Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аутоантитела к РНК в сыворотке крови опухоленосителей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутоантитела к РНК в сыворотке крови опухоленосителей"

На правах рукописи

Зайнуллина Альфия Салиховна

С Л

'ГО"»

i —; •

Аутоангитела к РНК в сыворотке крови опухоленосителей

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань -1998

Работа выполнена в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Винтер В.Г. доктор биологических наук, профессор Ишмухаметова Д.Г.

Официальные оппоненты: академик АН РТ, доктор

медицинских наук, профессор Зубаиров Д.М. кандидат биологических наук, врач-лаборант I категории Нехорошкова З.М.

Ведущая организация: Казанская государственная

Медицинская Академия, г. Казань

Защита диссертации состоится г. в _ ч. на

заседании диссертационного Совета К053.29.19 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан "сло/г-* 1998 г. Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук / ^

Аскарова А.Н.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи опухолевого процесса и аутоиммунного состояния организма в последние годы привлекает все больше внимания. В литературе имеются сведения о более высокой частоте возникновения злокачественных опухолей у больных с аутоиммунными патологиями (Ivorra et al., 1991; Flippo et al., 1993; Falcini et al., 1993). С другой стороны имеются данные о появлении признаков аутоиммунного состояния у пациентов, страдающих различными онкологическими заболеваниями (Peller, Kaufman, 1991; Dropho, King, 1994). Аутоиммунное состояние у онкологических больных может быть вызвано деструктивными процессами, происходящими в организме опухоленосителей (Меклер, 1978; Wortman et al., 1975) или выделением опухолевыми клетками биологически активных соединений.

Известно, что опухолевые клетки в интактном состоянии выделяют в окружающую среду множество различных биологически активных веществ, в том числе и РНК (Винтер, 1968; Stroun et al., 1978). Внеклеточная РНК обнаруживается в сыворотке крови опухоленосителей (Funaki et al., 1998; Occonnell et al., 1998), причем уровень ее содержания, как правило, превышает норму (Funaki et al., 1998; Блинов и др., 1987).

Однако, многие аспекты участия РНК и аутоантител (ААТ) к РНК в иммунологических взаимоотношениях опухоли и организма практически не изучены. В настоящее время изучение этих вопросов может способствовать ранней диагностике онкологических заболеваний и выяснению взаимосвязи опухолевого роста с аутоиммунным состоянием. Поэтому представляется актуальным необходимость исследования РНК-антигена как индуктора ААТ и содержания ААТ к РНК в сыворотке крови в норме и при опухолевом росте.

Целью настоящей работы явилось исследование содержания РНК и ААТ к РНК в сыворотке крови экспериментальных животных и онкологических больных.

Были поставлены следующие задачи:

1) Исследование динамики секреции РНК из опухолевых клеток.

2) Анализ содержания РНК в сыворотке крови у экспериментальных крыс в норме и при развитии опухоли.

' 3) Исследование содержания РНК в сыворотке крови у здоровых людей и у онкологических больных.

4) Разработка тест-системы на основе иммуноферменгаого анализа для определения ААТ к РНК.

5) Определение содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых лиц и онкологических больных.

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей и при различных аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваниях.

На основе анализа содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей дана характеристика порогового уровня содержания ААТ к РНК у здоровых лиц разных возрастных групп.

Обнаружено, что в сыворотке крови у пациентов со злокачественными опухолями уровень содержания РНК (у 71% больных) и ААТ к РНК (у 85% больных) выше по сравнению с ее содержанием в сыворотке крови здоровых лиц.

Выявлена корреляция между изменением уровня содержания РНК в сыворотке крови и стадиями развития опухоли Эр лиха у экспериментальных крыс.

Получены данные указывающие на возможность участия РНК, выделяемой опухолевыми клетками, в возникновении аутоиммунных симптомов у онкологических больных.

Практическая значимость. В результате проведенных нами исследований была разработана тест-система на основе иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания ААТ к РНК в сыворотке крови человека. Разработанная тест-система была апробирована при массовом обследовании больных в ЛПУ г. Казани: городской инфекционной больнице №1, терапевтическом отделении Медицинской академии, детской городской клинической больнице №1, Республиканском онкологическом центре МЗ РТ.

При помощи данной тест-системы нами были установлены пороговые значения уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей различных возрастных групп.

Полученные данные о повышении уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови у онкологических больных являются предпосылкой для применения тест-системы по выявлению лиц с повышенной вероятностью развития опухоли.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в докладах на итоговых научных конференциях КГУ (1992, 1995, 1997), XVIII конференции ФЕБО (Базель, Швейцария, 1995), III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1997), научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 1998).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 170 страницах, содержит 13 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 231 наименований, из которых 68 отечественных и 163 иностранных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные и штамм опухолей. В качестве перевивной опухолевой линии был использован тетраплоидный штамм асцитной опухоли Эр лиха (АОЭ), (отдел клеточных культур Всероссийского Онкологического Научного Центра, г. Москва). В работе использовали 90 беспородных белых крыс весом 120 - 150 г и около 300 белых беспородных мышей весом 18 - 20 г из питомников «Крюково» и «Столбовая» Московской области.

Онкологические больные и здоровые доноры. В работе были использованы сыворотки крови 258 пациентов республиканского онкологического центра и 51 больных с лейкозами из гематологического отделения больницы № 5, сыворотки крови 45 больных аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) терапевтического отделения клиники Казанской Государственной Медицинской Академии, 84 больных рожей из инфекционной больницы №1 г. Казани. Анализированы сыворотки крови 201 здорового человека без клинических симптомов аутоиммунных и онкологических заболеваний (из донорских пунктов КНИИЭМ и Казанской СПК, из родильного дома №1 и детской клинической больницы №1 г. Казани).

Выделение и очистка РНК из асцитной жидкости и плазмы крови. Асциггную жидкость собирали шприцом из брюшной полости мышей на 7-е сутки после перевивки опухоли Эрлиха. Опухолевые клетки из асцита удаляли центрифугированием. РНК из бесклеточной асцитной жидкости выделяли фенольно-детергенгаым методом по Кирби с некоторыми модификациями (Roberts, 1965). Количество РНК определяли флуоресцентным методом с бромистым этидием (БЭ) (Le Pecq, Paoletti, 1968).

Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию 0,1% -ным раствором трипанового синего (Адаме, 1983). Гибель клеток, при культивировании опухолевых клеток in vitro, контролировали по

присутствию в культуралыгой среде внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Cook, Mitchell, 1989).

Исследование секреции РНК при инкубации опухолевых клеток in vitro. Предварительно меченые С14-уридином опухолевые клетки переносили в среду без метки. Через определенные промежутки времени отбирали по 3-5 мл пробы, после удаления из них клеток фильтрованием, к пробе культуралыюй жидкости добавляли дрожжевую РНК (1 мкг/мл) для соосаждения С|4-РНК. РНК из пробы осаждали 15% раствором ТХУ на фильтрах из стекловолокна и просчитывали радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Mark П (Nuclear Chicago, USA).

Аутоантитела к РНК определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на полистироловых планшетах НПО «Полимед» (г. Санкт-Петербург). В качестве антигена использовали суммарную дрожжевую РНК (НПО «Вектор» НИКТИ БАВ, г. Новосибирск). Для выявления ААТ использовали меченые пероксидазой диагностические антитела против иммуноглобулинов человека (г. Москва). Оптическую плотность (ОП) реакционной смеси измеряли при длине волны 492 нм (ОП492) на приборе «Мультискан» («Flow», Англия). Результаты выражали в относительных единицах (отн. ед.) как соотношение ОП исследуемой сыворотки к ОП стандартной сыворотки. Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятым методам (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Определение содержания РНК в сыворотке крови

опухоленосителей Анализ содержания РНК в сыворотке крови онкологических больных и здоровых доноров показал, что у большинства (71%) пациентов со злокачественными опухолями обнаруживается повышенное содержание РНК. Это различие наиболее четко выявляется

у больных со злокачественными опухолями II стадии, с тенденцией к снижению в III и IV стадиях (табл. 1).

Более четкую картину изменения содержания РНК в сыворотке крови по стадиям развития опухоли нам удалось выявить в экспериментах по гетеротрансплшгтации мышиной асцитной опухоли Эр лиха (АОЭ) крысам. Этот методический прием удобен тем, что за относительно короткий срок позволяет проследить все стадии развития и регрессии опухоли.

Нами обнаружено, что количество РНК в плазме крови крыс с АОЭ начинает увеличиваться на 2-ой день после перевивки опухоли, и возрастает в период интенсивной пролиферации опухолевых клеток, о

Таблица 1.

Содержание РНК в сыворотке крови онкологических больных и

здоровых лиц

Диагноз РНК (мкг/мл) Количество человек

Рак шейки матки 9,46±1,18' 20

РМЖ 8,98 ±0,88' 35

Рак легких 10,17 ±0,47' 20

Рак кожи 9,32 ±1,20* 9

Рак пищевода 13,19 ±1,40' 7

РЩЖ 8,38 ±0,98" 4

I 8,84 ±1,09 н 21

II 11,33 ±1,31' 33

Ш 9,40 ±1,27' 40

IV 5,40 ±1,17' 26

Здоровые доноры 7,45 ±0,07 26

I, П, Ш, IV- стадии развития злокачественных опухолей; РМЖ-рак молочной железы; РЩЖ- рак щитовидной железы Различие по сравнению с нормой достоверно: * - при Р < 0,01; ** - при Р < 0,05 ;н - различие не достоверно.

чем свидетельствует высокий митотический индекс (МИ=0,200). Далее с уменьшением МИ до 0,004 содержание РНК в плазме крови крыс с опухолью снижается до уровня ее содержания в плазме крови контрольных крыс. На 7-8 день после перевивки опухоль останавливается в росте (МИ=0), а затем постепенно полностью рассасывается. Содержание РНК в плазме крови контрольных крыс оставалось неизменной на протяжении всего эксперимента. Это означает, что повышение уровня содержания РНК в плазме крови коррелирует со стадиями роста опухоли (рис. 1).

(.2. Динамика выхода РНК из клеток АОЭ в культур алыгую среду

Рис. 1 Изменение содержания РЖ в плазме крови крыс при развитии и регрессии АОЭ По горизонтали: дни после перевивки опухоли, по вертикали: содержание РНК в плазме крови (отн.ед./мл)

□ митотический индекс £ ■ контрольная группа крыс

* ♦ крысы с опухолью Эрлиха

Мы предположили, что повышение содержания РНК в плазме

крови у опухоленосителей, может быть связана с секрецией РНК

опухолевыми клетками. Нами исследована секреция РНК в опытах т

vitro по выходу меченой РНК из опухолевых клеток, предварительно инкубированных в среде с 14С-уридином.

Через 20 минут инкубации клеток АОЭ в культуральной среде, при высокой жизнеспособности клеток, обнаруживается меченая С14-РНК (табл.3). После достижения определенного уровня,содержание С14-РНК в среде стабилизируется. Дальнейшая инкубация клеток не приводит к изменению количества С14-РНК в среде, что косвенно указывает на возможность регуляции секреции внеклеточной РНК.

Нами обнаружено, что радиоактивность РНК, секрегтируемой предварительно мечеными опухолевыми клетками, при инкубации их в культуральной среде с добавлением асцигной РНК (5 мкг/мл) значительно ниже (120£9 имп/мин), чем в контрольной, без добавления РНК (270±11 имп/мин). Снижение секреции РНК из опухолевых клеток при инкубировании их в среде с добавлением РНК свидетельствуют о наличии обратной связи между выходом РНК из опухолевых клеток и ее концентрацией в среде.

Таблица 3

Секреция РНК при инкубации клеток АОЭ in vitro

Время инкубации (мин) Радиоактивность РНК в среде (имп/мин) Жизнеспособность клеток (%)

20 200±10 98,0

40 340±20 97,0

60 450±37 97,0

80 400±31 96,5

100 380±35 97,0

120 380±37 96,5

140 390±40 97,0

160 390±38 96,5

180 400±34 96,0

Нами было сделано предположение, что РНК, активно секретируемая опухолевыми клетками, попадая в кровоток, может индуцировать синтез ААТ к РНК у опухоленосителей.

1.3. Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови человека 1.3.1. Разработка тест-системы на основе ИФА для определения ААТ к РНК в сыворотке крови человека

Существующие методы определения ААТ к РЖ малопригодны для проведения массовых клинических исследований. Ограничением метода ИФА на полистироловых планшетах является низкая способность РЖ к сорбции на твердую фазу. Для увеличения сорбции антигена (АГ) на планшет имеются примеры использования УФ-облучения (гоиаН, Б^Наг, 1986). Сорбция РЖ на планшет с использованием УФ-облучения в литературе не описана. Нами были разработаны условия облучения планшета с раствором РЖ, которые позволяют увеличить интенсивность ИФА, и одновременно уменьшить разброс данных, что видно по снижению коэффициента вариации (С,) (табл.4). Оптимальным временем облучения является УФ-обработка планшета с раствором РЖ в течение 10 минут.

Связывание АГ с планшетом зависит от ионной силы и рН буфера. Исследование. различных буферов в диапазоне рН от 4,5 до 10,0 показало, что наилучшая иммобилизация РЖ на планшет наблюдается при использовании цитратного буфера со значениями рН» 4,5-5,5 (табл. 5). На стабильность и воспроизводимость результатов ИФА влияет также концентрация АГ. Оптимальной для сорбции РЖ является концентрация 100 мкг/мл.

Характерным свойством ААТ к нуклеиновым кислотам является их полиспецифичность. Нами исследована специфичность ААТ к РЖ методом истощения сыворотки крови различными АГ (нДЖ, дДЖ и РЖ). Наибольший процент истощения ААТ к РЖ наблюдается при использовании родственного РЖ-АГ (до 59% истощения), в

Таблица 4

Интенсивность цветной реакции ИФА и значения коэффициента вариации (Су, %) в зависимости от времени Уф облучения

Время Облучение Уф светом Контроль - без УФ -

облучения Интенсивность Су, облучения

(в минутах) реакции ИФА % Интенсивность Су,%

(оп. ед.) реакции ИФА

(оп. ед.)

1 100±13 10,73 80±14 16,00

2 110±10 11,00 100±18 15,00

5 320±40 7,00 120±20 16,20

10 510±12 2,20 100±17 14,92

15 500±15 3,53 94±16 14,50

20 510±20 3,70 110±18 14,25

30 490±13 2,51 140±20 14,63

45 500±14 3,40 160±25 15,00

60 520±17 3,90 170±31 15,40

отличие от нДНК и дДНК (29% и 33%) соответственно. Эти результаты указывают на то, что ААТ к РНК в сыворотке крови являются гетерогенными и представлены различными популяциями: среди них есть кроме ААТ взаимодействующих только с РНК, так и небольшое количество ААТ перекрестно взаимодействующих с ДНК

1.3.2. Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей

и онкологических больных Нами проанализировано содержание ААТ к РНК в сыворотке крови 207 онкобольных и 201 здорового человека Индивидуальные уровни содержания ААТ к РЖ в сыворотке крови у отдельных лиц в группе онкобольных колеблются от 0,3 до 2,0 отн.ед. В то время как у здоровых людей эти значения варьируют в диапазоне 0,1-0,8 отн. ед.

Таблица 5

Влияние рН и состава буфера на интенсивность цветной реакции ИФА (оп.ед.)

Название буфера рН Оп. ед. СУ(%)

Ацетатно- 4>5 , 0,831±_0,005 0,65

аммонийный 5,0 0,711± 0,000 0,01

буфер 5,5 0,811±_0,016 1,44

Фосфатный буфер 5,5 0,842± 0,036 3,82

6,0 0,839± 0,038 4,00

6,5 0,519± 0,060 1,08

7,0 0,505± 0,088 1,25

7,5 0,178± 0,010 3,00

8,0 0,200± 0,010 8,90

Трис - НС1 буфер 7,0 0,810± 0,006 0,73

7,5 0,604± 0,010 2,00

8,0 0,165± 0,007 2,80

8,5 0,256± 0,030 9,00

9,0 0,669± 0,020 3,50

Карбонат - 9,0 0,235± 0,030 8,00

бикарбонатный 9,5 0,286± 0,010 5,30

буфер 10,0 0,667± 0,040 4,30

Цитратный буфер 4,5 0,976± 0,030 2,50

5,0 1,030± 0,030 2,90

5,5 1,000± 0,040 3,00

6,0 0,940± 0,070 5,50

6,5 0,862± 0,002 0,01

7,0 0,265±0,020 9,00

7,5 0,758± 0,050 6,21

Таблица 6

Вариации уровня ААТ к РНК в сыворотке крови онкологических больных и здоровых людей

Уровень содержания ААТ к РНК (отн.ед.) Частота встречаемости (%)

онкобольные здоровые

0,1-0,2 - 8,25

0,2-0,4 - 50,52

0,4-0,6 18,87 29,90

0,6-0,7 43,30 6,18

0,7-0,9 31,41 5,00

0,9 и выше 10,41

Таблица 7

Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови онкологических больных в зависимости от типа злокачественной опухоли

Заболевание количество человек ААТкРНК (отн. ед.)

рак молочной железы 38 0,67±0,01*

рак легких 37 0,69±0,03*

рак щитовидной железы 10 0,71 ±0,05*

рак желудочно-кишечного тракта 26 0,70±0,05*

лейкозы 51 0,36±0,04н

Злокачественные опухоли Стадии развития П 18 0,59±0,02*

Ш 13 0,74±0,05*

IV 11 0,66±0,04*

Среднее по группам АИЗ 45 1,27±0,10"

Онкобольные 207 0,69±0,05*

здоровые доноры 201 0,36±0,01

Различие по сравнению с нормой достоверно:* - при Р < 0,01; " - при Р < 0,05; " - различие не достоверно У большинства обследованных пациентов (75%) уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови находится в диапазоне 0,5-0,9 отн. ед. У здоровых людей уровень содержания ААТ к РНК в 80% случаев находится в пределах 0,2-0,6 отн. ед. (табл. 6).

В сыворотке крови онкобольных при большинстве исследованных форм злокачественных опухолей наблюдается, как и при АИЗ, повышенный уровень содержания ААТ к РНК (табл.7). Исключение составляет группа больных с лимфопролиферативными заболеваниями. У этих пациентов уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови не превышает порогового значения нормы, а в случае хронического лимфолейкоза даже значительно ниже этого значения (0,28±0,04). Поскольку при лейкозах поражаются компоненты иммунной системы, то это может быть вероятной причиной общего снижения иммунного ответа и выработки ААТ. Уровень содержания ААТ также зависит и от стадии развития опухоли. Как видно из данных табл. 7, повышение уровня содержания ААТ к РНК наблюдается в III стадии развития опухоли (0,74±0,05), с тенденцией к понижению в IV стадии (0,66±0,04). Среднее значение уровня содержания ААТ к РНК в группе онкологических больных (0,69±0,05) в 1,9 раз превышает среднее значение' уровня содержания ААТ к РНК здоровых людей (0,36±0,01). Повышение ААТ к антиядерным антигенам многие авторы связывают с возрастом пациентов (8\шза е1 а1., 1990; Ншшпет й а1., 1990). В связи с этим представлялось интересным выяснить, как изменяется с возрастом уровень содержания ААТ к РНК у здоровых людей.

По нашим данным уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови у здоровых людей варьирует в различные периоды онтогенеза (табл. 8). Наиболее высокий уровень содержания ААТ к РНК обнаруживается в сыворотке крови новорожденных (0,47±0,01) и детей младшего возраста до 8 лет (0,44±0,02). В возрасте от 9 до 15лет

уровень содержания ААТ к РНК значительно снижается (0,27±0,02) и сохраняется в низких титрах до 20 лет - периода остановки роста Далее содержание ЛАТ к РНК в сыворотке крови несколько повышается и стабилизируется на этом уровне (0,36±0,02) до зрелого возраста с тенденцией к дальнейшему повышению после 40 лет. С 40 до 60 лет - в период умеренного старения, появляется тенденция к дальнейшему повышению уровня содержания ААТ к РНК (0,43±0,01). Это, по-видимому, связано с возрастной инволюцией тимуса и снижением активности Т-супрессоров при старении (Бутенко, 1993). Наши результаты о снижении уровня ААТ к РНК у пожилых людей старше 60 лет (0,29±0,01) отличаются от данных других авторов (Hooper et al.,

Таблица 8

Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей и онкобольных разных возрастных групп (в отн.ед.)

Возрастные группы (года) здоровые онкобольные

ААТкРНК Кол-во чел-к ААТкРНК Кол-во чел-к

0-1 0,47 ±0,01* 17 -

2-8 0,44 ± 0,02** 10 -

9-15 0,27 ±0,02** 11 -

16-20 0,26 ±0,02* 20 -

21-30 0,36 ± 0,02н 29 0,66±0,01* 17

31-40 0,35 ± 0,01н 38 0,67±0,01* 21

41-50 0,43 ±0,01** 39 0,70±0,01* 32

51-60 0,41 ± 0,02н 15 0,72±0,01* 25

61-70 0,29 ±0,01** И 0,66±0,03* 83

71-86 0,29 ±0,01** 11 0,65±0,00* 28

Среднее значение 0,36 ± 0,02 201 0,69±0,03* 207

Различие по сравнению со средним значением в общей группе

здоровых лиц: * - достоверно при р<0,01; ** - достоверно при р<0,05; " - различие недостоверно 1972; Ка^апоуа с! а1., 1984). Такое различие, очевидно, обусловлено несовпадением календарного и биологического возраста людей обследуемых разными авторами.

Анализ уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови онкобольных 6 возрастных групп показал, что возрастные различия в содержании ААТ к РНК не превышают среднее значение содержания ААТ к РНК в общей группе больных с опухолями (табл. 8). Если сравнить результаты по содержанию ААТ к РНК в сыворотке крови опухоленосителей и здоровых лиц, видно, что у онкобольных средний уровень содержания ААТ к РНК значительно превышает среднее значение данного показателя в группе здоровых лиц (табл.8). Эта разница не укладывается в рамки возрастных изменений, представленных в табл.8. Это говорит о том, что повышенный уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови онкологических больных и возникновение у них симптомов аутоиммунного состояния, очевидно, связаны именно с ростом опухоли и ее воздействием на организм.

Таблица 9

Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови людей при различных заболеваниях

Заболевание Кол-во человек ААТ к РНК (отн.ед.)

АИЗ 45 1,27±0,20

Опухоли 207 0,69±0,03

Рожа 84 0,49±0,01

Здоровые доноры 201 0,36±0,02

Известно, что ААТ к РНК обнаруживаются в сыворотке крови и при других заболеваниях, например, при инфекциях (Рыжикова и др., 1986). Однако, как показали наши исследования, повышение уровня содержания ААТ к РНК при инфекционных заболеваниях значительно

ниже, по сравнению с повышением их уровня содержания при онкологических заболеваниях.

ВЫВОДЫ

1. Интактные опухолевые клетки секретируют в культур альную среду РНК, секреция РНК регулируется гомеостатическим механизмом по типу обратной связи и зависит от концентрации внеклеточной РНК в среде.

2. Содержание РНК в плазме крови крыс с асцигной опухолью Эр лиха коррелирует со стадиями развития опухоли. Максимальное содержание РНК в плазме крови наблюдается в период интенсивного роста опухоли. Регрессия опухоли у крыс сопровождается снижением уровня содержания РНК в плазме крови.

3. Разработана тест-система на основе иммуноферменгаого анализа для определения уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови человека.

4. В сыворотке крови здоровых людей постоянно обнаруживаются ААТ к РНК. Пороговый уровень содержания ААТ к РНК у здоровых людей составляет 0,36±0,06. Установление порогового уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови человека может иметь диагностическое значение для определения группы риска среди здоровых людей.

5. Существует возрастная зависимость содержания ААТ к РНК в сыворотке крови у здоровых людей. Наиболее высокий уровень содержания ААТ к РНК наблюдается у новорожденных (0,47±0,01 отн. ед.) и детей до 8 лет (0,44±0,02 отн. ед.). У возрастной группы от 9 до 20 уровень содержания ААТ к РНК снижается до 0,27±0,04 отн. ед. У лиц в возрасте от 20 до 40 лет уровень содержания ААТ к РНК совпадает со средним значением уровня нормы. В возрасте от 40 до 60 лет уровень ААТ к РНК повышается до 0,43±0,02 отн. ед. После 60 лет уровень содержания ААТ снижается до 0,29±0,01 отн. ед.

6. У пациентов со злокачественными опухолями различной локализации и типов содержание ААТ к РНК в сыворотке крови превышает норму в 1,9 раз. Исключение составляют больные с лимфопролиферативными заболеваниями, у которых содержание ААТ к РНК не превышает порогового значения нормы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Зайнуллина A.C., Саттарова Л.И., Гафиятуллина Л.А., Аглиуллина Д.Г., Винтер В.Г. Разработка условий иммобилизации РНК на полистироловом планшете отечественного производства для иммуноферментного анализа антител к РНК. - Каз. Ун-т. - Казань , 1995. - Деп. В. ВИНИТИ от 27.10.95. № 2869 - 1395.

2. Бабкина С.С., Винтер В.Г., Зайнуллина A.C. Иммуноферменгное определение антител к ДНК на нитроцеллюлозных мембранах // Журнал аналитической химии - 1994. - т.49. - №12. - с. 1313 - 1316.

3. Бабкина С.С., Винтер В.Г., Зайнуллина A.C. Иммуноферментный метод определения низкомолекулярных органических соединений со спекгрофотометрической индикацией аналитического сигнала // Журнал аналитической химии. - 1994. - т.49. - №10. - с. 1119- 1123.

4. Зайнуллина A.C., Коликова Ю.О. Изменение уровня содержания аутоантител в онтогенезе // Тезисы Ш Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов. - Казань. -10-11 октября. - 1997. - с. 87.

5. Коликова Ю.О., Зайнуллина A.C., Гилмуллина Ф.С. Физиологическая роль аутоантител к ядерным антигенам // Тезисы Ш Республиканской научно - технической конференции молодых ученых и специалистов. -Казань, - 10-11 октября. -1997. -с.91.

6. Коликова Ю.О., Зайнуллина A.C. Возрастные изменения содержания аутоантител в сыворотке крови здоровых лиц. // Тезисы докладов

научно-практической конференции молодых ученых.- Казань.- 23 апреля,- 1998.-c.29.

7. Vinter V.G., Sattarova L.I., Agliullina D.G., Sainullina A.S. Anti - DNA antibodies in the normal subjects and in patients with malignancies // Abstracts 23-rd Meeting of Federation of European Biochemical Societies. -Basel. - August 13-18.- 1995.

Подписано в печать 13.11.98. Усл.печлист 1,25. Тираж 50. Договор № 4 от 13.11.98. Отпечатано в лаборатории оперативной печати ТГГИ 420036, г.Казань, ул. Побежимова 47а

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайнуллина, Альфия Салиховна, Казань

. ■■■'' /

Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина

Зайнуллина Альфия Салиховна

п На правах рукописи

■гп ^

с-

АУТОАНТИТЕЛА К РНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Винтер Виктор Георгиевич, д.б.н. Ишмухаметова Диляра Галимовна

Казань - 1998

Список сокращений (по алфавиту)

ААТ - аутоантитела

ДДС - додецилсульфат натрия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза

дДНК - денатурированная ДНК

нДНК - нативная ДНК

дцРНК (ДНК) - двуцепочечная РНК (ДНК)

ДЭПК - диэтилпирокарбонат

ЖДА - железодефицитная анемия

ИФА - иммуноферментный анализ

КЖ - культуральная жидкость

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

Оп. ед. - оптические единицы

Отн. ед. - относительные единицы

оц РНК (ДНК) - одноцепочечная РНК (ДНК)

ПААГ - полиакриламидный гель

РА - ревматоидный артрит

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНКаза - рибонуклеаза

РНП - рибонуклеопротеид

СКВ - системная красная волчанка

ССД - системная склеродермия

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ТЭС - телячья эмбриональная сыворотка

ФСБТ - фосфатно-солевой буфер с твином

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз ХМЛ - хронический миелолейкоз ЭБ - этидий бромид ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ_ 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_10

1.1 Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в норме и при развитии опухоли__10

1.1.1 Аутоантитела и их свойства_10

1.1.2 Клетки продуценты аутоантител_15

1.1.3 Функции аутоантител_ 18

1.1.4 Механизм возникновения аутоантител_ 24

1.1.5 Аутоантитела к РНК_ 26

1.1.6 Аутоантитела в сыворотке крови у здоровых людей_ 32

1.1.7 Аутоантитела в сыворотке крови при развитии опухоли_ 36

1.2 Внеклеточные нуклеиновые кислоты__ 41

1.2.1 Мембраноассоциированные РНК_ 45

1.2.2 Рибонуклеиновые кислоты в сыворотке крови в норме и при развитии опухоли______ 46

1.3 Заключение по обзору литературы_ 51

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ_ 53

2.1. Объекты исследований____ 53

2.1.1 Экспериментальные животные___ 53

2.1.2 Онкологические больные и здоровые доноры_ 53

2.2 Выделение ДНК из тимуса теленка_ 54

2.3 Выделение и очистка РНК из бесклеточной асцитной жидкости опухоли Эрлиха_ 55

2.3.1 Получение бесклеточной асцитной жидкости и удаление опухолевых клеток из культуральной жидкости_ 55

2.3.2 Выделение РНК из асцитной жидкости_ 57

2.4 Определение количества РНК флуоресцентным методом в сыворотке крови____59

2.5 Гетеротрансплантация асцитной опухоли Эрлиха мышей крысам_________60

2.6 Определение жизнеспособности опухолевых клеток_60

2.7.Исследование секреции РНК при инкубации опухолевых клеток in vitro_62

2.8. Определение содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови_____62

2.9 Статистическая обработка результатов_64

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ_66

3.1. Исследование секреции РНК опухолевыми клетками в культуральную среду_66

3.1.1 Контроль за жизнеспособностью опухолевых клеток при инкубации in vitro_66

3.1.2 Адаптация клеток опухоли Эрлиха к росту in vitro_70

3.1.3 Быстрое удаление опухолевых клеток из культуральной среды

щадящим способом_70

3.1.4. Динамика выхода РНК из клеток асцитной опухоли Эрлиха в культуральную среду______ 72

3.2.Ауторегуляция секреции РНК клетками опухоли Эрлиха_76

3.3 РНК плазмы крови в норме и у опухоленосителей_78

3.3.1. Изменение содержания РНК в плазме крови

экспериментальных животных при развитии опухоли_ 78

3.3.2 Содержание РНК в сыворотке крови онкологических больных

___79

3.4. Определение содержания аутоантител к РНК в сыворотке

крови_82

3.4.1. Разработка оптимальных условий для иммуноферментного анализа антител к РНК 82

3.4.1.1 Оптимизация условий сорбции РНК на планшетах_84

3.4.1.2. Влияние рН и состава буфера на сорбцию РНК_86

3.4.1.3. Влияние концентрации РНК на сорбцию ее на планшет_89

3.4.1.4. Подбор оптимального разведения тестируемой сыворотки 91

3.4.2. Исследование полиспецифичности аутоантител к РНК по перекрестным реакциям с РНК и ДНК антигенами_92

3.4.3. Обнаружение антител к РНК в сыворотке крови здоровых людей_____ 93

3.4.4. Аутоантитела к РНК в сыворотке крови у онкологических больных_97

3.4.5. Аутоантитела к РНК в сыворотке крови при роже_104

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_107

ВЫВОДЫ_128

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 130

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи опухолевого процесса и аутоиммунного состояния организма в последние годы привлекает все больше внимания исследователей. В литературе имеются сведения о высокой частоте возникновения злокачественных опухолей у больных с аутоиммунными патологиями (Ivorra et al., 1991; Flippo et al., 1993; Falcini et al., 1993). С другой стороны имеются данные о появлении признаков аутоиммунного состояния у пациентов, страдающих различными онкологическими заболеваниями (Peller, Kaufman, 1991; Dropcho, King, 1994). Аутоиммунное состояние у онкологических больных может быть вызвано деструктивными процессами, происходящими в организме опухоленосителей (Меклер, 1978; Wortman et al., 1975) или выделением опухолевыми клетками биологически активных соединений.

Давно уже известно, что опухолевые клетки в интактном состоянии выделяют в окружающую среду множество различных биологически активных веществ, в том числе и РНК (Винтер, 1968; Stroun et al., 1972).

Внеклеточная РНК обнаруживается в сыворотке крови опухоленосителей (Funaki et al., 1998; Occonnell et al., 1998), причем уровень ее содержания, как правило, превышает норму (Funaki et al., 1998; Блинов и др., 1981).

Нами было сделано предположение, что процесс синтеза аутоантител к РНК при опухолевом процессе может быть индуцирован внеклеточной РНК, активно секретируемой опухолевыми клетками.

Целью настоящей работы явилось исследование содержания РНК и аутоантител к РНК в сыворотке крови экспериментальных животных и онкологических больных.

Были поставлены следующие задачи:

1) Исследование динамики секреции РНК из опухолевых клеток.

2) Анализ содержания РНК в сыворотке крови у экспериментальных животных в норме и при развитии опухоли.

3) Исследование содержания РНК в сыворотке крови у здоровых людей и у онкологических больных.

4) Разработка тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител к РНК.

5) Определение содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови здоровых лиц и онкологических больных.

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови здоровых людей и при различных аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваниях.

На основе анализа содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови здоровых людей дана характеристика порогового уровня содержания аутоантител к РНК у здоровых лиц разных возрастных групп.

Обнаружено, что в сыворотке крови у пациентов со злокачественными опухолями уровень содержания РНК (у 71% больных) и аутоантител к РНК (у 85% больных) выше по сравнению с ее содержанием в сыворотке крови здоровых лиц.

Выявлена корреляция между изменением уровня содержания РНК в сыворотке крови и стадиями развития опухоли Эрлиха у экспериментальных крыс.

Получены данные указывающие на возможность участия РНК, выделяемой опухолевыми клетками, в возникновении аутоиммунных симптомов у онкологических больных.

Практическая значимость. В результате проведенных нами исследований была разработана тест-система на основе иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови человека. Разработанная тест-система была апробирована при массовом обследовании больных в лечебно-профилактических учереждениях г. Казани: городской инфекционной больнице №1, терапевтическом отделении Медицинской академии, детской городской клинической больнице №1, Республиканском онкологическом центре МЗ РТ.

При помощи данной тест-системы нами были установлены пороговые значения уровня содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови здоровых людей различных возрастных групп.

Полученные данные о повышении уровня содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови у онкологических больных являются предпосылкой для применения тест-системы по выявлению лиц с повышенной вероятностью развития опухоли.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аутоантитела к РНК в сыворотке крови в норме и при

развитии опухоли

1.1.1. Аутоантитела к нуклеиновым кислотам и их свойства

Одним из основных свойств аутоантител к нуклеиновым кислотам является их полиспецифичнрсть и гетерогенность по степени сродства к своему антигену, то есть по аффинности. Как известно, аффинность любых антител зависит от того, насколько хорошо антигенная детерминанта стереохимически точно соответствует отдельному антигенсвязывающему участку антитела (Албертс и др., 1987; Кетти, 1991; Пол, 1989). Гетерогенная популяция антител полиспецифической сыворотки всегда содержит различные субпопуляции антител, обладающих различной аффинностью по отношению к определенной антигенной детерминанте. Поэтому в этом случае для оценки сродства антител к антигену используют термин - авидность, которая отражает суммарную усредненную характеристику связывания антитела с антигеном. Аутоантитела к ДНК, содержащиеся в сыворотке крови, при аутоиммунных заболеваниях широко варьируют по степени сродства к своему антигену (Цебецауер и др., 1987; Мс^епг ег а1.,1989; Бшеепк й а1., 1988), в отношении их также справедливо применение термина авидность.

Бтеепк с сотрудниками исследовали авидность аутоантител к ДНК по диссоциации их комплексов с ДНК при различных условиях. Используя широкий спектр градиентов концентраций солей, авторы выявили две фракции иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов ДНК с антителами к ДНК,

названными ими как высокоавидные и низкоавидные антитела к ДНК. Иммунные комплексы с низкоавидными антителами к ДНК разрушались при увеличении концентрации солей до 50%, в то время как высокоавидные антитела к ДНК оставались связанными с ДНК, но они были чувствительны к повышению температуры. На основании этих экспериментальных данных ученые пришли к заключению, что взаимодействие между ДНК и низкоавидными антителами обусловлено чисто электростатическими связями. Авторы считают, что при образовании устойчивых комплексов ДНК с высокоавидными антителами к ДНК во взаимодействие вовлекаются вторичные водородные связи (8шеепк е! а1.Д988).

Впоследствии этот подход был использован ЫоБзегй с сотрудниками для дифференциации низко и высокоавидных аутоантител в сыворотке крови (КГозБегй а1.,1989). Авторы в работе применяли различные иммунологические методы, такие как метод Фарра, ПЭГ-преципитация и иммунофлуоресцентный анализ. Было обнаружено, что иммунофлуоресцентным методом выявляются как высокоавидные, так и низкоавидные антитела к ДНК, причем выявление составляет 100%. При использовании метода Фарра, который заключается в радиоиммунном анализе осажденных 50% сульфатом аммония иммунных комплексов, происходит диссоциация части комплексов ДНК с антителами. В этом случае комплексы ДНК с низкоавидными антителами разрушаются, и обнаруживается 72% комплексов, состоящих, в основном, только из высокоавидных антител. ПЭГ-осаждением было выявлено 24% положительных сывороток, и это были комплексы ДНК с низкоавидными антителами.

Очевидно, что высокоавидные и низкоавидные антитела к ДНК отличаются друг от друга по биохимическим свойствам.

Так, Цебецауэр с сотрудниками высказывают мнение, что высокоавидные аутоантитела к ДНК принимают участие в

образовании локальных структур иммунных комплексов в почках, а низкоавидные аутоантитела к ДНК образуют преимущественно макромолекулярные комплексы (Цебецауер и др., 1987).

Другим важным свойством, присущим аутоантителам, является полиспецифичность, то есть способность к перекрестным реакциям.

Специфичность антител определяется по способности отличать антиген, против которого они были получены от любого другого антигена. Однако, некоторые детерминанты антител могут быть общими для нескольких молекул различных антигенов, особенно для сходных молекул родственных видов животных. В этом случае некоторые из антител, образовавшихся на стимуляцию данным антигеном, могут связываться и с другими антигенами.

Аутоантитела к нуклеиновым кислотам обладают выраженной полиспецифичностью. Так, аутоантитела, связывающие ДНК, могут перекрестно реагировать как с нативной, так и с денатурированной ДНК (Vaishnov, Antony, 1989).

Koffler с соавторами, исследуя сыворотку крови больных аутоиммунными заболеваниями и иммунизированных кроликов методом гемагглютинации и преципитации, установили, что одноцепочечная ДНК содержит детерминанты для многих антител, реагирующих с двуцепочечными ДНК. Тем не менее авторы отмечают, что эти аутоантитела специфически узнают конформацию молекулы ДНК. Так. при использовании в качестве антигена синтетических полидезоксирибонуклеотидов, они не взаимодействовали с аутоантителами к одноцепочечной ДНК. Авторы высказывают мнение, что требуется уникальная конформация, или нуклеотидная последовательность, для того, чтобы произошла реакция с антителами к ДНК (Koffler et al., 1971).

Аутоантитела к РНК также обладают сходной полиспецифичностью в отношении вторичной структуры антигена

(Koffler etal., 1971). Авторы показали, что антитела к двуцепочечной РНК могут связываться с одноцепочечным полирибонуклеотидом, таким как поли А. В то же время эти антитела не вступают в реакцию с рибосомальной и транспортной РНК.

Особый интерес представляет проблема перекрестного реагирования аутоантител к РНК с ДНК.

Shur и Monroe в сыворотке больных системной красной волчанкой, используя методы иммунопреципитации и иммунофлуоресценции, обнаружили антитела к РНК, перекрестно реагирующих с денатурированной ДНК (Shur, Monroe, 1969).

Сходным образом антитела к ДНК могут связываться с РНК, преимущественно с двуцепочечной молекулой. Koffler с коллегами методом гемагглютинации изучали способность антител к нативной и денатурированной ДНК вступать в перекрестные реакции с другими антигенами. Учеными было обнаружено, что антитела к нативной ДНК взаимодействуют как с нативной, так и с денатурированной ДНК, а также с двуцепочечной РНК, в то время как антитела к одноцепочечной ДНК связывались, в основном, только с одноименным антигеном (Koffler et al., 1969).

Антитела к нуклеиновым кислотам могут перекрестно реагировать не только с близкородственными антигенами, но также с различными белками, входящими в состав комплексов нуклеиновых кислот и белков (Hassfeld et al., 1995; Reichlin et al., 1995; Chang et al., 1998), с кардиолипином (Koire et al., 1982), гликопротеинами (Faber et al., 1984). С другой стороны и антитела, индуцированные перечисленными антигенами, легко образуют иммунные комплексы с нуклеиновыми кислотами.

Так, ДНК может перекрестно реагировать с антителами к дерматансульфату (Ohnishi et al., 1989), фосфатидилинозитолфосфату и холестеролу (Stollar et al., 1989). Такая способность к

перекрестному взаимодействию между различными антителами и нуклеиновыми кислотами, возможно, происходит за счет похожего строения фосфатных или углеводных групп (в случае перекреста с фосфолипидами и гликопротеидами). Перекрестные реакции антител к нуклеиновым кислотам с антигенами различного происхождения могут иметь место вследствие низкой авидности аутоантител.

Существует и другая точка зрения. Кажущиеся перекрестные реакции между антителами к ДНК и РНК, а также между аутоантителами к РНК и ДНК могут быть связаны с гетерогенностью популяций антител в исследуемых сыворотках.

ЕПа1 и БсЬесЬгег, анализируя сыворотку ^М^КВ мышей ингибированием Н3-тРНК и С14-ДНК обнаружили, что все сыворотки, связывающие ДНК, также являются позитивными и к тРНК. Ими было доказано, что антитела, связывающие тРНК и ДНК, представлены разными популяциями антител, так как ингибирующее действие двух популяций различных нуклеиновых кислот были неодинаковыми (ЕИа^ ЗсЬесМег, 1976).

Ное1 с коллегами методом радиоиммунного анализа изучали корреляцию активности болезни системной красной волчанки с уровнем содержания антител к РНК и ДНК. Было обнаружено, что уровень антител к РНК и к ДНК параллельно возрастает с развитием болезни. Возможность выявления антител к РНК, в результате перекрестной реакции антител к ДНК с РНК, авторы исключили, так как, во-первых, антитела к ДНК не ингибировали реакцию антител с РНК. Во-вторых, добавление немеченой РНК не влияло на активность связывания антител с ДНК. Авторы, таким образом, пришли к заключению, что антитела принадлежат к разным популяциям (Ное1е1а1., 1991, 1993).

Недавно было обнаружено еще одно свойство аутоантител. Это - их каталитическая активность. Такие аутоантитела получили название абзимы (от английских слов "antibody" и "enzyme"). Они обладают гидролизующей активностью в отношении ДНК, РНК, пептидов (Gabibov et al., 1994; Guialis et al., 1994; Sun et al., 1995). Известные на сегодняшний день абзимы были выделены из сыворотки крови пациент�