Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов

Разумов, Иван Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов"

На правах рукописи

□□3454252

РАЗУМОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИРУСОВ

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0 5 ДЕК 2008

КОЛЫДОВО - 2008

003454252

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Локтев Валерий Борисович Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор

Малыгин Эрнст Георгиевич

ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Доктор биологических наук, профессор Покровский Андрей Георгиевич Новосибирский государственный университет

Доктор биологических наук Таранин Александр Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН

Ведущая организация:

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва)

Защита диссертационной работы состоится « 06_» февраля 2009 г. в 09-00 на

заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, Кольцово, Новосибирский район, Новосибирской области.

Автореферат разослан « 008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ^Лл^—

доктор биологических наук ¿у Карпенко Лариса Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Только за последние 3-4 десятилетия было выявлено около 30 новых возбудителей инфекционных болезней, поразивших за этот период сотни миллионов человек и унесших миллионы жизней. К их числу относятся несколько возбудителей острых и хронических диарей, гепатитов С и Е, возбудители венесуэльской (вирус Гуанарито) и бразильской (вирус Сабиа) геморрагических лихорадок, СПИДа, геморрагических лихорадок Эбола (вирус Эбола) и Марбург (вирус Марбург) и других заболеваний. Кроме того, инфекционные заболевания расширяют ареал своего распространения. Ярким примером возникновения и распространения в последнее время новых вариантов вирусов является проникновение вируса Западного Нила в Северную Америку (Нью-Йорк) в 1999 году и его повсеместное распространение по территории континентов Северной и Южной Америки. Под эгидой ВОЗ совместными усилиями правительств многих стран в 20-м веке удалось ликвидировать только одну вирусную инфекцию - натуральную оспу. Вместе с тем, в настоящее время по ряду причин, включая угрозу биотерроризма и отсутствие современных способов лечения и профилактики, центры по контролю и предотвращению болезней во многих странах снова ставят вирус натуральной оспы на первое место в списке потенциальных агентов массового поражения. Необходимо отметить, что для многих вновь возникающих инфекций нет ни средств специфического лечения, ни эффективных способов профилактики.

Вместе с тем, гибридомная технология, разработанная Kohler & Milstein (1975) для получения клеточных гибридов, гибридом, синтезирующих моноклональные антитела (МКА) предопределенной специфичности и высокого аффинитета, позволила вывести на новый уровень понимание многих структурно-функциональных особенностей биологических объектов, в том числе вирусов. Создание гибридомной технологии и изучение свойств МКА стимулировали проведение исследований на уровне аминокислотной последовательности вирусных белков в отношении многих вирусов патогенных для человека. Использование современных молекулярно-биологических методов в сочетании с МКА позволило получить целый комплекс новых фундаментальных данных: о структуре и функции вирусных белков; о природе взаимодействия антигена и антитела, о структуре вирусных антигенных детерминант и их функциях. Так, изучение взаимодействия МКА с вирусными белками и их рекомбинантными аналогами в системах in vivo и in vitro позволило идентифицировать наиболее важные структурные участки вирусных белков и локализовать их на аминокислотной последовательности, выявить особенности строения вирионов, получить новую информацию о роли вирусных белков в формировании противовирусного иммунитета. Именно с этими исследованиями из области молекулярной вирусологии и

иммунной биотехнологии связывается дальнейший прогресс в изучении структуры и функций вирусных белков и на его основе создания новых более эффективных методов иммунодиагностики вирусных заболеваний, способов профилактики и средств специфического лечения. Цепь и задачи исследования.

Целью настоящей работы является получение с помощью моноклональных антител комплекса новых данных о структурно-функциональных свойствах белков патогенных для человека вирусов.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Освоить комплекс методов по технологии получения гибридом и создать коллекцию гибридом, продуцирующих моноклонапьные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека.

2. Получить и очистить моноклонапьные антитела, исследовать их иммунобиологические свойства и сформировать представительные панели МКА к структурным белкам вирусов.

3. Провести с помощью панелей моноклональных антител изучение структурных белков вирусов патогенных для человека, в том числе филовирусов, вирус Марбург (ВМ) и вирус Эбола (ВЭ), флавивирусов, вирус Западного Нила (ВЗН), ортопоксвирусов, вирус эктромелии (ВЭм), вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК), вирус натуральной оспы (ВНО), в следующих направлениях:

- выявление и изучение перекрестно-реактивных антигенных детерминант на белках филовирусов Марбург и Эбола;

- определение иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков КР, \Ф35 и УР40 вируса Марбург (ВМ);

- исследование роли ИР, \ЛР35 и УР40 белков филовирусов в формировании противовирусного иммунитета;

- поиск и изучение перекрестно-реактивных и видоспецифических антигенных детерминант и эпитопов белков ортопоксвирусов;

- исследование антигенной изменчивости штаммов ВЗН, выделенных в России и в ближнем зарубежье;

- сравнительное изучение антигенной схожести вирусных белков и их рекомбинантных аналогов;

- детальное картирование эпитопов белка УР35 вирусов Эбола и Марбург и гликопротеина Е ВЗН;

- проведение сравнительного анализа противовирусной активности гибридомных и рекомбинантных одноцепочечных и гуманизированных антител против белка Е ВЗН.

Научная новизна

стыке трех наук, вирусологии, иммунологии и молекулярной биологии. С помощью МКА был проведен цикл работ по изучению антигенной структуры и картированию антигенных детерминант структурных белков флавивирусов, ортопоксвирусов, филовирусов и других вирусов, патогенных для человека. Проведенное исследование позволило получить комплекс новых данных по антигенной структуре изучаемых вирусов и уточнить функции вирусных белков в процессе формирования противовирусного иммунитета.

Так использование моноклональных антител позволило получить приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, ЫР и УР35, и матриксного УР40 белков вирусов Марбург и Эбола и ее роли в формировании противовирусного иммунитета.

Впервые обнаружено наличие общей перекрестно-реактивной антигенной детерминанты на нуклеокапсидных белках № и УР35 вирусов Марбург и Эбола.

С помощью МКА проведено топологическое картирование эпитопов белков ОТ, УР40 и УР35 вируса Марбург. Установлено, что 7 эпитопов на структурных белках ОТ, УР35 и УР40 вируса Марбург, взаимно перекрываясь, образуют функциональный домен, индуцирующий синтез МКА. Именно эти МКА проявляли антивирусную активность — в присутствии комплемента они вызывали лизис клеток, инфицированных вирусом Марбург. В ходе уточнения роли антигенных детерминант на белке УР40 ВМ было выявлено 2 эпитопа, которые индуцируют синтез протективных антител В-клетками. Предварительное введение этих МКА в морских свинок защищает их от гибели при заражении ВМ.

В результате исследования закономерностей формирования противовирусного иммунитета на белки филовирусов обнаружено, что иммунный ответ, как на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе начального развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные № и УР35 белки и УР40 матриксный белок.

Анализ антигенной структуры белков филовирусов (ЫР, УР40, УР35 ВМ и УР35 ВЭ) и их рекомбинантных аналогов показал, что не только рекомбинантные белки, но и их фрагменты могут сохранять антигенную конформацию вирусных белков. Используя МКА и фрагменты рекомбинантных аналогов вирусных белков, впервые удалось провести картирование антигенных детерминант и эпитопов на аминокислотной последовательности УР35 белков вирусов Марбург и Эбола.

В результате анализа взаимодействия МКА с ортопоксвирусами была выявлена высокая перекрестная реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы. Было обнаружено, что белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЬ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками

вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды prl29L (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

С помощью нейтрализующих МКА против штамма VIg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА, например, штаммы Нр-94 и Tur-2914, у которых выявлены различия в нейтрализации по 7 эпитопам. Даже штаммы VIg99-27889 и VlgOQ-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали вариабельность в реакции нейтрализации по 4 эпитопам.

В результате анализа взаимодействия МКА с рекомбинантными пептидами белка Е ВЗН продемонстрировано наличие двух дискретных районов, вовлеченных в процессы (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район 321-466 ао белка Е ВЗН, несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН, и включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между 1-126 ао, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

В результате сравнительного изучения иммунобиологических свойств МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов (одноцепочечных и гуманизированных антител) было обнаружено, что рекомбинантные аналоги сохранили конформацию вариабельного домена исходных гибридомных антител, определяющего способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9E2 в разведении 1/1024000 против ВЗН была сравнима с таковой гибридомных антител.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 2142507; № 2281327; №2265658; № 2144565 и отражены в публикациях в реферируемых отечественных и зарубежных журналах и изданиях.

Практическая ценность работы.

гепатита А, а также к вирусу Западного Нила, к филовирусам, вирус Марбург и вирус Эбола, к ортопоксвирусам, включая вирус экгромелии, вирус осповакцины, вирус оспы коров. Полученные гибридомы и в настоящее время могут быть успешно использованы, как штаммы-продуценты для получения МКА.

Сформированная коллекция гибридом и полученные наборы МКА с изученными свойствами, панели МКА, к структурным белкам вирусов могут быть использованы для развития прикладных исследований в области иммунодиагностики вирусных инфекций:

в диагностических целях для создания диагностических препаратов и тест-систем;

в качестве средств контроля в производстве иммунобиологических препаратов;

в качестве лигандов для аффинной хроматографии и с целью очистки биомолекул из сложных биологических смесей.

В то же время, представленные научные результаты по изучению антигенной структуры и функций вирусных белков могут способствовать развитию и созданию не только иммунодиагностических, но и иммубиологических препаратов для профилактики и защиты от патогенных для человека вирусов.

Исследуемые в работе рекомбинантные белки и полипептиды филовирусов (вирусы Марбург и Эбола), ортопоксвирусов (ВНО и ВЭм) и флавивирусов (ВЗН) могут быть использованы в качестве антигена, как для разработки иммунодиагностических тест-систем, так и профилактических препаратов.

Полученные и описанные в работе гуманизированные вируснейтрализующие антитела против ВЗН являются, на наш взгляд, перспективными для разработки препаратов нового поколения для профилактики и терапии лихорадки Западного Нила.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Создание оригинальной коллекции гибридом, которые и в настоящее время могут быть успешно использованы как штаммы-продуценты, секретирующие моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными, очищенными, гомогенными и высоко-аффинными препаратами антител с определенной специфичностью.

2. Наборы очищенных препаратов МКА с изученными свойствами, панели МКА, могут быть успешно использованы для изучения структурных белков вирусов патогенных для человека, включая филовирусы (вирусы Марбург и Эбола), флавивирусы (вирус Западного Нила), ортопоксвирусы (ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО).

3. Нуклеокапсидные, NP и VP35, и матриксные VP40 белки филовирусов играют значительную роль в формировании защитного иммунного ответа организма: так в процессе развития филовирусной инфекции иммунный ответ у переболевших животных формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, NP и VP35, и VP40 матриксный белки филовирусов, что, возможно, является определяющим фактором выживания.

4. Белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и вируса натуральной оспы.

5. Современные штаммы ВЗН, циркулирующие в Евразии, обладают значительными антигенными отличиями: с помощью панели МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине). Кроме того, в реакции нейтрализации выявлены максимальные антигенные различия у штаммов Нр-94 (год выделении 1963) и Tur-2914 (год выделении 1973), у которых, по-видимому, изменено по 7 эпитопов на белке Е ВЗН.

6. Получены МКА, которые обладают нейтрализующей активностью против 7 исследованных штаммов ВЗН, являются перспективными для создания иммунодиагностических наборов и, возможно, для разработки препаратов для иммунотерапии тяжелых случаев лихорадки Западного Нила. Так, на наш взгляд, высоко активные нейтрализующие гуманизированные антитела Fc-9E2 привлекательны для будущего конструирования и создания нового антивирусного препарата для лечения лихорадки Западного Нила.

7. Используемая нами методология, включающая объединенное применение двух инструментов исследования, панели МКА и набора антисывороток, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с изученными свойствами, позволяет расширить наши возможности при картировании и перейти к локализации эпитопов связывания с МКА на аминокислотной последовательности вирусных белков.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах: Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994; First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995; Vth International Congress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995; Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996); Russian-German colloquium on filoviruses: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997); Vlth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999); Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000); IX

Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001); VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия,;2001); 3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно-технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов A.A.); проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98-04-49439-а (рук. Нетесов C.B.), 01-04-49877-а (рук. Качко A.B.), №01-04-48972-а (рук. Разумов И.А.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 35 статей, получено 4 патента на изобретения штаммов гибридных клеток, представлено более 35 тезисов. Все исследования выполнены в ГНЦ ВБ «Вектор». Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве с дбн В.Б. Локтевым (глава 3), кбн Е.В. Агапов (раздел 3.1), кбн A.B. Перебоев (раздел 3.1., 3.8), Е.Е. Коноваловым (раздел З.1., 3.7), кбн В.А. Святченко (раздел 3.1 и 3.8), кбн Е.В. Протопопова (раздел 3.1 и 3.7), кбн Е.И. Казачинская (раздел 3.1 - 3.5., 3.7 и 3.8), дбн, чл-корр. РАН C.B. Нетесов (раздел 3.1-3.5), кбн A.A. Букреев (раздел 3.2, 3.4 и 3.5), кбн A.A. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн A.A. Беланов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн A.B. Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн A.B. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), A.B. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и 3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А. Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн С.Н. Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С. Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте

данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.

Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф., Локтеву Валерию Борисовичу.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при оформлении и обсуждении диссертационной работы д.б.н., Татькову Сергею Ивановичу.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 329 страницах, включающих 33 рисунка и 51 таблицу и список литературы (316 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав (глава 1 - «Обзор данных литературы»; глава 2 - «Экспериментальная часть»; глава 3 - «Результаты и обсуждение исследований»), заключения, выводов, списка литературы и приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ «Вектор» за период с 1982 по 2007 годы

Основой успешного развития биотехнологических, вирусологических и молекулярно-биологических работ с использованием моноклональных антител (МКА), продуцируемых культивируемыми гибридными клетками, гибридомами, является наличие коллекции этих культур клеток. Создание коллекции гибридом в нашем Центре включало в себя: получение гибридом и хранение в жидком азоте (-196°С) на протяжении длительного времени; стабилизацию и паспортизацию штаммов клеточных линий в соответствии с общепринятыми требованиями ВОЗ; формирование панели МКА, то есть наработку, очистку и изучение свойств, продуцируемых гибридомами моноклональных иммуноглобулинов.

Весь период формирования коллекции был довольно условно по времени разбит мной на два этапа, методический (1982-1994 г) и научно-исследовательский (1995-2007 г).

Краткое описание коллет/ии гибридом 1982-1994 г К этому списку относятся гибридомы, полученные лично автором, с его участием или под его руководством, к следующим вирусным антигенам:

32 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, в том числе 23 крысиных и 9 мышиных гибридом. Четыре гибридомы защищены авторскими свидетельствами;

> 34 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей, в том числе 17 крысиных и 17 мышиных гибридом. Две гибридомы защищены авторскими свидетельствами;

> 3 гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу клещевого энцефалита, получены в ИБХ СО РАН и депонированы в нашей коллекции;

> 7 гибридом, продуцирующих МКА к белку р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа, в том числе 4 мышиных и 3 крысиных гибридомы. Все эти клеточные линии были депонированы во Всесоюзной коллекции клеточных линий;

У 6 гибридом, продуцирующих МКА к вирусу полиомиелита, тип 2;

> 3 крысиных гибридомы, продуцирующих МКА к вирусу гепатита В;

> 11 мышиных гибридом, продуцирующих МКА к шести различным формам цитохрома Р-450 из печени крыс;

> более 150 гибридом к ортопоксвирусам;

> 32 гибридомы к вирусу гепатита А;

> 28 гибридом к вирусу гепатита В;

> 18 гибридом к вирусу полиомиелита, типа 2;

> 14 гибридом, секретирующих моноклональные антиидиотипические антитела, взаимодействующие с паратопами МКА против вируса ВЭЛ;

> 21 гибридома, продуцирующая МКА к белкам р105, р160 и р170 Opistorchis felineus;

> более 16 гибридом, секретирующих МКА к иммуноглобулинам человека, а также ряд других гибридных клеточных линий.

Именно, на 1 этапе было получено более 500 гибридом, продуцирующих МКА к вирусным белкам. В частности, в этот период была создана многочисленная коллекция гибридом к ортопоксвирусам, которая, лишь частично, представлена в данной работе.

Проводи мое в нашем Центре с 90-х годов изучение структурно-функциональной организации геномов вирусов патогенных для человека предполагало детальное выяснение функций фрагментов генома, кодирующих тот или иной ограниченный район вирусного белка. В рамках этого направления работ в Центре была расширена коллекция гибридом, продуцирующих МКА против различных вирусных белков.

Краткое описание коллекции 1995-2007 гг

На этом этапе стартовали работы по созданию гибридом, продуцирующих МКА, использование которых в изучении вирусных белков в основном широко представлено в данной работе. В списке представлены гибридомы к следующим вирусам и антигенам:

> 38 гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам вируса Эбола;

> 21 гибридома, секретирующая МКА к структурным белкам ВМ;

> 32 гибридомы, продуцирующие МКА к вирусу Западного Нила. Одна гибридома защищена патентом РФ;

> 15 гибридом, продуцирующих МКА к вирусу японского энцефалита.

Указанные клеточные линии были получены лично автором или с его участием.

На протяжении всего периода создания коллекции гибридомы, включенные в каталог, использовались для формирования наборов МКА с изученными свойствами, панелей МКА, к различным вирусным антигенам. С целью формирования панелей МКА к вирусам первоначально проводилось культивирование гибридом in vitro и перевивание in vivo, в BALB/c мышах и Lou крысах. В результате проделанной работы, как правило, получали значительные количества МКА в виде асцитической жидкости, из которой были приготовлены очищенные препараты. Панели МКА постоянно использовались и используются в исследованиях лабораторий Центра. В качестве примера Вашему вниманию предоставлена панель МКА к вирусу Марбург. Для характеристики МКА были определены: подклассы иммуноглобулинов; вирусные белки-мишени, с которыми они взаимодействуют; титры специфического взаимодействия с вирусным препаратом; количественный уровень синтеза гибридомных IgG в организме мышей BALB/c; константы аффинитета МКА (таблица 1).

Таким образом, коллекция гибридом, созданная за период с 1982 по 2007 годы, на наш взгляд, имеет неоценимое значение как хранилище штаммов-продуцентов, секретирующих МКА к различным вирусным антигенам. Проделанная на этом этапе работа явилась началом создания «фундамента», в материальном, методическом и научном плане, который может служить основой для получения в течение неограниченно долгого периода времени препаратов антител, необходимых для обеспечения научных исследований, для организации производства тест-систем (применяемых для диагностики различных инфекционных заболеваний), для производства и выпуска МКА, которые как стандартные иммунобиологические препараты, могут быть использованы для контролирования, стандартизации и совершенствования различных биотехнологических процессов по получению новых профилактических и лекарственных препаратов. Кроме того, дальнейшее развитие работ в направлении получения и изучения МКА может привести к созданию препаратов гибридомных антител и на их основе получения рекомбинантных гуманизированных антител для лечения различных заболеваний человека.

Представленная работа, в частности, отражает или иллюстрирует лишь возможности использования МКА для изучения структурных белков патогенных для человека вирусов.

Таблица 1

Свойства моноклональных антител к белкам вируса Марбург. (Панель МКА против вируса Марбург)

№ п/п Названиие гибридомы и МКА Класс ДО Белок-мишень Титры МКА против ВМ в ТИФА (обр величины) Концент очищенных ДО (мг/мл) Константа аффинности К.,М"'

Культуральная среда Асцитическая жидкость

1 1Е2 ¡¿С2а УР35 2700 656100 3,7 6,3х 10'

2 1Н5 и 0 УР35 900 2700 н о н о

3 ЗР9 ^С2а УР35 6075 768000 6,5 3,4x10'

4 5Н7 ДО1 ИР 24300 1248000 7,7 2,9x10'

5 6В7 н 0 УР40 2430 729000 1,3 5,9x10'

б 8вЗ ДО2а УР35 8100 656100 3,6 2,1x10"

7 7С4 \gG23 УР40 7290 2624400 4,9 4,5x10"

8 7Н10 ДО2а УР40 2430 729000 2,9 7,7x10'

9 9С7 ДО1 ИР 6561 6516000 8,7 25x10"

10 9И8 ДО1 УР35 7290 729000 4,9 4,5x10"

11 9в6 ДО2а УР40 8100 218700 5,1 1,5x10'

12 1С7 11 0 УР40 900 729000 4,2 н о

13 708 \gG2a УР40 24300 2624400 5,9 13x10'

14 5Р2* II 0 но 81 но н о н о

15 508 ^М УР40 6561 656100 1,4 3,2x10'

16 1С12 ДО2а УР40 2187 н о н о н о

17 5П ДО1 № 6561 2624400 3,6 6,3x10'

18 ЗА5 1ЕС1 - 900 218700 4,3 н о

19 11Н7* н 0 УР40 2187 но н о н о

20 10Е11 ДО2Ь УР40 7290 но н о н о

21 509** ДО2Ь УР40 24300 2187000 7,2 9,9x10'

Примечание '-' - отсутствие взаимодействия, н о - не определяли, 'данные гибридомы тестировали по культуральной среде,

**5С9Л}11/АЗ - полное название гибридомы, продуцирующей представленные МКА

МКА в изучении структурных белков филовирусов Марбург и Эбола.

Определение перекрестно-реактивных антигенных детерминант филовирусов

Мы использовали сформированные панели МКА против вируса Марбург (таблица 1) и вируса Эбола, чтобы изучить антигенную структуру белков филовирусов, которые являются особо-опасными патогенами человека. Необходимо отметить, что, хотя вирусы Марбург и Эбола являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют, по-видимому, существенные отличия. Имеющиеся литературные данные по перекрестной реактивности филовирусов с антисыворотками носили несколько противоречивый характер. Вместе с тем, в результате сравнения аминокислотной последовательности белков УР35 и № (нуклеопротеинов) филовирусов были выявлены гомологичные аминокислотные участки, что позволяло предположить наличие перекрестно-реактивной антигенной структуры у этих белков.

В наших экспериментах перекрестное взаимодействие антител, специфичных к филовирусам, было исследовано методами твердофазного ИФА (ТИФА) и иммуноблота. Методом ТИФА (таблица 2) было обнаружено перекрестное взаимодействие поликлональных антител сывороток с гетерогенными вирусными антигенами. Необходимо отметить корреляцию результатов между высоким титром антител к гомологичному вирусу и обнаружением перекрестного взаимодействия антител с гетерологичным вирусным антигеном.

Вместе с тем, при использовании гибридомных антител, ни одно из 21 типа МКА против ВМ не взаимодействовало с вирусом Эбола, а при использовании 13 МКА против ВЭ перекрестное взаимодействие с № ВМ было обнаружено лишь для двух МКА, 7Е1 и 6С8, специфичных к ЫР ВЭ.

С помощью метода иммуноблота нам удалось выявить вирусные белки, которые являются мишенью перекрестного реагирования антител. Для вируса Марбург были выявлены два белка - нуклеопротеин и УР35, которые являются мишенью для поликлональных антител к ВЭ. Из двух МКА к нуклеопротеину ВЭ (116 кДа) и перекрестно реагирующих в ТИФА с ВМ, лишь МКА 608 взаимодействовали с нуклеопротеином ВМ (96 кД) в иммуноблоте.

Таким образом, проведенные нами исследования позволили получить ряд принципиально новых результатов, касающихся наличия перекрестно-реактивной антигенной структуры у филовирусов. Так, с помощью метода ТИФА была показана взаимная перекрестная активность поликлональных и моноклональных антител, специфичных к ВЭ, с антигеном ВМ, а антител поликлональных сывороток, специфичных к ВМ, с антигеном ВЭ. Кроме того, методом иммуноблота с использованием поликлональных и моноклональных антител против вируса Эбола нами были выявлены перекрестно-реактивные белки -ЫР и УР35 филовирусов.

Таблица 2

Сравнительное изучение перекрестного взаимодействия поликлональных и моноклональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА.

Источник антител (сыворотки животных и гибридомные МКА) Вирус титры антител (обратные величины)

Антигены

ВЭ ВМ

мышь* ВЭ 72900 2700

кролик* ВЭ 72900 2700

крыса* ВЭ 72900 8100

морская свинка* ВЭ 900 <100

лошади** ВЭ 218700 24300

морская свинка*** ВЭ 900 <100

МКА 7Е1 кЫР ВЭ 24300 2700

МКА608 к№ ВЭ 8100 2700

Мышь N1* ВМ <100 8100

Мышь N2* ВМ 300 24300

кролик* ВМ <100 2700

ЧРС**** ВМ 900 24300

морская свинка *** ВМ <100 900

нормальные сыворотки***** <100 <100

Примечание: *сыворотки от иммунизированных животных; '* {¿О, очищенные из сыворотки лошади, иммунизированной инактивированным и нативным вирусом; *** сыворотки от инфицированных животных; **** сыворотка человека, переболевшего лихорадкой Марбург; ***** нормальные сыворотки мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля.

Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков ОТ, УР35 и УР40 ВМ Наличие коллекции моноклональных антител (МКА) к белкам вируса Марбург предоставило возможность изучения иммунобиологических свойств структурных вирусных белков и их роли, как в процессе репродукции или

размножения данного вируса, так и в формировании защитного иммунитета организма.

Иммунобиологический эффект взаимодействия 6 типов МКА с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 вируса Марбург был исследован in vitro, в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero, и в антителозависимом комплемент-опосредованном лизисе клеток (A3KOJ1K) инфицированных вирусом, а также in vivo, в реакции пассивной защиты морских свинок при введении антител. Использование данного подхода выявило отсутствие нейтрализующей активности у 6 изученных гибридомных антител, так как инкубация МКА с вирионами не влияла на инфекционность ВМ. Вместе с тем, два типа гибридомных антител, 5G9.G11 и 5G8.H5, специфичных к белку VP40 ВМ, хотя и не проявляли вируснейтрализующей активности при постановке РН на культуре клеток Vero, обладали способностью in vitro опосредовать лизис вирус-инфицированных клеток в присутствии комплемента (таблица 3). Всего из 19 типов МКА протестированных в реакции A3KOJIK 7 МКА (3 МКА против VP40, по 2 МКА против VP35 и NP белков ВМ) проявляли активность, вызывая лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента.

Для определения протективной активности моноклональных антител животным внутрибрюшинно были введены антитела за сутки до инфицирования вирусом Марбург. Как видно из результатов, представленных в таблице 4, из 6 исследованных МКА только МКА 5G9.G11 и 5G8.H5, которые проявляли противовирусную активность in vitro, в реакции A3KOJIK, были способны предохранять от гибели морских свинок (р<0,05) в течение, по меньшей мере, 14 дней (срок наблюдения).

При вскрытии погибших животных наблюдались типичные для ВМ морфологические изменения со стороны внутренних органов [Kiley MP, et al 1988], тогда как у выживших животных каких-либо видимых патологических изменений обнаружено не было. В сыворотке крови переболевших морских свинок методом ИФА была выявлена сероконверсия антител против ВМ, при этом титры противовирусных антител в крови животных колебались в интервале от 1:200 до 1:12800. Не было отмечено корреляции между уровнем специфических антител в крови и типом вводимых гибридомных МКА. По всей видимости, различие в уровне противовирусных антител в крови инфицированных, но выживших морских свинок определяется особенностями индивидуального иммунного ответа животных на вирусную инфекцию [Bowen ET, et al 1977]. Представленная работа является одной из первых попыток оценить роль белков NP, VP35 и VP40 ВМ в формировании защитного иммунитета при филовирусной инфекции, используя полученные противовирусные МКА к этим белкам. Проведенные нами исследования в рамках данной темы позволили получить ряд принципиально новых результатов. Так, впервые было показано, что МКА против

Таблица 3

Иммунобиологические свойства моноклональных антител к вирусу Марбург. _

МКА ♦Титры МКА в ТИФА (обр. величина Белок-мишень "АЗКОЛК РН

5G9.G11 218700 VP40 + -

7D8 656100 VP40 - -

5F1 656100 NP - -

ЗА5 218700 н,и. - -

5G8.H5 729000 VP40 + -

7С4 656100 VP40 - -

5Н7 218700 NP + но

9С7 656100 NP + но

8G3 218700 VP35 + но

1Е2 72900 VP35 + но

6В7 656100 VP40 + но

Примечание "Постановку азколк проводили с использованием контролей, согласно описанной ранее методике [Babiuk, L А, et al 1975] * В качестве источника антител использовали асцитическую жидкость + лизис более 30% клеток Vero инфицированных вирусом Марбург в присутствии комплемента морских свинок, - отсутствие эффекта в данной реакции, ни- белок данным методом не идентифицирован, но - не определяли

Таблица 4

Определение протективной активности МКА против ВМ _при введении в морских свинок._

МКА Соотношение животных выжило/общее % выживших животных р * Фишера

5G9.G11 4/4 100 0,0368"

7D8 2/5 40 1,0000

5F1 1/5 20 0,2635

ЗА5 2/5 40 1,0000

5G8.H5 5/5 100 0,0242"

7С4 2./5 40 1,0000

Контроль вируса 2/5 40

* - Р «ишч» - точный критерий Фишера (при малых обьемах выборок) между экспериментальными и контрольной группами животных, инфицированных ВМ [Ашмарин И П, Воробьев А А , 1962]

** -- значения, являющиеся статистически достоверными с вероятностью > 95 %

нуклеокапсидных, № и УР35, и матриксного УР40 белков ВМ (3 МКА против УР40, по 2 МКА против УР35 и ИР) проявляли противовирусную активность в реакции АЗКОЛК. Вместе с тем, анализ полученных нами данных (по пассивной защите животных, сероконверсии антивирусных антител, а так же морфологии внутренних органов экспериментальных животных) позволяет утверждать, что введение МКА, специфичных к матриксному белку УР40 ВМ и активных в реакции АЗКОЛК, ингибирует развитие инфекционного заболевания на ранних стадиях, предохраняя или защищая организм морских свинок от летального развития патологического процесса. Подобный феномен указывает, по нашему мнению, что белок УР40 ВМ способен индуцировать синтез протективных антител в организме.

Определение иммунодоминантных белков филовирусов В настоящее время в научной литературе недостаточно данных для понимания роли структурных белков филовирусов Марбург и Эбола в формировании иммунного ответа, как в процессе иммунизации, так и в ходе заболевания. Недостаток таких данных, на наш взгляд, препятствует процессу создания эффективных средств профилактики и терапии геморрагических лихорадок, вызываемых этими высокопатогенными вирусами.

Предварительные данные, полученные нами при изучении взаимодействия набора антисывороток с инактивированными препаратами филовирусов указывали, что значительный иммунный ответ формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные белки, ЫР и УР35, а также матриксный белок УР40, а не на белки оболочки вириона, вР и УР24, как изначально ожидалось.

Вместе с тем, существует мнение, что большая панель МКА, полученных от одного вида животных в действительности может имитировать (представлять) основную композицию антител поликлональной сыворотки против вирусного агента. Проведенный нами анализ полученных данных по специфичности полученной панели МКА к белкам филовирусов (таблица 5), также указывал, что, возможно, именно эти белки, ЫР, УР40 и УР35 вирусов Марбург и Эбола, являются основными иммуногенами, на которые формируется иммунный ответ при иммунизации животных. Представленные в научной литературе данные по белок-специфичности наборов МКА против филовирусов, также подтверждали этот вывод.

В связи с вышеизложенными фактами, с целью детального изучения особенностей формирования иммунного ответа животных на структурные белки филовирусов нами проводилось выявление уровня специфических антител (^в) на структурные белки филовирусов в антисыворотках, а также определение с помощью моноклональных и поликлональных антител вирусных белков, которые являются иммунодоминантной или основной

Таблица 5

Сводная таблица определения белок-специфичности панели МКА к структурным белкам филовирусов Марбург и Эбола.

Количество МКА к вирусному белку. (% от общего количества) Иммуноген Вирусный белок-«мишень»

16 (42,1%) ВЭ (вирус Эбола) №

3 (7,9%) ВЭ УР35

13 (34,2%) ВЭ УР40

6(15,8%) ВЭ Не определен

3 (14,3%) ВМ (вирус Марбург) ОТ

5 (23,8%) ВМ УР35

11 (52,4%) ВМ УР40

2 (9,5%) ВМ Не определен

«мишенью» для иммунного ответа организма, то есть индуцируют максимальный синтез антител В-клетками. На этом этапе работы был сформирован и расширен набор поликлональных позитивных сывороток против ВМ и ВЭ. Как представлено в таблице б, все исследуемые сыворотки, специфичные к ВЭ (от иммунизированных и инфицированных животных), взаимодействовали с инактивированным ВЭ в ТИФА. Титры специфических антител к белкам ВЭ находились в диапазоне разведений от 1/900 до 1/2187000. Максимальный титр антител был обнаружен в препарате иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки гипериммунизированных лошадей (производитель ВЦ НИИ микробиологии МО РФ, Сергиев Посад). Наиболее низкий титр антител был выявлен в сыворотке переболевших морских свинок. Идентификация белков ВЭ, на которые идет формирование иммунного ответа, и с которыми взаимодействуют поликлональные антитела иммунных сывороток, представленных в таблице 6, была также проведена методом иммуноблота. Полученные результаты показали, что поликлональные АТ сывороток к антигену штамма Заир, выявляют белки ОР, ОТ, УР35, УР24, УР40, УР30 и Ь вируса Эбола. Поликлональные АТ сывороток к вирионам 8МС штамма также выявляют белки СР, ОТ, УР35, УР24, УР40, УРЗО и Ь вируса Эбола и набор, по-видимому, клеточных или балластных белков, которые не были полностью удалены в процессе очистки вируса. Исходя из величины этих участков, выявляемых в иммуноблоте, основными иммуногенами являются белки ОТ, УР35, УР40, как штамма Заир, так и 8МС ВЭ. Антивирусные антитела иммунных сывороток против ВЭ штамм Маут§а также выявляли белки ОТ, УР35 и

Таблица 6

Определение специфичной реактивности поликлональных антител с _ инактивированными препаратами вируса Эбола._

Сыворотки (источник антител) Титр антител в ИФА (обр. величины) ВЭ-иммуноген Белки-иммуногены, выявляемые в иммуноблоте

мышь' 72900 штамм Maiynga NP*, VP40*, VP35*,VP30, VP24

кролик1 72900 штамм Maiynga NP*, VP40*, VP35*,VP30, VP24

крыса' 72900 штамм Maiynga NP*

морская свинка' 900 штамм Maiynga NP

ДО лошади2 218700 штамм Заир NP*, VP40*, VP35*

морская свинка3 900 штамм Maiynga GP, NP*

мышь5 81000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

мышь5 729000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

мышь3 2187000 штамм Заир GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

мышь5 9000 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30hL

мышь5 243000 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

мышь3 72900 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

мышь5 72900 штамм 8МС GP, NP*, VP35*, VP24, VP40*, VP30 и L

нормальные сыворотки4 <100 -

Примечание - отсутствие взаимодействия в данной реакции,1 - сыворотки от иммунизированных животных, 2 - 5gG, очищенные из сыворотки лошади, иммунизированной инактивированным и живым вирусом,3 - сыворотка от инфицированного животного, * - нормальные сыворотки мыши, кролика, лошади, морской свинки использовались в качестве отрицательного контроля в ИФА и иммуноблоте, 5 ~ пул сывороток от иммунизированных животных, используемых в гибридизации, ♦ - мажорные полосы, выявляемые в иммуноблоте и соответствующие вирусным белкам

УР40 ВЭ, как основные иммуногены. Итак, данные, полученные нами с использованием антител поликлональных антисывороток, указывали, что основными иммуногенами при иммунизации инактивированными препаратами и, возможно, инфицировании вирусом являются белки ИР, УР35 и УР40 вируса Эбола.

Кроме того, мы провели изучение иммунного ответа, который развивается на структурные белки филовирусов при инфицировании морских свинок вирусом Марбург (штамм Popp), и определение вирусных белков-мишеней для иммунного ответа. Выявляемые на 14-й день инфицирования титры специфических антител (IgG) к ВМ соответствовали от 1/200 до 1/12800 разведениям сывороток (таблица 7).

Таблица 7

Определение методом иммуноблота белков ВМ, индуцирующих синтез противовирусных иммуноглобулинов, выявляемых в сыворотке инфицированных, но выживших морских свинок.

N Условное Вирусные белки Титры

груп обозначение мишени IgG-анти-ВМ

пы животных иммунного ответа (обратные

организма величины)

1 1.1 NP, VP35, VP40 1600

1.2 NP, VP35 400

1.3 NP, VP40 400

1.4 NP, VP40 400

2 2.1 NP, VP35, VP40 1600

2.2 GP,NP, VP35.VP40 6400

3 3.1 VP40 200

4 4.1 NP, VP35, VP40 800

4.2 GP, NP, VP35, VP40 6400

5 5.1 NP, VP35, VP40 800

5.2 NP, VP35 400

6 6.1 NP, VP35, VP40 ' 400

6.2 NP, VP35, УР40 6400

6.3 GP, NP, VP35, VP40 12800

6.4 NP 200

6.5 NP, VP35, VP40 6400

7 7.1 NP, VP35, VP40 800

7.2 NP 200

Примечание: для определения протективной активности морским свинкам массой 180-200г вводили внутрибрюшинно МКА в виде 0,8 мл асцитической жидкости. Через 24 часа животных инфицировали вирусом Марбург в дозе 1-2 ЛД50 (5-10 БОЕ). За животными наблюдали в течение 14 дней.

Данные иммуноблота, представленные в таблице, показывают, на наш взгляд, что синтез противовирусных иммуноглобулинов, выявляемых в сыворотке инфицированных, но выживших морских свинок, происходит, прежде всего, на нуклеокапсидные белки, ЫР и УР35, а также матриксный белок УР40 вируса Марбург. Необходимо отметить, что рост количества

выявляемых сыворотками вирусных белков был пропорционален повышению титров специфических антител.

Итак, с помощью МКА и поликлональных антител позитивных сывороток было обнаружено, что при иммунизации животных инактивированными препаратами филовирусов формируется иммунный ответ, прежде всего на внутренние нуклеокапсидные белки (NP, VP35) и магриксный VP40, нежели на основной белок оболочки. Кроме того, необходимо отметить, что у инфицированных ВМ, но выживших морских свинок, наиболее значительный иммунный ответ также формируется на нуклеокапсидные (NP, VP35) и матриксный VP40 белки.

Изучение белков NP, VP40 и VP35 ВМ и их рекомбинантных аналогов

Для исследования роли отдельных филовирусных белков в формировании антигенной структуры филовирусов было решено использовать рекомбинантные белки как инструмент и обьект исследования, то есть было намечено провести сравнительное изучение филовирусных белков и их рекомбинантных аналогов, полученных в результате экспрессии полноразмерных вирусных генов в прокариотической системе.

С этой целью в лаборатории C.B. Нетесова были собраны и экспрессированы полноразмерные копии генов NP, VP35 и VP40 вируса Марбург в плазмиде pQE (QIAGEN). Рекомбинантные белки rGP, rNP, rVP35 и rVP40 были синтезированы в Е. coli JM103 в значительной концентрации и очищены с помощью Ni-хелатной хроматографии (Таблица 8). Сравнительное изучение иммунореактивных свойств белков ВМ проводили с использованием набора сывороток от животных, иммунизированных очищенным препаратом ВМ или рекомбинантными белками, а так же серопозитивной сыворотки рековалесцента, которая содержит противовирусные антитела, отражающие распознавание антигенных детерминант вируса иммунной системой человека в течение инфекции. Результаты тестирования, представленные в таблице 9 демонстрируют, что рекомбинантные аналоги вирусных белков GP, NP, VP35 и VP40 обладают иммуногенностью, вызывают синтез антител в организме животных и выявляют специфические к вирусу Марбург антитела в сыворотках иммунизированных животных и переболевшего человека, то есть обладают антигенными свойствами.

На рисунке 1 представлен результат специфического взаимодействия антител моноспецифических сывороток против рекомбинантных белков с аналогичными вирусными белками в иммуноблоте.

Детальное изучение антигенной структуры рекомбинантных белков с помощью МКА показало (таблица 10), что 14 из 16-ти типов антител, синтез которых вызывают эпитопы вирусных белков, специфично взаимодействовали с исследуемыми рекомбинантными аналогами. Проведенные исследования антигенной структуры белков вируса Марбург (штамм Popp) с применением специфичных поликлональных и

Таблица 8

Характеристики рекомбинантных белков вируса Марбург.

Рек Белки Молекулярный вес (ВДа) Вектора (ОШЗЕМ) Синтез рек белков (мг/л) Котентгргция очищенных белков (мг/мл)

ПААГ-ЭФ * Теоретич.ь

ЮР 74 «74 РС?Е31 1-2 0,1

гОТ 98 «82 РС?Е-32 5-9 0,5

гУР35 40 «41 Р<ЗЕ-31 50-70 2-5

гУР40 37-38 «37 Р<ЗЕ-31 90-100 5-7

Примечание: а рекомбинантные белки были очищены, используя №-МТА хроматографию (С?ГАОЕ1Ч), разделены в 12% ПААГ-ЭФ и визуализированы окрашиванием с Кумасси синим ; ь определяли путем компьютерного анализа аминокислотной последовательности рекомбинантных белков;

Таблица 9

Взаимодействие рекомбинантных белков с поликлонапьными _сыворотками против вируса Марбург._

ПКА (1£0) Взаимодействие очищенных рекомбинантных белков с ПКА позитивных сывороток (Иммуноблот) Титры специфического взаимодействия рекомбинантных белков с ПКА в ТИФА (обратные величины)

гС,Р | гЫР | гГР35 | г УР40 гОР | гЫР | гУР35 | гУР40

ЧРС - + + + 800 12800 8100 8100

Л1яО - + + 1600 72900 40500 13500

ШС-ВМ + + + + 900 24300 8100 8100

МАС-гОР + 72900 <100 <100 <100 „

МАС-гЫР + <100 218700 <100 <100

МАС-гУР35 + <100 <100 656100 <100

МАС-гУР40 + <100 <100 <100 10875 00

Примечания ЧРС- сыворотка человека (1/500), Л /^С-лошадиные иммуноглобулины против ВМ ( 1/1500), ШС-ВМ- мышиная антисыворотка (1/1000), МАС-гОР - сыворотка против рек СР (1/1000); МАС-гЫР - сыворотка против рек ИР (1/5000), ШС-гУГ40 - сыворотка против рек УР40 (1/10000), МАС-гУР35 - сыворотка против рек УР35 (1/5000)

Рисунок 1.

Выявление методом

иммуноблота взаимодействия белков КР, УР40 и УР35 вируса Марбург с

моноспецифическими сыворотками против

рекомбинантных белков.

1 - антисыворотка мыши к вирусу Марбург в разведении (1/1500);

2 - антисыворотка к рек. белку N1' в разведении (1/1000);

3 — антисыворотка к рек. белку УР35 в разведении (1/1000);

4 - антисыворотка к рек. белку УР40 в разведении (1/1000).

моноклональных антител, позволяют сделать вывод, что нуклеокапсидные белки, № и УР35, матриксный УР40 имеют выраженные антигенные участки, которые активно распознаются иммунной системой животных. Причем индукция антител к этим белкам возникает, как в ответ на иммунизацию вирусным антигеном, так и, по-видимому, в процессе развития филовирусной инфекции при инфицировании людей и животных. Противовирусные поликлональные антитела, синтез которых индуцируется у животных в ответ на введение вирусных белков или их рекомбинантных аналогов, и гибридомные МКА против вирусных белков обладают высокой специфичностью по отношению к исследуемым белкам. Данный факт указывает на близкое сходство, если не идентичность антигенной структуры вирусных белков и их рекомбинантных аналогов, что позволило перейти, в дальнейшем, к картированию антигенной структуры на аминокислотной последовательности вирусных белков с помощью делеционных вариантов их рекомбинантных аналогов.

Таблица 10

Определение взаимодействия МКА, специфичных к вирусу Марбург, с эпитопами рекомбинантных белков: rNP, rVP35 и rVP40.

Иммуноблот Титры МКА в ТИФА

№ МКА Белок -мишень ВМ Рек. аналог Эпитоп rVP35 rVP40 rNP

1 1Е2 VP35 + 1а 67500 <100 <100

2 1Н5 VP35 - н.о. <100 <100 <100

3 3F9 VP35 + 1с 1822500 <100 <100

4 8G3 VP35 - 2а <100 <100 <100

5 9D8 VP35 + Ib 607500 <100 <100

б 6В7 VP40 + 2d <100 656100 <100

7 7С4 VP40 + 2а <100 729000 <100

8 7Н10 VP40 + Ib <100 729000 <100

9 5G8 VP40 + 2с <100 656100 <100

10 5G9 VP40 + la <100 72900 <100

11 9G6 VP40 + le <100 21870 <100

12 1С7 VP40 + н.о. <100 72900 <100

13 7D8 VP40 + 2b <100 243000 <100

14 5F1 NP + la <100 <100 243000

15 5Н7 NP + 2a <100 <100 2187000

16 9С7 NP + 2b <100 <100 6561000

Примечание: н.о. - не определен эпитоп; + взаимодействие МКА с рек. белком; - отсутствие взаимодействия МКА с рек. белком;

Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов

Марбург и Эбола

Анализ результатов, проведенного нами топологического картирования методом конкурентного ИФА эпитопов VP35, VP40 и NP белков ВМ позволяет утверждать о наличии не менее 2 двух антигенных сайтов на каждом исследуемом белке. В результате сравнения перекрывания антигенных эпитопов этих белков было обнаружено, что 7 эпитопов (2 эпитопа NP, 3 эпитопа VP40 и 2 VP35) взаимно перекрываются, образуя общий функциональный участок, который является специфичным для МКА, участвующих в антитело-зависимом комплемент-опосредованном лизисе инфицированных клеток. В их числе некоторые МКА, которые обладали также антивирусной активностью in vivo [Разумов И.А., и др., 2001].

Следующим подходом, используемым для картирования антигенных детерминант филовирусных белков, явилось объединённое применение двух

инструментов исследования, моноклональных антител, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с исследованными антигенными свойствами. С целью идентификации и локализации на аминокислотной последовательности эпитопов связывания моноклональных и поликлональных антител с белком УР35 ВМ были сконструированы и экспрессированы различные фрагменты сОИА гена УР35 ВМ. Одиннадцать фрагментов рекомбинантного белка г\Ф35, содержащих перекрывающиеся аминокислотные последовательности белка УР35 ВМ были синтезированы в Е.соИ (рисунок 2)._____

Рисунок 2. Схема получения фрагментов белка рек.УР35 ВМ.

A. Фрагмент генома ВМ 1027 пн был использован для клонирования рек. УР35.

B. Фрагмент рекомбинантной плазмиды р(}-В5. Отмечены сайты рестрикции плазмиды р(2-05.

C. Фрагменты белка рек.\Ф35 ВМ. Названия фрагментов указаны слева.

Б. Профиль гидрофобности/гидрофильности (Ку1е & Ооо1Ме) белка УР35 ВМ.

С целью определения -иммуногенности полученных рекомбинантных белков (фрагментов гУР35) была проведена иммунизация мышей. Сыворотки, полученные при иммунизации животных фрагментами гУР35, исследовались в ИФА на специфичность взаимодействия с рекомбинантными иммуногенами,

динамику наработки антител в организме в разные сроки после иммунизации и перекрестную реактивность с УР35 вируса Марбург (таблица 11). Полученные результаты продемонстрировали, что в результате иммунизации животных рекомбинантными белками, у всех животных был получен специфический иммунный ответ на эти иммуногены.

Таблица 11

Некоторые характеристики фрагментов белка гУР35 ВМ.

Концентрация Определение в ИФА титров

Рек. Молекулярный вес очищенных (обр.величина)

белок в кДа. гУР35 белков в взаимодействия очищенных

растворе гУР35 белков с антителами

(мкг/мл) сывороток:

ПААГ- Теорет.ь МПС-гУР35" МПС-ВМС

ЭФ"

гУР35 40 40,913 40 7290 8100

рА1 24 24,004 30 2430 8100

рА2 32 32,698 35 2430 2700

рАЗ 17-18 19,083 500 24300 21870

рА4 29 28,811 500 72900 218700

рА5 11 11,130 400 16 <2

рА112 14 14,574 170 8100 65610

рА113 36 36,422 50 7290 21870

рА114 22 24,303 600 218700 656100

рА115 11 11,608 30 ' 8 <2

рАПб 6-7 7,101 30 8 <2

рА117 33 32,918 50 8 <2

Примечание: а рекомбинантные белки были очищены, используя №-М'ГА хроматографию (01АОЕЫ), разделены в 12% ПААГ-ЭФ и визуализированы окрашиванием с Кумасси сшит; ь определяла путем компьютерного анализа аминокислотной последовательности рекомбинантных белков; с МПС-ВМ® мышиная поликлональная сыворотка против вируса Марбург. <1МПС-гУР35 - мышиная поликлональная сыворотка против гУР35 белка.

Антигенная реактивность фрагментов рек.УР35 бьша исследована методом ИФА (таблицы 12) и иммуноблота (рисунки 3 и 4), используя поликлональные антитела антивирусных сывороток и пять УР35-специфических моноклональных антител. Все одиннадцать гУР35 фрагментов реагировали специфически с сывороткой против рекомбинантного белка УР35. Но поликлональные антитела антивирусных сывороток распознавали в ИФА только семь УР35 фрагментов (рА1, рА2, рАЗ, рА4 и рА 112, рАПЗ, рА114). По-видимому, это означает, что только эти фрагменты имитируют антигенную структуру и имеют антигенные свойства исходного вирусного белка. Анализ взаимодействия противовирусных сывороток с указанными фрагментами выявил присутствие двух антигенных участков на белке УР35

ВМ, расположенных между 1 и 174 аминокислотными остатками (ао) и в пределах 174-278 ао около С-конца последовательности.

Изучение взаимодействия 11 фрагментов rVP35 с моноклональиыми антителами против VP35 ВМ показало, что 2 типа МКА, 1Н5 и 8G3, против VP35 ВМ не взаимодействовали с рекомбинантным белком rVP35 и его фрагментами. Три типа МКА (1Е2, 3F9, 9D8), взаимодействующие с рекомбинантным белком VP35, активно реагировали только с пятью (рАЗ, рА4 и рА112, рА113, рА114) из семи rVP35 фрагментов, распознаваемых антивирусными антителами поликлональных сывороток. Результаты изучения взаимодействия aimi-VP35 МКА с рекомбинантными белками, фрагментами rVP35, указывают, что эпитопы, распознаваемые МКА (1Е2, 3F9, 9D8) на белке VP35 ВМ, расположены между 251 и 278 ао.

Таким образом, исследование иммунохимическими методоми взаимодействия перекрывающихся фрагментов рекомбинантного белка VP35, экспрессированных в E.coli., с антивирусными моноклональиыми и

Таблица 12

Определение в ИФА взаимодействия фрагментов белка рек.УР35 ВМ с

Фрагменты VP35 ВМ МКА специфичные к белку VP35 вируса Марбург (сайт, эпитоп).

1Е2 (1а) 3F9 (1а) 9D8 (1а) 8G3 (2а) 1Н5 (?) Смесь МКА

рА1 1-174 ао - - -

рА2 1-251 ао - - - -

рАЗ 167-329 ао 2+ 2+ 2+ - +2+

рА4 84-329 ао 2+ 2+ 2+ - - +2+

рА5 246-329 ао - - - - -

рА112 167-278 ао 2+ 2+ 2+ 2+

рА113 1-278 ао 2+ 2+ 2+ - - 2+

рА114 84-278 ао 2+ 2+ 2+ - - 2+

рАП5 246-329 ао - - - -

рА116 246-278 ао - - - -

рА117 193-268 ао - -

-<• „? 3 V -У 6 г

Рисунок 3 Взаимодействие ПАТ сывороток с фрагментами рек.\Ф35 ВМ в иммуноблоте. Очищенные фрагменты рек УР35 после ЭФ были перенесены на мембрану, как описано в материалах и методах. Затем, мембрана была обработана ПАТ мышиной сыворотки в разведении ¡:3000 и раствором коньюгата антивидовых АТ с пероксидазой. 1, Е. со//-р<ЗЕ31 клеточный лизат; 2, рА112(ао 167-278); 3, рА114 (ао 84-278); 4, рАНЗ (ао 1-278); 5, рА4 (ао 84329), 6, рАЗ (ао 167-329); 7, рА1 (ао1-174).

Й 3 -V 5 в 7"

I---—-¿у'

Рисунок 4. Взаимодействие МКА с фрагментами рек,УРЗ5 ВМ в иммуноблоте. Мембрана с очищенные полипептидами была обработана раствором очищенных МКА 1Е2; ЗР9; 908 (смесь 1:1:1 объем/ объем) в концентрации 1 мкх/мл. 1, рА4 (ао 84—329); 2, рАЗ (ао 167-329); 3, рА1 (ао 1-174); 4, рА113 (ао 1-278); 5,рА112(ао 167-278); 6, рА2 (ао 1-251); 7, рА114 (ао 84-278).

поликлональными антителами позволило выявить 2 антигенных участка на белке УР35 ВМ. Один антигенный участок, названный нами доминантным антигенным районом (ДАР) был локализован между аминокислотными остатками 251-278 с помощью МКА. Месторасположения другого антигенного

участка было выявлено между 1 и 174 аминокислотными остатками с помощью поликлональных антител антивирусных сывороток.

По подобной схеме нами были проведены исследования по картированию антигенных детерминант белка УР35 ВЭ. С этой целью были получены рекомбинантные белки, обозначенные как гУР35 (1-340 ао), ЯесЗЮЫ (1-310 ао), Яес148Н (1-148 ао), ЯесЮОЫ (1-100 ао), Яес86М (1-86 ао), Яес274СЛЧ (36-310 ао), которые имели электрофоретическую подвижность, соответствующую 38.5, 31, 17.5, 10.5, 12, 35 кДа, что соответствовало их расчётным молекулярным весам.

С целью картирования проводили оценку взаимодействия фрагментов белка с антителами антивирусных сывороток и МКА против белка УР35 ВЭ. Как показано в таблице 13, было определено, что антитела кроличьей антисыворотки (КАС) и очищенные лошадиные иммуноглобулины распознавали фрагменты гУР35 так же эффективно, как и полноразмерный белок. Причем важно отметить, что наименьший рекомбинантный фрагмент содержал первые 86 аминокислот с И-конца последовательности УР35. Это позволяет утверждать, что на >4-конце белка локализованы эпитопы для

, Таблица 13

Определение методом ИФА взаимодействия

фрагментов гУР35 ВЭ с антивирусными антителами.

rVP35 и фрагменты белка. М.в. (кДа) Титры антител в ИФА*(обратные величины)

МАС-rVP35 МКА 1С7 МКА 6F7 КАС Ig G лошади

rVP35 1-340 ао 38,5 1 968 300 218 700 24 300 40 500 8 100

Ree 310N 1-310 ао 35 1 968 300 656 100 218 700 218 700 24 300

Ree 148N 1-148 ао 17,5 1 968 300 1 968 300 218 700 72 900 24 300

Ree lOON 1-100 ао 10,5 656 100 1 968 300 218 700 1 968 300 656 100

Ree 86N 1-86 ао 12 656 100 656 100 218 700 72 900 24 300

Ree 274CN 36-310 ао 31 218 700 <100 <100 218 700 72 900

Лизат M15 <100 <100 <100 <100 <100

связывания антител и этот район во многом формирует иммунный ответ на VP35 белок. Взаимодействие МКА с рекомбинантными фрагментами белка VP35 ВЭ в ИФА и иммуноблоте было отличным от реагирования с поликлональными антителами. Отсутствие взаимодействия МКА 1С6 и 6F7 с полипептидом Rec274CN (36-310 а.о.), вероятно, свидетельствует о том, что первые 36 N-концевых аминокислотных остатков VP35 ВЭ задействованы в формировании эпитопов для МКА и их удаление приводит к нарушению связывания. Кроме того, тот факт, что полипептид Rec274CN (36-310 ао) не взаимодействовал с МКА, но реагировал с антителами позитивных сывороток, даёт нам основание предположить, что на белке VP35 ВЭ находится не менее двух антигенных детерминант, индуцирующих синтез антител B-клетками в ходе развития иммунного ответа.

Выявление перекрестно-реактивных эпитопов белков ортопоксвнрусов, взаимодействующих с нейтрализующими МКА.

К настоящему времени накопились данные, которые указывают, что различные виды ортопоксвнрусов значительно отличаются по степени контагиозное™ и спектру патогенности, но обладают морфологическим подобием и перекрестно-реактивной антигенной структурой [Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. 1998; Moss В., 2000]. Вирус эктромелии (ВЭм), который также относится к ортопоксвирусам, не патогенен для человека, хотя вызывает заболевания у мелких грызунов, и значительные эпизоотии мышей с летальными исходами были зарегистрированы [Chen N., et al 2003]. Изучение перекрестной реактивности МКА против ВЭм и их ингибирующего действия на репликацию патогенных для человека ортопоксвнрусов in vitro, например, в реакции нейтрализации, позволяет надеяться на выявление родоспецифических нейтрализующих МКА и идентификацию новых эпитопов белков ортопоксвнрусов, участвующих в формировании защитного иммунитета. Кроме того, лабораторные линии мышей, восприимчивые к вирусу эктромелии, могут быть использованы в качестве пермиссивной животной модели ортопоксвирусной инфекции, то есть для выявления роли нейтрализующих перекрестно-реактивных МКА в подавлении инфекции при введении в организм.

В нашем Центре была создана коллекция из 125 гибридом, крысиного происхождения, продуцирующих МКА к ВЭм. Целью нашего исследования явилось изучение перекрестной реактивности и нейтрализующей активности полученных МКА против патогенных для человека ортопоксвнрусов: вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК) и вирус натуральной оспы.

В результате анализа взаимодействия 125 МКА с ВОВ и ВОК нами было обнаружено, что 112 видов МКА (90%) перекрестно взаимодействовали с ВОВ и ВОК, и лишь 12 МКА (10%) реагировали только с ВЭм. Исходя из представленных в работе данных иммунопрециитации вирусных белков с МКА, можно сделать вывод, что при введении в нечувствительных к вирусу

эктромелии крыс Lou очищенных вирионов ВЭм индуцируется иммунный ответ на белки 14 кДа, 35 кДа и 37 кДа. Наиболее иммунодоминантным является белок 14 кДа, который, по-видимому, является продуктом гена 129L ВЭм по аналогии с геном A27L ВОВ. МКА СЗ (шАЬСЗ) [Rodriguez J.F., et al 1985] к белку 14 кДа (ген A27L) ВОВ, штамм WR, любезно предоставленные доктором Эстебано, были использованы для идентификации белка 14 кДа ВЭм (ген 129L), с которым взаимодействуют в иммунопреципитации полученные гибридомные МКА. Получив позитивный результат, мы сформировали панель из 22 типов очищенных препаратов МКА, реагирующих с белком 14 кДа (таблица 14). В состав этой панели вошли 19 МКА против ВЭ, 1 против ВОК и 2 против ВОВ. Далее мы провели анализ перекрестного реагирования этих МКА с ВОВ, ВОК, ВЭм и ВНО в ИФА. Было выявлено, что 9 из 10 перекрестно-реагирующих МКА взаимодействовали с также с ВНО.

Чтобы выяснить, как наличие перекрестно-реактивной структуры соотносится с антивирусной активностью МКА, были исследованы вируснейтрализующие свойства 46 МКА в реакции нейтрализации (РН) ВОВ на культуре клеток Vero. Как показано в таблице 14, из 10 представленных перекрестно-реагирующих МКА пять нейтрализовали ВОВ, из них 2 МКА с максимальной антивирусной активностью были оценены в РН с ВНО, где они также подавляли размножение этого вируса.

Известно, что белок слияния 14 кДа (ген A27L) ВОВ индуцирует синтез вируснейтрализующих антител и активирует клеточный иммунный ответ в инфицированном организме. Развитие ортопоксвирусной инфекции может быть предотвращено при введении в организм нейтрализующих антител против белка 14 кДа (ген A27L). Это позволяет говорить о принципиально важной роли белка слияния в процессе формирования противовирусного иммунитета. Для более полного исследования свойств белков слияния ВЭм и ВНО, гомологов белка слияния ВОВ (ген A27L), в отделе С.Н. Щелкунова были клонированы гены 129L ВЭм и ген A30L ВНО в составе плазмиды pQE32 (Qianogen). Это позволило получить аффинно-очищенные рекомбинантные полипептиды prl29L и prA30L в количествах достаточных для проведения данного исследования. В таблице 15 представлены данные по взаимодействию МКА с аффинно-очищенными prl29L , и prA30L полипептидами. Двадцать один тип МКА из 22 гибридомных антител взаимодействовал с очищенным prl29L ВЭм как в ИФА, так и в иммуноблоте. Исключение составили МКА 112Н12, которые эффективно взаимодействовали с белком слияния в составе вирусной частицы ВЭм, и хотя не распознавали его рекомбинантный аналог, prl29L, но реагировали при этом в ИФА с prA30L полипептидом. Девять типов МКА перекрестно взаимодействовали в ИФА и 8 из них в иммуноблоте с ргАЗОЬ, что указывало на наличие общих антигенных детерминант как у белков слияния

Таблица 14

Перекрестное реагирование и нейтрализующая активность МКА при _ взаимодействии с ортопоксвирусами.__

Название МКА Титр МКА (обратные величины) в ИФА ИФА МКА с ВНО» РН"

ВЭм ВОВ ВОК ВОВ ВНО

111 АЗ 3,65x105 1,09х106 1,2х105 + - но

111С4 3,65x10' < 100 < 100 - - но

112Н12 1,09x106 3,65х105 1,09x10' + 80 110

11305 1,2х105 8,1 х10 3 8,1 хЮ 3 - 200 но

ИЗБв 1,09x106 3,65x10* 1,2х105 + 200 110

115К11 1,09x106 1,09x106 3,65х105 + - но

117АЗ 1,2x105 < 100 <100 - - но

122С10 1,2х105 < 100 < 100 - - 110

122Е9 1,2x105 < 100 < 100 - - но

12204 4,1x10" < 100 <100 - - но

122Н9 2,2x106 2,2x106 2,2x10' + 12000 500

123СЭ 1,4x10" < 100 < 100 - - но

124В6 З,65х103 < 100 < 100 - - но

124Н9 3,65х105 < 100 <100 - - но

124Н2 3,65х105 < 100 < 100 - - но

12509 1,09х106 2,2x106 1,5x10® + 8000 500

126С9 4,1x10" < 100 <100 - - но

126СЗ 4,1x10" < 100 < 100 - - 110

127И2 1,2х105 < 100 < 100 - - но

1Е1 2,4x10" 1х103 2,4x10" + - но

8В11 <300 2,2х105 1х103 + - но

1Ю7 6,6х106 6,6х106 2,4x105 + - но

* - ВНО был обработан, как описано ранее, и полученный лизат использован в качестве антигена в ИФА, где значения оптической плотности при 495 нм обозначены "-"<0 2,"+" >1,0 МКА были использованы в виде асцитической жидкости в разведении 1 500, " указана обратная величина разведения асцитической жидкости, содержащей МКА, ингибирующих >50% бляшкообразующих единиц (БОЕ) при введении 1000 БОЕ в лунку, - отсутствие эффекта в нейтрализации, но - не определяли

ВЭм и ВНО, так и у их рекомбинантных аналогов.

Итак, полученные нами данные свидетельствуют, о наличии перекрестно-реагирующих или, возможно, родоспецифических эпитопов у белков слияния разных видов ортопоксвирусов, патогенных и непатогенных для человека, и что исследуемые рекомбинантные полипептиды полностью сохраняют или имитируют згу структуру. Пять типов перекрестно-реагирующих МКА к белку слияния обладали активностью в реакции

нейтрализации против ВОВ, штамм ЛИВП, а дополнительно изученные МКА 122Н9 и \22G9 были способны также нейтрализовать ВНО, штамм Инд-За. Таким образом, впервые удалось показать наличие эпитопов на белке АЗОЬ ВНО, которые непосредственно участвуют в нейтрализации вирусной активности

Таблица 15

Определение взаимодействия МКА с очищенными рекомбинантными полипептидами, рг129Ь ВЭм и ргАЗОЬ ВНО.

№ Название МКА Вирус-иммуноген Результаты реагирования МКА с рекомбинантными белками

рг129Ь ргАЗОЬ

Титр МКА в ИФА" Иммуноблотк Титр МКА в ИФА' Иммуноблоть

1 111АЗ ВЭм 3,65 х105 + 2,2x10' +

2 111С4 ВЭм 1,29х105 + < 100 -

3 112Н12 ВЭм <100 - 4,05x10" -

4 11305 ВЭм 4,05x104 + < 100 -

5 113Р8 ВЭм 3,65x105 + 2,2x105 +

6 И5П1 ВЭм 4,05x10" + 4,05x10" +

7 117АЗ ВЭм 4,05x10" + < 100 -

8 122С10 ВЭм 1,29х105 + < 100 -

9 122Е9 ВЭм 3,65хЮ5 + <100 -

10 12204 ВЭм 3,65х105 + <100 -

11 122Н9 ВЭм 3,65x10' + 3,65x10' +

12 12303 ВЭм 1,29x10' + < 100 -

13 124В6 ВЭм 3,65x10' + <100 -

14 124Н9 ВЭм 3,65x10' + <100 -

15 124Н2 ВЭм 1,29x10' + < 100 -

16 125в9 ВЭм 1,29x10' + 1,29x10' +

17 126С9 ВЭм 1,29x10' + <100 -

.18 126СЗ ВЭм 1,29x10' + <100 -

19 127Р2 ВЭм 4,05x10" + < 100 -

20 1Е1 ВОК 2,43x10" + 2,43x10" +

21 8В11 ВОВ 2,43x10" + 2,43x10" +

22 1Ю7 ВОВ 4,4x10" + 4,4x10" +

Примечание: "в таблице приведены обратные величины титров МКА, определенные в ИФА. Вестерн-блот, где специфическое взаимодействие МКА с рекомбинантными белками отмечено знаком «+», отсутствие взаимодействия «-».

Изучение с помощью нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН

Одновременно со вспышкой лихорадки Западного Нила в Северной Америке в 1999 году была зарегистрирована вспышка лихорадки Западного Нила в южных районах России (в Астрахани и Волгограде). В 2002 году были получены первые свидетельства циркуляции современного генотипа вируса Западного Нила на территории юга Западной Сибири. Вместе с тем данные об антигенной вариабельности штаммов, выделяемых на территории России и ближнего зарубежья, отсутствовали. В связи с этим, мы получили коллекцию гибридом и сформировали панель из 24 МКА, реагирующих в ИФА с ВЗН, штамм Vlg99-27889, который был выделен в 1999 году в Волгограде от больного. Полученная панель МКА была использована для исследования нейтрализующей активности МКА против различных штаммов ВЗН и картирования нейтрализующих эпитопов (Nt-эпитопов) белка Е ВЗН. Из этой панели было выбрано 16 МКА (таблица 16), которые проявляли вируснейтрализующую активность против штамма Vlg99-27889 (генотип 1а). Далее, нейтрализующая активность МКА из этой панели была определена одновременно по отношению к 7 штаммам ВЗН, которые были получены из Государственной коллекции вирусных штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, Россия).

Нейтрализующие МКА были разделены на 4 группы на основе реактивности в реакции нейтрализации, иммуноблоте, РТГА, перекрестной реактивности с 7 штаммами ВЗН и вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) (таблицы 16 и 17). В группу I вошли МКА с нейтрализующей активностью по отношению ко всем исследованным штаммам ВЗН. Нейтрализующая активность МКА против различных штаммов ВЗН в пределах групп II - IV была различной от штамма к штамму. Обобщение данных по Nt-эпитопам ясно указывает, что эти Nt-эпитопы различны. Это позволило нам заключить, что имеется не менее 13 различных Nt-эпитопов ВЗН, узнаваемых нйтрализующими МКА (Nt-MKA), большинство из которых расположено на гликопротеине Е ВЗН. От одного до семи видов Nt-MKA были отрицательны в РН с использованием штаммов VlgOO-27924, Нр-94, А-1640, А-72, Tur-2914 и EglOl ВЗН. Мы предположили, что эти штаммы ВЗН не имеют идентичных эпитопов, которые распознают соответствующие Nt-MKA. Для подтверждения этой гипотезы мы исследовали взаимодействие МКА по отношению к этим штаммам в ИФА. Результаты ИФА продемонстрировали, что большинство штаммов ВЗН имеют эпитопы для взаимодействия Nt-MKA. Это позволяет заключить, что некоторые эпитопы белка Е штаммов VlgOO-27924, А-72 и Eg 101 ВЗН сохранены, но не все из них вовлечены в нейтрализацию. Штаммы Tur-2914, А-1640 и Нр-94 не взаимодействовали с несколькими видами Nt-MKA групп III и IV в ИФА (таблица 19, черные ячейки). Такая мозаичная нейтрализующая активность и взаимодействие в ИФА указывают, по-видимому, на два вида антигенной вариабельности для ВЗН. Первый тип

антигенной вариабельности связан с отсутствием нейтрализующей активности МКА после взаимодействия их с эпитопами, а второй тип антигенной вариабельности связан с потерей способности МКА, взаимодействовать с этими эпитопами.

Таблица 16

Панель нейтрализующих МКА к ВЗН.

МКА Субтип IgG Белок мишень Титр в ИФА" (обр.величины) Титр в РТГА ИФА с ВКЭ

9Е2 IgG2a Белок Е 21.870000 819200 -

7G9 IgG3 Белок Е 2.430000 40 -

11G3 IRG3 Белок Е 810000 1280 -

7Е6 IgG3 Белок Е 243000 320 -

5Н6 IgGl - 656100 - -

7В9 IgG2b Белок Е 729000 - +

2G12 IgG3 Белок Е 24300 - +

5F11 lgG3 67 кОа* 243000 - +

1В7 IgG3 Белок Е 243000 - -

3F4 IgG2b Белок Е 656100 -

4F11 IgG3 Белок Е 243000 160 -

5F7 IgGl 24300 - -

7В2 IgGl Белок Е 24300 - -

1D12 IgGl 67 кЭа* 8100 -

4D10 IgGl — 72900 -

7F9 IgGl Белок Е 243000 -

Гиперим сыворотка n.d. п.6. 2.430000 320 +

Примечание: (+) - указывает на взаимодействие; (-) - отсуствие взаимодействия; (*) -блот-с лизатом инфицированных ВЗН клеток, n.d. - не определяли, "а" - титр в ИФА приведен в виде обратных величин разведения превышающих контрольный показатель ОП (cut-off value) не менее, чем в 3 раза.

Картирование антигенных детерминант при помощи рекомбинантных полипептидов позволяет уточнить расположение районов аминокислотной последовательности вирусных белков, вызывающих образование антител. Такой подход был ранее успешно использован нами для белков вирусов Марбург и Эбола [Рудзевич Т.Н, и др., 2003; Sorokin A.V., et al 2002]. В

настоящей работе, мы попытались использовать этот же подход для картирования антигенных детерминант белка Е ВЗН.

Таблица 17

Определение нейтрализующей активности МКА против размножения __штаммов ВЗН в культуре клеток Vero._

МКА Титр МКА (обр. величины) в РН:

Vlg99-27889 VlgOO-27924 Нр-94 A-1640 Tur-2914 A-72 EglOl

Гиперимм. сыворотка ** 128,000 64,000 400 32,000 100 6,400 128,000

Группа Ja (нейтрализующие все штаммы, блот +)

9Е2 1.024,000 256,000 64,000 512,000 64,000 512,000 1.024,00 0

7G9 512,000 64,000 200 64,000 400 256,000 512,000

11G3 256,000 3,200 3,200 128,000 400 128,000 256,000

7Е6 16,000 4,000 4,000 8,000 4,000 16,000 8,000

Группа Ib (нейтрализующие все штаммы, блот -)

5Н6 512,000 800 200 64,000 400 128,000 512,000

Группа II (перекрестно-реагирующие)

7В9 512,000 800 ..¿:í S L - ^ 16,000 64,000 32,000

2G12 4,000 200 тШжп 400 800

5F11 256,000 , 32,000 4,000 F" 200 64,000

Группа III (WNVS, блот+)

1В7 128,000 400 ■ i . 32,000 200 64,000

3F4 128,000 64,000 400 128,000

4F11 64,000 64,000 800 64,000

Группа IV (WNVS, блот

5F7 800 400 400

7В2 6,400 50 50 50 50

№12 50 50 50 50 50 50

4D10 16,000 n.d. n.d. 250 ti d n.d. ,, 'ji <í '.¿% 'Щ К"'

7F9 6,400 n.d. 4,000 n.d. IBÉ ¡ n.d. 800

Примечание: Титр в РН был рассчитан как разведение МКА, ингибирующее более чем на 50% развитие ЦПД. Н.о - не определяли. ** - отсутствие активности в реакции.

- отсутствие нейтрализации МКА

- отсутствие нейтрализации и взаимодействия МКА в ИФА

В результате работ по клонированию кДНК фрагментов генома ВЗН (штамм LEIV-Vlg99-27889- human) были клонированы в векторах E.coli фрагменты гена структурного белка Е ВЗН. Сотрудниками нашего отдела

были получены короткие рекомбинантные фрагменты белка Е, которые были использованы для картирования эпитопов связывания с МКА [Razumov I.A., et al 2002].

Результаты взаимодействия поликлональных антител и МКА с рекомбинантными фрагментами белка Е ВЗН в ИФА представлены в таблице 18. Семь рекомбинантных фрагментов, представляющих практически всю последовательность белка Е, были использованы для картирования эпитопов Nt-MKA. Результаты исследования взаимодействия Nt-MKA с эти полипептидами (rVPE,.I80, rVPE,.277, rVPEi.321, rVPEI27.193, rVPE i.g6,rVPE 53-126 и rVPE260-466) в ИФА указывают, что только пять типов Nt-MKA распознавали эти полипептиды.

Таблица 18

Взаимодействие МКА с рекомбинантными фрагментами белка Е ВЗН в ИФА.

№ МКА Титр МКА в ИФА:

Е1-180 ао Е 1-277ао Е 1-321ао Е 1-86 ао Е 127193 ао Е 53126 ао Е 260-466 ао

1 9Е2 <100 <100 <100 <100 <100 <100 2187000

2 7G9 <100 <100 <100 <100 <100 <100 729000

3 11G3 <100 <100 <100 <100 <100 <100 8100

4 7Е6 <100 <100 <100 <100 <100 <100 24300

5 5Н6 <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100

4F11 121500 121500 121S00 2700 <100 8100 <100

6 ГПА-ВЗН 24300 24300 24300 2700 2700 2700 218700

7. ИПА-ВЗН 8100 8100 8100 900 900 900 72900

8 NS0-асцит <100 <100 <100 <100 <100 <100 <100

Примечание: но - не определяли. Полипептиды сорбировали на пластик в течение ночи в концентрации 100-200 нг/лунку. Лизат бактериальных клеток в разведении 1:100 - 1:200 использовали в качестве отрицательного контроля. ГПА-ВЗН -поликлоиальные антитела гипериммунной сыворотки против ВЗН; ИПА-ВЗН -поликлональные антитела иммунной сыворотки против ВЗН.

МКА 9Е2, 7G9, 11G3 и 7Е6 из группы 1а реагировали только с rVPE26o-466. а МКА 4F11 (группа III) взаимодействовали с rVPE].180) rVPEU321 rVPE i.g6, и rVPE 53-126- Результаты ИФА были подтверждены в иммуноблоте с Nt-MKA и полипептидами rVPEi.32i. rVPE 53.i26 и rVPE260_466- Анализ данных указывает, что район 321-466 ао белка Е, в который входит домен III (домен III образован единым фрагментом последовательности 305-394 ао), есть наименьший из полученных рекомбинантный фрагмент, несущий эпитопы для всех Nt- МКА из 1а группы.

Второй район взаимодействия для 4F11 Nt-MKA был локализован между аминокислотными остатками 1-126, которые включают аминокислотные остатки доменов I и II Е белка. Внутри этой последовательности расположен пептид слияния белка Е ВЗН, который участвует в процессе взаимодействия вируса с клеткой. Взаимодействие нейтрализующих МКА 4F11 с районом Е белка, в состав которого входит пептид слияния (98-113 ао), вызывает торможение гемагглютинации гусиных эритроцитов вирусом. Отсутствие взаимодействия других Nt-MKA с относительно большими rVPE полипептидами позволяют предположить, что большинство эпитопов для Nt-MKA являются конформационными. Данные результаты, что МКА из 1а группы распознают аминокислотные остатки 321466 белка Е, позволяют предположить, что взаимодействие этих нейтрализующих МКА с указанным районом, по-видимому, подтверждает ранее опубликованные данные по индукции III доменом белка Е ВЗН вируснейтрализующих антител.

Проведенный нами конкурентный анализ взаимодействия меченных и немеченых МКА с ВЗН в ИФА, показал, что МКА 9Е2, 7G9, 11G3 и 7Е6 взаимно конкурируют (ингибирование связывания > 75%) между собой за взаимодействие с белком Е ВЗН. Это указывает, по-видимому, на то, что они взаимодействуют с одним и тем же сайтом Е белка. МКА 5Н6 не конкурировали с этими МКА за взаимодействие с белком Е ВЗН. МКА 4F11 не конкурировали ни с одним из используемых МКА за взаимодействие с ВЗН и, по-видимому, также реагировали с другим сайтом. Это позволяет считать, что данные по пространственному расположению эпитопов белка Е ВЗН, полученные методом конкурентного ИФА совпадают с результатами эпитопного картирования (таблица 18).

Результаты этой работы позволили обнаружить антигенную вариабельность современных штаммов вируса Западного Нила, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия моноклональных антител. Обобщая наши данные по иммунобиологической активности Nt-MKA и картированию Nt-эпитопов с использованием рекомбинантных полипептидов, можно говорить о наличие не менее 13 различных Nt-эпитопов у штаммов ВЗН. Такое большое количество Nt-

эпитопов предполагает, что механизм нейтрализации ВЗН является более сложным, чем считалось ранее, и он нуждается в дальнейшем исследовании. Вероятно, что полученные нами МКА 9Е2, 7G9, 11G3 и 7Е6, реагирующие с 321-466 ао белка Е ВЗН, не идентичны описанным ранее МКА 5С5 и 5Н10 [Sanches M.D., et al 2005]. Взаимодействие нейтрализующих МКА 4F11, активных также в РТГА, с полипептидами rVPEi-ш, rVPE|.8(5, гУРЕ,.180 указывает, что домены I и II белка Е также вовлечены в рецепторные взаимодействия вируса и клетки.

Анализ нейтрализующей активности МКА 9Б2 и рекомбинантных одноцеиочечных scFv 9Б2 и гуманизированных Fc-9E2 антител

В последние десятилетия внимание ученых и фармацевтических производителей привлекают рекомбинантные антитела, которые в принципе можно получить в значительных количествах и использовать как в научных исследованиях, так и в практическом плане. Наибольший интерес при этом, конечно, вызывают гуманизированные антитела, в которых вариабельные участки человеческих антител заменены последовательностями, высокоспецифичными к выбранному объекту, например, последовательностями гибридомных МКА.

В связи с этим, целью данного этапа работы явилось получение на основе гибридомных МКА 9Е2, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН, рекомбинантных одноцепочечных (scFv 9Е2) и гуманизированных (Fc-9Е2) антител (рисунок 5) и проведение сравнительной оценки их свойств и нейтрализующей активности. Рекомбинантные антитела были получены под руководством сотрудника нашего Центра А.В. Перебоева совместно с сотрудниками Центра генотерапии (Университета Алабамы, Бирмингем, США) и представлены нам для исследования. С целью определения белка-мишени для взаимодействий антиген-антитело, методом иммуноблота мы визуализировали реагирование scFv9E2 антител с ВЗН, перенесенным на мембрану. Как показали результаты иммуноблота, представленные на рисунке 6, очищенный препарат ВЗН взаимодействовал с рекомбинантным полипептидом ~ 30 кДа в составе лизата клеток штамма рОРЕЮ1/9Е2. По-видимому, антитела scFv 9Е2 имитируют паратоп гибридомных МКА 9Е2 и могут быть использованы для создания гуманизированных антител.

Рекомбинантные химерные Fc-9E2 антитела были получены и очищены, как описано ранее [Pereboev A, et al 2008]. Мы фракционировали очищенные Fc-9E2 антитела в электрофорезе. Для сравнения на рисунке 7 показана электрофореграмма МКА 9Е2 и очищенных гуманизированных антител Fc-9E2, подготовленных в редуцированных и нередуцированных (то есть без нагревания и обработки меркаптоэтанолом) условиях. Методом иммуноблота с ВЗН было показано (рисунок 7), что гуманизированные Fc-9E2 антитела, как и гибридомные МКА 9Е2, взаимодействуют с белком Е ВЗН, перенесенным на шпроцеллюлозную мембрану.

Рисунок 5. Схема конструирования рекомбинантных одноцепочечных 5сРу 9Е2 и гуманизированных Рс-9Е2 антител на основе нейтрализующих гибридомных МКА 9Е2 против ВЗН.

Рисунок 6. Анализ рекомбинантных scFv 9Е2 антител, синтезирующихся в E.coli. Электрофореграмма и иммуноблот. А - 1 и 5 - лизат E.coli JM103, 2 - 4, 6 и 7 - лизат клонов E.coli JM103 трансформированных плазмидой рОРЕЮ1/9Е2; 8 - белки-маркеры молекулярного веса фирмы «Sigma», 200, 96, 66, 43, 29, 18 и 14 кДа, соответственно. Б - 1 -лизат E.coli JM1Ö3 (отрицательный контроль); 2 - лизат штамма-продуцента, синтезирующего антитела scFv 9Е2;__

Antiviral Res. 2008 Jan;77(l):6-13. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. [Pereboev A, et al 2008]

Итак, нами было продемонстрировано, что гуманизированные Рс-9Е2 антитела несут детерминанты Рс-фрагмента человеческого иммуноглобулина, так как реагируют с антивидовым коньюгатом, и в тоже время сохраняют специфичность гибридомных антител, так как взаимодействуют с белком Е ВЗН.

Для того чтобы убедиться, что полученные рекомбинантные аналоги (бсРу 9Е2 и Рс-9Е2) сохраняют свойство природных антител, нейтрализовать инфекционность вирионов ВЗН, мы провели сравнительное изучение нейтрализующей активности полученных рекомбинантных и гибридомных 9Е2 антител.

Рисунок 7. Анализ рекомбинантных Fc-9E2 антител. Электрофореграмма. I - маркеры молекулярного веса белков фирмы «Sigma», 200, 96, 66, 43, 29, 18 и 14 кДа, соответственно; 2 - антитела Fc-9E2 (10 мкл), приготовленные без меркаптоэтанола и нагревания; 3 - Fc-9E2 (10 мкл), приготовленные с меркаптоэтанолом и нагреванием; 4 - гибридомные очищенные МКА 9Е2, 5мкл, (с меркаптоэтанолом и нагреванием). Иммуноблот. Определение взаимодействия Fc-9E2 антител с белком Е ВЗН. Полоски мембраны с белками ВЗН (штамм Vlg99-27889) обработаны: 1 -гибридомными МКА 9Е2 в разведении (1/1000); 2 - очищенными рекомбинантными антителами Fc-9E2 в разведении (1/1000); 3 -рекомбинантными антителами Fc-9E2 (культурадьная среда от трансфекцированных клеток-продуцентов антител); 4 - лизат клеток нетрансфекцированных гошмидой._

Как видно из представленных данных (таблица 19), как гибридомные МКА 9Е2, так и их рекомбинантные аналоги (scFv 9Е2 и Fc-9E2) нейтрализовали инфекционность вирионов ВЗН, штаммы Vlg99-27889 и Eg 101, в различных разведениях, то есть обладали различной противовирусной активностью. Так одноцепочечные антитела scFv 9Е2, хотя и были использованы в концентрации ~ в 4 раза выше, чем гуманизированные антитела Fc-9E2, проявляли нейтрализующую способностью в 200-400 раз ниже. Нейтрализующая активность полученных химерных антител Fc-9E2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 штаммов Vig99-27889 и Eg 101 ВЗН была сравнима с таковой гибридомных МКА 9Е2.

Таблица 19.

Исследование противовирусного действия очищенных гибридомных МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов в реакции нейтрализации ВЗН.

Антитела (С мг/мл) Ингибирование вирионов штаммов ВЗН

Штамм VIg99-27889 Штамм Eg 101

1000 100 1000 100

ТЦЦ50 ТЦЦ50 ТЦД50 ТЦЦ50

Титры антител (обр. величины), вызывающие эффект нейтрализации вируса

МКА9Е2 (2,8) 1024000 1024000 - 1024000

scFv 9Е2 (2,5) но 10240 по 5120

Fc-9E2" (0,6) 128000 1024000 - 1024000

FC-9E2*" (2,5) 128000 1024000 - 256000

NS/0 асцит - - - -

контроль вируса - - - -

контроль клеток + + + +

Примечание: * "обратные величины разведения антител или титры МКА, вызывающие эффект нейтрализации вируса; - нет эффекта нейтрализации, полное цитонатическое действие вируса на клетки; + монослой клеток без явлений ЦПД; но - не определяли;

аффинноочшценные антитела (—90% чистоты) продуцируемые в культуре клеток А549 и очищенные, используя белок А; "*' антитела (-30%), продуцируемые в культуре клеток 293 и очищенные, используя переосаждение в сульфате аммония.

Таким образом, совокупность представленных нами результатов по сравнительному изучению свойств гибридомных МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов, одноцепочечных бсРу 9Е2 и химерных Рс-9Е2 антител, позволяют утверждать:

- полученные рекомбинантные антитела сохранили конформацию вариабельного домена исходных МКА 9Е2 и способны взаимодействовать с эпитопами поверхностного гликопротеина Е ВЗН, штаммов N^99-27889 и У^00-27924, циркулирующих на территории России;

- при взаимодействии с ВЗН рекомбинантные антитела (бсРу 9Е2 и Рс-9Е2) проявляют свойство гибридомных МКА 9Е2, способность нейтрализовать инфекционность вирионов ВЗН, штаммов У1я99-27889 и Её 101. Нейтрализующая активность полученных химерных антител Рс-9Е2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 вирионов штаммов \Mg99-27889 и Ея 101 ВЗН сравнима с таковой гибридомных антител и лишь несколько ниже (в

разведении 1/12800 для Рс-9Е2 вместо 1/1024000 для МКА 9Е2) против 1000 ТЦД50 штамма У^99-27889 ВЗН;

- относительная простота наработки и очистки гуманизированных антител Рс-9Е2 в совокупности с вышеизложенными свойствами делает такие антитела перспективным объектом для дальнейшей оценки возможности их использования в разработке средств иммунотерапии против лихорадки Западного Нила.

ВЫВОДЫ

1. Созданы и заложены на хранение (-196°С) в банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор" уникальные коллекции гибридных клеток-продуцентов, более чем 700 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов, в том числе, к филовирусам, вирус Марбург (ВМ) (21 гибридома) и вирус Эбола (ВЭ) (38 гибридом); к ортопоксвирусам, вирус эктромелии (ВЭм) (125 гибридом), вирус осповакцины (ВОВ) (27 гибридом), вирусы оспы коров (ВОК) (9 гибридом); к флавивирусам, вирус Западного Нила (ВЗН) (25 гибридом).

2. В результате использования панели МКА против структурных белков вирусов Марбург и Эбола получены приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, NP и VP35, и матриксного VP40 белков и их роли в формировании иммунного ответа:

- впервые показано, что белки NP и VP35 вирусов Марбург и Эбола содержат перекрестно-реактивные антигенные детерминанты, взаимодействующие с моноклональными и поликлональными антителами против филовирусов;

- впервые установлено, что МКА к NP, УР35 и VP40 белкам ВМ обладают антивирусной активностью - вызывают in vitro лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента; а предварительное введение морским свинкам МКА к VP40 ВМ ингибирует развитие фюювирусной инфекции у животных;

- обнаружено, что иммунный ответ, как при иммунизации инактивированным вирусом, так и в процессе развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, NP и VP35, и VP40 матриксный белки;

- выявлено, что вирусные белки (NP, VP40, VP35 ВМ и VP35 ВЭ) и их рекомбинантные аналоги, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена вирусного белка в E.coli, при введении в животных индуцируют синтез противовирусных антител, которые перекрестно

реагируют с этими белками, что указывает на близкое сходство антигенной структуры вирусных белков и их рекомбинантных аналогов.

3. Впервые на структуре белка VP35 ВМ выявлено две антигенных детерминанты, по одной на N-концевой и С-концевой части последовательности, соответственно. Одна антигенная детерминанта локализована между 251-278 ао с помощью МКА, а вторая между 1-174 ао с помощью поликлональных антител;

- при картировании белка VP35 ВЭ впервые показано, что первые 86 аминокислотных остатков N-концевой части последовательности принципиально важны для формирования антигенной структуры белка. Причем первые 36 ао N-концевой части VP35 определяют формирование не менее двух эпитопов для паратопов МКА.

4. В результате анализа взаимодействия панели МКА с ортопоксвирусами выявлено наличие родоспецифических антигенных детерминант, определяющих перекрестную реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы:

- так 112 типов МКА (~ 90%), из 125 исследованных МКА против ВЭм, перекрестно взаимодействовали с антигенными детерминантами ВОВ и ВОК, и лишь 12 типов МКА (~ 10%) реагировали только с видоспецифическими детерминантами белка слияния ВЭм (ген 129L);

- белки слияния ВЭм (ген 129L), ВОВ (ген A27L), ВОК и ВНО (ген A30L) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез B-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды prl29L (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

5. С помощью панели МКА против штамма Vlg99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии:

-на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине), которые разделены на 4 группы при обобщении данных по перекрестной реактивности МКА с вирионами 7 штаммов ВЗН и вирусом КЭ. МКА, взаимодействующие с группой I, способны нейтрализовать все 7 исследуемых штаммов ВЗН. Нейтрализующая активность МКА групп II-IV являлась вариабельной. Максимальные различия в реакции нейтрализации выявлены у штаммов Нр-94 и Tur-2914, у которых, по-видимому, изменены 7 эпитопов.

6. Продемонстрировано наличие двух дискретных районов белка Е ВЗН, вовлеченных в реакции (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район ао 321-466, включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН и несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между ао 1126. Эта последовательность включает аминокислотные остатки I и II доменов

Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

7. Получены рекомбинантные аналоги нейтрализующих МКА 9Е2, одноцепочечные scFv 9Е2 и гуманизированные Fc-9E2 антитела, которые сохранили способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9E2 сравнима с таковой у гибридомных антител.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. СТАТЬИ.

1. Pereboev A, Borisevich V, Tsuladze G, Shakhmatov M, Hudman D, Kazachinskaia E, Razumov I, Svyatchenko V, Loktev V, Yamshchikov V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus //Antiviral Res. -2008,- Vol.7, Nl.-P.6-13.

2. Razumov I.A.. E.I. Kazachinskaia, V.A. Temovoi, E.V. Protopopova, I.V. Galkina*, V.L. Gromashevskii*, A.G. Prilipov*, D.K. L'vov*, and V.B. Loktev . Neutralizing monoclonal antibodies against Russian Strain of the West Nile Vims. //Viral Immunology. - 2005. - V.18., N3. - P. 558-568.

3. Разумов И.А. И.П. Гилева, M.A. Васильева, T.C. Непомнящих, М.Н. Мишина, Е.Ф. Беланов, Г.В. Кочнева, Е.Е. Коновалов, С.Н. Щелкунов и В.Б. Локтев. Нейтрализующие моноклональные антитела перекрестно реагируют с белками слияния вирусов эктромелии {ГЕН 129L) и натуральной оспы {ГЕН A30L) //Мол. Биология - 2005. - том 39, № 6. - С.1046-1054.

4. Разумов И.А.. М.А. Васильева, О.А. Серова, Л.В. Артемьева, Н.И. Бормотов, Е.Ф. Беланов, Г.В. Кочнева, Е.Е. Коновалов, В.Б. Локтев. Изучение нейтрализующей активности и перекрестного реагирования моноклональных антител к вирусу эктромелии с патогенными для человека ортопоксвирусами //Вестник РАМ. - 2004. - том 8. - С. 19-22.

5. Т.Н. Рудзевич, В.А.Терновой, Е.И. Казачинская, И.А. Разумов. А.А. Чепурнов, В.Б. Локтев, С.В. Нетёсов. Выявление антигенных детерминант на N-конце белка VP35 вируса Эбола с помощью коротких рекомбинантных фрагментов этого белка //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2003. - № 2. - С. 38-41.

6. A.V. Sorokin, E.I. Kazachinskaia, A.V. Ivanova, A.V. Kachko, S.V. Netesov, A.A. Bukreyev, V.B. Loktev, and I.A. Razumov, Mapping of two dominant sites ofVP35 of Marburg virus. //Viral Immunology. - 2002 - V.15 - P. 481-492.

7. T. Cheusova, A.V. Kachko, A.V. Sorokin, E.I. Kazachinskaia, I. Cheshenko, L Razumov. S.V. Netesov, E. Ryabchikova . Studies of the expression of Marburg

virus recombinant nucieoprotein. //G.I.T. Imaging & Microscopy - 2002. - V.4 -P. 26-27.

8. Казачинская E. И., В. А. Терновой, Т. H. Рудзевич, С. В. Нетесов, А. А. Чепурнов, И. А. Разумов. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. //Вопр. Вирусологии. -2001. - том 46, № 5. - С.25-31.

9. Разумов И.А.. Е.Ф. Беланов, Н.И. Бормотов, Е.И. Казачинская. Выявление противовирусной активности моноклональных антител, специфичных к белкам вируса Марбург //Вопр. Вирусологии. - 2001. - т.46, №1. - С.33-37.

10. Качко А.В., Т.Б. Чеусова, А.В. Сорокин, Е.И. Казачинская, И.О. Чешенко, Е.Ф. Беланов, А.А. Букреев, А.В. Иванова, И.А Разумов. Е.И. Рябчикова, С.В Нетесов. Сравнительное изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург //Мол. Биология. - 2001. - том 35, № 3. - С.492-499.

11. Казачинская Е.И, А.В. Перебоев, А.А. Чепурнов, Е.Ф, Беланов, И.А. Разумов. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург //Вопр. Вирусологии. - 2000. - т.45, N3,- С.40-44.

12. Ivan V. Surovtsev", Ivan A. Razumovb. V.M. Nekrasov, Alexander N. ShvaIovc J.T. Soini, V.P. Maltsev, A.K. Petrov, V.B. Loktev and A.V. Chernyshev Mathematical modeling the kinetics of cell distribution in the process of Iigand-receptor binding //J.theor. Biol. - 2000. - V.206, N3 - P. 407-417.

13. А.В.Сорокин, Е.И. Казачинская , А.В Качко, А.В. Иванова, А.А. Букреев , И А.Разумов. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург //Вопр. Вирусологии. - 1999.-t.44, N5,- С.274-279.

14. Ivan V. Surovtsev", Ivan У. Razumovb, Alexander N. Shvalov0 Kinetic study of formation of antigen-antibody complexes on the cell surface with the scanning flow cytometry //SPIE Proceedings. -1999 - Vol.3604. - P. 199-206.

15. Разумов И.А.. Е.Ф. Беланов, А.А. Букреев, Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеристика //Вопр. Вирусологии. - 1998. N6. -С.274-279.

16. Кузьмичева Г.А., Кувшинов В.Н., Разумов И.А.. Иванисенко В.А., Ерошкин А.М., Мишин В.П., Ушакова Т.А., Локтев В.Б., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Использование фаговой библиотеки пептидов в картировании группоспецифического гемагглютинирующего домена гликопротеина Е2 альфавирусов //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1997. - N4-C.25-29.

17. Кузьмичева Г.А., Кувшинов В.Н., Разумов И.А.. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M., Мишин В.П., Орешкова С.Ф., Локтев В.Б., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Локализация группоспецифического, гемагглютинирующего эпитопа гликопротеина Е2 альфавирусов с помощью фаговой библиотеки пептидов //ДАН РФ. - 1997.-Т.352, N1.-C.112-116.

18. Pereboev A.V.. I.A.Razumov. V.A.Svyatchenko, V В Loktev. Glycoprotein E2 of the Venezuelan and Eastern equine encephalomyelitis viruses contain multiple cross-reactive epitopes //Arch.Virology. - 1996. - Vol.141, N. 11. -P.2191-2205.

19. Лифке B.B., И.А. Разумов, C.H. Коновалова. Моноклональные антнидиотипические антитела, имитирующие антигенную детерминанту сайта гемагглютинации гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ //Вопр. вирусологии. -1997. - T.42,N1 - С.19-23.

20. Ильичев А.А. Меламед Н.В., Разумов И.А., Максютов И.А., Перебоев А.В., Закабанин А.И., Локтев В.Б. (1996). Изучение экспресии фрагментов гена белка Е2 вируса ВЭЛ в системе основанной на РНК-полимеразе фага Т7 //Мол. биология 1996. - Т. 30, вып 1. - С. 76-83.

21. Шпилевая М.В., Кущ А.А., Разумов И.А., Архипов В.Н., ЦилинскийЯ.Я., Локтев В.Б. (1995). Эпитопная специфичность и протективная активность моноклональных антител к вирусу венесуэльского энцефаломиелита лошадей //Вопр. Вирусологии. - 1995. - т. 40. N 2- С. 82-85.

22. Разумов И.А.. Т.Н.Разумова. Изучение роли моноклональных антител к вирусу ВЭЛ в качестве специфических активаторов in vivo иммунокомпетентных клеток, выявляемых in vitro //Вопр. вирусологии-1995. -N3.- С. 106-109

23. E.V. Agapov, I.A. Razumov. I.V. Frolov, А.А. Kolykhalov, S.V. Netesov and V.B. Loktev. Localization of four antigenic sites involved in Venezuelan Equine Encephalomyelitis virus protection //Arch.Virology.- 1994. - Vol.139.Nl-2. - P.173-181.

24. Razumov I.A.. A.D.Khusainova, E.V .Agapov, S.Ya.Gaidamovich, A.V.Pereboev, A.A.KoIykhalov, S.V.Netesov & V.B.Loktev, The study of the hemagglutination activity domains of VEE and EEE viruses //Intervirology. -1994. - Vol.37, N6,- P. 356-360.

25. Святченко B.A., Перебоев A.B., Агапов E.B., Разумов И.А., и др. Изучение антигенной структуры вируса ВЭЛ. Картирование сайтов Е2-2 и Е2-6 гликопротеина Е2 с помощью пептидов //Вопр. Вирусологии. - 1993. -Т. 38, N4-Р. 162-167.

26. Перебоев А.В., Святченко В.А., Агапов Е.В., Разумов И.А.. и др. Изучение антигенной структуры гликопротеинов Е1 и Е2 вируса ВсЭЛ при помощи МКА //Вопр. Вирусологии,- 1993. - Т.38, N3. - Р.117-122.

27. Разумов И.А.. Агапов Е.В., Перебоев А.В„ Протопопова Е.В., Лебедева С.Д., Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры вируса ВЭЛ при помощи моноклональных антител. 1. Получение гибридом и антигенная структура белка Е1 вируса ВЭЛ //"Итоги науки и техники" сер. Вирусология. -1992 -т.28, часть 2 - "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" под ред. Д.К.Львова,-Москва - С. 66-72.

28. Разумов И.А.. Агапов Е.В., Перебоев А.В,. Протопопова Е.В., Лебедева С.Д., Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры вируса ВЭЛ при помощи моноклональных антител. 1. Антигенная структура белка Е2 и протективная

активность моноклональных антител //"Итоги науки и техники" сер. Вирусология, - 1992. -т.28, часть 2 - "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" под ред. Д.К.Львова,-Москва - С. 73-80.

29. Агапов Е.В., Лебедева С.Д., Разумов И.А.. Фролов И.В., Колыхалов A.A., Локтев В.Б., Нетесов C.B., Сандахчиев Л.С., 1991, Варианты вируса ВЭЛ, резистентные к нейтрализующему действию моноклональных антител. //Доклады Академии наук СССР. - 320, N 6. - С.1485 -1488.

30. Разумов И.А.. Агапов Е.В., Перебоев A.B., Протопопова Е.В. Лебедева С.Д., Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры гликопротеина El вируса Венесуэльского энцефаломиелита лощадей с помощью моноклональных антител //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1991.N.6 -С. 21-24.

31. Разумов И.А., Агапов Е.В., Протопопова Е.В., Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклональных антител //"Итоги науки и техники" сер. Вирусология. - 1991. - Т.24 -"Арбовирусы и арбовирусные инфекции" под ред. Д.К.Львова,- Москва. -С. 54-57.

32. Разумов И.А.. Агапов Е.В., Перебоев A.B., Протопопова Е.В., Лебедева С.Д., Локтев В.Б. Изучение антигенной структуры гликопротеина Е2 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей с помощью крысиных моноклональных антител //Вопросы вирусологи. - 1991. Т.36. N 1 - С.34-37.

33. Разумов И.А.. Перебоев A.B., Агапов Е.В.,Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Агапов Е.В., Мельникова Е.Э., Гайдамович СЛ., Локтев В.Б. Изучение рецепторной области вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител //Вопросы вирусологии. -1991. - Т.36, N. 6. - С.489 - 492.

34. Razumov I A, Agapov Е V, Pereboev А V, Protopopova Е V, Lebedeva S D, Loktev V.B. Investigation of antigenic structure of attenuated and virulent Venezuelan equine encephalomyelitis virus by of monoclonal antibodies //Biomedical Science -1991. - Vol.2 - P. 610-615.

35. Гайдамович С.Я., Локтев В.Б., Лаврова H.A., Максютов A.3., Мельникова Е.Е., Перебоев A.B., Протопопова Е.В., Разумов И.А., Свешникова H.A., Хусаинова А.Д. Моноклональные антитела перекрестно реагирующие с вирусом клещевого энцефалита и вирусом Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. //Вопр. Вирусологии. - 1990. - №3. -С.221-225.

ПАТЕНТЫ.

1. Васильева М.А., Разумов И.А.. Локтев В.Б., Беланов Е.Ф.,. Коновалов Е.Е. «Штамм гибридных клеток животного Rattus norvégiens L. 122Н9 -продуцент перекрестно-реактивных нейтрализующих моноклональных антител против ортопоксвирусов патогенных для человека» Патент РФ на изобретение № 2265658 (Заявка на патент №2004126520, приоритет от 01.09.2004.

2. Казачинская Е.И, Алексенко Т.П., Разумов И.А. Протопопова Е.В., Локтев В.Б. «Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 9Е2, используемый для получения моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила штамм WNV/LEIV-Vlg99-27889». Патент РФ № 2265658 (заявка на патент №2004100930, приоритет от 09.01.2004).

3. .A.B. Сорокин, И.А. Разумов..Е.И. Казачинская, A.B. Качко,A.B. Иванова, В.П. Мишин,A.A. Букреев, Е.Ф. Беланов, , С.В.Нетесов, В.Б.Локтев Рекомибинантная плазмидная ДНК Q_D5, кодирующая гибридный полипептид G5, обладающий антигенными и иммуногенными свойствами белка VP35 вируса Марбург, способ ее получения, и штамм бактерий E.Coli - сверхпродуцент рекомбинаитного полипептида Î35. Патент РФ 2144565. Положительное решение формальной экспертизы по заявке N 98120373 от 12 ноября 1998.

4. Е.И. Казачинская, И.А. Разумов. В.Б. Локтев. Заявка на изобретение: "Штамм гибридных культивируемых клеток животного Rattus norvegicus, используемый для получения моноклональных антител к вирусу гепатита А человека." Патент РФ № 2142507 Положительное решение формальной экспертизы от 11.08.97 по заявке на патент РФ N 97107909. от 13.05.97

РАЗУМОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИРУСОВ

Автореф дисо на соискание ученой степени доктора биологических наук Подписано в печать 20 10.2008. Заказ № 89 Формат 60x90/16 Уел печ л 2. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им Г К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Разумов, Иван Алексеевич

Список использованных сокращений. 6

ВВЕДЕНИЕ. 8

ГЛАВА 1. Обзор данных литературы. 19

1.1. Моноклональные антитела как инструмент изучения вирусных белков.

1.1.1. Моноклональные антитела: получение и основные свойства.

1.1.2. Исследование и картирование антигенных детерминант на вирусных белках с помощью МКА.

1.2. Филовирусы: вирусы Марбург и Эбола.

1.2.1. Классификация, морфология, организация генома, структура и функции белков.

1.2.2. Иммунитет при филовирусных инфекциях.

1.2.3. Вакцинный потенциал филовирусных белков.

1.2.4. МКА к филовирусам: получение, свойства и применение.

1.3. Флавивирусы: вирус Западного Нила (ВЗН).

1.3.1. Общая характеристика ВЗН

1.3.2. Структурные белки флавивирусов и белок Е ВЗН.

1.3.3. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН в изучении флавивирусов.

1.4. Ортопоксвирусы: ВНО, ВОВ, ВОК, ВЭм.

1.4.1. Краткая характеристика ортопоксвирусов.

1.4.2. Некоторые методы исследования ортопоксвирусных белков.

1.4.3. Мембранные белки ортопоксвирусов.

1.4.4. МКА против структурных белков ортопоксвирусов.

1.5. Использование рекомбинантных белков для изучения и картирования антигенных детерминант на вирусных белках.

1.6. Гибридомные МКА и рекомбинантные одноцепочечные, химерные и гуманизированные антитела на их основе.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть (Материалы и методы). 77

2.1. Исходные материалы.

2.1.1. Материалы и реактивы.

2.1.2. Вирусные препараты.

2.1.3. Клеточные культуры и среды.

2.1.4. Сыворотки и иммуноглобулины.

2.1.5. MICA к вирусным белкам.

2.1.6. Рекомбинантные белки вирусов и рекомбинантные антитела.

2.2. Методы получения гибридом и приготовления MICA.

2.2.1. Иммунизация животных-доноров иммунных спленоцитов

2.2.2. Получение гибридом.

2.2.3. Клонирование гибридом.

2.2.4. Криоконсервация клеточных линий.

2.2.5. Наработка значительных количеств МКА in vivo.

2.2.6. Методы очистки МКА.

2.2.7. Измерение концентрации белковых препаратов.

2.2.8. Определение класса и подкласса моноклональных иммуноглобулинов.

2.2.9. Приготовление конъюгатов антител с биотином.

2.3. Иммунологические методы.

2.3.1. Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.3.2. Конкурентный иммуноферментный анализ.

2.3.3. Определение константы аффинности МКА.

2.3.4. Иммуноблот.

2.3.5. Реакция нейтрализации вируса in vitro.

2.3.6. Антителозависимый лизис инфицированных вирусом клеток.

2.3.7. Определение протективной активности МКА при пассивной иммунизации животных.

2.4. Электрофорез.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение исследований. 96

3.1. Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ

Вектор» » за период с 1982 по 2007 годы.

3.2. Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител. 103 3.2.1. Исследование препаратов вирусов Марбург и Эбола, используемых для получения гибридом.

3.2.2. Получение коллекции гибридом, продуцирующих MICA к филовирусам, и изучение свойств гибридомных антител.

3.3. Использование МКА в изучении белков филовирусов, их антигенной структуры, биологической активности и иммуногенных свойств.

3.3.1. Применение специфических моноклональных и поликлональных антител для выявления перекрестно-реактивных антигенных детерминант на структурных белках филовирусов Марбург и Эбола.

3.3.2. Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 ВМ, на репродукцию вируса.

3.3.3. Определение с помощью моноклональных и поликлональных антител иммунодоминантных белков филовирусов, формирующих В-клеточный иммунный ответ.

3.4. Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител. 141

3.4.1. Использование моноклональных антител для сравнительного изучения иммуногенных и антигенных свойств белка VP35 вируса

Эбола и его рекомбинантного аналога.

3.4.2. Изучение белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител.

3.5. Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов

Марбург и Эбола, с использованием моноклональных антител, рекомбинантных белков и их фрагментов.

3.5.1. Топологическое картирование антигенных сайтов и эпитопов на белках NP, VP40 и VP35 вируса Марбург.

3.5.2. Картирование антигенных детерминант и эпитопов для МКА на аминокислотной последовательности белков VP35 филовирусов

Марбург и Эбола.

3.6. Изучение перекрестного взаимодействия МКА против ортопоксвирусов с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами.

3.6.1. Определение видоспецифических эпитопов ВЭм и родоспецифических эпитопов ВНО, ВОВ, ВОК и ВЭм

3.6.2. Выявление перекрестной нейтрализующей активности МКА, реагирующих с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии ген 129L) и натуральной оспы (ген A30L).

3.7. Исследование с использованием гибридомных МКА антигенных взаимоотношений штаммов вируса Западного Нила, изолированных в России и за рубежом.

3.7.1. Получение и характеристика MICA, реагирующих с общими и дифференцирующими антигенными детерминантами ВЗН.

3.7.2. Изучение с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом.

3.8. Сравнительный анализ нейтрализующей активности гибридомных

МКА 9Е2 и рекомбинантных одноцепочечных scFv 9Е и гуманизированных Fc-9E2 антител против белка Е ВЗН.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов"

Актуальность проблемы

Только за последние 3-4 десятилетия было выявлено около 30 новых возбудителей инфекционных болезней, поразивших за этот период сотни миллионов человек и унесших миллионы жизней. К их числу относятся несколько возбудителей острых и хронических диарей, гепатитов С и Е, возбудители венесуэльской (вирус Гуанарито) и бразильской (вирус Сабиа) геморрагических лихорадок, СПИДа, геморрагических лихорадок Эбола (вирус Эбола) и Марбург (вирус Марбург) и других заболеваний. Кроме того, инфекционные заболевания расширяют ареал своего распространения. Ярким примером возникновения и распространения в последнее время новых вариантов вирусов является проникновение вируса Западного Нила в Северную Америку (Нью-Йорк) в 1999 году и его повсеместное распространение по территории континентов Северной и Южной Америки. Совместными усилиями правительств многих стран, под эгидой ВОЗ, в 20-м веке удалось ликвидировать только одну вирусную инфекцию - натуральную оспу. Вместе с тем, в настоящее время по ряду причин, включая угрозу биотерроризма и отсутствие современных способов лечения и профилактики, центры по контролю и предотвращению болезней во многих странах снова ставят вирус натуральной оспы на первое место в списке потенциальных агентов массового поражения. Необходимо отметить, что для многих вновь возникающих инфекций нет ни средств специфического лечения, ни эффективных способов профилактики.

Целью настоящей работы является получение с помощью моноклональных антител комплекса новых данных о структурно-функциональных свойствах белков вирусов патогенных для человека.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Освоить комплекс методов по технологии получения гибридом и создать коллекцию гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека.

2. Получить и очистить моноклональные антитела, исследовать их иммунобиологические свойства и сформировать представительные панели МКА к структурным белкам вирусов.

- выявление и изучение перекрестно-реактивных антигенных детерминант на белках филовирусов Марбург и Эбола;

- определение иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков УР35 и УР40 вируса Марбург (ВМ);

- исследование роли М5, УР35 и УР40 белков филовирусов в формировании противовирусного иммунитета;

- исследование антигенной изменчивости штаммов ВЗН, выделенных в России и в ближнем зарубежье;

- сравнительное изучение антигенной схожести вирусных белков и их рекомбинантных аналогов;

- детальное картирование эпитопов белка УР35 вирусов Эбола и Марбург и гликопротеина Е ВЗН; проведение сравнительного анализа противовирусной активности гибридомных и рекомбинантных одноцепочечных и гуманизированных антител против белка Е ВЗН. Научная новизна

Создание коллекции гибридных клеточных линий, гибридом, продуцентов антител к вирусным антигенам, и формирование представительных панелей МКА стимулировали исследование вирусов на стыке трех наук, вирусологии, иммунологии и молекулярной биологии. С помощью МКА был проведен цикл работ по изучению антигенной структуры и картированию антигенных детерминант структурных белков флавивирусов, ортопоксвирусов, филовирусов и других вирусов, патогенных для человека. Проведенное исследование позволило получить комплекс новых данных по антигенной структуре изучаемых вирусов и уточнить функции вирусных белков в процессе формирования противовирусного иммунитета.

Так использование моноклональных антител позволило получить приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, МР и УР35, и матриксного УР40 белков вирусов Марбург и Эбола и ее роли в формировании противовирусного иммунитета.

Впервые обнаружено наличие общей перекрестно-реактивной антигенной детерминанты на нуклеотидных белках 1чГР и УРЗ 5 вирусов Марбург и Эбола.

С помощью МКА проведено топологическое картирование эпитопов белков ЫР, УР40 и УРЗ 5 вируса Марбург. Установлено, что 7 эпитопов на структурных белках УРЗ5 и УР40 вируса Марбург, взаимно перекрываясь, образуют функциональный домен, индуцирующий синтез МКА. Именно эти МКА проявляли антивирусную активность - в присутствии комплемента они вызывали лизис клеток, инфицированных вирусом Марбург. В ходе уточнения роли антигенных детерминант на белке УР40 ВМ было выявлено 2 эпитопа, которые индуцируют синтез протективных антител В-клетками. Предварительное введение этих МКА в морских свинок защищает их от гибели при заражении ВМ.

В результате исследования закономерностей формирования противовирусного иммунитета на белки филовирусов обнаружено, что иммунный ответ, как на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе начального развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные КР и УРЗ 5 белки и УР40 матриксный белок.

Анализ антигенной структуры белков филовирусов (ЫР, УР40, УРЗ 5 ВМ и УРЗ 5 ВЭ) и их рекомбинантных аналогов показал, что не только рекомбинантные белки, но и их фрагменты могут сохранять антигенную конформацию вирусных белков. Используя МКА и фрагменты рекомбинантных аналогов вирусных белков, впервые удалось провести картирование антигенных детерминант и эпитопов на аминокислотной последовательности УР35 белков вирусов Марбург и Эбола.

С помощью нейтрализующих МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА, например, штаммы Нр-94 и Тиг-2914, у которых выявлены различия в нейтрализации по 7 эпитопам. Даже штаммы У^99-27889 и У^00-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали вариабельность в реакции нейтрализации по 4 эпитопам.

В результате сравнительного изучения иммунобиологической активности МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов (одноцепочечных и гуманизированных антител) было обнаружено, что рекомбинантные аналоги сохранили конформацию вариабельного домена исходных гибридомных антител, определяющего способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9Е2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 ВЗН была сравнима с таковой гибридомных антител.

Практическая ценность работы.

В результате проделанной работы был успешно создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором депонировано более чем 700 гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов: к вирусам Японского энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей; восточного энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1, к вирусу иммунодефицита человека типа 2, к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В, гепатита А, а также к филовирусам, вирус Марбург и вирус Эбола; к ортопоксвирусам, включая вирус эктромелии, вирус осповакцины, вирусы оспы коров; к флавивирусам, вирус Западного Нила. Полученные гибридомы и в настоящее время могут быть успешно использованы, как штаммы-продуценты для получения МКА.

Сформированная коллекция гибридом и полученные панели МКА с изученными свойствами к структурным белкам вирусов могут быть использованы для развития прикладных исследований в области иммунодиагностики вирусных инфекций: в диагностических целях для создания диагностических препаратов и тест-систем; в качестве средств контроля в производстве иммунобиологических препаратов; в качестве лигандов для аффинной хроматографии и с целью очистки биомолекул из сложных биологических смесей.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Создание оригинальной коллекции гибридом, которые и в настоящее время могут быть успешно использованы как штаммы-продуценты, секретирующие моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными, очищенными, гомогенными и высокоаффинными препаратами антител с определенной специфичностью.

3. Нуклеокапсидные, и УР35, и матриксные УР40 белки филовирусов играют значительную роль в формировании защитного иммунного ответа организма: так в процессе развития филовирусной инфекции иммунный ответ у переболевших животных формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, и УР35, и УР40 матриксный белки филовирусов, что, возможно, является определяющим фактором выживания.

4. Белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЪ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и вируса натуральной оспы.

5. Современные штаммы ВЗН, циркулирующие в Евразии, обладают значительными антигенными отличиями: с помощью панели МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине). Кроме того, выявлены максимальные антигенные различия в реакции нейтрализации у штаммов Нр-94 (год выделении 1963) и Тиг-2914 (год выделении 1973), у которых, по-видимому, изменено по 7 эпитопов на белке Е ВЗН.

6. Получены МКА с нейтрализующей активностью против 7 исследованных штаммов ВЗН, которые являются перспективными для создания иммунодиагностических наборов и, возможно, для разработки препаратов для иммунотерапии тяжелых случаев лихорадки Западного Нила. Так, на наш взгляд, высоко активные гуманизированные нейтрализующие антитела Рс-9Е2 привлекательны для будущего конструирования и создания нового антивирусного препарата для лечения лихорадки Западного Нила.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах:.

Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994; First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995; Vth International Congress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995; Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996); Russian-German colloquium on filoviruses: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997); Vlth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999); Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000); IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001); VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия, 2001); 3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно-технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов A.A.); проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 (рук. Покровский А.Г.) и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98-04-49439-а (рук. Нетесов C.B.), 01-04-49877-а (рук. Качко A.B.), №01-04-48972-а (рук. Разумов И.А.).

Публикации.

3.5), кбн A.A. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн A.A. Беланов (раздел 3.2, 3.3 и

3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн A.B. Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн A.B. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), A.B. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и

3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А. Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн С.Н. Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С. Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.

Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф. Локтеву Валерию Борисовичу.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.х.н., проф. Малыгину Эрнст Георгиевичу и д.б.н. Татькову Сергею Ивановичу.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Разумов, Иван Алексеевич

ВЫВОДЫ.

- впервые показано, что белки NP и YP35 вирусов Марбург и Эбола содержат перекрестно-реактивные антигенные детерминанты, взаимодействующие с моноклональными и поликлональными антителами против филовирусов;

- впервые установлено, что МКА к NP, VP35 и VP40 белкам ВМ обладают антивирусной активностью - вызывают in vitro лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента; а предварительное введение морским свинкам МКА к белку VP40 ВМ ингибирует развитие филовирусной инфекции у животных;

- выявлено, что вирусные белки (NP, VP40, YP35 ВМ и VP35 ВЭ) и их рекомбинантные аналоги, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена вирусного белка в E.coli, при введении в животных индуцируют синтез противовирусных антител, которые перекрестно реагируют с этими белками, что указывает на близкое сходство антигенной структуры вирусных белков и их рекомбинантных аналогов.

3. Впервые на структуре белка УР35 ВМ выявлено две антигенных детерминанты, по одной на ]Ч-концевой и С-концевой части последовательности, соответственно. Одна антигенная детерминанта локализована между 251-278 ао с помощью МКА, а вторая между 1-174 ао с помощью поликлональных антител;

- при картировании белка УР35 ВЭ впервые показано, что первые 86 аминокислотных остатков Ы-концевой части последовательности принципиально важны для формирования антигенной структуры белка. Причем первые 36 ао 1\[-концевой части УР35 определяют формирование не менее двух эпитопов для МКА.

- так 112 типов МКА 90%), из 125 исследованных МКА против ВЭм, перекрестно взаимодействовали с антигенными детерминантами ВОВ и ВОК, и лишь 12 типов МКА (~ 10%) реагировали только с видоспецифическими детерминантами белка слияния ВЭм (ген 129Ь);

- белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЬ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды рг129Ь (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

5. С помощью панели МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии:

6. Продемонстрировано наличие двух дискретных районов белка Б ВЗН, вовлеченных в реакции (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район ао 321-466, включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН и несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между ао 1-126. Эта последовательность включает аминокислотные остатки I и II доменов Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

Заключение.

В ходе проделанной работы был освоен комплекс методов по получению гибридом и характеристике антител и на основании этой технологии был создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором хранятся уникальные коллекции гибридных клеток-продуцентов, более чем 700 гибридом ('— более 5000 ампул), секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным антигенам, в том числе, к патогенным для человека агентам: к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В, гепатита А, вируса иммунодефицита человека типа 2, к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1 и к структурным белкам альфавирусов (вирусы венесуэльского энцефаломиелита лошадей и восточного энцефаломиелита лошадей), флавивирусов (вирусы клещевого энцефалита, лихорадки Западного Нила и Японского энцефалита), ортопоксвирусов (вирусы эктромелии, осповакцины, оспы коров) и филовирусов (вирусы Марбург и Эбола).

Одним из подходов, используемых в ходе выполнения данной работы, является применение МКА специфичных к вирусным белкам, как инструмента для изучения антигенной структуры и роли определённых вирусных белков в формировании иммунного ответа. МКА с этой целью были получены и охарактеризованы по ряду свойств. Получение и использование панели МКА с определенными свойствами для изучения структурных белков филовирусов, вирусы Марбург (штамм Popp) и Эбола (штамм Mayinga), в направлении: выявление антигенной и перекрестно-реактивной структуры, биологической (противовирусной) активности и закономерностей формирования противовирусного иммунитета позволили получить ряд принципиально новых результатов: впервые была показана взаимная перекрестная активность поликлональных и моноклональных антител, специфичных к ВЭ с антигеном ВМ, а антител поликлональных сывороток, специфичных к ВМ, с антигеном ВЭ. Кроме того, методом иммуноблота с использованием поликлональных и моноклональных антител против вируса Эбола нами были выявлены, что белки NP и VP35 филовирусов содержат перекрестно-реактивные антигенные структуры;

- впервые было установлено, что МКА, специфичные к нуклеокапсидным (NP и VP35) и матриксному (VP40) белкам вируса Марбург обладают антивирусной активностью in vitro - вызывают специфический лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента;

- анализ полученных нами данных, по пассивной защите животных, сероконверсии вируса, а так же патоморфологии внутренних органов экспериментальных животных, позволяет утверждать, что введение антивирусных МКА 5G9 и 5G8, специфичных к матриксному белку VP40 ВМ, ингибирует развитие инфекционного заболевания на ранних стадиях, предохраняя организм морских свинок от летального развития патологического процесса. Подобный феномен указывает, по нашему мнению, на наличие способности белка VP40 вируса Марбург индуцировать синтез защитных антител B-клетками при иммунизации животных; с помощью МКА и поликлональных антител позитивных сывороток было обнаружено, что при иммунизации животных инактивированными препаратами филовирусов формируется иммунный ответ, прежде всего на внутренние NP и VP35 нуклеокапсидные белки и VP40 матриксный белок.

С целью изучения антигенной структуры индивидуальных вирусных белков, мы использовали рекомбинантные белки и МКА, как инструмент выявления и идентификации эпитопов на вирусных и рекомбинантных белках. В результате сравнительного изучения вирусных белков, NP, VP40, VP35 вируса Марбург и VP35 вируса Эбола, и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител было обнаружено,

- вирусные и рекомбинантные белки, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена белка в E.coli, имеют выраженные иммуногенные структуры, которые активно распознаются иммунной системой животных.

Причем индукция антител к вышеуказанным вирусным белкам возникает как в ответ на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе развития филовирусной инфекции при инфицировании животных.

- противовирусные антитела, которые индуцируются у животных в ответ на введение вирусного белка или его рекомбинантного аналога, обладают перекрестной реактивностью по отношению к данным белкам, что указывает на близкое сходство, если не идентичность их антигенной структуры.

Детальное картирование эпитопов структурных вирусных белков, используя моноклональные антитела, рекомбинантные белки и их фрагменты; позволили получить новые данные:

- построены топологические карты антигенной структуры трех белков ВМ, УР35, УР40 и 1МР: на нуклеопротеине определено 2 сайта, включающих 4 эпитопа; на УР35 - 2 сайта (4 эпитопа); на УР40 - 2 сайта (7 эпитопов). В результате сравнения перекрывания на топографичекой карте эпитопов этих сайтов было обнаружено, что 7 эпитопов этих белков (2 эпитопа М5, 3 эпитопа УР40 и 2 УР35) взаимно перекрываются, образуют функциональный домен, индуцирующий комплемент-зависимый лизис инфицированных клеток и синтез защитных антител (МКА 5в9 и 508);

- впервые на структуре белка УР35 ВМ было выявлено две антигенных детерминанты, по одной на И-концевой и С-концевой части последовательности, соответственно. Один антигенный участок, названный нами доминантным антигенным районом (ДАР) был локализован между 251278 ао с помощью моноклональных антител. Месторасположения другого антигенного участка было выявлено между 1 и 174 ао с помощью поликлональных антител антивирусных сывороток;

- результаты по картированию белка УР35 ВЭ впервые показали, что первые 86 аминокислотных остатков 1Ч-концевой части УР35 ВЭ принципиально важны для формирования антигенной структуры УР35 и содержат, по-видимому, эпитопы различных антигенных детерминант. Причем первые 36 аминокислотных остатков Ы-концевой части УР35 предопределяют формирование двух эпитопов для МКА 1С6 и 6Р7.

В результате анализа перекрестного взаимодействия анти-ортопоксвирусных МКА с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами было обнаружено,

- из 125 исследованных МКА против ВЭм 112 типов МКА перекрестно взаимодействовали с антигенными детерминантами ВОВ и ВОК и лишь 12 типов МКА реагировали только с вирусом эктромелии (штамм К1);

- детальный анализ взаимодействия панели МКА против ортопоксвирусов с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии (ген 129Ь) и натуральной оспы (ген АЗОЬ) и их рекомбинантными аналогами, рг129Ь и ргАЗОЬ, указывает на наличие, как минимум, трех различных групп эпитопов на белке слияния ортопоксвирусов. Группа эпитопов 1 является видоспецифической, так как МКА (12 типов) к ней взаимодействуют только с ВЭм. А остальные эпитопы групп 2 и 3 могут быть отнесены к родоспецифическим. МКА (10 типов) к этим эпитопам перекрестно-реагируют с такими ортопоксвирусами как ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО. Кроме того, эпитопы группы 3, распознаваемые 5 типами МКА, вовлечены в индукцию вируснейтрализующих антител.

- белки слияния ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против вируса натуральной оспы, и что рекомбинантные полипептиды рг129Ь (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти эпитопы.

Проведенное исследование с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом, позволило заключить:

- впервые создана коллекция из шестнадцати гибридом, продуцирующих нейтрализующие МКА против штамма У^99-27889 ВЗН, выделенного в 1999 году от погибшего человека в течение вспышки лихорадки Западного Нила в Волгограде, Россия. Нейтрализующие МКА были разделены на 4 группы на основе перекрестной реактивности в реакции нейтрализации, иммуноблоте, РТГА, реактивности в ИФА с 7 штаммами ВЗН. Обобщение данных по перекрестной реактивности МКА с вирионами этих штаммов ясно указывает, что на структурных белках ВЗН имеется не менее 13 различных эпитопов, узнаваемых нейтрализующими МКА, большинство из которых расположено на Е гликопротеине;

- выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов вируса Западного Нила, циркулирующих в Евразии. Так МКА группы I были способны нейтрализовать следующие штаммы ВЗН Vlg99-27889, VlgOO-27924, Нр-94 (Астраханская обл.), А-1640 (Азербайджан), А-72 (Россия), Tur-2914 (Туркмения) и EglOl. Нейтрализующая активность МКА групп II-IV по отношению к этим штаммам ВЗН была вариабельной. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА. Даже штаммы Vlg99-27889 и VlgOO-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали необычную вариабельность в реакции нейтрализации при использовании "полученной панели нейтрализующих гибридомных антител;

- мозаичная нейтрализующая активность МКА и взаимодействие в ИФА указывают, по-видимому, на два вида антигенной вариабельности характерной для штаммов ВЗН. Первый тип антигенной вариабельности связан с наличием эпитопов для взаимодействия МКА, но отсутствием нейтрализующего эффекта. Второй тип антигенной вариабельности связан со структурными изменениями эпитопов и потерей способности МКА, взаимодействовать с этими эпитопами;

В ходе детального изучения антигенной структуры белка Е ВЗН было продемонстрировано наличие двух дискретных районов белка Е, вовлеченных в процесс нейтрализации ВЗН и ингибирования (торможения) реакции гемагглютинации. Это район 321-466 ао, в который входит домен III (304-395 ао), белка Е, несущий эпитопы для МКА 9Е2, 7G9, 11G3 и 7Е6 из группы 1а (взаимодействие с пептидом 260-466 ао и не реагирование с пептидом 1-321 оа), нейтрализующих все исследуемые штаммы. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА (реагирование МКА с пептидами 1-86 и 53-126 ао) был локализован между аминокислотными остатками 1-126, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов Е белка. Внутри этой последовательности расположен пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в процессе проникновения вируса в клетку.

Совокупность представленных нами результатов по сравнительному изучению свойств гибридомных МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов, одноцепочечных бсРу 9Е2 и гуманизированных Рс-9Е2 антител, позволяют утверждать:

- полученные рекомбинантные антитела сохранили конформацию вариабельного домена исходных МКА 9Е2 и способны взаимодействовать с эпитопами поверхностного гликопротеина Е ВЗН, штаммов У1§99-27889 и У1§00-27924, циркулирующих на территории России;

- при взаимодействии с ВЗН рекомбинантные антитела (бсБу 9Е2 и Рс-9Е2) проявляют свойство гибридомных МКА 9Е2, способность нейтрализовать инфекционность вирионов ВЗН, исследуемых штаммов У1§99-27889 й Е^ДОГ. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Рс-9Е2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 вирионов штаммов У1§99-27889 и Eg 101 ВЗН сравнима с таковой гибридомных антител и лишь несколько ниже (в разведении 1/12800 для Рс-9Е2 вместо 1/1024000 для МКА 9Е2) против 1000 ТЦД50 штамма У^99-27889 ВЗН;

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Разумов, Иван Алексеевич, Кольцово

1. Агафонов А.П. Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург: Автореферат диссертации канд. биол. наук. Кольцово. 1996.-21с.

2. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Кузьмин В.А., Акименко 3.JL, Косарева Т.В., Кашенцева Е.А. // Иммуногенные свойства белков вируса Марбург. -Вопр. вирусол. 1992. - Т.31, N1. - С. 58-61.

3. Беклемишев А.Б. 1995. Протективная активность белков оболочки вируса осповакцины, выделенных с использованием неионных детергентов. //Вопр. Вирусол. 40(4), 154-158.

4. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген- антитело. // Иммунология (под ред. У.Пол). Мир, Москва (1989). Том 3, с.5-89.

5. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. под ред. - М., Медицина, 1982. - С. 46-87.

6. Борисевич В.Н., Михайлов В.В., Краснянский Б.П. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулинов против лихорадки Эбола. //Журнал «Вопросы вирусологии» N6 (1996). Том 41, с.270-273.

7. Ю.Букреев A.A., Скрипченко A.A., Гусев Ю.М. и др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург. //Журнал «Вопросы вирусологии» N 4 (1995). Т. 40,-с. 161-165.

8. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванова В.Т., Рубин С.Г., Семашко И.В., Каравано A.C. (1998) Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с помощью синтетических пептидов. //Биорганическая химия, Т.24, №2, С. 100-111.).

9. Гайдамович С.Я., Логинов Н.Б. Общая и частная вирусология. Под ред. 1982. Семейство Togaviridae., M., Т.2.-С.49-94.

10. Н.Гендон Ю.З. Прогресс в разработке вирусных полинуклеотидных (ДНК) вакцин. //Журнал «Вопросы вирусологии» N4 (2001). Том 44, сЛ48-1547

11. Дебабов Д.В. Гетерологичная секреция в системе Escherichia coli. //Журнал «Молекулярная биология» N 3 (1994). Том 28. С.496-505.

12. Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Стрельцова М.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введенииинактивированного вируса Марбург морским свинкам. //Журнал «Вопросы вирусологии» N2 (1991). Том 36, с.421-423.

13. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Нетесов С.В., Чепурнов A.A., Разумов И.А. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. //Журнал «Вопросы вирусологии» N5 (2001), с.25-31.

14. Казачинская Е.И., A.B. Перебоев, A.A. Чепурнов, Е.Ф, Беланов, И.А. Разумов. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург.//Вопр. Вирусологии 2000 г.,-т.45, N3.- С.40-44.

15. Локтев В.Б. Диссертация доктора биол. наук. Кольцово. ГНЦВБ «Вектор»(1993).

16. Леннет Э., Н.Шмидт. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. //Москва, "Медицина" 1974, с. 44, 95.

17. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd., Москва.-1998.-386с.

18. Маркин В.А., Михайлов В.В., Краснянский Б.П., и др. //Разработка принципов экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. -1997.-Т.42. N1. - С. 31-34.

19. Машко C.B. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. Москва, Наука (1990), с. 220-239.

20. Мертвецов Н.П., Беклемишев А.Б., Савич И.М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Москва. Наука, 1987.

21. Михайлов JI.M., A.M. Титенко. Получение и характеристика моноклональных антител к антигенам Brucella abortus 19 В А. // Журнал «Биотехнология» N1 (2001). С.38-43.

22. Муравлев А.И., Агафонов А.П., Решетников С.С., Лавриненко И.А., Чешенко И.О., Беклемишев А.Б. 1995. Протективная активность белков оболочки вируса осповакцины, выделенных с использованием неионных детергентов. //Вопр. Вирусол. 40(4), 154-158.

23. Никифоров В.В., Туровский Ю.И., Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. //Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. -1994. - № 3. -С. 104-106.

24. Зб.Покровский А.Г., Беланов Е.Ф. Волков Г.Н. и др. Ингибирование репродукции вируса Марбург глицирризиновой кислотой и ее производными. //Доклад РАН N5 (1995). Том 344, с.709-711.

25. Стрельцова М.А. Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург. Автореферат диссертации канд.биол.наук. Кольцово (1998).

26. Чепурнов A.A., Чернухин И.В;, Терновой В.А., Кудоярова Н.М., Махова Н.М. Азаев М.Ш. Смолина М.П. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. // Журнал «Вопросы вирусологии» N 6 (1995), с. 257260.

27. Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. // Журнал «Вопросы вирусологии N 6 (1994). Т.39, с.254-257.

28. Шевченко JI.A., O.K. Бичуль, Б.Н. Мишанькин. сАМР-связывающий белок возбудителя чумы: изучение свойств с помощью полученных к нему моноклональных антител. // Журнал «Биотехнология» N4 (1996), с.42-46.

29. Adams-SC,-Broom-АК, Sammels LM, Hartnett-AG,-Howard MJ, Coelen RJ, Mackenzie JS, Hall RA. Glycosylation and antigenic variation among Kunjin vims isolates. //Virology. 1995 - Jan 10; -vol.206(l):- p.49-56.

30. Babiuk, L. A., Wardley, R.C., and Rouse, В. T. // Defense mechanisms against bovine herpesvirus: Relationship of virus-host cell events to susceptibility to antibody-complement lysis. -// Infect. Immun. 1975. - Vol. 12 - P. 958-963.

31. Baize S, Leroy EM, Mavoungou E, Fisher-Hoch SP. Apoptosis in fatal Ebola infection. Does the virus toll the bell for immune system? // Apoptosis 2000 Feb;5(l):5-7.

32. Baker O.R., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. //Antiviral. Res. -2003.-- vol.53, -p.13-23.

33. Bakonyi T, Hubalek Z, Rudolf I, Nowotny N. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, central Europe. //Emerg Infect Dis. 2005 Feb;l l(2):225-31.

34. Bakonyi T, Ivanics E, Erdelyi K, Ursu K, Ferenczi E, Weissenbock H, Nowotny N. Lineage 1 and 2 strains of encephalitic West Nile virus, central Europe. //Emerg Infect Dis. -2006 Apr; - vol. 12(4): p.618-23.

35. Bazin H., Malache I.M., Nisol F., Delaunay T. 1990. Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies. In: H.Bazin (Ed.) CRC Press, Florida, 165-201 p.

36. Beasley, D.W.C., A.D.T. Barrett. Identification of Neutralizing Epitopes within Structural Domain III of the West Nile Virus Envelope Protein. // J. Virol. -2002.-vol.76: 13097-13100.

37. Becker S, Feldmann H, Will C, Slenczka W. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? // J Med Microbiol Immunol -(1992)-vol.l81:-p.43-55.

38. Becker Y. Retrovirus and filovirus «immunosuppressive motif» and the evolution of virus pathogenicity in HIV-1, HTV-2, and Ebola viruses. // Virus Genes (1995);- vol.1 l(2-3):p. 191-195.

39. Becker S, Huppertz S, Klenk HD, Feldmann H. The nucleoprotein of Marburg virus is posphorylated. // J Gen Virol 1994- vol.75:p.809-818.

40. Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // Naturwissenschaften (1999) 86, 8-17.

41. Besselaar, T.G., N.K. Blackburn. 1988. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies. // Arch. Virol. 99:75-88.

42. Betakova T, Wolffe EJ, Moss B. //Membrane topology of the vaccinia virus A17L envelope protein. //Virology. 1999 Sep 1;261 (2):347-56.

43. Blasco R, Sisler JR, Moss B. Dissociation of progeny vaccinia virus from the cell membrane is regulated by a viral envelope glycoprotein: effect of a point mutation in the lectin homology domain of the A34R gene. // J Virol. 1993 Jun;67(6):3319-25.

44. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. -1976. -vol.72, 248-254.

45. Brinton MA, Kurane I, Mathew A, Zeng L, Shi PY// Clin Diagn Virol. -1998 -Jul 15; vol. 10(2-3):-p. 129-39. Review.

46. Buchsbaum DJ, Forero-Torres A, Lobuglio AF. TRAIL-receptor antibodies as a potential cancer treatment. // Future Oncol. 2007 Aug;3(4):405-409.

47. Bukreyev AA, Volchkov VE, Blinov VM, Dryga SA, Netesov SV. The complete nucleotide sequence of the Popp (1967) strain of Marburg virus: a comparison with the Musoke (1980) strain. // Arch Virol (1995) 140:15891600.

48. Bukreyev A, Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. Homology between Mar burg and Ebola viruses. // FEBS Lett 1993-vol.322:-p.41-46.

49. Bukreyev A, Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The GP-protein of Marburg virus contains the region similar to the immunosuppressive domain of oncogenic retrovirus P15 E proteins. // FEBS Lett (1993) 323:183-187.

50. Bukreev AA, Belanov EF, Blinov VM, Netesov SV. Complete nucleotide sequences of Marburg virus genes 5 and 6 encoding VP30 and VP24 proteins. // Biochem Mol Biol Int (1995) 35:605-613.

51. Brüggemann M, Winter G, Waldmann H, Neuberger MS. The immunogenicity of chimeric antibodies. // J Exp Med. 1989 Dec l;170(6):2153-7.

52. Campbell GL, Marfin AA, Lanciotti RS, Gubler DJ. West Nile virus. // Lancet Infect Dis. 2002 Sep;2(9):519-29. Review.

53. Chan SY, Ma MC, Goldmith MA. Differential induction of cellular detachment by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. // J Gen Virol (2000) Sep;81:2155-2159.

54. Chan SY, Speck RF, Ma MC, Goldsmith MA. Distinct mechanisms of entry by envelope glycoprotein of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. // J Virology (2000) May;74(10):4933-4937

55. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM. Flavivirus genome organization, expression, and replication. // Annu Rev Microbiol. 1990;44:649-88. Review.

56. Chen N., Danila M.I., Feng Z., Buller R.M.,Wang C., Han X., Lefcovitz E.J., Upton C. The genomic sequence of ectromelia virus, the causative agent of mousepox. //Virology. 2003.- vol.317,- p. 168-186

57. Cheung SC, Dietzschold B, Koprowski H, Notkins AL, Rando RF. A recombinant human Fab expressed in Escherichia coli neutralizes rabies virus. //J Virol. 1992 Nov;66(l l):6714-20.

58. Clegg J., Barber G., et al. Expression of Lassa virus nucleocapsid gene- fragments in bacteria. // Med Microbiol Immunol (1986)475(2-3):93-95.---

59. Cianciolo GJ, Copeland TJ, Oroszlan S, Snyderman R. Inhibition of lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral envelope protein. // Science (1985) 230:453-455.

60. Colcher D, Bird R, Roselli M, Hardman KD, Johnson S, Pope S, Dodd SW, Pantoliano MW, Milenic DE, Schlom J. In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. //J Natl Cancer Inst. 1990 Jul 18;82(14):1191-7.

61. Colcher D, Pavlinkova G, Beresford G, Booth BJ, Choudhury A, Batra SK. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically-engineered antibodies. //Q JNucl Med. 1998 Dec; vol.42(4):p.225-231.

62. Czerny C.P., Johann S., Holzle L., Meyer H. 1994. Epitope detection in the envelope of intracellular naked orthopox viruses and identification of encoding genes. //Virology 200, 764-777.

63. Dauphin G, Zientara S, Zeller H, Murgue B. West Nile: worldwide current situation in animals and humans. //Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2004 Sep; 27(5):343-55. Erratum in: Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2005 May; 28(3):249-50.

64. Demkowicz WE, Maa JS, Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. //J Virol. 1992 Jan;66(l):386-98.

65. Demkowicz WE, Maa JS, Esteban M. //Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. J Virol. 1992 Jan;66(l):386-98.

66. Derrien M, Punjabi A, Khanna M, Grubisha O, Traktman P. Tyrosine phosphorylation of A17 during vaccinia virus infection: involvement of the HI phosphatase and the F10 kinase. //J Virol. -1999- Sep;-vol.73(9):7287-96.

67. Dessen A, Volchkov V, Dolnik 0,Klenk HD, Weissenhorn W. Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus. // J EMBO (2000) Aug 15;19(16):4228-4236.

68. Elliott LH, McCormick JB, Johnson KM. Inactivation of Lassa, Marburg, and Ebola viruses by gamma irradiation. // J Clin Microbiol (1982) 16:704-708.

69. Elliot LH, Killey MP, McCormick JB. Descriptive analyses of Ebola virus proteins. // J Virology (1985); 147:169-176.

70. Engelstad M, Smith GL. The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. Virology. 1993 Jun; 194(2): 627-3 7.

71. Essani K, Dales S. Biogenesis of vaccinia: evidence for more than 100 polypeptides in the virion. Virology. 1979 Jun;95(2):385-94.

72. Feldmann H, Volchkov VE, Volchkova VA, Klenk HD. The glycoproteins of Marburg and Ebola virus and their potential roles in pathogenesis. // Arch Virol Suppl (1999);15:159-169.

73. Feldmann H, Nichol ST, Klenk HD, Peters CJ, Sanchez A. Characterization of filoviruses based on differences in structure and antigenicity of the virion glycoprotein. // Virology (1994) Mar; 199:469-473.

74. Feldmann H, Will C, Schikore M, Slenczka W, Klenk HD. Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus. // Virology (1991) 182:353-356.

75. Feldmann H,' Klenk H-D, Sanchez A. Molecular biology and evolution of filoviruses. // Arch Virol (1993) 7 (suppl):81-100.

76. Feldmann H, Slenczka W, Klenk HD. Emerging and reemerging of filoviruses. // Arch Virol Supp (1996) 11:77-100.

77. Feldmann H, Muhlberger E, Randolf A, Randolf A, Will C, Kiley NP, Sanchez A, Klenk HD. Marburg virus, a filovirus: Messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle. // Virus Res (1992) 24:1-19.

78. Fisher L.E. Localization of antigenic sites in the primary sequence of the Sendai virus NP protein. // Intervirology (1990) Vol 31, p. 116-121.

79. Franke CA, Wilson EM, Hruby DE. //Use of a cell-free system to identify the vaccinia virus L1R gene product as the major late myristylated virion protein M25. J Virol. 1990 Dec;64(12):5988-96.

80. Franke CA, Reynolds PL, Hruby DE. Fatty acid acylation of vaccinia virus proteins. //J Virol. 1989 Oct;63 (10):4285-91.

81. Galmiche MC, Goenaga J, Wittek R, Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. Virology. 1999 Feb l;254(l):71-80.

82. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. 1999. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. Virology 254, 71-80.

83. Gaunt MW, Sail AA, de Lamballerie X, Falconar AK, Dzhivanian TI, Gould EA. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography. J Gen Virol. 2001 Aug;82(Pt 8): 1867-76.

84. Gefler ML, Margulies DH, Scharff MD. A simple method for potyethylene glucol promoted hybridization of mouse myeloma cells. // Somat Cell Genet (1977); 3:231-236.

85. Gefter, M.L., Margulies D.H., Scharft M. D. 1977. A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells. Somat. Cell. Genet. 3,231-236.

86. Gonzalez JP, Nakoune E, Slenczka W, Vidal P, Morvan JM. Ebola and Marburg virus antibody prevalence in selected populations of the Central African Republic. // J Microbes Infect (2000) Jan; 2(l):39-44.

87. Gordon J., Mohandas A., Wilton S., Dales S. 1991. A prominent antigenic surface polypeptide involved in the biogenesis and function of the vaccinia virus envelope. Virology 181, 671-686.

88. Hall RA, Burgess GW, Kay BH, Clancy P. Monoclonal antibodies to Kunjin and Kokobera viruses. Immunol Cell Biol. 1991 Feb;69 (Pt l):47-9.

89. Hartlieb B, Weissenhorn W. Filovirus assembly and budding. Virology. 2006 Jan 5;344(l):64-70. Review.

90. Harris DT, Cianciolo GJ, Snyderman R, Argov S, Koren HR. Ingibition of human natural killer cell activity by a synthetic peptide homologous to a conserved region in the retroviral protein, pl5E. // J Immunol (1987) 138:889894.

91. Heinz FX, Mandl CW, Holzmann H, Kunz C, Hams BA, Rey F, Harrison SC. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization. J Virol. 1991 C)ct;65(10):5579-83.

92. Hevey M, Negley D, Geisbert J, Jahrling P and Schmaljohn A. Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein. // Virology (1997) 239,206-216.

93. Hevey M, Negley D, Pushko P, Smith J and Schmaljohn A. Marburg virus vaccines based upon alphavirus replicons protect guinea pigs and nonhuman primates. // Virology (1998) 251,28-37.

94. Hevey M, Negley D, VanderZanden L at al. Marburg virus vaccines: comparing classical and new appoaches. // J Vaccine (2001), Nov 12;20(3-4):586-93.

95. Hevey Michael, Negley Diane, Geisberg Joan, Jahrling Peter and Schmaljohn Alan. //Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein expressed by baculovirus recombinant. Virology. - 1997.- Vol. 239.-P. 206-216.

96. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. 1999. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. J. Virol. 73, 8750-8761.

97. Hoenen T, Volchkov V, Kolesnikova L, Mittler E, Timmins J, Ottmann M, Reynard O, Becker S, Weissenhorn W.VP40 octamers are essential for Ebola virus replication.// J Virol. 2005 Feb;79(3): 1898-905.

98. Hooper J.W., Custer D.M., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L. 2000. DNA vaccination with vaccinia virus L1R and A33R genes protects mice against a lethal poxvirus challenge. Virology 266, 329-339.

99. HubalekZ. European experience with the West Nile virus ecology and epidemiology: could it be relevant for the New World? Viral Immunol. 2000; 13(4):415-26. Review.

100. Ichihashi Y., Oie M. 1988 Epitope mosaic on the surface proteins of orthopoxviruses. Virology 163, 133-144.

101. Ichihashi Y, Oie M. Epitope mosaic on the surface proteins of orthopoxviruses.//Virology. 1988 Mar;163(l):133-44.

102. Ichihashi Y, Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus.//Virology. 1996 Jun 15;220(2):491-4.

103. Ichihashi Y. Extracellular enveloped vaccinia virus escapes neutralization.//Virology. 1996 Mar 15;217(2):478-85.

104. Ichihashi Y, Matsumoto S, Dales S. //Biogenesis of poxviruses: role of A-type inclusions and host cell membranes in virus dissemination. Virology. 1971 Dec;46(3):507-32. No abstract available.

105. Ichihashi Y, Oie M. //Adsorption and penetration of the trypsinized vaccinia virion.//Virology. 1980 Feb;101(l):50-60. No abstract available.

106. Ichihashi Y, Tsuruhara T, Oie M. The effect of proteolytic enzymes on the infectivity of vaccinia virus. //Virology. 1982 Oct 30;122(2):279-89.

107. Ichihashi Y, Oie M, Tsuruhara T. //Location of DNA-binding proteins and disulfide-linked proteins in vaccinia virus structural elements. J Virol. 1984 Jun;50(3):929-38.

108. Ichihashi Y, Oie M, Tsuruhara T. Location of DNA-binding proteins and disulfide-linked proteins in vaccinia virus structural elements. //J Virol. 1984 Jun;50(3):929-38.

109. Ichihashi Y, Takahashi T, Oie M. Identification of a vaccinia virus penetration protein.//Virology. 1994 Aug l;202(2):834-43.

110. Ignat"ev GM, Agafonov AP, Strelsova MA, Kashentseva EA. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys. // J Biotechnology (1996),44:111-118.

111. Ito H, Watanabe S, Takada A, Kawaoka Y. Ebola virus glycoprotein: proteolytic processing, acylation, cell tropism, and detection of neutralizing antibodiesr// TVirol (2001) Feb;75(3)T1576=1580:

112. Jasenosky LD, Neumann G, Lukashevich I, Kawaoka Y. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer. // J.Virol (2001) Jun;75(l 1):5205-5214.

113. Sanchez A, Kiley MP. Identification and analysis of Ebola virus messenger RNA.//Virology (1987) 157:414-420.

114. Jensen ON, Houthaeve T, Shevchenko A, Cudmore S, Ashford T, Mann M, Griffiths G, Krijnse Locker J. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. //J Virol. 1996 Nov;70(l l):7485-97.

115. Johnson KM, Lange JV, Webb PA, Murphy FA Isolation and partial characterisation of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. // Lancet (1977) -vol. I - P. 569-571.

116. Johnson ED, Johnson BK, Silverstein D. et al. Characterization of new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya. // Arch Virol Suppl (1996) 11:101-114.

117. Joklik W.K. The purification of four strains of poxvirus.//Virology — 1962-vol 18, p9-18.

118. Katz E, Moss B. //Vaccinia virus structural polypeptide derived from ahigh-molecular-weight precursor: formation -and -integration- into virusparticles. J Virol. 1970 Dec;6(6):717-26.

119. Kiley MP, Regnery RL, Johnson KM. Ebola virus: identification of virion structural proteins. // J Gen Virol (1980) 49:333-341.

120. Kiley MP, Cox NJ, Elliot LH, Sanchez A, Defries R, Buchmeier MJ, Richman DD, McCormick JB. Physicochemical properties of Marburg virus: evidence for three virus strains and their relationship to Ebola virus. // J Gen Virol (1988) 69:1557-1567.

121. Kimura-Kuroda, J., K. Yasui. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. //J. Gen. Virol. 1986.- 67(Pt 12):2663-2672.

122. Koch J, Liang M, Queitsch I, Kraus AA, Bautz EK. Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein. //Virology. 2003 Mar 30;308(l):64-73.

123. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature (1975), 256, 495.

124. Ksiazek T.G., Murphy F.A. Immunization against virus disease. In Fields Virology, 3-d Edition. Ed-s: B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley, et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, P. 467-498.

125. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N, Cropp CB.

126. Phylogeny of the genus Flavivirus.// J Virol. 1998 Jan;72(l):73-83.

127. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature (London). 227, 680-685.

128. LeGuenno B, Formentry P, Wyers M, Gounon P, Walker F, Boesch C. Isolation and partial characterisation of new strain of Ebola virus. // Lancet (1995) 345:1271-1273.

129. Lewis AD, Chen R, Montefiori DC, Johnson PR, Clark KR. Generation of neutralizing activity against human immunodeficiency virus type 1 in serum by antibody gene transfer. J Virol. 2002 Sep;76(17):8769-75.

130. Lin T-H, Chia C-M., Hsiao J-C., Chang W., Ku C-C., Hung S-C., Tzou D-L. M. 2002. Structural Analysis of the Extracellular Domain of Vaccinia Virus Envelope Protein, A27L, by NMR and CD Spectroscopy. J. Biol. Chem. 277, 20949-20959.

131. Lindenbach, B.D., C.M. Rice, 2001. Flaviviridae: The viruses and their replication: 589-641. In: Knippe DM, Howley PM. Editors. Fundamental Virology. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins.

132. Lin CL, Chung CS, Heine HG, Chang W. //Vaccinia virus envelope H3L protein binds to cell surface heparan sulfate and is important for intracellular mature virion morphogenesis and virus infection in vitro and in vivo. J Virol. 2000 Apr;74(7):3353-65.

133. Lucht A., C. Otterbein, P. Moller, H. Feldmann, S. Becker, and R. Grunow. Prodution of monoclonal antibodies to Ebola-Zaire virus. // Symposium on Marburg and Ebola viruses. Germany, Marburg (2000), October 1-4. P. 5.

134. Maa JS, Esteban M. //Structural and functional studies of a 39,000-Mr immunodominant protein of vaccinia virus. J Virol. 1987 Dec;61(12):3910-9.

135. Mandl CW, Guirakhoo F, Holzmann H, Heinz FX, Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tickborne encephalitis virus as a model. J Virol. 1989 Feb;63(2):564-71.

136. Martin KH, Grosenbach DW, Franke CA, Hruby DE. //Identification and analysis of three myristylated vaccinia virus late proteins. J Virol. 1997 Jul;71(7):5218-26.

137. Martin KH, Franke CA, Hruby DE. // Novel acylation of poxvirus Atype inclusion proteins. Virus Res. 1999 Apr;60(2): 147-57.

138. Maruyama T, Rodriguez LL, Jahrling PB, Sanchez A, Khan AS, Nihol ST, Peters CJ, Parren PW and Burton D. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. // Jurnal of Virology (1999) July, p.6024-6030.

139. Mathiot, C.C., A.J. Georges, V. Deubel. 1990. Comparative analysis of

140. West Nile-virus strains -isolated from human and animal-hosts—using"monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles. Res. Virol. 141:533-543.

141. McKelvey TA, Andrews SC, Miller SE, Ray CA, Pickup DJ // Identification of the orthopoxvirus p4c gene, which encodes a structural protein that directs intracellular mature virus particles into A-type inclusions. J Virol. 2002 Nov;76 (22):11216-25.

142. McKinney M.M., Parkinson A//A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. 1987 - J. Immunol. Meth. - vol.96 - P.271-278.

143. Medzon EL, Bauer H. Structural features of vaccinia virus revealed by negative staining, sectioning, and freeze-etching. Virology. 1970 Apr;40(4):860-7.

144. Meloen R.H., et al. Antigenicity and immunogenicity of synthetic peptides of foot-and-mouth disease virus. // J Gen'Virol (1987) Vol 115, p.305-314.

145. Mercer J, Traktman P. //Investigation of structural and functional motifs within the vaccinia virus A14 phosphoprotein, an essential component of the virion membrane. J Virol. 2003 Aug;77(16):8857-71.

146. Meyer H., Osterrieder N., Czerny C.P. 1994. Identification of binding sites for neutralizing monoclonal antibodies on the 14-kDa fusion protein of orthopox viruses. Virology 200, 778-783.

147. Milenic DE, Yokota T, Filpula DR, Finkelman MA, Dodd SW, Wood

148. JFf-'Whitlow M, - Snoy P, Schlom —J. Construction, binding- properties,metabolism, and tumor targeting of a single-chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. //Cancer Res. 1991 Dec 1 ;51(23 Pt 1):6363-71.

149. Mitchel SW, McCormick JB. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical labratory analyses.// J Clin.Microbiol.- 1984.- Vol.20, N3.-P.486-489.

150. Mitchell SW, McCormick JB. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses. // J Clin Microbiol (1984) 20:486-489.

151. Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Nov; 81(21):6851-5.

152. Morvan, J., T. Besselaar, D. Fontenille, P. Coulanges. 1990. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978. Res. Virol. 141:667-676.

153. Moss B. 2000. Poxviridae: The viruses and their repluication. In Fields Virology, 4-d Edition. Ed -s: B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley, et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 2849-2880p.

154. Moss B. 1991. Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development. Science. 252(5013), 1662-1667.

155. Muhlberger E, Weik M, Volchkov VE, Klenk HD, Becker S. Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola Virus by using artificial replication systems. // J Virol (1999) Mar;73(3):2333-2342.

156. Muehlberger E, Sanchez A, Randolf A, Will C, Kiley MP, Klenk HD, Feldmann H. The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: homologies with paramyxoviruses and rhabdoviruses. // Virology (1992) 187:534-547.

157. Murphy FA, van der Groen G, Whitfield SG, Lange JV. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy. In: Pattyn SR (ed) Ebola virus haemorrhagic fever. // Elsevier North-Holland (1978), Amsterdam. P.61-8.

158. Niedrig M, Klockmann U, Lang W, Roeder J, Burk S, Modrow S, Pauli G. Monoclonal antibodies directed against tick-borne encephalitis virus with neutralizing activity in vivo. Acta Virol. 1994 Jun;38(3): 141-9.

159. Niikura M., Ikegami T., Saijo M., Kurane I., Miranda M.E., Morikawa S. Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. // J Clinical Microbiol (2001)39:3267-3271.

160. Niles EG, Seto J. //Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein. J Virol. 1988 Oct; 62(10):3772-8.

161. Nybakken GE, Oliphant T, Johnson S, Burke S, Diamond MS, Fremont DH. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody. Nature. 2005 Sep 29;437(7059):764-9.

162. Payne LG. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by.„monoclonal antibodyprecipitation. Virology.-1992 Mar; 187(1 ):251-60

163. Payne LG. //Identification of the vaccinia hemagglutinin polypeptide from a cell system yielding large amounts of extracellular enveloped virus. J Virol. 1979 Jul;31(l):147-55.

164. Payne LG. //Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia. J Gen Virol. 1980 Sep;50(l):89-100.

165. Payne LG. //Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonal antibody precipitation. Virology. 1992 Mar; 187(1):251-60.

166. Pedersen K, Snijder EJ, Schleich S, Roos N, Griffiths G, Locker JK. Characterization of vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. //J Virol. 2000 Apr;74(8):3525-36.

167. Pedersen K, Snijder EJ, Schleich S, Roos N, Griffiths G, Locker JK. //Characterization of vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. J Virol. 2000 Apr; 74(8):3525-36.

168. Pereboev A, Borisevich V, Tsuladze G, Shakhmatov M, Hudman D, Kazachinskaia E, Razumov I, Svyatchenko V, Loktev V, Yamshchikov V. //Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. //Antiviral Res. - 2008,- Vol.7, N1 - P:6-13.

169. Peiris, J.S., J.S. Porterfield, J.T. Roehrig. 1982. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. J. Gen. Virol. 58(Pt 2): 283-289.

170. Peters CJ, Sanchez A, Rollin PE, Ksiazek TG, Murphy FA. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // Fields Virology (1996).Chapter 39, p.l 1611176.

171. Peters D, Mueller G, Slenczka W. Morphology, Development and classification of the Marburg virus. // (1971) In: Martini G, Siedelberg New York. P. 68-83.

172. Pringle Cr. The order Mononegavirales. // Arch Virol (1991) 117:137140.

173. Ramsey-Ewing A, Moss B. //Apoptosis induced by a postbinding step of vaccinia virus entry into Chinese hamster ovary cells. //Virology. 1998 Mar 1;242(1): 138-49.

174. Ramsey-Ewing A, Moss B. // Recombinant protein synthesis in Chinese hamster ovary cells using a vaccinia virus/bacteriophage T7 hybrid expression system. J Biol Chem. 1996 Jul 12;271(28): 16962-6.

175. Ravanello MP, Hruby DE. //Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly .//J Virol. 1994 0ct;68(10):6401-10.

176. Ravanello MP, Hruby DE. //Characterization of the vaccinia virus L1R- myristylproteinas a-component-of the intracellular virion- envelope.//-J- Gen

177. Virol. 1994 Jun;75 (Pt 6):1479-83.

178. Reichert JM. Trends in the development and approval of monoclonal antibodies for viral infections. //BioDrugs. 2007;- 21(1): pl-7.

179. Reichert JM, Dewitz MC. Anti-infective monoclonal antibodies: perils and promise of development. //Nat Rev Drug Discov. 2006 Mar;5(3): 191-5.

180. Reichert JM, Valge-Archer VE. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. //Nat Rev Drug Discov. 2007 May;6(5):349-56. Review.

181. Reichert JM. Trends in US approvals: new biopharmaceuticals and vaccines. //Trends Biotechnol. 2006 Jul;24(7):293-8.

182. Rey FA, Heinz FX, Mandl C, Kunz C, Harrison SC. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. //Nature. 1995 May 25;375(6529):291-8.

183. Regnery RL, Johnson KM, Kiley MP. Virion nucleic acid of Ebola virus. //J Virol (1980)36:465-469.

184. Rodriguez D, Risco C, Rodriguez JR, Carrascosa JL, Esteban M. Inducible expression of the vaccinia virus A17L gene provides a synchronized system to monitor sorting of viral proteins during morphogenesis.//J Virol. 1996 Nov;70(l l):7641-53.

185. Rodriguez J.F., Paez E., Esteban M. 1987. A 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus is involved in cell fusion and forms covalently linked trimers. //J. Virol. 61, 395-404.

186. Rodriguez J.F., Janeczko R., Esteban M. 1985. Isolation and characterization of neutralizing monoclonal antibodies to vaccinia virus. //J. Virol. 56:482-488.------------------------------------------------------------------------------

187. Rodriguez J.F., Esteban M. 1987. Mapping and nucleotide sequence of the vaccinia virus gene that encodes a 14-kilodalton fusion protein. //J. Virol. 61,3550-3554.

188. Rodriguez D, Risco C, Rodriguez JR, Carrascosa JL, Esteban M. //Inducible expression of the vaccinia virus A17L gene provides a synchronized system to monitor sorting of viral proteins during morphogenesis. //J Virol. 1996 Nov;70(ll):7641-53.

189. Rodriguez JR, Risco C, Carrascosa JL, Esteban M, Rodriguez D. //Vaccinia virus 15-kilodalton (A14L) protein is essential for assembly and attachment of viral crescents to virosomes.//J Virol. 1998 Feb;72(2): 1287-96.

190. Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M. //The vaccinia virus 14-kilodalton fusion protein forms a stable complex with the processed protein encoded by the vaccinia virus A17L gene. J Virol. 1993 Jun;67(6):3435-40.

191. Roger H Kennett and Thomas J. McKearn. Hybridomas: A new dimension in biological analyses. // Plinum Press (1981). New York and London.

192. Ross N., et al. A novel immunogold cryoelectron microscopic approach to invectigate the structure of the intracellular and extracellular forms of vaccinia virus. //EMBOJournal.-1996.- V.15. 2343-2355.

193. Saijo M, Niikura M, Morikawa S, Ksiazek T.G., Meyer R.F., Peters C.J., Kurane I. Enzyme-linked immunosorbent asseys for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins. II J Clin Microbiol (2001) Jan; 39 (1): 1-7.

194. Sanchez A, Trappier SG, Many BW, Peters CJ, Nichol ST. The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two readieng frames and are expressed through transcriptional editing. // Proc Natl Acad Sci USA (1996); 93:3602-3607.

195. Sanchez A, Killey MP, Holloway BP, Auperin DD. Sequence analysis of the Ebola virus genom: organization, genetic elemets, and comparison with the genom of Marburg virus. // Virus Res (1993) 29:215-240.

196. Sanchez A, Kiley MP, Klenk HD, Feldmann H. Sequence analysis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negative-strand RNA viruses. // J Gen Virol (1992) 73:347-357.

197. Sanchez A, Khan AS, Zaki SR, Nabel GJ, Ksiazek, and Peters CJ. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. // J Filds Virology (2001) Charter 40. P.1279-1304.

198. Sanchez MD, Pierson TC, McAllister D, Hanna SL, Puffer BA, Valentine LE, Murtadha MM, Hoxie JA, Doms RW. Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus. Virology. 2005 May 25;336(1):70-82.

199. Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-d Fd. - Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

200. Sardelis MR, Turell MJ, Dohm DJ, O'Guinn ML. Vector competence of selected North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus. //Emerg Infect Dis. 2001 Nov-Dec;7(6): 1018-22.

201. Sarov I, Joklik WK. Studies on the nature and location of the capsid polypeptides of vaccinia virions. Virology. 1972 Nov;50(2):579-92.

202. Sawyer LA. Antibodies for the prevention and treatment of viral diseases. Antiviral Res. 2000 Aug;47(2):57-77.

203. Scianimanico S, Schoehn G, Timmins J, Ruigrok RH, Klenk HD, Weissenhorn W. Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein. // J EMBO (2000) Dec 15; 19(24):6732-6741.

204. Shchelkunov S.N., 1995. Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes. Virus Genes 10:53-71.

205. Schmaljohn A. L., Johnson E. D., Dalrymple J. M., Cole G.A. //Non neutralizing monoclonal antibodies can prevent lethal alphavirus encephalitis. -//Nature. 1982. - Vol.297. - P. 70-72.

206. Scherret JH, Poidinger M, Mackenzie JS, Broom AK, Deubel V, Lipkin WI, Briese T, Gould EA, Hall RA. The relationships between West Nile and Kunjin viruses. //Emerg Infect Dis. 2001 Jul-Aug;7(4):697-705.

207. Smith GL, Law M. The exit of vaccinia virus from infected cells.//Virus Res. 2004 Dec; 106(2): 189-97. Review.

208. Smithburn, K.C., T.P. Hughes, A.W. Burke, J.H. Paul. 1940. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda. Am. J. Trop. Med. Hyg. 20:471-492.

209. Sullivan NJ, Sanchez A, Rollin PE, Yang ZY, Nabel GJ. Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. // J Nature (2000) Nov 30; vol.408(6812):605-609.

210. Takahashi T, Oie M, Ichihashi Y. //N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins.//Virology. 1994 Aug l;202(2):844-52.

211. Takada A, Robison C, Goto H. et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. // Proc Natl Acad Sei USA (1997) Dec.23; 94(26): 14764-14769.

212. Takada Ayato, Shinji Watanabe, Hirohi Ito, and Yoshihiro Kawaoka. Infectivity-enhancing antibodies to Ebola virus glycoprotein. // Simposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany (2000), abstract. P.53.

213. Takada A, Watanabe S, Ito H, Okazaki K, Kida H, Kawaoka Y. Downregulation of beta 1 integrins by Ebola virus glycoprotein: implication for virus entry. // Virology (2000) Dec 5;278(l):20-26.

214. Takada Ayato, Shinji Watanabe, Hirohi Ito, and Yoshihiro Kawaoka.

215. Ebola virus glycoproteins.-//-Simposium on Marburg and Ebola viruses.

216. Marburg, Germany (2000), abstract. P. 14.

217. Takada A, Watanabe S, Okazaki K, Kida H, Kawaoka Y. Infectivity-Enhancing Antibodies to Ebola virus glycoprotein. // Journal of Virology N5 (2001) March.75:2324-2330.

218. Tilson MD, Ozsvath KJ, Hirose H, Xia S, and Lanita R. A novel hypothesis to explain the hemorrhagic and connective tissue manifestations of Ebola virus infection. // J Clinical immunology and immunopathology (1996) Dec;81(3):303-306.

219. Timmins J, Scianimanico S, Schoehn G, Weissenborn W. Vesicular release of Ebola Virus matrix protein VP40. // Virology (2001) Apr 25;283(1) -p.1-6.

220. Tsekhanovskya MA, Matveev LE, Rubin SG, et all. Epitope analyses of TBE complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res (1993), Vol.30, p. 1-16.

221. Towbin H, Staekelin T, Gordon J. Electrohporetic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc Natl Acad Sci USA (1979); 76:4350-4354.

222. Ulaeto D, Grosenbach D, Hruby DE. The vaccinia virus 4c and A-type inclusion proteins are specific markers for the intracellular mature virus particle. //J Virol. 1996 Jun; 70(6):3372-7.

223. Van der Groen G, Elliot L, Lack of cross reactivity of rhabdovirus antibodies with Marburg and Ebola antigens in the inderect immunofluorescent antibody test. // Ibid (1982) Vol 62, p.67-68.

224. VanderZanden L, Custer D, Bray M, Huggins J, Schmaljohn C. Developments in nucleic acid vaccines for filoviruses.// In: American Society for Virology 16th Annual Meeting (1997). Bozeman, Montana, July. P. 19-23.

225. Va'zques M-A., Esteban M. Identification of Functional Domains in the 14-Kilodalton Envelope Protein (A27L) of Vaccinia Virus. //J. Virol. 1999. -Vol.73, -p.9098-9109.

226. Vigerust DJ, Shepherd VL.Virus glycosylation: role in virulence and immune interactions/Trends Microbiol. 2007 May;15(5):211-8. Epub 2007 Mar 29. Review

227. Volchkov VE, Chepurnov AA, Volchkova VA, Ternovoj VA, Klenk HD. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus.W Virology. 2000 Nov 10;277(l):147-55.

228. Volchkov VE, Volchkova VA, Chepurnov AA, Blinov VM, Dolnik O, Netesov SV, Feldmann H. Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus. // J.Gen.Virol (1999) Feb;80 (Pt2):355-362.

229. Volchkov VE, Volchkova VA, Muhlberger E, Kolesnikova L, and Klenk H-D. Expression strategy of the Ebola virus GP gene: implication of the transcriptional RNA editing. // Marburg 2000. Symposium on Marburg and Ebola viruses, abstract. P. 4.

230. Volchkov- VE, Becker S, Volchkova VA, Ternovoj VA, Kotov AN, Netesov SV, Klenk HD. GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases. // Virology (1995) 214:421-430.

231. Volchkov VE, Feldmann H, Volchkova VA, Klenk HD. Processing of the Ebola virus glycoprotein convertase furin. // Proc Natl Acad Sei USA (1998).95:5762-5767.

232. Volchkov VE, Volchkova VA, Slenczka W, Klenk Hd, Feldmann H. Release of viral glycoproteins during Ebola virus-infectionr// Virology (1998) — May 25;245(1):110-119.

233. Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. // FEBS Lett (1992) 305:181-184.

234. Volchkov VE, Volchkova VA, Muhlberger E, Kolesnikova LV, Weik M, Dolnik O, Klenk HD. Recovery of infectionus Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. // J Science (2001) Mar 9;291 (5510):1965-1969.

235. Wallengren K., Risco C., Krijnse-Locker J., Esteban M., Rodriguez D. 2001. The A17L gene product of vaccinia virus is exposed on the surface of IMV. //Virology 290, 143-152.

236. Wallengren K, Risco C, Krijnse-Locker J, Esteban M, Rodriguez D. //The A17L gene product of vaccinia virus is exposed on the surface of IMV. Virology. 2001 Nov 10;290(1): 143-52.

237. Weber E.L., Buchmaier M.J. Fine mapping of a peptide sequence containing an antigenic site conserved among arenavirus. // Virology (1988) Vol 164, p.30-38.

238. Weissenhorn W, Carfi A, Lee KH, Skehel JJ, Wiley DC. Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain. // Mol Cell (1998) Nov; 2(5):605-616.

239. Weissenhorn W, Dessen A, Calder LJ, Harrison SC, Skehel JJ, Wiley

240. DC. Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses. Mol Membr

241. Biol. 1999 Jan-Mar; 16(1 ):3-9. Review.

242. Wengler Gerd and Gisela Wengler. Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release. //J. of Virology, -1989, Vol. 63, N 6, - p.2521-2526.

243. Will C, Muhlberger E, Linder D, Slenczka W, Klenk HD, Feldmann H. Marburg virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein. // J Virol (1993) 67:1203-1210.

244. Wilson JA, Hart MK. Protection from Ebola virus mediated by cytotoxic T lymphocytes specific for the viral nucleoprotein. // J Virol (2001) Mar; 75(6):2660-2664.

245. Wilson JA, Hevey M, Bakken R, Guest S, Bray M, Schmaljohn A.L, Hart MK. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. //J Science (2000) Mar 3;287 (5458):1664-1666.

246. Wilson JA, Bray M, Bakken R, Hart MK. Vaccine potential of Ebola virus VP24, VP30, VP35, and VP40 proteins. // J Virology (2001) Aug 1;286 (2):384-390.

247. Wolffe EJ, Weisberg AS, Moss B. //The vaccinia virus A33R protein provides a chaperone function for viral membrane localization and tyrosine phosphorylation of the A36R protein. J Virol. 2001 Jan;75(l):303-10.

248. Xu L, Sanchez A, Yang Z, Zaki SR, Nabel EG, Nichol ST, Nabel GJ. Immunization for Ebola virus infection. // Nat Med (1998) 4:37-42.

249. Yang Z, Delgado R, Xu L, Todd RF, Nabel EG, Sanchez A, Nabel GJ. Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins. // Science (1998) 279:1034-1037.

250. Zinoviev VV, Tchikaev NA, Chertov OYu, Malygin EG. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35. //Gene. -1994 Sep 30; Vol. 147(2) : p.209-14.

Информация о работе

Разумов, Иван Алексеевич
доктора биологических наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы