Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталитические функции антител и экспрессированных фрагментов кДНК ферментов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Каталитические функции антител и экспрессированных фрагментов кДНК ферментов"

Й 3®

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.083.3

ГАБИБОВ Александр Габибович

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ АНТИТЕЛ И ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ кДНК ФЕРМЕНТОВ

03.00.03 — молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в виде научного доклада

Москва 1992

Работа выполнена в группе химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАН, профессор,

доктор химических наук В. К. Антонов

член-корреегтондеит РАН, профессор,

доктор химических наук А. А. Богданов

профессор, доктор биологических наук О. А. Поляновский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Химический факультет МГУ им. М. В.Ломоносова, кафедра химической энзимологии

седании Специализированного совета по защите докторских диссертаций Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта.

Защита состоится

часов на за

Реферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических паук

о

ОБМл ЛА2АКТЗРЖ11ЖА РА50ТК

Актуальность проблема. Последнее десятилетие' отмечено революционными успехами в области биокатализа /см. схему I/. Наряду с развитием традиционных исследований природных ферментов, а также катализа ионами металлов и модельных систем в больней степени на основе кофакторов ферментов, были инициированы работы по получению альтернативных биокатализаторов.

Успехи развития биокатализа

Природные- ферменты Катализ ионам

металлов

Лутантные ферменты,

полученные методам Каталитические ВЕК,

сайт-каправленкогс рибозимы

мутагенеза

Биокатализаторы-гибридныг бедки

С широким внедрением в энзикологио техники рекомбинантных ДЖ были получены мутантные ферменты с измененными каталитическими свойствами. Открыта каталитическая функция ЕНК, исследованы свойства рибозимов. Другим важнейшим достижением в области биокаталя-за последних'лет является получение каталитических антител или абзимов, моноклональных антител на стабильные аналоги переходных состояний ферментативных реакций. Новые направления развиваются в

Схема I

Модельные системы,

кофакторы ферментов

Каталитические-антитела, природные и индуцированные аб-ззмы

тесной взаимосвязи с традиционными, сбогацая тем самым друг друга как в плане постановки фундаментальных задач, так и методически.

.Действительно, например, само наличке у РНК каталитической функции органически связано с эволюцией бисжатализа /см.схему I/. las многие асфакторы ферментов /модельные-, системы/ имеют куклеоткдную природу, т.е. являются в известной степени фрагментами РЫК. А ионы металлов, участвующие в электрофильном катализе, необходимы для протекания реакции с участием ркбозимов. Для исследования структурно-функциональных взашоотнсоекий в ферментах в течение многих лет ранее прзаменялись методы сайт-направленной химической кодификации и ограниченного протеолиза белковой молекулы. В настоящее вреда эти метода эффективно дополняются методами сайт-направленного мутагенеза и исследования доменной структуры фермента с помощью изучения свойств экспрессированыых фрагментов! соответствующих кДНК /биокатализаторы-гибридные белки, см.схему I/. Последней подход нашел свое отражение в данной диссертации.

Появление: абзкмов также нельзя считать неожиданным. Идея использования высокоаффинного связывания антиген-антитело для имитации столь жз высокоаффинного взаимодействия'аналог переходного состояния - фермент принадлежит В.Длсенксу. Гак км образом, исходя из теории активированного комплекса* антитело; полученное на стабкьжй аналог переходного состояния, дол-ино эффективно его связывать и мо-•«ет каТ£.икзгроЕать соответствующее. химическое превращение. Неслучайно, что эта весьма понятная, но в то же время глубокая идея получила свою реализацию только в последних исследованиях. Естественна: тср.,:озсм исследован;:;: в облас::: абгимов в 7С-ие годы лги-

лось е^е недостаточное развитие представлении с структуре ссст-ветствуадих переходных состояний фер.'гентатинных превращений, методов их синтеза, а также отсутствие технолога .'/.скокдснальнкх антител, методов их получены и селекция. лак и Есякая смежкаэ. область, возникшая на стыке двух традиционных. ¡: давно развиваемых направлений - химической энзимслсгии п хгггукслсгнн, асзнмсз

потребовала одновременного и интенсиЕнсгс развития как г::з:::.с~лг-мпческкх подходов и методой синтетической'сргакическс" .т.:.' ::-, :..=>: и иммунологических методов. Сегодня можно узе с уверенностью сказать, что абзимология бистро акцептировала все современные достижения. в исследовании ферментов - сайг-направлэннкй мутагенез, адресованную химическую модификацию белковой молежулы антитела специфическим и аффинными метками, метода стационарной и быстрой кинетики и физико-химические:, оптические, методы исследования ферментативных реакций» В этой области с успехом начали применяться все последние достижения гибридошон техники, а также намечаются перг-спектшзы по активному использованию методов генетической инженерии антител. Все это может превратить абзимологию из области чисто научного: курьеза в ванную фундаментальную ветвь современного Сиокатализа, в практически ценное направление, биотехнологии.

Сегодня, несмотря на то, что круг реакций, катализируеьмх абзи-мами значительно расширяется, необходило признать, что наибольший успех абзимология достигнув в исследовании реакций, имитирующих действие протешгатических ферментов. Это объясняется проведением достаточно глубоких исследований в области химии переходного состояния, и,в частности, наличием широкого круга фосфорорганических соединений - аналогов структуры переходного состояния с тетраэд-риче.ским атомом углерода. На сегодня нет сколько-нибудь серьез-

нкх исследований в областд абзимологии превращений ДЫК. Это связано с существованием естественных преград развитая этого направления - отсутствием доступных аналогов переходных состояний реакции метаболизма ДНК.

Е основу настоящей диссертационной работы положена концепция существования природных абзимов. Наш высказано предположение о существовании природных каталитических антител к ДШС среди множества ZüK-актител, имеющих место при развитии аутоиммунного процесса у Ч( ловека. Выдвинутая концепция нашла подтверждение в работах группы С.Паула /Университет штата Еебраска, США/, где: обобщены данные по каталитической активности аутоантител к вазоактивному интестиналь-ному пептиду.

цель и задачи исследования. Главной целью настоящего исследования явилось расширение, представлений о свойствах и функциях биокатали- заторов:, исследование функциональных свойств экспрессированнкх фра ментов кДЕК ферментов к экспериментальная проверка выдвинутой гипотезы существования природных ДДК-абзимов. Конкретными задачами был:

1.исследование каталитических своЛсте продуктов экспрессии фрагментов jwiK ключевого фермента обмена серосодержащих аминокислот цш татионазк.

2.Исследование функциональных, каталитических, свойств продуктов экспрессии фрагментов хДНК топоизомеразы I.

3.Получение антшдиотипичесхих аутоантител к топоизомеразе и исследование их функциональных свойств.

4.Доказательство наличия каталитической активности у аутоантител.

Научная новизна. Сформулированы представления о функциональной активности зкспресслрованных фрагментов кДНК ферментов, Исследования функциональной активности проведены на двух ферментах: цистатионазе и тсг-поизамеразе I. Обнаружена каталитическая активность экспрессированных фрагментов кДЖ цистатионазы. Показано, что каталитические свойства зависят от протяженности экслресюарованшго полйлептвда. Обнаружь фрагмент топоизомеразы, взаимодействующий с моноклонаяьными антителами к ферменту и ответственный за связывание антител из аутоиммунной сыворотки. В'сыворотках крови больных системными аутоиммунными заболеваниями обнаружена ангивдиоттические антитела к топоязомеразе I. Показана их внсокоспецифическая ДНК-связыванщая активность. Выдвинута гипотеза о существовании природных каталитических антител и получены экспериментальные данные, подтверждающие; существование ДНК-гидролизувдих аутоантител.

Практическая ценность.Впервые показано, что топокзоиераза I является "характеристическим антигеном"' не только при склеродермии, но и при ряде других аутоиммунных, заболеваний» Рекомбинантная топоизоме-раза, содержавшая фрагмент молекулы, ответственный за связывание аутоантител, с успехом заменила труднодоступный нативннй фермент в диагностических тест-система». Исследование; уровня антиидиотипичес-ких антител к топоизамеразе и уровня антител, обладающих каталитической активностью в сыворотках крови больных аутоиммунными заболеваниями, может составить основу для разработки прогностических К|И}те-зкев развития системного аутоиммунного процесса, Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 14-эм и 1а-ом Международных биохимических конгрессах /Прага, 1988; Иерусалим, 1991/, на IX конференции ФВВО /Будапешт, 1990/, на Мездународ-

б.

ной конференции "Топоизомгразы в химиотерапии" /Еатойа, 1991/, на 8-ом Международном симпозиуме по Витамину В^ и карбонильному катализу /Осака, 1930/, на Лелщународкой конференции "Ферменты, в органическом; синтезе" /дью-Дели, 1Эа2/, на Всесоюзном симпозиума "ймму нолосичесхие аспекта аутоиммунных заболеваний и вторичных лымуноде фицигов человека /Новосибирск, 193Э/, на У Всесоюзной конференции "Метода получения и анализа биохимических. реактивов" /Юрмала, 1587 на конференциях научных работ *3нстигута молекулярной биологии, км. Ь.А.Энгелъгардта ВдН. /Москва, 1эй<5,193^,1 ааО /, на семинарах "¿Молекулярная иммунология"' /ЙЛБ, 1ЭЭ0/, Кафедры биохимии Токийского У: верситета /Токио, 1990/, Кафедры биохимии Университета гЛсукуба/Г куба, 1991/, на Всесоюзном биохимическом съезде. /С-Петербург, 1932,

Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в саааторсхв с З.С.Алекберавсй, И.Б.Бронштейнам, Г.ВЛГололабавым, й.й.Грамовсй, О.А.&зашук, Ч.Б.Зрокаевай, А^.ломутовым, Р.М.Хомутавнм, А.М.Шусте ром. Вклад других соавторов отражав в публикациях по темг диссерза цки» Ьсем коллегам автор приносит благодарность за. участие в совме ных работах и обсуждении результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОШ И ИХ ОБСУЖДЕН]®

.ФУНКЩЮНАЛШОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ЭКСПРЕССИИ ФРАЫШОВ кДНН. ФЕРМЕНТОВ.

Структурно-функциональнве исследования являются важнейшей состав-шцей современной энзкмологии. Исследование молекулы фермента с по-эщыо методов ограниченного протеолиза и сайт-направленной химической эдификации позволяло в принципе построить доменную структуру фермен-1 еще до стадии рентгено-структурного анализа. Активное внедрение тех-зки рекомбинантных ДНК в энзимологическую практику внесло существенна коррективы в упомянутые подходы. Внесение направленных точечных му-аций в большинстве случаев позволяет вполне адекватно решать задачи, гавившиеся ранее перед химической модификацией. Вполне адекватной за-гной на наш взгляд,метода ограниченного протеолиза явилось бы функ-юнальное исследование продуктов экспрессии фрагментов кДНК ферментов, зскольку фрагменты кДЖ различной протяженности экспрессируются как эавило в векторах в составе, фьюжен-белков /или гибридных белков/, это травление было определено нами ранее как "энзимология фьюжен-белков"'. зедставляется целесообразным перечислить потенциальные возможности зе сложенного подхода:

'Исследование доменной структуры фермента.

'Исследование доменоэ, содержащих активный центр, регуляторные центры фермента,

'Обнаружение эпитопов, связывающих моноклональнне антитела. Построение линейной функциональной схемы молекулы фермента. 'Исследование проблем фоддинга доменов.

Предложенный подход мы решили использовать для анализа струк-

турно-функциональных взаимоотношений ключевого фермента метаболкз- ' ма серосодержащих аминокислот - % -цистатионазы и ¿Щ-топоизамера-зы I типа.

I .Исследование- каталитической активности экспресстрованных фрагментов кДНК ^цистатионазк.

Одним из современных методов клонирования генов эукариот является иммунологический скрининг библиотек кДНК,- полученных в энспрес сирующихся векторах. В этих системах экспрессируются фрагменты кДНИ различной протяженности. Таким образом можно исследовать "семейства ферментов, используя при этом традиционные энзимолагические приемы и методы, что в конечном итоге- должно расширить наши представления о ферментативном катализе. Б настоящее время в литературе имеются лишь единичные сообщения об исследовании функциональных свойств прс дуктов экспрессии в составе; гибридных белков /Кауфман, 1985; Черч^ 1991/. В настоящем разделе- мы рассматриваем этот подход на примере ^-цистатионазы. Нарушение активности этого фермента, обусловленное в том числе е точечными мутациями в кДЕК., приводит к развитию тяжелого наследственного заболевания человека - цистатионинурзш /Штурман, 1986/. Фермент полифункционален и катализирует, в частности, превращение цистатионина в цистезш с образованием с^ -кетобутирата, В результате иммуноскрининга экспрессируидейся библиотеки кДЕК в прокариогическом векторе Х1^ 11 нами было" получено несколько позитивных клонов, содержащих, фрагменты кДО фермента. Продукты их экспрессии представляли гибридные белки цистатионаза - Ц>-гаиакт.ози-даза, которые были очищены в препаративных количествах и проанализированы /см, "1*1етодичаскую часть"1/. Молекулярные массы гибридна белков были оценены с помсацью выспкаэффекташой жидкостной хрома-

гографжи в релима идеальной гель-фильтрации /ВЭ£Х/ в присутствии ),1 Ь D S. Они составили: 125, 135, 120 лЛ/ I - Р» 125, Б - Pi 135 i Е - Б-ь 120/. Еаш были исследованы каталитические свойства очи-аенных белков. Оказалось* чт.а гибридный белок Б -£* »¿достаточно эффективно катализировал превращение модельного' субстрата гомосерина

з rf. -кэтобутират / ккат> / ^ = 4 3,jq3 jfV*1 /. Методам ВЭЗХ в абра-

' ¿Я *

зеяной фазе был идентифицирован накзгшшащийси продукт в форме 0-бен-

зилоксима. Кинетические? параметры исследованных гибридных белков и на-

гивной цистатионазы приведены в Таблице I. /¿Идентификация ^-кетобутира-а представлена на Еис.1/

Таблица I

Синетические параметры гибридных белкоъ и цистатионазы

(атализатор

м

нкат.»°

ккат./ !ГЬ-1

? - Ее 125 5 - Ег 135

• - Ft 120

хистатионаза

-4

7 • 1й" 7 • 1С-4

? »10'

а то"4

i.o

з,о о.з

35

1,4 • 10 4,3 ЧО3

4,3 • 10

7,0 «Ш

4

Из данных Таблицы I'следует, что хотя константы Лихаэлиса для гиб-ээдных белков и нативной цистатионазы отличаются незначительно,-каталитические параметры исследованных белков варьируют существенно. Незначительную разницу в значениях К-<5 можно объяснить достаточно жеет-свш требованиями к Р1, Реферирующему району молекулы биокатализато->а„ Исходя из анализа величин ккат » мо^о утверждать, что нал-

ЕисЛ Образование- сА -кетабутира-та в'присутствии 20 мке гибридного белка Б - ?г 13&. Инкубация 2 часа при 32°С. Состав субстратной смеви: 10 гомосерина, 0,2 и, Р1 В, 50 мМ калий-фосфатный буфер рН После инкубации субстратно смеси в реакцию при рЕ 5,5 добавля ли О-бенаилгидроксиламйН до конечной концентрации 10 мХ Инкубация 4 часа при 37°0. Смесь разделяли на ВЭХС колонке

Скорость потока I мл/:лин. Злюиро-ванные пики соотнесены со стандартами, слева направок О-бензилгид-роксиламин, О-бензилоксим с^-кето-масляной кислоты, О-бензилоксим пи ридоксаль-5»фосфата.

Вис.2 Ингибированиа реакции деградации гомосерина под действием гибридного белка и цистатионазы

-аминооксизтил) - Ъ -цисте-

ином.

те

болея эволюционко соверлгнным биокатализатором является собственно нативная цистатионаза. Наиболее близок к ней Р - Ег 135, отличающийся также значительной стабильностью. Этот белок сохранял нативист каталитическую активность при длительном хранении /две недели, +4°С/, что вполне- соответствует данным, известным для цистатиа-назы. Два других исследованиях белка теряли каталитическую активность в течение одного дня. Шми были идентифицированы также гибридные-- белки, содержавшие-- кДМ цистатионазы, но не обладавшие- каталитической активностью. Некоторые из них обладали ингибирукхцим эффектом на реакцию, катализируемую нативным ферментом. Если прежние подхода, применявшиеся в знзимологии, основывались на неизменности биакатализа-тора /исключая методы химической модификации/ и на модификации субстратов, ингибиторов, эффекторов, то приведенный з настоящем разделе материал в принципе позволяет исследовать, например, энергетику реакции, фолдинв на уровне измененных молекул биокатализатора.

Известно, что 0-заыещенные гидроксиламины являются типовыми ингибиторами Р1. Р-зависимых ферментов. Дот повышения их селективности было предложено использовать соответствующие еубстрато- и/или продукто-подобные структуры» Б частности,субстратоподобный й-1р>- аминоокси-этил)-Ь -цистеин спетяфически тормозил цистатионазу, образуя(как и гидроксиламин-содержащие аналоги аспартата в случаее аспартат транс-аминаз^, оксим фермента,.моделирующий по-видимому одно из промежуточных соединений, возникающих в ходе ферментативного катализа. Как видно из дачных,, приведенных на Вис.2, упомянутый субстратоподобный ингибитор также эффективно ингибировал реакцию элиминирования, катализируемую гибридным белком Е-Ръ 135 /к1ШЕ =0,06 мин"^/. Таким образом, нами показано, что 0-замеэденнае гидроксиламины, мишенью

которых является пиридоксальфосфат в составе холофермента, ингибиру ют гибридны!; белок, содержащий в своем составеь фрагмент цистатионаз Это является дополнительным подтверздением участия ЕЪ Е в реакции, а близость кинетических параметров ингибирования /см.Ряс.2/ являете свидетельством в пользу идентичности механизма шшибирования. Наш было исследовано также? влияние пропаргилглицина, сьюисиидальнсго ин гибитора ряда ЕЬ Е-зависямых ферментов. на реакцию, катализируемую гибридным белком. Известно, что соединения этого типа взаимодейству ют как с кофактором, так к содной из функциональных групп белка, ра положенных вблизи субстратной площадки, результатом чего является н обратимая инактивация фермента. Однако, пропаргилглицин не- оказывал ингибирующето действия на реакцию, катализируемую гибридным белком в отличие от реакции, катализируемой нагивным ферментом. Отсутствие торможения можно объяснить возможностью экранирования ингибитор-ак-цептирующе£ группы, в частности, из-за присутствия фрагмента р* гал тогидаэн или из-за меньшей нонформационной доступности соответствующего участка белка.

2.Исследование функциональной активности экспрессированных фрагментов к£аК топоизомеразы I.

Топоизсмеразы эукариот I типа - ферменты, обладающие способной* изменять конформацизо ЛДК путем введения и последующего зашивания од цепочечных разрывов, играют существенную роль в макромолекулярном ь таСолкзме ДйК,. принимая, по-видимому, участие во всех генетических процессах. Рассматриваемый нами подход к структурно-функциональном? анализу сесмектов на основании исследования свойств продуктов эксщ с;::: кДлН достаточно перспективен для топоизомераз из-за полифункцис нальнссти этих ^еркентсв, а также из-за того, что 2/3 нативного йе]

ента не принимает участие в каталитическом акте разрыва-соединения осфодиэфирной связи. Интерес к структурно-функциональным исследовании топоизомеразы I вызван еие и ее связью с аутоиммунным процес-ом. Так, в исследованиях Ротфилд ж Эрнпоу ДЭЗй/ было показано, что опоизомзраза I является "характеристическим антигеном" при системной клеродермии. Отсюда возникает вопрос о локализации фрагментов белка, тветственных за связывание моноклональннх антител и аутоантител к ерменту.

В результате ишунасхрининга библиотеки kJ52C плаценты человека в кспресотрущемся векторе2 с применением неизодшнай детекции

a основе авилин-биотинавай системы было получено несколько клонов, ававагах положительный ответ на аффинао-очищенные антитела к топо-зомеразе, полученные из аутоиммунной сыворотки. Продукты экспрессии эаиметтав кДОК были выделены в препаративном количестве /см."Методи-гскую часть"/. Молекулярная масса била определена, как. описано В: пре-|дущем разделе, и составила I6Û и 180 кД. На схеме 2 представлена ipia зкспресскрующейся части вена топоизомеразы I человека.

- Human toi» I сША 3Û45 bp-

-P3 £330 bp -

SH SS S E

-1 I." ..■Wy Я .LU li'J "I ■J..'WI I'..1..' ' ..j-^yjfe .¡»-.I .'UUIIH [ ilUMH-

503 ауОгвОу8(Зе;гХ£иАг4Та1С1иШаПй 617

3 - ЕаиЯА. - '

Н -Н1п<Ш Е -ЕсоШ

:ема 2. Схематическое изображение экспрессирушейся части гена топо-

юмеразы. 1.йтмечениый клон: Вь один из идентифицированных нами. Он »держит каталитический центру участок, связывания моноклональных ан-;тел, аутсантител и консервативный ДНК-свяэывающий полилептид/ЬОЗ -7 аминокислотные остатки/.

Наиболее интенсивному анализу был подвергнут клон Рд, отмеченный на схема:- 2. Он кодирует фрагмент топоизомеразы с 362 по 765 аминок» лотний остаток. Частичный сшсвеис клона продемонстрировал, что клон является составной частью топоизомеразн I человека /ЭрншоуД988/. Qi наруженные наш гибридные белки в своем составе содержали клон. Pg. j идентифицированные экспресстрованше. фрагменты не обладали релаксир; ющей активностью. В ряде случаев они ингибировали реакцию релаксацш тогда как клон TIA, идентифицированный Эрншоу. /1938/, обладал слабсп каталитической активностью.

Мы исследовали способность идентифицировашшго гибридного -белка, с: зывать моноклональныа антитела /полученные А .В .Тимофеевым в йнотиту. молекулярной биолсшии РАН/ и антитела, выделенные: из аутоиммунных ci вороток. Для количественной оценки связывания моноклональных антите. с топоизомеразой и идентифицированным гибридным белком мы воспользо: лесь линейным преобразованием изотермы адсорбции в координатах Скэт-чарда. Как видно из графика, представленного на Рис.3, исследуемые моноклональные антитела высокоспецифично взаимодействуют с нативной топоизомеразой /Кдао =4,5ни1/ и с экспрессированным гибридным белкам /К„ис =5.,? нМ/. Следовательно, рекомбинантный белок, может в ряде- сл; чаев заменить нативнуа тодоизомеразу, которая является весьма труда! доступным ферментом. Это практически оправдано при исследовании спе: фического связывания аутоиммунных, сывороток с топоизомеразой.

Таким образом, эпитоп связывания моноклональнаго антитела входит в структуру вдентифицированнота гибридного белка.

Впервые в работе Эрншоу с соавт. /1986/ было показано, что при си темной склеродермии в сыворотках крови больных повышен титр антител

К£, 4.5 пМ

РЮТЭ топо-АВ а-ТОР I

ТОР I

Рис.3.Определение константы диссоциации топоизомеразы из плаценты человека и экспресси-рованного гибридного белка с монаклональными антителами к ферменту.

к топоизомеразе. Получив сведения о - специфическом характере взаимодействия моноклональных антител с рекомблнантннм ферментом, мы использовали последний для скрининга ряда аутоиммунных сывороток. Согласно данным, приведенным в Таблиц® II, ряд больных с системной склеродермией /СКЛ/, системной, красной волчанкой /СКВ/, ревматоидным артритом /РА/, болезнью Лайма /ЕЛ/, системным заболеванием-соединительной ткани /СЗСТ/, псораатическим артритом /ПА/, давали устойчивый положительный ответ на рекомбинантную топоизомераэу. Величина ответа, воспроизводимость результатов соответствовала опытам, в которых в качестве антигена использовалась нативная топоизомераза из плаценты человека. Таким образом, полученный нами рекомбинантннй белок метает заменить

Таблица

Положительная иммунологическая реакция сывороток крови больных ауте иммунными заболеваниями на гибридный белок, моноклональные антитеж к топонзомеразе: и на антитела к ДНК

Аутоиммунное Общее; ____Положительная реакция

заболевание^ количество рекомбинант. топоизомераза моноклон, антитела к ферменту антитела к да

РА 10 7+- 7+ 10+

СКВ 15 4+ 4+ 15+

СКЛ 9 9+ 9+ 9+

БЛ I 1+ 1+ 1+

сза I 1+ I* 1+

ПА I 1+ 1+ 1+

^Все больные были обследованы в клинике Института ревматологии АШ Росски^Диаглоз был достоверным и соответствовал критериям Американской ревматологической ассоциации /АРА/. Количественный анализ взаимодействия антиген-антитело проводился с помощью Е1-1&А метода. Гибридный белок подвергался очистке на гель-фильтрационной колонке ЬЭдХ к' ЗОШ^уу /Подробнее см."Методическую часть"/. Отрицател ным контролем при исследовании взаимодействия моноклональных антите с сыворотками крови служили моноклональные антитела к белка!/ оболе ки вируса картофеля. Достоверным считался результат, превышающий фс на Ю0£. Рабочее разведение сыворотки 1г1СЮ.

. тг-

- Расшифровка обозначении дана в текста на стр,15.

ативную топоизомеразу в к-сгуяологических исследованиях в качестве-^агностического теста для аутоиммунных заболевании. Использование кспрессированных фрагментов кШК ферментов для целей диагностики яв-яется весьма перспективным приемом. Недавне было показано, что. "ха-актеристическнм антнееэнам" является также топоизомераза II и некото-ые другие ферменты нуклеинового обмена. Все.- они в большинстве своем руднодостулны и весьма подвержены протеолязу. Работа же с экспресси-ованшми фрагментами вполне:-технологична и позволяет обеспечить необ-эдимое1 количество воспроизводимых и надежых тест-систем. Б литературе имелась неоднозначность относительно, высокой специфич-зсти "топоиэомеразного теста" для системной склеродермии. По данным рншоу и соавт.ДЭйб/ была показана абсолютная специфичность этого эста. В исследовании Эшлимана с соавт.Д98Э/ были приведены данные наличии положительного, "топоиэомеразного теста" при ряде других ау-зиммунных заболеваний, в частности при СйЗ. Из данных, представленных Таблицей IX, следует, что наряду со 10.0/« положительной реакцией в слу-1е СКЛ, сыворотки при РА и й£В также иногда дают реакции на топоизо->разу. Следовательно, по нашим данным "топоизомеразный тест" не являе-:я абсолютно специфичным для СКД,

Таким образом, нами бала выдвинута концепция исследования функ-юнальных. свойств экслрессирозанных фрагментов кДНК ферментов, что было продемонстрировано в настоящем разделе. Впервые обнаружена и ис-[едована каталитическая активность экспрессированных фрагментов кДНК ютатионазы, исследованы функциональные свойства фрагментов кДЙК то-шзомеразы.

18.

П. АНТШДИОТИШЕСЖЖ АНЖЕЛА К ТШСИЗОШРАШ I Б СЬВОЕйШХ .

крови больных аутожшшыш зшжвшшт.

Получение; специфически* антител к различным физиологически акт ныы соединениям, их предшствешникам, аналогам переходных состояли! ферментативных реакций: пептидам, белкам, белковым ингибиторам и фе ментам получает в последнее время новое развитие благодаря появлеш новой области на стыке1 энзимологив и имиунолашш- - биокатализа аяп телами ила абзииами, 1ак как ключ к пониманию каталитических функщ биокагализаторсв лежит чефев исследование их специфичности, то и а рейший вопрос иммунологии - взаимодействие антиген-антитело требует теперь исследования в новой плоскости на молекулярном уровне.

Концепция имкщнологической сети НильсаЕрни Д974/, описываща? иммунную систему как. тонкий саморегулирующийся механизм, функционирующий благодаря динамическому равновесию-вдиотшг-антиидиатш, элиминировала во многом формальную разницу мевду антигеном и антителом /см. схему 3/. .....

Схема 3. Взаимодействие идиотип-антиидиотип согласно концепции идаотипическай сети йильса Ерни,

Fab ; Fe

Antigen

_Antibody --*

АЬ1

Anti-idioiypis antibody At>2

Эта обстоятельство натолкнуло нас на мысль необходимости исследования функциональных свойств антиидиотипических антител как потенциальных биокатализаторов. Характеристика, антиидиотипических антител как "внутренних образов" антигена отбыла самостоятельное направление' современной молекулярной биологии и биохимии. В области фундаментальных исследований: дизайн и исследование свойств антиидиотипических антител, молекул белка, иммуноглобулиновой природы, отличающихся от молекулы первичного антигена, но в качестве его "внутреннего образа", отображающих, хотя бы частично его свойства. В изве-стнэм смысле здесь реяь идет о передаче информации от белка к белку, безусловно с использованием генетического аппарата иммунной системы.

В практической области исследование антиидиотипических антител служит основой: для создания вакцин нового поколения. Представляет интерес исследование антиидиотипических антител при аутоиммунном процесс, се. Согласно некоторым из имевшихся концепций развития аутоиммунного процесса равновесия идиотип-ангжвдиотап могут свидетельствовать о глубине протекания заболевания.

I.Идентификация антиидиотипических антител к топоизомеразе I в сыворотках крови больных аутоиммунными заболеваниями и их очистка.

лак отмечалось выше, при аутоиммунном процессе имеет место развитие вторичной сети антител. Следовательно, можно предположить, что при наличии значительного уровня первых антител к топоизмеразе I, обнаруженных при аутоиммунных заболеваниях/смЛаблицу II/, может такке наблюдаться вторичный ответ, то есть антвдшютиппческиег антитола к Ферменту. Специфическим антигеном могут тогда явиться мо-

2С

ноклональные антитела к ферменту. По данным Таблицы II сыворотки, больных СКЛ характеризовались высоким процентом положительных ответов на моноклональные антитела к тшоизомеразе. Положительная реа ция наблюдалась также при СКВ а РА. Положительный ответ часто совпа дал с большим уровнем ответа в "топоизомеразном тесте", но корреляцию абсолютных значений нам установить не. удалось. Как правило, осо бенно высокий ответ наблюдался при бурнопротекавдих заболеваниях. Наличие положительных реакций на моноклональные антитела к топоизо-меразе дало основание предположить,, что при некоторых формах аутоим кунных заболеваний в сыворотках крови больных накапливаются антивди типические антитела к ферменту. Необходимо было продемонстрировать специфический характер обнаруженной реакции.

Нами был получен Р ав-фрагмент моноклонального антитела, С пдаощ: аффинной хроматографии на протеин-А сефарозе нам удалось очистить Р фрагмент до гомогенного состояния /Рас„4/. Сыворотка больного с рев; тоидаым артритом, дававаая высокий положительный ответ на топоизоме^ зу и на моноклональные антитела к ней, была подвергнута высокоэффек-ной жидкостной хроматографии на гель-фильтрационшой колонке ТДК £> 40-Ои /Рис.4/. В соответствии! с условиями, описанными в "Методич; ксш части", нам удалось разделить фракции иммуноглобулинов аутоимму! ной сыворотки. По данным Е11 в метода моноклональные антитела в: ккодействовали только с 1^0, фракцией антител. Полученные данные свид; тельствуют в пользу специфического характера взаимодействия монокло-нальных антител с аутоиммунной сывороткой, так как наиболее вероята неспецифическкй ответ е этом случае:, вызванный ревматоидным факторог. связан, как правило, с Е с -фрагментом иТ§М -фракцией сыворотки. Та-образок, в аутоиммунных сыворотках, дающих положительный ответ

тЛ

'Кг

-м^ 1

I 12113

II

4 ъ

(Ьомг$ )

в

«к -

68

29

РисЛ. Доказательство специфичности связывания моноклональных антител к топоизомеразе I с аутоимь^гаными сыворотками. А.Щ>офиль элюции- аутоиммунной сыворотки С.-ВЭЖ гель-фяльтрационнвй колонки Т5 « й 4000 /21.6 х еООмм/.ЗйЛ -электрофорез фракций иммуноглобулинов /Нетяжелая цепь ; Ь „-легкая цепь Г^ /_ В» 3 -электрофорез моноклональных антител к топоизомеразе^: пала-иновый гидролиэат/справа/, 2 ав-фрагмент, очищенный на протеин А-сеэфа^азе5 /слева/.

сб.

на моноклональные антитела к топоизомеразе Ь, по видимости, накапливаются ангивдиотигаческие антитела к ферменту.

£а схеме 4 представлены основные этапы выделения антиидиотипичес-ких антител, а также их детекции. Б препаративном варианте антитела выделялись с использованием поликлональных антител к ферменту, полученных в свои очередь на носителе с привитой топоизомеразой 1/см. стадии 1,2,5, схемы 4/. На стадии 4 из аутоиммунной сыворотки получались антиидиотшические антитела, которые подвергались дальнейшей очистке: на гель-фильтрацдонкой колонкее в условиях ВЭЖХ» Использование поликлональных антител для препаративных целей вместо монокло-нальных объясняется желанием получить более широкий спектр антиидио-тидических антител к ферменту, а также повысить.их выход.

Анализ данных, приведенных в Таблице II, свидетельствует, что многие сыворотки больных аутоиммунными заболеваниями содержат антитела к ДНК. Этот результат не: вызывает удивления, т.к. наличие антител к №К является характерным признаком некоторых аутоиммунных: патологий, например СйВ, Использованный нами достаточно чувствительный метод на основе- Е 1.1 £ Й -системы позволял детектировать антитела к ДЕК и в случае СНЛ и РА. В последнем случае нами зарегистрирован значительный процент положительных ответов по сравнению с известными литературными данными. Возможно это связано с анализом боль ных с бурнолр отекающими процессами«

По имеющимся современным литературным даннын^СтсшлярДЭЭй/ антитела к ЩК достаточжг разнообразны и их свойства, а также физиологическая функция при аутоиммунном процессе требует еще углубленного изучения. В настоящей работе мы не задавались целью подвергнуть их детальной классификации, однако, исхода из постулата об антивдиотипи

Детекция «итинднотнпических итгтел к топоизомеразе ! АУТолиития СУК*07К>

$3—топоюоы^лэл!

■ I

дюгсспигальнл* лиг

-0

полкхлонлльныг мтпглл к ТОПОКЭСЫЕИ13Е I

лпотмуннлл сывоготхл

— поликлмшьни!

АНТНТЕЛ* К ТОПОИММ£УЛЗ£ I

»лткидмотнпнчигт!

/

\

шисии» НА лшкши X л««

НА ионоклинл^ьнш

мпчтии К ТаК»ООМ£ГА31-

«ункиисмлличл» «ГОШДОИ. МНГИЬИГОвЛНИ*

нисиии

Схема 4. Выделение и детекция антивдиотшшчегских антител к топоизо-меразер I.

Все иммуносорбентк получены с помощью приливки белков к. 5>ч С ^-активированной агарозеЛБиолар"'/; целлюлоза с привитой двухспираяв-ной ДНК - препарат фирмы "Сигма". Иммунологические- свойства анти-идиотипичесхих антител как антител к ДЖ и антител к моноклонать-ным антителам к топоизомеразе I анализировались методом ЕЫ& А. Стандартный кит для детекции антител к ¿¡Ш -фирмы "Биолар".

ческих антителах как об антителах "внутреннего образа", отображайте по ряду свойств первичный антиген, т предположили, что детектировав ные антиидиотипические антитела к топоизомеразе, одному из основных ферментов метаболизма ДНК, могут обладать иммунологическими свойств* ми в отнолении ДНК. Следовательно:, во фракции ДНК-антител в аутоимм; ных сыворотках могут содержаться антиидиотпические антитела к ферме!

В соответствии с высказанными предположениями^ аутоиммунная сыворо: ка была также подвергнута аффинной хроматографии, на колонке с привитой двухспиральной ДНК /стадии 5,6, схема 4/. Специфически сорбированные фракции сыворотки /стадии 4 и а, схема 4/ были элшрованы и подвервнуты перекрестному анализу: фракция, элюированная с ДНК-коло! ки давала положительный ответ на моноклональные антитела к топоизоме разе, а ва фракции, элвираванной с колонки с привитыми антителами к ферменту, детектировались антитела к ДНК. Таким образом, используя последовательность стадий очистки, предложенных в схеме 4, мы получили антитела, специфически отвечающие, на моноклональные антитела к топоизомеразе.

2.Исследование свойств антиидиотипических антител к топоизомеразе I,

Как уже упоминалось выше, аятитела"внутренн£1сг образа" могут обладать >.рядом свойств, характерных для первичного антигена. Исследуя антиидиотипические антитела на ДИК-метаболизирующий фермент - топои: меразу, мы попытались выявить их специфичность в отношении ДНК и их роль в топонзомеразной реакции.

Б предыдущем разделе мы показали, что среди' достаточно .гетерогеза» популяции антител к ДНК, имеющих место- при аутоиммунном процессе, и ется незначительная фракция антител к топоизомеразе, которые облада] свойствами антител к ДНК. Представлялась интересным исследовать их

:войства как дНК-связивающгга белка. Для этапа мы исследовали взаимодействие натгакой топоизомеразы и антшдиотипических антител с фраг-дентом ДНК- частью глобинового гена, содержащего консенсус нуклеоти-ЮТ,. специфический к топаизомеразе I /400 пар оснований/. Эти данные тредстявлены ка Еис.а* йтлажение данные по связывании в координатах ¡¡войнах обратных величин дало возможность определить константы диссоциации комплексов ДНК-фермент /кривая I/ и ДНЕ-антитеото /кривая 2/, )нй составляли и ОДЗ н«!, соответственно. Тот факт, что кон-

:танты диссоциации столь малы свидетельствует а: наличии высоноспеци-Ьического связывания. Эти значения близка известным константам диссо-даацил комплексов ДНК с белками-регуляторами генетической активности слетки, обладающими специфической ДаК-связывающей активностью. При этом в первичной структуре топоизомеразн имеется специфический кснсен-:ус, характерный для ДНК-связывающих белков /см. схему 2/. Наличие ¡го мы продемонстрировали в ходе исследования первичной структуры' обнаруженного, клона Bg.

Необходимо была уделить особое внимание: специфическому функциональ-юму характеру обнаруженшню высскоаффинжшо связывания. Для этой nein нами был получен 5 ав-фрагмент антиидиогипичехжих антител/Рис.6/ Оделенные антиидиотпические антитела были подвергнуты папаинолизу, грапущенн через протеин А-сефарозу и затем очищены на колонке: т$ 1С •

ЗОШ 5л//Рис.6А/. Таким образом был получен гомогенный Б ав-фрапмент штител /электрофореграмма представлена на Вис.бВ/. Нами была исследо->ана ДНК-связываэдая активность этого фрагмента. Анализ, аналогищшй [редставленному на Eac.ä, привел к аналогичному результату.

Одним из основных критериев детекции антивдиотипических' антител :вляется реакция конкуренция антиедиотепи ческих антител с антигеном .

КЛ I - 2.5-10

н—н

10

Еис.з. Определение, констант диссоциации комплексов тол изомераза-ДНК. /линия. I/ и титело-ДЦК /линия2/ в двои: обратных координатах. ¿ЩК-фрагменг Л " -глобшовово : срм -импульсы/мин.. Ь-конце трация ЛНК

ЕЮ 9

Рис.7 Кривая конкуренции а идиотипических антител с ф ментом за связывание с мои клональными антителами к т< изомеразег. Данные получены помощью детекции на основе дин-биотиковай системы /см."Методическую часть"/.

о

3.5 l

Овгем з-гоекта /ил/

ftîc-..о A. Профиль злпции папаккстого-гкдролизата антивдиотпических антител к гспоизомераза I. 53.~í гелъ-:Енль трацил. Колонка ï^ ¿ 3CGC &w.

200 IÍ6-

I5& Jas

Ргс.6 3. Электро::орегра'я:з очклен-нкх препаратов патакнозсго гкдрлли-зата антиидистипическЕХ антител.

66-

<5-'

31

ва связывание: с первым антигеном. Как видно из данных, цредставлен-ных на РнсЛ, аффинао очищенные- антитела конкурировали с нативной тодоизомеразой за связывание с моноклональными антителами. Это еще раз подтвердило наше утверждение о том, что при аутоиммунном процессе образуются вторичные антитела к "характеристическому антигену".

Согласно высказанной выше гипотезе существования природных абзи-мов необходимо было рассмотреть участие антиидиотипических антител в катализе топоизомеразной реакции. Учитывая, что антиидиотипичес-кие антитела являются "антителами внутреннего образа" и по ряду свойств отображают парвичяий антиген, можно ожидать, что в ходе аутоиммунного процесса в условиях, когда нарабатывается значительно! количество- антител к ДМ, нуклеопротеадным комплексам, ферментам обмена нуклеиновых кислот, принципиально может создаться ситуация, при которой произойдет индукция каталитически активных антител -или каталитически активных антиидиогипов, либо антител на.некий ну-клеопротеидный комплекс, напоминающий переходное состояние ферментативной реакции, стабилизирующий ДНК в неком "подготовленном доя превращения состоянии"'. В частности, это может быть "открытое состояние ДНК".

Как. показали наши исследования, выделенные антиидиотипические антитела не; обладали сколь-нибудь зачетной каталитической активностью в топоизомеразной реакции. Однако, нами была продемонстрирована ингибиррощая способность I ав-фрагмента антиидиотипических антител /Рис,8/. В концентрационном интервале 20-50 мкг/мл антии-диотнлическке антитела ингибировали тодоизомеразную реакцию. Это является еще одним свидетельством в пользу функциональной активности выделенных антиидиотипических антител.

рИС19

1оро1

ОС

сс

Рис.8 Влияние антиидиотипических ангагаезгна активность.топоизомера-зы. I- Активность топоизомеразы.. 2' -активность топоизомеразы в при-■ сутствии Р ав-фрашента антител,

3 -активность в присутствии

Таким образом, в настоящем разделе продемонстрировано выделение антиидаотипнческих антител к "характеристическому антигену"' при аутс*-ямунных процессах - топоизомеразе I.Показано, что выделенные антитела обладают иммунологической активностью в отношении ДШ{, конкурируют с первичным антигеном, топоизомеразой I за связывание с моноклонаяг ными антителами, обладают высокоспецифической ДИК-связывашей активностью и ингибируют специфически толоизомеразную реакцию.

Ш.ДНК-С1ЕдйЗШЕСКЖ МШЙШЕСКИЕ АУ10АНШЕМ.

Как уже: отмечалось интенсивно развивающаяся область биокатализа, абзимология имеет все же свсш естественные ограничения. Они связаны в первую очередь с трудностями дизайна аналогов переходного состояния многих ферментативных реакций, а также возможностями синтеза соответствующих соединений. Однако- возможности получения новых биояатализагоров на основе? антител нельзя ограничить лишь отбором позитивных моноклонав, полученных на стабильные аналоги переходных состояний реакций. По нашему мнению биокаталитические функции аутоантител таят в себе много неизведанного. Несмотря на значительное расширение* представлений ст функции антител, в организме к вопросу о существовании их природной каталитической активности многие исследователи относятся весьма настороженно/^ШульцДЭЭО/.

- Это" вызвано необходимостью представления весьма строгих доказательств наличия каталитической активности, не связанной с присутствием в реакционной смеси эндогенных ферментатишых препаратов, а также с отсутствием достаточно ясных представлений о путях возникновения природных каталитических функций у антител. Возникновение нааей гипотезы существования каталитически активных ДНК-ауто-антител /1989/ по времени совпадает с первой^публикацией группы С.Паула из Университета итата Нейраска, в которой была продемонстрирована каталитическая активность аутоимунной сыворотки в реакции специфической деградации вазоактивного интестинального пептида. В настоящее время большинство критических замечаний в адрес этих исследований можно считать несостоятельными после появления данных о субстратной спеэцкфичности /Паул, 1991/, а также получения мсшс-клональных антител к. вазоактивному пептиду., обладающих специфической пептвдазной активностью, аналогичной обнаруженной ранее /Паул, персональное сообщение/.

I.Обнаружение эндонуклеазной активности в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями.

На Рис.9 представлена злектрофореграмма плазмидной ДНКриС <3 , инкубировавшейся с аутоантителамз из сыворотки крови больного ревматоидным артритом. Сравнение дорожек. I и 3 /суПерскрученная форма ДНК, инкубировавшаяся в течение ночи в субстратной смеси и суперскрученкзя форма, инкубировавшаяся в тех. же условиях, но в присутствии 10 лат тотальной фракции антител аутоиммунной сыворотки/ свидетельствует об исчезновении полосы, соответствующей суперскрученной форме и появлении более интенсивной полосы в районе никованиой фермы. Этот процесс накопления кольцевой формы ДНК можно объяснить, если предположить, что во фракции антител присутствует некое "активное- начало", обладающее никувдеЯ активностью. Это может быть как нуклеаза, имеющая место в аутоиммунной сыворотке, так и антитела, обладающие каталитической активностью.

На первом этапе исследования нами была выбрана весьма чувствительная система детекции активности, т.к. достаточно лишь одного ник-разрыва одной из цетей суперскрученной ДЗК -субстрата, чтобы наблюдать эту реакцию. Это давало принципиальную возможность детектировать, как весьма низку» в неочищенном состоянии ожидаемую каталитическую активность природного абэима, так. и даже, незначительные примеси нуклеаза.

В таблице, сопровождающей Р.яс.3 приедены все экспериментальные, условия наблюдения обнаруженной реакции, позволяющие идентифицировать природу исследуемого процесса.

условия шкубадет 123456 7 88 1011 12 1514 15

суперскручаннЕя ДЕК + + + + + + +

фракция - + -+ + + - - - + - + + - -

антитела, аффинно _ _______

очицекнке на ДЕК- ~ шлсолозе-

ангктела, подвергнутые "кислску цго---- - - - + - ---— - -

ку" _________

вШс!ВШШрШ----

фракция ■ аутоггун— ______ — + — — + _ _ _ _

- ной скбойотки,

см>Ркс.1Р_;_:-

Г ав-фраг>-'5нт — — - — — - - ---— ■ + —

Г с-фрагкект ---- - -- -- ------,-.+

¿иК-аза Х;1мкп

10 ли + + + -- + +- + + +++++ +

10 ¡й _ _ _ + _ __________ _

1С мД _.___+____ —. _ _ _ _

2С »¿й _+_____.________

ю ?.-;.; _________ + _ _ __

Пзеикку5ация —

фракции с пзотеин ---_-__ + _

А се-тзссэса_•_•

Ангола:.::: гвотге-:-

челс2е>: а --_______--_ +

г::с..£ Зляпэсфс'эегзг.ггг пл&змиде-зй ¿ел, пштсгзсванной гаи оазлгчных 5кгг5р2Х£Н75ЛЬ2шх услогкх. оО .'.¿1 Ирис-ЕС! ^уфер рЕ 7,5, 100

2,Доказательство наличия ДЙК-абзима в аутоиммунной сыворотке. Очистка активных препаратов.

Необходимо было идентифицировать природу обнаруженного "активного начала*,. С этой целью нами была исследована активность профиля элюции тотальной фракции антител'аутоиммунной сыворотки с гель-филь-трационнсй колонка БЭ£1 ТВ к. 3000 ^^/см.Рис.Ю/. Из рисунка видно, что обнаруженная активность сосредоточена как в высокомолекулярных фракциях /Фр.Г и 5Г6/, так и в низкомолекулярной фракции /Фр.11,12/. Исходя из данных по временам удерживания белковых стандартов с использованной колонки, было установлена; что высокомолекулярным фракциям соответствовали значения молекулярных масс 350 кД и 150-200 кД, а кизкомолекулярной -ЗОкД. Было исследовано влияние на никующую активность специфических тиоингибиторов ДНКазы, например дитиотреитола. Оказалось, что эндонуклеазная активность фракц-ций I и 5,6. не уменьшалась, а во фракции 11,12 было отмечено снижение активности. На основании данных по молекулярной массе активных <£расций и специфическому ингибированшо мы высказали предположение о том, что в аутоиммунной сыворотке действительно имеют место каталитически активные антитела,, а также эндогенная ДНКаза крови. Нами была предложена сх-ема очистки "активного начала", присутствующего в позитивных, фракциях-. Она включала в себя следующие стадии: I.Осаждение фракции антител сульфатом аммония до 3'¿ъ насыщения. 2,Гель-фильтрация на ВЭЖХ-колонке; ТЬ К аОСЮ й.Аффинная хроматография на колонке с Дротевн-А сефароэой.

4.Аффинная хроматография на колонке с ДНК-целлюлозой в некаталитических условиях/отсутствие ионов двухвалентных металлов/.

5.Гель-фильтрация на колонке ТЬ¡с 3000*5 и/.

А

а

eso

ю

20

мин.

Рис.10 Исследование никувцей активности аутоимунной сыворотки.

¿.Фракционирование снгсротгл на:.колонке TV> К 3000 SWG ¿акразены активные фракции.

В.Исследование активности профиля элзоции /условия аналогичны Рис,

В

1 'е 3 4 Ь 6 7 8 9 10 11 12 13 14

:ö3 J^-

f

Белковая высокомолекулярная фракция, соответствовавшая по времени удерживания 150 кД и полученная после всех перечисленных стадий, представляла собой препарат, не содержавший, как следует из Бис.II, дополнительных низкомолекулярннх полос» йданно эта очищенная фракция сохраняла активность и давала положительный ответ в ELl¿ft -тесте на антитела против человека. Это давало основание утверждать, что обнаруженная эндонуклеазная активность связана с природными ДНК-абзимами. Необходимо было проверить наличие примесной нук-"леазной активности за счет прочно ассоциированной с антителами ДдКазы. Как видно из Рис Л 2, демонстрирующего схему опыта-по "кислому шоку',' не»» не удалось элиминировать никувдую активность в результате инкубации "активного начала"' в жестких условиях при низких значениях рН„ По известным нам данным даже самый прочный нековалентный комплекс антиген-антитело должен диссоциировать в подобных условиях. Таким образом, обнаруженная нами эндонуклеазная активность по всей вида-мости.является функциональным свойством высокомолекулярной фракции сыворотки, г.е:. нами обнаружены ДНК-специфические абзимы. В дальнейшем мы работали лишь с фракцией!^ , хотя, как. свидетельствовала наш первые результаты/см.РисДи/, каталитическая активность была найдена также и в -фракции антител аутоиммунной сыворотки.

Данные по очистке природных каталитических ДЦК-антител сведены в Таблицу III.

л

92000 .69000 " 46000 **

ЗОООО

21000 — 14000

г з

Рвс.П.Элезсзрофоретический ан; лаз препаратов каталитических аутоантител

Х-белки-мелчнки; 2- ; 3-1 фрагмент.

и го п\.

Еис.12. Хроматография каталитических аутоантител в условиях низких значений рН. /опыт по"к: лому шоку"/. Условия опыта:, и бадия аутоантител при рН. 2,4 : чение: I часа; гель-фильтрация рН. 2,4 на ВЭ1Х колонке. Т£> К 3

1-Я.и 111 Очистка ДНК-специфических каталитических аутоантител

Стадия очистки Общий белок. 'Активность 'Удельная активность Выход

Протеин А-сефароза 2 МГ 100 ед 50 ед/мг -

ДНК-цегллюлоза 0,034мг 80,Бед 2500ед/мг 8С,5/,

"Кислый ион" 1мг оЗед Збед/мг 76>.

§1 единица активности соответствует количеству антител, которое- способно перевести ОД мкг суперскрученкой формы плазмидной ¿М в кольцевую форму за I час при 37°С.

Представленная очистка приводится на I мл. сыворотки больного СлЗ.

3. Исследование свойств ¿Нд.-абзимов.

Нами исследованы свойства обнаруженных каталитических антител. Был получен гомогенный препарат Р ав-фрагмента каталитических анти-тел/см.Еис.II/. Оказалось, что Б ав-фрагмент в отличие от Р с фрагмента сохранял каталитическую активность. Было обнаружено, что никувщая активность проявляла строгую зависимость от ионов двухвалентных металлов Л^* '¿<\\ Са '"/.Активность ингг.^г.свалг'сь ' /сч.Рнс.Э/. йнкубацня реакционной скзси о ;::,гго5;^:г-онанйа-.: протг-ино:* А или ^титела'.'!: против человека ■: .тсчсзлспь-

нкю активности.

за,

Наибольшая эффективность реакции- гидролиза ДЦК наблюдается в присутствии гонов магния.. Были описаны примеры ДНКаз, использующих в каталитическом акте два иона металла. Один из них, как. правило, выполнял координирующую рсиь, а другой - функцию кислотного катализатора. При ксследованиз одновременного влянва на реакцию, катализируемую ДИД-абзимом ионней парией _ Ме .была обнаружено, что максимальная скорость гидролиза наблюдается в паре магний - кальций. Присутствие в реакционней смеси ионов .\:едт. еле цинка полностью ингшбирует реакцию. При этом добавление магния не сказывается на скорости реакции. По всей видимости роль магния сводится к.роли кислотного катализатора. Эти данные: подтверждаются опытами па. ннгибированш реакции фторид-ионам. л5агний служит координаторам молекул воды; являющихся нуклеофильными агентами. Фторид-ион способен замещать воду, образуя тем самым непродуктивный комплекс. В наших опытах было показано, что фторид-ион ингибируеЕД активность антител в концентра^ 10 Ш, что соответствует данным по. ингибированию ДДКаз и экзонуклеазной активности полимераз. Ионы кальция па всей видимости служат для структурирования в ыолежулах субстрата, а также могут вызывать структурные- изменения в активном центра антител. Фосфат-ион выступает в роли конкурентного ингибитора реакции, катализируемой абзимами в концентрации 10 мМ,

Обнаруженная наш эндонуклеазная активность антител исследовал; количественно. Бесспорно, использованный нами метод регистрации перехода суперскрученная ДНК - кольцо является весьма чувствительны"/, '•.льтернативный способ регистрации продемонстрирован на Рис.13-

60 «го пш

Еис.13. Кинетика образования пиков. Регистрация по сопряженной реакции.-с ДБК-полимеразой I:

1-ДНК рис 18 в отсутствие: белка;

2-ДНКр^С18, инкубировавшаяся с ЛДКазой I Днг/;

'З-ДОС 18, инкубировавшаяся с Р ав-фрагмеятот аутоантител ДСмкг/.

30 во

Бремя ( над.;

Рис.14 Кинетическая кривая изменена линейного дихроизма плаз-мидной ДЖ при ее инкубации с ДККазой I.

Детекция образования "ников" проводилась с помощью сопряженной-реакции с полной ДНК-полимеразой I, Регистрировалось включение меченых нуклеотвдов па местам внесения одноцепочечных разрывов. Удавалось определить изменяющееся во времени количество включенных нуклеотвдов по сравнению с фоновым количеством одноцепочечных разрывов при фиксированном времени проведения полимеразнай реакции,, С помощью • этого метода удалось впервые показать, что активность аутоантител из сыворотки крови больных аутоиммунными заболеваниями в расчете: на т белка значительна выше, чем таковая у антител из сыворотки крови здорового донора»

4.Взаимодействие каталитических антител с ДНК.

Исследование каталитической активности природных абзимов осуши влялось с помощью нескольких методов: 1/по регистрации ник-разрыво: суперскрученной ДНК /см.Рис.Э/; 2/ по. сопряженной реакции с ДНК-д< лимеразой 1/см.РлюДЗ/; 3/ по изменению линейного дихроизма ориентирований в потоке ДДК /Рис.15. л !&/; 4/ по регистрации деградации ДНК в полиакриламидном геле/Рис.17/.

Известно, что метод линейного дихроизма успешно применяется дш анализа структурных изменений в молекуле: ДЖ. Линейный дихроизм ДН* ориентированной в потоке, изменяется при'изменении гидродинамичеж?-копо размера молекулы. ¡Летод оказывается чувствительным при оценкЕ деградации ДЗК. Изменение линейного дихроизма / ДД / ориентированной в потоке ДаК определяеггса:1/гидродинамичеш£им размером и 2/ум®

¡пением величины линейного дихроизма при увеличении гибкости цепи ДНК /например, при экранировании фосфатных групп/. Использование этих параметров позволило качественно описать изменения, происходящие в плазмидной ДЕК при ее деградации ДНКазой I.

На Бис.14 представлена кинетическая кривая изменения ЛД при инкубации плазмидной ДНК с ДНКазой I. Увеличение: ЛД на первом участке кривой скорее всего связано со снятием отрицательных супервитков при внесении одного ник-разрыва. Ъторой участок, кинетической кривой скорее всего связан с увеличением гибкости ДНК за счет образования шарниров областей и, следовательно, увеличения числа статистически возможных комбинаций. Третий участок кривой можно соотнести с деградацией молекулы ДЕК за счет накопления множественных одноцепочечных разрывов. Представленное объяснение' вполне согласуется с данными по кинетике деградации плазмидной ДНК под действием ДИКазы I,полученными с помощью электрофореза а полиацриламидаом геле. Оказалось, что при временах, соответствующих первому и второму участкам кинетической кривой существенной деградации ДЩ не происходит.

Анализ кинетической кривой изменения ЛД под действием каталитических антител показывает, что первый участок практически идентичен соответствующей фазе: кривой ДНКазной деградации. Второй участок характеризуется существенна большим временем, чем соответствующий участок кривой ДНКазной деградации. Это может быть связано со стабилизирующим эффектом антител и/или за счет протекткрованш большей части ДЕК неактивной фракцией антител. Относительно подробный аналиа -кинетики деградации был нам необходим для выбора наиболее адекватного для количественных измерений временного участка кривой. В ка-

честве такового нами был использован первый участок.

На Рис.15 представлены кинетические кривые изменения ДЦ плазмнд-ной ДНК под действием ДНКааы 1/крквая I/ и антител/кривая 2/. В вь раннем временном интервале характер кинетической кривой в обоих с?, чаях практически неизменен. Времена полупревращения Хмкг плазмвдне ДНК ДНКазой I и антителами составили 20 а 70 мин. .соответственна.

Предложенный метод был использован, нами для количественных оценок. активнееси антител..

На Рис»16 представлены данные активности каталитических антител выделенных из сыворотки крови больного СКВ до и после лечения, ДНК антител из крови здорового донора, а также данные по активности ДН азы1. Активность антител из сыворотки крови больнешов активном пер оде быше таковой после лечения. Активность ДНКазы отличается сущес венвд/2-3 порядка/. Удельная активность ДНК - антител больного аут мунвым заболеванием в среднем на два порядка выше; активности антител здорового донора. "

В Таблица- 1У представлена более широкая выборка данных па актив: ти антител из различных сывороток. Общим заключением, к которому М' но прийти при анализе данных Таблицы 1У и Рис.Ьа, является обнаружь кие зависимости активности антител отвида и стадии заболевания, чт-в принципе могло бы послужить основой для выработки в последующем прогностических критериев развития аутоиммунного процвсса.

Представляло интерес исследовать характер деградации двухцегш.-чечной ДДК под действием ДДК-абзшла. На Рис.!? представлен анализ продукта деградации ДНК длиной 300 п.о..подвергшейся обработ-

Еяс.15. Кинетическая кривая накопления "ников" в плазмидной ДНК ' {>ис 18 под'действием ДНКазы Г /кривая I/ и каталитических антител/кривая 2/, зарегистрированная методом ДЦ. 0.5 1.0 1.5 2.0 гас

РисЛб Измерение активности ДНКазы /линия4/ и каталитических антител /тотальная фракция 1§6/: больного СКВ/линия!/, больного СКВ после лечения/линия2/,здорового донора/линия З/.В пробу вносилось 100 мкл

Таблица 1У

Сравнительная удельная активность каталитических антител из различных сывороток

Заболевание

Количество пациентов

Усредненная актз ность

скл СКВ

Р-А

Увеарегинит Псориаз Симпатическая офтальмопатия Здоровые доноры

6 .10 , 15 20 10

Г. 12

+++

++-Н-+

§ у одного из пациентов

+-И-Н-

ке каталитическими антителами и 1д М классов, а также ДеКазой ДВКазой из сыворотки крови человека. Сравнение полученных данных щ: водит к выводу об абсолютной идентичности продуктов деградации, кал лизируемой антителами обоих классов. В то же: время видно, что. несмс на отсутствие избирательности по отношению к нуклеотидному составу каталитических антител, характер продуктов деградации, катализируем ими, существенно отличается от ферментативного расщепления, что ода ремекяо явлается, по нашему мнению, одним из главных доказательств сутствия загрязняющих активностей, связанных с эндогенными нуклеаза На сегодня мы не можем с полной уверенностью утверждать, что о£ ружейные ДНК-абзимы являются действительно антиидиотипическши анта телами к топоизомеразе к тем самым катализируют лшь первую полуреа цим>. Каталитическая никуюаая активность обнаружена во фракции антш: типических антител, но использовать эту фракцию в препаративных вы; ленкях не представилось возможным. Мы не исключаем, что обнаруженна

ыШ ^

к

«■•«в* -г

- £э ,

е®

»

п-1 ** £

к. _ е-» — в __

г8

— в» в» «»

,: П

^ 5 •• «я

•-1»

**

«»га»

12 3 4 5 6

Рис.17. Характер деградации ДНК ДЕКазой I, ДНКазсй сыворотки крови человека и каталитическими антителами.

В реакции использовался фрагмент ДКК /300 пар оснований/ содержащий промотор и транскрибируемый фрагмент рибо-сомальното гена крысы. Взято 20 нг меченой ДНК. Условия деградации: 25 М Триа-Ш, рЫ7,5, 100 Ш ' На-М , 10 Ш С&х.

- дорожка I: аффинно очищенные антитела Го^&-фракцш, 1мкг/шкубация

12 часов при 37°С/;

- дорожа 2:аффинно очищенная фракция М, 1мкг /12 часов,37°С/;

- дородна 3; контроль - ДНК без катализатора.

- дорожка 4:ДдКаза из сыворотки крови человека, 2мкг/12 часов, 37°С/^-

- дорожка и:ДНКаза I, 0,25 едДмкн, 37°С/;

- дорожка 6:сиквенс стандартов А*С

активность связана с наличием ДНК-антител, стабилизирующих ДНК. ь нужной информации. Физиологическую роль природных абзимов, существующих, как теперь уже ясно, в сыворотках крови аутоиммунных больных и способных катализировать разрыв пептидной связи /работы С.Паула/, и фосфодиэфирнсй связи/настоящее исследование/ ©ве предстоит выяснить.

Представляло также интерес исследовать реакцию на модельных субстратах -олиЕонуклеятидах.Было выяснена, что в диапазоне длины от 10 до ¿0 нуклеотвдов не наблюдается каких-либо различий в скорости гидролиза .Предпочтительнее гдцролизувтся сеязи в б-с парах. Наиболее эффективно гидролизовался 10-мерный олигонуклеотид состав) .Олитонуклеавд самокомплемеятарен и может сущеста< вать в виде дуплекса и шпильки, йо всей видимости для специфическс го узнавания субстрата выделашым абзимом. существенную ршш играет вторичная структура олшгонуклеотэднаго производного.

Б настоящем разделе- мы попытались привести экспериментальные дг ные обосновывающие правомочность выдвинутой гипотезы существования ДЫК-абзнмов. Эти положения свсщшгся н. следующим: 1/Обнаруженная активность связана с высокомолекулярной фракцией ау

иммунной сыворотки. 2/Еомогенность активных фракций прсдемонстр^рсшана электрофорвтичг

ни и спомощыо ВЭ££. о/Каталитическая, активность присуща Е аз-фрагменту и отсутствует у I с-фратмента.

4/Актквносгь элиминируется при инкубации сыворотки с иммобилизован

ми антителами к 1^6 человека и протеином А. с/Каталитическая активность сохраняется в опытах по "кислоиу шоку" 6/Урсвень каталитической активности различен при разных заболевали ?Дарактер деградации Дал огллчаетсй при обработке ДЕКазоЙ. I, ДйК-азой крови 2 каталитическими антителами.

ШСДИЧЗСХАЯ ЧАСТЬ Выделение' и очистка белков.

Ь работе использовались гомогенные препараты ^-цистатионазы печени крысы и гопсизомеразы I из тимуса теленка и плаценты че-Бека. Методика выделения и очистки этих ферментов была существенно дифицирсвана. Для. этого были использованы методы ВЭ'М в ретлме гель-льтрация, гидрофобной хроматографии, ионообменной хроматографии. Для выделения -цистатионазы на начальных этапах была использо-на классическая методика/Матсуо и Гринберг,1953/. На последующих апах стандартные хроматографические стадии /гель-фильтрация низ-го давления,хроматография на ДЗлй-целлюлозе/ были заменены на высо-эффективную тадкостную хроматографию в ре.тале кеидеальной гель-филь-ации. Экстракт после сульфаташонийного осавденш наносился на пре-эативную колонку TS К 40Q0 &WG, в 0,005 М калий фосфатном буфере 5,5. Балластные белки элкировались тем буфером. Цистатионаза оировалась с колонки 0,1 ¡K калий-фосфатным буфером pH 7,5. В методе использованы слабые катлонообменкые свойства 1<¿K -носителя, что звслило оптимизировать все' предыдущие хроматографические- стадии, результате одного хро.чатографического выделения получалось 20 мл? логенного препарата с активностью бйОед.

выделение топоизомеразы I проводилось также с использованием Meies препаративной ВЭ.1Х /колонка Т^К 3C0Q SWG>/. Условия гель-филь-щии: 50 -/Л калий-фосфатного буфера рЕ 7,2, ICO rf/¡ tJ&GL. Скорость :ока 2 мл/мгсн. Активная фракция наносились на колонку о сорбентом 5 PW яля гидрофобной хроматографии. Условия разделении мГЛ буфер Трис-üCl, pH 7,2, понижающийся градиент сульфата аммония ,5 до 10 wl!í, повышавшийся градиентэтпленгликоля с 10 до ЗС

Бре:.'Л градиента 40 мин. Скорость потока 0,5 мл/мин. Из 0,5 кг тим; получали 4-5 мл гомогенного препарата фермента.

Гибридные белки/фьюжен-белки/ ^ -дистатионаза - {ь-галактозида: и топокг-омераза- р-галакгозидаза, полученные в результате экспрес< в векторе ^ , очищали по стандартной методике /Лнг и ДэвисД! с использованием аффинного сорбента с привитыми антителами к £-r¡ тсзкдЕзе. Зта методика предполагала стадии "кислого шока" при сня' препарата с кмлукосорбента. Б спыгах, требовавших максимального с< нения функциональной активности экспрессированного продукта польз< лись специально разработанной методикой с применением B3SX.

На рис.18 приведены условия разделения гибридных белков, йспо. валась колонка ТЬК 3000 для гель-фильтрации. Условия разделе] 50 Трис-HCI буфер, рН7,2, ICO Na.(Л. Скорость потока 0,5 т, Фракцию, дававшую положительный иммунологический ответ подвергали кейней очистке на JEAS-SBW колонке. Условия разделения: 50 мМ Тр: буфер рЫ 7,2, повышающийся градиент 10 м!Л-0,5 М. Скорость ni

0,5 мл/мин. Время градиента 40 мин.

Рис.18. Очистка гибридных 6ej

: .Авидин-биотановая система для целей микродетездии.

В настоящем исследовании для целей микродетекции при иммудаскри-нинге экспрессирующихся библитек и молекулярном клонировании, а также при количественных оценках- взаимодействия антиген-антитело нами была использована авидин-биотиновая система. -С целью повышения чувствительности и воспроизводимости используемых методов мы сосре^ доточили своз внимание на ее компонентах: эффективных биотетилиру-ющих агентах' на основе эфиров биоткна и на проявляющей системе -авидин-пероксидазном комплексе. Нами предложен новый, оригинальный метод получения высокоочищеннаго авидина с активностью 14 ед с помощью метода спиртового осазщения грубого экстракта на начальных стадиях и последущей дочистке его с помощью методов ВЭ2Х. Полученные таким образом гомогенные препараты авидина были использованы для синтеза высокоактивных кснъюватов авидин-лероксидаза. Ваш установлена, что наиболее активными являются конъюгаты стехиометрии: авидш^-перокси-даза-£. Эти коншгатн были выделены и использованы в качестве проявляющий системы при нолекулярном копировании.

3.ГЛоледулярное клонирование проводили согласно метода!.!, описанным Янгом и Дэвисом, 1984г.

4.Пациенты. Сыворотки крови больных были предоставлены Институтом ревматологии Академии Медицинских Наук. России. В работе использовано 52 сыворотки"больных и 20 сывороток здоровых доноров.

б.ДКК-связывание антител и топоизомеразы проводили согласно сизеан-ной методике1 / Оду; 1989/. Использовался фрагмент глобиковсго гена крысы. Константу диссоциации определяла по методу двойных обратных величин.

ВЫВОДЫ

I.Выдвинута концетцая исследования функциональных свойств экспрес-сированннх фрагментов кДНК ферментов.

1/Обнаружена каталитическая активность продуктов экспрессии фрагментов кДНК ключевого фермента метаболизма серосодержащих амине кислот, дисгатионазы.

2/Разработаны методы выделения соответствующих полипептидсв различной протяженности. Установлено, что стабильность и каталитическая эффективность зависят от протяженности акспресстрстаннт полипептвдов цистатионазы. Так, для белков с М.М. 120,125^135, кI соотношение кка5^ ^ - 4.3 102; 1,4 103;4,3 ЮЬ Г1,с"1,соответственно,

З/Выделен. фрасмаи, содержащий эпитшт топоизомераэы I, отвел-ствен ный за высокоспецифическое, взаимодействие с моноклональными ант телами к ферменту■Дд2с =5,7 Ш/, антителами из аутоиммунной сы воротки и ингибирующий каталитическую активность фермента.

4/Показано, что экспресстрованный фрагмент кМП топоизомеразы может адекватно заменять нативный фермент в диагностических теста на аутоиммунные заболевания.

II.Установлено, что антиидиотилические антитела к. топокзомеразе I типа, обнаруженные в сыворотках крови больных аутоиммунными заболеваниями, обладают высокосдецифичёской ДИК-связывающей активностью /Кд^гОДб нМ/. конкурируют с первичным антигезюм-топоизомэразой за связывание с моноклональными антителами к ферменту л ингибирувт топоизомеразную реакцию.

Ш. .Выдвинута гипотеза существования природных каталитических антител, абзимав. Получеян данше, экспериментально подтвер>-зиаяаие. правомочность гипотезы.

1/Б сыворотках крова больных аутоикмукккда заболеваниями обнаружены антитела, специфически взаимодействующие с Дпл и обладающие эндонуклеазной активностью. Разработан метод их выделения. Предложены метода регистрации ш активности.

2/Показано, что абзимная активность элиминируется при инкубации о иммобилизованными препаратами антител к Х^б человека и протеином А.

З/Установлено, что специфичность Ддл-ебзимов отличается от специфичности ДНКазы I и ¿ЕКазы крсвк.

4/Доказано, что обнаруженная активность присуща Е ав-фрагменту антител и отсутствует у Б с-фрагмента.

^/Продемонстрировано наличие айзимней активности в условиях разрушения нековаяентных. комплексов антиггезь-антитело.

б/Обнаружено, что уровень активности ДДК-абзимов различен в сыворотках крови больных с различными аутоиммунными заболеваниями человека и примерно на два порядка выше, чем у здоровых доноров.

?/Обнару.тея декамерный самокомплеменгарный олигонуклеотид, характеризующийся специфичностью к ДНК-абэиму.

8/Показано, что реакция является Са.г -зависимой, ьоны цинка, меди полностью ее; ингибируют. Фторвд-ион ингибирует реакцию при концентрации 10~2М, фосфат-ион. при концентрации 10 мМ конкурентно ингибирует реакции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО 1E;vE ДИССЕРТАЦИИ

Х.А.Г.Габибов, A.M.Шуетер, А.Р.Хомутов, Э.А.Голоса, Е.В.Еоряченко-ва. Паридохсальфосфат-зависеиые ферменты метаболизма серосодерж щюс аминокислот. Биохимия, 1939, т.54, с.726-730.

2, A.Ll.Shuster, O.A.Kvashuk, IX. Chumakov, V.S.Prassolov, A.G.Ga-bibov. Cystathionase: HPLC, i,".olecular cloning in/\gt!1. nonradioactive immunodetection of fusion protein.Biochimie, 1989 v.71,p.599-604.

A.H.Khomutov,A. G .Gabibov,E.H.Khurs, E.A.Tolosa, A.K.Shuster, E.V.Goryachenkova & E.K.Khomutov. Selective Inhibition of PL?-Dependent Enzymes Ъу Kydroxylamine derivatives. in:Bioche-■ mistrу of vitamin Bg CBirkhauser Verlag, 1987),pp.317-321.

4. A.G.Gabibov, A.K.Shuster, O.A.Kvashuk, A.K.Khomutov, G.I.Tchen-chik, E.A.Tolosa, E.V.Goryachenkova. PLP-Dependent Enzymes of Sulfur Amino Acid Ketabolism. Catalytic Activity of Fusion Protein. in .-Enzymes Dependent or. PIP and Other Carbonyl Compounds as Cofactors (¥ergamon Press, 1991) pp.325-328

б.Г.В.Гололобов, Ajvl.Шустер, О.А.Квашук, А.Г.1абибов. Антиидиотипи ческиег: и каталитически активные антитела. Молекулярная биология, 1991, т.25, с.593-602.

6.И.Б.Бронштейн, A.M.Шустер, И.М.Громова, ОЛ.Кваиук, О.Н.Гева, З.С.Алекберова, А.Г.Габибов, Антиидиоткпические? антитела к топо-изокеразе I в сыворотках крови больных аутоиммунными заболеваниями. ДАН СССР, 1991, т.318, с.1496-1499.

Б.Бронштейн, А.М.Ыустер, Д.В.Шевченко, й.И.Еромона, О.А.Квашук О.Н.Гева, А.Г.Гаоибов, Топоизомераза I из плаценты человека. Фун; цкснальная активность продуктов акспрессяи клонированных фрагментов кДНК. Молекулярная биология, 1939,. т„23, с.1553-1557.

3.И.Б.Бронштейн, А.Ы.Шустер, И.И.Громова, О.А.Квашук, О.Н.Гева, Е.В.Гололрбов, Т.Б.Прокаева, З.С.Алекберова, А.Г.Габибов. Взаимодействие сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями с экспрессированным фрагментом кДНК тспоизомеразы I и манокло-нальными антителами к ферменту. Бгалл.Экспер.Биол.Мед.Д990,т.Ш}, с.598-600.

Э.А.М.Шустер, Г.В.Гололобав, О.А.Квашук, А.ГДабибов, ДНК-специфические каталитические антитела в сыворотках крови человека. ДАН СССР, 1991,- т. 318, c.I262-L2£cu

[О.А.М.Шустер, Г.ВДололобов, О.А.Квашук, А.Г.Габнбов. Каталитические антитела: природныее и индуцированные абзимы. Биохимия. 1992, в печати.

Ц.А.М.Шустер, Г.В.Галолобсга, О.А.Нвашук, А.Э.Богомолова, И.В.Смирнов, АДДабибсш. Взаимодействие каталитически активных антител с ДНК. ДАН СССР, т.319, с.1504-1507.

[2.1.B.Bronstein, A.M.Shuster, G.V.Gololobov, O.A.Kvashuk, K.A.Belo-stotskaya, A.G.Gablbov. BNA-Specific Anti-Idiotypic Antibodies" In The Sera of Patients with Autoimmune Diseases. FEBS Lett. 1992 in press.

L3.A.K.Shuster, G.V.Gololobov, O.A.Kvashuk, A.E.Bogomolova, I.V.Smir-nov & A.G.Gabibov. DHA Hydrolyzing Autoantibodies. Science, 1992, v. p.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

E4.А.Г.Габибов, А.И.Шустер, Б,Л»Казаксш, Н.Н.Кондралшна, Е.З.Горя-ченкова. Цистатионаза: ВЭМ в режиме неидеальной гель-фильтрации. Молекулярная биолопия, 1983, т.22, с.787-793.

15.Г.В.Гололобов, Р.ПДдав, А.Э.Богомолова, А.Л.Шустер, К.М.Бело-

стоцкая, А.Г.Габибов. Выделение и характеристика каталитических

антител к ДНК при системной кпасной волчанке. Биохимия; 1932, т. с.

16.ГJB»Еололобоб, А.МЛустер, ¡ЦС.Зашие, А.Е.Еабибов, А.1.Рабин-коб. Синтез высокочувствительных олигомерных конъюгатов авидин-пероксидаза. Еиаорс. химия. 19Э1» т.Г?, с.353-358.

17.А.Б.Ильина, А»Г.Рабинковг Е.В.Зихрева, А.ГЛабибов. Синтез производных /У- оксисукцинимидных эфиров биотина и их применение да биотинклированкя белков. Биоорд.хшия. 1939, т.15, с.354-357.

13.А.Р.Хомутав, АЛЧРабшшов, Е.В.Вихрева, Д.Ю.лковлев, А.Ы.Шустер 1.К.Корпела, А.;.5.Крищшй, А.Г.ГаОибов, Р.М.Хомутов. Гидрохлорид 4-амяноонсибутилаыида. бисгаина как реагент для биотинилирсшания нуклеиновых кислот и белков. Авт. Свидетельство И591458.

19.V-E.Piskarev, A.K.Shuster, A.G.Gabibov, A.G.Rabinkov. A Hovel Preparative Method For Isolation of Avidin and Riboflavin -Binding Glycoprotein by the Use of HPLC. Biochem.J. 1990, v.265 p.301-304.

20.G.V.Gololotov, A.lI.Shuster, I.K.Zalite, A.G.Gabibov, A.G.Rabin-Kov. Avidin-Peroxidase: Synthesis and Isolation of Highly Sensitive Oligomers. J.Biochem.Biophys.Kethods. 1990, v.21, p.267-27i