Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором

Баландина, Анна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором"

004606803

На правах рукописи

БАЛАНДИНА Анна Николаевна

Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004606808

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН и в Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Атауллаханов Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Васильев

Сергей Александрович

кандидат биологических наук

Домогатский Сергей Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им.Н.Н.Семенова РАН

Защита диссертации состоится « 30» июня 2010 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.001.042.02. при Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан «Л У» 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Система гемостаза обеспечивает целостность кровеносной системы в организме человека. Выделяются три составляющих: тромбоцитарный гемостаз, плазменный гемостаз и сосудистый гемостаз. Все три составляющие необходимы для эффективного предотвращения кровопотери: агрегировавшие в месте повреждения тромбоциты обеспечивают прочность сгустка, образованная в результате работы плазменной системы свертывания фибриновая полимерная сеть скрепляет клетки и предотвращает просачивание жидкости, вазоконстрикция сосудов перераспределяет ток крови, уменьшая его в месте повреждения.

На данный момент хорошо изучены все компоненты системы свертывания с точки зрения биохимии - известны константы реакции, условия протекания реакций и др. Однако, так как система состоит более чем из 100 элементов, связанных между собой множеством реакций, сложно предсказать ее работу в целом и влияние на нее отдельных параметров. В медицинском аспекте это проявляется в том, что до сих пор неясно, почему, например, дефицит одного белка системы приводит к сильнейшей кровоточивости, а другого - остается незамеченным организмом. Более половины смертей в мире имеют в качестве непосредственной причины нарушения свертывания крови тромбозы или кровотечения. Поэтому изучение работы системы гемостаза является важной биофизической и медицинской задачей.

Система свертывания должна обладать пороговыми свойствами, чтобы избежать случайного возникновения тромбов и запускаться только в случае наличия повреждения. Под порогом по активации свертывания здесь и далее понимается минимальное ненулевое количество активатора свертывания, вызывающего образование фибринового сгустка. Существуют указания на такое свойство в системе свертывания крови (Kastrup et al. PNAS 2006; Pokhilko Thromb. Res. 2000; Okorie et al. Blood, 2008). Однако до сих пор не были проведены эксперименты, в которых зарегистрировали пороговые значения активатора свертывания. Во всех проведенных ранее исследованиях в образце цельной крови или плазмы без добавления активатора свертывания происходило формирование сгустка.

Пороговое поведение системы свертывания связывают с наличием в ней положительных обратных связей. Положительная обратная связь позволяет системе свертывания самостоятельно усиливать свою работу за счет того, что продукт реакции влияет на собственное производство. В системе свертывания основным таким регулятором является тромбин - последний фермент каскада реакций, превращающий растворимый белок фибриноген в нерастворимый полимеризующийся фибрин. Тромбин вступает в реакции, приводящие к еще большей наработке самого тромбина в

системе. В математических моделях, описывающих работу систем типа системы свертывания, активно изучается функция таких обратных связей. Показано, что они позволяют ускорить на порядки работу системы и обеспечить избирательную чувствительность системы к запускающему сигналу - свертывание начинается только при получении сигнала выше определенного уровня. Из клинических примеров хорошо известно, что отсутствие того или иного фактора системы свертывания, участвующего в своей положительной обратной связи, по-разному влияет на здоровье человека. Так, при тяжелой форме гемофилии А больные нуждаются в постоянном восполнении недостающего элемента системы свертывания, а при гемофилии С заболевание проявляет себя только при серьезных травмах. При этом степень кровоточивости не всегда коррелирует с уровнем дефицитного фактора, так что пациенты с одинаковым исходным уровнем фактора нуждаются в индивидуальном подборе терапии.

В данной работе изучались пороговые свойства системы свертывания человека исследована роль положительных обратных связей в экспериментах in vitro с использованием математического моделирования. Целью работы являлось изучение пороговых свойств системы свертывания крови и роли положительных обратных связей активации факторов V (фУ), VII (фУП), VIII (фУШ) в активации свертывания формировании фибринового сгустка в системе in vitro. Отличительной особенностью работы является исследование пороговых свойств в системах in vitro с различно пространственной организацией: активация свертывания в объеме (пространствен!« однородная система), на поверхности и от единичных клеток (пространственш распределенные системы). Пространственно-распределенная система свертывания i vitro имитирует рост сгустка от стенки сосуда. В такой системе реакции свертываш запускаются на поверхности с тканевым фактором (ТФ) и распространяются вглуЕ тонкого неперемешиваемого слоя плазмы. Поверхность с клетками, вызывающим свертывание крови, позволяет выяснить роль единичных клеток в формировали фибринового сгустка. Математическая модель системы свертывания позволит обнаружить вероятные элементы регуляции в системе и спроектировать эксперимент! проверяющие теоретические представления. Клинически наиболее актуальной часты работы было исследование влияния замещающей терапии фУШ при гемофилии / Исследовалась корреляция пространственного роста сгустка с частотой кровотечений уровнем фУШ.

Цель работы: Изучить пороговые свойства свертывания крови и poj положительных обратных связей в формировании фибринового сгустка в системе : vitro.

Задачи исследования: 1. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной <

тромбоцитов плазмы крови в пространственно-однородной системе.

2. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-распределенной системе при активации поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.

3. Сравнить формирование фибринового сгустка при активации свертывания от равномерно иммобилизованного на поверхности тканевого фактора и от клеток, экспрессирующих тканевый фактор.

4. Выявить роль положительных обратных связей в процессе активации и формирования фибринового сгустка.

5. Изучить динамику формирования сгустка у пациентов с гемофилией А при введении им фактора VIII.

Научная новизна. Показано существование порога в свободной от тромбоцитов плазме крови по концентрации ТФ (в пространственно-однородной системе) и плотности активатора на поверхности (в пространственно-распределенной системе). Впервые экспериментально измерена величина порога по активации свертывания. Показано, что положительная обратная связь активации фУ тромбином позволяет системе свертывания осуществить быстрый переход из неактивного состояния к образованию плотного фибринового сгустка при небольших изменениях концентрации и плотности ТФ. При переходе от гомогенной постановки к пространственно-распределенной меняется вклад отдельных реакций в процесс свертывания плазмы крови. Впервые установлена зависимость параметров роста сгустка в пространстве от плотности и распределения ТФ. Показано, что рост сгустка зависит от локальной плотности активатора, а не от его количества. При этом даже единичный фибробласт -клетка с большой плотностью ТФ на мембране - способен эффективно активировать свертывание крови. Впервые экспериментально показана значимость положительной обратной связи активации фУП фактором Ха. В экспериментах с плазмой больных гемофилией А было показано, что при введении пациентам ф\Щ1 изменяются параметры роста сгустка в пространственно-распределенной системе. Динамика этих изменений, коррелирует с клиническим проявлением заболевания.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о регуляции системы свертывания могут быть применены в области лечения и создания новых препаратов для пациентов с дефицитом факторов свертывания. В работе показано, что учет пространственных неоднородностей в свертывании позволяет проводить оценку и подбор терапии при восполнении недостающих компонентов системы свертывания. Это позволяет поддерживать систему свертывания пациентов вблизи нормальных показателей свертывания на протяжении всего времени между двумя инъекциями препарата.

Положения, выносимые на защиту:

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором, равномерно распределенным по объему и по поверхности.

2. Тканевый фактор, сосредоточенный на пятнах, вызывает свертывание, а то же его количество, распределенное равномерно по поверхности - не вызывает свертывания.

3. Порог при активации свертывания в пространственно-однородной системе регулируется положительной обратной связью активации фУ тромбином, а порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фУ тромбином и фУН фактором Ха.

4. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Апробация работы. Работа прошла апробации: 12 апреля 2010 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и 19 апреля 2010 года на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН.

Результаты диссертационной работы были представлены: Шестая ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН-вузы "Биохимическая физика" (Москва, Россия, Ноябрь 24-27 2006 г), III Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, Россия, Февраль 1-3 2007 г), XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцария, Июль 6-12 2007), Fouth International Symposium on Computation Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Method Resources (Moscow, Russia, September 1-5 2007), 31 Международная конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века"(Пущино, Россия, Октябрь 29 - Ноябрь 2 2007), II International Conference "Mathematical Biology and Bioinformatics" (Pushchino, Russia, September 7 - 13, 2008), XXII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Бостон, CIIIA, Июль 11-16 2009).

Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 10 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов - 9

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и

библиографического указателя, включающего 240 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией к.б.н. Пантелеев М.А.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения о системе гемостаза человека. Основное внимание в обзоре уделено плазменному свертыванию, его структуре, функциям и нарушениям, связанным с дефектами компонентов системы. Рассмотрены основные экспериментальные модели и методы исследования свертывания. Также описаны существующие на данный момент математические модели системы свертывания. Отдельно рассмотрена роль обратных связей в функционировании системы свертывания как с точки зрения экспериментально известных фактов, так и предсказаний математических моделей.

В главе 2 описываются материалы и методы, используемые в работе. В том числе приводятся все реактивы, использованные при проведении экспериментов, методика забора крови у пациентов и приготовления из нее плазмы крови (концентрация тромбоцитов не превышала 109 клеток/литр), методики работы с замороженной плазмой. Также описана методика приготовления поверхностей, активирующих свертывание в пространственно-распределенной системе: пленок с фибробластами и иммобилизованного на мембранах или пластике ТФ, и методики контроля приготовленных поверхностей (подсчет клеток в монослое, определение средней плотности ТФ на поверхности по его активности).

В главе описана методика проведения исследования свертывания в пространственно-однородной системе. Активация свертывания проводилась с помощью ТФ. Регистрация свертывания производилась по сигналу светопропускания с помощью микропланшетного спектрофотометра. В лунки планшета помещалось 10 мкл раствора активатора разной концентрации, разведенный в буфере. Концентрация ТФ менялась с шагом 2Ш, от 5 пМ до 0.002 пМ. Далее одновременно, с помощью многоканального микродозатора, вводилась плазма и тщательно перемешивалась. Объем плазмы составлял 90 мкл (при этом концентрация ионов добавляемого кальция составляла 20 мМ). Сразу после этого планшет помещался в микропланшетный спектрофотометр

(Molecular Devices, Sunnyvale, CA), температура в котором поддерживалась на уровне 37° С. Измерение оптической плотности проводились на длине волны 405 нм. Для предотвращения высыхания плазмы в течение 5-часового эксперимента планшет закрывался крышкой. По зависимости оптической плотности от времени с начала активации вычислялся лаг-период - время образования сгустка с плотностью 50% от максимальной плотиости сгустка, образованного при активации плазмы 5 пМ ТФ.

Кроме того, подробно описана экспериментальная методика, используемая для исследования формирования фибринового сгустка в пространственно-распределенной системе. Активация свертывания проводилась поверхностью с иммобилизованным ТФ или фибробластами. Плотность ТФ и фибробластов варьировалась в пределах двух порядков - от 0.5 до 135 пмоль/м2. Регистрация пространственного сгустка производилась по сигналу светорассеяния в специально сконструированной измерительной системе.

Метод измерения: сущность метода исследования пространственной динамики свертывания (Ovanesov et al. ВВА 2002) заключается в локальной активации свертывания и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы крови с добавленным ингибитором контактной активации свертывания. В ходе работы использовалось несколько модификаций прибора, отличающихся геометрией измерительной кюветы, методом термостатирования и используемыми для обработки результатов программами. Здесь описана одна из модификаций.

Измерительная юовета: детали кюветы вырезались методом лазерной резки из листов полистирола толщиной 1 мм. Детали кюветы соединялись между собой и проклеивались по периметру клеем на основе дихлорэтилена с добавками полистироловой стружки. Перед экспериментом кювета помещается в термостат и заполняется рекальцифицированной плазмой (300 мкл), содержащей ингибитор контактной активации. В кювету вводится активатор свертывания и запускаются реакции свертывания, что приводит к формированию фибринового сгустка в месте активации и его распространению вглубь плазмы.

Активатор свертывания: в качестве активатора свертывания выступает пленка с фибробластами или иммобилизованным ТФ. ТФ иммобилизован на пластиковую поверхность, предварительно активированную с помощью полиэтиленимина, химическим методом через глутаровый альдегид. Методы иммобилизации ТФ были разработаны в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН И.И. Шмыревым и О.А. Фадеевой.

Измерительный прибор', для поддержания необходимой температуры и контроля во время проведения измерения в качестве нагревателей водяного термостата использовались резисторы СВЧ и цифровой датчик температуры.

Освещение кюветы осуществлялось красными светодиодными сборками. Рассеянное растущим в кювете сгустком излучение фокусировалось макрообъективом на высокочувствительный 16-битный ПЗС датчик цифровой фотокамеры. Для регулировки яркости и режима работы светодиодов, а также управления нагревом термостата использовались две специально разработанные платы управления. Разработка и конструирование приборов было осуществлено сотрудниками ГНЦ В.И. Сарбашом и С.С. Карамзиным.

Программное обеспечение: для получения фотографий растущего фибринового сгустка и вычисления параметров пространственной динамики роста использовалась программа Maxim DL 4.62 (Diffraction Limited, Канада).

Вычисление параметров роста сгустка: на всех кадрах проводится специальная линия перпендикулярно активатору, называемая репером (рис. 1А). Вдоль репера строится распределение яркости пикселей. Набор кривых яркости вдоль репера для всех фотографий называется графиком профилей светорассеяния (рис. 1Б). Из графика профилей светорассеяния строится зависимость размера сгустка от времени (рис. 1В) и вычисляются параметры пространственной динамики свертывания: лаг-период, скорости роста сгустка (начальная и стационарная) и размер сгустка через 40 минут после начала активации. Задержка свертывания с момента активации - лаг-период - и начальная скорость роста сгустка характеризуют начальную фазу активации свертывания. Стационарная скорость роста характеризует фазу пространственного роста сгустка. Размер сгустка — интегральная характеристика пространственного роста сгустка. Наличие спонтанных сгустков вдали от активатора свидетельствует о присутствии прокоагулянтного материала в образце. Амплитуда сигнала светорассеяния пропорциональна плотности образовавшегося сгустка.

Компьютерное моделирование свертывания крови проводилось с использованием детальной механизменной модели свертывания в пространственно-однородной и пространственно-распределенной системах. Модель создана на базе разработанной ранее модели в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН М.А. Пантелеевым (Panteleev et al. Biophys J 2006).

В случае пространственно-распределенной системы модель свертывания двухфазна: реакции протекают как на поверхности с ТФ, так и в объеме плазмы. Все константы, используемые в модели, взяты из экспериментов по литературным данным. Кинетика реакций системы описывается системой дифференциальных уравнений. Переменными в этих уравнениях являются концентрации факторов свертывания, изменяющиеся во времени (и также в пространстве, тогда система превращается в систему дифференциальных уравнений в частных производных).

Сами уравнения выписываются на основании закона действующих масс и в общем

случае имеют вид:

« = (1)

Зг 5дс

где слева стоит скорость изменения концентрации фактора Р во времени, справа стоит диффузионный член, а затем идут скорости реакций, отвечающих за производство (Р) и ингибирование (1) этого фактора. Пример конкретного уравнения модели, описывающего изменение концентрации фУШа:

8[УШа] дг[УШа] дг[Ша] дг\УШа] к™'"" \УШ\[Па'\ г ,

Ы т'°( дх1 ду> 5г2 } К™-°°+[Па'] [ 1 {>

где справа стоит диффузный член, скорости реакций формирования фУШа и его распада. В том случае, когда анализировалась гомогенная кинетика свертывания, диффузионный член отсутствовал и слева стояла полная производная вместо частной.

5 мин

Рис. 1. Последовательность шагов обработки экспериментальных данных но светорассеянию.

(А) Исходные фотографии растущего сгустка. На последнем кадре выбрана полоса, вдоль которой вычислялись профили светорассеяния. Показан рост сгустка в нормальной плазме при активации максимальной плотностью (96 пмоль/м2) иммобилизованного ТФ. Полоса слева - пленка с ТФ. Светлые области соответствуют сгустку, темные - несвернувшейся плазме. (Б) Профили светорассеяния растущего от активатора сгустка. Показаны профили через каждые 5 минут. (В) Зависимость размера сгустка от времени. Стрелками показаны моменты: лаг-период (1), конец начальной фазы роста (2), конец стационарной фазы роста (3). Скорости роста сгустка вычислялись по наклону участков этой кривой, на рисунке аппроксимирующие линии показаны пунктиром.

Глава 3 содержит результаты работы.

1. Порог по активации свертывания в пространственно-однородной системе. Для эффективной работы система свертывания должна обладать порогом по активации -свертывание не должно запускаться от сколь угодно малого количества активатора. Однако до сих пор не было проведено экспериментов, доказывающих наличие этого

порога, так как необходимы специальные экспериментальные условия, обеспечивающие отсутствие контактной активации свертывания и возможность длительного проведения эксперимента. В данной работе такие условия были выполнены: ингибитор контактной активации добавлялся на этапе забора крови, рН плазмы поддерживался постоянным в течение всего эксперимента и предотвращалось испарение плазмы.

Для изучения пороговых свойств системы свертывания были проведены эксперименты по активации свертывания в плазме крови здоровых доноров в зависимости от концентрации ТФ. При этом ТФ перемешивался равномерно по всему объему плазмы. Такая модель является самой простой моделью свертывания in vitro. При некоторых видах патологий в кровотоке может появляться растворимый ТФ. До сих пор не до конца понятно, как ТФ может воздействовать на свертывание в условиях организма. За образованием фибринового сгустка наблюдали с помощью измерения оптической плотности плазмы в микропланшетном спектрофотометре. На рисунке 2 А показана зависимость лаг-периода от концентрации ТФ. При уменьшении концентрации активатора время образования сгустка резко увеличивается. На рисунке 2 Б продемонстрирована зависимость конечной оптической плотности фибринового сгустка через 5 часов после начала активации свертывания. Приведенную зависимость можно разделить на три части, обладающих различным поведением: 1) в диапазоне от О до 0.005 пМ ТФ фибриновый сгусток не образуется вовсе в течение всего эксперимента; 2) в диапазоне от 0.005 до 0.02 пМ ТФ наблюдается резкая зависимость плотности сгустка от концентрации активатора; 3) в диапазоне от 0.02 до 5 пМ ТФ конечная плотность сгустка близка к максимальной и практически не зависит от концентрации активатора. Таким образом, есть область ненулевых концентраций ТФ, в которой сгусток не образуется как минимум 5 часов - порог по активации свертывания. Область, где образуется непрочный фибриновый сгусток (область 2) невелика, так что при свертывании практически всегда будет образовываться максимально плотный сгусток, полностью выполняющий свои функции в предотвращении кровотечения.

А Б

ТФ. пМ ТФ, пМ

Рис. 2. Пороговые свойства активации системы свертывания в нормальной плазме. (А)

Экспериментальная зависимость времени образования сгустка и конечной плотности сгустка от концентрации ТФ. (Б) Экспериментальная зависимость конечной плотности фибринового сгустка через 5 часов после запуска активации свертывания. Представлены результаты 3 отдельных экспериментов. На графиках изображены средние значения ± S.E.M.

2. Порог по активации свертывания в пространственно-распределенной системе. Так как свертывание в организме активируется от поврежденной стенки сосуда и распространяется за счет диффузии вглубь сосуда, то и в in vitro модели свертывания важно учесть пространственную неоднородность протекания реакций в системе свертывания. Свертывание в организме может начинаться и от единичных клеток, несущих на своей мембране ТФ. Например, такими клетками могут быть активированные моноциты. Само место повреждения сосуда может иметь различные размеры - от размера одиночной клетки эндотелия до зоны в несколько сантиметров. Плотность экспрессированного ТФ на клетках также может варьировать в широких пределах - от нуля для здоровых клеток эндотелия, до сотен пмоль/м2 для фибробластов. Для учета распределения ТФ по поверхности в экспериментах смоделировано два крайних случая - равномерно распределенный по всей активирующей поверхности ТФ и клетки с экспрессированным ТФ - фибробластов. При этом варьировалась плотность ТФ и плотность клеток для каждого типа активации соответственно.

Чтобы выяснить, как свертывание будет зависеть от плотности равномерно распределенного по поверхности активатора, были проведены эксперименты по активации свертывания пленками с иммобилизованным ТФ различной плотности - от 0.7 до 107 пмоль/м2. На пленках с большой плотностью ТФ сформировались значительные фибриновые сгустки. При меньших плотностях ТФ профили светорассеяния сгустка приобретают все более размытую форму, концентрация фибрина в образовавшемся сгустке меньше и плавно убывает по мере удаления от активирующей поверхности. А при активации пленками с ТФ из нижней области исследуемого диапазона плотностей сгусток не формируется вовсе - практически не видно изменений светорассеяния в течение всего эксперимента. Причем, чем меньше плотность активатора, тем позже сгусток начинает формироваться и меньших размеров достигает.

JIar-период резко зависит от плотности ТФ и представляет собой монотонно спадающую функцию (рис. 3 А). Для пленок с плотностью ТФ пмоль/м2 ниже 1.4 свертывание не наблюдается как минимум в течение 120 мин (время проведения эксперимента). То есть изменения в величине времени начала роста сгустка достигали более 30 раз в исследуемом диапазоне плотности ТФ. Скорость роста сгустка уменьшалась с уменьшением плотности активатора. Это в итоге приводит к резкой

зависимости размеров сгустка от плотности активатора (рис. 3 Б). На вставке показана увеличенная область низких плотностей ТФ для зависимости размера сгустка от плотности ТФ: свертывание не происходит при плотности ТФ ниже 1.4 пмоль/м2 -существует порог по активации свертывания.

Таким образом, система свертывания критически чувствительна к изменению плотности равномерно иммобилизованного на поверхности ТФ и при ее уменьшении время начала образования сгустка и скорость его распространения существенно падают. Изменится ли что-либо в ответе системе, где свертывание активируется тем же количеством ТФ, но сосредоточенном на фибробластах?

Чтобы выяснить, как живые клетки, с экспрессированным на их мембране ТФ, активируют систему свертывания было проведено исследование активации свертывания от фибробластов. Для этого использовались в качестве активатора пленки, с различной плотностью фибробластов - от 10 кл/мм2 до 1000 кл/мм2. Выбранный диапазон плотности клеток соответствует заполнению фибробластами пленки от плотного монослоя до одиночных, существенно удаленных друг от друга клеток. Средняя плотность ТФ по поверхности при этом варьируется на 2 порядка (от 0.5 до 135 пмоль/м2), перекрывая тем самым весь диапазон плотностей ТФ, используемый в экспериментах с иммобилизованным ТФ.

Опыты показали, что, в отличие от активации равномерным ТФ, рост сгустка от пленки с фибробластами практически не зависит от средней измеренной плотности ТФ во всем диапазоне плотностей (рис. 3). При этом, например, для средней по поверхности плотности ТФ, равной 1.4 пмоль/м2, среднее расстояние между соседними клетками составляет примерно 300 мкм. Этот факт позволяет говорить о независимом формировании фибринового сгустка вблизи отдельных клеток и демонстрирует, что даже отдельные фибробласты способны образовывать сгустки.

Таким образом, при активации свертывания одним и тем же количеством ТФ, процесс активации свертывания зависит от того, как представлен на поверхности ТФ. При активации клетками свертывание запускается быстро, и сгусток растет также быстро. Если то же количество ТФ равномерно иммобилизовать по всей поверхности -свертывание будет идти медленно или вообще не происходит.

° Равномерно распределенный ТФ

® Фибробласты

Г5 100 125

5 а.

о о. (В 5 о га О.

ТФ, пмоль/м

25 SO 75

ТФ, пмоль/м'1

Рис. 3. ТФ на клетках гораздо эффективнее активирует свертывание при той же средней плотности ТФ на поверхности. Зависимости лаг-периода (А) и размера сгустка через 40 мин после начала эксперимента (Б), от средней плотности ТФ для равномерного его распределения (•) и для клеток (•). Линиями показаны соответствующие аппроксимации, серые области — диапазон +/- S.E.M. Для каждой плотности активатора проводилось в среднем 3 эксперимента с плазмами разных доноров.

3. Исследование роли положительных обратных связей в активации и распространении фибринового сгустка в пространстве. Как было показано ранее, система свертывания обладает пороговым поведением. Из теоретических работ известно, что это свойственно системам с положительными обратными связями и ингибированием. В системе свертывания доказано наличие 4 положительных обратных связей: активация факторов V, VIII, XI тромбином и активация фУИ фактором Ха. До сих пор не рассматривались отдельно вклады этих реакций в формирование порога (кроме исследования активации фактора XI, в котором показано, что роль этой реакции невелика). Самый удобный способ оценить влияние отдельных реакций в системе -компьютерная имитация, где возможно "отключение" этих реакций по отдельности. Поэтому в работе была использована компьютерная модель свертывания.

С помощью модели были рассчитаны зависимости конечной плотности фибринового сгустка от концентрации ТФ. При этом рассматривалась полная модель системы свертывания и модели с отсутствием каждой из положительных обратных связей по отдельности.

При отсутствии реакции активации факторов VII, VIII и XI в пространственно-однородной системе зависимость конечной концентрации фибрина от концентрации активатора отличается от зависимости полной модели незначительно, тогда как при отсутствии обратной связи активации фУ зависимость не только "растягивалась" по оси концентраций активатора, но и приобретала совершенно иной характер. Вместо резкого перехода из несвернувшегося состояния к полному свертыванию фибриногена наблюдается плавный рост кривой, то есть зависимость практически линейна. Таким

образом, среди всех существующих положительных обратных связей модель предсказывает основополагающую роль в организации порогового поведения системы свертывания реакции активации фУ.

Предсказанная моделью роль обратной связи активации фУ нуждается в экспериментальной проверке. С помощью модели был спланирован такой эксперимент. В реальной системе свертывания невозможно просто "выключить" реакцию, однако можно использовать плазму, дефицитную по тому или иному фактору. Таким образом, в модели свертывания были проведены расчеты, имитирующие эксперимент in vitro. На рисунке 4 показаны результаты расчетов и экспериментальные данные по проверке роли активации фУ тромбином в формировании порога по активации в системе свертывания. Представлен расчет для системы без фУ и с 1% фУ. Присутствие небольшого количества фУ имитирует экспериментальные условия: практически сложно получить плазму, не обладающую следовой активностью какого-либо фактора системы свертывания. Из графиков видно, что наличие даже небольшого количества фактора приводит к изменению вида кривой, что, однако, не нивелирует различие в зависимостях для нормальной и дефицитной плазмы. Экспериментальная зависимость лаг-периода от сигнала активации также хорошо совпадает с теоретическими расчетами. В системе не содержащей фУ, порог по активации свертывания сдвигается в район 10 рМ ТФ. Однако основной особенностью системы без активации фУ является то, что область неплотного сгустка становится гораздо шире, по сравнению с нормальной плазмой. Для того чтобы в эксперименте показать, что влияние на активацию свертывания в гомогенной системе оказывает только обратная связь активации фУ, проводился контрольный эксперимент с дефицитной по фУШ плазмой. Математический расчет такого эксперимента и сам эксперимент представлены на рис. 4. Существует лишь небольшое различие в форме кривой зависимости максимальной концентрации фибрина от концентрации активатора - вблизи насыщения в дефицитной по фУШ плазме зависимость имеет более пологий вид.

При исследовании влияния положительных обратных связей на рост сгустка в пространственно-распределенной системе модельный расчет показал, что на лаг-период оказывают существенное влияние активации факторов V и VII, причем важно не абсолютное изменение этого параметра, а их соотношение в случае активации свертывания поверхностью с равномерным ТФ и с пятнами ТФ. Эти две обратные связи - активация фУ тромбином и активация фУИ фактором Ха приводят к расхождению времени задержки при изменении распределения ТФ на поверхности, то есть данные реакции могут регулировать образование сгустка в зависимости от распределения активатора по поверхности. Напротив, петля активации фУШ тромбином незначительно снижает это различие. Таким образом, модель предсказывает, что чувствительность системы свертывания к распределению

активатора по поверхности регулируется положительными обратными связями активации факторов V и VII.

Рис. 4. Проверка действия обратных связей активации факторов V и VIII на свертывание в пространствеяно-одиородной системе. Зависимость конечной концентрации фибирина от концентрации ТФ. (А, В) модельный расчет, (Б, Г) эксперимент. На панели А показан расчет для дефицитной по фУ плазмы и плазмы с 1% фУ. На панели Г открытые символы - дефицитная по фУШ плазма, закрашенные символы - дефицитная плазма с добавлением 20% фУШ. Везде на графиках изображены средние значения ± S.E.M.

Ранее роль реакции активации фУП была неизвестна. Для выяснения механизмов ее работы были проведены расчеты на модели с исследованием роли диффузии факторов свертывания в процессе формирования сгустка в пространственно-распределенной системе. Было показано что данная реакция компенсирует диффузный отток фактора Ха от активирующей поверхности.

Чтобы экспериментально проверить предсказание модели о роли положительных обратных связей активации фУ и фУН, были проведены эксперименты с использованием плазм пациентов с дефицитом факоторв V, VII и VIII (активность соответствующих факторов менее 1%). На рисунке 5 показаны модельные расчеты и экспериментальные данные для нормальной плазмы и плазм, дефицитных по факторам V, VII, VIII с добавками фУа и фУНа в плазмы с соответствующими дефицитами, для обеспечения свертывания. В случае отсутствия активации фУИ, различие

между активацией свертывания равномерным ТФ и пятнами с ТФ практически исчезает, а в дефицитной по фУ фактору плазме - оно существенно сокращается по сравнению с нормой. При отсутствии активации фУШ это различие близко к нормальной плазме. Это подтверждает теоретические предсказания, что именно положительные обратные связи активации фУ и фУП необходимы для обеспечения системы свертывания способностью "чувствовать" распределение ТФ на поверхности, его локальную плотность. При отсутствии активации фУШ соотношение размеров сгустков при различной активации свертывания остается таким же, как и в норме, однако сами величины меньше. Это связано с тем, что при гемофилии А нарушается фаза роста сгустка, тогда как его активация протекает совершенно нормально.

А Б 1оо

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 5. Роль обратных связей активации факторов V и VII в формировании чувствительности системы свертывания к распределению ТФ по поверхности (А) модельные расчеты, (Б) экспериментальные данные. Использовались плазмы. (1) смесь дефицитной по фУ и фУ11 в соотношении 1:1 (используется в качестве нормальной плазмы для корректного сравнения, так как использовались замороженные дефицитые плазмы), (2) дефицитной по фV с добавлением фУа (1 % в модели и 0.1% в эксперименте), (3) дефицитной по ф\Щ с добавлением 1% фУПа b (4) дефицитной по фУШ. Показан лаг-период для нормальной плазмы и плазм, дефицитных по факторам V, VU и VIII. Плотность ТФ - 6.25 и 8 пмоль/м2 для модельных расчетов и эксперимента соответственно. Для каждого случая проводилось 3-5 экспериментов. Указанная погрешность - SD.

4. Изменение в формировании сгустка в плазме больных гемофилией А после восполнения фактором VIII. Как известно из литературных данных и было показано в предыдущем разделе, положительная обратная связь активации фУШ тромбином влияет не на стадию формирования фибринового сгустка, а на скорость его распространения в пространстве. Таким образом, при гемофилии А сгусток образуется, но он не обладает свойствами, необходимыми для предотвращения кровотечения в месте повреждения стенки сосуда. Необходимым в данной ситуации будет применение пространственно-неоднородной модели свертывания. Для лечения этого заболевания используются препараты, содержащие фУШ. Подбор терапии на данный момент производится при помощи наблюдения за уровнем фУШ в крови пациента. Показано в экспериментах in vitro, что для нормального свертывания достаточно 10% фУШ от его

количества у здоровых доноров. Однако на практике оказывается, что клинические проявления течения заболевания не всегда согласуются с уровнем фУШ, измеряемым во время терапии. Поэтому в работе рассмотрен вопрос подбора терапии при гемофилии А с помощью пространственной модели свертывания in vitro.

Для того чтобы оценить, существует ли различие в пространственном росте сгустка у пациентов с различными уровнями дефицита фУШ и клиническим состоянием пациентов, было проведено сравнение роста сгустка: пациентов не имеющих кровотечений и не нуждающихся в терапии (при этом собственный уровень фУШ менее 1%) и пациентов с несколькими кровотечениями в месяц при проведении постоянной терапии (уровень фУШ менее 1%). Было получено, что для всех пациентов с тяжелым течением заболевания стационарная скорость роста сгустка ниже диапазона норм, тогда как у пациентов с легким течением гемофилии у части пациентов стационарные скорости роста сгустка ниже нормы, а у части - в пределах нормы. Это может служить предпосылкой к тому, что у пациентов с легким течением заболевания гемофилии А компенсация гемостаза происходит с помощью различных механизмов. Можно полагать, что часть механизмов связана с плазменным звеном свертывания и при этом фибриновый сгусток формируется достаточных размеров. На рис. 6 представлены профили роста сгустков через 50 минут после начала активации свертывания для пациентов с легким течением заболевания и тяжелым. Для сравнения приведен профиль сгустка здорового донора. Таким образом, несмотря на одинаковое количество фУШ в крови, пространственный рост сгустка у пациентов с тяжелой формой гемофилии А может существенно отличаться.

Около 15% пациентов с тяжелой формой гемофилии испытывают от 1 до 6 кровотечений в месяц, при том что с помощью терапии поддерживается необходимый уровень фУШ в крови. Для эффективного подбора терапии и оценки ее эффективности очень важным является использование адекватных лабораторных тестов. На данный момент в клинической практике используется оценка уровня фУШ в крови. При этом известно, что пациенты с одним и тем же исходным уровнем фактора или уровнем фактора на момент перед следующим введением препарата могут иметь существенные различия в клинических проявлениях заболевания. Поэтому существует острая необходимость в применении другого теста, показания которого соответствовали бы клинической картине пациента и учитывали работу системы свертывания в целом. Для оценки состояния системы свертывания у таких пациентов параллельно с измерением фармакокинетики фУШ и АЧТВ проводилось исследование роста сгустка в пространстве.

I К

I ё

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Расстояние, мм

Рис. 6. Рост сгустка у больных гемофилией А.

Профили роста фибринового сгустка через 50 минут после начала активации свертывания. Плотность ТФ 80 пмоль/м". Показан рост сгустка у здорового донора, пациентов с легким течением тяжелой формы гемофилии А без постоянного введения препарата фУШ (собственный фУШ <1%) и тяжелой формой гемофилии А с терапией фУШ 30 МЕ/кг каждые 3 дня (собственный фУШ <1%, период после последнего введения фУШ составлял 5 дней).

На рис. 7 представлены зависимости

АЧТВ, фУШ и стационарной скорости роста сгустка от времени после введения препарата. Данные представлены для 5 пациентов с тяжелой формой гемофилии А, нуждающихся в постоянном введении препарата фУШ. Тест АЧТВ хорошо чувствителен к гемофилии А в ее исходном состоянии. Однако после введения фУШ значение АЧТВ не возвращается в диапазон нормы, а остается повышенным и с течением времени после введения препарата плавно увеличивается до исходного уровня. То есть тест АЧТВ непригоден для оценки эффективности терапии у пациентов с гемофилией А. При этом уровень фУШ резко возрастает до 80-125% от нормального уровня после введения препарата и далее спадает с течением времени. Динамика изменения уровня фактора для различных пациентов схожа. По динамике стационарной скорости роста сгустка у пациентов наблюдаются существенные различия в максимальной скорости роста сгустка, времени спадания пика и наличию спонтанных сгустков вне зоны активации свертывания ТФ. Скорости роста сгустка чувствительны к введению препарата. Наибольшие изменения наблюдаются в величине стационарной скорости роста сгустка. До введения фактора она составляет 6-30 мкм/мин, далее повышается в течение 0.5-3 часов до своего максимального значения 26-56 мкм/мин и спадает до исходного уровня с течением последующих 3 суток. У части пациентов после введения препарата в течение 3 часов наблюдались спонтанные сгустки, свидетельствующие о гиперкоагуляционном состоянии плазмы.

Для оценки этих методов и сопоставления результатов на рисунке 7 Г построены зависимости стационарной скорости роста сгустка от уровня фУШ. При низком уровне фУШ (до 10% от нормы) стационарная скорость роста сгустка резко увеличивается при увеличении концентрации фУШ и при 10% достигает нормального значения. Далее, в диапазоне концентраций фУШ от 10 до 80% стационарная скорость роста сгустка практически не меняется, оставаясь в пределах нормальных значений. При дальнейшем увеличении уровня фУШ стационарная скорость роста сгустка резко возрастает, в этой области могут возникать спонтанные сгустки в плазме. Используя клинические данные о том, что 10% фУШ уже достаточно для нормального функционирования системы

гемостаза и опираясь на данные по сопоставлению скорости роста сгустка и уровня фУШ, можно заключить, что стационарная скорость роста сгустка действительно адекватно отражает состояние системы свертывания.

20 зо время, ч

60, 60- т» А | • •

40- b v mi о А, □

io- ——♦ □ ♦

20 К Д : Д

10- >0. т

П-

25 50 75 100 125 ф\/Ш, % от нормы

Рис. 7. Эффект введения фактора VIII пациентам с тяжелой формой гемофилии Л. Временные зависимости АЧТВ (А), уровня фУШ (Б) и стационарной скорости роста сгустка (В) после введения препарата фУШ. Нулевая точка снята непосредственно перед введением фактора. Погрешность определения значения стационарной скорости составляла не более 10%. (Г) Корреляция стационарной скорости роста сгустка с уровнем фУШ. Линия - аппроксимация экспериментальных данных функцией Хилла. Прямоугольники - соответствующие диапазоны нормальных значений стационарной скорости роста сгустка, уровня фУШ и АЧТВ.

Глава 4 посвящена обсуждению основных результатов работы.

Система свертывания крови призвана решать сложную пространственную задачу -создание фибринового сгустка, предотвращающего кровопотерю при повреждении стенки сосуда. Сгусток должен формироваться быстро, только при наличии повреждения и быть локализован только в месте этого повреждения. Нарушения в работе системы могут привести и к кровоточивости и к тромбозам. Необходимое свойство для эффективной работы системы свертывания - "умение" распознавать является та или иная ситуация сигналом для запуска работы системы. В данной работе рассматривалась роль положительных обратных связей в работе системы свертывания.

Для этого использовались пространственно-однородные и -распределенные модели свертывания in vitro и in silico.

В ходе исследования было обнаружено, что система свертывания крови может распознавать образы: система распознает отдельно стоящие пятна с большой локальной плотностью ТФ и быстро образует фибриновый сгусток вокруг пятна с активатором, если пятно имело достаточные размеры. Если то же количество ТФ равномерно распределить по данной поверхности, активация свертывания будет идти, так что ингибиторы свертывания будут справляться со своей задачей, таким образом, сгусток не образуется вовсе. Когда активатор собран на поверхности в локальные области с большой плотностью, сгусток всегда растет быстро и параметры роста малочувствительны к общему количеству активатора при его вариациях до 2 порядков. Напротив, время начала образования сгустка чрезвычайно чувствительно к плотности ТФ в случае его равномерного распределения по поверхности.

Дальнейшей задачей работы было выяснить, как в системе свертывания устроена функция распознавания активатора. Поиск этих механизмов велся с помощью двух взаимодополняющих подходов - математическое моделирование и эксперименты in vitro. Расчеты модели системы свертывания помогают из сотен реакций системы выделить существенные для данного процесса и изменяющие его. Далее, с помощью математической модели планируется эксперимент, позволяющий проверить полученную гипотезу. Завершающим этапом является экспериментальная проверка имеющихся представлений о работе системы свертывания.

В работе впервые выявлены механизмы, позволяющие системе свертывания распознавать распределение активатора. Эта способность системы контролируется двумя положительными обратными связями: активацией фУ тромбином и активацией фУП фактором Ха. Было показано в модельных расчетах, что только эти реакции отвечают за чувствительность системы к распределению ТФ. Экспериментально было показано, что другая положительная связь - активация фУ1П тромбином не влияет на чувствительность системы к распределению активатора на поверхности.

Роль реакции активации фУП фактором Ха ранее была неясна. Было лишь показано, что свертывание чувствительно к этой реакции при низких концентрациях ТФ. Однако модельные расчеты показали, что данная положительная обратная связь предоставляет дополнительное количество фактора Ха, компенсируя тем самым его диффузный отток от поверхности с ТФ.

Практическое значение полученных результатов состоит в возможности направленного воздействия на тот или иной процесс в системе свертывания. Понимание работы и регуляции в системе свертывания может помочь при лечении патологий свертывания. Используемый в данной работе метод оценки пространственного роста сгустка позволил обнаружить в системе свертывания ранее

неизвестные свойства: чувствительность к локальной концентрации активатора, роль обратных связей активации факторов V и VII. Ингибирование или активация факторов V и VII может изменить чувствительность системы к распределению ТФ в организме. Также метод был применен при исследовании плазмы пациентов с гемофилией А и показал свою высокую чувствительность к уровню фУШ и, по-видимому, является более адекватным для определения состояния пациентов. Есть основания предполагать, что применение метода оценки пространственного роста сгустка в клинической практике позволит дополнить и существенно расширить диагностические способности коагулологических анализов для пациентов с широким спектром заболеваний, находящихся как в гипо- так и в гаперкоагуляционных состояниях.

ВЫВОДЫ

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по объему.

2. Порог при активации свертывания в гомогенной системе регулируется положительной обратной связью активации фактора V тромбином.

3. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по поверхности.

4. Система свертывания чувствительна к локальной плотности тканевого фактора, но не к его общему количеству в системе.

5. Порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фактора V тромбином и фактора VII фактором Ха.

6. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Шибеко A.M., Разработка установки для исследования пространственной дина-мики генерации тромбина при свертывании крови, Труды шестой ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН-вузы "Биохимическая Физика", Москва, Россия, Ноябрь 24-27 2006 г, стр. 7- 9.

2. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Сарбаш В.И., Шибеко A.M., Атауллаханов Ф.И. Разработка установки для исследования пространственной динамики генерации тромбина, Материалы III всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», Москва, Россия, Февраль 1-3 2007 г, стр.17-18

3. Balandina A.N., Kireev D.A., Panteleev М.А., Shmirev I.I., Shibeko A.M., Ataullakhanov F.I. Threshold behavior of the blood clotting system activated by the

tissue factor, Abstracts of XXIst Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Женева, Швейцария, Июль 6-12 2007 г.

4. Balandina A.N., Karamzin S.S. Spatial dynamics of thrombin generation in plasma, Abstracts of Fourth international symposium on computation methods in toxicology and pharmacology integrating method resources., Moscow, Russia, September 1-5 2007, p 81.

5. Баландина A.H., Киреев Д А., Пантелеев М.А., Шмырев И.И., Шибеко A.M., Атауллаханов Ф.И. Пороговое поведение системы свертывания крови при активации различной плотностью тканевого фактора, Абстракт 11 Международной конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, Россия, Октябрь 29 - Ноябрь 2 2007 г, стр. 69.

6. Баландина А.Н., Ованесов М.В., Шибеко A.M., Пантелеев М.А., Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Пространственная динамика генерации тромбина в плазме крови, Абстракт 11 Международной конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века", Пущино, Россия, Октябрь 29 - Ноябрь 2 2007 г, стр. 231.

7. Balandina A.N., Panteleev М.А., Kireev D.A., Shibeko A.M., Lipets E.N., Shmirev 1.1., Ataullakhanov F.I. Application of a new method of biochemical systems reduction: regulatory functions of positive feedbacks in blood clotting abstracts of II international conference "Mathematical biology and bioinformatics", Pushchino, Russia, September 7-13,2008, pp 56 - 57.

8. Balandina A.N., Panteleev M.A., Shibeko A.M., Shmirev I.I., Ataullakhanov F.I., Regulatory functions of positive feedbacks of factors v and vii activation in blood clotting initiation, Abstracts of XXII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Бостон, США, Июль 11-16 2009 г.

9. Panteleev М.А., Balandina A.N., Ovanesov M.V., Ataullakhanov F.I., Task-oriented modular analysis of the blood coagulation network: The role of factor V feedback activation in triggering clot formation, Abstracts of XXII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Бостон, США, Июль 11-16 2009 г.

10.Panteleev М.А., Balandina A.N., Lipets E.N., Ovanesov M.V., Ataullakhanov F.I., Task-oriented modular decomposition of biological networks: trigger mechanism in blood coagulation. Biophys J 2010; 98 (9):1751-1761.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Баландина, Анна Николаевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о гемостазе человека.

1.2. Плазменное свертывание крови.

1.2.1. Состав и структура системы свертывания.

1.2.2. Активация свертывания.

1.2.3. Петли положительной обратной связи и образование комплексов.

1.2.4. Формирование фибринового сгустка.

1.2.5. Ингибиторы свертывания.

1.3. Нарушения плазменного звена системы свертывания.

1.3.1. Дефициты факторов свертывания.

1.4. Экспериментальные модели свертывания крови.

1.4.1. Модели свертывания in vivo и ex vivo.

1.4.2. Пространственно-однородные модели.

1.4.3. Пространственно-распределенные модели.

1.5. Математические модели свертывания крови.

1.5.1. Качественные и феноменологические модели.

1.5.2. Количественные и механизменные модели.

1.6. Пороговые свойства и роль обратных связей в in vitro моделях свертывания крови.

1.7. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Доноры крови.

2.3. Подготовка плазмы крови.

2.3.1. Получение плазмы крови.

2.3.2. Работа с замороженной плазмой.

2.3.3. Стабилизация рН плазмы.

2.3.4. Ингибирование контактной активации.

2.3.5. Восполнение дефицитной плазмы факторами V, VII и VIII.

2.3.6. Рекальцификация плазмы.

2.4. Стандартные тесты: АЧТВ и определение уровня фактора VIII.

2.5. Приготовление пленок с фибробластами.

2.5.1. Культура фибробластов.

2.5.2. Подсчет плотности клеток.

2.5.3. Посадка клеток на пленку.

2.6. Приготовление пленок с иммобилизованным тканевым фактором.

2.7. Иммобилизация тромбопластина на полистироловую поверхность.

2.8. Определение плотности тканевого фактора.

2.9. Экспериментальные системы.

2.9.1. Пространственно-однородные эксперименты.

2.9.2. Рост сгустка в пространстве.

2.9.2.1. Конструкция кюветы.

2.9.2.2. Схема и принцип работы установки.

2.10. Программный комплекс получения и обработки экспериментальных изображений.

2.10.1. Получение изобраэ/сений.

2.11.2. Обработка экспериментальных кадров.

2.11. Математическая модель свертывания.

2.11.1. Уравнения и параметры модели.

2.11.2. Пространственно-однородная модель.

2.11.3. Трехмерная пространственно-распределенная модель.

2.11.3.1. Равномерное распределение тканевого фактора.

2.11.3.2. Моделирование фибробластов.

2.11.3.3. Исключение обратных связей из модели.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Порог по активации свертывания в пространственно-однородной системе. .62 3.1.1. Свертывание в плазме здоровых доноров.

3.2. Исследование роли положительных обратных связей при активации свертывания в пространственно-однородной системе.

3.2.1. Изучение пороговых свойств системы свертывания в модели in silico.

3.2.2. Свертывание в плазме, дефицитной по фактору V.

3.2.3. Свертывание в плазме, дефицитной по фактору VIII.

3.3. Порог по активации свертывания в пространственно-распределенной системе.

3.3.1. Активация свертывания поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.

3.3.2. Активация свертывания фибробластами.

3.4. Исследование роли положительных обратных связей при активации свертывания в пространственно-распределенной системе.

3.4.1. Исследование роли обратных связей в свертывании в математической модели.

3.4.2. Планирование эксперимента для верификации модели.

3.4.3. Экспериментальная проверка роли положительных обратных связей активации факторов V и VII.

3.5. Динамика роста сгустка в плазме больных гемофилией А после восполнения фактором VIII.

3.5.1. Рост сгустка у больных гемофилией А с различными фенотипами.

3.5.2. Динамика изменения роста сгустка при введении пациентам фактора VIII.

3.5.3. Корреляция скорости роста сгустка с параметрами А ЧТВ, уровнем фактора VIII в крови и клинической картиной у пациентов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Регуляция свертывания в пространственно-однородной системе.

4.2. Регуляция свертывания в пространственно неоднородной системе.

4.3. Свертывание крови у пациентов с гемофилией.

4.4. Новые представления о работе системы свертывания крови.

4.5. Пространственная динамика свертывания как новый метод диагностики и оценки терапии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором"

На данный момент хорошо изучены все компоненты системы свертывания с точки зрения биохимии - известны константы реакции, условия протекания реакций и др. Однако, так как система состоит более чем из 30 элементов, связанных между собой множеством реакций, сложно предсказать ее работу в целом и влияние на нее отдельных параметров. В медицинском аспекте это проявляется в том, что до сих пор неясно, почему, например, дефицит одного белка системы приводит к сильнейшей кровоточивости, а другого - остается незамеченным организмом. Более половины смертей в мире имеют в качестве непосредственной причины нарушения свертывания крови тромбозы или кровотечения [1-4]. Поэтому изучение работы этой системы является важной биофизической и медицинской задачей.

Система свертывания должна обладать пороговыми свойствами, чтобы избежать случайного возникновения тромбов и запускаться только в случае наличия повреждения. Под порогом по активации свертывания здесь и далее понимается минимальное ненулевое количество активатора свертывания, вызывающего образование фибринового сгустка. Существуют указания на такое свойство в системе свертывания крови [5-7]. Однако до сих пор не были проведены эксперименты, в которых зарегистрировали пороговые значения активатора свертывания. Во всех проведенных ранее исследованиях в образце цельной крови или плазмы без добавления активатора свертывания происходило формирование сгустка.

Пороговое поведение системы свертывания связывают с наличием в ней положительных обратных связей. Положительная обратная связь позволяет ускорить образование продукта реакции за счет того, что он влияет на собственное производство. В системе свертывания основным таким регулятором является тромбин - последний фермент каскада реакций, превращающий растворимый белок фибриноген в 7 нерастворимый полимеризующийся фибрин. Тромбин вступает в реакции, приводящие к еще большей наработке самого тромбина в системе. В математических моделях, описывающих работу систем типа системы свертывания, активно изучается функция таких обратных связей [8-15]. Было показано, что они позволяют ускорить на порядки работу системы и обеспечить выборочную чувствительность системы к запускающему сигналу — свертывание начинается только при получении сигнала, выше определенного уровня. Однако, из клинических примеров хорошо известно, что отсутствие того или иного фактора системы свертывания, участвующего в своей положительной обратной связи, по-разному влияет на здоровье человека. Так, при тяжелой форме гемофилии А больные нуждаются в постоянном восполнении недостающего элемента системы свертывания [16-18], а при гемофилии С заболевание проявляет себя только при серьезных травмах [19], редко встречающийся дефицит фактора V иногда ассоциирован с тромбоэмболиями [20,21], а дефицит фактора VII парадоксальным образом может сопровождаться тяжелыми тромбозами [22]. При этом степень кровоточивости не всегда коррелирует с уровнем дефицитного фактора, так что пациенты с одинаковым исходным уровнем фактора нуждаются в индивидуальном подборе терапии.

В данной работе изучались пороговые свойства системы свертывания человека и исследована роль положительных обратных связей с использованием экспериментов in vitro и математического моделирования. Целью работы являлось изучение пороговых свойств системы свертывания крови и роли положительных обратных связей активации факторов V, VII, VIII в активации свертывания и формировании фибринового сгустка в системе in vitro. Отличительной особенностью работы является исследование пороговых свойств в системах in vitro с различной пространственной организацией: активация свертывания в объеме (однородная система), на поверхности и от единичных клеток (пространственно-распределенные системы). Пространственно-распределенная система свертывания in vitro имитирует рост сгустка от стенки сосуда. В такой системе реакции свертывания запускаются на поверхности с тканевым фактором и распространяются вглубь тонкого неперемешиваемого слоя плазмы. Поверхность с клетками, вызывающими свертывание крови, позволяет выяснить роль единичных клеток в формировании фибринового сгустка. Математическая модель системы свертывания позволила обнаружить вероятные элементы регуляции в системе и спроектировать эксперименты, проверяющие теоретические представления. Клинически наиболее актуальной частью работы было исследование влияния замещающей терапии факторами свертывания VIII при гемофилии А.

Цель работы: Изучить пороговые свойства свертывания крови и роль положительных обратных связей в формировании фибринового сгустка в системе in vitro.

Задачи исследования:

1. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-однородной системе.

4. Выявить роль положительных обратных связей в процессе активации и формирования фибринового сгустка.

5. Изучить динамику формирования сгустка у пациентов с гемофилией А при введении им фактора VIII.

Научная новизна. Показано существование порога в свободной от тромбоцитов плазме крови по концентрации тканевого фактора (в пространственно-однородной системе) и плотности тканевого активатора на поверхности (в пространственно-распределенной системе). В работе впервые экспериментально измерена величина порога по активации свертывания. Показано, что положительная обратная связь активации фактора V тромбином позволяет системе свертывания осуществить быстрый переход из неактивного состояния к образованию плотного фибринового сгустка при небольших изменениях концентрации и плотности тканевого фактора. При переходе от пространственно-однородной постановки к пространственно-распределенной меняется вклад отдельных реакций в процесс свертывания плазмы крови. Впервые измерена зависимость параметров роста сгустка в пространстве от плотности и распределения тканевого фактора. Показано, что рост сгустка зависит от локальной плотности активатора, а не от его количества. При этом даже единичный фибробласт - клетка с большой плотностью тканевого фактора на мембране - способен эффективно активировать свертывание крови. Впервые экспериментально показана значимость положительной обратной связи активации VII фактора фактором Ха. В экспериментах с плазмой больных гемофилией А показано, что при введении пациентам фактора VIII изменяются параметры роста сгустка в пространственно-распределенной системе. Динамика этих изменений, по-видимому, коррелирует с клиническим проявлением заболевания.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о регуляции работы системы свертывания могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых препаратов для пациентов с дефицитами факторов свертывания. В работе показано, что метод, созданный на основе пространственно-распределенной модели, может быть использован для оценки и подбора терапии при восполнении недостающих компонентов системы свертывания. Это позволяет поддерживать систему свертывания пациентов вблизи нормальных показателей свертывания на протяжении всего времени между двумя инъекциями препарата.

Положения, выносимые на защиту:

2. Тканевый фактор, сосредоточенный на пятнах, вызывает свертывание, а то же его количество, распределенное равномерно по поверхности — не вызывает свертывания.

4. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Баландина, Анна Николаевна

Выводы

6. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Благодарности

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность людям, без которых эта работа была бы невозможна:

Сотрудникам лаборатории физической биохимии:

Алексею Михайловичу Шибеко за помощь в разработке и реализацию математической модели свертывания.

Висилию Ивановичу Сарбашу и Сергею Сергеевичу Карамзину за создание установки по исследованию пространственного роста сгустка.

Игорю Игоревичу Шмыреву и Ольге Александровне Фадеевой за создание поверхностей с иммобилизованным тканевым фактором.

Елене Ивановне Синауридзе, Андрею Александровичу Бутылину, Борису Ефимовичу Мовшеву и многим другим сотрудникам лаборатории за советы, помощь и поддержку.

Сотрудникам отделения реконструктивно-восстановительной ортопедии для больных гемофилией:

Константину Геннадиевичу Копылову и Марии Алексеевне Кумсковой за активное участие, поддержку и постоянный интерес к работе.

Сотрудникам станции переливания крови за предоставленную возможность работать с кровью доноров.

Людмиле Ивановне Ульяновой за ее многолетний самоотверженный труд по культивированию клеток.

Особая благодарность моему научному руководителю

Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, за его помощь, поддержку и внимание, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории и Михаилу Александровичу Пантелееву, чей вклад в эту работу неоценим.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баландина, Анна Николаевна, Москва

1. Российский статистический ежегодник. Москва: Федеральная служба государственной статистики, 2009.

2. Dempfle СЕ, Knoebl PN. Blood coagulation and inflammation in critical illness the importance of the protein С pathway. Bremen u.a.: UNI-MED Verl, 2008.

3. Баркаган ЗС, Момот АП, Тараненко ИА, Шойхет ЯН. Основы пролонгированной профилактики и терапии тромбоэмболии. Москва: "Ньюдиамед", 2003.

4. Котельников MB. Ведение больных с венозными тромбоэмболиями. Москва: Боргес, 2006.

5. Kastrup CJ, Runyon МК, Shen F, Ismagilov RF. Modular chemical mechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complex network of hemostasis. Proc Natl AcadSci USA 2006; 103: 15747-15752.

6. Pokhilko AV. Intrinsic coagulation pathway: an activation threshold. Thromb Res 2000; 99: 285-293.

7. Khanin MA, Semenov VV. A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J Theor Biol 1989; 136: 127-134.

8. Семенов BB, Ханин MA. Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика 1990; 35: 139-141.

9. Образцов ИФ, Ханин MB, Горбатюк ИА. Математическая модель кинетики активации факторов VII и X системы гемокоагуляции. ДоклАкад Наук 1992; 326: 558-561.

10. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Кинетика активации внутреннего пути гемокоагуляции: пороговый эффект .ДоклАкад Наук 1996; 349: 560-562.

11. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Пороговые эффекты в кинетике активации контактной системы гемокоагуляции. ДоклАкад Наук 1999; 367: 130-132.

12. Beltrami Е, Jesty J. Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 8744-8748.

13. Beltrami E, Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math Biosci 2001; 172: 1-13.15

Информация о работе

Баландина, Анна Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы