Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталитические аутоантитела к ДНК при системной аутоиммунном ответе: аспекты субстратной специфичности

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Каталитические аутоантитела к ДНК при системной аутоиммунном ответе: аспекты субстратной специфичности"

; ОА 1 8 МЛ?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

на правах рукописи

Щуров Дмитрий Вячеславович

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АУТОАНТИТЕЛА К ДНК ПРИ СИСТЕМНОМ АУТОИММУННОМ ОТВЕТЕ: АСПЕКТЫ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории химических рснов биокатализа Института Молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: доктор химических наук А. Г. Габибов

Официальные оппоненты: доктор биол. наук, проф. О.Л. Поляновский

доктор биол. наук, проф. Р.Т. Василов

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии им. М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится ^ 1^6 в /2- часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно Молекулярной биологии им.

Автореферат разослан ^

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ознакомиться в библиотеке Института Энгельгардта

1996 г.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунная система представляет собой одну из наиболее высоко организованных систем млекопитающих, адаптировавшую в ходе эволюционного развития комплекс механизмов, позволявших защитить организм от внешних агентов (патогенных бактерия, вирусов и паразитов). Механизмы гуморального иммунного ответа связаны с выработкой антител - группы белков, которые связывают практически любые природные и синтетические молекулы (антигены) с высокой аффинностью и исключительной специфичностью. Селективное связывание достигается за счет большого числа слабых нековалентных взаимодействия, таких как водородные связи, ван дер Ваальсовы силы и электростатическое взаимодействие.

В 1986 году впервые удалось получить антитела, обладавшие каталитической активностью. В дальнейшем область моноклональных каталитических антител (абзимов) получила огромное развитие, и были получены антитела, способные катализировать широкий спектр различных химических превращений, включая реакции, для которых неизвестны ферментативные аналоги. Субстратная специфичность каталитических антител обычно выше, чем у ферментов, и в ряде случаев эффективность катализа под действием антител близка к ферментативной, В последние годы исследователи стали отходить от получения антител, катализирующих простые гидролитические реакции, и исследования абзимов принимают все большую практическую ориентацию. Описаны антитела, смещающие равновесие в сторону образования энергетически невыгодных соединений, обладающие исключительной стереоселективностью в отношении продуктов реакции, и другие. Одной из наиболее интригующих, но пока нерешенных задач этой области науки является создание высокоспецифичных протеаз на основе антител. Однако катализ разрыва высокоэнергетических пептидной и фосфодиэфирной связей описан для природных каталитических аутоантител, что показывает Принципиальную возможность решения такой задачи современной абзимологией.

Уникальным свойством иммунной системы является способность дискриминировать аутоантигены и внешние антигены. Однако в ряде случаев нарушения в механизмах регуляции иммунного ответа ведут к развитию аутоиммунных процессов, при которых отмечается продукция

антител к аутоантигенам. Наибольший прогресс в области исследования аутоиммунных заболевания достигнут в изучении механизмов индукции и регуляции системной красной волчанки (СКВ). Характеристическим маркером развития СКВ как у человека, так и в мышиных моделях этого аутоиммунного заболевания является продукция аутоантител к нативной двуцепочечной ДНК (нДНК). Принято считать, что аутоантитела к нДНК вносят значительный вклад в патогенез СКВ. Кроме того, интерес к исследованиям ДНК антител обуславливается возможность» их использования в качестве модельной системы для изучения взаимодействия ДНК-белок в целом. За последние несколько лет антитела к ДНК были детально исследованы, и, возможно, представляют на сегодняшний день наиболее охарактеризованную систему антиген-антитело из всех известных у млекопетаюших. Определено ' более 250 последовательностей ДНК антител, исследуются механизмы срыва толерантности и развития аутоиммунного ответа к ДНК, проведено значительное количество иммунохимических и генетических исследований, ведутся работы по кристаллизации комплексов антител с их ДНК субстратами. Тем не менее, причины индукции аутоантител к ДНК при системном аутоиммунном ответе остаются неясными. Самые недавние исследования позволяют предполагать, что не нДНК сама по себе, а. комплексы ДНК с ДНК-связывающими белками (гистонами, другими ядерными или рецепторными белками) скорее всего служат основным Иммуногеном для патогенных аутоантител к ДНК. Однако в этом вопросе по-прежнему остается много неясного. Очевидно, что исследования антигенной специфичности аутоантител к ДНК должны помочь идентифицировать эпитопы на ДНК, вызывающие развитие иммунного ответа к нДНК.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы было исследовать специфичность обусловленного аутоантителами гидролиза ДНК и сопоставить ее со специфичностью ряда ДНК-метаболизирующих ферментов, определить кинетические параметры взаимодействия ДНК-абзимов р их субстратами, а так асе охарактеризовать каталитические функции моноклонального ДНК аутоантитела.

Научная новизна и практическая ценность исследования. В работе впервые детально исследованы закономерности взаимодействия обнаруживаемых при СКВ каталитических аутоантител к ДНК с различными модельными субстратами, выявлены преимущественные субстраты для таких антител, охарактеризованы кинетические параметры гидролиза. Результаты исследования позволяют подробно охарактеризовать уникальные каталитические свойства ДНК аутоантител. Кроме того, впервые продемонстрирован гидролиз ДНК под действием моноклонального аутоантитела BY04-01, изучены его кинетические параметры и специфичность , предложена модель структуры каталитического центра антитела и выявлена роль отдельных аминокислотных остатков в катализе. Полученные результаты могут найти применение в исследованиях механизмов индукции и развития аутоиммунных патологий, закономерностей взаимодействия ДНК-белок и в разработке новых каталитических антител к энергетически стабильным субстратам.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на:

1. International conference on "Modern Enzymology: Problems and trends", 1992, St. Petersburg, Russia.

2. International conference on "Catalytic antibodies and antibody engineering", 1993, Moscow, Russia.

3. 16th IUBMB congress, 1994, New Delhi, India.

4. WHO International Laboratory Course on Molecular and Cellular Aspects of Immunology, 1994, Welzmann Institute of Science, Israel.

5. 23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, 1995, Basel, Switzerland.

6. Annual Meeting .of the Laboratory of Tumor Cell Biology, 1995, Bethesda, Maryland.

Структура ц обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах, содержит 20

рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 118 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение препаратов антител. обладающих гидролитической активностью, из сывороток крови больных СКВ.

При работе с каталитически активными антителами необходимо иметь полную гарантию отсутствия в препарате малейших примесей ферментных аналогов. В данной работе в качестве критериев отнесения ДНК-гидролизуюшей активности (ДГА) к фракции антител были приняты следующие:

- активность ассоциирована с фракцией антител при аффинной очистке препарата на колонке с Protein G и последующей очистке на гель-фильграции в обычной режиме и в условиях диссоциации нековалентных комплексов ("кислый шок");

- полученные? препарат» антител и Fab фрагментов антител электрофоретически гомогенны;

- гидролиз протекает под действием Fab фрагментов антител, выделенных из активных сывороток, в то время как Fc фрагменты не проявляют каталитической активности;

- активность исчезает после инкубации препаратов антител с иммобилизованным Protein А или антителами к IgG человека.

Для очистки препаратов антител, удовлетворявших этим критериям, было предложено несколько альтернативных схем. В данной работе была проведена модернизация предложенных ранее схем очистки, позволяющая сократить до минимума продолжительность процедуры, что крайне важно для сохранения активности препарата, и свести до минимума вероятность загрязнения препаратов антител примесными ферментами. Использованная в работе схема приведена на рис. 1 и основана на двух основных свойствах биокатализатора, а именно: биокатализатор представляет собой молекулу антитела; биокатализатор имеет сродство к ДНК.

После двукратного высаливания сывороток крови сульфатом аммония, осадок растворяли в буфере 1 (Трис-НС1 50 мМ, NaCl 100 мМ, рН 7.5) и наносили на колонку с Protein G. После промывки 20 обьемами буфера 1, колонку промывали 10 обьемами буфера 2 (Трис-,НС1 50 мМ, NaCl 2 М, рН 7.5) для диссоциации неспецифических и Ионных комплексов антител с белками и ферментами сыворотки крови. После этого "антитела элюировали буфером 3 (глицин-НС1 100 мМ,

Рис. 1. Схема очистки ДНК-абзимов

Таблица /. Таблица очистки препарата ДНК: абзгшов Ш.

Стадия Общее количество белка, МГ Общая активность, ед Удельная активность, ед/мг Выход, %

1 100 . - -

2 80 2900 36 -

3 60 2100 35 72

4 55 1900 34 92

5 б 1500 250 79

6 3 1200 400 80

NaCl 500 мМ, pH 2.5) и сразу наносили на гель-фильтрационную колонку Superóse 12, предварительно уравновешенную этим асе буфером. Хроматография в таких условиях Скислый шок") -обеспечивает диссоциацию специфических комплексов антител с ферментами и их разделение за счет различия молекулярных масс. Необходимость этой стадии очистки вызвана обнаруженной у антител к ДНК способностью образовывать специфические комплексы с ферментами метаболизма нуклеиновых кислот, фракции, содерасавде IgG, собирали и сразу после хроматографии доводили рН до нейтрального добавлением 1 М Трис-HCl, рН 8.0, после чего проводили повторную очистку на колонке с Protein G, с которой после промывки буфером 1 препарат антител элюировали 100 мМ глицин-HCl, рН 2.5. Зто позволяет провести доочистку препарата IgG, сконцентрировать его и перевести в бессолевой буфер. После нейтрализации рН, препарат антител наносили на колонку с ДНК-сефакрилом, и после промывки буфером 4 (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5), препарат ДНК-антител элюировали квадратичным градиентом NaCl (0-2 М) в этом же буфере. На последней стадии очистки, препарат ДНК-антител после диализа против буфера 4 наносили на ионообменную колонку MonoQ, и после промывки буфером 4 элюировали квадратичным градиентом NaCl (0-1 М) в этом же буфере. Эта стадия позволяет обогатить конечный препарат фракцией ДНК-гидролиэуюших антител.

Для определения общей и удельной активности ДНК-гмдролизуюших антител использовалась следующая система единиц: за единицу активности принималось количество антител, способное полностью перевести 0,1 мкг полностью суперскрученноя плазмидной ДНК в кольцевую форму за 1 час при 37°С. Контроль активности вели по результатам электрофореза в 1* агарозном геле. В ходе данной работы было проведено аналитическое выделение антител из 54 сывороток пациентов с СКВ. В двух случаях полученные препараты проявили значительный уровень ДНК-гидролизующей • активности (препарат 1, далее Л1 - 270 ед/мл, препарат 2, далее П2 - 290 ед/мл), a eme в одном случае (препарат 3, далее ПЗ) уровень активности составил 60 ед/мл. Таблица 1 демонстрирует эффективность очистки препарата П1 по предлоаоенной схеме'. Как следует из представленных данных, в результате очистки удалось добиться 11-кратного увеличения специфической активности препарата.

Субстратная специфичность поликлональных препаратов ДНК-гидролизуюших антител. полученных из сывороток крови больных СКВ,.

Антитела к ДНК являются характеристическими маркерами СКВ, и особенности их взаимодействия с природными и искусственными субстратами подробно изучены. Согласно специфичности связывания они делятся на три основные группы: антитела, направленные против нуклеотидов и взаимодействующие только с денатурированной (одноцепочечной) ДНК; антитела, узнавшие конформационные эпитопы двойной спирали и связывающие только нативную ДНК и ее фрагменты; и антитела, взаимодействующие с детерминантами, характерными для обеих форм ДНК (главным образом с сахарофосфатным . остовом). Электрофореграмма продуктов гидролиза суперспирализованной

I

плазмидной ДНК р11С19 препаратами антител представлена на рис.2. Согласно данным этого рисунка, антитела вносили одноцепочечный разрыв в структуру ДНК, что приводило к образованию преимущественно кольцевой (релаксированной) формы плазмидной ДНК.

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Динамика гидролиза суперспирализованной плазмидной ДНК рЦС19: 1-3 - стандарты суперспирализованной, линейной и кольцевой плазмидной ДНК. 4-6 - плазмидная ДНК (1 мкг) после инкубации с 1 мкг препарата антител П1 в течение 0.5, 1 и 2 часов.

Как было показано ранее, специфичность природных ДНК-абзимов к фрагменту нативной ДНК длиной 300 пар оснований отлична от специфичности ДНКазы крови и ДНКазы I. Однако вопрос взаимодействия ДНК-абзимов с одноцепочечными ДНК-субстратами прежде не рассматривался. Препарат аутоантител сыворотки крови пациента с СКВ П1 был использован в экспериментах по исследованию специфичности гидролиза низкомолекулярных субстратов. Для изучения влияния последовательности оснований в субстрате на опосредованный антителами гидролиз были синтезированы олигодезоксирибонуклеотиды различной длины, которые согласно

особенностям их первичной структуры можно разделить на три подгруппы:

а). (Н1)п:. 1 - (Ц)0; 2 - (Т)10; 3 - <А)13

б}. ЧН1-Н2)п; 4 - (ТГ>2; 5 - (ГТ)6; 6 - (ГА)б; 7 - (ЦА)3; в -(АЦ)10; 9 - (ТЦ,10

в). (Н1-Н2-НЗ )п: 10 - (ТГА)3; 11 - (ТТЦ>3; 12 - <ЦАА>5; 13,-(ТЦА»5

Представленные на рис. 3 результаты свидетельствуют о независимости скорости реакции от последовательности оснований в субстрате и об отсутствии среди рассмотренного набора олигонуклеотидов специфически расщепляемого субстрата. Показательно, что исследуемый препарат антител гидролизовал все гомоолигонуклеотиды с близкой эффективностью. Не удается также выделить преимущественные сайты гидролиза. В то же время нельзя не отметить неравнозначность гидролизуемых связей в пределах отдельных субстратов: так, для олигонуклеотида 6 явно

1 2346« 78 8 Ю 11 12 13

Рис. 3.'Зависимость активности

препарата ДНК-абзимов П1 от ну-клеотидной последовательности субстрата. Левая в каждой паре дорожек - контрольная инкубация (без добавления антител).

14 15 « а и 19 20 н

ш ^ Ш ■ т -

Рис. 4. Зависимость активности

препарата ДНК-абзимов П1 от размеров субстрата. Правая в каждой паре дорожек - контроль (без добавления антител).

предпочтительный является гидролиз по Г-А-связям.

Тетрануклеотид 4 оказался устойчив к расщеплению в рассматриваемых условиях, а степень гидролиза в значительной мере зависела от размеров субстрата (например, степень превращения олигонуклеотида в (20 основания» значительно выше, чем для олигонуклеотида сходной последовательности 7 (8 оснований)). Для более подробного анализа подобной зависимости мы использовали серию олигонуклеотидов длиной от 4 до 14 оснований, каждый последующий член которой был получен добавлением случайных оснований к предыдущему, что позволяло также следить за локализацией доминантных сайтов гидролиза на субстратах родственного строения, но различной длины:

14 - ТТГЦАГЦАЦТГАЦЦ; 15 - ТТГЦАГ11АЦТГА; 16 - ТТГЦАГЦАЦТ; 17 -ТТГЦАГЦАЦ; 18 - ТТГЦАГЦА; 19 - ТТГЦАГЦ; 20 - ТТГЦАГ; 21 - ТТГЦ.

Минимальным субстратом в условиях реакции оказался олигонуклеотид 20 (6 оснований), который гидролизовался препаратом антител по двум сайтам (рис. 4). При дальнейшем увеличении длины субстрата наблюдается постепенное увеличение степени гидролиза за указанное время от 52 для 20 до 80Х для 14. Крайне интересным является сдвиг доминантного сайта гидролиза, по направлению от 5'-конца при увеличении длины олигонуклеотидов 6% ,6 до 12 основания, в результате чего основная расщепляемая связь в этих случаях находится на примерно одинаковом удалении от 3'-конца. Это может быть связано с ролью 3'-концевого остатка дезоксирибозы в связывании субстрата антителами. Следует отметить также появление сдвоенных полос в положениях гидролизуемых связей Г-Ц для олигонуклеотида 19 (7 оснований) и Ц-А для олигонуклеотида 15 (12 оснований). Очевидно, это связано с возможностью гидролиза ДНК антителами двумя возможными способами с оставлением фосфатного остатка как в 3'-, так и в 5'-положении. Не ясно, обладает ли подобной способностью один клон антител, или же за различные активности отвечают разные клоны. До настоящего времени не поступало сообщений об обнаружении нуклеаз, образующих продукты гидролиза с 5' фосфатом и 3' фосфатом одновременно.

Механизм стерического " взаимодействия ДНК-абзимов с их субстатами пока неясен, и казалось интересным в ходе данного

исследования определить, оказывает ли влияние вторичная структура олигонуклеотида на его гидролиз. Подобное влияние могло бы быть обусловлено лучшей комплементарностыо связывающего центра антитела и олигонуклеотида в конформации последнего, отличной от линейной. В качестве субстратов для подобного исследования были выбраны олигонуклеотиды, большая часть которых способна образовывать при низких концентрациях структуры типа "шпильки". Такая структура субстрата позволяет также оценить предпочтительность двуцепочечнои ДНК (ножка шпильки) по сравнению с одноцепочечной ДНК (петля шпильки). За базовый субтрат был принят самокомплементарный олигонуклеотид следующего строения: 22 ШГАЛТТЦГГ, х&ТФрып э предварительных экспериментах гидролизовался со сравнительно высокой скоростью. В последовательность этого олигонуклеотида синтетическим путем были внесены модификации, направленные на стабилизацию или ослабление образующейся шпильки:

23 - ЦГГААТШЦГ - вариация последовательности базового субс

трата.

24 - ЦЦАААТТТГГ - дестабилизация "шпильки" за счет замены

нековалентной связи Г-Ц на более легкоплавкую А-Т.

25 - ЦГГААТТЦГТ дестабилизация "шпильки" за счет нарушения

26 - ЦАГААТТЦГГ одной нековалентной связи.

27 - ЦЦГАААТТЦГГ стабилизация "шпильки" за счет увеличения

28 - ЦЦГААЦТТЦГГ длины "петлевого" участка.

29 - ТТАГГЦЦТАА - дестабилизация "шпильки" за счет замены

трех нековалентных связей Г-Ц более легкоплавкими А-Т связями.

30 - ТТТТТТТЦГГ

31 - ГГЩТТТТТТ

32 - ТТТТТТТАГГ

Последние три олигонуклеотида были синтезированы для проведения сравнительного анализа "расщепления гомополимерного и

гетерополимерного участков в пределах одной молекулы субстрата.

32

Для получения структур типа "шпилька" [у Р 1АТФ-меченые олигонуклеотиды (22)-(29) прогревали 10 мин при +8(Яс для денатурации, после чего резко охлаждали до сРс. В концентрационных пределах 10~7-10~6 М при таком отжиге подобные

олигонуклеотиды образует "шпильки", что подтверждали данные электофореза в полиакриламидном геле (неденатурируюшие условия). После' такого отжига олигонуклеоиды инкубировали с препаратом антител П1.

Представленные на рис. 5 результаты свидетельствуют об отсутствии выраженной зависимости скорости гидролиза от вторичной структуры субстрата. Фосфодиэфирные связи в пределах ножки и петли различных шпилек гидролизоались антителами с близкой эффективностью. Однако, полученные позже данные о способности антитела В704-01 "раскручивать" ножку шпильки при связывании с субстратами подобной структуры и поликлональный характер использованных в данном исследовании препаратов не позволяет :-:а основании этих данных делать выводы, о равнозначности одно- и двуцепочечных участков ДНК при гидролизе под действием аутоантител. На примере олигонуклеотидов 31 - 32 четко проявляется,эквивалентность гидролиза на гомо- и гетерополимерных участках, что подтверждает высказанное ранее предположение об узнавании ДНК-абзиыами сахарофосфатного скелета субстратов.

Интересные данные были получены при исследовании влияния

22 23 24 25 26 17 28 29

30

Ъ1 32

Рис. 5. Зависимости активности препарата П1 ДНК-абзимов от вторичной структуры субстрата. Левая в каждой паре дорожек -контрольная инкубация (без добавления антител).

«я*

Фт

т

ч*

концентрации субстрата на специфичность гидролиза под действием препарата антител ПЗ. Как видно из рис. 6, с увеличением концентрации исходного. субстрата, в качестве которого использовался гомоолигонуклеотид (1А)10, изменяется характер его деградации. Прежде всего обращает на себя внимание появление сдвоенной полосы в положении, соответствующем гидролизуемой связи между аденинами 7 и в с .5'-конца, аналогичной описанным выше (рис. 4). Таким образом, можно предположить, что гидролиз с оставлением фосфата в 3' или в 5' положении имеет различный концентрационный барьер. Представленные на рис. 6 данные были использованы для расчета кинетических параметров реакции гидролиза, который вели для одного произвольно выбранного сайта (связь между аденинами 6 и 7- с 5'-конца исходного олигонуклеотида) по данным обработки электрофореграммы на сканнере ЬКВ ингавсап. Для рассматриваемого сайта гидролиз подчинялся уравнению Михаэлиса-Ментен, а константа Михаэлиса

-7

составила 4-10 М. Такое низкое значение Ку свидетельствует о

прочном связывании субстрата с молекулой биокатализатора. Для

известных на сегодня нуклеаз характерной является величина К..

-Л -к .и

порядка 10 -10 М. Полученное значение константы Михаэлиса служит еще одним важным доказательством обусловленности наблюдаемого гидролиза ДНК нукяеазной активностью фракции антител. Коцстанта скорости реакции Ккат оказалась равной 0.013,

Рис. 6. Изменение паттерна гидролиза олигонуклеотида (с!А)10 под действием препарата ДНК-абзимов ПЗ в зависимости от концентрации субстрата: 1-0.4 мкМ; 2-1.2 мкМ; 3-2.4 мкМ; 4-5.4 мкМ; 5 - 10.4 мкМ; 6 - 25.4 мкМ К - контрольная инкубация (без добавления антител)

1/мин, что ниже значений, характерных для. типичных нуклеаз. Однако следует принять во внимание, что в данном исследовании был использован поликлональный препарат антител, и оценка реальной концентрации катализатора не представляется возможной. Таким образом, реальная величина Ккат для данного катализатора может быть значительно выше.

Олигодезоксирибонуклеотид <А)10 был использован для изучения кинетических параметров- гидролиза под действием Fab фрагмента аутоантител, полученных из сыворотки крови другого пациента 1П2). Полученные результаты представлены графически на рис. 7. Рассчитанное из графика значение для 5*-фосфорилированного олигонуклеотида (150 пМ> свидетельствует о высокой прочности связывания субстрата, характерной для молекулы антитела и значительно превышающей параметры связывания нуклеазами. Б то же время связывание нефосфорилированного олигонуклеотида происходило

l/vo, ч/ихМ 200

-20 0 20 40 60 80 100120140160180200 1/[S], мкМ"1

1/Vn, ч/шсМ

160

140

120

100

SO

60

40

20 n

-40-35-30

О 20 40 60 80 100 120

Рис. 8. Кинетический анализ гидролиза суперспирализованной плазмид-ной ДНК в присутствии Fab-фрагмен-та препарата ДНК-абзимов П2.

-10-5 о 5 ю [Ц, мкМ

Рк.7* Кинетический анализ гидролиза олигонуклеотида в присутствия РаЬ-фрагмс1гта ДНК-эбзимов. а -зависимость начальной скорости гидролиза з'-Р-деэ-окси-Аю от концентрации субстрат« [S] в координатах Лаяунвсра-Бсрса; в - определение константы свазыпяп У-ОН-доогся-Аю по Диксону; концентрация 5'-[ Р]деэокся-Ат в реакционной смеси: J -0.2 нМ, 2-I.OhM.

со значительно меньшей эффективностью ' lKd = 34 мкМ), что

указывает на важность 5'-концевого фосфата при взаимодействии

низкомолекулярных субстратов с молекулой антитела. Следует

отметить достаточно высокие каталитические параметры реакции

(ккат" 0,2 мин_1)-

Во многих случаях короткие олигонуклеотиды не представляют

столь богатых возможностей для связывания с ДНК антителами как

нативная ДНК, и поэтому характеризуются значительно более слабыми

параметрами связывания по сравнению с макросубстратами. Поэтому

представлялось крайне интересным оценить каталитический потенциал

одного и того же препарата антител по отношению к различным

субстратам. С этой целью мы использовали Fab фрагмент препарата

П2 для оценки параметров гидролиза плазмидной ДНК. Препарат

суперспирализованной плазмидной ДНК в различных концентрациях

инкубировали с FaT> фрагментом антител, продукты гидролиза

разделяли электрофорезом в агарозном геле, и по результатам

сканирования геля определяли кинетические параметры реакции. За

степень гидролиза принимался процент перевода

суперспирализованной плазмидной ДНК в кольцевую форму. Полученные

данные описывались уравнением Михаэлиса-Ментен и представлены

графически на рис. 8. Обобщение каталитических параметров

аутоантител в отношении различных субстратов приведено в табл. '2.

Константа Михаэлиса для гидролиза плазмидной ДНК составила -7

0.92-10 М, что очень близко к значению Км для (сШ10. Таким образом, для данного препарата антител субстрат длиной 10 оснований • представляет достаточно большую долю структурной информации, необходимой для эффективного узнавания субстрата антителом. В то же время Ккат оказалась равной 40 1/мин, что на два порядка выше, чем для олигонуклеотида. Отсюда следует, что нативная ДНК является лучшим субстратом для ДНК абзиыов. В целом

Таблица 2. Кинетические параметры гидролиза различных субстратов в присутствии ДНК-абзиыов.

Препарат Субстрат К«, М Km, мин"1 К„„ / К», 1/(М*мин)

ГО шпнтела (dA),„ 4»10-7 < 0.013 3.2*104

П2 Fab . фрагмент (<LA)10 1.5* 10' 1 0.2 1.3*106

• cc.pUC19 0.92*10-' 40 4.3*108

следует отметить крайне высокую эффективность катализа гидролиза обоих субстратов (Ккат/Км = 1.3-107 1/М-мин для <dA)10 и 4.3-Ю9 1/М-мин для плазмидноя ДНК), значительно превышающую значения, характерные для искусственных абзимов, и сравнимую с эффективностью ДНК метаболизирующих ферментов.

В целях изучения механизмов возникновения и действия каталитически активных аутоантител представлялось исключительно важным сопоставить характер обусловленной ими деградации ДНК в сравнении с некоторыми широко распространенными ДНК-метаболизируюшими ферментами. Как известно, каждая нуклеаза характеризуется присущей только ей тонкой специфичностью к различным структурным элементам ДНК. Для характеристического анализа специфичности расщепления ДНК под действием ДНК антител мы исследовали паттерны гидролиза двух различных по структуре субстратов, двуцепочечного фрагмента ДНК длиной 96 пар оснований и короткого одноцепочечного гомоолигонуклеотида (dA ^4 , под действием микрококковой нуклеазы, фосфодиэстеразы змеиного яда, нуклеазы S1, ДНКазы I и Fab фрагмента аутоантител П2. Как следует из данных, приведенных на рис. 9а, Fab фрагмент антител, аналогично фосфодиэстеразе 1 и нуклеазе S1, при гидролизе оставлял фосфатную группу в 5' положении и требовал присутствия дивалентного катиона для осуществления каталитических функций. Однако гидролиз под действием Fab фрагмента носил эндонуклеазный характер, и гидролиз как одноцепочечной, так и двуцепочечной ДНК происходил со сравнимой эффективностью. Здесь следует заметить, что большинство антител к нДНК взаимодействуют . с высокой аффинностью и с оцДНК, что позволяет предположить, что такие, антитела связываются только с одной цепью ДНК, хотя они и способны разместить в активном центре двойную спираль нДНК. Из использованных в работе нуклеаз наиболее близкими с Fab фрагментом свойствами обладает ДНКаза 1. Однако сравнение паттернов гидролиза фрагмента двуцепочечной ДНК под действием этого фермента и Fat фрагмента антител показывает (рис. 96), что разные участки двойной спирали были чувствительны к атаке этими биокатализаторами. Таким образом, приведенные на рис. 9 и просуммированные в таблице 3 данные демонстрируют, что ни одна из

рассмотренных нуклеаз не обладает набором свойств, присущих каталитическим антителам, и позволяют характеризовать ДНК-абзимы как биологический катализатор с уникальными параметрами и механизмом гидролиза.

Проведенные исследования показывают, что ДНК-специфические каталитические аутоантитела способны с высокой эффективностью гидролиэовать как нативную, так и денатурированную ДНК без выраженной субстратной специфичности, но с уникальным паттерном

1 с) 1 2 з

А) Б)

«а»

* - »«»

• -

ф

ф

»ф о.

*

Рис. 9. Гидролиз ДНК в присутствии препарата РаЪ фрагмента ДНК-абзимов П2 и различных нуклеаз. А) Олигонуклеотид <<1А)10 инкубировали в присутствии: 2,3- микрококковой нуклеазы 10.001 и 0.002 ед,, 3 мин); 4, 5 - РаЪ фрагмента ДНК-абзимов (0.5 и 1.5 мкг, 30 мин);

6 - фосфодиэстеразы 1 (3-10 5 ед.,

7 мин); 7 - нуклеазы (0.8 ед., 3 мин). 1 - контрольная инкубация (без катализатора).

Б) Фрагмент двуцепочечной ДНК инкубировали с: 2 - ДНКаэой 1 (0.01 нг, 10 мин); 3 - ГаЬ-фрагментом ДНК-абзимов (0.5 мкг, 4 ч.).

Таблица 3. Сравнительная характеристика ДНК-абзимов.

Характеристика ДНК-эбзикы ДНКаза I Микрококковая нуклеаза Нуклеаза Фосфодк-эсгераза I

Специфичность:

а)оцДНК* + + - + + +

б) дцДНК" + + + - —

Кофактор М^.Са2' М^'.Са2* Са2* 2л1*

Уходящая группа СКЗ-) О(З') 0(5-) ОСТ 0(3-)

Тип активности Эндо- Эндо- Эндо^ Эндо- Экзо-

Предполагаемая структура, Сахаро-фосфат- Малая бороздка Сахаро-фосфат- Сахаро-фосфат- 5'-концевой

обусловливающая связыва- ный остов двойной спирали иый остов ный остов фосфат

йте

* оцДНК _ одноцепочечлая ДНК.

• дцДНК - двухцепочечная ДНК.

деградации. Как 5'-, так и 3'-концевой участок низкомолекулярных субстратов, по-видимому, участвуют в процессе связывания, что свидетельствует о комплексном механизме и высокой степени комплементарности подобного взаимодействия. Вероятно, основной вклад в рассматриваемое взаимодействие вносит сахарофосфатный остов ДНК.

Гидролиз ДНК под действием моноклонального аутоантитела

BV04-01

Моноклональное аутоантитело BV04-01 было.получено в лаборатории Э. Восса от неиммунизированных мышей (NZB-NZW)Fl, развивающих спонтанный аутоиммунный ответ. BV04-01 специфично к оцДНК, причем предпочтительно связывает poly(dT) и poly(dG) последовательности. Данные кристаллографического исследования комплекса BV04-01 с его субстратом (cLT)3 показали, что антитело использует механизм индуцированного соответствия для оптимального размещения субстрата в связывающем центре. В описанной структуре центральное тиминовое основание размешалось в гидрофобном кармане, образованном TyrL32 и ТгрНЮОа с дополнительной стабилизацией за счет водородной связи с SerL91, а сахарофосфатный скелет был сильно изогнут за счет интеркаляции боковой цепи HlsL27d между вторым и третьим нуклеотидами. Вызванное за очет этих взаимодействий напряжение в структуре субстрата, а также близость His, описанного в структурах активных центров многих ферментов, к наиболее напряженной фосфодиэфирной связи, позволили предположить возможность наличия у этого . антитела гидролитической активности в отношении ДНК.

В данной работе был использован описанный р&нее экспрессиро-ванный вариант BY04-01 - одноцепьевое антитело SCA04-01, в котором вариабельные ¿омены легкой и тяжелой цепей соединены между собой пептидным линкером4 SCA04-01 было экспрессировано в Е. coll и очищенно на ДНК агарозе с последующей гель-фильтрацией. Полученное таким образом антитело было использовано для проверки возможности гидролиза ДНК под действием SCA04-01. В качестве субстратов для проверки способности SCA04-01 проявлять ДНК-ги'дролизующую активность были выбраны гомоолигонуклеотиды (<Ш14 и (dTU . Как

видно из рис. 10а, ЗСА04-01 действительно оказалось способным гидролизовать оцДНК, причем, несмотря на опубликованные ранее данные о специфичности этого антитела к ро1у(йТ) последовательностям, оба использованных олигонуклеотида гидролизовались под действием ЗСА04-01. Гидролиз требовал присутствия катиона, причем

ион в концентрации 1 мМ максимально способствовал катализу,

2 +

реакция протекала с меньшей скоростью в присутствии Са в той

же концентрации, а ион 2п2+ не был способен выступать в качестве

-4

медиатора гидроли: 1 и ингибировал реакцию с К1 = 8-10 М.

Хотя (йА)|4 ((1Т)15 гидролизовались под действием ЗСА04-01 с близкой эффекти: юстью, анализ характера деградации этих субстратов • под действ 2м 5СА04-01 показывает значительные различия паттернов гидроли I. Действительно, (йТ)^ гидролизовался преиму-

(А)

(б)

чпд>

» • е о Рис. 10. Гидролиз одноцепочечных

дезоксирибонуклеотидов в присутствии ЗСА04-01: (А) - Гидролиз гомоолиго-нуклеотидов <сШ15 (дорожка В) и V <£№^4 (дорожка Б). Дорожки А и С -^ контрольные инкубации соответствующих олигонуклеотидов (без добавления белка). ... (Б) Сравнение паттернов деградации олигонуклеотида А7С7АТАТАСШ;СТ7 в присутствии ЗСА04-01 (дорожка В), <■»*» нуклеазы Э1 (дорожка С) и микроко-* кковой нуклеазы (дорожка О. ф Дорожка А - контрольная инкубация. ш

щественно в районе 3'-конца, что хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа, так как именно вблизи этой области субстрата наблюдались максимальные структурные изменения и локализовался потенциально каталитически активный Н1бЬ27с1 . В то же время при гидролизе (ЛА>14 предпочтительными оказались сайты в центре молекулы субстрата. Такие различия в характере деградации могли быть связаны с различиями в механизме, связывания различных гомоолигонуклеотидов ЗСА04-01. Чтобы оценить возможное влияние структурных различий этих субстратов на характер их узнавания антителом, в лаборатории Э. Босса (США) были построены молекулярные модели активного центра антитела с субстратами и ионом При моделировании за основу были приняты данные рентгеноструктурного анализа ВУ04-01 в комплексе с <1Т)3. Согласно результатам такого моделирования для <с1Т>15, ион магния может размешаться вблизи расщепляемой связи и координироваться боковыми цепями Туг1.32, Н1зЬ27с1 и, возможно, Н1б1.93. При этом возможны дополни7е-льные изменения структуры связанного с антителом субстрата. В результате Мг-зависимыя катализ гидролиза ДНК под действием БСА04-01 может осуществляться посредством следующих механизмов:

1) Стабилизация расщепляемой связи в чувствительной к гидролизу конформации;

2) Координация ионом металла молекулы водыг которая может служить нуклеофилом в реакции гидролиза;

3) Стабилизадия отрицательного заряда на кислороде уходящей группы.

В то же время.предполагаемая конформация (йА)^, связанного в

активном центре антитела, значительно отличается от конформации

«1Т.15, что обусловлено различиями геометрии нуклеотидов. В

частности, позиция 3'-концевого основания оказывается значительно (

удаленной от каталитически активного центра. В связи с этим различия в характере деградации рассмотренных- субстратов оказываются вполне обьяснимыми.

Для характеризации обнаруженной каталитической активности ЗСА04-01 мы изучили деградацию модельного одноцепочечного олиго-нуклеотида А^АТАТАСССССТу под действием этого антитела в сравнении с микрококковой нуклеазой и нуклеазой . При дизайне олигонуклеотида мы учитывали ранее опубликованные данные о том,

что достаточную структурную информацию для связывания ВУ04-01 представляет гекеануклеотидная последовательность. Неожиданно оказалось, что гидролиз под действием ЗСА04-01 носит выраженный цитозин-специфичный характер (рис. 106). БСА04-01 выступает как Ме-зависимая эндонуклеаза и, аналогично Б1 нуклеазе, атакует 3* , 0-Р связь, но субстратная специфичность гидролиза под действием антитела носит уникальный характер. Причины столь выраженной предпочтительности гидролиза С-содержащей последовательности под действием ЗСА04-01 достаточно трудно объяснить ввиду опубликованных ранее данных о специфичности этого антитела к олиго(1Т). Возможной причиной здесь можно назвать ингибирование гидролиза тимин-богатых участков за счет высокой константы диссоциации комплексов продукт-антитело. В то же время цитозин, являясь, как и тимин, пиридиновым основанием, может принимать в связывающем центре антитела конформацию, чувствительную к эффективному гидролизу, а более низкие связывающие параметры ЭСА04-01 по отношению к олиго(с!С) облегчают диссоциацию комплекса антитело-продукт, что может обеспечить более высокое число оборотов биокатализатора.

Согласно опубликованным ранее данным, ВУ04-01 связывает оцДНК гораздо более эффективно, чем нативную, при этом энергия связывания ДНК антителом оказывается настолько высокой, что позволяет антителу при наличии короткой одноцепочечноя петли денатурировать прилегающий к ней двуцепочечный участок ДНК, увеличивая длину связанной антителом последовательности до 10 оснований. В связи с этим представлялось интересным оценить возможность гидролиза двуцепочечной ДНК под действием 5СА04-01. Как видно из рис. 11а, БСА04-01 оказалось способно вызывать релаксацию суперспирализова-нной плаэмидной ДНК, причем каталитические параметры реакции оказались достаточно высокими (Табл. 4). Сравнение характера деградации двуцепочечного фрагмента ДНК под действием 5СА04-01 и ДНКазы 1 I рис. 116) убедительно показывает, что данное антитело обладает уникальной субстратной специфичностью, причем (Х-богатые участки гидролизуются антителом предпочтительно. Эти данные позволяют предположить, что либо энергия.связывания ДНК антителом БСА04-01 настолько высока, что позволяет ему расплетать участки двуцепочечной ДНК (что кажется маловероятным ввиду предпочтительности СС-богатых участков для гидролиза), либо активный центр

антитела настолько динамичен, что позволяет антителу связываться (хоть и с пониженной аффинностью) с нативной ДНК. В любом случае, полученные данные наглядно демонстрируют необходимость многофакторного анализа при интерпретации данных кристаллографических исследований.

Как было показано выше, боковые цепи Н1з1.27с1 и Туг1.32 вовлечены в связывание. Щ,, вносят вклад в конформационные изменения молекулы лиганда при связывании антителом и наряду с Н1в93 могут участвовать в координации иона металла. Для проверки вовлеченности этих аминокислотных остатков в катализ, мы

Рис. 11. Гидролиз двуцепочечной ДНК

в присутствии ЗСА04-01:

(А) - Гидролиз суперспирализованной

плазмидной ДНК риС19 (2). 1 - инкубация

без добавления белка.

(Б) - Сравнение паттернов деградации

фрагмента двуцепочечной ДНК (96 пар

оснований) в присутствии 5СА04-01

(дорожка А) и ДНКазы 1 (дорожка В).

Дорожка С - сиквенс фрагмента (А+Т),

дорожка Д - контрольная инкубация.

(Б)

«■с*

4 *

т. ■ • * *

_ * * • » »

! * ?

Таблица 4. Кинетические параметры гидролиза суперспирализованной плазмидной ДНК риС19 в присутствии различных варианто» 5СА04-01.

БСА Уапат Км Кл

Ь32Туг/1_27(Л-П5 ОЛЯ) 2.5X10'М 1.3 X Ю'тт-' згхю'тт-'м-'

|_32РЬе/1_27с№ 6.0Х10'9М 1.1 X Ю^тт'1 1.8 X 10'тт'М'1

L32Ala/L27dH¡s 2.4 X 10'7М 1.0Х 10'тт"' 4.2 X Ю'гЫгг'М"1

|.32Туг/и27с1А1а 4.1Х10'М 4.9 X Ю^тт-' ^гХЮ'тт-'М-1

М

Т

f*

»1

.я

исследовали три полученных в лаборатории *Э. Босса мутантных антитела, в структуре которых.. были проведены следующие замены: Туг1.32-Р11е, Туг1.32-А1а, Н1б1.27<1-А1а. Результаты кинетического исследования гидролиза суперспирализованной плазмидной ДНК под действием этих мутантных антител приведенны в табл. 4. Замена тирозина на фенилаланин приводит к 10-кратному уменьшению Км, при этом пропорционально уменылаетвя Ккат. Более прочное связывание субстрата этим мутантом может быть вызвано увеличением гидрофобности активного центра антитела, а уменьшение числа оборотов биокатализатора является, очевидно, следствием увеличения аффинности антитела к продуктам реакции. Наоборот, замена тирозина на аланин вызывает 10-кратное ослабление связывающих параметров антитела вследствие нарушения вызванной стекинг-взаимодеиствием нуклеотида с ароматическим кольцом тирозина стабилизации субстрата в активном центре антитела, при этом каталитическая константа гидролиза также пропорционально возрастает. Эти данные демонстрируют важность баланса параметров связывания и катализа для повышения эффективности гидролиза. Следует отметить, что оба мутанта требовали более высокой по сравнению с исходным антителом концентрации иона что

указывает на участие Туг1.32 в координации металла. Наконец, замена Н151.27£1 на аланин приводила к значительному уменьшению каталитической константы гидролиза (3.7Ж от активности исходного антитела) без существенного изменения параметров связывания субстрата. Кроме того, оптимальная концентрация- для этого

мутанта возрастала в 10 раз. Таким образом, данный гистидин участвует как в катализе, так и в координации иона металла.

Приведенные данные позволяют охарактеризовать аутоантйтело ВУ04-01 как уникальная биокатализатор и предложить механизм обусловленного им гидролиза ДНК. Каталитические параметры реакции значительно превышают значения эффективности искусственных абзимов, при том что пока йе удалось искусственным путем получить антитела, катализирующие реакцию гидролиза ДНК. Зто позволяет рассматривать природные каталитические антитела как потенциальный источник эффективных терапевтических и ^иотехнологических агентов и 'вызывает значительней интерес к исследованиям в этой области.

ВЫВОДЫ

1. Предложена модифицированная схема очистки препаратов ДНК гидролизуюших аутоантител из сывороток крови, позволявшая быстро нарабатывать большие количества функционально активного биокатализатора.

2. Исследована субстратная специфичность поликлональных препаратов ДНК-гидролизуюших аутоантител.

- Показано отсутствие избирательности гидролиза по отношение к нуклеотидному составу ДНК.

- Установлено, что скорость гидролиза значительно возрастает при увеличении длины олигонуклеотидного субстрата от 6 до 14 основания. Обнаружено, что минимальным субстратом для ДНК-абзимов в физиологических условиях является гексануклеотид.

- Показано пр»»иипиал^жг& отличие1 характере детредада» ДОС 1»д действием ДНК-абзимов и ДНК-метаболизируюших ферментов. Продемонстрирование, что ДНК аутоантитела проявляют эндонуклеазную магния-зависимую активность и атакуют преимущественно 3' О-Р связь.

- Кинетический атал!»э гидро-лстга едт- » дв'уиетдач<Е?Ч!да# ДШ иод действием аутоантител и Fab, фрагмента показал высокие параметры связывания субстратов антителами и„ позволил охарактеризовать нативную ДНК как оптимальный субстрат для биокатализа под действием аутоантител.

- Совокупность полученных результатов позволила охарактеризовать аутоантитела к ДНК как уникальный по набору свойств и достаточно эффективный биокатализатор и указывает на первичную роль сахарофосфатного остова во взаимодействии полученных от больных СКВ препаратов каталитических аутоантител с ДНК.

3. Впервые охарактеризован гидролиз ДНК под действием моноклоиального аутоантитела к ДНК BV04-01. Показано, что антитело проявляет эндонуклеазные свойства, требует присутствия в реакции катионов М^* или Са2+ и эффективно гидролизует как одноцепочечную, так и двуцепочечную ДНК с выраженным предпочтением к цитозин-содержашим участкам. Путем компьютерного моделирования и сайт-направленного мутагенеза выявлена определяющая роль HlsL27d и TyrL32 в катализе.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. G. V. Gololobov, R. P. Yadav, А. Е. Bogomolova, К. М. Belostotskaya, Б. V. Schourov ь A. G. Gabibov. Natural DNA ab2ymes from sera of parients with systemic lupus erythematosus.

1993. Ind. J-. Chem. 32B: 81-84.

2. Щуров Д.В., Макаревич О.И., Лопаева- O.A., Бунева В.А., Невинский Г.А., Габибов А.Г. Взаимодействие ДНК-гидролизующих аутоантител с олигонуклеотидными субстратами. 1994. Докл. Акад. Наук 337, 407-411.

3. Gabibov A:G., Gololobov G.Y., Makarevich O.I., Schourov D.Y., Chernova E.A., Yadav E.P. DNA-Hydrolyzlng Autoantibodies. 1994. Appl. Biochem. Biotechnol. 47, 293-303.

4. Schourov D.V., Makarevich 0.1., Gabibov A.G. Specificity of DNA-hydrolyzing antibodies. Abstracts of 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Mew Dehli, India.

1994. Vol. 3, p. 21.

5. Gololobov G.V., Chernova E.A., Schourov D.Y., Kudelina I.A., Smirnov I.V., Gabibov A.G. Cleavage of supercolled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: Application of the flow linear dichro^ ism technique. 1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 254-257.

6. Schourov D.V.Gololobov G.V., Makarevich 0.1., Yadav E.P., Chernova E.A., Nevlnsky G.A., Prokaeva T.B., Alekberova Z.S., Gabibov A.jG.: DNA-hydrolyzing autoantibodies in autoimmune pathologies. 1995. Ann.N-Y.Acad.Sei. 750, 255-264.

7. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Kolesnlkov A.V., 'Schourov D.V., Kozyr A.V., Shuster A.M. DNA hydrolyzing antibodies. 1995. AIDS Kes. Hum. Retroviruses 11: S91.

8. Gabibov A.G., Kozyr A.V., Kolesnlkov A.V., Schourov D.V., Makarevich 0.1. Hydrolysis of DNA by autoantibodies. Abstracts of 23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Basel, Switzerland. 1995. p. 136.

9. Gololobov G.V., Rumbley C.A., Rumbley J.N., Schourov D.V., Makarevich O.I., Gabibov A.G., Voss E.W., Rodkey L.S. DNA hydrolysis by BV04-01 monoclonal 'autoantibody: origin of catalytic activity. J. Biol. Chem., submitted for publication.