Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в норме и при развитии опухолей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в норме и при развитии опухолей"

рГ Б ОД

Г ""' и '

На правах рукописи

САТТАРОВА Лилия Ирековна

АУТОАНТИТЕЛА К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ В НОРМЕ И ПРИ РАЗВИТИИ ОПУХОЛЕЙ

03. 00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени каноиаата биологических наук

КАЗАНЬ - 1995

Работа выполнена в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Винтер В. Г.

кандидат биологических наук, старший научный сотгудник Аглиудлина Д. Г.

Официальные оппоненты: академик АН РТ, доктор медицинских

наук, профессор Зубаиров Д.М.

кандидат биологических наук, врач-лаборант I категории Нехороппсова З.М.

Ведущая организация: Государственный институт для усовершенствования врачей, г. Казань

Защита диссертации состоится 1 июня 1995 г. в ч. на заседании диссертационного Совета К 053.29.19 при Казанском государственном университете имени В. И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Аскарова А. Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуя-пънпгугь ntnfíjiRMH- В последние годы все больше внимание исследователей привлекает взаимосвязь между возникновением злокачественных опухолей и аутоиммунным состоянием организма. Замечено, что у пациентов с аутоиммунными патологиями значительно чаще по сравнению с другими заболеваниями появляются опухоли СГогичадзе Г.К., 1992).. Известны случаи, когда при органоспецифических аутоиммунных патологиях рак возникает в пораженном органе, а при неорганоспецифических заболеваниях, таких,как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Шегрена и др., развиваются злокачественные опухоли лимфоидного. часто В-клеточного происхождения CBatallle R. et al.. 1989).

Одновременно было замечено, что у больных со злокачественными опухолями появляются признаки, характерные для аутоиммунного состояния: дисбаланс иммунорегуляторных клеток -Т-хелперов и Т-супрессоров С Peller S. and Kaufman S., 1991), появление в сыворотке крови аутоантител к различным тканевым антигенам СЧернушенко Е.Ф. и др., 1985: Falrley С.Y., 1972: Nelson D.S., 1977: Whltehause J.M.A. and Holborou E.J., 1971: Гриневич Ю.А. и Алферов А. Н.. 1981). Взаимосвязь между аутоиммунным состоянием и злокачественным ростом, очевидно, носит не случайный характер, поскольку показано, что противотканевые антитела являются важным компонентом в противоопухолевой защите организма. Введение противотканевых антител мышам, имешим спонтанные злокачественные новообразования, приостанавливает развитие последующих опухолей и замедляет рост уже существую-, щих новообразований С Терещенко И.П. и Сараева З.М., 1983). С другой стороны, существует мнение, что при злокачественном росте иммунные комплексы осуществляют блокировку противоопухолевого иммунитета С Белохвостое A.C., 1978).

Аутоантитела к собственным антигенам обнаруживаются и у клинически здоровых людей, но содержание их незначительно. Полагают, что они ответственны за утилизацию продуктов метаболизма и деструкции клеток. Такой аутоиммунитет был назван Физиологическим CGrabar Р., 1965). В случае аутоиммунных заболеваний в сыворотке крови наблюдается значительно повышенный уровень циркулирующих аутоантител, которые вызывают нарушение функций многих жизненно важных органов и тканей.

Прпт, м чапаим мгг-прпппянмд Целью работы явилось определение уровня аутоантител к ядерным антигенам в сыворотке крови здоровых людей, опухоленосителей и при аутоиммунных заболеваниях.

В задачу исследований входило:

- разработка тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител к нативной и денатурированной ДНК й дезоксирибонуклеопротеиду:

- определение содержания исследуемых аутоантител в сыворотке крови здоровых доноров и установление порогового уровня ауто антител к нативной и денатурированной ДНК и дезоксирибонуклеопротеиду в норме:

- определение содержания исследуемых аутоантител при аутоиммунном заболевании - системной красной волчанке, и при инфекционных процессах, сопровождающихся распадом тканей - туберкулез и стрептококковая инфекция;

- определение концентрации ДНК в плазме крови здоровых людей и онкологических больных:-

-определение содержания аутоантител к ядерным антигенам в си-воротке крови онкологических больных с различной локализацией опухолевого процесса.

Научная нгтигчна, В результате проведенных исследований разработана тест-система на основе иммуноферментного анализа СИФА) для определения содержания ' аутоантител к нативной СнДНЮ, денатурированной ДНК СдДНЮ и дезоксирибонуклеопротеиду СДНГС) в сыворотке крови человека. Проведен сравнительный анализ аутоантител к ядерным антигенам в сыворотке крови здоровых людей и при различных заболеваниях. ' Установлен пороговый уровень содержания аутоантител к нДНК, дДНК и ДНП в сыворотке крови здоровых доноров. Впервые обнаружены повышенные уровни аутоантител к ДНП при лимфопролиферативных заболеваниях и аутоантител к нДНК и дДНК при раке молочной железы, раке легкого и желудочно-кишечного тракта.

Прак-плцргкая янаиммпрть. Практическая значимость исследований заключается в расширении возможности лабораторной диагностики аутоиммунных реакций при различных заболеваниях. Разработанная иммуноферментная тест-система используется для массового клинического обследования больных в городской инфекционной больнице N 1, в ГИДУВе и в детской городской больнице N 1 г.Казани. Определение содержания антиядерных аутоантител в

сыворотке крови здоровых людей и аутоиммунных больных позволило установить пороговый уровень содержания этих аутоантител в норме. Показано, что превышение этого порогового уровня свидетельствует о наличии в организме аутоиммунных реакций. Повышение содержания аутоантител к ядерным антигенам при отсутствии аутоиммунных заболеваний может указывать на развитие злокачественных опухолей, что следует учитывать при постановке диагноза.

Гтпук-тура и nfrhPM работы. Диссертация, состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 206 страницах, содержит 22 таблицы и 32 рисунка. Список литературы включает Í80 наименований.

Апппбания работы. Основные результаты работы были доложены на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета С1991, 1992, 1993, 1994 гг.), на Международной конференции "XVI European Congress of Allergology and Clinical Immunology ECACI'95" С Spain, Madrid).

- Пуб.пмк-ании. Основное содержание диссертации отражено в 4 опубликованных работах.

Матрпмапы и мртппы иссдрпгтания. В работе использована венозная кровь от 60 здоровых доноров С50 женщин и 10 мужчин): 122 больных гематологического отделения городской больницы N 5 г. Казани: 166 больных Республиканского онкологического диспансера г. Казани: 20 больных системной красной волчанкой С СКВ) терапевтического отделения клиники ГИДУВа г. Казани: 14 больных со стрептококковой инфекцией из инфекционной больницы N 1 г. Казани: 20 больных с костной и легочной Формой туберкулеза из Казанской городской туберкулезной больницы С п. Каменка).

Определение содержания ДНК в плазме крови проводили спек-трофлюорометрическим методом с красителем Hoechst 33258 С Serva, ФРГ).

Оптимальные длины волн возбуждения флюоресценции Hoechst определяли при изучении спектров, записанных" в области длин волн Флюоресценции сЭфл) 410-510 нм с шагом 10 нм с непрерывным автоматическим изменением длин волн возбуждения СЭв), начиная с длины волны 280 нм.

Определение аутоантител СМТ) к ядерным антигенам проводили с использованием созданной нами тест-системы на основе

- б -

иммунофермент::ого аначиза. Для этого были выделены из тамуса крупного рогатого скота и очищены следующий ядерные антигены: нДНК, дДНК и ДНП.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятым методам С Лакин Г.Ф.. 1990: Тейлор Д., 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Опрплрлрнмр кплмиегута ЛНК r плаямЕ кплии цр.ппкрк-?. цотп-лоу (Ьлкдрйспрнтнпгп анализа.

Для выбора оптимального режима измерения флюоресценции Hoechst 33258 при его взаимодействии с ДНК изучены следующие спектры: раствора красителя Hoechst 33258, красителя с добавлением раствора стандартной ДНК, красителя с супернатантом плазмы, красителя с добавлением супернатанта плазмы и стандартной ДНК. Анализ спектров позволил выбрать оптимальные длины волн возбуждения и наблюдения флюоресценции: Лв=350 нм и Дфл=450 нм.

С применением разработанного метода флюоресцентного анализа исследованы образцы плазмы крови 15 здоровых доноров и 15 онкологических больных на содержание ДНК. В плазме крови здоровых донорое обнаруживается ДНК в концентрации от 3.0 до 9.0 мкг/мл. Средний уровень содержания ДНК у здоровых людей составляет 6.3±0.9 мкг/мл. В плазме крови онкологических больных концентрация ДНК превышает корму (находится в пределах 9.6 - 51.3 мкг/мл) независимо от вида опухоли и стадии ее развития.

Разработка трст-систрмы на п.-нпйр иммунп<6ррмрнтнпгп анализ л ля пппрпялрния ААТ к ЛНК и ЛНП.

Пппгптгтка янтмгрнпр. ппя I/ИРА. В качестве антигенов использовались препараты нДНК, дДНК и ДНП, выделенные из тимуса крупного рогатого скота. О степени очистки полученной нДНК судили по соотношению оптических плотностей Е260/Е280, которое составило 1.9. О нативности ДНК судили по гиперхромному эффекту, который был равен 33%. Денатурированную ДНК получали тепловой обработкой нДНК в присутствии 0.05% раствора формальдегида, который добавляли для предотвращения ренатурации.

В качестве аналогов денатурированной и нативной ДНК использовались препараты синтетических олигонуклеотадов длиною 12 оснований. Соответственно, были использованы одноцепочечная

олигонуклеотидная последовательность ВА-65 СОЦ) и двуцепочеч-ная олигонуклеотидная последовательность С Ш), полученная при отжиге комплементарных олигонуклеотидных . последовательностей ВА-65 и ВА-66.

ВА-65 5'>ЕАТССТАССТАЙ<3' ВА-66 5'>СТАОСТАСйАТС< 3'

Гипохромный эффект при этом составил 222. Эти олигонук-леотидные последовательности использовались нами в качестве модельных антигенов при исследовании в сыворотке крови ААТ к нДНК и дДНК.

Сравнительная оценка результатов ИША с использованием нДНК и дДНК и результатов ИФА, в котором в качестве аналогов указанных антигенов были использованы одно- и двуспиральные олигонуклеотиды, выявила, что независимо от происхождения препаратов антигенов (природные или синтетические? наблюдается идентичная картина содержания ААТ. 06 этом свидетельствует соотношение оптических плотностей дДНК/нДНК=1.6 и ОЦ/Ш-1.8. Эти данные свидетельствуют о том, что в сыворотке крови Человека обнаруживаются две популяции ААТ к ДНК. Одна из этих популяций ААТ реагирует с нДНК, другая - с дДНК. Эти данные были подтверждены при использовании в качестве антигенов синтетических олигонуклеотидов.

Препарат ДНП в нативном состоянии экстрагировали из хроматина. полученного при лизисе изолированных ядер ткани тимуса в деионизованной воде. Выделенный препарат ДНП по данным гелъфильтрации на колонке с сефадексом 6-200 С деионизованная вода) представлял собой стабильный комплекс и имел следующие характеристики: соотношение ДНК/белок составило 1.33, содержание белка - 652. соотношение ДНК:РНК=12:1, содержание ДНК -123 мкг/мл и РНК - 10 мкг/мл.

Иммпбмли.чяпия антмгрыпд на_пплигтнрплпрыц ппянщртяу На

первом этапе работы при проведении ИФА необходимо подобрать условия иммобилизации антигенов на поверхности полисшролово-го планшета. Показано, что иммобилизация антигенов на поверхности полистироловых планшетов зависит от многих факторов. Одним из них является сорбционная способность полистирола. Нами изучены две возможности повышения эффективности сорбции антигенов: предварительное покрытие лунок протаминсульфатом и облучение планшетов ультрафиолетовым СУФ) светом.

Результаты исследований показали, что предобработка план-

шетов протаминсульфатом приводила к повышению уровня фона в ИФА за счет неспецифического связывания сыворотки с протаминсульфатом. Поэтому в дальнейших исследованиях мы отказались от предварительной обработки планшетов протаминсульфатом и применяли УФ облучение. Нами установлено, что оптимальный уровень сорбции ДНК достигается при 2-часовом облучении планшетов УФ светом. Увеличение времени экспозиции более 6 часов приводит к повышению Фона. Используемые нами планшеты отечественного производства сохраняли после облучения повышенную сорбционную активность в течение 5-6 дней. Для стандартизации полученных результатов исследований в качестве "стандарта" нами использован образец пуловой сыворотки больных СКВ. Параллельно с определением ААТ в исследуемых образцах сывороток определяли и ААТ в стандартной сыворотке, что позволило проводить количественное сравнение исследуемых образцов сывороток. Результаты выражали в относительных единицах Сотн. ед.) по формуле: 0П492 опы-та/0П492 стандарта.

На сорбцию антигена на планшеты' большое влияние оказывает и состав буфера, в котором антиген наносится на планшеты. Нами проанализированы 6 буферов разного состава, применяемые для сорбции ДНК и ДНП:

0.1 М ацетатно - аммонийный буфер, рН от 4.5 до 5.5:

0.1 М фосфат - 0.05 М цитратный буфер, рН от 4.5 до 7.5:

0.1 М фосфатный буфер, рН от 5.5 до 8.0:

0.01 М трис-НС1 - 0.15 М NaCl, рН от 7.5 до 9.0:

0.01 М бикарбонатный буфер, рН от 9.0 до 10.0:

0.15 М NaCl - 0.015 М цитрат Na, рН 7.0.

Проведенные исследования показали, что наилучшая сорбция ДНК наблюдается в кислей области значений рН - от 4.5 до 5.5 и не зависит от состава буфера. Наиболее высокие уровни ответов наблюдаются при иммобилизации ДНП на планшеты в фосфат - цит-ратном буфере при кислых значениях рН и бикарбонатном буфере в области щелочных значений рН. Однако результаты гельфильтра-ции ДНП в этих буферных растворах на сефадексе G-200 показали, что при растворении ДНП в бикарбонатном буфере, рН 9.0, происходит диссоциация ДНП-комплекса на белок и ДНК, в то время как при растворении ДНП в фосфат-цитратном буфере, рН 5.0, комплекс ДНП сохраняет свое нативное состояние. Исходя из полученных результатов, для дальнейшей работы был выбран 0.1 М фосфат - 0.05 М цитратный буфер, рН 5.0.

Существенное значение для стабильной сорбции антигена на полистироле имеет концентрация антигена в растворе, вносимом в лунки планшета. Нами было установлено, что оптимальной является концентрация ДНК 10 мкг/мл. При этой концентрации ДНК отмечена более стабильная воспроизводимость результатов измерений.

Следуюций этап в ИФА связан с разведением тестируемой сыворотки. Актуальность правильного выбора разведения сыворотки, с одной стороны,обусловлена тем, что при разведении сыворотки уровень ответа должен быть достаточно высоким, что определяет чувствительность метода. С другой стороны, необходимо свести к минимуму уровень Фона, что позволяет повысить специфичность метода. Полученные результаты по определению оптимального разведения сывороток показали, что достаточно высокий уровень ответа наблюдается при разведении тестируемых сывороток 1:100. При этом разведении отсутствует неспецийичес-кое связывание изученных пуловых сывороток здоровых доноров и больных СКВ. Проведенные исследования по изучению влияния блокирования свободных мест связывания при использовании 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки СТЭС) показали, что такая обработка приводит к снижению чувствительности метода. На основании полученных результатов нами было предложено отказаться от этапа блокирования белковыми агентами свободных мест связывания, что не сказывалось на специфичности ИВА.

Таким образом, разработанная нами тест-система на основе ЙФА позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью определять количество ААТ к ДНК и ДНП в тестируемых образцах сыворотки.

УстаноаПйНИВ_ппгшгпйпгп_упоини сппрржяния ААТ к нЛНК.

пЛНК и ЛНП я гьтпрптк-р кппии чппппйыу шплрй, С этой целью исследованы 60 сывороток крови здоровых доноров. Результаты экспериментов показали, что у здоровых людей в сыворотке крови всегда присутствуют ААТ к ядерным антигенам. По сравнению с содержанием в сыворотке крови больных СКВ уровень этих ААТ в норме невелик, и нами отмечена следующая закономерность в их обнаружении. Самый высокий уровень ААТ - против дДНК, ниже -уровень ААТ против нДНК и наиболее низкий уровень ААТ наблюдается к ДНП. Числовые показатели содержания ААТ соответствовали закону нормального распределения, поэтому при вычислении границ содержания ААТ в норме использовались формулы, принятые для этого вида распределения. Были вычислены среднее взве-

донное значение СХв) и стандартное отклонение С б). Приняв за величину порогового уровня Хв±3б, мы установили пороговые уровни содержания МТ в норме, которые составили: для ААТ к нДНК - 0.82+0.06 отн. ед., для МТ к дДНК - 1.08+0 08 ста. ед. и для ААТ к ДНП - 0.62+0.11 ота.ед.

Пппрпрпрнир урпвня ААТ к нЛНК. л.ПНК_и ЛНП в_СЫВОРОТКВ

кдпйи больным fKR и инйркчгмпяныим яабппраяцмяим ^агностическая значимость разработанной тест-системы была продемонстрирована на примере определения ААТ в сыворотке крови больных СКВ. В клинической практике СКВ известна как аутоиммунное заболевание, при котором ААТ к ДНК и ДНП встречаются в высоком титре и вовлечены в патогенез заболевания С Tan Е.М. et al., 1988: Em-len W. et al. 19S0: Shlomchlk M. et al., 1990). Нами обнаружено, что содержание ААТ к нДНК, дДНК и ДНП во всех исследованных образцах сывороток крови больных СКВ превышало соответствующий пороговый уровень их содержания в норме. В среднем для 20 исследованных сывороток больных СКВ СХв±т) уровень МТ составил к нДНК - 1.18±0.06 ота.ед.,к дДНК - 1.32±0.05 ота.ед. и к ДНП - 2.02+0.33 ота.ед. Среднее значение содержания МТ к нДНК превысило норму почти в 1.5 раза. Особенно резкое повышение уровня МТ при СКВ проявилось в отношении ДНП. Среднее значение содержания этих МТ превысило норму более, чем в 3 раза. Нами также исследовано изменение содержания МТ к нДНК. дДНК и ДНП в динамике заболевания у одной больной СКВ в течение 2 лет с момента постановки диагноза. Обнаружено,что изменение активности и тяжести заболевания сопровождается изменением уровня МТ- к нДНК, дДНК и ДНП, содержание которых увеличивается при обострении СКВ и снижается после лечения.

Следует отметить, что иногда повышение содержания МТ к ДНК наблюдается у клинически здоровых людей. Нами обнаружено, что у 5% обследованных здоровых доноров в сыворотке крови выявляются повышенные уровни МТ к дДНК и ДНП. Возможно это может иметь прогностическое значение. Так, Stiefel A. et al. С1985) считают, что людей, в сыворотке крови которых обнаруживаются МТ к ДНК, необходимо отнести к группе риска по заболеваемости СКВ.

Фактором, который может оказать влияние на изменение уровня МТ, является возраст. В процессе старения изменяется ряд параметров иммунной системы. Одним из клинических проявлений возрастных изменений в иммунной системе являются аутоим-

- и -

мунные процессы С Platt D., 1992). Однако в наших исследованиях мы не обнаружили какого-либо закономерного повышения содержания МТ к ядерным антигенам в зависимости от возраста.

В литературе описаны отдельные случаи появления ААТ к нуклеиновым кислотам при различных инфекционных заболеваниях. САарден Л. и Смеенк Р., 1983: CcttoI Р. et al., 1985: Shoenfeld Y. et al., 1986). Однако результаты наших экспериментов не подтвердили этого предположения. При исследовании сывороток крови больных туберкулезом (костная и легочная Формы) и больных со стрептококковой инфекцией не наблюдалось повышения уровней исследуемых ААТ к ДНК и ДНП. Более того, следует отметить, что средние уровни ААТ к нДНК, дДНК и ДНП у больных со стрептококковой инфекцией были даже ниже порогового уровня их содержания в норме. Аналогичная картина была отмечена и в отношении ААТ к нДНК и дДНК при туберкулезе. Исключение составила только легочная Форма туберкулеза, когда средний уровень ААТ к дДНК находился в пределах порогового уровня нормы. Таким образом, можно сделать заключение, что при стрептококковой инфекции и туберкулезе содержание исследуемых ААТ но превышает норму.

Ппрапрлрчир урпияя ААТ к нЛНК. пЛНК_и_ДШ_В__СЫБОЕОТ££

к-гшкм у ппууппрнпрм-лр прй. Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том, что в сыворотке крови онкологических больных обнаруживаются ААТ к нДНК. дДНК и ДНП. Уровень этих ААТ у обследованных пациентов колеблется в значительных пределах. По всей вероятности это колебание может быть обусловлено видом опухолей, их локализацией и стадией развитая. Однако, следует подчеркнуть, что среднее значение содержания ААТ к ядерным антигенам в общей группе онкологических больных С138 человек) превышало пороговое содержание этих ААТ у здоровых доноров и составило 0.90±0.04 отн.ед. для нДНК, 1.22±0.04 отн.ед. для дДНК и 0.89±0.06 отн.ед. для ДНП.

При анализе отдельных групп больных, объединенных в соответствии с видом опухоли, нами были отмечены некоторые закономерности в распределении ААТ. При раке молочной железы (FMK) среднее значение содержания всех трех видов исследуемых ААТ достоверно превышало пороговый уровень их содержания в : норме (табл.1). Значительное увеличение содержания ААТ было отмечено в отношении ААТ к нДНК и дДНК. Содержание ААТ к ДНП при РМЖ хотя и превышало норму, но не достигало уровня этих ААТ у больных СКВ.

Обследованная наш группа больных с РМЖ имела клинически установленный диагноз злокачественной патологии. Сыворотку

Таблица 1

Содержание аутоантител к ядерным антигенам в сыворотке крови онкологических больных

1 |Забо-Iлева-!ние Кол-во человек (п) 1 1 1 ААТ к нДНК I ААТ к дДНК 1 ААТ к ДНП I 1 1 1

I 1 1 1 II Хв±ш I 1а 1 Хв±га 1 и .1 Хв±т | ^ 1 II II II

1 РМЖ 23 ! 1 II II 1.09±0.05110.7411.. 35±0.04114.1610.72±0.0414.681 С Р>0.999 ) ) С Р>0.999 3 I С Р>0.399 3 I 1 1 1

I РЛ 18 1 1 1 1 1 1 0.98+0.041 7.4811.36+0.04113.0210.61+0.0510.421 С Р>0.999 ) 1 С Р>0.999 ) I не достоверно! 1 1 1

1РЖКТ 1 31 1 1 1 1 0. 95±0.051 5.5311.30±0.03117.52! 0.5Э±0. 0411.251 С Р>0.999 ) I С Р>0.999 ) 1 не достоверно! 1 1 1

крови получали при поступлении больных в клинику, т.е. когда больные еще не принимали лекарственных препаратов, не подвергались химио- и радиотерапии и хирургическому вмешательству. Наши исследования показали, что у больных с РМЖ на III—IV стадии развития опухоли имеется тенденция к повышению содержания МТ по сравнению с теми же показателями у больных 1-1I стадии. Кроме того, у больных с РМЖ при наличии процесса метастазиро-вания уровень ААТ в большинстве случаев также повышен.

При исследовании больных раком легких (РЛ) нами было обнаружено повышенное содержание ААТ к нДНК и дДНК. Это повышение было статистически достоверным при сравнении с пороговым уровнем содержания этих ААТ в норме. Однако уровень ААТ к ДНП у пациентов с РЛ, в отличие от пациентов с РМЖ, в среднем не превышал порогового уровня ААТ к ДНП в норме, хотя в отдельных случаях содержание этих ААТ было явно повышенным. Аналогичная картина в отношении содержания ААТ в сыворотке крови

наблюдалось и в группе онкологических больных с раком желудочно-кишечного тракта СРЖКТ). Уровень ААТ к нДНК и дДНК достоверно превышал пороговый уровень их содержания в норме, в то время как уровень ААТ к ДНП был в пределах нормы. Следует отметить, что в этой группе больных с РЖКТ не удалось заметить различий в содержании ААТ у больных с III и IV стадией развития опухоли в сравнении с общей группой. Лишь у больных с наличием метастазов отмечалась тенденция-к повышению содержания ААТ к нДНК. Это согласуется с нашими данными, приведенными выше относительно РМЖ, а также с данными литературы СТигпЬи11 А.Я. а1.,1975). О взаимосвязи аутоиммунного процесса и развития злокачественных опухолей свидетельствуют также данные ^/аББегтап Л. е! а1. С1975), которые обнаружили, что у пациентов, в сыворотке крови которых выявляются антинуклеарные ААТ, чаще возникают метастазы. В связи с этим, обнаружению антинук-леарных ААТ придается прогностическое значение.

Дополнительным фактором, оказывающим влияние .на повышение количества ААТ у пациентов со злокачественными заболеваниями, может быть возраст. Ранее нами было рассмотрено влияние этого Фактора на содержание ААТ у здоровых людей. Недавно были получены данные об изучении уровней антинуклеарного Фактора САНФ) и ревматического фактора С РФ) у онкологических больных СНшп1пег а1.,1990). Авторы сравнили одинаковые возрастные группы: пациентов со злокачественными новообразованиями и здоровых людей в молодом возрасте, и такие же две группы пациентов пожилого возраста. Авторы не обнаружили разницы в содержании АНФ и РФ в одной возрастной группе, т.е. и у здоровых людей и у онкологических больных уровень изучаемых показателей был одинаков. Однако согласиться однозначно с этим выводом нельзя. Действительно, деструктивные процессы и изменения в системе иммунитета могут играть определенную роль. Наши результаты свидетельствуют, что независимо от возраста у онкологических больных наблюдается достоверное увеличение содержания ААТ к ДНК и ДНП.

Пппрлрлянив УППВНЯ ААТ к яЛНК. лЛНК м ЛНП У_ЙПЛЪНЫХ_С

лимйпррплмйрратиинымм ■эяйпдрваыцдми- Нами исследованы сыворотки крови 66 больных со злокачественными опухолями системы кроветворения: лимфогранулематоз СЛГМ), хронический миелолейкоз СХМЛ), хронический лимфолейкоз СХЛЛ), острый лейкоз СОЛ). Показано, что в группе больных с лимфопролиферативными заболева-

ниями наблюдается увеличение содержания ДАТ к ДНП С табл. 2). Достоверно высокий уровень этих ААТ обнаружен во всех изученных группах больных с ЛГМ. хроническим лимфо- и миелолейкозом, острым лейкозом. Содержание ААТ к ДНП у больных с лимфопроли-феративными заболеваниями сравнимо с уровнем этих ААТ при СКВ. Причем, как отмечалось выше, уровень ААТ к ДНП при этом аутоиммунном заболевании самый высокий. Особо следует отметить, что уровень ААТ к нДНК, дДНК при ЛГМ достоверно превышает пороговое содержание этих ААТ в норме и сравним с уровнем этих ААТ при СКВ.

Таблица 2

Содержание аутоантител к ядерным антигенам в сыворотке крови больных лимфопролиферативными заболеваниями

1 1 1Заболе-1 п 1 1 ААТ к нДНК 1 1 ААТ к дДНК I ААТ к ДНП 1 1 |

1вание I 1 _ 1 1 Хв±ш I td 1 | 1 .1 1 1 Хв±т | 1(1 1 Хв+т I td 1 II II

1 ЛГМ I 6 1 1 11.08±0.061 7.94 1 С Р>0.999 ) 1 1 I I 1.43±0.08I 8.55|0.94±0.22| 2.911 С Р>0.999 ) 1 С Р>0.99 ) 1 1 |

1 ХМЛ I 22 1 1 10.66±0.091 3.40 I С Р>0.99 3 I 1 1 1 1.04±0.07| 1.10|1.14±0.07114.251 Сне достоверно)! С Р>0.999 ) 1 1 |

1 ХЛЛ 1 20 1 1 10.80±0.051 0.81 |Сне достоверно) 1 1 1 1 1.00±0.081 1.8810.95±0.05112.111 Сне достоверно)1 С Р>0.999 ) 1 1 |

1 ОЛ I 1 1 18 1 1 10.83±0.071 0.28 К не достоверно) 1 1 1 1 0.98±0.081 2.4811.11±0.08112.861 С Р>0.99 ) I С Р>0.999 ) 1

ВЫВОДЫ

1. Разработана иммуноферментная тест-система для количественной- определения уровня аутоантител к нативной, денатурированной ДНК и ДНП в сыворотке крови человека.

2. Показано, что в сыворотке крови здоровых людей постоянно

обнаруживаются аутоантитела к различным видам ДНК. Установлен пороговый уровень содержания этих аутоантител у здоровых людей, который составил 0.82±0.06 отн.ед. . для нативной ДНК. 1.08±0.08 отн.ед. для денатурированной ДНК и О.62±0.11 отн.ед. для ДНП. Наиболее высокий уровень аутоантител у здоровых людей обнаружен к денатурированной ДНК.

3. Показано, что при аутоиммунном заболевании системная красная волчанка уровень всех аутоантител превышает норму в 1.5 -10 раз. Высокий уровень аутоантител к ДНП свидетельствует о выраженной аутоиммунной патологии при этом заболевании и может являться диагностическим признаком при отсутствии клинических проявлений болезни.

4. Установлено, что туберкулез и стрептококковая инфекция не вызывают выработки перекрестнореагирунцих антител к ДНК и ДНП. Уровень аутоантител к ДНК и ДНП при этих заболеваниях не превышает порогового уровня содержания аутоантител в норме у здоровых людей.

5. Установлено, что у онкологических больных наблюдается увеличение содержания ДНК в плазме крови.

6. Показано, что при лимфогранулематозе, раке молочной железы, раке легких и желудочно-кишечного .тракта уровень аутоантител к нативной и денатурированной ДНК превышает пороговый уровень их содержания у здоровых людей.

7. При лимфопролиферативных заболеваниях, таких, как миело- и лимфолейкоз, отмечено повышение содержания аутоантител к ДНП в сравнении с пороговым уровнем их содержания в норме. Уровень аутоантител к нативной и денатурированной ДНК при этих заболевании не превышает порогового уровня нормы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Саттарова ЛИ., Аглиуллина Д. Г., Винтер В. Г. Ауто антитела к ДНК и ДНП в сыворотке крови здоровых доноров. - Москва, 1993. - 13 с. - Рукопись представлена ред. журн. "Иммунология". Деп. в ВИНИТИ, N 3177-В от 23.12.93

2. Саттарова Л. И., Гафиятуллина Л. А., Аглиуллина Д. Г., Винтер В. Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК // Биотехнология. - 1994. - N11-12 С в печати)

3. Саттарова Л.И., Гафиятуллина Л.А., Аглиуллина Д.Г. Оптими-

зация условий сорбции ДНК на полистироловых планшетах отечественного производства для иммуноферментного анализа антител к ДНК. - Казань, 1994. - 10 е.-Рукопись представлена Казанским ун-том. Деп. в ВИНИТИ, N 2609-В 94 от 16.11.94 4. Vlnter V.G., Agliullina D.G.. Sattarova L. I. / Autoantibodies to nucleic acids In neoplasia // accepted to XVI European Congress of Allergology and Clinical Immunology ECACI'95, Spain, Madrid, June 1995.

Сдано в набор 24.04.95. Подписано в печать 25.04.95. Форибум. 60 х 84 I/I6. Печ.л.1, Тираж 100. Заказ 183.

Лаборатория оперативной полиграфия КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5