecle T., Bottiger B., Orvell C., Johansson B. Characterization of two decades of temporal co-circulation of four mumps virus genotypes in Denmark: identification of a new genotype // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - Pt. 11. - P. 2675-2680.
291. Tecle T., Johansson B.5 Jejcic A. et al. Characterization of three co-circulating genotypes of the small hydrophobic protein gene of mumps virus // J. Gen. Virol. 1998. - Vol .79. - Pt. 12. - P. 2929 - 2937.
292. Tecle T., Johansson B., Yun Z., Orvell C. Antigenic and genetic characterization of the fusion (F) protein of mumps virus strains // Arch. Virol. 2000. - Vol. 145.-N. 6.-P. 1199-1210.
293. Teichmann D., Grobusch M.P., Wesselmann H. et al. A haemorrhagic fever from the Cote d'lvoire // Lancet. 1999. - Vol. 354. - P. 1608.
294. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. 1985. - Vol. 15. - P. 354 -369.
295. Timmins J., Scianimanico S., Schoehn G., Weissenhorn W. Vesicular release of Ebola virus matrix protein VP40 // Virology. 2001. - Vol. 283. - P. 1 - 6.
296. Tikhonova N.T., Bichurina M.A., Gerasimova A.G. et al. Enhanced surveillance for measles in low-incidence territories of the Russian Federation: defining a rate for suspected case investigation // Epidemiol. Infect. 2010. - Vol. 6. - P. 1-8.
297. Towbin H., Stalhelin T., Gordon I. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamid gels to nitrocellulose shuts procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1976. - Vol. 76. - N. 9. - P. 4350 - 4354.
298. Towner J.S., Sealy T.K., Khristova M.L. et al Newly discovered ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda// PLoS Pathog. 2008. — Vol. 4. - № 11. -el000212.
299. Truong A.T., Kreis S., Ammerlaan W. et al. Genotypic and antigenic characterization of hemagglutinin proteins of African measles virus isolates // Virus Res. 1999.-Vol. 62.-N. l.-P. 89-95.
300. Truong A.T., Mulders M.N., Gautam D.C. et al. Genetic analysis of Asian measles virus strains new endemic genotype in Nepal // Virus Res. - 2001. -Vol. 76.-P. 71-78.
301. Uchida K., Shinohara M., Shimada S. et al. Characterization of the F gene of contemporary mumps virus strains isolated in Japan // Microbiol. Immunol. -2003.-Vol. 47.-N. 2.-P. 167-172.
302. UN Office for the Coordination of Humanitarian Affairs (OCHA), ReliefWeb, Government of Uganda report edited. Fri 4 Jan 2008, http://reliefweb.int/rw/RWB.NSF/db900SID/EDIS-7AJL5L7QpenDocument.
303. Vaccines, Immunization and Biologicals 2002-2005 Strategy. Vaccines and Biologicals. WHO. 2002.
304. Vanderzanden L., Bray M., Fuller D. et al. DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge // Virology. -1998. Vol. 246. - P. 134 - 144.
305. Vardas E., Kreis S. Isolation of measles virus from a naturally-immune, asymptomatically re-infected individual // J. Clin. Virol. 1999. - Vol. 13. - N. 3.-P. 173-179.
306. Vardas E., Leary P.M., Yeats J. et al. Case report and molecular analysis of subacute sclerosing panencephalitis in a South African Child // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. -N. 3. - P. 775 - 777.
307. Vera N.J., Benjumeda R.L.M., Gutiérrez M. M. M. et al. Measles outbreak in Campo de Gibraltar, Cádiz, Spain, during the Period February-July 2008 // Rev. Esp. Salud. Publica. 2010. - Vol. 84. - N. 2. - P. 203 - 214.
308. Virology. A Practical Approach // Ed. B.W. J. Mahy. IRL Press, Oxford. -Washington DC. - 1985.
309. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses//FEBS Lett. 1992.-Vol. 305.-P. 181 - 184.
310. Wairagkar N.S., Shaikh N.J., Ratho R.K. et al. Isolation of Measles virus from ' cerebrospinal fluid of children with acute encephalopathy without rash // Indian Pediatrics. 2001. - Vol. 38. - P. 589 - 595.
311. Wamala J.F., Lukwago L., Malimbo M. et al. Ebola hemorrhagic fever associated with novel virus strain, Uganda, 2007-2008// Emerg. Infect. Dis. -2010. Vol. 16. - P. 1087 - 1092.
312. Warfield K.L., Swenson D.L., Olinger G.G. et al. Ebola virus-like particle-based vaccine protects nonhuman primates against lethal Ebola virus challenge // J. Infect. Dis. 2007. - Vol. 196(Suppl. 2) - P.430-437.
313. Watanabe S., Takada A., Watanabe T. et al. Functional importance of the coiled-coil of the Ebola virus glycoprotein // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 10194-10201.
314. Watanabe T., Watanabe S., Neumann G. Et al. Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenza virus-like particles // J. Virol. -2002. Vol. 76. - P. 767 - 773.
315. Watanabe Sh., Watanabe T., Nöda T. et al. Production of Novel Ebola VirusLike Particles from cDNAs: an Alternative to Ebola Virus Generation by Reverse Genetics // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - No. 2. - P. 999 - 1005.
316. Webb N.R., Summers M.D. Expression of proteins using recombinant baculovirus // Technique A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology. - 1990. - Vol. 2. -N. 4. - P. 173 - 188.
317. Webb P.A. Some observation on the properties of Ebola virus // In: Ebola virus hemorrhagic fever. Ed. Pattyn S.R. - Amsterdam, Elvesier. - 1978. - P. 91 -94.
318. Whittle H.C., Dowland M.G.M. // Lancet. 1984. - Vol. 2. - N. 8407. - P. 834 -837.
319. WHO (1998). Expanded programme of immunization standartization of the nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles // Wkly. Epidemiol. Rec. - 1998. - Vol. 74. - P. 429 - 440.
320. WHO. Measles: progress towards global control and regional elimination, 1990- 1998 // Wkly. Epidemiol. Rec. 1998. - Vol. 73. - P. 389 - 394.
321. WHO. Strategies for reducing global measles mortality // Wkly. Epidemiol. Rec.- 2000. Vol. 75. - P. 411 - 416.
322. WHO. Laboratory diagnosis of measles infection and monitoring of measles immunization: Memorandum from a WHO meeting // Bull. WHO. 1994. -Vol. 72.-P. 207-212.
323. WHO. World Health Statistics, 2008. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, 2008.
324. WHO. World Health Statistics, 2009. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, 2009.
325. WHO/UNICEF: WHO/UNICEF Joint Annual Measles Report 2008, 2009.
326. Wiktor T., MacFarlan R., Dietzschold B. et al. Immunogenic properties of vaccinia recombinant virus expressing the rabies glycoprotein // Ann. Inst. Pasteur / Virol. 1985. - Vol. 136. - P. 405 -411.
327. Wilson J.A., Hart M.K. Protection from Ebola virus mediated by cytotoxic T lymphocytes specific for the viral nucleoprotein // J. Virol. 2001. - Vol. 75. -No. 6.-P. 2660-2664.
328. Woodruff A.W., Monath T.P., Mahmoud A.A. et al. Lassa fever in Britain: an imported case // Br. Med. J. 1973. - Vol. 3. - P. 616 - 617.
329. Wu L., Bai Z., Li Y. et al. Wild type mumps viruses circulating in China establish a new genotype // Vaccine. 1998. - Vol. 16. - N. 2 - 3. - P. 281 -285.
330. Xu L., Sanchez A., Yang Z.-Y. et al. Immunization for Ebola virus infection // Nat. Med. 1998.-Vol. 4.-P. 37-42.
331. Yamaguchi S. Identification of three lineages of wild measles virus by nucleotide sequence analysis of N, P, M, F, and L genes in Japan // J. Med. Virol. 1997.-Vol. 52.-P. 113-120.
332. Yang K., Mustafa F., Valsamakis A. et al. Early studies on DNA-based immunizations for measles virus // Vaccine. 1997. - Vol. 15. - P. 888 - 891.
333. Yixin Ji, Songtao Xu, Yan Zhang et al. Genetic characterization of wild-type measles viruses isolated in China, 2006-2007// Virol J. 2010. - Vol. 7. - P. 105-112.
334. Zhang Y., Ding Z., Wang H. et al. New measles virus genotype associated with outbreak, China // Emerg. Infect. Dis. 2010. - Vol. 16. - P. 943-947.
335. Настоящее выдано е том »что в Государственную коллекцию виuycos Iii яішаш Г393 года депонирован автотзсклП штагда "Poop" вируса iviapöyрг,полученный в результате СЄДЄІЩИИ.ulтащу присвоен номер депонента ГлБ ІГ546.
336. Полученный вариант шташ "Ротго" патогенен для морских С2ИП0К при знутрибоюшшшом способе зат)ааешш,разшо;2ается на культуре клеток Л-СЗ»CV-i,ДК-53eto,Селекционный шташя Topp", шактивитэозаяный гакма-облучешег.! ила Формалином, обладает йшуно
337. ГЄНННШ СВОіІСТВаШ-ОбеСЯеЧИВаеТ ПеЗИСТеЯТНОСТЬ ПШуШШХ ¡ШВОТН13К usóme зашкения вирусом ;¿ap6ycr.
338. Рекомендован атаим для производства диагностических и зак-игігших д^едаоатов.
339. Коллекция культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" приняла на депонирование культурупредложенную автором (ами):
340. Агафонов АЛ., Игнатьев Г.М., Каменева С.М.1. Депозитор:
341. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
342. Принятая культура в НИИ ККМ получила регистрационный номер:
343. Вирус паротита, штамм «Драгун»1. УВ -051. Репин В.Е.я*™* **633159.1ГСО, Кольцове, ГШ I ВБ"Вектор", НИИ ККМ Тел.: 1(383-2)366-501, факс: »-<383-2) 36-74-09, Kmail: RKPIN@ otiline.nsk.su1. N Öl 0427 января 20041. СПРАВКА
344. Коллекция культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" приняла на депонирование культурупредложенную автором (ами):
345. Агафонов Д.П., Игнатьев Г.М., Неверов A.A., Каменева СМ., Гуськов A.A.1. Депозитор:
346. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
347. Принятая культура в НИИ ККМ получила регистрационный номер:
348. Вирус паротита, штамм «ПетроНо»»1. V-3301. Репин В.Е.1. N 030224 апреля 20021. СПРАВКА
349. Коллекция культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" приняла на депонирование культурупредложенную автором (ами):
350. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Каменева С.М.1. Депозитор:
351. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
352. Принятая культура в НИИ ККМ получила регистрационный номер: УВ -04 5 и
353. Вирус кори, штамм 1Чо\'0/961. Репин В.Е.1. FAX
354. WORLD HEALTH ORGANIZATION ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ WELTOESUNDHSITSOflGANISATION ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ1. Date: 06 June 20051. Head cifce:
355. Sehertl^tfej. DK-2100 Copenhagen O, Oanmaik Telephone; »45 39 17 1717; Fax: +45 39 17 18 18, T<ta: 12000 dk E-mail: postmaster® ouro,*toint Web sie: bttp^'ww-w.eurawivj int
356. REGIONAL OFFICE FOR EUROPE BUREAU RÉGIONAL DE L'EUROPE REGIOMALBÛRO F» ËUBOPA ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
357. Dr Gennadi G. Onischcnko Head
358. Federal Service on Protection for Consumer's Rights and Well-Being Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation Rahmanovskij pereulok 3 101431 GSP Moscow K-51 Russian Federation
359. Our reference Notre niféreneo: UnserZelcnon: См. наш номер:
360. Your reference: Voire reference: IhfZeichea-Ha Ваш номер:
361. Fax No.: + 7 (»5 973 27 44 0&1. No. of pages: I
362. Уважаемый Геннадий Григорьевич!
363. Мы надеемся, что быстрое завершение этой процедуры и скорсншее лицензирование тест-систем »РФ будет содействовать успеху Программы ВОЗ ni >ритории РФ H1. Копня для ннформаинн:
364. Dr MiUco Vicnoncn, Special Rep. of (he Director-General, WHO Office for the Russian Federation. 28 OMrohcnkaStrcci 119034 Mosaiw.Russian Federation, Kit/Fa*Phone: +7 095 7S72M9
365. Болезни, предупреждаемые с помощью вакцин, и иммунизация1. Telephone: Fax:1. E-maîk Web sits:
366. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ1. РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
367. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
368. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ
369. Закрытое акционерное общество "Медико-биологический Союз" «Корь-1«С,-ДС» ФСП 42-0155-7032-05
370. Тест-система иммуноферментная Вводится впервыедля количественного определения антител класса в к вирусу корн
371. Срок введения установлен с" 16" сентября 200 5 г. Срок действия с ""200г.
372. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА1. УТВЕРЖДАЮ
373. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
374. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ «Корь-^-ДС»тест-системы иммуноферментной для количественного определенияантител класса С к вирусу кори
375. Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия1. Человека
376. ИЩИОНАЛЫШЙ ОРГАН КОНТРОЛЯ МИЕП
377. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧЕРЕЖДЕЕИЕ НАУКИ
378. Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича
379. Закрытое акционерное общество «Медико-Биологический Союз»
380. ОТРАСЛЕВОЙ СТАНДАРТНЫЙ ОБРАЗЕЦ СТАНДАРТНОЙ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ И НЕ СОДЕРЖАЩИХ АНТИТЕЛА КЛАССА К1. ВИРУСУ КОРИ1. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ1. ОСО 42- 28-394- 071. Москвачеловека
381. НАШОНАЛЫШЙ ОРГАН КОНТРОЛЯ МИБП
382. НАЗНАЧЕНИЕ, стандартная панель сывороток, содержащее и не содержаших антитела класса IgG к вирусу кори, праязинзгагяз дтз оцени! чуБгтвнтелызктн и егапфатноета шгмувсфгрмеяхвглх тгег-енеген яя* вияяевкя антител класса IgG х вирусу кори.
383. ФГУ11 ГИСК им. Л .Л. Tapaoctieu ЗЛО иМадико-бишюгическиП Саки» ОСО 42-2S -39-1-07 Стандартна* trauent. сывороток. caiep»«mn\ > содержащих аншгела kjkicgi IgG к вирусу мри1. Годен до 6 2 (?•<<?' •
384. Хранить при температуре от 2 до Я "Сл Роспотрсбиалюрас/1. Я.П.Мслуншаш
385. Гдэжкынхетролог ФГУН ГИСК rat. ДА. Тэрасеакчз Роспотребяздгор;^!^^ В.Г. Петухов
386. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (РОСПАТЕНТ)19)1. RU (11)2029561 (із) С151. 6 А61К39/12иг, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк патенту Российской Федерации
387. НІИЦ'ДЦ ч Д^'.'ПИП'У'П'-'К ¿¿-"'"Піщ-цида!yipi-.А. .л.,,. .,
388. Дата публикации: 1995.02.27
389. Регистрационный номер заявки: 5004595/14
390. Дата подачи заявки: 1991.10.14 (45) Опубликовано: 1995.02.27
391. Аналоги изобретения- J. Gen. virol., 1988, v. 69, N 1, р.1957.
392. Имя заявителя: Научно-производственное объединение "Вектор"
393. Имя изобретателя: Агафонов А.П.; Стрельцова М.А.; Игнатьев Г.М.; Твердохлебов A.B.; Чепурнов A.A.; Калиберов С.А.; Кузьмин В.А.; Черный Н.Б.
394. Имя патентообладателя Научно-производственное объединение "Вектор"
395. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ ВИРУСОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ГЕМОРРАГИЧЕСКИЕ ЛИХОРАДКИ И ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОГЕННОЙ И ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
396. C12N 7/00 (2006.01) G01N 33/535 (2006.01)
397. ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ. ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМt12'ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ21., (22) Заявка: 2007119091/13, 22.05.2007
398. Дата начала отсчета срока действия патента: 22.05.2007
399. Опубликовано. 10.03.2009 Бюл. Na 7
400. ШТАММ ВИРУСА ПАРОТИТА ДРАГУН ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА-КОМПОНЕНТА ТЕСТ-СИСТЕМЫ И ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ПАРОТИТА57. Формула изобретения
401. Reduction Neutralization Assay and Enzyme Immunoassays II J. Clin. Microbiol., 2005, No.9, Vol.43,p.4847-4851SU1611218 A3, 30.11.1990.
-
Агафонов, Александр Петрович
-
доктора биологических наук
-
Новосибирск, 2010
-
ВАК 03.01.06
- Выявление антигенов вируса иммунодефицита человека 1- и 2-го типов
- Биотехнологические основы конструирования и использования иммунобиологических препаратов для молодняка крупного рогатого скота
- Совершенствование средств и методов диагностики ВИЧ-инфекции
- Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных
- Иммунологические вирусспецифические маркеры и ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека
