Каталитические антитела - протеазы

Пономаренко, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Каталитические антитела - протеазы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Каталитические антитела - протеазы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

На правах рукописи

□□3452445

Пономаренко Наталья Александровна

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА - ПРОТЕАЗЫ Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 - 2:3

Москва - 2008

003452445

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев Сергей Михаилович Доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного

университета им М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 3 декабря 2008 года, в на заседании Диссертационного совета Д.002 019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 2<?<?£7лН,Я 2008 года

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

—В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последние два десятилетия представление о биокатализе существенно расширилось в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам. Каталитические антитела (абзимы) представляют интерес как с точки зрения механизма их возникновения и роли в функционировании иммунной системы организма, так и как потенциальные терапевтические агенты. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов.

Существует несколько различных подходов для поиска каталитических антител. Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств т vivo.

«Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе». Для получения абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, механизм-зависимые ингибиторы се-риновых гидролаз на основе фосфонатов могут быть использованы в двух направлениях: «реакционная иммунизация» и «реакционная селекция». Использование метода фагового дисплея, в свою очередь, открывает широчайшие возможности по дизайну новых биокатализаторов и улучшению их каталитических свойств.

Другим возможным способом создания протеолитических антител является получение антиидиотипических антител к протеазам, т.е. антител, направленных к области связывания антигена у антител, узнающих, в свою очередь, участок активного центра протеаз. Эффективность этого метода была ранее продемонстрирована на примерах получения каталитически активных анти-

идиотипических антител к ацетилхолинэстеразе и Р-лактамазе.

Необходимо отметить, что к настоящему моменту накоплено достаточно данных о спонтанном образовании каталитических антител в организме человека и животных при аутоиммунных патологиях. Одним из таких заболеваний является рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных волокон. Традиционно ведущая роль в патогенезе рассеянного склероза отводилась аутореактивным С04+ ТЫ клеткам, специфичным к компонентам миелиновой оболочки, в первую очередь - основному белку миелина (ОБМ). Однако в последнее время значительное внимание было уделено роли гуморального ответа в патогенезе РС, и сейчас непосредственное участие аутоантител к ОБМ и миелин олигодендроцит гликопротеину (МОГ) в демиелинизации не вызывает сомнений и подтверждено экспериментально. Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундаментальный и практический научный интерес представляет изучение роли каталитических аутоантител к ОБМ в развитии РС. Структурно-функциональные исследования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии.

Очевидной областью потенциального медицинского применения абзимов является избирательное расщепление биополимеров и, в частности, белков. Высокая вероятность спонтанного образования абзимов в ходе развития аутоиммунного процесса, а также возможность индукции каталитического ответа на различные антигены у модельных животных с аутоиммунными патологиями дают основания для определенного оптимизма в области дизайна новых биокатализаторов - протеаз на основе антител.

Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».

Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы было получение протеолитических антител определенной специфичности и их струк-

турно-функциональный анализ. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Поиск протеолитических антител при различных аутоиммунных патологиях человека и модельных животных и характеристика их ферментативных свойств.

2. Индукция протеолитических антител, расщепляющих поверхностный антиген вируса ВИЧ-1 Ир 120, с использованием двух различных подходов- «реакционной» иммунизации и иммунизации на фоне аутоиммунного процесса.

3. Получение антиидиотипических антител с протеолитической активностью к участку активного центра эндопротеиназы - субтилизина Карлсберг.

4. Селекция из полусинтетической фаг-дисплейной библиотеки абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, с использованием механизм-зависимых ингибиторов сериновых гидролаз на основе фосфонатов. Научная новизиа » практическая значимость работы. Впервые получены данные о наличии природных антител с различной каталитической активностью у мышей линий МЯЫргЛрг, БЛЛ и 'NZBFNZW Рь характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

В ходе исследований впервые продемонстрирована антиген-специфическая каталитическая активность аутоантител к ОБМ у больных РС и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены 6 преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, изолированных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейро-дегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных. Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-ЮЗ. Обнаруженная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволяет вплотную подойти к разработке новых дифференциальных методов диагностики и эффективного лечения данной патологии.

Исследования антиидиотипического антитела 6В8Е12 к субтилизину Карлсберг показали, что данное антитело способно расщеплять эфирную, а также пептидную связь, как в составе п-нитроанилидных производных пептидов, так и белков. Эксперименты по определению специфичности протеолити-

ческого антитела показали общее сходство со специфичностью исходного фермента. Экспрессия рекомбинантного антиидиотипического антитела в виде од-ноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности яви' лась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.

Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз. Кроме того, было продемонстрировано, что иммунизация мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-1 gpl20 и фрагмента ОБМ, приводит к появлению протеолитических антител, избирательно расщепляющих антиген. Было показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gpl20, и установлен преимущественный сайт гидролиза gpl20 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка.

При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепо-чечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь.

Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию путей получения искусственных биокатализаторов Разработанные подходы могут быть использованы для индукции протеолитических антител, расщепляющих различные белковые субстраты. Оригинальные методы анализа ферментативной активности протеолитических антител могут быть использованы для изучения различных био-катализатиров.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 24 статьи и патент. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: Third Al-Ain International Immunology Meeting: Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, (2008, Al-Ain,

United Arab Emirates); XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2008 г., Москва); Biology of B-Cells in Health and Disease, (2007, Banff, Alberta); Международная конференция «Biocatalysis 2007: Fundamentals & Applications», (2007, Moscow - St. Petersburg, Russian Federation); VI симпозиум «Химия про-теолитических ферментов» (Москва, 2007); 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto, Japan); научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова», (2006, Москва); 1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, (2006, Evora, Portugal); Международная конференция «Biocatalysis 2005: Fundamentals & Applications» (2005, St. Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation); 6-ая международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Санкт-Петербург - Москва, 2003 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (369 наименований). Диссертация изложена на 279 страницах и содержит 33. рисунков и 19 таблиц. — ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ СЕЛЕКЦИИ» 1.1. Реакционная селекция антител из синтетической библиотеки генов иммуноглобулинов человека.

Механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек является эффективным инструментом для получения новых биокатализаторов. Использование необратимых ингибиторов позволяет проводить селекцию по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы. На сегодняшний день примеры химической селекции в применении к фаговому дисплею антител были в основном сфокусированы на нековалентном связывании с аналогами переходного состояния реакции или на ковалентной реакционной способности суицидальных субстратов.

В работе была использована полусинтетическая библиотека сегментов вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin. 1 (MRC, Center for proteing engineering, UK). Библиотека была построена на основе зародышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а также

26 и 21 сегмента вариабельных регионов к и X легких цепей, соответственно. Третий гипервариабельный участок как тяжелых, так и легких цепей был ран-домизирован методом ПЦР (Griffiths, Williams et al. 1994). Гены вырожденных одноцепочечных антител (ScFv) были проклонированы в^ фагемидный вектор pHEN2. Представительность библиотеки составила 1,2x10 . Схематически библиотека Griffin. 1 представлена на рисунке 1.

Для проведения химической селекции и скрининга были использованы п-

^ Н roí ВИЯ

Ш)

N V ГГП вхзя нш пи

\ А (ИИ вив

Ш1

i.il: Я_

■ ЬЛ vjniH

RBS pel В |mker myc leader lail

and trypsin cleavage site

pIIl-N2

^—(nolFl on)-1 Allin I-(МП nn>

Рис. 1. A - создание синтетического репертуара тяжелых и легких цепей (Griffiths, Williams et al. 1994). Б - карта библиотеки, построенной на основе вектора pHEN2 и синтетического репертуара сегментов генов иммуноглобулинов человека.

нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (X) и его биоти-нилированный аналог (Bt-X) (рис. 2).

Рис. 2. Структура п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфо-ната (А) и его биотинилированного аналога (Б).

Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз (Tramontano, Ivanov et al. 2000), и ранее был использован для детекции протео-литической активности у природных антител при различных аутоиммунных на-

рушениях (Paul, Tramontano et al. 2001). В отличие от фторпроизводных фосфо-натов, данное соединение устойчиво в водных растворах и не проявляет неспецифической активности по отношению к инертным белкам.

Для селекции активных фаговых антител, способных ковалентно взаимодействовать с Bt-X, была использована стандартная схема, с некоторыми модификациями. Реакцию фаговых частиц с биотинилированным фосфонатом проводили в растворе. Для достижения специфичности реакции варьировали

о о

концентрацию Bt-X (от 40 до 1 мкМ) и температуру реакции (22 С и 37 С). Избыток Bt-X удаляли двукратным переосаждением фаговых частиц раствором ПЭГ/NaCl. Для предотвращения неспецифической сорбции использовали кислый Трис-глициновый буфер (рН 2,7). Элюцию фаговых частиц проводили раствором трипсина.

По описанной выше схеме были проведены три раунда селекции. После третьего раунда селекции поликлональные одноцепочечные антитела (ScFv) были проэкспрессированы в клетках НВ2151. Растворимые ScFv были выделены из периплазматической фракции методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Ni-NTA. Полученные ре-комбинантные антитела были использованы для реакции с Bt-X. Продукты реакции разделяли в по-лиакриламидном геле (ПААГ) и детектировали методом иммуноб-лоттинга с использованием стреп-тавидина, коньюгированного с пе-роксидазой хрена. Наличие реком-бинантных ScFv, контролировали гибридизацией с моноклональны-ми антителами к шестигистидино-вому эпитопу (рис. 3).

Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что селекция прошла успешно, и поликлональные антитела, полученные

gptnamil-HRP alTI-StHt-HRP

1 2 3 4 5 6 РИММ 2 3 4 5 \

Рис. 3. Иммунодетекция поликлональных ScFv после реакции с Bt-X, методом иммуноблоттинга. На ПААГ наносили белки, выделенные из: десяти пулированных клонов, отобранных после третьего раунда селекции (1); общего пула клонов, отобранных после третьего (2) и второго (3) раундов селекции; неселектированной библиотеки Griffin. 1 (5). 4 - контрольное рекомбинантное антитело к тиреоглобулину; 6 - 0,1 мкг трипсина. Детекцию осуществляли с использованием стрептавидина или моноклональных антител к 6xHis эпитопу, конъюгированных с пероксидазой хрена.

после третьего раунда, способны ковалентно взаимодействовать с Bt-X фосфо-натом Девяносто шесть клонов после третьего раунда селекции были выбраны для дальнейшего изучения. Клоны, показавшие в ПЦР анализе наличие полноразмерного фрагмента одноцепочечных антител, были использованы для экспрессии. Периплазматическая фракция была выделена для каждого индивидуального клона и использована в реакции с Bt-X фосфонатом. Реакционные смеси были проанализированы методом

иммуноблоттинга, как описано выше. Одиннадцать эффективно экс-прессирующихся ScFv были отобраны на основании специфического мече-ния полосы в области 28 кДа (обозначены «А»), Семь рекомбинантных антител, не способных к ковалентной модификации (обозначены «S»), но показавших хороший уровень экспрессии, были выделены и, после рек-ции с биотинилированным фосфонатом, использованы для иммунофер-ментного анализа методом ELISA. Связывание с антигеном оценивали по сравнению с антителом из неселекти-рованной библиотеки, антителом, связывающим тиреоглобулин, и двумя антителами, способными взаимодей-

Рис. 4. Иммуноферментный анализ БсРу, после реакции с ЕК-Х. Адсорбцию ЭсРу проводили в лунках с иммобилизованными анти с-тус антителами. Комплекс БсРу-В^Х детектировали при помощи стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Б.1, Б.З, Б.7, Б.9, Б.П, Б.14, Б.17 - рекомбинантные антитела, отобранные после третьего раунда, неспособные ковалентно взаимодействовать с ВМС. N - БсВ/ из неселекти-рованной библиотеки, апй-ТугВ/ - одно-цепочечное антитело к тиреоглобулину, Е^-Х - биотинилированный фосфонат, инкубированный с реакционным буфером. А.5 и А.17 - 5сРу, отобранные после третьего раунда и взаимодейсгвую-ствовать с В1-Х ковалентно (рис. 4). щие с Фосфонатом ковалентно.

В результате трех раундов селекции из библиотеки были отобраны хорошо экспрессирующиеся растворимые одноцепочечные антитела, способные взаимодействовать с В1-Х фосфонатом либо ковалентно, либо нековалентно. 1.2. Структурно-функциональный анализ рекомбинантных одно-цепочечных антител.

Нуклеотидная последовательность была определена для всех отобранных

Беру. На основании сравнения их первичных последовательностей были выделены 8 (из 11) уникальных «реакционных» клонов (способных взаимодействовать с В 1-Х ковалентно) и 6 (из 7) связывающих клонов. Зародышевые линии и семейства тяжелых и легких цепей всех отобранных антител приведены в таблице 1.

Интересно отметить, что легкие цепи всех отобранных 8сРу, как связывающих, так и реакционных, за исключением 8.9, принадлежат к УА.1 семейству, причем БРЬ-З сегмент является наиболее распространенным. Среди связы-

Таблица 1. СОЮ последовательности, сегменты и семейства зародышевых линий отобранных клонов.

Клон Легкая цепь Тяжелая цепь К'ОТ-ЕО КОПИЙ

Семейство Сегмент СБЯЗ * Семейство Сегмент СОЮ

Связывающие клоны

5 1 Ул 1 ОРЬ-З АА'ЛТО51-У УН1 БР-14 МЬМУУО«. 1

Б 3 Ул1 ОРЬЗ АА\\'П051_СА УНЗ ОР-15» Е^йАРОЧ 1

5 7 Ул 1 ОРЬ-З длитюзизс УН1 БР-7 ЮН1.&А СЮ 1

Б9 УлЗ ОРИб УН4 ОР-67 ютштт

в 11 Ул 1 ОР1-: ААТОО^АР УНЗ УН4 ОР-47 ОР-67 вТЕйЕдЗ 1

в 14 Ул 1 ОРЬЗ АА\\Т>041.1-5Р УН1 БР-Ю м\т>мдк<> 1

Реакционные клоны

А1 Ул 1 ОРЬЗ АА\\Т>05ЮАР УН4 ОР-бб ГОАРХША 1

А 46 \л1 ОРЬЗ АА\УОО$1.Г5Р УН4 ОР-66 тсск5дур 1

А5 Ул 1 ААиТЮБЮТ УН4 ОР-65 гсгтохтн 1

А 43 Ул 1 ОР1^3 АА'ЛТО^ЬА!. УН4 ОР-65 ГСМОХТ 1

А 7 Ул 1 БРЬЗ АА\\ТЮ&1.СаР УН4 ОР-71 гбоооур

А 49 Ул 1 ОРЬ-З АА\\ТО51-ОТ УН4 БР-71 НЕа?1£<А<} 1

А 21 \л1 ОР1.-3 АА\\ТЮ5И«Р УН1 БР-3 ояы. 1

А 17 У). 1 ОРЬ-5 ОТЛ\Т>«1ЛР УН4 ОР-67 ьтдххнхоАК 2

* АА\Л/0051-, СТАЛ/ОББЬ, ^[ФБЗб Указанные последовательности не варьировались в библиотеке 6п№п.1.

вающих клонов встречаются УН1, УН4 и УНЗ семейства тяжелых цепей, однако для реакционных клонов основным семейством является VI14 (только А.21 относится к УН1 семейству). Таким образом, для связывания с В^Х фосфона-

том необходимо наличие либо VA.1 DPL3, либо VH4 DP-67 сегментов антител, тогда как для ковалентного взаимодействия предпочтительной является комбинация DPL3 сегмента и VH4 семейства, исключения составляют только А.17 и А.21. Третий гипервариабельный регион тяжелых цепей реакционных клонов имеет некий консервативный консенсус, а последовательность FGGQQVP встречается в двух различных клонах, что может свидетельствовать о непосредственном участии данного фрагмента в «ковалентном катализе».

В таблице 2 приведены кинетические характеристики реакции взаимодействия с фосфонатом X для всех реакционных ScFv. Можно заметить, что для

большинства антител кинетические параметры варьируются в очень узком диапазоне. Однако антитело А.17^ оказалось практически на порядок более реакционно-способным (к2=0,32 мин ). Согласно ранее опубликованным данным значения констант скорости реакции для бутирилхолинэстеразы, хнмот-рипсина и трипсина с фосфонатом X составляли 1800; 2600 и 4100 М мин , соответственно (Tramontano, Ivanov et al. 2000). Т.е., наиболее активное антитело А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз.

Реакция А.17 с Bt-X фосфонатом ингибировалась прединкубацией с ингибиторами сериновых протеаз, такими как: аминоэтилбензенсульфонил фторид (AEBSF) и аналоги валина и фенилаланина, карбоксильная группа которых заменена на дифенил фосфонат. В то же время прединкубация с более активными фтор фосфонатами, такими как: зарин и кумаринил этил п-трифтор ацетамидо-фенилметил фосфонат, - не приводила к ингибированию реакции модификации А.17 Bt-X (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о специфичности активного центра, отобранного в результате селекции на Bt-X фосфонат.

Наличие ковалентного взаимодействия между фосфонатом и антителами было подтверждено при помощи прямого метода масс-спектрометрии SELDI. В

Таблица 2. Кинетические параметры реакции ScFv с фосфонатом X.

к2,1Л|Ш1 Клмг, мкМ к2/Кднс, M-Imiih-1

Л. 17 0.1210,005 151X21 2119

А.5 o.oi5±o.oo2 35±2.1 100П

А.21 0,012+0.005 71±18 451

A.4J 0,017±0,(НМ Sl±41 210

А.46 0,021 ±0,004 Х9±49,1 216

Л.49 0.012+0.004 56+14 214

Л.7 0.017 Ю.003 21.И86 174

результате реакции одиоцепочечиых антител с биотинилированным фосфонатом происходит увеличение массы антител, соответствующее ровно одному остатку Bt-X (646 Да). Для определения нуклеофильного остатка, участвующего в ковалентном катализе, антитело А.17 было промодифицировано Bt-X, подвергнуто исчерпывающему трипсинолизу, и триптический гидролизат был проанализирован методом масс-спектрометрии SELDI в сравнении с контролем (рис. 6). Было обнаружено, что модификации подвергается пептид 152 - 180 одноцепочечного антитела: VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK (таб. 3). Данный пептид соответствует первому гипервариабельному региону легкой цепи и фланкирующим его первому и второму каркасным участкам.

Модифицированный пептид был дополнительно очищен методом аффинной хроматографии с использованием стрептавидин-сефарозы и подвергнут тандемной масс-спектрометрии. МС/МС анализ показал, что ковалентной модификации подвергается ТугЗб легкой цепи, расположен-

Таблица 3.

SELDI MW От до заряд Последовательность пептидов MW** теор.

1873 181-196 -ч LLIYDNNKRPSGIPDR 1872.00

2124 240-259 -1 LTYLGAAAHHHHHHGAAEQK 2123.34

2374 45-65 т1 GLLWIGSIYHSGSTYYNPSLK 2373.63

3060 152-180 -1-1 VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK 3059.36

3443 152-180 202-239 VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK* SGTSATLGITGLQTGDEADYYC'GTWDSSLNPVFGGGTK* 6886,45

3827 202-239 •SGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNPVFGGGTK 3828.09

После модификации

3704 152-180 + 1 (\TISCSGSSSNIGNNWSWYQQLPGTAPK)-Bl-X 3706,17

3767 152-180 202-239 t2 (VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK)-Bt-X* SGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNPVTGGGTK» 7533,26

*Цистеины, выделенные жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь. ** приведены средние молекулярные массы.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Иммунодетекция реакций антитела А.17 с механизм-зависимыми ингибиторами сери-новых протеаз. А.17 (1 мкМ) инкубировали 1ч на 37°С с 5мМ АЕВБР (1), 5мМ валил фосфоната

(2), 5мМ фенилаланин фосфоната

(3), с 100 мкМ зарина (4), 100 мкМ кумаринил этил п-трифторацетамидофенилметил-фосфоната (5), 100 мкМ X (6) и в отсутствии ингибитора (7). Затем все образцы инкубировали 1ч при 37°С со 100 мкМ В1:-Х, разделяли в ПААГ. Детекцию осуществляли методом иммуноблоттинга с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксида-зой хрена.

3059 6+Н

3443 0+Н 3327 0+Н

3/ьо

;.[3827 8+Н

(2374 0+Н

МГ*ВЧ»|

2000

3000

4000

Рис. 6. БЕим масс-спектр триптического гидролизата одноцепочечного антитела А.17 (верхняя панель) и антитела А.17, модифицированного ЕЛ-Х фосфонатом (нижняя панель).

ный во втором каркасном регионе легкой цепи.

Аналогичным образом для других антител, было показано, что в «кова-лентном катализе» принимает участие Туг32, расположенный в первом гипервариабельном регионе легкой цепи. Интересно отметить, что тирозины 32 и 36 являются весьма консервативными аминокислотными остатками в белках им-муноглобулиновой природы.

Одним из преимуществ работы с рекомбинантными антителами является возможность быстрого осуществления сайт-направленного мутагенеза. Для подтверждения масс-спектрометрических данных тирозины 32 и 36 легкой цепи А.17 и А.5 были заменены на фенилаланин, что не должно было сказаться на структуре антител, но могло кардинальным образом повлиять на их каталитические свойства. Кроме того, тирозин 36 антитела А.17 был заменен на серин. Антитела А.17 и А.5 и их мутанты были проэкспрессированы и выделены методом металл-хелатной хроматографии. Полученные препараты были использованы в реакции с В 1-Х фосфонатом. В качестве отрицательного контроля использовалось одноцепочечное антитело к тиреоглобулину. Детекцию протекания реакции вели методом иммуноблоттинга (рис. 7). Замена тирозина 32 на фенилала-

нин приводит к полной потере активности по отношению к Bt-X в случае антитела А.5, однако это практически не влияет на активность антитела А.17. При этом, замена тирозина 36 на фенилаланин приводит к прямо противоположному результату: мутанты A.17Y36F и A.17Y32,36F оказываются неактивными в реакции с фосфонатом. Неактивным оказался также и мутант A.17Y36S, содержащий замену тирозина 36 на серин. Таким образом, результаты мутагенеза двух «реакционных» антител полностью подтвердили масс-спектрометрические исследования. Было также ¡/t

показано, что в случае ан- А $ $ $ & <&

-А. -X -V -Ч jp2 jP?

титела А. 17 важно не £ к й> £ £ к> ъ Ъ

ъ-' V* V V V V" 'ß' V-' V'

только наличие аминокис- х-гхтт т'тх

лотного остатка, содер-

тт „ стрепгзЕидин и ^^

жащего гидроксильную HRP

группу в положении 36 легкой цепи, но и распо-

знтн-ггн/с

ложение ЭТОЙ гидроксиль- ■ """ * ................. анштела Ч«"«,,—

ной группы в активном

Рис. 7. Иммунодетекция антител А. 17, А.5 и их мутан-

" ' тов после взаимодействия с Bt-X. Комплекс детектиро-

А.17, как наиболее Вали стрептавидином, конъюгированным с пероксида-

реакционно-способный, 3°й хрена (верхняя панель) и моноклональными анти-

_ ' телами к с-тус эпитопу (нижняя панель),

был проверен на амидаз-

ную активность на небольшой библиотеке метилкумарин амидных субстратов. После трехстадийной хроматографической очистки одноцепочечное антитело катализировало гидролиз двух гидрофобных субстратов: Phe-MCA и Вос-А1а-Ala-Phe-MCA. Амидазная активность отсутствовала в препарате мутированного антитела A.17Y36F, ингибировалась в результате прединкубации А.17 с фосфонатом X и исчезала в результате иммуноадсорбции антителами к с-тус эпитопу, иммобилизованными на агарозу. Гидролиз субстрата Phe-MCA, рекомби-нантным одноцепочечным антителом А.17 подчиняется кинетической схеме

-4 -1

Михаэлиса-Ментен (kcat = 2,1 ± 0,8 х 10 min , Km = 47 ±12 мкМ).

В данном исследовании химическая селекция была применена для поиска белковых молекул, проявляющих ковалентную реакционную способность - химическую особенность, являющуюся универсальной для катализа. Одноцепо-чечные антитела, полученные в этой работе, могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в ка-

честве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств (directed enzyme evolution).

2. АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО С ПРОТЕОЛИТИЧЕ-СКОЙ ФУНКЦИЕЙ.

Данная часть работы проводилась в кооперации с коллегами из лаборатории инженерии ферментов технологического университета Компьена (Франция). Идиотипическое моноклональное антитело 5-Н4, полученное при иммунизации мышей линии Balb/c субтилизином Карлсберг, обладало способностью связываться с активным центром фермента и специфически ингибировало его протеолитическую активность. Антиидиотипические антитела были получены при иммунизации мышей линии Balb/c антителом 5-Н4. На первом этапе исследований методом иммуноферментного анализа (ELISA) было отобрано несколько десятков моноклональных антител, узнающих вариабельный фрагмент идиотипа 5-Н4. На следующей стадии антитела, выделенные из соответствующих клонов, были протестированы на способность гидролизовать хромогенные субстраты субтилизина suc-AAPFpNa и suc-GGLpNa. Из всей панели проанализированных клонов антитело 6В8-Е12 наиболее эффективно катализировало гидролиз обоих субстратов и было выбрано для дальнейших исследований. 2.1. Исследование каталитической активности антиидиотипи-ческого антитела 6В8-Е12.

Для изучения протеолитической активности антитела были предварительно очищены методами аффинной хроматографии с использованием протеин G-сефарозы и аффинного сорбента - иммобилизованных на сефарозе антител козы к иммуноглобулинам мыши, а также ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

С\б страт С V б т н л Ii j п н К арчсберг 6BS-E12

min*1 Knr mM k„/Km inXr'nun*1 km mm'1 Km mM k. ,/Kni mM 'mm'

ЛЛРГрК.1 GGI pNn п-нпгрофенп I ацетат (1 1:0 1 5) 104 0 2 010 03 (5 3-U 6) 104 (4 32±0 63) 10" 0 26±0 05 (1 66±0 56) 10' 24=4 5 1 45±0 34 17±6 9 1 5-0 2 1410 3 1 11037 0 5±0 06 3 2±0 5 0 2±0 04 16 2±3 7 2 6±0 7 6 2—3,1

Таб. 4. Кинетические параметры для реакций амидолиза и эстеролиза субтилизи ном Карлсберг и антителом 6В8-Е12.

Полученные данные по гидролизу низкомолекулярных субстратов suc-AAPFpNa и suc-GGLpNa и эстеролизу и-нитрофенилацетата приведены в Таб. 4. Оказалось, что каталитическая эффективность (ккэт/Км) в реакции с suc-AAPFpNa и для субтилизина и для антитела выше, чем для реакции suc-GGLpNa, что предполагает сходную субстратную специфичность между ферментом и антителом. В случае и-нитрофенилацетата каталитическая эффективность абзима и фермента сравнима, что можно объяснить слабой эстеролитиче-ской активностью субтилизина.

Детекция протеолитической активности абзима проводилась при помощи метода, основанного на разгорании флуоресценции при протеолитическом расщеплении белка, избыточно меченного флуорофорной группой. Прохождение реакции детектировалось по разго-ранию флуоресценции во времени по сравнению с контролем. Субстратом реакции являлся бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотио-цианатом (БСА-ФИТЦ). В качестве модельной протеазы для определения кинетических параметров данного метода использовался трипсин. Протеолитическая активность наблюдалась как в случае полноразмерного антитела 6В8-Е12, так и в случае его Fab-фрагмента, в то время как увеличение флуоресценции в случае амидазного антитела 4Н7-НЗ, гидролизующего suc-AAPFpNa, сводилась к фоновым значениям (Рис. 8). Кроме того, было показано, что антитело 6В8-Е12, также как и субтилизин, способно специфически расщеплять РНКазу А.

Эндопротеиназная активность антитела 6В8-Е12 уменьшалась при добавлении в реакционную смесь апротинина и, практически, сводилась до фоновых значений при действии классического ингибитора сериновых протеаз - PMSF, что предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка (Рис. 9а). Кроме того, протеолитическое расщепление БСА-ФИТЦ абзимом ин-

35 1

30 | 6 |

1;:! г| [

0__сЬ1.Х. _ п__ 1,

О 24 25 43 £3 72 Время ч

Рис. 8. Гидролиз субстрата БСА-ФИТЦ полноразмерным антиидиотипическим антителом 6В8-Е12 (черный) и его РаЬ-фрагментом (серый). Антитело 4Н7-НЗ использовалось в качестве отрицательного контроля.

6И81Л- Трипсин

О 20 40 6С 30 о 0,5 1 1.5 2 2 5

Время, ч ¡<-НЛ].

Рис. 9. Ингибирование гидролиза БСА-ФИТЦ антителом 6В8-Е12. 0,16 мкМ БСА-ФИТЦ инкубировалась: а - с 0,5 мкМ абзима (♦), в присутствии 1 мкМ апротинина (■) или 10 мкМ РМБР (Ж), б - с 1 мкМ 6В8-Е12 в присутствии антитела 5-Н4 (концентрация 5-Н4 изменялась от 0 до 3 мкМ). Относительная активность рассчитывалась как отношение скорости гидролиза субстрата в присутствии 5-Н4 к скорости гидролиза БСА-ФИТЦ в отсутствии идиотипа.

гибировалось в присутствии идиотипического антитела 5-Н4 (Рис. 96). Полученные результаты свидетельствуют о том, что каталитическая активность связана с антителом, и активный центр находится в антигенсвязывающем центре.

Альтернативное подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих ферментативных примесей было получено методом зимографии. Анализ зимограммы (Рис. 10) показывает наличие протеолитической активности только у белков с М\у~150 кДа (дорожки 2,3), в то время как флюоресценция контрольных антител (дорожка 1) отсутствует.

Для исследования специфичности полученного антиидиотипическо-го каталитического антитела был проведен масс-спектрометрический анализ продуктов протеолиза некоторых природных биоактивных пептидов (Рис. 11). Приведенные данные сви-

-ТрНГССШ!

Рис. 10. Зимограмма препарата антитела 6В8-Е12. 100 нг (дорожка 2) и 200 нг (дорожка 3) белка разделялось в 10% ПААГ в присутствии флуоресцентного субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в гель при полимеризации. Трипсин в количестве 100 пг (дорожка 4) и 1 нг (дорожка 5). Mab к с-Мус эпитопу (200 нг) (дорожка 1).

Пептиды Абшм 6В8Е12

Лейцкн-энкафелнн I \

Н *

Акгнотеншя А^р-Агг-Уа1|Туг^к)Нц-Рго]РЬс]

* м *

Брадикиннн ^-Рго-РгоЮтЩ-^ег-Рго-РЬс-Агг

Кияегеызин

Рис. 11. Гидролиз биоактивных пептидов антителом 6В8-Е12. Гидролизуемая связь указана черной стрелкой для антитела, красной - для фермента; ароматические аминокислотные остатки (прямоугольник), алифатические аминокислотные остатки (круг). Продукты гидролиза детектировались масс-спектрометрически.

детельствуют о том, что большинство исследованных пептидных субстратов имеют сайты расщепления, содержащие ароматические и алифатические аминокислотные остатки до или после сайта, что в некоторой степени

соответствует субстратной специфичности «родительского антигена» - субти-лизина Карлсберг.

2.2. Структурный анализ вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12.

Для изучения структурных особенностей антител и экспрессии абзима в гетерологичной системе вариабельные домены легких и тяжелых цепей данных антител были клонированы и определена их нуклеотидная последовательность.

В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-Н4 и 6В8-Е12 использовались соответствующие гибридомы. Наработка кДНК и амплификация генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей (РуН и БуЬ) проводилась методом одностадийного ЯТ ПЦР. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (УГ) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров, соответствующих М-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих ^фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (УН) амплифицировали при помощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательностей тяжелых цепей антител мыши, и обратных праймеров для ^фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по

размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+), обработанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки Е. coli штамма DH5а. Для положительных клонов была определена нук-леотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов.

Сравнение аминокислотных последовательностей антитела 5-Н4 с опубликованными ранее (Protein Data Bank) показало высокую степень сходства с антителами - ингибиторами ферментов: с легкой цепью антитела Fl 1.2.32, полученного против протеазы ВИЧ 1, и легкой цепью антитела 2b-2F; которое ин-гибирует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками. Антитело Fl 1.2.32 имеет интересную структурную особенность: CDR1 легкой цепи образует «выпячивание», формируя подобие «пальца», который предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1.

Компьютерная трехмерная модель одноцепочечного антитела 5-Н4 (Рис. 12) была построена с использованием программного обеспечения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомологией: ldzb (анти-лизоцим scFv 1F9) и ljp5 (scFv фрагмент антитела 1696 против протеазы ВИЧ 1). Анализ ЗО-модели антитела 5-Н4 показал наличие плоской поверхности, образованной тяжелой цепью, что характерно для белок-связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, возможно, взаимодействует с активным центром субтилизина.

Для создания ЗО-модели одноцепочечного антитела 6В8-Е12 в качестве матрицы использовалась последовательность lqok (scFv против антикарцино-эмбрионального антигена). При анализе этой модели было также установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок- и пептид-связывающих ан-

BBSS Ь°* л^КНЯг*9»

^■гЕЯМП" Ii

mw'^ii--Ar* üsbft Ъ n г кОЧЯ'ЯМЯ '■ - шЩШЯ шшш

ЯЛ

Рис. 12. Трехмерная модель вариабельного фрагмента идиотипического антитела 5-Н4. Заметны, характерные выступающая часть легкой цепи (1) и плоский участок тяжелой цепи (2)

тител, и широкой «щели» между VH и VL CDR участками с высокой концентрацией гидрофобных аминокислотных остатков, что, возможно, и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6В8-Е12. (Рис. 13)

2.3. Экспрессия рекомби-нантного антитела 6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела.

Генетическую конструкцию для экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела создавали по следующей схеме (Рис. 14)

На основании полученных данных по определению нуклео-тидной последовательности антитела 6В8-Е12 были созданы праймеры соответствующие N-концевым последовательностям (11, 12) и J-фрагментам (13, 14) легких и тяжелых цепей. Для клонирования в соответствующий вектор данные праймеры содержали необходимые сайты для эндонуклеаз рестрикции. Гибкий серин-глициновый линкер ((Ser-Gly4)3) был создан на основе праймеров 15-17. Линкер соединяли с вариабельным доменом легкой цепи с использованием сайтов Peil и Ncol, соответственно. Полученный фрагмент (линкер-VL) был амплифицирован с использованием праймеров 15 и 13 и лигирован с VH последовательностью при помощи Xhol и Sali сайтов рестрикции.

Конечный фрагмент, содержащий полную последовательность одноцепочечного антитела, был амплифицирован с использованием праймеров 12 и 13, рестрицирован эндонуклеазами Ncol и Notl и клонирован по соответствующим сайтам в плазмидный вектор pET22N, созданный на основе вектора рЕТ22Ь(+) и содержащий Ncol рестриктный сайт в последовательности периплазматическо-го лидера. Дополнительный фрагмент, содержащий последовательности, кодирующие эпитоп с-тус и шестигистидиновый кластер, был клонирован в конечную конструкцию по сайтам Bglll и Notl (Рис. 14Б).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli

Рис. 13. Трехмерная модель вариабельного фрагмента антиидиотипического антитела 6В8-Е12. Стрелками указана щель между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

I» 12

С УН -^

рСЕМ5Л(+) )

ПЦР с использованием соответсвующих праймеров

мм ^ 20«

Рестрикция по сайту вал

» 11

15 . 16

С---N

ПЦР с использованием соответсвующих праймеров

Л^рование и ПЦР с

по сайту Ра1

праймеров 15 и 13

| Рестрикция по сайту А/со(

VI.

Лигиромни« и пцр с прайме ров 15 и 13 | Рестрикция по сайту ХМ

№Ы и « N04

(Р«|в ! ■

рЕТ22Ы 1

Рестрикция по сайтам Мсо! и Моя

Рестрикция по сайтам №о1 и N011

Лигирование*

в^у в рЕТ22Ы

И1 ^ОД

Г)

Вд1\\

ш I Рестрикция с-тус по сайтам ВдНI и Л/оИ«-

Рестрикция по сайтам ВдШ и Nоя

Пигирование

««в ^ННК^ VI 6хН]5 С-тус scFv-H¡s-o-myc в pET22N

Рис. 14. Схема создания генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6В8-Е12 в виде одноцепочечного антитела.

ВЬ21(ОЕЗ). Для веру были подобраны условия культивирования, приводящие к появлению максимально возможного количества целевого белка в растворимой форме. Одноцепочечное антитело выделяли в нативных условиях методом ме-талло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Со2+-ТАЬОЫ. Дополнительная очистка была проведена с помощью ионообменной хроматографии на колонке МопоС^ (АтегеЬат). Экспрессированный белок также был дополнительно охарактеризован с помощью масс-спектрометрии продуктов его трипсинолиза. Полученные результаты свидетельствуют о соответствии экспериментально полученного белка его теоретической пептидной карте. 2.4. Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела.

Полученное рекомбинантное антитело проявляло заметную амидазную

активность (Рис. 15) по отношению к метилкумари-ламидным (МСА) субстратам, содержащим алифатические (Met-MCA, Leu-МСА) и ароматические (Phe-MCA) аминокислотные остатки, что соответствует данным по субстратной специфичности исходного антиидиотипического антитела 6В8-Е12.

Кинетика данных реакций подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен, что позволило рассчитать их кинетические параметры (Таб. 5). При этом не удалось зарегистрировать сколько-нибудь значительную протеолитическую активность по отношению к БСА-ФИТЦ.

Таким образом, реком-бинантное одноцепочечное антитело, в общих чертах, сохранило функцию исходного моноклонального антитела, что свидетельствует в пользу

Таб. 5. Кинетические параметры для реакций «абзиматической» природы

амидолиза рекомбинантным scFv 6В8-Е12. ,

обнаруженной активности.

Отсутствие активности по отношению к высокомолекулярному субстрату может быть обусловлено структурными особенностями рекомбинантного антитела - наличием междоменного гибкого линкера, затрудняющего правильный фол-динг продукта. По всей видимости, полученный «минимальный катализатор», не способен осуществить в полной мере сложную протеолитическую функцию, присущую полноразмерному антителу.

3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ.

Спонтанная индукция каталитических антител при ряде аутоиммунных нарушений, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, склеродермия, аутоиммунный миокардит и др. является сегодня неопро-

Вреш ч

Рис. 15. Гидролиз МСА-пептидов (50 мкМ) рекомбинантным scFv6B8-E12 (0,75 мкМ). (♦) - Met-MCA, (Ж) - Leu-MCA, (■) - Phe-MCA, (•) - буфер PBS

L„ A'm 'hi

С> бстрат mM mM"' mm'1

nun '

Met-MCA 09-t0 2 (6 J±1 8) IO'2 B9±6 9

Phe-MCA 0.45 ±0 OS (9 Oil.5) 10 * 52± 17

Leu-MCA 0 52±0 07 (5.0±0 9)10': 10 4±3 3

вержимым фактом. Протеолитическая деградация белковых антигенов абзима-ми описана для тироглобулина при аутоиммунном тироидите, вазоактивного интестинального пептида у больных бронхиальной астмой, фактора VIII свертывания крови у больных гемофилией А. Показана протеолитическая активность белка Бене-Джонса. Однако, вопрос о функциональной роли абзимов при аутоиммунных патологиях, путях и закономерностях их появления остается открытым и требует дальнейшего изучения.

3.1. Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями.

Инбредные линии мышей с аутоиммунными заболеваниями являются моделью для изучения многих аспектов аутоиммунности. У мышей линии МИ1-1рг/1рг, дефицитных по РА8, с возрастом возникают аутоиммунные нарушения, во многом сходные с СКВ и ревматоидным артритом. Новозеландские гибриды ЖВ/Жи^ спонтанно развивают СКВ-подобный нефрит. Линия БЛ/Г характеризуется целым рядом индуцируемых аутоиммунных нарушений, в том числе развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита (БАЕ) - модели рассеянного склероза. Таким образом, исследование природного спектра каталитических антител, образующихся у этих мышей, представляет безусловный интерес. В данной работе впервые был проведен сравнительный анализ каталитической активности антител у аутоиммунных мышей линий МШЛргЛрг, !5ЛЛ и Б] по отношению к линии ВАЬВ/с. Активность выделенных

препаратов поликлональных антител была охарактеризована по трём реакциям (ДНК-гидролиз, протеолиз, эстеролиз), для которых ранее была показана возможность катализа абзимами.

Протеолитическая активность в препаратах антител детектировалясь двумя различными методами: флуоресцентным и энзиматическим. В флуоресцентном тесте в качестве субстрата для протеолиза использовался бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСА-ФИТЦ).

Кроме того, для изучения кинетических параметров реакции расщепления белков абзимами был разработан альтернативный, принципиально новый способ - энзиматический тест. Принцип данного метода, основан на использовании в качестве субстрата малых количеств высокоактивного фермента - рибонук-леазы А, что позволяет достичь значительного молярного избытка фермента над субстратом и, таким образом, приблизить условия изучаемой реакции про-

теолиза к таковым для стандартной модели нестационарной кинетики (8о«Е). На рис. 16 представлены результаты тестирования лротеолитической активности в препаратах антител, выделенных из мышей линий МЯЬ-1рг/1рг, вЛЛ, Р[ и ВАЬВ/с. Полученные в ходе исследований результаты свидетельствуют о наличие природных антител с различной каталитической активностью у мышей, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями.

время инкубации, ч

Рис. 16. Определение протеолитической активности препаратов антител, выделенных из мышей линий ВАЬВ/с, ШВ/ЫШ Р1г МЯЫрг/1рг, БЛД флуоресцентным методом(а) и энзиматическим методом(б). а - 1 мкг БСА-ФИТЦ инкубировали с 5мкг очищенных 1дС в течение 24 и 48 часов. Изменение флуоресценции определяли в % по отношению к контролю (1 мкг БСА-ФИТЦ), инкубированному в тех же условиях, б -РНКазу А в концентрации 11 нМ инкубировали с очищенными 1д6 в концентрации 3.3 мкМ в течение 17 и 32 часов. Степень гидролиза РНКазы определяли в % как отношение измеренной рибонуклеолитической активности к таковой в начальный момент времени.

Таким образом, охарактеризованные аутоиммунные линии мышей \1RL-1рг/1рг, и Ы2ВЛчГ2\У являются перспективной моделью для направленного получения и изучения специфических абзимов с различной активностью. 3.2. Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе.

Механизмы развития системных аутоиммунных заболеваний, а также этиологические факторы, приводящие к возникновению этих нарушений, сегодня остаются неясными. При этом патологическая роль аутоантител в разрушении тканей и клеточных структур не вызывает сомнений. Среди заболеваний аутоиммунной природы рассеянный склероз (РС) представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Факторы, приводящие к массовой демиелинизации нервных волокон при данном заболевании, неизвестны. Одна из наиболее обоснованных теорий патогенеза отводит основную роль в разрушении миелина воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными ре-

акциями. В этой связи нами была высказана гипотеза о роли каталитической функции аутоантител в протеолитическом расщеплении компонентов миелино-вой оболочки. На предварительном этапе настоящего исследования был проведен анализ неспецифической протеолитической активности антител, выделенных из сывороток крови больных PC. Для детекции абзиматической активности был использован разработанный ранее флуоресцентный тест. Тестирование сывороток на наличие специфических аутоантител к ОБМ проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ полученных данных выявил высокую корреляцию (р<0.001) между концентрацией аутоантител и наличием протеолитической активности в препаратах антител у больных PC.

Таким образом, безусловный интерес представляло определение каталитической активности фракции аутоантител к ОБМ по отношению к антигену у

^ i больных PC и мо-

Пациент с PC "_SJLEAE

R Г

SJLEAE Пациент с PC

¿р

У о #

Р Р £

/ о-

А А ^

Р Р Р с?

£> чй>

-Г

Lc~ ОБМ—*

БСА- -Биотин

Lc-МОГ -

дельных животных. Индукцию ЕАЕ у мышей линии БЛ проводили по классической схеме двукратной иммунизацией ОБМ.

Выделение поликлональных из сывороток

Кумэсси Стрелтавидин Кумасси

Рис. 17. Электрофореграмма (А, Б, Г) и иммуноблот (В) образцов гидролиза ОБМ (А), БСА (В) и МОГ (Г) препаратами антител, полученными из сывороток крови больных РС (А, Г) и мышей линии крови пациентов с

с индуцированным ЕАЕ (Б, В). Показана протеолитическая активность суммарного пула иммуноглобулинов класса в (1дй фракция), а также сорбирующихся (1дС ОБМ+) и не сорбирующихся (1дв ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ антител. Легкие и тяжелые цепи антител обозначены Ьс и Не соответственно.

PC и мышей линии SJL с ЕАЕ осуществляли

хроматографией

на колонке ШТгар Рго1ет-0 ЗерЬагоБе (АтегеЬат), дальнейшее получение ОБМ-связывающих антител проводили методом аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента иммобилизованного на сефарозе основного белка миелина.

Активность полученных препаратов антител была охарактеризована по реакциям протеолиза с использованием неспецифических (биотинилированный

PC EAE

тотальный IgG тотальный IgG

/4?

U- • ОБМ- -

,OE

Lc- I ОБМ- .

U-06M—

Кумасси

Мочевина 0.6

V_ 0.3

Кумасси

Рис. 18. Электрофореграммы гидролиза ОБМ препаратами антител, полученными из сывороток крови больных РС, после выделения методом гель-фильтрации в денатурирующих условиях (А, Б) и адсорбции (В) с антителами против иммуноглобулинов человека (а-И) и мыши (а-т). На профиле элюции обозначены анализируемые фракции, соответствующие 150 кДа. л г-

бычий сывороточный альбумин, миелин-

олигодендроцитар-ный гликопротеин (МОГ), тиоредоксин I Е. coli) и специфического (основной белок миелина) субстратов. Результаты, представленные на рис. 17, свидетельствуют о том, что препараты антител, выделенных из сывороток больных

рассеянным склерозом и модельных мышей линии БЛ. с индуцированным ЕАЕ, обладали каталитической активностью только в отношении основного белка миелина. Контрольные антитела из пулированной сыворотки здоровых доноров проявляли фоновый уровень активности ко всем описанным субстратам.

Подтверждение «абзимати-ческого» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих ферментативных примесей было получено методами гель-фильтрации (рис.18) в денатури-

РС Fab

+ ~

PC IgG

Трипсин

Fab- I

ОБМ-

JgG—

-Трипсин Зимограмма

Рис.19. Электрофореграмма гидролиза ОБМ Fab фрагментами антител, полученных из сывороток крови больных PC (А). Зиммограмма сорбирующихся (ОБМ+) и не сорбирующихся (ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ IgG антител (Б). Белки разделялись в 5-20% ПААГ в присутствии флуоресцентного субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в гель при полимеризации. Трипсин в количестве 10 пг и 30 пг использовался в качестве положительного контроля.

рующих условиях (6М мочевина или буфер Gly-HCl, рН 2.6) и зимографии (рис. 196). Выделенные Fab фрагменты антител также обладали гидролизующей активностью по отношению к ОБМ (рис. 19а). Кроме того, обнаруженная активность исчезала после прединкубации с иммобилизованными антивидовыми антителами (рис. 18).

При сравнительном анализе протеолитической активности аутоантител, для 24 пациентов с различными стадиями PC была выявлена корреляция между уровнем каталитической активности аутоантител и глубиной развития патологического процесса PC согласно общепринятой шкале EDSS (expended disability status scale). Кроме того, обнаруженная активность ингибировалась копаксоном (Copaxone), известным лекарственным средством при PC, представляющим собой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина.

Методами иммуногистохимии удалось показать взаимодействие ОБМ-

А Б В

m h m h

МАт

382

Рис.20. Иммунодетекция взаимодействия ОБМ-специфичных антител с миелиновы-ми структурами мозга. (А) Иммуноблот: ОБМ (т), гомогенат мозга крысы (И), указаны антитела, использованные для детекции. (Б) Схема среза мозга крысы. (В) Окрашивание миелина по Райту. Г-Е - двойное окрашивание: (Г) -МАт382 (А1еха 546, красный), (Д) - антитела пациента с РС (Р1ТС, зеленый), (Е) - колокализация Г и Д, (Ж-3) - окрашивание на серийных срезах: (Ж) - МАт382 (А1еха 546, красный), (3) -антитела мыши с ЕАЕ (А1еха 488, зеленый).

специфичных абзимов с миелином на нативных срезах мозга и колокализовать

их с моноклональным антителом к ОБМ МАт 382, что свидетельствует о потенциальной возможности взаимодействия ОБМ-абзимов с миелиновыми структурами мозга (рис.20).

Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина аутоантителами.

Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трици-нового белкового электрофореза и масспектрометрии БЕЬО]. На первом этапе продукты гидролиза были разделены с использованием обращенно-фазовой хроматографии на колонке С4 (Рис. 21 А). Далее, образцы фракций анализировали с использованием трицинового электрофореза, с последующей детекцией А

ди

о.ою

IAAQK...HHAR23 9INIVT...MARRI64

113FSWG...MARR169 97T1W...MARRI69

12_£_3'

\.V.)KR['SQRSK|YI.ASASTMDHAWIiiri PRHK|DTCILDSI.(iRITCSI)RtiAPKR(iS(iKtXiHH

л \Ki iiiYiisi кжлу«iiiwoiM-M'vviшкм vii>riiwsg<¡kgk<и >Ti.ski;s\v<iAi-:<iy

12Ü 144 14?

KPüFGYG^ASDYI«AllK(il.K(il(DAQOTLSKlFta.OGltI»RSOSr\lAR^ Рис. 21. Обращенно-фазовая хроматография продуктов гидролиза ОБМ аутоантителами (А) и анализ образцов посредством трицинового электрофореза (Б): 1 - ин-тактный ОБМ, 2-8 - фракции, полученные при разделении продуктов гидролиза на обращенной фазе, 9 - гидролизат без разделения; показаны идентифицированные фрагменты. (В) основные сайты гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (красные стрелки). Желтым отмечены иммунодоминатные районы белка, оранжевым обозначен энцефалитогенный пептид.

низкомолекулярных пептидов при помощи флуоресцентного красителя Sypro Orange (Рис. 21 Б), и SELDI-масспектрометрии.

В результате удалось идентифицировать каждый фрагмент в структуре основного белка миелина и показать присутствие шести основных сайтов гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (Рис. 21В). Пять из них расположены в иммунодоминантных районах ОБМ, опознаваемых молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, ассоциированными с рассеянным склерозом, а два - локализованы на энцефалитогенном пептиде - индукторе ЕАЕ у модельных животных.

Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах.

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пепти-

17 терминатор

fl origin

His кластер с-пуоэгштоп His кластер

фрагмент ОБМ

Ыа (аггр)

pET-32b-MBPpeptide-CH(+)

сайт энтерокиназы S кластер тромбин His кластер

Тиоредоксин 77 промотер lac оператор

¡ас ï

CMElpBR322 origin

iTrxj- Hisx6 -DDDDKIVir^G[7T0BM 1-121 Hisx6 |

I 10 20 30 -to SO 60 TO 80 90 100 110 40 130 HO 150 160 170

a/ 717

9 7 10/11/-

Рис. 22. (А) Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии слитного белка тиоредоксина I £ co/ic фрагментами основного белка миелина. (Б) Аминокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пептидов на последовательности основного белка миелина.

дов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе в составе биополимера. Для изучения протеолиза изолированных эпитопов ОБМ специфичными антителами на основе экспрессионного вектора рЕТ-32Ь-СН(+) были созданы двенадцать генно-инженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина человека (Рис. 22). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов основного белка миелина был помещен линкер (SGGGG)3S, для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.

Фрагменты ДНК, кодирующие данные пептиды (ОБМ1-12) и серин-глициновый линкер (Link), были наработаны методом ПЦР с использованием перекрывающихся специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции (Рис. 23). Затем полученные ПЦР продукты пептидов ОБМ были рестрицированы эндонуклеазой BamHI и лигированы с ре-стрицированным Bglll линкером, с одновременной рестрикцией BamHI и Bglll для удаления из реакционной смеси нецелевых продуктов лигирования. Лигаз-ная смесь была использована для амплификации фрагментов Link-ОБМ методом

ПЦР с использованием концевых специфических олигонуклеотидных праймеров.

Наработанный таким образом фрагмент ДНК был рестрицирован эндонуклеазами Peil и Bell и лигиро-ван в Ncol-BamHI рестрицированный вектор рЕТ-32Ь-СН(+). Полученным лигатом трансформировали клетки Е. coli штамма DH5a.

Экспрессию проводили в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) в стандартных условиях. Поскольку

Рис. 23. Схема получения экспрессионного все рекомбинантные белки содержат вектора рЕТ-32Ь-ОБМпептид-СН(+), содер- (His)6 кластеры, их выделение из жащего фрагменты 1-12 ОБМ

Линкер 0BM1-12,7R/A

ПЦР Bglll i

♦ BamHI Рестрикция i

Лигирование t Link-ОБМ

ПЦР ♦ Bell

Peil Рестрикция ♦

Лигирование в вектор pET-32b-CH(+) Ncol-BamHI

Тгх-

Эпитопная библиотека ОБМ

д К ч >

л л 'ъ ,, ь( N л? К <->'

9> 9>

Контроль

Рассеянный склероз, 1дС

Остеохондроз, 1дС

клеточных лизатов проводилось с применением металл-хелатнои хроматографии. Дальнейшая очистка велась на ионообменной смоле МопоБ с последующей гель-фильтрацией на колонке 8ирег<1ех75. Гомогенность полученных препаратов контролировалась электрофорезом с окрашиванием Кумасси и иммуноблот-тингом с использованием моноклональных антител к с-тус эпитопу и составляла более 95%.

Для характеристики субстратной специфичности антител, фьюжн-белки тиоредоксина с фрагментами ОБМ инкубировались с иммуноглобулинами (суммарная фракция), изолированными из сыворотки крови 26 больных рассеянным склерозом, 22 пациентов с другими нейродегенера-тивными заболеваниями (ОКО), 11 здоровых доноров (НО) и мышей аутоиммунной линии с ЕАЕ. Как видно из приведенных электрофоре-грамм (Рис. 24), в случае пациентов с РС и остеохондрозом протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ. С другой стороны у мышей БЛ, с ЕАЕ, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ. Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения РС. Среди больных с ОЫО и здоровых доноров каталитического ответа не наблюдалось, за исключением двух случаев остеохондроза, при которых

Мышь линии ЭЛ, К^З

Трипсин

Катепсин Р

Металлопротеаза матрикса-3

Рис. 24. Сверху - вниз: Контроль; гидролиз модельных пептидов антителами, изолированными из пациента с РС, остеохондрозом, мышей линии БЛ с ЕАЕ;трипсином, ка-тепсином Р и ММР 3.

было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями. Контроль специфичности гидролиза осуществлялся разрезанием рекомбинант-ных белков трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (ММР-3) (Рис. 24).

Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (Рис. 25), и повторяют таковые в нативном белке. При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнару-

SJL ЕДЕ□ PCB

ОЬМ MASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSijKDSHHPARTAHyGSLPQKSHGRTQDEN 1 MASQKRPSQRFIGSKYlATASTMDHAfitfc 4 l!FFGGDRC.AFf<FfcSGK05HHPARlAH 7QDEN

3 MiFl PRHRDTGIl DSIGRFFGGORGAri« S R1AHYGSI f'QKSHGRIQDFN

iTASTMOHAWTCFLPRHRDTGILOSI S^SGKÜSHHHAHIAHYGSIPQKbHGRlQ

06MPVwrFKNaTPRTPPPS0GKGRGLSLSRrSWGAEGQRPGrGYGGRA5DYK5AHKGFKGVDAQGTLSKIFKlGGRDSR5GSPMARR 7 PVVHFK )VT IQWSOG 10PG"0YGG4A50Vf^l-ЮТ

« PVVHFFKM 9 RGLSLSPSWGAEGORPGFGYGGRAS J2 AQGTLSKIfRlbGRDSRSGSPMARR

e'JVTPO'PPbQGKGRGLSlSeS 11 RASCfy0AHKGf KGVDAQGTLSKIF|<il

Рис. 25. Последовательности пептидных фрагментов ОБМ человека. Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов антителами, изолированными из пациентов с рассеянным склерозом, обозначены красным; из мышей линии SJL с ЕАЕ - отмечены белым.

жено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась сравнимой. В большинстве случаев при PC наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт, и антитела, специфичные к участку ОБМ81"103, составляют подавляющее большинство в общем пуле ОБМ-гидролизующих иммуноглобулинов. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными относительно B-клеток, изолированных из больных PC, и узнающих преимущественно данный эпитоп, а также - с фактом значительной имму-нодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных Т-клеток.

Специфичность гидролиза ОБМ аутоантителами позволила разработать «модельный субстрат» для анализа сывороток больных PC и скрининга гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ. Для этого на основе вектора pQE30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные

пептидом ОБМ81-ЮЗ, содержащим энцефалитогенную последовательность, -

Интенсивность флуоресценции (AU)

0 5 10 15 20 ¿5 о гот 400 600 800 1000 1300

Время, часы Время,сек

Рис. 26. (А) Принципиальная схема РЯЕТ-подхода к исследованию кинетики абзи-матической реакции. (Б,В) Расщепление белка ЕРеРЯЕТ абзимами и модельными протеазами соответственно. Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени.

1.410' 1.3-10* 1.2-10* 1Л-1СГ* 1.0-10* 0.9-10'

1.4-10* -

1.2-10* 1 1.0-10* ■ 0.8-10*

так называемый «EPeFRET» - от ßticephalitogenic .Peptide Fluorescence Äesonance £negy Transfer (Рис. 26A). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (Рис. 26Б, В).

Были получены кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантите-лами и ингибирование данной реакции слитными белками и копаксоном.

Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу ОБМ возможно играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе рассеянного склероза. Нами показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет рассеянный склероз в сравнении с другими нейродегенератив-ными заболеваниями значительно больше, чем связывание с данным антигеном. Продемонстрированная сайт-специфичность в отношении основного белка мие-

лина и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем на основе сконструированных модельных субстратов.

4. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ВИЧ-1 GP120

Создание протеазы, способной узнавать и гидролизовать избранный белковый эпитоп, является одной из фундаментальных проблем современной биохимии и молекулярной биологии. В качестве белка-мишени в настоящей работе был выбран поверхностный гликопротеин gpl20 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), являющийся основным антигеном вируса и ключевым участником системы подавления вирусом иммунного ответа реципиента (Poignard, Saphire et al. 2001). Выбор объекта обусловлен безуспешностью попыток нейтрализовать ВИЧ in vivo антителами, полученными непосредственно иммунизацией животных поверхностными антигенами и их аналогами (Burton 1997; Tang, Kühen et al. 1999; Burton and Parren 2000), что является следствием гипервариабельности иммунодоминантных областей gpl20 и маскирования константных частей белка в результате тримеризации gpl20 и экранирования многочисленными N-связанными олигосахаридными группами (Pollard, Meier et al. 1991; Blankson, Persaud et al. 2002). Расщепление gpl20 в организме пациента по специфическим сайтам позволит преодолеть иммунологическую мимикрию вируса, нарушить упаковку поверхностного антигена, экспонировать его константные эпитопы и обеспечить возможность элиминации или эффективного сдерживания инфекции ВИЧ иммунной системой пациента.

Как уже отмечалось выше, природные протеолитические антитела часто обнаруживались при аутоиммунных патологиях. Одновременно с этим было показано, что при иммунизации аналогом переходного состояния реакции гидролиза сложных эфиров (фосфонатом) мышей линий SJL и MRL/lpr, склонных к аутоиммунным патологиям, частота появления гидролитических абзимов значительно выше, чем в случае контрольной линии Balb/c (Tawfik, Chap et al. 1995).

На основании всего вышесказанного для получения антител, расщепляющих gpl20, было предложено использовать два различных подхода: «реакционную иммунизацию» и индукцию антиген-специфического каталитического ответа на фоне аутоиммунного процесса

4.1. Индукция эпитоп-специфического каталитического ответа методом «реакционной иммунизации».

Суть метода «реакционной иммунизации» заключается в индукции антител, которые в отличие от «традиционных» связываются с гаптеном ковалентно.

Образование ковалентного интермедиата с фторпроизводными фосфонатов было показано для каталитических эстеролитических антител 17Е8 (Zhou, Guo et al. 1994; Guo, Huang et al. 1995) и 9A8 (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Эти факты позволяют предположить, что ковалентный каталитический аппарат сериновых гидролаз в абзимах может быть воспроизведен. Для получения специфического абзима методом реакционной иммунизации необходимо, чтобы гаптен представлял собой структуру, «голова» которой содержит механизм-зависимый ингибитор протеазы, а «хвост» - пептидильную цепь, соответствующую по длине участку, взаимодействующему в активном центре фермента.

В качестве полипептидной цепи была выбрана небольшая последовательность Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val, соответствующая аминокислотным остаткам 265-270 гликопротеина вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) - gpl20. Ранее было показано (Pollard, Meier et al. 1991), что специфичное расщепление по этому сайту приводит к тому, что gpl20 теряет свою способность связываться с рецептором CD4, что не позволяет вирусу инфицировать CD4+ клетки. Данный пептид был модифицирован по С-концевой аминокислоте группой механизм-зависимого ингибитора - дифенил фосфонатом. Такой пептид относится к пептидил а-аминоалкилфосфонатам. Схема его синтеза и структура представлены на рис. 27. Необходимо отметить, что важным свойством выбранного гаптена является низкая неспецифическая реакционная способность и высокая стабильность в водных растворах.

1 НБг/А "ОН

нЛ-, о AcOHWOT'.îh о 2КНЗЫП,, ai, ?

К * M . .cw —. H,cVvi; —

H,С ^=0 МИ, н. & 5 HjC Y ОС6Н5

' I HjN

О' О—s

CSH5

НзС о DCC

BÛC-Leu-Ala GîuirBuï-GtuitBu>~Glu£t3u) ♦ J[ Jj^-OC6H5 -► BOC-Leii-Ala «jilS'i) OlOCuWBui VolPIms

NH3 |tfa

HjC CH,

^ЧЛр-СР»

Рис. 27. Схема синтеза пептидил фосфоната - LAEEEV-Phos.

Поскольку известно, что малые молекулы, в большинстве случаев, являются слабыми иммуногенами, для проведения эффективной иммунизации синтезированные реакционные пептиды были конъюгированы с KLH. Для присоеди-

нения N-концевой аминогруппы пептида к доступным аминогруппам KLH был выбран метод с предварительной^ активацией носителя при помощи бис[сулфосукцинимидилсуберата] (BS , Pierce) и последующим присоединением гаптена. Для эффективной детекции каталитических антител N-конец синтезированного пептидил фосфоната был модифицирован активированным эфиром биотина.

Для получения эпитоп-специфических абзимов использовали три линии мышей: MRL/lpr,

NZB/NZW Fl и SJL - являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний. Иммунизацию мышей данных линий проводили по ранее опубликованной схеме получения каталитических антител к аналогам переходного состояния ферментативных реакций (Tawfik, Chap et al. 1995). Сравнительный анализ специфического иммунного ответа на антиген у разных иммунизированных мышей всех трех линий (рис. 28) проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA). В качестве антигена был использован исходный пептидилфосфонат, меченный биоти-ном; биотинилированный Уа1-фосфонат и нитрофенилметил-п-биотинилфенилметил фосфонат (Bt-Y), для которого ранее была показана специфическая ковалентная модификация активного центра абзимов (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Для всех трех линий иммунизированных мышей оказалось, что антитела обладают высокой специфичностью к модифицированному пептидному фрагменту антигена, не взаимодействуют в условиях данного эксперимента со свободным Val-фосфонатом, и, в то же время, связываются с более активным и менее специфичным модифицирующим агентом - Bt-Y.

Дальнейшее изучение типа взаимодействия полученных антител с реакционным пептидом проводилось на аффинно-очищенных препаратах IgG. Иммобилизованный на мембране ковалентный комплекс антиген-антитело детекти-

eSiol-LAEEEV-Phcs

• Blet-V-Phcs

оЫетУчтпрсйенил биогинщЬешл

Рис. 28. Иммуноферментный анализ сывороток крови иммунизированных мышей. Адсорбцию проводили в лунках с иммобилизованными антигенами. Комплекс детектировали при помощи антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.

контроль

иммун. LAEEEVPhos

контре

иммун. LAEEEVFtos

ровали методом иммуноблоттинга. Результаты данного эксперимента (рис. 29) свидетельствуют о наличии в препаратах поликлональных антител, выделенных из аутоиммунных мышей, иммунизированных «реакционным» пептидом ЬАЕЕЕУ-РИоз, как легких, так и тяжелых цепей иммуноглобулинов, способных к ковалентной модификации пептидом.

5 г- Т.е. в ре-

? о N 5 о N

зультате реакционной иммунизации образовались Не антитела, способные кова-лентно взаимодействовать с гапте-ном и строго специфичные к его пептидной компоненте.

В резуль-

116664535-

^ ^р)Ик шшш _Н с

•**.•«* — Lc

116 -66 -453525-

-Lc

электрофор еграмма

ст р ептави дин -HRP

Рис. 29, Электрофореграмма и иммуноблоттинг поликлональных антител (1 мкг), выделенных из иммунизированных мышей линий БЛ, и ШВ/ШМ Р1 после реакции с пептидил фосфонатом - 1_АЕЕЕ\/-РЬоб (ОД мкМ). Трипсин (1 мкг), БСА (5 мкг) и поликлональные 1дС, выделенные из мыши линии BAL.ES/c (1 мкг), были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей, соответственно.

тате скрининга панели гибридом, полученных из селезенок опытных мышей, были отобраны 7 моноклональных антител, способных к ковалентной модификации реакционным пептидил фосфонатом. Причем в двух случаях модификации подвергались легкие цепи антител, а в пяти - тяжелые.

ДНК, соответствующая вариабельным доменам данных антител, была наработана методом ПЦР, и определена нуклеотидная последовательность. Одно-цепочечные антитела были экспрессированны в прокариотической системе. Ре-комбинантные антитела Ell и Еб обладали каталитической активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA. Кинетические параметры гидролиза амидной связи составили: kcat^= 1,1 ± 0,5 х 10 min , Km = 53 ±14 мкМ для антитела Еб и kcat =3,2 ± 0,7 х 10 min , Km = 48 ±11 мкМ для антитела Ell.

Проведенные эксперименты показали принципиальную возможность по-

лучения специфичных к антигену каталитических антител методом реакционной иммунизации.

4.2. Получение каталитических антител, специфичных к др120, на фоне индуцированного аутоиммунного заболевания.

Для целей настоящего исследования была выбрана линия мышей SJL, развивающая ЕАЕ при иммунизации иммунодоминаитным пептидом ОБМ 85-97 (Sakai, Zamvil et al. 1988; Tan, Kennedy et al. 1992).

Была разработана оригинальная схема индукции антиген-специфического про-теолитического иммунного ответа при иммунизации животных слитным белком, состоящим из константных областей gpl20 и пептида ОБМ 85-101. Получение слитных белков для иммунизации и изучения свойств антител

Исходя из опубликованных исследований по структуре, иммуногенности и функциональной активности gpl20 (Hansen, Lund et al. 1996; Shioda, Oka et al. 1997; Sullivan, Sun et al. 1998) были определены участки белка с относительно константной последовательностью. Для дальнейшего использования был выбран химерный полипептид, состоящий из трех фрагментов gpl20 (аббревиатуры I, И, III) с делеци-ей первого, второго и третьего гипервариабельных регионов и окружающих их гидрофобных альфа-спиральных участков al, a2; также был удален лидерный пептид gpl20 и С-концевой альфа-спиральный участок аб. В качестве исходной матрицы для получения "минимального" белка была использована последовательность гена HXB2-env, соответстующий клон был предоставлен AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIH.

Был получен набор генетических конструкций, кодирующих выбранные фрагменты gpl20, тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновые кластеры, эпитоп человеческого белка р62с-шус и пептид ОБМ 85-101, в различных комбинациях (рис. 30).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli BL21(DE3). Полипептиды trx, и 1-3 выделяли методом металло-хелатной хроматографии в нативных условиях, тогда как для продуктов конструкций 4-10 использовали денатурирующие условия. Полученные белки были охарактеризованы масс-спектрометрически.

Для исследования сайт-специфичности протеолитических антител была также получена растворимая форма белка trx-gpl20I-III при экспрессии в штамме Ecoli Ongami В (DE3), с последующей преципитацией белка сульфатом аммония, металло-хелатной хроматографией и анионообменной хроматографей.

Л'/>/1 XitnK

1. Н Тгх ~~Нч>-/\—» trx-mbp

mbp

__/Г,mill Л aШ

2. Н Тгх —©KSHi!)-* trx-CH

^ &гтШ ЬсоЮЛ'оИ Ahoi

3. н Тгх ~XR>-(gK^VV-- trx-CHmbp

mbp

\<vl _ Bum 111 fioWA'Ml Xhu I

4. ч Trx Hjh)—С 1 I " I ir^^^y/s^-. trx-gpl201-lllmbp

йгоШ

5. 4 Trx —0~T " 1 "' У^Ы^И^ trx-gpl20I-HI

A'cul ЫоЛ

6. H Trx и^—( ' I |Г~>Я— trx-gpl20MI

__lluRI_«¡¡¡nlll

7. H Trx 1#-^ » I I» ЬЯ- trx-gp 1201I-III

_ ЬаВУ.'Пга! ЯадШ froRI

8 -) Trx T^i • trx-gp 120111

A'col ßomlil

9. , I и I m H^ gp120I-IH

(• 1 II | <« У

Mol B.imlll

( ' 1 II I У

F.n RI iVo/I ЛЫ

gpl20I-I!Imbp

mbp

<g> Гексагистидиповмй кластер ( I | ii | hi ) константные области gpl 20

(J^) Эпигон p62myc | Trx I Последовательность тиоредоксипа IE coli

/\ Нослсливак-лы10с1ь шлпида OliM 85-101

mbp

Рис. 30. Схема участков экспрессионных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки. Названия рекомбинантных белков приведены справа, номера конструкций -слева.

Поскольку нативный gpl 20 содержит 22-24 N-связанные олигосахаридные группы (Yeh, Seals et al. 1993), гликозилированный полноразмфный gpl20 для целей настоящего исследования был получен в бакуловирусной системе экспресии. Были использованы вектор рМеЮасВ и фрагмент гена env из плазмиды HXB2-env, соответствующий зрелому gpl20. Целевой белок был выделен из супернатанта культуры и очищен до гомогенности по ДСН-ПААГ. Идентичность очищенного gpl20 была подтверждена N-концевым секвенированием и энзиматическим N-дегликозилированием; электрофоретическая подвижность дегликозшшрованного gpl20 соответствовала теоретической массе (56 кДа). Таким образом, был получен набор рекомбинантных белков, достаточный для иммунизации животных, изучения

параметров иммунного ответа и характеризации каталитических антител. Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.

Индукция ЕАЕ у мышей линии SJL была проведена при помощи слитного белка gpl20I-IIImbp или пептида ОБМ85-97 в соответствии со стандартным протоколом (Miller and Karpus 1996). Распределение мышей по опытным и контрольным группам приведено в таб. 6.

Развитие ЕАЕ у мышей, иммунизированных gpl20I-IIImbp или пептидом ОБМ85-97, было дополнительно исследовано путем гистологического анализа, проведенного через 30 дней после начала иммунизации. На срезах тканей были зафиксированы изменения, типичные для развивающегося ЕАЕ (Schwartz 1993), что показывает возможность индукции ЕАЕ пептидом ОБМ85-Ю1 в составе слитного белка.

Группа животных SJL-1 SJL-2 SJL-3 | SJL-4 SJL-5 | SJL-6 Balb-1 Balb-2

Иммуногсн - Пептид OEM 85-97 Gpl20I-IIImbp gpl20I-lII - gpl20I-Illmbp

Доза, мкг - 170 150 300 150 300 - 300

tix-gp 120I-III - - + + + + - +

trx- gp 1201-II - - + + + + - +

trx- gpl20III - - + + + + - +

trx-mbp - + + + - - - +

ОБМ85-97 - БСА - + + + - - - +

Trx - - - - - - - -

Таб. 6. Специфический иммунный ответ мышей линии S3L, по данным ИФА. Результат ИФА считали положительным, если для всех мышей из исследуемой группы величина сигнала в три и более раз превышала фоновое значение. Разведение исследуемых сывороток при анализе варьировалось для разных антигенов. Все группы состояли из 5 мышей.

Каталитические свойства полученных антител

Исследование протеолитических свойств антител иммунизированных мышей проводилось с помощью ранее разработанного флуоресцентного теста. В качестве специфического субстрата использовался gpl20I-III, избыточно меченый флюорес-цеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Как видно из Рис 32, при иммунизации мышей слитным белком gpl20I-III-mbp происходит значительное увеличение протеолити-ческой активности антител по отношению к антигену, достигающее 9-ти раз при иммунизации gpl20I-III-mbp в дозе 150 мкг/мышь, по сравнению с контролями. Уменьшение активности антител в случае иммунизации gpl20I-III-mbp в дозе 300

БЛ.-1 ЭЛ_-2 БЛ-З Ва1Ь-1 Ва1Ь-2

Рис. 32. Протеолитическая активность антител. Увеличение интенсивности флюоресценции др1201-Ш-ФИТЦ при распаде субстрата. Относительное увеличение интенсивности флюоресценции вычислено как отношение разности интенсивности флюоресценции в момент времени I и интенсивности флюоресценции в момент начала реакции (Р0) к интенсивности флюоресценции в момент начала реакции (Р0): А=(РгРо)/Ро. Приведены средние значения для трех независимых измерений и стандартное отклонение.

мкг/мышь, может быть объяснено более интенсивным маскированием субстрата связывающими антителами. Также следует отметить, что уровень протеолитиче-ской активности антител по отношению к неспецифическому субстрату ФИТЦ-БСА практически одинаков для иммунизированных и интактных мышей 8 Д. (данные не приводятся). Установление сайт-

специфичности протеоли-тических антител к др120

Специфичность протеолиза, катализируемого исследуемыми антителами, была исследована при использовании в качестве субстрата §р1201-Ш и гликозилированного полноразмерного £р120, а также контрольного субстрата - БСА. Продукты гидролиза анализировали при помощи ДСН-ПААГ и блоттинга (Рис. 32). Распад контрольного субстрата БСА под действием антител не наблюдался ни в одном из случаев. В то же время при инкубации антител, выделенных из мышей группы БЛ-З, с gpl20I-Ш и гликозилированным §р120 наблюдалось появление единственного крупного продукта расщепления, обозначенного треугольником. В случае негликозилированного §р1201-Ш разница в молекулярной массе субстрата и продукта гидролиза, рассчитанная по изменению подвижности полос, составила около 3 кДа, что соответствует расположению сайта гидролиза в районе С-конца §р120 перед гексагистидиновым кластером либо в Ы-концевой части белка.

Для точного определения сайта гидролиза gpl20 антителами был использован слитный белок Тгх^1201-Ш, полученный в растворимой форме. Он содержит одиночный гексагистидиновый кластер между доменами тиоредоксина и gpl20 и два кластера на С-конце белка. Для отделения пептидных продуктов протеолиза §р120 и точного измерения их молекулярной массы была применена масс-спектометрия 8ЕЬ01. Наличие у предполагаемых продуктов реакции гексагистидиновых ютасте-

Ат со _1 . I Ат -> СО -J СО 1 со W Ат —> со со <0 со

инкубация + + | + др120 + + + + др120 + + +

—116 9Р120- НС^ >1 г т т —116 — 66 — 45 др120 — ига —116 — 66 — 45

не— дрИОНИ^ 2 п ► — 35 — 35

т ш — 45 ^ — 35 Lc— •• — 25 * — 25

Lc— С — 25 — 16 _ — 18

Г о СП Д со СО ч-

Ат —} со —I СО 1 —5 ю _1 -} » Ат (О -1 to w «

БСА + + 1 + -1 - БСА + + + - -

- 11(

Не/" м ы — 45 — 35

Lc— — - — — — 25 — 18

—116 — 86 -- 45

— 35

— 25

— 16

Рис. 32. Катализируемый антителами гидролиз gpl20HII по данным ДСН-ПААГ (А), глико-зилировэнного др120 по данным ДСН-ПААГ (Б) и иммуноблоттинга (В); отсутствие гидролиза биотинилированного БСА по данным ДСН-ПААГ (Г) и иммуноблоттинга (Д). Гели окрашивали серебром (А, Б, Г) либо проводили иммуноблоттинг с использованием конъюгата нейтрави-дина и пероксидазы хрена (В, Д). Молекулярные массы полос маркера указаны стрелками и приведены в кДа, тяжелые цепи IgG, легкие цепи и продукты распада др120 отмечены надписями Не, Lc и треугольником, соответственно. Ат - антитела.

ров позволило использовать мишень, содержащую иммобилизованные комплексы нитрилтриуксусной кислоты и ионов никеля. Масс-спектрометрический анализ продуктов гидролиза Trx-gp 120I-III под действием антител показал (рис. 33), что основной пик на опытном спектре соответствует пептиду с молекулярной массой 5526.8 Да, что соответствует расположению сайта гидролиза между остатками Рго493 и Leu494 (позиции обозначены в соответствии с номенклатурой HXB2CG). В молекуле слитного белка Trx-gp 120I-III этот сайт соответствует позициям 484485; теоретическая молекулярная масса отщепляемого пептида - 5528 Да, что соответствует ошибке определения 0,02%.

Выявленный сайт гидролиза находится в относительно консервативной области gpl20. Согласно сведениям базы данных, содержащей большинство известных вариантов последовательностей белка gpl20 ВИЧ-1 (HIV Sequence Database, 2002), 12-членный пептид, окружающий сайт гидролиза, содержится полностью в 34% последовательностей. 7-членные пептиды, содержащие сайт гидролиза и составляющие типичный линейный эпитоп, узнаваемый антителами, содержатся целиком в 48% последовательностей (среднее значение для 6 возможных пептидов). Таким

5000 6000 7000 8000 т/г

Рис. 33. Масс-спектрометрический анализ гидролиза др120 антителами. По оси абсцисс отложено отношение массы молекулярных ионов к их заряду, по оси ординат - интенсивность сигнала. Основной пик, соответствующий С-концевому пептиду 1:гх-др120ЫИ, обозначен стрелкой. Контрольные спектры сдвинуты вниз, молекулярные массы приведены в Да.

образом, около половины из охарактеризованных вариантов ВИЧ-1 потенциально чувствительны к действию изучаемых протеолитических антител.

выводы.

1. Впервые продемонстрирована каталитическая активность природных антител у мышей с БРБ статусом линий МЯЫргЛрг, БЛЛ и Рь характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.

2. Впервые показана антиген-специфическая каталитическая активность аутоан-тител к основному белку миелина (ОБМ) у больных рассеянным склерозом (РС) и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены шесть преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности ау-тоантител, выделенных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных. Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-ЮЗ. Обнаруженная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволила создать основу для новых дифференциальных методов диагностики РС.

3. На примере антитела 6В8Е12 к субтилизину Карлсберг впервые показано, что антиидиотипические антитела, полученные к протеазе, могут осуществлять каталитическую функцию, схожую с первичным антигеном. Экспрессия антитела 6В8Е12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.

4. Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (ЬАЕЕЕ-УРЬоз) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной составляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.

5. Разработана оригинальная схема иммунизации мышей линии БД, гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-1 gpl20 и фрагмента ОБМ, приводящая к появлению протеолитических антител, из-

бирателыю расщепляющих антиген. Показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gpl20, и установлен преимущественный сайт гидролиза gpl20 Pro493-Leu494, находящийся в константной области бежа. Разработанный подход может быть использован для получения «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий.

6. При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепо-чечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибиторами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь. Данные одноцепочечные антитела могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в качестве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1. H.A. Пономаренко. Е.С. Александрова, И.И. Воробьев, О.М. Дурова, A.B. Козырь, A.B. Колесников, Г.Б. Телегин, А.Р. Калинина, C.B. Сучков, А.Г. Габибов. Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями. // Доклады Академии Наук, 2000. Т. 375. С. 224-227.

2. N.A. Ponomarenko, О.М. Durova, I.I. Vorobiev, E.S. Aleksandrova, G.B. Telegin, O.G. Chamborant, L.L. Sidorik, S.V. Suchkov, Z.S. Alekberova, N.V. Gnuchev, A.G. Gabibov. Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. II J. Immunol Methods. 2002 . v. 269. №1-2 p.197-211.

3.А.Г. Габибов, А. Фрибуле, Д. Тома, A.B. Демин, H.A. Пономаренко. И.И. Воробьев, Д. Пиле, М. Паон, Е.С. Александрова, Г.Б. Телегин, A.B. Решетняк, О.В. Григорьева, Н.В. Гнучев, К.А. Малышкин, Д.Д. Генкин. Антитела - протеазы: подходы к индукции каталитического ответа.// Биохимия, 2002, т. 67, с. 14131426.

4. H.A. Пономаренко. О.М. Дурова, И.И. Воробьев, C.B. Сучков, А.Г. Габибов. К вопросу о каталитической активности аутоантител при рассеянном склерозе.// Доклады Академии Наук, 2004т.395, с.839-842.

5. Воробьев И.И., Пономаренко H.A.. Решетняк A.B., Дурова О.М., Мисиков В.К., Сучков C.B., Габибов А.Г. Каталитические антитела в медицине: специфическая деградация аутоантигенов и новые подходы к инактивации патогенов// Молекулярная медицина, 2004, №3, с.48-55.

6. Сучков С.В., Мисиков В.К., Дурова О.М., Черепахина Н.Е., Кимова М.В., Введенская О.Ю., Пономаренко Н А.. Пронина О.А., Котов С.В., Габибов А.Г. Аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетическая и клиническая зависимость// Неврологический журнал, 2005, №4, т. 10, с. 49-54.

7. С.В. Сучков, Т.Е. Наумова, А.Н. Хитров, В.А. Агеев, Е.А. Огнева, З.С. Алек-берова, О.М. Дурова, Н.А. Пономаренко. А.Г. Габибов // Новые механизмы ан-тителоопосредованной цитотоксичности и их возможная роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний// Молекулярная медицина, 2005, №1, С. 32-36.

8. Е.В. Калинина, Н А. Пономаренко. О.М. Дурова, Ф.Н. Палеев, И.И. Воробьев, Н.Н. Кекенадзе, З.А. Шогенов, М.Е. Земцова, Н.В. Гнучев, А.Г. Габибов, С.В. Сучков Каталитические аутоантитела при аутоиммунном миокардите: клинич-кое и патогенетическое значение// Терапевтический архив, 2005, №(9), с. 65-70.

9. С.В. Сучков, З.С. Алекберова, Ф.Н. Палеев, Т.Е. Наумова, В.К. Мисиков, Е.С. Кряжева, Н.А Пономаренко, А.Г. Габибов // Достижения и перспективы клинической абзимологии// Вестник РАМН, 2005, №9, С. 38-43.

10. В.К. Мисиков, М.В. Кимова, О.М. Дурова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков, И.И. Воробьев, Н.А.Пономаренко Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе: патогенетические и клинические аспекты.// Бюл Экс Биол. Мед 2005 т. 139. №(1), с. 98-101.

11. N A. Ponomarenko, О. М. Durova, I. I. Vorobiev, A. A. Belogurov, A. G. Petrenko, G. В. Telegin, S. V. Suchkov, V. К. Misikov, S. L. Kiselev, M. A. Lagark-ova, V. M. Govorun, M. V. Serebryakova, B. Avalle, P. Tornatore, A. Karavanov, H. C. Morse III, D. Thomas, A. Friboulet, A. G. Gabibov. Autoantibodies from MS patients and EAE developing mice exhibit site-specific cleavage of myelin basic protein. //Proc. Natl Acad Sci USA, 2006. V. 103. № 2, P.281-286.

12 N.A Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev, A.A. Belogurov, G.B. Telegin, S.V. Suchkov, V.K. Misikov, H.C. 3rd Morse, A.G. Gabibov. Catalytic activity of autoantibodies toward myelin basic protein correlates with the scores on the multiple sclerosis expanded disability status scale. II Immunol Lett 2006. T. 103. № 1 C. 4550.

13. Ponomarenko N A.. Vorobiev I.I., Alexandrova E.S., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Khaidukov S.V., Avalle В., Karavanov A., Morse H.C. 3rd, Thomas D., Friboulet A., Gabibov A.G. Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone mice: antibody-mediated cleavage of HIV-1 glycoprotein GP120.//Biochemistry. 2006 Jan 10;45(l):324-330.

14. K.A. Мальцев, А.Н. Хитров, О.Ю. Введенская, Н А. Пономаренко. М.А. Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела - новый молекулярный инструмент в кардиологии и офтальмологии// Терапевтический архив, 2006, №11, стр.70-76.

15. А.Н. Хитров, К.А. Мальцев, О.Ю. Введенская, Н.А Пономаренко. М.А. Исаева, М.В. Кимова, Е.Б.Третьяк, З.С. Шогенов, З.С. Алекберова, А.Г. Габибов, С.В. Сучков. //Каталитические аутоантитела как новый молекулярный ин-

струмент в ревматологической практике.// Терапевтический архив, №6, 2006, стр.59-66.

16. Gabibov A.G., Ponomarenko N.A.. Tretyak Е.В., Paltsev M.A., Suchkov S.V. Catalytic autoantibodies in clinical autoimmunity and modern medicine.// Autoimmun Rev. 2006, №(5) p. 324-330.

17. Калинина E.B , Воробьев И.И., Шогенов 3.C., Пономаренко H.A.. Земцова М.Е., Дурова О.М., Палеев Ф.Н., Кекенадзе Н.Н., Габибов А.Г., Гнучев Н.В., Джанашия П.Х., Мальцев К. А., Сучков С.В. Феномен антителоопосредованно-го катализа при аутоиммунном миокардите// Молекулярная медицина, 2006, №1, с.36-41.

18. Reshetnyak A.V., Armentano M.F., Ponomarenko N.A , Vizzuso D., Durova O.M., Ziganshin R., Serebryakova M., Govorun V., Gololobov G., Morse H.C .3rd, Friboulet A., Makker S.P., Gabibov A.G., Tramontano A. Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles // J Am Chem Soc 2007;v. 129, №(51), p. 16175-16182.

19. Ponomarenko N.A . Pillet D., Paon M., Vorobiev I..I, Smirnov I.V., Adenier H., Avalle В., Kolesnikov A.V., Kozyr A.V., Thomas D., Gabibov A.G., Friboulet A. Anti-idiotypic antibody mimics proteolytic function of parent antigen.// Biochemistry 2007, v. 46, №(50), p. 14598-14609.

20. А В.Решетняк, М.Ф.Арментано, Г.С.Морзе, А.Фрибуле, С.П.Маккер, А.Трамонтано, В.Д.Кнорре, А.Г.Габибов, Н А.Пономаренко. Механизмзависи-мая селекция библиотек генов иммуноглобулинов для получения ковалентных биокатализаторов.// Доклады Академии Наук, 2007, т. 415, №2, с. 268-272.

21. С.В Сучков О.Ю. Введенская, И.В. Вострикова,А.Г. Габибов, М.В. Кимова, Ю.А. Бурдакова, Н.А. Пономаренко. М.А. Пальцев. Антителоопосредованный протеолиз ассоциированных с миелином белков как новый механизм контроля за процессами демиелинизации при рассеянном склерозе.// Вестник РАМН, 2007, №7, с. 32-36.

22. Белогуров А.А., Куркова И.Н., Мисиков В.К., Сучков С.В., Телегин Г.Б., Алехин А.И., Гончаров Н.Г., Кнорре В.Д., член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. К вопросу о субстратной специфичности каталитических аутоантител при нейродегенеративных процессах. // Доклады Академии Наук, 2007, т.413, №3, с. 408-41 1.

23. Belogurov A.A. Jr, Kurkova I.N., Friboulet А, Thomas D., Misikov V.K., Zakharova M.Y., Suchkov S.V., Kotov S.V., Alehin A.I., Avalle В., Souslova E.A., Morse H.C. 3rd, Gabibov A.G., Ponomarenko NA. Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis //JImmunol 2008, v. 180, №2, p. 1258-1267.

24. Смирнов И.В., Воробьев И.И.,Фрибуле А.,Аваль Б., Тома Д., Кнорре В.Д, член-корреспондент РАН Габибов А.Г. и Пономаренко Н.А. Антиидиотипиче-ский подход для получения антитела-протеазы.// Доклады Академии Наук, 2008, т.420, №1, с. 1-4.

Патент

1. 20040265975 (United States Patent Application) Габибов А.Г., Пономаренко H.A., Колесников A.B., Воробьев И.И., Александрова Е.С, Демин A.B. «Метод получения каталитических аутоантител; антигены для иммунизации и нуклео-тидные последовательности» 30.12. 2004

Заказ № 63/10/08 Подписано в печать 25 06 2008 Тираж ЮОэкз Уел пл 3

ООО' Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 чмт с/г ги ; е-тай т/о@с/г ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Пономаренко, Наталья Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ИСКУССТВЕННЫЕ ФЕРМЕНТЫ.

1.1. ИНЖЕНЕРИЯ ФЕРМЕНТОВ.

1.2. ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ.

1.3. МЕТОД ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОГО ИЗМЕНЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ.

2. ИСКУССТВЕННЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

2.1. АНТИТЕЛА НА АНАЛОГИ ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИЙ РЕАКЦИИ.

2.2. ВВЕДЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЦЕНТР АНТИТЕЛА ПУТЕМ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ИЛИ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА.

2.3. СОЗДАНИЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ КАТАЛИЗА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИ НЕВЫГОДНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ.

2.4. АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

2.4.1. Антиидиотипические антитела к рецепторам.

2.4.2. Антиидиотипические вакцины.

2.4.3. Структурные исследования антиидиотипических антител.

2.4.4. Каталитические антиидиотипические антитела.

2.5. ПОЛУЧЕНИЕ АБЗИМОВ ПУТЕМ РЕАКЦИОННОЙ ИММУНИЗАЦИИ.

2.6. АБЗИМЫ, СОДЕРЖАЩИЕ КОФАКТОРЫ.

2.7. ГРАНИЦЫ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ АБЗИМОВ.

3. ПРИРОДНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

3.1. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ВАЗОАКТИВНОМУ ИНТЕСТИНАЛЬНОМУ ПЕПТИДУ.

3.2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АКТИВНЫЕ ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ.

3.3. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ТИРОГЛОБУЛИНУ.

3.4. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ VIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ.

3.5. ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА.

3.6. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА НЕОБЫЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ.

3.7. ПРИРОДНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА КАК ЧАСТЬ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ.

3.8. МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИРОДНЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ.

3.9. ОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

4. РАССЕЯННЫЙ СКЛЕРОЗ.

4.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

4.2. Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ В ПАТОГЕНЕЗЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА.

4.3. РОЛЬ В-КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА.

4.4. РОЛЬ НАТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА. ЗНАЧЕНИЕ TLR.

4.5. КРОСС-РЕАКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ КАК ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

4.6. ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА.

5.ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА. СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ.

5.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МИЕЛИНА.

5.2. ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА, СТРОЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

6. ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА GP120.

6.1. СОЗРЕВАНИЕ И ПРОЦЕССИНГ ENV ГЛИКОПРОТЕИНА.

6.2. СТРУКТУРА GP120.

6.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ GP120 С РЕЦЕПТОРАМИ.

6.3.1. CD4-gpl20 взаимодействие.

6.3.2. Взаимодействие схемокиновым рецептором.

6.4. КОМПЛЕКС С GP41.

6.5 УКЛОНЕНИЕ ВИРУСА ОТ ИММУННОГО ОТВЕТА.

6.6. СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ GP120.

6.7. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ GP120.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ СЕЛЕКЦИИ».

1.1. РЕАКЦИОННАЯ СЕЛЕКЦИЯ АНТИТЕЛ ИЗ СИНТЕТИЧЕСКОЙ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА.

1.2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ.

1.2.1 Структурные особенности одноцепочечных антител.

1.2.2 Каталитические свойства одноцепочечних антител.

1.2.3 Определение нуклеофильного остатка, участвующего в «ковалентном катализе».

1.2.4 Сайт-направленный мутагенез одноцепочечных антител.

2. АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИЕЙ.

2.1. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИИДИОТИПИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА 6В8-Е12.

2.2. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 5-Н4 И 6В8-Е12.

2.3. ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИТЕЛА 6В8-Е12 В ВИДЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА.

2.4. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННОГО ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА.

3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ.

3.1. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАТИВНЫХ АНТИТЕЛ У МЫШЕЙ С АУТОИММУННЫМИ НАРУШЕНИЯМИ.

3.2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АУТОАНТИТЕЛА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ.

3.2.1 Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина аутоантителами.

3.2.2 Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах.

4. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ВИЧ-1 GP120.

4.1. ИНДУКЦИЯ ЭПИТОП-СПЕЦИФИЧЕСКОГО КАТАЛИТИЧЕСКОГО ОТВЕТА МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ ИММУНИЗАЦИИ».

4.2. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К GP120, НА ФОНЕ ИНДУЦИРОВАННОГО АУТОИММУННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ.

4.2.1 Получение слитных белков для иммунизации и изучения свойств антител.

4.2.2 Экспрессия слитных белков в прокариотической системе.

4.2.3 Экспрессия др120 в бакуловирусной системе.

4.2.4 Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.

4.2.5 Каталитические свойства полученных антител.

4.2.6 Установление сайт-специфичности протеолитических антител к др120.

ВЫВОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ПАЦИЕНТЫ И ЗДОРОВЫЕ ДОНОРЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ.

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ И СОПУТСТВУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ.

РАБОТА С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ.

АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

РЕСТРИКЦИЯ.

ЛИГИРОВАНИЕ.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОЭЛЮЦИЯ.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

ВЫДЕЛЕНИЕ МА ТРИЧНОЙ РНК, СИНТЕЗ кДНК И КЛОНИРОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНЫХ

ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ Ell И Еб.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ

ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХАНТИТЕЛ Ell И Е6.

САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ А. 5 И А. 17.

ВЫДЕЛЕНИЕ МА ТРИЧНОЙ РНК, СИНТЕЗ кДНК И КЛОНИРОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНЫХ

ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ 6В8Е12 И 5-Н4.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО

ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА 6В8-Е12.

СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ GP120 В

ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ.

СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ GP120 В БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЕ.

СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ «ЭПИТОПНОЙ БИБЛИОТЕКИ» ОБМ.

СОЗДАНИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ EPeFRET.

МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭЛЕКТРОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.

ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК Е COLI МЕТОДОМ ЭЛЕКГРОПОРАЦИИ.

ПЦРСКОЛОНИЙ.

НОЧНАЯ КУЛЬТУРА.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МУЗЕЙНОГО ШТАММА.

РАБОТА С ФАГАМИ.

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ GP120 В КЛЕТКАХ Е COLI.

РАБОТА С БЕЛКАМИ.

ДЕНА ТУРИРУЮЩИЙЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.2 J

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ.

ИММУНОБЛОТТИНГ.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ELISA).

ТРИПТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ ДЛЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

МАССПЕКТРОМЕТРИЯ SELDI.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ MALDI.

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИЗА ЭПИТОПНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОБМ АНТИТЕЛАМИ И МОДЕЛЬНЫМИ

ПРОТЕАЗАМИ.

КИНЕТИКА ГИДРОЛИЗА EPeFRET АНТИТЕЛАМИ И МОДЕЛЬНЫМИ ПРОТЕАЗАМИ.

АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИДИОТИП-АНТИИДИОТИП МЕТОДОМ ПОВЕРХНОСТНОГО

ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА.

ДЕТЕКЦИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО

МЕТОДА.

ДЕТЕКЦИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРА ТА АНТИТЕЛ МЕТОДОМ

ЗИМОГРАММЫ.

АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА GP120 ПРИ ПОМОЩИ ДСН-ПААГИ ИММУНОБЛОТТИНГА. 245 ДЕТЕКЦИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРА ТА АНТИТЕЛ МЕТОДОМ

ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО ТЕСТА.

ДЕТЕКЦИЯ ГИДРОЛИЗА РИБОНУКЛЕАЗЫ А АНТИТЕЛОМ 6В8Е12.

ИЗМЕРЕНИЕ ЭСТЕРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

КА ТАЛИЗ ГИДРОЛИЗА АМИДНОЙ СВЯЗИ.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ МОНОКПОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 6В8-Е12.

ИНГИБИРОВАНИЕ КА ТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 6В8-Е12.

КОНЪЮГИРОВАНИЕ ПЕПТИДОФОСФОНА ТА С БЕЛКОМ-НОСИТЕЛЕМ.

ПОЛУЧЕНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННОГО АНАЛОГА ПЕПТИДИЛФОСФОНА ТА.

СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН.

АНАЛИЗ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧНОСТИ В ПРЕПАРА TAX ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

СПЕЦИФИЧЕСКОЕ МЕЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ БИОТИНИЛИРОВАННЫМ

ПЕПТИДИЛФОСФОНА ТОМ.

РЕАКЦИИ МОДИФИКАЦИИ РЕКОМБИНА ТНЫХ АНТИТЕЛ ФОСФОНА ТОМ X.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ РАСПАДА TRX-GP120I-III ПО МЕТОДУ

SELDI.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПРОЦЕДУРЫ.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА АНТИТЕЛ.

ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХАНТИТЕЛ (SCFV).

ВЫДЕЛЕНИЕ СЛИТНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ GP120-MBP.

ВЫДЕЛЕНИЕ ОБМ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G ИЗ СЫВОРОТОК КРОВИ.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЬЮЖН-БЕЛКОВ trx-mbp peptide.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА EPeFRET (ОБМ81-ЮЗ).

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ ХРОМА ТОГРАФИЯ.

ПОЛУЧЕНИЕ GP120 В БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ.

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛОНОВ ВИРУСА ACMNPV.

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА GP120.

ПРЕПАРАТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЛИКОПРОТЕИНА GP120.

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Каталитические антитела - протеазы"

В последние два десятилетия представление о биокатализе существенно расширилось в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам. Каталитические антитела (абзимы) представляют интерес как с точки зрения механизма их возникновения и роли в функционировании иммунной системы организма, так и как потенциальные терапевтические агенты. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов.

Существует несколько различных подходов для поиска каталитических антител. Один из них -это получение антител на аналог переходного состояния реакции. Затем, так называемая реакционная иммунизация, при которой образуются антитела ковалентно связывающие гаптен. Третий подход состоит в получении антиидиотипических антител как образа активного центра фермента и, наконец, поиск, изучение и направленная индукция абзимов при различных аутоиммунных нарушениях. Использование метода фагового дисплея в свою очередь открывает щирочайшие возможности по дизайну новых биокатализаторов и улучшению их каталитических свойств.

Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализаторы, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний реакций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряемой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и активации предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.

Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Способность ферментов образовывать ковалентные комплексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное участие в «ковалентном катализе». Для получения абзимов, обладающих повышенными нуклеофильными свойствами, механизм-зависимые ингибиторы сериновых гидролаз на основе фосфонатов могут быть использованы в двух направлениях: «реакционная иммунизация» и «реакционная селекция».

Необходимо отметить, что к настоящему моменту накоплено достаточно данных о спонтанном образовании каталитических антител в организме человека и животных при аутоиммунных патологиях. Одним из таких заболеваний является рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных волокон. Традиционно ведущая роль в патогенезе рассеянного склероза отводилась аутореактивным СЭ4+ ТЫ клеткам, специфичным к компонентам миелиновой оболочки, в первую очередь -основному белку миелина (ОБМ). Однако в последнее время значительное внимание было уделено роли гуморального ответа в патогенезе РС, и сейчас непосредственное участие аутоантител к ОБМ и миелин олигодендроцит гликопротеину (МОГ) в демиелинизации не вызывает сомнений и подтверждено экспериментально. Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундаментальный и практический научный интерес представляет изучение роли каталитических аутоантител к ОБМ в развитии РС. Структурно-функциональные исследования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии.

Информация о работе

Пономаренко, Наталья Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Каталитические антитела - протеазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Каталитические антитела - протеазы ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Каталитические антитела - протеазы"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Пономаренко, Наталья Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Каталитические антитела - протеазы"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Каталитические антитела - протеазы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология