Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональных свойств аутоантител к ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козырь, Арина Владимировна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.123

КОЗЫРЬ Арина Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АУТОАНТИТЕЛ К ДНК

(03.00.03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель проф., д.х.н. А.Г. Габибов

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................4

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................5

1.1. Развитие представлений об аутоиммунности

и современные исследования аутоантител...........................................................5

1.1.1. История исследований аутоиммунности..........................................................5

1.1.2. Роль аутоантител при аутоиммунных патологиях...............................................9

1.1.3. Природные аутоантитела: специфичность, происхождение, генетические данные....15

1.2. Аутоантитела к ДНК..................................................................................19

1.2.1. Механизмы образования антител к ДНК.........................................................19

1.2.2. Специфичность антител к ДНК....................................................................23

1.2.3. Аутоантитела к В-ДНК и одноцепочечной ДНК................................................27

1.3. Природные каталитические антитела...........................................................33

1.4. Аутонтитела при лимфопролиферативных заболеваниях.................................43

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................46

2.1. Материалы...............................................................................................46

2.2. Методы....................................................................................................47

2.2.1. Выделение и очистка фрагментов иммуноглобулинов в.....................................47

2.2.2. Разделение БаЬ и Бс фрагментов иммуноглобулинов 0.......................................48

2.2.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание полиакриламидных гелей...................................................................................49

2.2.4. Иммуноблот............................................................................................50

2.2.5. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК.....................................51

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК.......................................................................51

2.2.7. Электрофорез в агарозном геле.....................................................................52

2.2.8. Анализ препаратов антител на связывание ДНК и определение константы связывания ДНК с антителами............................................................................................53

2.2.9. Анализ ассоциированности ДНК-гидролизующей активности с антителами методом аффинной сорбции...........................................................................................54

2.2.10. Выделение ядерного матрикса и приготовление аффинного сорбента на основе белков ядерного матрикса..................................................................................55

2.2.11. Культура эукариотических клеток и анализ цитотоксического эффекта антител.....57

2.2.12. Анализ цитоплазматической фракции клеток на наличие фрагментов ДНК...........58

2.2.13. Анализ проникновения антител в клетку флюоресцентной микроскопией............59

2.2.14. Выделение мембранных белков и анализ кросс-реактивности ДНК-гидролизующих

антител с мембранными белками и белками ядерного матрикса...................................60

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................61

3.1. Разработка методики выделения каталитических аутоантител к ДНК и связь ДНК-гидролизующей акивности с РаЬ-фрагментом антител...............................................61

3.2. Определение константы связывания ДНК-гидролизующих антител с ДНК...............68

3.3. Метод аффинной сорбции для определения ДНК-гидролизующей активности антител и распределение ДНК-гидролизующих антител в сыворотках крови больных системной красной волчанкой (СКВ) и лимфопролиферативными заболеваниями..........................72

3.4. Взаимодействие ДНК-гидролизующих антител с белками ядерного матрикса............78

3.5 Цитотоксический эффект аутоантител к ДНК......................................................82

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ........................................................................................97

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.................................................................98

ВВЕДЕНИЕ

Исследования последних десятилетий значительно расширили представления молекулярных биологов и медиков о свойствах аутоантител. Возникновение этих антител, обладающих способностью связывать собственные антигены организма, как правило, сопряжено с развитием целого ряда тяжелейших заболеваний, получивших название аутоиммунных. Громадное количество проведенных исследований позволило точно установить связь появления аутоантител с развитием аутоиммунных заболеваний, а в ряде случаев установить и механизмы их участия в патологическом процессе.

Примечательно, что аутоантитела обнаруживаются не только при заболеваниях чисто аутоиммунной природы. Повышенный уровень аутоантител наблюдается при ряде лимфопролиферативных заболеваний, а также заболеваниях инфекционной природы (СПИД, гепатиты), и в этом случае они, безусловно, также вносят свой вклад в развитие патологического процесса. Поскольку особенностями большинства лимфопролиферативных заболеваний в той или иной мере являются нарушения нормальной работы иммунной системы, появление повышенного уровня аутоантител при этих заболеваниях вполне обосновано, однако конкретные причины, вызывающие сопряженный с лимфопролиферацией аутоиммунный процесс, еще не выяснены и требуют дальнейших исследований. Изучение свойств аутоантител и выявление их роли при различных лимфопролиферативных процессах открывают широкие перспективы для установления этих причин и могут внести свой вклад в разработку подходов к диагностике и терапии опухолей крови. С другой стороны, данные о развитии аутоиммунных процессов, причинах образования и свойствах аутоантител помогают понять базовые механизмы функционирования здоровой иммунной системы и ее влияние на работу других систем организма.

Огромное количество новых данных появилось в последние годы о ранее не обнаруженных свойствах аутоантител. Было выяснено, что некоторые природные аутоантитела способны проявлять каталитические функции по отношению к различным субстратам, таким образом, они как могут быть задействованы в деградации продуктов распада клеток при патологическом процессе, так и наносить серьезный вред живым клеткам и тканям, провоцируя патологические изменения. В частности, ряд работ, посвященных цитотоксичности аутоантител к ДНК, позволяет высказать предположение о их гораздо большем, чем предполагалось ранее, значении в развитии патологического процесса. В этом плане крайне любопытны исследования, показавшие возможность проникновения антител к ДНК в клетку с последующей локализацией в клеточном ядре. Эти данные дают возможность строить гипотезы о потенциальной роли аутоантител в регуляции жизнедеятельности живых клеток.

Все эти ранее не отмеченные свойства аутоантител требуют тщательного дальнейшего изучения, поскольку они могут иметь значение не только в плане фундаментальных научных исследований, но и найти широкое применение как в клинической диагностике аутоиммунных заболеваний и заболеваний, сопряженных с аутоиммуными нарушениями, в частности, многих опухолей крови, так и в разработке новых подходов к их терапии.

Предметом данной работы является обнаружение и исследование каталитических и цитотоксических свойств аутоантител к ДНК при лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваниях, поиск потенциальных антигенов, вызывающих их образование, и механизмов патогенности, и разработка методов быстрого скрининга и детекции каталитических антител к ДНК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОБ АУТОИММУННОСТИ И СОВРЕМЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АУТОАНТИТЕЛ

1.1.1. История исследований аутоиммунности

Исследования аутоиммунности начались практически одновременно с формированием науки иммунологии на рубеже Х1Х-ХХ веков. После того, как в 1899 году Жюль Борде обнаружил, что антитела к эритроцитам могут вызывать их разрушение в присутствии неспецифически действующих факторов комплемента сыворотки [1], возникло предположение, что ткани и клетки иммунизированого организма могут повреждаться анителами, вырабатывающимися к ним "побочно" при иммунном ответе. Сам термин "аутоиммунность" был введен в науку в 1900 году Полом Эрлихом [2] для обозначения особого типа иммунной реакции организма, при которой происходит выработка антител к его собственным антигенам. По мнению П.Эрлиха, аутоиммунный процесс мог иметь фатальные последствия для организма. Однако, быстро было выяснено, что появление аутоантител в здоровом организме достаточно редкое явление. Тем не менее, сформулированная П.Эрлихом догма о том, что организм не способен развивать иммунный ответ на собственные антигены существовала недолго. Вскоре было выяснено, что аутоантитела могут играть существенную роль при различных патологиях, образуясь как в результате собственно аутоиимунного процесса, так и на фоне других заболеваний, например, таких как сифилис и симпатетическая офтальмия. Наконец, в 1904 году Дональд и Ландштейнер опубликовали первое описание истинного аутоиммунного заболевания -пароксизмальной холодовой гемоглобинурии [3].

В начале XX века долго дебатировался вопрос о возможности органоспецифической аутоиммунизации. В 1933 году появилось сообщение о развитии острого энцефаломиелита у обезьян, иммунизированных чужеродной нервной тканью [4]. Однако, несмотря и на последующие данные о том, что иммунизация обезьян тканями обезьяньего мозга вызывает у животных экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) [5], органоспецифическая аутоиммунизация не получила общего признания, поскольку не была обнаружена связь между аутоантителами к ткани мозга и энцефаломиелитом. Энцефаломиелит не рассматривался как аутоиммунное заболевание, так как аутоантитела при нем не обнаруживались. Лишь появившиеся в 1942 данные о переносе гиперчувствительности замедленного типа лимфоцитами [6] помогли установить, что в данном случае в аутоиммунном ответе ключевая роль принадлежала Т-лимфоцитам.

Большой вклад в развитие представлений об аутоиммунности был внесен в 1956 году работой Эрнеста Витебски и Ноэля Роуз, обнаруживших, что кролики, иммунизированные кроличьим тиреоглобулином, не только имели поражения щитовидной железы, подобные тироидиту человека, но и продуцировали антитела к тиреоглобулину [7]. Вскоре были обнаружены антитиреоглобулиновые антитела и при тироидите человека [8].

Во время второй мировой войны остро встал вопрос об обеспечении безопасности для организма пациента при переливании крови. Дело в том, что довольно часто при гемотрансфузии с донорской кровью привносились аллоантитела, вызывавшие у реципиента гемолитические реакции. В 1945 году Кумбсом был разработан тест, позволявший детектировать антитела к эритроцитам, не вызывавшие лизиса клеток [9]. Позже было показано, что этот тест может быть использован и для диагностики гемолитической анемии [10].

Впервые патогенная роль аутоантител, образующихся при аутоиммунном процессе была установлена в отважном эксперименте Уильяма Харрингтона. Исследователь сделал себе инъекцию плазмы крови пациента с аутоиммунной тромбоцитопенией. Это быстро

привело к критическому падению в крови уровня тромбоцитов, и экспериментатор покрылся пурпурой. Однако, никаких повреждений мегакариоцитов в костном мозге обнаружено не было, и через неделю уровень тромбоцитов также пришел в норму. Таким образом, было однозначно показано, что аутоантитела способны вызвать заболевание [11].

Несмотря на весь обширный объем накопленной информации, в течение долгого времени в медицинских кругах аутоиммунные заболевания не имели самостоятельного статуса, а к секретирующимся при них аутоантителам применялись термины "факторы" или "субстанции". Два серьезнейших системных аутоиммунных заболевания - ревматоидный артрит и системная красная волчанка классифицировались как заболевания соединительной ткани или коллагенозы, несмотря на доказанное наличие при ревматоидном артрите аутоантител к тяжелым цепям иммуноглобулинов в (ревматоидного фактора) и аутоантител к ДНК при системной красной волчанке [12]. Лишь с созданием в 1959 году первой животной модели аутоиммунного заболевания - новозейландских черных мышей (ЖВ) открылись возможности для разработки экспериментальных подходов к изучению аутоиммунности [13]. Для мышей линии характерно лишь одно аутоиммунное

нарушение - аутоиммуная гемолитическая анемия, но дальнейшие исследования показали, что при скрещивании их с другой линией мышей - новозейландскими белыми у потомства возникало тяжелое заболевание с симптомами нефрита, развивающегося у человека при волчанке [14]. Стало очевидно, что не только аутоиммунизация, но и конкретные аутоиммунные нарушения генетически обоснованы.

Основной причиной, задержавшей исследования в области аутоиммунности было отсутствие теории, способной объяснить подавление аутоиммунных процессов в здоровом организме. В 1957 году эта теория была выдвинута в работах МакФарлейна Бернета. На основе своих экспериментов он сформулировал понятие иммунотолерантности и предположил, что на ранних стадиях развития в тимусе происходит отбор и уничтожение клонов лимфоцитов несущих рецепторы к аутоантигенам, таким образом, аутоантитела

способны продуцироваться клонами, по каким-либо причинам избежавшими этой участи [15]. С момента опубликования работы Бернета до настоящего момента эта теория много раз пересматривалась и дополнялась, но и по сей день она лежит в основе всех исследований иммунотолерантности и аутоиммунности.

С начала шестидесятых годов постоянно увеличивается количество экспериментальных работ в области исследования аутоиммунности. Совершенствуются экспериментальные модели и подходы, и возможно, что в начале следующего тысячелетия исследователи вплотную подойдут к полному раскрытию молекулярных основ сложнейших природных механизмов иммунотолерантности и его нарушений, результатом которых являются аутоиммунные заболевания.

1.1.2. Роль аутоантител при аутоиммунных патологиях

Аутоиммуные заболевания наряду с онкологическими и сердечно-сосудистыми входят в число основных медицинских проблем современного индустриального общества. Только в США ежегодно регистрируется 6.5 миллионов случаев ревматоидного артрита. Аутоиммунный диабет типа I поражает 0.2-0.5% населения [16]. В большинстве случаев аутоиммунные заболевания приводят к нетрудоспособности и часто становятся причиной смерти.

Природа аутоиммунных заболеваний, особенно в последние десятилетия, активно исследуется во многих мировых лабораториях. В качестве факторов, влияющих на их возникновение, называются и бактериальные и вирусные инфекции, и наследственная предрасположенность, и гормональный статус организма, и климатические условия местности [12, 17]. Однако, несмотря на огромное количество молекулярно-биологических данных и клинических наблюдений пока не удалось составить полную и однозначную картину механизма нарушений, лежащих в основе аутоиммунного заболевания.

Тем не менее, большинство проведенных исследований доказывает, что в основе развития аутоиммунного процесса начинается с нарушения базовых механизмов иммунотолерантности, что приводит к выработке в организме повышенного количества антител к собственным антигенам, т.е. так называемых аутоантител [12, 18, 19].

К сожалению, наличие аутоантител в крови больного аутоиммунным заболеванием не является только диагностическим критерием. Аутоантитела могут вносить свой вклад в развитие патологического процесса и способствать неблагоприятному прогнозу заболевания. Дело в том, что аутоантитела способны связывать широкий спектр существующих в организме антигенов различной химической природы от ДНК и мембранных белков до фосфолипидов и гепарина [12, 20, 21]. Для них характерна повышенная перекрестная специфичность (полиреактивность), таким образом, одно антитело часто может взаимодействовать с несколькими различными антигенами и другими антителами [12, 22-25]. Эта особенность аутоантител и является причиной их патогенности. Например, связываясь друг с другом аутоантитела образуют крупные белковые комплексы, которые накапливаются и вызывают воспалительные процессы в почечных гломерулах, приводящие к их разрушению. Развивающаяся в результате почечная недостаточность -наиболее типичная причина смерти больных системной красной волчанкой [19].

Аутоантитела, направленные против таких мишеней на клеточной поверхности, как молекулы рецепторов, явно патогенны. В частности, при миастении (Myastenia gravis) обнаруживается большое количество аутоантител к рецептору ацетилхолина [26, 27]. Рецепторы ацетилхолина находятся на краях складок постсинаптических мембран волокон скелетной мускулатуры. Они связывают выделяемый нервными окончаниями ацетилхолин, при этом открываются катион-спе