Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека в клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека в клетках млекопитающих"

На правах рукописи

Орлова Надежда Александровна

ДИЗАИН ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г б сен т

Москва-2013

005533346

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук и в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Габибов Александр Габибович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Георгнева Софья Георгиевна, доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, лаборатория факторов транскрипции, заведующая лабораторией. Судариков Андрей Борисович, доктор биологических наук.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Минздрава России, лаборатория молекулярной гематологии, заведующий лабораторией.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук.

Защита состоится 1 8 октября 2013 г. в ^ на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 1119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан « IЬ » сентября 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

с^-тг- ——^ • Крашенинников И. А

Актуальность проблемы

Фактор свертывания крови VIII (FVI1I) - это неэнзиматичеекий кофактор фактора 1Ха, который при протеолитической активации образует с фактором 1Ха плотный нековалентный комплекс, связывающий и активирующий фактор X. Данный комплекс является основным элементом петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови. Дефекты гена FVIII могут приводить к развитию гемофилии А — Х-связанного рецессивного генетического заболевания с частотой встречаемости около 1 случая на 5000 мужчин. Единственной эффективной терапией гемофилии А является регулярно проводимая заместительная терапия лекарственными препаратами FVIII. Традиционный источник FVIII — это донорская плазма крови, количество которой ограничено. Ее использование в качестве сырья для получения терапевтических белков связано с риском передачи пациентам вирусных и прионных инфекций. Рекомбинантный FVIII человека (rhFVIII) для терапии гемофилии А может быть получен при помощи культивируемых клеток млекопитающих. Допущенные к медицинскому применению варианты rhFVIII секретируются трансфицированными клетками яичника китайского хомячка (СНО) или почки новорожденного хомячка (ВНК) и полностью эквивалентны FVIII из донорской плазмы при проведении заместительной терапии.

Основным недостатком существующих методов получения rhFVIII является крайне низкий уровень экспрессии, вызванный большим размером целевого белка и сложным набором пост-трансляционных модификаций. При удалении домена В, составляющего значительную часть молекулы FVIII, удельная прокоагулянтная активность FVIII и его период полураспада в плазме крови практически не падают. Замена домена В на короткий линкерный пептид, обозначаемый как SQ, приводит к существенному увеличению уровня продукции FVIII в клетках СНО и почти полному протеолитическому процессингу белка-предшественника до зрелой двухцепочечной формы. Медицинский препарат rhFVIII с делецией домена В (FVIII BDD SQ) допущен к медицинскому применению, его показатели эффективности и безопасности аналогичны таковым для препаратов полноразмерного rhFVIII. Типичные опубликованные уровни продуктивности для клеток линии СНО, продуцирующих FVIII BDD SQ, составляли 0,5-2 МЕ/мл, что соответствует концентрации FVIII около 0,2 мкг/мл и на несколько порядков уступает продуктивности промышленных продуцентов других рекомбинантных факторов свертывания крови (VII, IX).

Создание новых генетических конструкций для гетерологичной экспрессии биотехнологически важных белков имеет не только прикладное, но и фундаментальное

значение. Современные подходы, связанные с дизайном регуляторных последовательностей гена, кодирующего интересующий белок, позволяют существенно улучшить уровень экспрессии последнего. Получение линий клеток-продуцентов с существенно большим уровнем секреции биологически активного г№У1И является актуальной практической задачей, результаты решения которой будут востребованы современной биофармацевтикой и могут быть использованы для получения промышленно пригодных систем экспрессии других фармацевтически значимых белков.

Цель работы и основные задачи исследования:

Основной целью работы была демонстрация возможности получения клональной клеточной линии-продуцента гЫ-УШ с высокой продуктивностью и харакгеризация ее основных свойств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику продуктивности клеточных популяций, экспрессирующих гены полноразмерного гЬРУШ и делециошюго варианта ВЭЭ БС? под контролем промотора СМУ.

2. Разработать специализированный плазмидный вектор, позволяющий существенно повысить уровень экспрессии гена гЫ-УШ.

3. Получить клональные линии-продуценты гИРУШ с продуктивностью более 10 МЕ/мл при помощи разработанного вектора.

4. Исследовать основные свойства линий-продуцентов и разработать варианты лигандов для аффинной очистки гЬРУШ.

Научная новизна: В результате проведения настоящей работы обнаружено, что уровень секреции клетками-продуцентами делециошюго варианта гЬРУШ в безбелковую культуральную среду значительно выше уроня секреции полноразмерного гЫ-УШ, при этом процесс амплификации трансгена гЬР/Ш в геноме клеток-продуцентов для генетической конструкции на основе промотора СМУ идет с низкой эффективностью даже при объединешш открытых рамок считывания целевого гена и селекционного маркера в составе бицистронной РНК. Было продемонстрировало, что использовшше нетранслируемых и фланкирующих областей гена фактора элонгации трансляции 1А (ЕЕР1А1) китайского хомячка вместо вирусного промотора СМУ позволяет существенно увеличит!, уровень экспрессии гЬРУШ в стабильно трансфицированной культуре клеток. Включение в состав экспрессионного вектора конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр (ЕВУ) дает возможность увеличивать уровень экспрессии гена гЬРУШ более чем в 10 раз при амплификации генетической кассеты в геноме клеток. Были впервые получены линии-продуценты делециошюго варианта гЬРУШ с

продуктивностью 30-40 МЕ/мл при простом периодическом культнвировании клеток в безбелковой среде, не использующие ко-экспрессшо шапероиа rhFVIIl или реинжинирш1г сигнальных путей и ферментных систем продуцентов. Было продемонстрировано, что лиганды для аффинной очистки rhFVIIl могут быть получены как созданием моноклональных антител, так и докингом in silico библиотек химических соединений.

Теоретическая и практическая ценность: Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию процессов биосинтеза и секреции FVIII гетерологичными клетками. Полученные результаты могут быть использованы для создания линий-продуцентов различных фармацевтически значимых белков и методов генотерапии гемофилии А.

Апробация работы: Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на I Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2009» (Турция, Анталия, 25-27 мая 2009), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012), 16й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 16-21 апреля 2012), Международной конференции «Биология-наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012), на 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, материалов российских и международных конференций - 6. Оформлено 2 патента.

Структура и объем работы: Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий ссылок. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит^-У таблицы и З^рйсунка.

Содержание работы

Результаты исследования и их обсуждение 1.Создание линии продуцента фактора VIII с деленной В-домена на базе стандартной

экспрессионной системы

1.1 Создание эксирессионных конструкций деленпонного мутанта FVIII

Экспрессионная конструкция pOptivec/F8, кодирующая полноразмерный FVIII, была создана на основе вектора pOptivec-TOPO. При клонировании варианта FVIII BDD SQ минимизировали использование ПЦР для снижения вероятности возникновения мутаций

(рис. 1). Для получения стабильных линий-продуцентов использовали линеаризованные плазмиды с разрушенным геном ß-лактамазы.

F8 Kozak

F8 signal peptide

polyA' DHFR

F8BDD

EMCV IRES

+Qr*{.

pOplivec 13423 no.

F8BD0/ pOplivec 10741 no.

i>Al-F12

' ., fl agmen1

3242 n.o

Рисунок 1. Карта экспрессиониои плазмиды pOptivec/F8BDD п общая схема клонирования

CMV-prom - цитомегаловирусный промотор, F8 Kozak - природная последовательность Козак гена FV/II, F8 signal peptide - последовательность, кодирующая природный сигнальный пептид FVIII, F8BDD - ОРС FVIII BDD SQ, EMCV IRES - внутренний участок связывания рибосом EMCV, DHFR-ОРС дигидрофолатредуктазы, polyA - сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, pUC ori - бактериальная область начала репликации, Ыа - ОРС ß-лактамазы, Ыа prom -промотор гена ß-лактамазы. Направление транскрипции генов указано стрелками. Б. Прямоугольники - линейные фрагменты ДНК, круги - плазмиды. Стадии ПЦР показаны пунктирной линией, рестрикции-лигирования — сплошной.

1.2 Получение и характернзация линнм-продуцента BDD-FVIII

Дефектные по dhfr клетки СНО DG-44 трансфицировали линеаризованными плазмидами в бессывороточной среде с использованием реагента, свободного от продуктов животного происхождения. Популяции стабильно трансфицированных клеток получены во всех случаях после культивирования трансфицированных клеток в селективной среде в течение 15-20 дней.

Концентрацию секретированного FVIII определяли методом ИФА. Для полноразмерного FVIII все три популяции секретировали менее 1 ОМЕ/л FVIII. Для делеционного варианта была обнаружена популяция с уровнем секреции BDD-FVIII 71 ± 10 МЕ/л, которая использовалась для амплификации трансгена.

Клетки выбранного пула подвергали воздействию селекционного агента -метотрексата (MTX), начиная с концентрации 25 нМ. После стабилизации культуры концентрацию MTX удваивали и продолжали амплификацию (рис. 2). Не обнаружено плавного подъема уровня секреции BDD-FVIII в течение всего курса амплификации, максимальный уровень BDD-FVIII в кондиционированной среде получен после пяти последовательных шагов амплификации (0.5 мкМ MTX). Дальнейшее увеличение концентрации MTX привело к немедленному падению уровня секреции продукта в 10 раз с

последующим возвращением к величинам, примерно соответствующим исходной культуре стабильно трансфицированных клеток (74 ± 6 МЕ/л для 16 мкМ MTX). Это явление предположительно обусловлено увеличением в популяции доли непродуцирующих клеток, содержащих измененную бицистронную мРНК (Fann, 2000) или амплифицированные «посторонние» гены, например ген множественной лекарственной устойчивости, кодирующий гликопротеин Р (Assaraf, 1989).

Рисунок 2. Уровень секреции BDD-FVIII в конфлюентных клеточных понуляцнях по данным НФА. Измерения проводили в двух повторностях, погрешности указаны для доверительных интервалов 95%.

О 0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 1 2 4 8 16 MTX, мкМ

Популяцию клеток с максимальным уровнем продукции BDD-FVIII, полученную в присутствии 0,5 мкМ MTX, использовали для клонирования клеток-продуцентов методом предельного разведения (табл. 1).

Таблица 1. Секреция BDD-FVIII 10 наиболее продуктивными клональиьши клеточными линиями

Клональная линия, номер 18 22 17 9 1 2 15 3 4 16

Секретируемый BDD-FVIII, МЕ/л* 502 475 434 416 410 399 395 379 378 375

Концентрацию секретированного продукта измеряли для прикрепленных культур в момент достижения конфлюентности.

Не было зафиксировано существенного падения уровня ВОО-РУШ в двух клональных

линиях, #18 и #22, при продолжительном культивировании. Более продуктивную лпшно #18

выбрали для дальнейшего использования. Секретируемый BDD-FVIII из

кондиционированной среды и клеточных лизатов отобранной клональной линии, названной

DG-BDDFVIII-18, был охарактеризован методом иммуноблотгинга (рис. 3).

Рисунок 3. Иммуноблотннг секретированного и внутриклеточного BDD-FVIII

«тяжелая цепь» и «легкая цепь» — гибридизация с моноклональными антителами к тяжелой и легкой цепи FVIII соответственно; «BDD-FVIII-» и «BDD-FV1II+» — образцы, соответствующие нетрансфицированным клеткам СНО DG-44 и клеткам линии DG-BDDFVIII-18, соответственно. Приведенные для каждого из антител дорожки соответствуют одной мембране, разделение в 7.5% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, молекулярные массы указаны в кДа.

тяжелая цепь легкая цепь среда клетки среда клетки BDD-FVIII - + - + . + - +

' т . рЯ' » ni!.«

170- * " ' 130-

__ -170

95- -130

95

'П

."-72

Основная часть секретированного BDD-FVIII и его внутриклеточного белка-предшественника была процессирована до двухцепочечной формы. Подвижность полос тяжелой и легкой цепи при ДСН-ПААГ соответствовала подвижности цепей BDD-FVIII, определенной ранее Келли и соавторами (Kelley, Jankowski et al.).

Прокоагулянтная активность BDD-FVIII в кондиционированной среде составила 0,47 ME/мл, а уровень антигена F VIII в этом образце, измеренный при помощи ИФА, составил 0,52 ME/мл. Секретируемый клональной клеточной линией DG-BDDFVIII-18 FVIII обладает полной удельной прокоагулянтной активностью.

2 Дизайн генетических элементов для оригнналыюн системы экспрессии р.1.1

В качестве элемента, обеспечивающего транскрипционную активность целевого гена, был выбран конститутивный аутологичный промотор СНО, и области, фланкирующие ген EEF1A1 клеток СНО. Ограничением векторов, включающих ОРС и протяженные регуляторные области, может являться низкая эффективность трансфекции и низкая частота амплификации целевого гена в геноме, вызванная большим размером генетической кассеты и возможностью независимой амплификации гена селекционного маркера. Для уменьшения размера генетической кассеты - создана минимальная плазмида (бэкбон), на основе которой собирался экспрессионный вектор. Для увеличения вероятности интеграции и частоты амплификации в вектор ввели фрагмент конкатемера терминальных повторов EBV.

2.1 Получение минимального базового вектора pBL

Были сформулированы требования к плазмиде, которую можно использовать как основу для создания экспрессионного вектора, среди которых: 1) минимальный размер, 2) высокая копийность в бактериях, 3) пригодность для клонирования сложных последовательностей.

Для создания минимального базового вектора был применен метод инвертированной ПЦР с использованием длинных адапторных праймеров. Был получен базовый вектор — транскрипционо-неактивный и содержащий удобный для дальнейшей сборки фрагментов полилинкер.

2.2 Получение флапкирующнх областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка

Ген китайского хомячка EEFIA1 и фланкирующие его области были клонированы и депонированы в публичную базу данных GenBank под номером AY188393 авторами работы (Running Deer and Allison 2004), показавшими также, что два фрагмента AY188393, соответствующие позициям 8532—12603 и 14545—18794, содержат все необходимые

элементы для стабильной экспрессии гетерологичных белков в клетках млекопитающих. Для получения данных районов нами была применена стратегия модульной сборки (рис. 4). При помощи разработанной нами программы BIOF фланкирующие районы гена EEF1AI были поделены на 5 и 6 модулей. Небольшая длина модулей (<0,8 т.п.о.) позволяла определять нуклеотидную последовательность фрагментов до их сборки, то есть быстро и экономично получить полностью корректную последовательность целевых геномных участков.

Разработанная в ходе решения этой задачи программа BIOF для разбиения геномных

последовательностей на модули, содержащие гибридные рестриктиые сайты,

распространяется на условиях лицензии GNU GPL. программа и ее исходный код доступен

по адресу http://sourceforge.net/proiects/biof/. Данная стратегия клонирования (MAC, рис. 4)

может применяться для других приложений, например, для получения ОРС редких

транскриптов в ходе in vitro сплайсинга.

Клонирование длинного продукта ПЦР MAC • Модульная сборка Рисунок 4. Схема принципа

.......»_ , —., _.». __ .. , метода модульной сборки

X. Нем5>^зяам[мифигаци8 модулей ~ Мутации или неизвестные

2. Прямое секвекирование ПЦР продухи»/ нуклеотиды обозначены

параллельное клонирование разных ПЦР ЗвеЗДОЧКаМИ «ОЮ> -

продувов и секаенирование со стандарт- верифицированные

ных праймеров к вектору ' 1

1. ПЦР амплификация всей целевой области

2. Клонирование ПЦР-продукта

3. Секвенироаание множественных клонов с различных специфических праймеров

—fed

SDK

последовательности ДНК. Праймеры для секвенирования ОК щ— обозначены стрелками.

4. Продолжение секвенирования до обнаружения полностью корректного клона или комбинирование корректных частей последовательностей рестрикцией-лигировэнкем при условии наличия в последовательности нужных сайтов

щок Щрон

3. Сборка модулей с полиостью верифицированной последовательностью с использованием введенных при ПЦР совместимых сайгоа рестрикции

Клон с верифицированной целевой последовательностью

Все 11 модулей были получены при ПЦР с геномной ДНК СНО DG-44 без оптимизации условий, клонированы в Т-вектор, и собраны в ходе последовательных шагов рестрикции-лигировапия.

Когда были опубликованы первые данные «черновой» сборки генома СНО (Hammond, Kaplarevic et ai. 2011), в них были обнаружены те же отличия от AY188393, что и у нас, за исключением двух замен. Следует отметить, что фрагменты сборки генома СНО, примыкающие к гену EEF1A1 - AFTDO1093962 и AFTD01093963.1, не полностью перекрываются с последовательностью AY188393, то есть в опубликованной сборке отсутствует фрагмент длиной 810 по, соответствующий нуклеотидам 11387 -12196 AY188393 (Рис. 5). Полученная нами последовательность, предположительно, лучше

отражает истинную последовательность этих районов, так как была достигнута большая избыточность при секвенировании клонов, содержащих короткие субфрагменты. Одна однонуклеотидная замена и инсерция двух нуклеотидов, не совпадающие со сборкой генома СНО и АУ188393, встречались во всех проанализированных клонах, и могут быть обусловлены ошибками ПЦР или мутациями генома сублинии СНО 00-44.

[ АУ188393 (18794П.О)__-— 810п.о.

АРЮ01093962 |_5493п.о.

2 т.п.о.

AFTD01093963.1 (28454п.о.)

UFR DFR

EEF1A1

Рисунок 5. Известные данные о геномной последовательности областей, фланкирующих ген EEF1A1 китайского хомячка Схематически изображены имеющиеся на данный момент в данные о последовательности областей генома, окружающих ген EEF1A1. UFRu DFR- upstream, downstream flanking regions- районы, фланкирующие ген EEF1A1, использованные при создании вектора pl.l.

2.3 Получение экспрессионного вектора р.1.1

Экспрессионный вектор pl.l (рис. 6) был собран на основе разработанного нами нетранскрибируемого вектора pBL-2, в который были последовательно добавлены собранные из модулей геномные области, фланкирующие ген EEF1A1 СНО, фрагмент конкатемера терминальных повторов EBV, EMCV IRES и ОРС DHFR мыши.

"V

3AL-ID

pUC ori

bla

bla prom EBV TR

PBL2-ID

I5CHF1-6 T5AL-5CH ЧрВ|

¡-иингч!)

|TATA

transcription start полилинкер СНО EEFIA intron 1

3CH Fl-6 pAL-ЗСН

fpl.l(EBVTR-)

a—

pEGFPC2

4

¡pAl-eSFP fpl.leGFP fpl.î(EBVTR-) eGFP

Рисунок 6. Карта экспрессионного вектора р 1.1 и общая схема клонирования

A. pUC ori — область начала репликации; Ыа — ОРС ß-лактамазы, Ыа prom — промотор гена ß-лактамазы; EBVTR - участок терминального повтора EBV; EMCV 1RES - внутренний сайт связывания рибосом EMCV; DHFR - ОРС дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках; СНО EEF1A! UFR и DFR - районы, фланкирующие ген EEF1А1 СНО, рА - сигнал полиаденилирования гена EEFIA 1 СНО; TATA, transcription start - ТАТА-бокс и точка начала транскрипции; СНО EEF1A1 intron 1 - первый интрон гена EEF1A1 СНО. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Б. Прямоугольники - линейные фрагменты ДНК, круги - плазмиды. Стадии ПЦР показаны пунктирной линией, рестрикции-лигирования — сплошной.

Был также создан контрольный вектор р1.1 (ЕВУТЯ-) без повторов ЕВУ. На основе этих векторов получены экспрессионные конструкции р1.1-еОРР и р1.1(ЕВУТК-)-еОРР с геном зеленого флуоресцентного белка для проверки их функциональных свойств.

2.4 Проверка свойств вектора р1.1 и определение условий получения стабильно трапсфпцировапных линий клеток и амплификации трансгена для модельного белка еСКР

Клетки СНО ВО-44 трансфицнровали сверхскручепными плазмидами и через 48 часов определяли интенсивность флуоресценции еОРР в лизате клеток и долю флуоресцирующих клеток. Установлено, что доля транзиентно трансфицнрованных клеток и общий уровень продукции сОРР не различались для случаев трансфекции клеток СНО ПО-44 плазмидами сходной длины, содержащими или не содержащими участок ЕВУТЯ. Эффективность транзиентной трансфекции для плазмид на основе вектора р1.1 была значительно ниже, чем для контрольной плазмиды рНОГР-Ы2 с минимальным вирусным промотором, что объясняется большей длиной вектора р 1.1.

Линеаризованные плазмиды р1.1-ЕСРР и р 1.1 (РВУТИ-)-РОРР использовали для трансфекции клеток и последующе!! селекции стабильно трансфицированной популяции.

Культура, трансфицированная плазмидой рР 1-РОРР, содержащей участок ЕВУТЯ, проходила минимум клеточной плотности на 11 -й день культивации в селективной среде, при этом плотность составила 147,5 тыс. клеток/мл при доле жизнеспособных клеток 27,7%. В случае плазмиды рР 1(ЕВУТК-)-ЕСРР, без ЕВУТЯ, минимум был достигнут на 13-ый день культивации в селективной среде, при этом плотность составила 42,5 тыс. клеток/мл при доле жизнеспособных клеток 3,6%. Средний уровень экспрессии целевого гена еОИР для обеих полученных популяций не имел существенных различий — 62,0 тыс. ОЕФ/50 тыс. клеток и 63,8 тыс. ОЕФ/50 тыс. клеток, соответственно. Таким образом, участок ЕВУТЯ не влияет на средний уровень экспрессии трансгена для стабильно трансфицнрованных линий клеток.

Для количественной оценки уровня интеграции плазмид в геном продуцентов через 48 ч после трансфекции клетки перемещали в селекционную среду и высевали в лунки микропланшетов по 5 тыс. клеток на лунку. Через 2 недели после посева подсчитывали общее число выросших колоний, число флуоресцирующих колоний и уровень флуоресценции для нескольких колоний с максимальной интенсивностью флуоресценции

(табл. 2). При высевании в лунки планшетов клеток, обработанных трансфекционным

реагентом без добавления плазмид, колониеобразования не происходило.

Таблица 2. Эффективность колоннеобразования при стабильной трансфекции клеток СНО плазмидами с участком ЕВУТИ и без него

Название плазмиды PEGFP-N2 pl.l-EGFP pl.l(EBVTR-)-EGFP

Транзиентно трансфицированные клетки, % 22,8% 5,8% 6,0%

Удельная интенсивность флуоресценции, тыс. ОЕФ/БОтыс. клт 114 35,3 31,9

Жизнеспособные клетки, % 86% 83% 84%

При получении олигоклональных линий-продуцентов eGFP траисфекция плазмидой, содержащей участок EBVTR, позволила увеличить количество позитивных колоний в 40 раз, при этом уровень экспрессии целевого гена для самой продуктивной олигоклональной линии был выше в 4,6 раза. При получении олигоклональных популяций стабильно трансфицированных плазмидой pl.l-EGFP клеток в присутствии 50 нМ MTX было установлено, что удельный уровень флуоресценции для 10 наиболее продуктивных олигоклональных популяций приблизительно в два раза выше, чем в случае селекции олигоклонов в среде без MTX (Рис. 7А). Для получения более продуктивных линий, экспрессирующих ген eGFP, проводили амплификацию целевого гена в геноме клеток под действием MTX. Популяции клеток, стабильно трансфицированные плазмидами pl.l-EGFP и pl .l(EBVTR-)-EGFP высевали в лунки микропланшетов в присутствии различных концентраций MTX. В случае плазмиды pl.l(EBVTR-)-EGFP не наблюдали значимого увеличения уровня флуоресценции при использовании MTX в концентрациях до 200 нМ, также не наблюдали образования колоний при концентрациях MTX 400 и 800 нМ (данные не приводятся). Для олигоклональной линии, полученной при трансфекции клеток плазмидой pl.l-EGFP, были получены колонии для всех концентраций MTX, результаты измерения удельной интенсивности флуоресценции лизатов клеток для 8 колоний с максимальным уровнем экспрессии eGFP (для каждого уровня MTX) приведены на рис. 7Б.

Таким образом, наличие участка EBVTR в плазмиде pl.l существенно увеличивает скорость амплификации целевого гена и позволяет получать высокопродуктивные линии в короткие сроки (15 дней) под действием высоких концентраций MTX. Возможный механизм действия участка EBVTR при амплификации целевого гена — образование шпильки на одноцепочечной ДНК при транспозиции области целевого гена, ускорение амплификации трансгенов по механизму транспозиции описано в работе (Tanaka, Tapscott, 2002). Наиболее вероятно образование шпильки между участками GGGGGCCGCGGG (нуклеотиды 161-172)

и CCCGCAGCCCCC (84-95) или CCCGCGGACCCC (100-111), инвертированные повторы с одной некомплементарной парой нуклеотидов. А Б В

образующими

О 10 20 30 40 50 60

время культивации, дней

Ol-г—,-,-г—,-г—,-,-г—

123456789 10

номер олигоклона

о

12345678

номер олигоклона

Рисунок 7. Удельная интенсивность флуоресценции для наиболее продуктивных олигоклональных линий, экспресснрующих eGFP.

А Уровень экспрессии eGFP для 10 наиболее продуктивных олигоклональных лунок, при культивации в среде, содержащей 0 и 50 нМ MTX; Б. Уровень экспрессии eGFP для 8 наиболее продуктивных олигоклонов, полученных при амплификации трансгена под действием различных концентраций MTX; исходная олигоклональная популяция получена без MTX. Для всех серий панели Б — 1 шаг амплификации трансгена под действием MTX, для каждого уровня MTX анализировали по 2x96 лунок. В, Постоянство экспрессии eGFP линиями-продуцентами при суспензионном культивировании (пассирование 1 раз в 4 дня). ОЕФ — относительные единицы флуоресценции.

Показано, что продуктивность нескольких наилучших олигоклональных линий может быть увеличена приблизительно в 5 раз при выполнении однократной процедуры амплификации.

Для 10 олигоклональных линий были получены моноклональные линии -продуценты eGFP, из них для 6 линий с различными уровнями продуктивности измеряли динамику удельной флуоресценции при продолжительном культивировании. Значимого изменения уровня продуктивности не наблюдалось ни в одной из линий (рис. 7В), что позволяет заключить, что линии-продуценты, полученные при трансфекции клеток СНО DG-44 плазмидой на основе вектора р 1.1 и последующей одностадийной амплификации целевого гена, сохраняют стабильный уровень экспрессии целевого гена в течение 60 дней. Такой срок сохранения неизменного уровня продукции целевого белка обычно считается достаточным для промышленного использования линий-продуцентов в биофармацевтике.

З.Получение и характеризация линий-продуцентов BDD-FVIII на основе разработанной системы экспрессии

Генетическая конструкция pl 1-F8BDD была получена лигированием ОРС FVIII BDD SQ и консенсусной последовательности Козак с вектором pl.l, обе НТО из кДНК FV1II были полностью удалены, и ОРС FVIII была полностью перемещена в контекст гена EEF1A1. Трансфекцию и получение первичной популяции клеток-продуцентов проводили в тех же условиях, что и для плазмиды pOptivec/F8BDD. Обнаружено, что уровень секреции FVIII для транзиентно трансфицированной культуры составляет 9 мМЕ/мл, а для стабильно трансфицированной популяции - 0,134 ME/мл по данным ИФА. Полученную популяцию использовали для проведения амплификации целевого гена в адгезионной культуре при концентрациях MTX 50, 100, 200, 400 нМ; одновременно с этим повторно провели трансфекцию клеток СНО DG-44 плазмидой pl 1-FVI1I-BDD и провели первичную селекцию продуцентов в присутствии 50 нМ MTX в условиях адгезионной культуры. Наиболее продуктивные олигоклональные линии реадаптировали к культивации в суспензионных условиях. Результаты анализа продуцентов для различных уровней селекционного давления приведены на рис 8.

12 3 4 5 6 7 Номер клона

d 0

го

У

m m тг

MTX 50нМ

Рисунок 8. Уровень секреции FVIIJ при амплификации тряпсгена при помощи МГХ или первичной селекции в адгезионной культуре.

А - уровень секреции для лучших 10 олигоклональных линий, отобранных среди 182 лунок для каждой использованной концентрации MTX, измерение в момент достижения конфлюентности в первых 10% лунок. Б - уровень секреции FVIII для олигоклональных линий после реадаптации к суспензионному культивированию. Концентрация FVIII измерена ИФА для культуральной среды, взятой по достижении клетками концентрации 1,2 млн клт/мл. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям, п=2. Линии 2-F6, 3-В8, 4-Н6 получены первичной селекцией в адгезионной культуре, остальные линии получены при концентрации MTX 200 нМ.

Установлено, что одностадийная амплификация трансгена для первичной популяции клеток под действием 200 нМ MTX и первичная селекция олигоклональных линий в присутствии 50 нМ MTX приводят к получению линий со сходной продуктивностью, не уступающей продуктивности большинства описанных в литературе моноклональных линий-продуцентов делеционных вариантов FVIII. Для дальнейшей амплификации трансгена была выбрана олигоклональная линия 3-В8, полученная первичной селекцией при концентрации MTX 50 нМ и секретирующая только интактный FVIII по данным иммуноблоттинга (рис. 9).

_heavy chain_ light chain Рисунок 9. Иммуноблотинг сегрегированного

_ce|Js— -cells--и внутриклеточного BDD-FVIII для

> ш > ш > ш различных продуцентов «heavy chain» и «light

ш 170-

2 J , S ï '¡SX

о о <->_<->. о р chain» - гибридизация с моноклональными

антителами к тяжелой и легкой цепи FVIII соответственно; «CMV» и «CHEF1 » - образцы, 130" соответствующие клеткам линии DG-BDDFVIH-

çjÊL "17° 18 (промотор CMV) и 3-В8 (промотор CHEF 1),

в5 ™ '..............130 соответственно. Приведенные для каждого из

антител дорожки соответствуют одной мембране, 72- ^ разделение в 7.5% ДСН-ПААГ в

в|

43-

34-

восстанавливающих условиях, молекулярные массы указаны в кДа.

-34

При постепенном повышении концентрации MTX в суспензионной культуре линии 3-В8 было обнаружено, что существенное падение жизнеспособности клеток наблюдается при концентрации MTX 1 мкМ. Наиболее продуктивная поликлональная популяция клеток была получена при культивации в присутствии 4 мкМ MTX (табл. 3) и использована для генерации клональных линий-продуцентов методом конечных разведений.

Была получена 361 изолированная колония, среди которых была выбрана наиболее продуктивная моноклональная линия-продуцент 11А4Н, обладающая удельной продуктивностью 7,7 мкМЕ/клт/д по данным коагулометрии и временем деления 30 ч.

При культивировании линии 11А4Н в перемешиваемой колбе в течение пяти суток в стандартной безбелковой культуралыюй среде РгоСНО 4 был достигнут уровень FVIIPC 39±3 ME/мл при конечной концентрации клеток 3,5 млн/мл и жизнеспособности более 85%. Для выбранной линии 11А4Н постоянство уровня секреции FVIII было подтверждено для 60 дней последовательног о культивирования в отсутствие MTX (данные не приводятся).

Таблица 3. Схема получения и продуктивность основных линий н популяций продуцентов FVII1

Название линии/ Схема селекции и амплификации при помощи Уровень Удельная

популяции клеток метотрексата секреции FVIII, МЕ/мл продуктивность, мкМЕ/клг/д

3-В8 50 нМ 5,4+0,4*

3-В8 1К 50нМ->500нМ->1мкМ 20,1* -

3-В8 2К 50 нМ->500 нМ->2 мкМ 18,8*

3-В81К2К 50нМ->500нМ-> 1мкМ->2мкМ 17,6**

3-B8 1К4К 50нМ->500нМ-> 1 мкМ~>4 мкМ 18,6»* -

13B4F 50 нМ->500нМ-> 1 мкМ->4 мкМ-> клонирование 39,0±5,5*** 6,5

11А4Н 50нМ->500нМ-> 1 мкМ->4 мкМ-> клонирование 39,4±3,4*" 7,7

21А7В 50 нМ-^500 нМ -> 1 мкМ->4 мкМ -у клонирование 34,4±0,8*** 6,2

* - измерение концентрации РУШ по ИФА, стандарт - полноразмерный рекомбинантный РУШ. ** - измерение активности РУШ одностадийным коагулометрическим методом. *** - измерение активности РУШ двухстадийным коагулометрическим методом.

Методом Г1ЦР-РВ подтверждена амплификация экспрессионной кассеты в геноме СНО (рис. 10).

А

200

§150 X

0

£100

1 50

о

MTX ГТЛМВШМ Ш1НШ1 " "B4f 11A4H 21А7В

I _4_i КЛОН

Б 2 , Г / ■ PPIB с

' . ■ I......Й ■ I

ЗВ8 3BS1K ЗВ82К* ЗВ8К2К- 3BS1K4K 11А4Н

Рисунок 10. Копийность экспрессионной кассеты в геноме но данным ПЦР-РВ.

А. Изменение средней копийности экспрессионной кассеты в ходе амплификации. ID- данные, полученные при помощи праймеров к области IRES-DHFR, F8B - к области ОРС SQ FVIII BDD. Приведена схема амплификации, где указаны использованные концентрации MTX. Б. Данные для праймеров к области гена пептидил-пролил изомеразы В (PPIB), предположительно уникальной для генома СНО. В. Копийность кассеты для трех клонов-продуценты FVIII - 13B4F, 11А4Н, 21А7В. SPCD - удельная продуктивность клонов, мкМЕ/клт./день. Приведено число копий на гаплоидный геном СНО. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего».

Сравнение данных, полученных с использованием праймеров к области 1RES и гена дигндрофолатредуктазы мыши и праймеров к ОРС FVIII-BDD (области SQ делеции В-домена) показало сохранение сцепления гена селекционного маркера и целевого гена, то есть интактности экспрессионной кассеты при амплификации. Установлено, что линия-продуцент 11А4Н содержит 29±1 копий трансгена на гаплоидный геном.

При анализе кДНК методом Г1ЦР-РВ не выявлено значимых отличий в уровне транскрипции трансгена между тремя клонами с максимальной продуктивностью (рис. 11 А), одновременно с этим уровень секреции продукта был максимален для клона с повышенным уровнем экспрессии шаперона BiP (рис.11 Б).

А

SPCD

S 1 6-2

|14-----------------------------11,7%--------

¿12----------SPCD--------------j.-----------

J10......... б'.5.. SPCD |________

7,3% 7,7 fej

I 8 т 5,5% I......

| _ 0,0% III °'0%

DG44 13B4F 11А4Н 21А7В FIX р Рисунок 11. Анализ кДНК клонов-продуцентов [ VIII методом ПЦР-РВ. А Экспрессия трансгена, % от Р-актина. Б. Изменение уровня экспрессии генов по сравнению с DG44. Нормирование данных вели по уровню (Î-актина. EiFlal- фактор инициации трансляции 1А эукариот, EiF3- фактор инициации трансляции 3 эукариот, PPIB- пептидил-пролил изомераза В (циклофилин В), BIP — иммуноглобулин-связывающий белок (Grp78); OSTC- субъединица комплекса олигосахарилтрансферазы; St3gal -бетагалактозид-2,3-сиалил трансфераза III; B4gal - Р-1,4-галактозилтрансфераза I. I3B4F, 11А4Н, 21А7В - клоны-продуценты FVIII, FIXp - контрольная популяция продуцентов фактора IX. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего».

Методом гибридизации по Саузерну для клонов UA4H и 21А7В было установлено, что копии интегрированного в геном клеток-продуцентов экспрессионного вектора в основном присутствуют в неизменном виде (рис. 12).

Для области ОРС FVIII не обнаруживается рестриктных фрагментов измененной длины, а для областей DHFR, EMCV 1RES, bla наблюдается присутствие одного укороченного рестриктного фрагмента, что может указывать на наличие преобладающего разрыва последовательности ДНК экспрессионной конструкции в одной из этих областей, то

А - 13B4F • - 11А4Н Я - 21А7В

а

Ц

OSTC St3Gal B4Gal

есть предположительного нахождения преобладающей точки рекомбинации ДНК экспрессионной конструкции и геномной ДНК клетки-хозяина в одной из них.

FVIII probe

IRES-DHFR-bla probe blot

X

S (5 û

*т

о

20000-

100007000- * ! ¡В

5000- й-'

4000-

ЗООО- Щ

2000-

1000-

750500-

Рисунок 12. Анализ геномной ДНК клонов -продуцентов FVIII методом гибридизации по Саузерну с меченными биотином зондами.

FVIII probe - гибриизация с зондом к области ОРС FVIII, IRES-DHFR-bla — с зондом к вспомогательным областям экспрессионной кассеты (ОРС DHFR, EMCV 1RES, Ыа, pUC18 ori). Разделение в 0,8% ТВЕ-агарозе, геномная ДНК рестрицирована EcoR\. Изображения ДНК в геле инвертированы,контраст сканограмм окрашенных мембран увеличен для улучшения видимости полос гибридизации.

4.Разработка подходов к очистке рекомбинантного белка BDD-FVII1

4.1 Очистка и характеризацня BDD-FVIII

Выделение и очистку FVIII из культуралыгой среды проводили при помощи пяти последовательных стадий хроматографии, ультрафильтрацию и сходные методы разделения не использовали из-за необратимого связывания FVIII с материалом ультрафильтрационных мембран. Данные гель-электрофореза белковых фракций, полученных на трех первых стадиях очистки, приведены на Рис. 13. таблица очистки приведена в Таб. 4. Было установлено, что гомогенный по данным электрофореза препарат FVIII может быть получен при помощи стадий очистки на сорбентах Capto ММС, SP Sepharose, VIII Select, однако удельная прокоагулянтная активность, соответствующая фармакопейным требованиям для лекарственного препарата делеционного варианта FVIII «ReFacto», достигается только после проведения пяти стадий очистки. Общий выход целевого белка (по прокоагулянтной активности) составил более 20%, что позволяет считать использованный процесс выделения и очистки пригодным для промышленного использования.

Рисунок 13. Электрофореграмма белковых фракций препарата FVIII в процессе хроматографической очистки.

Обозначения: М - маркер; ММС wash - фракции промывки, стадия 1; SP el -фракции элюции, стадия 2; VIII ff- фракция проскока, стадия 3; VIII el — фракция элюции, стадия 3. Нетяжелая цепь, LC — легкая цепь. Молекулярные массы указаны в кДа.

Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Дорожки А, В, С приведены из Sandberg Н. et al//Semin Hematol, V.38, N.2, (2001), 41-42.

Таблица 4. Таблица очистки FVIII

№ стадии Тип хроматографии Сорбент Объем, мл Белок, мг/мл* Активность, МЕ/мл" Удельная активность, МЕ/мг Кол-во FVIII, тыс. ME Выход стадии Выход общий

0 Культуральная среда - 320 — 36,3 11,6 _ -

1 Мультимодальная кагионообменная Capto ММС 17 0,233 496,9 2133 8,45 73% 73%

2 Катионообменная SP Sepharose 10 0,271 538,1 1986 5,38 64% 46%

3 Аффинная VIII Select 11 0.046 382,0 8304 4,2 78% 36%

4+5 Анионообменная + гель-фильтрация Capto Q + Superdex 75 10 0,026 284.1 10925 2.84 68% 24%

Примечания. *- на стадиях 0-3 измерение по методу Брэдфорд, на стадии 4+5 УФ-спектрометрией; **- измерение прокоагулянтной активности методом АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).

Идентификацию триптических пептидов очищенного BDD-FVIII проводили методом масс-спектрометрии. В масс-спектрах триптических гидролизатов цепей BDD-FVII1 и одноцепочечной формы белка были обнаружены пики, суммарно соответствующие пептидам, составляющим 44% общей длины BDD-FVIII. В стандартном режиме работы масс-спектрометра (positive mode) не был выявлен пик пептида, потенциально содержащего три остатка сульфотирозина, а также не выявлены пики пептидов, содержащих три полностью занятых сайта N-пшкозилирования, одновременно с этим присутствовали пики пептидов, содержащих частично заполненные сайты О-гликозилирования Т1651, Т1652,

пики пептидов, потенциально содержащих одиночные остатки сульфотирозинов и пик пептида 37-47, содержащего частично заполненный сайт N-гликозилирования N41. Присутствие в спектрах пиков пептидов с немодифицированными остатками тирозина может быть объяснено как их неполным сульфатированием, так и фрагментацией пептидов при ионизации.

4.2 Компьютерное моделирование, попек синтетического лиганда для очистки

При получении фармацевтических препаратов FVIII с помощью иммуноаффинных сорбентов у пациентов выявлены аллергические реакции на остаточный иммуноглобулин мыши (Larson, 2004). Альтернативой иммунсорбентам являются сорбенты с иммобилизованными малыми молекулами (Morrill, 2002). Компьютерное моделирование таких лигандов было проведено в две последовательные стадии: докинга виртуальной библиотеки химических соединений Asinex против пространственных рецепторных решёток доменов С1 и С2 FVIII, и докинга виртуальной библиотеки ChemBridge против тех же пространственных рецепторных решеток. Для проверки релевантности выбранных сайтов связывания использовались известные лиганды FVIII - L3 и L4. Для поиска сайтов связывания были выбраны поверхности доменов С1 и С2 FVIII, содержащие большое количество как ионизированных, так и гидрофобных боковых цепей аминокислот (согласно анализу распределения заряда и гидрофобных областей по поверхности FVIII при помощи утилиты SiteMap), и образующие область контакта FVIII с мембраной (Shen, 2008; Ngo, 2008).

Над поверхностями потенциальных сайтов связывания были расположены границы рецепторных решёток кубической формы со стороной 34 ангстрема. Докинг лигандов L3 и L4 в рецепторные решётки предполагаемых сайтов связывания доменов С1 и С2 дал величины композитного индекса Glidescore в диапазоне -7 - -9. Докинг библиотек химических соединений производился по схеме последовательного обогащения более энергетически выгодными лигандами, связывающимися с рецепторными сайтами. Докинг библиотеки Asinex позволил отобрать 40 наиболее энергетически выгодных молекул-кандидатов, величина Glidescore для которых соответствовала диапазону Glidescore конформеров L3 и L4. Соединения с наилучшими (наиболее отрицательными) значениями Glidescore показаны на рис.12. Значительная часть (24) этих соединений имели в составе карбоксильную группу (16 из 24 содержали 2 и более карбоксильных групп).

CO-Ö а.

V0^ ил

^ЧЯ,. чЧн I г L3 С?

<Кч: ■V хР У > yXojr, L4 V

V'- V

Рисунок 14. Кандидатные лиганды, отобранные из библиотеки химических соединений Asinex Gold

L3 (справа вверху) и L4 (справа внизу) — структурные формулы соответствующих лигандов.

Поскольку проведение докинга но исходной схеме для большей по размеру виртуальной библиотеки химических соединений CheniBridge потребовало бы около 60 недель вычислений одной рабочей станции, для второго этапа докинга использовали только соединения, пригодные для иммобилизации на подложке, а также 3 рабочие станции. После фильтрации библиотеки Chem Bridge было обнаружено около 120 тыс. молекул, содержащих первичную аминогруппу или карбоксильную группу. Данные молекулы были пакетно модифицированы путем включения в их состав концевого участка соответствующей линкерной группы. Был проведён докинг полученной библиотеки в решётки докинга вершин доменов С1 иС2. Величины Glidescore для кандидатных лигандов (рис. 13) соответствовали области значений Glidescore для конформеров L3 и L4 и для выбранных на первом этапе докинга кандидатов из библиотеки Asinex.

Рисунок 15. Структурные формулы

модифицированных кандидатных лигандов, отобранных из библиотеки химических соединений «СЬстВпс^е».

4.3 Получение моиоклональных антител для иммуноаффинной очистки

Промышленная очистка белка ВОО-ПУШ включает в себя четыре стадии обычной хроматографии и одну стадию аффинной хроматографии. Таким образом, ключевым компонентом всего процесса может быть мкАт, способное связывать ВОЦ-РУШ из культуральной среды или из промежуточного концентрата и диссоциировать в мягких условиях элюции. Моноклональные антитела, пригодные для аффинной очистки ВОО-РУШ, получены путем скрининга гибридомных клонов (продуцирующих антитела к РУШ) при помощи ИФА. Были отобраны четыре клона с высоким титром специфических антител и максимальной чувствительностью к промывке лунок раствором этиленгликоля (табл. 4).

Таблица 5. Свойства моноклинальных антител, чувствительных к этиленглпколю

Клон Титр мкАт в асцитной жидкости Падение сигнала в ИФА при промывке этиленгликолем, % Динамическая емкость сорбента, МЕ/мл Степень элюции FVIII, %

А2 1:123 000 40 2.6 89

ЕЗ 1:68 500 39 2.8 89

А4 1: 27 500 15 1.6 >90

В6 1:123 000 35 3.4 86

Все четыре отобранных мкАт избирательно связывались с тяжелой цепью BDD-FVIII при иммуноблотинге (данные не приведены). Очищенные мкАт, полученные из асцитной жидкости, были иммобилизованы на хроматографическом сорбенте в соотношении 1 мг мкАт на 1 мл осажденного сорбента. Полученные иммуносорбенты использовали для выделения BDD-FVIII непосредственно из кондиционированной среды методом адсорбции в объеме. В таких условиях наблюдалась неполная адсорбция BDD-FVIII (около 20-30%), но практически весь адсорбированный целевой белок удерживался на сорбенте при промывке PBS и элюировался 50% раствором этиленгликоля. Уровень FVIII во фракции несвязавшихся белков и во фракциях элюатов измеряли при помощи коагулометрического теста. Присутствие активного FVIII во фракциях элюата указывало на то, что в использованных условиях элюции не происходит существенного повреждения продукта.

Таким образом, получены мкАт, потенциально пригодные для препаративной иммуноаффинной очистки рекомбинантного FVIII.

Заключение

В настоящей работе рассмотрены способы получения высокопродуктивной линии-продуцента фактора свертывания крови VIII с делецией области В-домена и описаны возможные варианты лигандов для проведения аффинной очистки РУШ.

При генерации линий-продуцентов Р\Т1[ с помощью общепринятых плазмидных векторов с промотором цитомегаловируса нами было установлено, что уровень секреции полноразмерного РУШ в безбелковую культуральную среду значительно ниже, чем уровень секреции В-домен делетированного варианта. При амплификации трансгена в геноме клеток-продуцентов под действием метотрексата уровень секреции функционально активного делеционного варианта РУШ был доведен до 0,5 МЕ/мл, при этом было обнаружено, что общая эффективность процесса амплификации для генетической конструкции с областью ОРС БУШ невысока, несмотря на использование бицистронной матрицы, кодирующей целевой белок и селекционный маркер. Продуктивность полученной системы экспрессии соответствовала имеющимся литературным данным, полученным ранее для векторов, кодирующих раздельные мРНК РУШ и селекционного маркера. Было предположено, что относительно низкий уровень экспрессии гена РУШ в клетках СНО может быть существенно увеличен при переносе открытой рамки считывания РУШ в специально сконструированный плазмидный вектор, включающий протяженные регуляторные области гена домашнего хозяйства китайского хомячка, фрагмент концевого повтора вируса, увеличивающий частоту интеграции кассеты в геном и как можно более короткий участок ДНК, необходимый для наработки плазмиды в бактериях. Согласно литературным данным, высокий и постоянный уровень экспрессии целевых генов наблюдался при переносе их ОРС в контекст гена фактора элонгации трансляции I альфа (ЕЕЕ1А1), однако векторы на основе данного гена были практически непригодны для амплификации трансгена в геноме продуцентов и обладали довольно низкой частотой интеграции в геном.

Нами были последовательно решены вспомогательные задачи по получению «нетранскрибируемого» плазмидного вектора минимального размера и молекулярному клонированию протяженных фрагментов гена ЕЕЕ1А1. При помощи полученных фрагментов был сконструирован плазмидный вектор р1.1 для трансфекции клеток млекопитающих. На примере ОРС модельного флуоресцентного белка евРР, клонированной в вектор р1.1, были найдены условия проведения трансфекций клеток линии СНО и амплификации трансгена в геноме продуцентов, позволяющие за короткое время создавать продуктивные и стабильные линии-продуценты.

Генетическая конструкция р1.1-Р8БЮО, кодирующая делеционный вариант БУШ, была трансфицирована в клетки СНО по разработанной методике, что позволило получить олигоклональные линии-продуценты РУШ с продуктивностью 5-10 МЕ/мл при помощи одной-двух стадий селекции и амплификации. Обнаруженный уровень продуктивности не уступал мировым результатам, достигнутым для клональных линий-продуцентов, полученных многостадийным отбором. При дальнейшей амплификации трансгена возрастающими концентрациями метотрексата и последующей генерации клональных линий были получены линии с продуктивностью до 39 МЕ/мл и проведен их молекулярный анализ, продемонстрировавший высокую копийность трансгена и высокий уровень мРНК целевого гена при отсутствии значимого числа аберрантных копий целевого гена. Таким образом, повышение уровня мРНК РУШ в клетках-продуцентах является достаточным условием для многократного увеличения уровня секреции функционально активного РУШ в безбелковую культуральиую среду, позволяющего вести его экономически обоснованный промышленный выпуск.

Поскольку медицинское применение препаратов РУШ предполагает его полную очистку от белков продуцента, нами была исследована возможность обнаружения низкомолекулярных лигандов, специфически связывающих РУШ, методами скрининга библиотек химических соединений т зШсо, а также получена панель моноклональных антител, узнающих эпитопы в составе тяжелой цепи РУШ и пригодных для адсорбции РУШ из культуральной среды и практически полной десорбции функционально активного РУШ.

Созданный в ходе настоящей работы плазмидный вектор р1.1 и исследованные методы его применения могут быть использованы для получения высокопродуктивных клеточных линий, секретирующих фармацевтически значимые белки.

Выводы

1. Создана генетическая конструкция для экспрессии полипептнда структурного варианта фактора VIII с делегированным В-доменом, соответствующего разрешенному к применению в клинической практике белку. Установлено, что при использовании стандартного плазмидного вектора на основе промотора цитомегаловируса (CMV) и кДНК дигидрофолатредуктазы могут быть получены линии-продуценты фактора VIII с уровнем секреции 0,5 МЕ/мч Амплификация созданной трансгенной конструкции в геноме клеток CHO-DG44 под действием метотрексата позволяет увеличивать продуктивность в 2,3 раза по целевому белку.

2. Для стабильной экспрессии гетерологичных белков с высоким уровнем на основе нетранслпруемых областей гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка и фрагмента конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр создан специализированный вектор pl.l. На модельном белке (eGFP) показано, что конструкции на основе созданного вектора интегрируются в геном клеток CHO-DG44 с высокой эффективностью. Использование данной системы позволяет многократно увеличивать уровень экспрессии целевого гена при амплификации под действием метотрексата и обеспечивает постоянный уровень экспрессии целевого гена в течение длительного времени.

3. При трансфекции клеток линии CHO-DG44 генетической конструкцией состоящей из вектора pl.l и кДНК фактораVIII с делегированным В-доменом при одностадийной селекции получены клональные линии-продуценты фактора VIII с продуктивностью 5-ЮМЕ/мл, что не уступает известным мировым аналогам. После многостадийной амплификации трансгенной конструкции под действием метотрексата получена стабильная клональная линия-продуцент делеционного варианта фактора VIII11А4Н, секретирующая фактор VIII в концентрации 39 МЕ/мл, что существенно превосходит известные показатели для промышленных продуцентов данного белка. Таким образом, установлено, что увеличение уровня мРНК фактора VIII является достаточным для многократного повышения уровня его секреции траисфицированными клетками СНО.

4. Разработаны подходы к очистке и характеризации рекомбинантного фактора VIII человека. Методом скрининга библиотек химических соединений ш si/ico отобраны кандидатные молекулы, потенциально пригодные для аффинной очистки фактора VIII. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, позволяющие проводить аффинную очистку активного фактора VIII. Разработана пятистадийная схема очистки фактора VIII, секретируемого линией 1А4Н. Получаемый этим методом гомогенный препарат обладает удельной активностью 11тыс.МЕ/мг, что соответствует данным для известных лекарственных препаратов на основе рекомбинантного фактора VIII.

Сппсок публикаций по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Orlova N.A.. Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Yuriev A.S., Gabibov A.G., Vorobiev A.I. Stable Expression of

Recombinant Factor VIII in CHO Cells Using Methotrexate-Driven Transgene Amplification // Acta Naturae. 2012. V.4. № 1. P. 93-101.

2. Мацкевич B.A., Орлова Н А.. Воробьев И.И., Юрьев А.С., Воробьев А.И. Поиск

низкомолеклярного лиганда для аффинной хроматографической очистки фактора свертывания крови VIII человека молекулярным докингом in silico // Математическая биология и биоинформатика. 2011. Т. 6. № 1С. 14-22.

3. Орлова Н.А.. Ковнир С.В., Воробьев И.И., Габибов А.Г., Воробьев А.И. Фактор свертывания

крови VIII-от эволюции к терапии //Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 2. С. 19-39 (Обзор)

4. Orlova N.A.. Kovnir S.V., Vorobiev 1.1., Gabibov A.G. Coagulation Factor IX for Hemophilia В Therapy //ActaNaturae. 2012. V4. № 2. P. 62-75 (Обзор)

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Orlova N.A., Orlov A.V., Vorobiev I.I. A modular assembly cloning technique (aided by the BIOF software tool) for seamless and error-free assembly of long DNA fragments // BMC Research Notes. 2012.5:303. Тезисы:

1. Orlova N.A.. Kovnir S.V., Vorobiev 1.1., Vorobiev A.I., Gabibov A.G. Design of genetic elements and expression system optimization for high-level coagulation factor VIII production in mammalian cells II Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 «Mechanisms in Biology». FEBS Journal 280 (Suppl. 1). 2013. P. 595

2. Воробьев И.И., Орлова Н А.. Ковнир С В. Методы получения рекомбинантного фактора

свертываемости крови VIII // Тезисы научно-практической конференции «Достижения в гематологии и трансфузиологии». Гематология и трансфузиология. 2009. Т.54, N1. С. 28-29.

3. Орлова НА.. Ковнир СВ., Усакин JI.A., Воробьев ИИ. Плазмидный вектор pl.l для высокоэффективной стабильной экспрессии гетерологичных белков в культивируемых клетках китайского хомячка // Биология - наука XXI века: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пущине. 2012. С. 137.

4. Orlova N.A.. Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Vorobiev A.I. Generation of a high-level factor VIII producer cell line using expression system bearing untranslated regions of the elongation factor 1 alpha gene of Chinese hamster // Proceedings of the International Scientific Conference «Pharmaceutical and Medical Biotechnology». Moscow. 2012. P. 114-115.

5. Орлова Н А . Ковнир С В., Воробьев И И. Оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии. Сборник трудов. Казань. 2012. С. 210-213.

6. Орлова Н А.. Ковнир С В., Воробьев И И., Габибов А Г., Воробьев А.И. Высокопродуктивная линия-продуцент фактора свертывания крови VIII человека на основе вектора с нетранслируемыми областями гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка // Материалы Международной конференции «Биология-наука XXI века». Москва 2012. С. 655-656.

Патенты:

1. Орлова Н А.. Ковнир С В., Воробьев И.И., Юрьев А.С., Воробьев А.И. Экспрессионная

генетическая конструкция pOptivec/F8BDD, кодирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В домена и клеточная линия DG OV F8BDD 18, продуцирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В домена. Патент РФ № 2429294. Приоритет от 23.10.2009 // Бюл. «Изобретения. Полезные модели», № 26, 20 И.

2. Орлова Н А.. Ковнир С В., Воробьев И И. Экспрессионный плазмидный вектор для

гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и усиленной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, бицистронная мРНК, способ получения стабильных линий продуцентов рекомбинантных белков с использованием указанного вектора, способ получения рекомбинантных белков. Патент РФ № 2488633. Приоритет от 16.11.2011 // Бюл. «Изобретения. Полезные модели», № 21,2013.

Подписано в печать 09.09.2013 Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж ЮОэкз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Надежда Александровна, Москва

российская академия наук

фгбун центр «биоинженерия»

На правах рукописи

0420136198?

удк 577.123

Орлова Надежда Александровна

Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека в клетках млекопитающих

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

чл.-корр. РАН, профессор А.Г. Габибов

Москва-2013

Оглавление

Список сокращений...........................................................................................................................4

Введение.............................................................................................................................................6

Обзор литературы..............................................................................................................................8

1. Функции фактора VIII в системе гемостаза.......................................................................8

2. Структура фактора VIII......................................................................................................10

2.1 Структура гена FVIII и особенности его экспрессии...............................................10

2.2 Доменная структура фактора VIII..............................................................................11

2.3 Координированные ионы металлов............................................................................14

2.4 Пост-трансляционный процессинг белка-предшественника FVIII.........................16

2.4.1 N-гликозилирование.............................................................................................16

2.4.2 Формирование дисульфидных связей................................................................17

2.4.3 Фолдинг и взаимодействие с шаперонами ЭПР................................................18

2.4.4 Транспорт FVIII из ЭПР в аппарат Гольджи.....................................................19

2.4.5 Процессинг FVIII в аппарате Гольджи...............................................................21

3. Фактор VIII в циркуляции..................................................................................................22

4. Взаимодействие FVIII с фактором 1Ха.............................................................................24

5. Взаимодействие с фактором X..........................................................................................24

6. Взаимодействие с фосфолипидами...................................................................................24

7. Активация FVIII и инактивация FVIIIa............................................................................25

8. Удаление FVIII из системной циркуляции.......................................................................26

9. Полноразмерный рекомбинантный FVIII.........................................................................27

10. Рекомбинантный FVIII с делецией В-домена................................................................29

11. Факторы, ограничивающие продуктивность систем гетерологичной экспрессии FVIII .............................................................................................................................32

12. Антитела к FVIII...............................................................................................................35

13. Варианты FVIII пролонгированного действия..............................................................35

14. Системы гетерологичной экспрессии белков в клетках млекопитающих с высоким выходом .............................................................................................................................38

Материалы и методы.......................................................................................................................44

1. Материалы и реактивы.......................................................................................................44

2. Методы.................................................................................................................................46

2.1 Общие методы работы с бактериями Escherichia coli..............................................46

2.2 Общие методы работы с ДНК.....................................................................................48

2.3 Создание экспрессионных конструкций....................................................................50

2.4 Препаративное получение плазмид для трансфекции..............................................58

2.5 Ведение культур клеток млекопитающих.................................................................58

2.6 Трансфекция и селекция стабильно трансфицированных клеток...........................59

2.7 Создание моноклональных линий-продуцентов.......................................................59

2.8 ПЦР в реальном времени.............................................................................................60

2.9 Саузерн-блот гибридизация........................................................................................62

2.10 Иммуноферментный анализ......................................................................................63

2.11 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ).........63

2.12 Количественное определение белка.........................................................................64

2.13 Иммуноблотинг..........................................................................................................64

2.14 Получение мкАт.........................................................................................................64

2.15 Коагулометрия............................................................................................................65

2.16 Компьютерное моделирование.................................................................................66

2.17 Хроматографическая очистка FVIII.........................................................................66

2.18 Масс-спектрометрия..................................................................................................68

Результаты и обсуждение...............................................................................................................70

1. Создание линии продуцента фактора VIII с делецией В-домена на базе стандартной экспрессионной системы........................................................................................................70

ч 1.1 Создание экспрессионных конструкций делеционного мутанта FVIII..................70

1.2 Получение и характеризация линии-продуцента BDD-FVIII..................................71

2. Дизайн генетических элементов для оргинальной системы экспрессии р.1.1.............74

2.1 Получение минимального базового вектора pBL.....................................................75

2.2 Получение фланкирующих областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка................................................................................................................................80

2.3 Получение экспрессионного вектора р.1.1................................................................84

2.4 Проверка свойств вектора pl.l и определение условий получения стабильно трансфицированных линий клеток и амплификации трансгена для модельного белка eGFP.....................................................................................................................................87

3. Получение и характеризация линий-продуцентов BDD-FVIII на основе разработанной системы экспрессии......................................................................................91

4. Разработка подходов к очистке рекомбинантного белка BDD-FVIII............................99

4.1 Очистка и характеризация BDD-FVIII.......................................................................99

4.2 Компьютерное моделирование, поиск синтетического лиганда для очистки.....102

4.3 Получение моноклональных антител для иммуноаффинной очистки.................110

Заключение.....................................................................................................................................112

Выводы...........................................................................................................................................114

Список литературы........................................................................................................................115

Список иллюстраций.....................................................................................................................133

Список таблиц................................................................................................................................134

Список сокращений

FVIII - фактор свертывания крови VIII;

FVIII BDD, BDD-FVIII - фактор VIII свертывания крови с делецией домена В; FVIII BDD SQ - фактор VIII с делецией домена В вариант SQ; BiP - immunoglobulin-binding protein; GRP78;

СНО - Chinese hamster ovary - клетки яичника китайского хомячка, Cricetulus griseus; CNX - кальнексин; CRT - кальретикулин;

DHFR - дигидрофолатредуктаза [КФ 1.5.1.3]; dNTP - дезоксирибоинуклеотидтрифосфат; EBV - вирус Эпштейна-Барр;

ELISA - метод твердофазного иммуноферментного анализа; EMCV - вирус энцефаломиокардита; ERAD - ER-associated degradation;

ERGIC - ER-Golgi intermediate compartment, промежуточный компартмент;

FIX - фактор свертывания крови IX;

GRP78 - glucose-regulated protein MW 78,000 иначе BiP;

GTI, GTII - глюкозидазы I и II;

HAT среда - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин;

НТ среда - среда, содержащая гипоксантин и тимидин;

IEX - ионообменная хроматография;

IRES — внутренний сайт связывания рибосом;

Ка — константа диссоциации;

Кт - константа Михаэлиса-Ментен;

МТХ — метотрексат;

PBS - фосфатно-буферизованный раствор;

SEC - гель-фильтрация (size exclusion chromatography);

TEMED - тетраэтилметилендиамин;

UGT- UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase;

UPR - unfolded protein response;

Vmax - максимальная скоростьь ферментативной реакции; АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время; БСА - бычий сывороточный альбумин;

Да - Дальтон;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДСН - додецилсульфат натрия;

ИФА - метод твердофазного иммуноферментного анализа; кДа - тысяча Дальтон; мМ- миллимолярный;

МЕ - международная единица (соответствует содержанию фактора VIII в 1 мл

пулированной донорской плазмы);

мкАт - моноклональное антитело;

мкг - микрограмм;

мкл - микролитр;

мл - миллилитр;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

НТО - нетранслируемая область;

об/мин - обороты в минуту;

ОРС - открытая рамка считывания;

ОТ-ПЦР - ПЦР с этапом обратной транскрипции;

п.о. — пар оснований;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

т. п. о. - тысяча пар оснований;

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

Тритон Х-100 - полиоксиэтилен (П=9 Ю)-п-третоктил-фенол;

ффВ (vVF) - фактор фон Виллебрандта;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭПР - эндоплазматический ретикулум.

Введение

Фактор свертывания крови VIII (FVIII) - это неэнзиматический кофактор фактора 1Ха, который при протеолитической активации образует с фактором 1Ха плотный нековалентный комплекс, связывающий и активирующий фактор X. Данный комплекс белков является основным элементом петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови. Дефекты гена FVIII могут приводить к развитию гемофилии А — X-связанного рецессивного генетического заболевания с частотой встречаемости около 1 случая на 5000 мужчин. Около половины всех случаев гемофилии А вызваны инверсиями в интроне 22 гена FVIII [1], еще около 5% - инверсиями в интроне 1. По состоянию на июнь 2012 года было описано 1492 различные мутации гена FVIII, проявляющиеся как гемофилия А [2].

Единственной эффективной терапией гемофилии А является регулярно проводимая заместительная терапия лекарственными препаратами FVIII. Традиционный источник FVIII - это донорская плазма крови, количество которой ограничено. Кроме того, использование донорской плазмы в качестве сырья для получения терапевтических белков связано с риском передачи пациентам вирусных [3; 4] и прионных [5] инфекций даже после тщательного скрининга единиц заготовленной плазмы и множественных процедур вирус-инактивации. Рекомбинантный фактор VIII человека для терапии гемофилии А может быть получен при помощи культивируемых клеток млекопитающих, очищен до фармакопейных показателей при помощи аффинной хроматографии и трех-четырех стадий обычной хроматографии и подвергнут вирус-инактивации при помощи обработки детергентом и растворителем, а также нанофильтрации или прогревания. Допущенные к медицинскому применению варианты рекомбинантного FVIII человека были получены при помощи культур клеток яичника китайского хомячка (СНО) или почки новорожденного хомяка (ВНК) и полностью эквивалентны FVIII из донорской плазмы при проведении заместительной терапии.

Основным недостатком существующих методов получения рекомбинантного FVIII человека является крайне низкий уровень экспрессии, вызванный большим размером целевого белка и сложным набором пост-трансляционных модификаций. При удалении домена В, составляющего значительную часть молекулы FVIII, удельная прокоагулянтная активность FVIII и его период полураспада в плазме крови практически не падают [6]. Замена домена В на короткий линкерный пептид, обозначаемый как SQ, приводит к существенному увеличению уровня продукции FVIII в клетках СНО и почти полному протеолитическому процессингу белка-предшественника до зрелой двухцепочечной

формы. [7]. Медицинский препарат фактора VIII с делецией домена В (FVIII BDD SQ) был допущен к медицинскому применению под торговым названием «Рефакто»; его показатели эффективности и безопасности были аналогичны таковым для препаратов полноразмерного рекомбинантного FVIII человека [8]. Типичный уровень продуктивности для клеток линии СНО, продуцирующих FVIII BDD SQ составлял 0.5-1 МЕ/мл по данным [7]; в независимо проведенной работе [9] для наилучшего клонального продуцента BDD-FVIII был зафиксирован сходный уровень продуктивности 0.5-2 МЕ/(1 млн клт * д), что соответствует концентрации FVIII около 0,2 мкг/мл и на несколько порядков уступает продуктивности промышленных продуцентов других рекомбинантных факторов свертывания крови (VII, IX).

Получение линий клеток-продуцентов с существенно большим уровнем секреции биологически активного рекомбинантного FVIII человека является актуальной практической задачей, результаты решения которой будут востребованы современной биофармацевтикой и могут быть использованы для получения промышленно пригодных систем экспрессии других фармацевтически значимых белков.

Создание новых генетических конструкций для гетерологичной экспрессии биотехнологически важных белков имеет не только прикладное, но и фундаментальное значение. Современные подходы, связанные с дизайном регуляторных последовательностей гена, кодирующего интересующий белок, позволяют существенно улучшить уровень экспрессии последнего. Оптимизация условий гетерологичной экспрессии и методов очистки целевого белка также может давать свои практические результаты.

В настоящей работе мы сосредоточились на указанных выше направлениях целью получения технологически оправданных количествах фактора VIII для медицинских целей.

Обзор литературы 1. Функции фактора VIII в системе гемостаза

Функционально FVIII может быть описан как неэнзиматический кофактор активной протеиназы фактор 1Ха. Плотный нековалентный комплекс FVI 1а и FIXa образуется на поверхности фосфолипидной мембраны и дополнительно включает молекулу FX, активируемую FIXa, покидающую комплекс после активации и запускающую, в свою очередь, реакцию превращения протромбина в тромбин (FII в Fila), который уже непосредственно превращает фибриноген в основной компонент тромба - фибрин. Тройной комплекс факторов свертывания FIXa, FVIIIa и FX, связанных с фосфолипидной мембраной, обычно называется «Х-аза» или «теназа» и представляет собой основной элемент петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови (Рисунок 1). Функционально аналогичный теназе комплекс может быть описан для внешнего пути свертывания (FUI, FVIIa, FIX, FX), однако его энзиматическая эффективность значительно ниже, чем у «внутренней» теназы, что и соответствует фактическим проявлениям гемофилии А - сохранению гемостаза при мелких повреждениях сосудов и отсутствию контроля более значительных кровотечений.

Название

Фибриноген

^Свойства

Протромбин

Тканевый фактор, тромболластин

Са++

АС-глобул ии,

Проконвертин

Анти гемофнл ьный глобулин

Фактор Кристмаса

Фактор Стюарта-Прауэра

Предшественник тромболластина

Фактор Хагеманна

Фибринолигаэа (а), фибрин стабилизирующий фактор

ВИЗ, СП

ВКЗ, СП

ВКЗ, СП

Фактор Виллебранда

Фактор Флетчера,

плазменный

прекалликреин

Фактор Фитцжеральда, высокомолекулярный кинимоген плазмы

Путь

EJ

Е, I

EJ

Теназа внешнего пути

hx

Теназа внутреннего пути

VIJIHCL,

>

Протромбиназа

Рисунок 1. Функции фактора VIII в системе гемостаза

А Схема системы свертывания крови и международная номенклатура факторов свертывания [10]. ВКЗ - витамин K-зависимый, СП - сериновая протеаза, ТГ - трансглутаминаза, НЭК - неэнзиматический кофактор; Е - внешний; I - внутренний, FC - конечный общий путь свертывания крови. Рисунок воспроизведен из [11].

Б Схема сборки теназного комплекса на мембране клеток. Римскими цифрами обозначены факторы свертывания крови в форме проферментов, римскими цифрами с индексом «а» -активированные ферменты. Факторы свертывания ассоциированы с мембраной, фактор III -трансмембранный белок. VIIIHC - тяжелая цепь фактора VIII, VIIILC - легкая цепь фактора VIII, белым шрифтом обозначеы домены Al, А2, A3, С1,С2 в составе цепей FVIII. VHC - тяжелая цепь фактора V, VLC - легкая цепь фактора V.

Различная толщина белых стрелок обозначает разницу в скорости реакций.

Уникальной особенностью теназного комплекса является огромная степень усиления каталитической эффективности малоактивной протеиназы FlXa, сообщаемая FVIIIa -около 5 порядков [12]. Как видно из Таблицы 1, Кт для FLXa по отношению к FX уменьшается на 4 порядка при внесении в реакционную смесь фосфолипидов, что соответствует связыванию фермента и субстрата с поверхностью фосфолипидной мембраны и их взаимной пространственной ориентации при образовании комплекса. Дальнейшее внесение FVIIIa не изменяет Km реакции и повышает Vmax, чему соответствует изменение конформации активного сайта FlXa, вызываемое образованием комплекса FLXa и FVIIIa [13]. Гомолог фактора VIII - фактор V аналогичным образом потенцирует активность FXa в составе комплекса протромбиназы с коэффициентом усиления каталитической эффективности 240х.

Таблица 1. Кинетические свойства FlXa и кофакторов

Фермент и кофакторы Km, мкМ Vmax, мин-1* Относительная каталитическая эффективность**

1Ха 300 0,002 1

1Ха, Са2+ 181 0,011 8

IXa, Са2+, PL 0,06 0,002 5,8*103

IXa, Са2+, PL,Villa 0,06 500 1*109

* Моль фактора Ха/мин/моль фактора 1Ха.

** Отношение Ушах/Кш для смеси и Ушах/Кш для чистого фактора 1Ха. Данные приведены для белков быка [14], цит. по [15].

Несмотря на то, что РУШ является кофактором гидролитического фермента с известными низкомолекулярными субстратами, его удельную активность практически невозможно измерить достоверным обра