Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дизайн системы векторов для экспрессии каталитических антител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демин, Александр Викторович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УДК 577.123

ДЕМИН Александр Викторович

ДИЗАЙН СИСТЕМЫ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

(03.00.03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: чл-корр. РАН, д.б.н., проф. Н.В. Гнучев д.х.н., проф. А.Г. Габибов

I

%

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................6

1.1. Экспрессия антител.....................................................................6

1.1.1. Рекомбинантные антитела..........................................................6

1.1.2.Экспрессия антител в Escherichia coli.............................................8

1.1.3. Экспрессия атител в дрожжах.....................................................14

1.1.4. Экспрессия антител в клетках насекомых....................................16

1.1.5. Экспрессия антител в клетках млекопитающих.............................20

1.2. Каталитические антитела.............................................................24

1.2.1. Гидролитические антитела, полученные иммунизацией аналогами переходных состояний......................................................24

1.2.2. Природные каталитические антитела..........................................40

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................48

2.1. Материалы.................................................................................48

2.2. Методы......................................................................................49

2.2.1. Конструирование векторов.........................................................49

2.2.2. Экспрессия фрагментов антител..................................................51

2.2.3. Получение периплазматического экстракта...................................51

2.2.4. Очистка экспрессированного продукта.........................................52

2.2.5. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание полиакриламидных гелей...............................................53

2.2.6. Иммуноблот.............................................................................54

2.2.7. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК..................55

2.2.8. Выделение плазмидной ДНК.......................................................55

2.2.9. Электрофорез в агарозном геле....................................................57

2.2.10. Анализ ассоциированности ДНК-гидролизующей

активности с антителами методом аффинной сорбции...........................57

2.2.11. Определение активности Fab фрагмента антитела 1F5...................58

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................60

3.1. Разработка системы экспрессии для протеолитической легкой цепи....60

3.2. Клонирование эстеролитического антитела 1F5................................66

3.3. Экспрессия Fab-фрагмента эстеролитического антитела 1F5...............71

3.4. Моделирование Fab-фрагмента и анализ вероятного

активного центра эстеролитического антитела 1F5.................................74

3.5. Моделирование Fab-фрагмента и анализ вероятного активного центра ДНК-связывающего антитела MRL4. Экспрессия Fab-фрагмента ДНК-связывающего антитела MRL4...............................78

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ..........................................................................86

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК...................................................87

ВВЕДЕНИЕ

За последнее десятилетие представления об антителах претерпели значительные изменения. Обнаружены новые свойства этих белков: способность катализировать химические превращения, цитотоксичность, способность проникать в клетку. Особое внимание уделяется исследованиям каталитических свойств антител, изучение которых интересно как с точки зрения решения фундаментальных проблем биокатализа - детализации механизмов катализа самых разнообразных реакций, так и для прикладных разработок, направленных на создание новых устойчивых биокатализаторов.

Естественно, что детальное изучение действия каталитического антитела, как и любого фермента, невозможно без клонирования его гена, мутагенеза и анализа мутантных форм. Самым распространенным на сегодняшний день методом получения продуцентов антител является гибридомная техника. Но давая возможность получать каталитические антитела, она не позволяет производить направленный мутагенез абзимов. Поэтому естественным продолжением развития этой области стало получение рекомбинантных антител в бактериальных и эукариотических культурах клеток.

Самой распространенной и развитой на сегодняшний день системой экспрессии антител является система клонирования и экспрессии одноцепочечных антител на основе вектора рСАМТАВ. Но применение одноцепочечных антител имеет много недостатков, одним из которых является возможность потери каталитической активности при переходе от интактного антитела к одноцепочечному. По этой причине актуальным является сохранение нативной структуры антиген-связывающего фрагмента при любых операциях с

каталитическими антителами. Еще одним необходимым свойством векторов, используемых для работы с антителами, является их универсальность, обусловленная огромным разнообразием генов антител.

Так как на сегодняшний день абзимология предъявляет свои собственные требования к геноинженерным работам весьма актуальной задачей является создание системы клонирования и экспрессии, ориентированной на использование в исследованиях каталитических антител.

Целью настоящей работы является создание системы экспрессии и клонирования каталитических антител и ее использование на примере экспрессии трех гидролитических абзимов: протеолитической легкой цепи антитела с23.5, эстеролитического антитела 1F5 и ДНК-гидролизующего антитела MRL4, а также клонирование эстеролитического антитела 1F5 и структурный анализ активных центров антител 1F5 и MRL4.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экспрессия антител 1.1.1. Рекомбинантные антитела

Успешное развитие гибридомной технологии Келером и Мильштейном и, в результате, возможность получения моноклональных антител стало началом новой эры в науке. Использование технологии рекомбинантных ДНК и увеличение знаний в генетике и структуре иммуноглобулинов позволило проводить генетические манипуляции с молекулами антител. Это позволило варьировать их свойства и создавать новые усовершенствованные молекулы. В связи с этим активно стали развиваться различные системы экспрессии с целью получения новых функциональных антигенсвязывающих молекул.

Существуют два основных класса рекомбинантных антител. Первый представлен интактными и химерными антителами [1-6]. Второй класс молекул состоит из фрагментов молекул антител. Они включают фрагменты, которые получают в результате протеолиза, такие как Fab, Fab', (Fab')2, а так же другие фрагменты основанные на различных вариантах вариабельных доменов. Эти молекулы включают в себя одноцепочечные антитела (sFv) [7-8] и дисульфид стабилизированные (dsFv) [9].

Маленькие фрагменты антител имеют преимущества перед цельными иммуноглобулинами для некоторых клинических применений, таких как хорошее проникновение в твердые опухоли и быстрая очистка [10-11]. В дополнение они могут быть получены посредством фагового дисплея [12].

Эти фрагменты могут заканчиваться другими молекулами, такими как металл-связывающие белки [13], цитокины [14], токсины или лекарства [10]. Они стали много обещающими агентами для использования в исследованиях in vivo.

Меченные радиоактивной меткой были успешно использованы для создания изображений карциномы в клинических условиях [15]. В дополнение могут быть получены так называемые биспецифические и бивалентные антитела, называемые диабоди [16].

Фрагменты рекомбинантных антител были успешно получены в различных системах экспрессии, в таких как бактериальные [4, 17, 7, 8], основанные на культурах клеток млекопитающих [18-19] и насекомых [20], растительных клеток [23] и дрожжей [21-22], а так же в системах трансляции in vitro [24].

В процессе достижения желаемой экспрессии клонированный ген должен быть эффективно транскрибирован и транслирован. Выходы и биологическая активность рекомбинантных белков сильно различаются и зависят от большого числа факторов таких, как растворимость, стабильность и размер белка.

Экспрессия каждого белка представляется уникальной проблемой, в силу уникальности аминокислотной последовательности. Хотя общие заключения могут быть сделаны из исследования какого-либо одного белка, для каждого нового белка требуется свой процесс оптимизации экспрессии. Термин "антитело" покрывает целый класс белков, но каждое антитело имеет свою отличительную последовательность. Следовательно, экспрессия каждого антитела или его фрагментов имеет свои сложности. Система экспрессии, которая подошла для одного антитела, может не подойти для другого. Оптимальная система зависит от типа экспрессируемой молекулы, индивидуального антитела, а так же других факторов, таких как требуемое количество и чистота конечного продукта.

1.1.2.Экспрессия антител в Escherichia colt

Фрагменты иммуноглобулинов обычно экспрессируют в E.coli. Преимущества этой системы проявляются в способности производить белок в больших количествах. E.coli растут с очень высокой скоростью по сравнению с клетками млекопитающих, давая возможность очистить, проанализировать и использовать проэкспрессированный белок за очень короткое время. В дополнении к этому трансформация клеток E.coli чужеродной ДНК проводится очень легко и требует минимальное количество ДНК. Инженеринг антител с использованием E.coli проводится с минимальными затратами. Эти причины объясняют популярность бактериальных систем. Тем не менее, E.coli не подходит для экспрессии глигозилированных белков. Следовательно, если требуется получить цельную молекулу антитела, которая гликозилирована по Сн2 домену, необходимо использовать другие системы экспрессии.

Для проведения успешной экспрессии, ген, кодирующий молекулу антитела, должен быть помещен в окружении подходящих последовательностей, которые позволят транскрипцию и трансляцию белка. Обычно для контроля экспрессии белка используются индуцибельные промоторы. Это необходимо для предотвращения потери гена или его мутации в случае токсичности белка для бактерии. Чаще всего используется lac промотор, trp промотор и их гибрид, tac промотор, который регулируется посредством lac репрессора и индуцируется изопропил-(3-галактозидазой (ИПТГ) [25-26]. Другой популярный промотор - XPL промотор, отвечающий за транскрипцию ДНК фага X и регулирующийся чувствительным к температуре репрессором. Т7 РНК промотор может так же быть использован для получения хорошо контролируемой экспрессии с высоким уровнем, включающей два уровня амплификации [27-28]. Второй важный фактор

для эффективной трансляции в Е.соН является наличие прокариотического сайта связывания рибосомы, который состоит из инициаторного кодона и последовательности Шайн-Дальгарно, образуемой 3-9 нуклеотидами и расположенной на расстоянии 3-11 нуклеотидов выше инициаторного кодона [29-32]. Последним, важным контрольным элементом является терминатор транскрипции, который останавливает транскрипцию за целевым геном и увеличивает стабильность ДНК.

Экспрессия фрагментов рекомбинантных антител в востанавливающих условиях цитоплазмы приводит к образованию нерастворимых телец включения, которые содержат белок с неправильной укладкой цепи. Это приводит к необходимости выполнения рефолдинга для получения активного материала. Существует ряд используемых для этого методов, каждый из которых необходимо оптимизировать для каждой отдельной молекулы. Большинство методов включает в себя выделение телец включения, растворение рекомбинантных белков и их ренатурацию в условиях позволяющих корректное образование дисульфидных связей и трехмерной структуры белка [32].

Растворение неактивных белков обычно проводится с использованием денатурирующих агентов, таких как гуанидинхлорид или мочевина. Так же могут быть использованы мягкие детергенты, которые связываются с белком не слишком сильно [33-35]. Вместе с детергентами используются восстанавливающие агенты, такие как (3-меркаптоэтанол или дитиотреитол, для восстановления меж- и внутри-молекулярных дисульфидных связей, которые моглибы образоваться в процессе лизиса бактерий и растворения белка.

Образование дисульфидных связей может быть осуществлено путем простого окисления кислородом [36], в некоторых случаях ускоряемого ионами

металлов [37]. Разрыв и образование диеульфидных связей, необходимые для увеличения вероятности получения правильной конфигурации, могут быть ускорены использованием дисульфидизомеразы [38] или введением ЯесЮх пары, образованной смесью окисленных и восстановленных тиоловых групп какого-либо реагента, например, глутатиона [37].

Одной из главных проблем, которые приходится решать в процессе рефолдига, является образование агрегатов, которое происходит в результате взаимодействия гидрофобных участков на поверхности частично или полностью уложенных белков. Этот процесс может быть минимизирован понижением концентрации белка в смеси.

Рефолдинг может быть также ускорен стабилизирующим сорастворителем, таким как аргинин. Эти сорастворители выводятся из сферы непосредственного окружения белка как стерическими помехами, так и пертрубациями поверхностного натяжения воды на границе между белком и растворителем или химическими взаимодействиями между сорастворителем и белком (таким как отталкивание зарядов) [39]. На молекуле белка с неуложенной цепью площадь поверхности, с которой происходит взаимодействие сорастворителя, больше, чем в нативной молекуле. Так как создание таких поверхностей термодинамически невыгодно, то это ускоряет процесс укладки пептидной цепи.

Выше уже упоминалось, что каждое антитело уникально. Точно так же нет универсальной методики рефолдинга. Некоторые белки быстро и просто принимают правильную конформацию. Они могут быть ренатурированы простым разведением денатурированного материала до физиологических условий с образованием диеульфидных связей посредством окисления

кислородом воздуха. Другие белки могут быть ренатурированы только по сложной методике рефолдига. Тем не менее, некоторые антитела плохо денатурируют, принимая энергетически выгодную конформацию, которая не соотвествует нативной конформации антитела [32].

Множество параметров может быть оптимизировано в протоколе рефолдинга: температура процесса, время, концентрация белка, присутствие сорастворителя или окислительвосстановительной пары и pH раствора. Но это может легко окупиться, так как по некоторым данным с использованием ферментера может быть получено до 100-130 мг/л активного одноцепочечного антитела sFv [32].

Альтернативным подходом является использование лидерной последовательности для секреции антитела в периплазматическое пространство бактерий, которое находится между внутренней и внешней мембраной грамотрицательных бактерий и имеет окислительные условия для образования дисульфидных связей. Кроме этого в периплазме присутствует ряд шаперонподобных белков и дисульфидизомераз, которые могут помочь процессу укладки белковой цепи рекомбинантного антитела. Этот подход был впервые использован для экспрессии Fv [17]. В качестве лидерных могут быть использованы лидер pelB гена пектатлиазы из Erwinia carotovora [40] и лидерная последовательность гена щелочной фосфотазы E.coli, которые отрезаются сигнальными пептидазами в периплазматическом пространстве [41].

В некоторых случаях экспрессированное антитело выходит из периплазмы через внешнюю мембрану в культуральную среду [42]. Степень, в которой происходит этот процесс, зависит от штамма бактерии, условий индукции и конкретной аминокислотной последовательности антитела даже

больше, чем от лидерной последовательности [43-44]. Экспрессия в среду позволяет быстро отскринировать хороший продуцент антитела и в случае хороших выходов проводить очистку прямо из супернатанта, но это происходит далеко не всегда.

Если материал не найден в супернатанте культуральной среды, продукт может быть выделен из периплазматического экстракта, часто получаемого осмотическим лизисом, что имеет преимущества, так как целевой белок часто присутствует в высоких концентрациях и с довольно высокой степенью чистоты [45]. Часто материал находится в периплазме в нерастворимой форме. В этом случае необходимо растворить белок и ренатурировать его [46].

Существует много различных примеров экспрессии антител. Fv фрагмент антитела D1.3 к лизоциму, которое широко используется в качестве модельной системы в инженерии антител, может быть выделен с выходом 10мг/л прямо из супернатанта культуральной среды [42]. После тщательной оптимизации условий экспрессии Fab фрагмент антитела к CD3 был получен в количестве 700 мг/л [47]. До 2 г/л функционального гуманизированного Fab фрагмента (HuMab4D5-8 Fab') было получено в штамме E.coli 25F2 [48]. Другие sFv не могут быть получены с приемлимыми выходами даже рефолдигом нерастворимой фракции в периплазме.

Следовательно, существуют несколько факторов, которые необходимо определить при проведении экспрессии нового антитела. В каком компартмен