Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка

Парунов, Леонид Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка"

На правах рукопи!

Парунов Леонид Александрович

РОЛЬ ИНГИБИТОРА ПУТИ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА В ПРОСТРАНСТВЕННОМ ФОРМИРОВАНИИ ФИБРИНОВОГО

СГУСТКА.

03.01.02- биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

г 8 НОЯ 2013

005541420

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук.

Научный руководитель - доктор физико-математических наук,

Пантелеев Михаил Александрович.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук Спиридонова Вера

Алексеевна (старший научный сотрудник, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова).

доктор медицинских наук, профессор, Мазуров Алексей Владимирович (руководитель лаборатории клеточной адгезии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России)

Ведущее учреждение — Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» Российской академии наук

Защита состоится " /?- " 2013 г. в /-/ час £Ю минут.

на заседании диссертационного совета Д 002.252.01 в Федеральном научно-

клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д.

Рогачёва по адресу ул.Саморы Машела, д.1, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН ЦТО ФХФ РАН по

адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, 4

Автореферат разослан " /3 " НОЛ. </АЛ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук И.С. Николаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Задачей системы гемостаза является предотвращение потери крови при нарушении целостности кровеносной системы. Плазменное звено свертывания - одна из важных составляющих этой системы, задачей которого является формирование геля в месте повреждения сосуда для предотвращения просачивания жидкости. В свертывании плазмы крови участвует более 30 белков, которые взаимодействуют друг с другом, образуя огромную сеть биохимических реакций. Такая сложная система требует соответствующей регуляции. Это приводит к тому, что даже небольшие нарушения в деликатном балансе про- и антикоагулянтных реакций могут приводить к тяжелым последствиям для организма: тромбозам и кровотечениям.

Одним из важных регуляторных белков в системе свертывания является ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Он функционирует на стадии активации свертывания крови. На данный момент не известны случаи дефицита TFPI у людей. Кроме того, известно, что гомозиготные по отношению к дефициту TFPI мыши погибают внутриутробно, а люди со сниженным уровнем TFPI имеют повышенную склонность к тромбозам. Это говорит о критически важной роли TFPI в организме.

Относительно недавно была высказана новая идея, как улучшить свертывание в гемофилии: инактивировать ингибитор, регулирующий запуск реакций свертывания крови (TFPI). В последнее время появились работы, посвященные разработке ингибиторов к TFPI и их тестированию. В общем, данные подтверждают их положительный эффект на гемостаз в случаях гипокоагуляции. Однако эксперименты in vivo описывают слишком общие эффекты TFPI на свертывание и не способны четко выделить закономерности процессов в связи со многими неопределенностями экспериментальных условий. Все исследования in vitro проводились в гомогенных экспериментах, которые принимают во внимание активности белков свертывания, но не учитывают процессы диффузии. Однако in vivo свертывание активируется на поверхности с тканевым фактором (ТФ), а пространственный рост сгустка происходит во многом за счет диффузии активных факторов. Как было ранее показано, в таких условиях роль некоторых белков в гемостазе может поменяться. Таким образом, пока нет данных о роли TFPI в пространственной

динамике свертывания. Не ясно подавляет ли TFPI пространственный рост сгустка и способно ли ингибирование TFPI его улучшить. В свете активного развития идеи ингибирования TFPI у больных гемофилиями полезно было бы знать последствия такой терапии. Для этого требуется понимать механизм, степень влияния TFPI и условия, при которых ингибиторы TFPI будут оказывать положительное действие на пространственный рост сгустка. На сегодняшний день этот аспект остается не изученным. Кроме того, не известно, как будут взаимодействовать лекарственные препараты ингибиторов TFPI и концентрата фактора VIII при одновременном назначении больному гемофилией А.

Для того чтобы разобраться в этих вопросах в данной работе использовали пространственно-неоднородную экспериментальную модель свертывания (тест Тромбодинамики). Ее ключевая особенность состоит в том, что свертывание плазмы крови запускается поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ) и затем распространяется в объем плазмы. Наблюдение за ростом фибринового сгустка производили оптически по светорассеянию методом темного поля. Эта экспериментальная модель имитирует условия протекания процесса свертывания in vivo, так как отражает как биохимические реакции каскада свертывания, так и процессы диффузии. Для выбора условий эксперимента, предсказания поведения системы гемостаза и выяснения механизмов влияния TFPI на пространственный рост сгустка в данной работе было проведено математическое моделирование.

Цель работы: Исследовать роль TFPI в пространственном формировании фибринового сгустка в норме и при гемофилии А.

Задачи исследования:

1. Определить диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при которых пространственное свертывание в свободной от тромбоцитов плазме оказывается чувствительным к изменениям концентраций TFPI.

2. В плазме здоровых доноров и больных гемофилией А определить параметры пространственного роста сгустка, на которые оказывает влияние TFPI. Сравнить эффективность усиления внешнего пути свертывания при ингибировании TFPI в плазме нормальных доноров и больных гемофилией А.

3. Сравнить действие ингибитора TFPI и рекомбинантного фактора Vila (rVIIa) на пространственное формирование сгустка в плазме больных гемофилией А.

4. В математической модели и экспериментах ex vivo исследовать лекарственное взаимодействие концентратов фактора VIII и ингибитора TFPI на пространственное свертывание.

Научная новизна. Впервые влияние TFPI исследовалось в пространственно-неоднородной системе in vitro. Определен диапазон плотностей ТФ на поверхности активатора, при котором влияние TFPI на пространственное свертывание оказывается существенным. Определены ключевые параметры пространственного роста, на которые оказывает действие TFPI. Впервые показано, что инактивация TFPI способна улучшить пространственный рост сгустка, сокращая время задержки свертывания и увеличивая скорость его пространственного роста. Показано, что влияние TFPI ограничено тонким приактиваторным слоем в 100-200 мкм, или 10 минутами после начала роста сгустка. Влияние TFPI на пространственную скорость роста вдали от активатора незначительно. Показано, что усиление внешнего пути свертывания через ингибирование TFPI и добавление rVIIa оказывают качественно и количественно разные эффекты на пространственный рост фибринового сгустка. Стимуляция гемостаза фактором rVIIa приводит к дозозависимому ускорению пространственного роста сгустка на всех расстояниях от активатора, а при концентрациях выше 10 нМ к свертыванию во всем объеме экспериментальной кюветы, в то время как инактивация TFPI ускоряет начальную фазу роста сгустка только вблизи активатора, и это действие обладает эффектом насыщения. Впервые дано предсказание взаимодействия лекарственных препаратов, ингибирующих действие TFPI, и концентратов фактора VIII: увеличение концентрации фактора VIII в крови снижает относительный эффект антагониста TFPI на размер сгустка.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о роли и вкладе TFPI в пространственное свертывание плазмы крови могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых лекарственных препаратов для пациентов больных гемофилией А или другими коагулопатиями. Предсказания относительно взаимодействий препаратов, ингибирующих TFPI, и концентратов фактора VIII могут быть полезными при планировании терапии у больных гемофилией А.

Положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что пространственное свертывание плазмы крови чувствительно к изменениям концентрации TFPI в условиях активации системы гемостаза ТФ с низкой плотностью (1-4 пмоль/м2).

2. Показано, что при активации свертывания ТФ с низкой плотностью TFPI влияет на пространственный рост сгустка, главным образом, сокращая время задержки свертывания и увеличивая начальную скорость роста сгустка. Область ускорения формирования сгустка ограничивается тонким слоем вблизи активатора.

3. Показано, что ингибирование TFPI способно улучшить пространственное свертывание в плазме больных гемофилией А.

4. Показано, что rVII и антагонисты TFPI оказывают качественно разные эффекты на свертывание плазмы крови

Апробация работы состоялась 14 мая 2013г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Материалы диссертации докладывались на конференции "Математика, компьютер, образование" (Пущино, февраль 2011), 36th Federation of European Biochemical Societies Congress (Турин, Италия, июнь 2011), XXIIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, июль 2011), Тромбоз, гемостаз и реология (Москва, Россия, 2011), 58th Annual meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Ливерпуль, Великобритания, июнь 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья в рецензируемом журнале и 6 тезисов в сборниках трудов 5 конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, приложения и библиографического указателя, включающего 264 источника. Текст диссертации иллюстрирован 11 таблицами и 36 рисунками. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории Молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф.-м.н. М.А. Пантелеев).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении показана актуальность выбранной темы диссертации, сформулированы цель работы, ее научная новизна и практическая ценность.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит общие сведения о системе гемостаза, подробное описание внешнего пути свертывания, механизмов работы TFPI, проблемы больных гемофилией А, а также основных подходов и идей терапии гемофилии А. Один из разделов посвящен описанию основных экспериментальных методов исследования свертывания крови и математических моделей гемостаза, учитывающих TFPI.

В главе 2 описываются материалы и методы исследования, в том числе: используемые реактивы, протоколы выделения и подготовки плазмы крови, общее описание математической модели свертывания и использованных в работе экспериментальных моделей ш vitro: измерения активированного тромбопластинового времени (АЧТВ) и метода Тромбодинамики (измерения пространственного роста сгустка).

Главы 3 и 4 содержат результаты работы и их обсуждение.

Краткое описание методики и параметров, характеризующих

пространственный рост сгустка

Поскольку метод Тромбодинамика является относительно новым, в начале главы описываются основные параметры, которые он измеряет, и их значение. Типичные фотографии, получаемые в эксперименте, показаны на рис. 1а. В результате обработки подобных изображений вычисляют профили светорассеяния, по которым определяют скорости роста сгустка. На рис. 16 и 1в представлены примеры таких профилей в нормальной плазме при активации свертывания иммобилизированным ТФ (2 пмоль/м2) в отсутствии или присутствии 300 нМ аптамерного ингибитора TFPI ВАХ499 (Baxter, США). Графики демонстрируют светорассеяние как функцию расстояния от поверхности активатора. Время между отдельными профилями составляет 2,5 минуты, общая длительность эксперимента - 90 минут. На рис. 16 и 1в виден первый результат: ингибирование TFPI приводит к увеличению размера сгустка и сигнала светорассеяния, что говорит об увеличении плотности сгустка. На основе профилей вычисляли зависимость размера сгустка от времени (рис. 1 г). На рис. 1г также указаны четыре параметра, выбранные для описания процесса свертывания в тесте Тромбодинамики: время задержки роста сгустка (далее

лаг-тайм - время от начала эксперимента до начала роста сгустка); начальная скорость роста сгустка (наклон аппроксимирующей прямой, рассчитанный по методу наименьших квадратов (МНК) в течение первых 10 минут после начала роста сгустка - tg а); стационарная скорость роста сгустка (наклон аппроксимирующей прямой, рассчитанный по МНК, в течение последующих 30 минут - tg Р); размер сгустка через 60 минут после начала эксперимента.

0,5 1,0 Расстояние, мм

20 40 60 Время, мин

Рис. 1. Измерение скорости роста сгустка в пространстве, (а) - Фотографии растущего сгустка через 5 и 50 мин после активации свертывания; профили светорассеяния в нормальной плазме в отсутствии (б) или присутствии (в) 300 нМ ВАХ499 при активации свертывания поверхностью с ТФ (2 пмоль/м ) и зависимости размеров сгустка от времени (г) для экспериментов показанных на панелях (б) и (в). Описание основных измеряемых параметров см. в тексте.

Предварительная оценка влияния ТРР1: компьютерное моделирование

Влияние ТРР1 может меняться в зависимости от плотности ТФ на активаторе. Для оценки общих эффектов ТБР1 и экспериментальных условий, в которых влияние ТБР1 будет наиболее выраженным, было проведено предварительное компьютерное моделирование. Было рассмотрено четыре сценария роста сгустка: в нормальной плазме, в нормальной плазме без ТТР1, при гемофилии А (без фУШ), и при гемофилии А в отсутствии ТБР1. Для каждого случая были проведены расчеты с активацией свертывания ТФ с плотностью 5 и 100 пмоль/м2 (рис. 2а и б). При активации свертывания 5 пмоль/м2 ТФ отсутствие ТБР1 приводило к сокращению лаг-тайма в норме и при гемофилии. При активации ТФ с плотностью 100 пмоль/м2 (рис. 26)

исключение ТРР1 из системы гемостаза не приводило к существенным изменениям в динамике свертывания.

Расчеты для случаев гемофилии А с и без ТРР1 в широком диапазоне изменения плотности ТФ (от 5 до 100 пмоль/м2) показали, что роль ТБР1 должна значительно возрастать со снижением плотности ТФ (рис. 2в). В плазме с дефицитом фУШ на низких плотностях ТФ полное исключение ТРР1 из модели вызывало сокращение лаг-тайма в 1,5-5 раз.

Время, мин Время, мин ТФ, пмоль/м*

Рис. 2. Компьютерное моделирование пространственной динамики свертывания плазмы крови: эффект полного отсутствия TFPI на свертывание нормальной плазмы (НП) и плазмы с дефицитом фУШ (ГА), (а), (б) - Зависимости размеров сгустка от времени при активации свертывания ТФ с плотностями 5 и 100 пмоль/м2, соответственно, (в) - Зависимость лаг-тайма от плотности ТФ на активирующей поверхности в плазме с дефицитом фактора VIII с и без TFPI.

Зависимость эффекта ингибирования TFPI от плотности ТФ

Для экспериментальной проверки результатов математического моделирования и определения диапазона условий, при которых TFPI оказывает влияние на пространственное свертывание, были выполнены следующие эксперименты: в нормальную плазму добавляли ингибитор TFPI или буфер, свертывание активировали ТФ в широком диапазоне плотностей (от 1 до 100 пмоль/м2). В качестве селективного ингибитора TFPI был взят аптамер ВАХ499. Это олигонуклеотид с 40 кДа остатком полиэтиленгликоля, пришитым на 5'-конце. Предсказания модели подтвердились: влияние инактивации TFPI на пространственное свертывание зависит от плотности ТФ на активаторе. Оно было значительным при плотностях ТФ 1-4 пмоль/м2 (рис. 3). В этих условиях ингибирование TFPI приводило к сокращению лаг-тайма в 2,5 раза (рис. За) и увеличению начальной скорости в 1,8 раз (рис. 36). Это, в итоге, приводило к увеличению размера сгустка в 2 раза (рис. Зг). Ингибитор TFPI оказывал слабое влияние на стационарную скорость (рис. Зв) во всем диапазоне плотностей ТФ. В условиях активации ТФ с

плотностями >10 пмоль/м значительных изменений в динамике свертывания при ингибировании ТРР1 не наблюдалось.

Из данных предварительного моделирования и экспериментов можно заключить, что в пространственно-неоднородной системе значительная ингибирующая роль ТРР1 проявляется только на низких плотностях ТФ. Рис. 3. Влця ние ингибитора ТРР1 на параметры пространственного свертывания в

О нМ ВАХ499 -О 300 нМ ВАХ499

¡55 5.1

™ гю

4 8 16 32 64 128 ТФ, пмоль/м3

■ О нМ ВАХ499 300 нМ ВАХ499

4 8 16 32 64 128 ТФ, пмоль/мэ

А 60

о о 50

о.

о х * X 40

« 2 го 5 30

I 2 Л 2 20

с; го 10

го X 0

1800

1 1500

я*

I 1200

& 900

а. 600

£ о 300

а. 0

• 0 нМ ВАХ499 300 нМ ВАХ499

4 8 16 32 64 128 ТФ, пмоль/мг

0 нМ ВАХ499 -о 300 нМ ВАХ499

4 8 16 32 64 128 ТФ, пмоль/м2

нормальной плазме в зависимости от плотности ТФ на активаторе, (а) - Лаг-тайм; (б) -начальная скорость роста сгустка; (в) - стационарная скорость роста сгустка; (г) - размер сгустка через 60 мин после активации свертывания. Представлены средние величины ± стандартное отклонение (п=2-4).

Для дальнейшего изучения роли ТРР1 в пространственном свертывании было выбрано две плотности ТФ: низкая (2 пмоль/м2) и средняя плотность, где эффект значительно слабее или отсутствует совсем (20 пмоль/м2).

Влияние ВАХ499 на свертывание в плазме с дефицитом ТРР1

Чтобы убедиться, что эффект ВАХ499 на гемостаз связан только с ингибированием ТРР1 и больше он ни на что не влияет, были проведены контрольные эксперименты на активаторах с низкой плотности ТФ (2 пмоль/м2) в лиофилизированной плазме с дефицитом ТРР1. Добавление 10 нМ ТРР1 в дефицитную по ТРР1 плазму значительно увеличивало лаг-тайм (рис. 4), тогда как одновременное добавление 10 нМ ТРР1 и 300 нМ ВАХ499 восстанавливало лаг-тайм до базового уровня. При этом сам по себе ВАХ499 не оказывал

влияния на свертывание исследуемой плазмы, что говорит о его высокой специфичности к ЮТ и делает его хорошим инструментом в исследовании роли этого ингибитора.

Ингибирование ТРР1 в плазме здоровых доноров

Далее было изучено влияние ВАХ499 на пространственное свертывание в нормальной плазме в широком диапазоне концентраций (от 0 до 1000 нМ). Для активации свертывания использовали только две плотности ТФ: 2,0±0,1 и 20,6±4,0 пмоль/м2 (указаны среднее ± стандартная ошибка, количество измерений равно 22 и 5, соответственно).

При активации свертывания ТФ с плотностью 2 пмоль/м2 увеличение концентрации ВАХ499 от 0 до 30 нМ приводило к сокращению лаг-тайма в 2 раза и увеличению начальной скорости роста сгустка на 30% (рис. 5а и б). Эффект достигал насыщения при 100-300 нМ ВАХ499. Стационарная скорость практически не менялась во всем диапазоне концентрации ВАХ499 (рис. 5в). Таким образом, можно говорить, что концентрация ВАХ499 100-300 нМ является насыщающей, при которой практически весь ТРР1 оказывается инактивирован. ВАХ499 в насыщающей концентрации оказывал заметный эффект на размер сгустка через 60 минут после активации свертывания (рис. 5г). При этом концентрация ВАХ499, на которой достигалась половина от максимального эффекта, оказалась ниже 10 нМ.

Гистограммы средних значений всех параметров при нулевой и насыщающей концентрации (300 нМ) ВАХ499 показаны на рис. 6. Эффект от добавления ВАХ499 оказался статистически значимым для всех измеряемых параметров (р<0,05).

Рис. 4. Влияние ВАХ499 и ТРР1 на плазму с дефицитом ТРР1 при активации свертывания ТФ с низкой плотностью. Представлены средние значения ± стандартные отклонения (п=2).

-ТРР1 -ТРР| -ТРР1 -ТРР|

+10 НМ +300 НМ +10 нМ ТРР1 ТРР1 ВАХ499 +300 нМ ВАХ499

I 20 |15

« 10

я 5 С

§•

3 1

к 1 10

2 г й-1 5

Й..........I

Р'

200 400 600 8001000 ВАХ4Э9, нМ

1 %

г; 20

1115 о 2 к "5 10-П5 б

5 I 5 с;

? о

| 1200 1000 800 ;>. 600

200 400 600 8001000 ВАХ499, нМ

400 200 0

Г'-

200 400 600 8001000 ВАХ499, нМ

■I..........I

200 400 600 8001000 ВАХ499, нМ

Рис. 5. Влияние ВАХ499 на пространственный рост сгустка в пуле плазм здоровых доноров при активации свертывания низкой плотностью ТФ (2 пмоль/м2). Показаны средние значения ± стандартные отклонения (п=4).

Норма

Норма I- 300 НМ ВАХ499

Норма

Норма ► 300 нМ ВАХ499

Рис. 6. Влияние насыщающей концентрации ВАХ499 на пространственное свертывание в нормальной плазме при активации низкой плотностью ТФ. Показаны средние значения по п=6 экспериментам ± стандартная ошибка. Знаком (*) помечены статистически значимые отличия (р<0,05) от базового уровня (0 нМ ВАХ499).

Аналогично было исследовано влияние различных концентраций ВАХ499 на пространственное свертывание в нормальной плазме при активации средней плотностью ТФ 20 пмоль/м2 (дозозависимости не показаны). На рис. 7 представлены средние значения параметров Тромбодинамики при 0 и 300 нМ ВАХ499. Хотя некоторые различия оказались статистически значимыми, эффект от ингибирования ТРР1 в этих условиях оказался очень слабым.

Рис. 7. Влияние 300 нМ ВАХ499 на параметры свертывания в нормальной плазме при активации 20 пмоль/м2 ТФ. Показаны средние значения ± стандартные отклонения (п=3). Знаком (*) помечены статистически значимые отличия от базового уровня при концентрации ВАХ499 0 нМ (р<0,05).

Ингибирование TFPI в плазме больных гемофилией А Исследование ингибирования TFPI проводили на свободной от тромбоцитов плазме шести пациентов (табл. 1). У всех исследуемых больных была диагностирована тяжелая форма гемофилии А (активность ф\ЛП<1%). Все пациенты на момент исследования проходили терапию концентратами фактора VIII (25-30 МЕ/кг), но не принимали препарат в течение трех дней перед забором крови.

Пациент Jfe Возраст Количество кровотечений в месяц Уровень фактора VIII в день проведения эксперимента, % АЧТВ, сек

1 21 0-1 <1 103

2 24 1-2 2Д 82

3 43 1-2 1,2 86

4 48 1-2 1,4 80

5 21 1-2 <1 120

6 36 2-3 <1 102

Табл. 1. Характеристика пациентов, участвовавших в экспериментах.

Воздействие ВАХ499 на плазму больных гемофилией А изучали в сравнении с широко распространенным в клинике при терапии гемофилии А препаратом рекомбинантного активного фактора VII (г\ГПа, Иоуозеуеп) в эквивалентных концентрациях (от 0 до 1000 нМ). Типичные фотографии пространственного роста сгустка, активированного ТФ низкой плотности в нормальной плазме, плазме больных гемофилией А, а так же в той же плазме больного с добавлением В АХ499 или гУПа показаны на рис. 8а. На рис. 86 показана зависимость размера сгустка от времени для экспериментов, представленных на рис. 8а.

Время, мин

О 10 20 30 40 50 60

--Нормальная плазма

I 500--ГА

|--ГА+300 нМ ВАХ499

- 400----ГА+30 нМ

Нормальная плазма

Гемофилия А

Гемофилия А + 300 нМ 8АХ499

Гемофилия А + 30 нМ гУПа

Рис. 8. Эффекты 300 нМ ВАХ499 и 30 нМ гУПа на пространственное свертывание в норме и при гемофилии А. (а) - Типичные фотографии светорассеяния при росте сгустка, активированном 2 пмоль/м2 ТФ, сделанные через равные промежутки времени. Активатор с ТФ на снимках виден в качестве темной полосы слева. Белая полоска на первом кадре показывает масштаб 0,5 мм. (б) - Влияние ВАХ499 и гУПа на рост сгустка в нормальной плазме и плазме больного гемофилией А.

Дозовые зависимости эффектов ВАХ499 и гУПа в плазме больных гемофилией А снимали в диапазонах концентраций от 0 нМ до 1000 нМ. В экспериментах использовали свежую плазму трех пациентов из табл. 1 (пациенты № 1-3). Активацию свертывания производили 2 пмоль/м2 ТФ. На рис. 9 представлены зависимости усредненных нормированных (на значение при нулевой концентрации препаратов) параметров пространственного свертывания от концентрации препаратов. При увеличении концентрации ВАХ499 от 0 до 10 нМ его эффект достигал своего насыщения (рис. 9а и б). При этом лаг-тайм сокращался в два раза, а начальная скорость роста сгустка увеличивалась в 1,5-2 раза. При добавлении гУНа лаг-тайм достигал своих минимальных значений уже при 3 нМ и снижался в 4 раза по отношению к нулевому значению (рис. 9а). ВАХ499 не оказывал заметного влияния на стационарную скорость роста сгустка во всем диапазоне исследованных концентраций (рис. 9в), в то время как гУПа приводил к сильным дозозависимым изменениям этой скорости (30 нМ фактора гУПа увеличивали стационарную скорость роста сгустка в 7 раз по сравнению с базовым значением). Итоговый размер сгустка в присутствии насыщающей концентрации ВАХ499 увеличивался на 75-100%. В противоположность ВАХ499, увеличение концентрации гУПа способствовало дозозависимому увеличению размера сгустка в диапазоне концентраций 0-30 нМ (до 800%) без эффектов насыщения. Следует отметить, что для более высоких концентраций гУПа размер сгустка через 60 мин после активации свертывания не мог быть

определен в связи с быстрым свертыванием плазмы во всем объеме измерительной кюветы (равномерное увеличение яркости фона на рис. 8а).

3 1,0

го а 0,8

5 0,6

& 0,4

го С 0,2

I Гемофилия А + ВАХ499 О Гемофилия А + г\Л1а

О 10 20 30 400 800 Концентрация, нМ

о а о

к л я <2 , хго 4

О. О.

О 10 20 30 400 800 Концентрация, нМ

£ 8

1 6

с; « п

л 0 X

Я ю

О. 2 8 I 6

0 4 о.

1 2 г о

.л-

О 10 20 30 400 800 Концентрация, нМ

0 10 20 30 400 8( Концентрация, нМ

Рис. 9. Эффекты добавления ВАХ499 или фактора гУПа на пространственное свертывание плазмы больных гемофилией А при активации свертывания ТФ низкой плотности (2 пмоль/м2).Представлены средние значения ± стандартные отклонения (п=3).

В плазме больных гемофилией А при активации свертывания 2 пмоль/м2 ТФ концентрация ВАХ499, вызывающая полумаксимальный эффект (ЕС50), составляла 0.70±0.06 нМ.

Из приведенных данных (рис. 8 и рис. 9) можно заключить, что, несмотря на то, что ВАХ499 и гУПа оба усиливают работу внешнего пути свертывания, характер их воздействия на систему качественно и количественно различен. Ингибирование ТРР1 улучшает формирование сгустка, сокращая лаг-тайм и увеличивая начальную скорость роста и итоговый размер сгустка. Для эффектов ВАХ499 наблюдается эффект насыщения. В противоположность этому, гУПа влияет на все параметры Тромбодинамики. Он дозозависимо увеличивает скорости роста сгустка и стимулирует сильное свертывание во всем объеме кюветы, независящее от ТФ.

Рис. 10 наглядно демонстрирует эффекты, достигаемые при ингибировании ТБР1 и добавлении 30 нМ гУ11а, в плазме больных гемофилией А. Для сравнения на рисунке приведены данные из экспериментов в нормальной плазме. В плазме больных гемофилией А ингибирование ТБР!

статистически значимо влияло на лаг-тайм, начальную скорость роста и размер сгустка через 60 мин после активации свертывания.

При этом лаг-тайм в плазме больных сократился почти в 2 раза по сравнению с исходной величиной в этой плазме в отсутствии ВАХ499, и сократился на 30% по сравнению с уровнем в норме (рис. 10а). Начальная скорость роста сгустка увеличилась с 40 до 75% от нормы (рис. 106), что в итоге привело к удвоению размера сгустка (с 30 до 60% значений нормы) (рис. Юг).

35-

X 5 25

20-

1Ь

Норма ГА

ГА + 300 нМ ВАХ49Э

ГА •ЗОнМ ГУМа

л 30

а § 20

к 1 |ю

1 2

§ 0

=г

го

£ 30

о &

£ I 20

1 I Ю

г 1600 ж

* 1200 £

о 800

о. 400

Норма

ГА ГА ГА + 300 ИМ + 30 нМ ВАХ499 гУНа

Норма ГА

ГА + 300 нМ ВАХ499

ГА -ЗОнМ ГУМа

Норма

ГА ГА + 300 нМ ВАХ499

ГА ■ ЗОнМ ГУМа

Рис. 10. Нормализация свертывания добавлением 300 нМ ВАХ499 или 30 нМ гУНа в плазме больных гемофилией А. Плотность ТФ 2 пмоль/м2. Графики (а,б,в,г) показывают лаг-тайм, начальную и стационарную скорости роста сгустка, а также через 60 мин, соответственно. Указаны средние значения ± стандартные отклонения (п=3-6). Знаком (*) отмечены статистически значимые отличия (р<0,05).

В плазме больных гемофилией А при активации свертывания ТФ средней плотности (20 пмоль/м2) (табл. 1, пациенты № 4-6), ВАХ499 (0-1000 нМ) не приводил к какому-либо значительному ускорению динамики роста сгустка, в то время как гУПа продолжал сильно ускорять свертывание (не показано).

Чтобы наглядно сопоставить эффективность ингибирования 7ТР1 ВАХ499 в нормальной плазме и плазме больных гемофилией А, были построены гистограммы отношений параметров свертывания, измеренных в присутствии 300 нМ ВАХ499, к базовому уровню 0 нМ (рис.11). Из приведенных данных можно заключить, что влияние ТРР1 (и эффективность ВАХ499) в плазме с дефицитом фУШ выше, чем в нормальной плазме.

Лаг-тайм Начальная Стационарная Размер скорость скорость сгустка

Рис. 11. Сравнение эффективности ВАХ499 в плазмах больных гемофилией А и здоровых доноров. Отношения параметров свертывания с и без ВАХ499 (300 нМ) в нормальной плазме (столбики без штриховки) и плазме больных гемофилией А (заштрихованные столбики). Указаны средние значения ± стандартная ошибка, количество экспериментов п=3-6.

Совместное влияние TFPI и фУШ на пространственное свертывание плазмы крови. Так как в клинической практике ингибиторы TFPI и фактор VIII могут применяться одновременно, важно знать как эти лекарственные препараты будут взаимодействовать и какой эффект от их совместного применения можно ожидать. Чтобы это исследовать, было проведено компьютерное моделирование пространственного свертывания при различных комбинациях концентраций TFPI и фУШ. Уровень фактора VIII изменялся в диапазоне 0-0,7 нМ, a TFPI 0-2,5 нМ. Активация проводилась ТФ с плотностью 10 пмоль/м2, которая в модели рассматривается как низкая (см. рис. 2в). Модель показала (рис. 12), что при снижении концентрации TFPI будет сокращаться лаг-тайм и увеличиваться начальная скорость роста сгустка, в то время как изменение концентрации фУШ будет оказывать наибольшее влияние на пространственные скорости роста сгустка и слабее всего действовать на лаг-тайм.

Из данных на рис. 12г можно заключить, что TFPI оказывает влияние на размер сгустка во всем диапазоне исследованных концентраций фактора VIII. При этом абсолютное увеличение размера сгустка, обусловленное удалением TFPI из системы, слабо зависит от уровня фактора VIII (более наглядно на рис. 13а), а относительный вклад значительно снижается при увеличении уровня фУТП (рис. 136). Таким образом, модель предсказывает, что относительная эффективность антагонистов TFPI (в том числе и ВАХ499) будет падать при повышении концентрации фактора VIII в плазме крови.

Рис. 12. Результаты математического моделирования, формирования сгустка в зависимости от концентраций ТРР1 и фУШ в системе. Предсказание эффектов взаимодействия ингибиторов ТРР1 и концентратов фУ1П. Представлены зависимости следующих параметров пространственного свертывания: лаг-тайм (а); начальная и стационарная скорость роста сгустка (б и в, соответственно) и размер сгустка на 60 мин (г). Активация свертывания проводилась ТФ с плотностью 10 пмоль/м2, которая для модели считается низкой.

-D-TFPI»0MM —О-TFPI * 0,5 нМ -Д-TFPl- 1 ММ - !,5 НМ ■ 2 НМ

>,2 0.4

фУШ, НМ

Рис. 13. Абсолютное (а) и относительное (б) увеличение размера сгустка при снижении концентрации TFPI (от начальных 2,5 нМ) в зависимости от концентрации фактора VIII.

Экспериментальное изучение одновременного влияния ВАХ499 и фактора VIII на пространственное свертывание было выполнено на плазме 9-ти пациентов, страдающих от тяжелой формы гемофилии А. После периода отмывки от фактора VIII (2-3 дня) плазма забиралась до введения концентрата фактора VIII (точка 0 часов), а также через 1 час и 24 часа после введения фактора. Таким образом, для каждого пациента было получено 3 пробы с различным уровнем фактора VIII. Данные по пациентам в разные моменты времени, а так же вводимые дозы фактора VIII представлены в табл. 2.

Пациент Профилактики D точке 0 часов через 1 час через 24 часа

Xs ф\Ш, % АЧТВ, с ф\Ш, % АЧТВ, с ф\|П. % АЧТВ, с

1 Hacmoctín, 50 МЕ/кг а 60 82 ...... 38 42

2 Haemoctíti, 50 МЕ/кг 1.« : 82 86 34 45

3 Haemociin, 50 МЕ/кг 16 59 ' 84 35 ■i 49

4 Haemoctin, 50 МЕ/кг ............14 ....... 76 ¡20 32 30 47

5 Haemoctin, 50 МЕ/кг 5.2 69 i 38 24 52

6 Kogenate. 30 МЕ/мл - _ 60 59' 41 . 26 ' 50

7 Octanate 25 МЕ/кг 7.6 67 56 45 53

8 Octanate 19 МЕ/кг 1 123 i 28 53 15 66

9 Kogenate, 25 МЕ/кг Щ 45 1MÍ1HR1 36 2& 53

Табл. 2. Характеристика больных гемофилией А до и после введения фактора VIII.

Представлены активность фактора VIII и АЧТВ в плазмах.

Для каждого образца плазмы были также измерены in vitro дозовые зависимости эффектов ВАХ499 (0-600 нМ) при активации свертывания ТФ низкой плотности (2 пмоль/м2) (не показано). Аналогично предыдущим результатам ингибирование TFPI сокращало лаг-тайм и увеличивало размер сгустка с насыщением в области 30-100 нМ ВАХ499. Начальная и стационарная скорости роста сгустка слабо увеличивались в пределах всего диапазона исследованных концентраций ВАХ499.

Для дальнейшего анализа были отобраны только данные по пробам, содержащим нулевую и насыщающую концентрацию ВАХ499 (100 нМ). Для каждой выбранной концентрации данные были отсортированы по уровню фактора VIII и разделены по 3-м диапазонам: от 0 до 5%, от 5 до 30% и более 30% фактора VIII. Затем в каждом диапазоне данные были усреднены (рис. 14).

В присутствии менее чем 30% фактора VIII ингибирование TFPI сокращало лаг-тайм в 2 раза. В присутствии более чем 30% фУШ ВАХ499 не оказывал значительного влияния на лаг-тайм. Ингибирование TFPI слегка увеличивало скорости роста в 1,2-1,4 раза во всем диапазоне активности Для начальной скорости эффект был значимым в диапазоне 0-30% фактора VIII; для пространственной (стационарной) скорости роста сгустка достоверное различие было найдено только при уровне активности менее 5%. В полном соответствии с результатами компьютерного моделирования относительный эффект ВАХ499 на размер сгустка снижался с увеличением концентрации фактора VIII. В диапазонах активности фактора VIII 0-5, 5-30 и 30-100% ВАХ499 увеличивал размер сгустка на 180%, 70% и 40% соответственно. Таким

20 40 60 80 активность ф\ЛМ, %

20 40 активность фУШ, %

образом, можно утверждать, что при увеличении активности фУШ снижается роль TFPI в формировании пространственного сгустка.

Рис. 14. Влияние уровня фактора VIII в гемофилии А на пространственное свертывание в присутствии или отсутствии 100 нМ ВАХ499. (а) - Лаг-тайм, (б) - начальная скорость роста сгустка, (в) - стационарная скорость роста сгустка, (г) -размер сгустка через 60 мин. Показаны средние значения ± стандартные отклонения. Количество усредненных для каждой точки экспериментов (п) приведено на рисунке, данных, буквой п. Знаком (*) отмечено достоверное различие эффектов при 0 и 100 нМ ВАХ499 (парный t-тест, р< 0,05).

Усредненные данные на рис. 14 демонстрируют также влияние только фактора VUI на пространственное свертывание (черные точки). При увеличении уровня фактора VIII лаг-тайм изменялся меньше всего - на 25% (с 40 до 30 минут), начальная и стационарная скорости увеличивались в 2 раза, а размер сгустка в 3 раза. При этом основные улучшения показателей свертывания наблюдались в диапазоне активности фактора VIII от 0 до 30%.

Однако анализ пациентов по отдельности дал интересный результат: для одних больных относительный эффект ВАХ499 на размер сгустка снижался с увеличением активности фактора VIII (рис. 15а), а для двух из девяти пациентов (пациенты № 2 и 9) - не зависел от времени забора образца плазмы и был одинаковым при разных концентрациях фактора VIII (рис. 156).

Для пациента № 2 отношение размера сгустка при 600 нМ ВАХ499 к базовому значению составляло 2,2 (увеличение на 120%) для всех временных точек, хотя активность фактора VIII в исследуемых образцах изменялась в широком диапазоне: 1.8% в точке 0 ч, 86% спустя 1 ч, 24% спустя 24 часа после введения фактора VIII. Для пациента № 9 не было возможности изучить случай очень низкой концентрации фактора VIII, поскольку в точке 0 ч она составляла 37%. Однако для данного пациента описанные выше отношения составляли

одинаковые значения 1,25 для всех трех образцов (при активностях фактора VIII 37, 70 и 28%). Для пациента № 3 не было возможности определить относительный эффект ВАХ499, поскольку в контрольных экспериментах (при 0 нМ ВАХ499) размер сгустка равнялся нулю (запрет деления на ноль).

S 2

>■ ь

ф о

2 &

_ 7 л

я 6 а

я 5

i 25 60 76 100 126 Активность фУШ, %

- Пациент №2

- Пациент N39

25 50 75 100 125 Активность фУ|||, %

Рис. 15. Относительное увеличение размера сгустка при добавлении насыщающей концентрации ВАХ499 (300-600 нМ) у разных пациентов в зависимости от уровня фактора VIII: (а) - пациенты первого типа, (б) - пациенты второго типа.

Чтобы объяснить, почему у большинства пациентов относительный эффект ВАХ499 снижается при увеличении уровня VIII, опять использовали математическую модель. Фактор VIII и ВАХ499 ускоряют свертывание через активацию фактора X, но по разным путям: фактор VIII ускоряет формирование Ха через внутреннюю теназу (комплекс ф1Ха:фУШа), а ВАХ499 способствует наработке фХа внешней теназой (комплексом фУПа:ТФ). Модель была модифицирована таким образом, чтобы можно было рассчитывать фХа, созданный внешней и внутренней теназами по отдельности. Было смоделировано 4 случая: нормальная плазма (100% фУШ) с 0 и 2,5 нМ TFPI и случаи тяжелой гемофилии А (0% ф\ЧП) с 0 и 2,5 нМ TFPI. Рассчитанные зависимости размеров сгустка от времени для перечисленных случаев показаны на рис. 16а. Профили концентраций фактора Ха во времени, наработанного отдельно внешней и внутренней теназой, показаны на рис. 166.

Расчеты показали, что в нормальных условиях (рис. 166, ряд 1) фХа, произведенный внешней теназой, находится возле активатора, быстро ингибируется и далеко не диффундирует. В отличие от этого фХа, произведенный внутренней теназой, наблюдался в глубине объема плазмы, что и обеспечивало нормальный рост сгустка. Надо отметить, что в приактиваторной зоне концентрация фХа, произведенного внешней теназой, медленно возрастает до 0,09 нМ к 45 минутам, а после снижается из-за присутствия TFPI. В случае нормальной плазмы без TFPI (рис. 166, ряд 3),

концентрации фХа, наработанного внешней теназой в приактиватоной области, существенно возрастают. Максимальная концентрация была в 6,5 раз больше -около 0,6 нМ фХа и в дальнейшем не снижалась (из-за отсутствия ТРР1). Отсутствие ингибирования приводит к большей скорости наработки фХа в начальные моменты времени в приактиваторной области. Это в свою очередь приводит к ускоренной наработке тромбина, сокращению лаг-тайма и начальной фазы роста сгустка. Несмотря на то, что в отсутствии ТБР1 фактора Ха в приактиваторной области производится больше, он все так же не способен далеко диффундировать (быстрая инактивация плазменными ингибиторами). Таким образом, в норме рост сгустка вдали от активатора был обусловлен производством Ха внутренней теназой. В гемофилии фаза распространения подавлена (рис. 166, ряд 2). Удаление ТТР1 из системы приводит только к ускорению производства фХа внешней теназой в приактиваторной области, но из-за неспособности далеко диффундировать он ускоряет только начальную фазу роста сгустка.

Таким образом, объяснением независимости эффектов ВАХ499 и фУШ на пространственный рост сгустка является их функционирование в разных пространственно-разделенных фазах, слабо взаимодействующих друг с другом. Вклад ВАХ499 и фУШ в размер сгустка оказывается практически аддитивным, что приводит к снижению относительной эффективности каждого из веществ при повышении концентрации другого.

Норма

Гемофилия А Норма без ТЯР! Гемофилия А без ТРР1

Время, мин

Ха от внешней теназы Ха от внутренней теназы

Норма

Гемофилия А

Норма без ТРР1

Гемофилия А без ТРР1

005 Ха, нМ

Ха, нМ

0,05 Ха, нМ

о,5 1,о 1,5 0 «9®'*''' Расстояние, мм

0,04

Ха, нМ

Расстояние, мм

—Г °'6

Ха, нМ

0,5 1,0 1,5 0 о,«®

Расстояние, мм

Ха, нМ

О 0,5 1,0 1,5 "ф«®

Расстояние, мм

60 9Х

Рис. 16. Механизм взаимодействия фУШ и ингибитора ТРР1 ВАХ499: вклады внешней и внутренней теназы в производство фХа. (а) - Зависимость размера сгустка от времени для четырех комбинаций концентраций факторов VIII и ТРР1. (б) - Концентрация фактора Ха, произведенного отдельно внешней и внутренней теназами. во времени и пространстве для тех же экспериментов. Компьютерное моделирование проводили для активации свертывания ТФ с плотностью распределения 10 пмоль/м2.

Выводы

1. В пространственно-неоднородной системе TFPI существенно сокращает время задержки свертывания и увеличивает начальную скорость роста фибринового сгустка при активации гемостаза тканевым фактором с низкими плотностями распределения (1-4 пмоль/м2). Роль TFPI оказывается не существенной при активации свертывания ТФ со средними (10-20 пмоль/м2) и высокими (50-100 пмоль/м2) плотностями распределения, наблюдаемыми, например, в присутствии атеросклеротических бляшек или на фибробластах, соответственно.

2. In vitro ингибирование TFPI оказывает более выраженный ускоряющий эффект на пространственное свертывание в плазме с дефицитом фактора VIII, чем в плазме здоровых доноров.

3. Усиление гемостаза через внешний путь свертывания за счет инактивации TFPI или добавления фактора rVIIa имеет качественно разный характер. Ингибировние TFPI ускоряет только процессы инициации свертывания и начальную фазу роста сгустка, при этом эффект имеет насыщаемый характер. В отличие от этого, rVIIa в диапазоне концентраций 1-1000 нМ дозозависимо улучшает одновременно все параметры пространственного свертывания и способствует формированию сгустка во всем объеме плазмы крови, вне зависимости от ТФ.

4. Неспособность фактора Ха диффундировать далеко от активатора из-за его быстрого ингибирования приводит к ограничению влияния TFPI на свертывание в пространстве приактиваторной областью (слой 100-200 мкм). Это, в свою очередь, приводит к аддитивному эффекту на размер сгустка фактора VIII и ингибитора TFPI.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Parunov LA, Fadeeva OA, Balandina AN, Soshitova NP, Kopylov KG, Kumskova MA, Gilbert JC, Schaub RG, McGinness KE, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation. J Thromb Haemost. 2011 Sep;9(9): 1825-34.

2. L,A. Parunov, F.I. Ataullakhanov, M.A. Panteleev. Blood coagulation is not sensitive to the concentrations of the tissue factor pathway proteins: possible

mechanisms and physiological implications. 36th Federation of European Biochemical Societies Congress. Torino, Italy, June 2011, (Conference proceedings, page 290, abstract P15.26).

3. L.A. Parunov, N.P. Soshitova, O.A. Fadeeva, A.N. Balandina, K. G. Kopylov, M.A. Kumskova, K.E. McGinness, M.A. Panteleev, F.I. Ataullakhanov, R.G. Schaub, J.C. Gilbert. Spatial blood coagulation in the presence of anti-tfpi aptamer bax499 in hemophilia a patients after FVIII infusion.58th annual meeting of the Scientific and Standartization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Liverpool, United Kingdom, June 2012 (Conference Proceedings, SSC12-1095).

4. Parunov LA, Fadeeva OA, Balandina AN, Soshitova NP, Kopylov KG, Kumskova MA, Gilbert JC, Schaub RG, McGinness KE, Ataullakhanov FI and Panteleev MA. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation. XXIIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Kyoto, Japan, July 2011. Conference proceedings, page 230, P-MO-546.

5. Баландина A.H., Пантелеев M.A. Плющ О.П., Копылов К.Г., Кумскова М.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Тарандовский И.Д., Парунов JI.A., Атауллаханов Ф.И. Подбор замещающей терапии у пациентов с гемофилией А и Б: новый метод регистрации пространственного роста сгустка, Материалы Пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, Февраль 3-5,2011, стр. 47.

6. Парунов JI.A., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Почему свертывание крови малочувствительно к концентрациям белков пути тканевого фактора: возможные механизмы и физиологический смысл? Материалы Пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, Февраль 3-5, 2011 , стр. 47.

7. Парунов Л.А., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А. Почему свертывание крови малочувствительно к концентрациям белков пути тканевого фактора: возможные механизмы и физиологический смысл? Материалы восемнадцатой Международной конференции «Математика компьютер образование», Пущино, Россия, Январь 24-29, 2011, Выпуск 18, стр 110.

Подписано в печать: 11.11.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1017 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парунов, Леонид Александрович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук

На правах рукописи

04201450428

Парунов Леонид Александрович

Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании

фибринового сгустка.

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д. ф.-м. н. М.А. Пантелеев

Москва - 2013

Оглавление

1 ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................5

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................9

2.1 Общие представления о гемостазе человека..............................................................................................9

2.1.1 Механизмы гемостаза (триада гемостаза)...........................................................................9

2.1.2 Плазменное звено свертывания крови...................................................................................10

2.1.2.1 Формирование фибринового сгустка............................................................................................10

2.1.2.2 Каскад свертывания........................................................................................................................13

2.1.2.3 Два пути активации каскада свертывания....................................................................................15

2.1.2.4 Кофакторы и мембран зависимые реакции.................................................................................16

2.1.2.5 Ингибирование свертывания.........................................................................................................17

2.2 Внешний путь активации свертывания и его регуляция...........................................................................19

2.2.1 Компоненты внешнего пути свертывания...........................................................................19

2.2.1.1 ТФ - активатор внешнего пути свертывания.................................................................................19

2.2.1.2 Фактор VII........................................................................................................................................20

2.2.1.3 TFPI - ингибитор внешнего пути свертывания.............................................................................21

2.2.1.3.1 Структура и изоформы TFPI...............................................................................................21

2.2.1.3.2 Распределение TFPI в системе кровообращения............................................................21

2.2.1.3.3 TFPI в плазме......................................................................................................................22

2.2.1.3.4 TFPI в тромбоцитах............................................................................................................22

2.2.2 Регуляция внешнего пути свертывания.................................................................................22

2.2.2.1 Механизмы активации свертывания.............................................................................................22

2.2.2.2 Ингибирование фактора Ха посредством TFPI.............................................................................23

2.2.2.3 Ингибирование комплекса \/11а:ТФ посредством TFPI.................................................................24

2.2.2.4 Представления о роли TFPI в гемостазе в организме..................................................................25

2.2.2.5 Роль TFPI в заболеваниях...............................................................................................................26

2.3 Нарушения плазменного гемостаза при гемофилии...............................................................................28

2.3.1 Общие сведения о гемофилиях А и Б........................................................................................28

2.3.2 Терапия гемофилии А и Б..........................................................................................................29

2.3.2.1 Заместительная терапия................................................................................................................29

2.3.2.2 Другие способы лечения гемофилии............................................................................................30

2.3.2.3 Идея генной терапии гемофилии..................................................................................................32

2.3.2.4 Идея ингибирования TFPI...............................................................................................................33

2.4 Влияние ингибиторов TFPI на свертывание. Последние данные..............................................................36

2.4.1 Данные исследований с использованием аптамера ВАХ499................................................36

2.4.1.1 Фармакокинетические исследования с ВАХ499 и специфичность аптамера.............................36

2.4.1.2 Влияние ВАХ499 в тесте генерации тромбина (ТГТ).....................................................................38

2.4.1.3 Влияние ВАХ499 на показания тромбоэластографии (ТЭГ) и тромбоэластометрии (ТЕМ).......39

2.4.1.4 Изменчивость реакции на ВАХ499 ................................................................................................40

2.4.1.5 Результаты клинических испытаний ВАХ499................................................................................41

2.4.2 Влияние других ингибиторов TFPI на свертывание..............................................................41

2.5 Экспериментальные модели свертывания крови.....................................................................................42

2.5.1 Модели свертывания in vivo, ex vivo и in vitro.........................................................................42

2.5.2 Принципиальные подходы к регистрации свертывания......................................................43

2.5.3 Пространственно-однородные модели.................................................................................44

2.5.4 Пространственно-неоднородные модели.............................................................................47

2.5.5 Типы математических моделей. Достоинства и недостатки..........................................49

2.5.6 Феноменологические модели...................................................................................................50

2.5.7 Количественные детальные модели......................................................................................51

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................................................55

3.1 Приобретенные материалы......................................................................................................................55

3.2 Приготовление активаторов свертывания...............................................................................................56

3.2.1 Иммобилизация тромбопластина на полистироловую поверхность...............................56

3.2.2 Определение плотности иммобилизованного тканевого фактора.................................57

3.3 Подготовка образцов плазмы крови.......................................................................................................57

3.3.1 Протокол приготовления свежей плазмы крови..................................................................57

3.3.2 Протокол приготовления лиофилизированной плазмы с дефицитом TFPI......................58

3.3.3 Протокол приготовления замороженной плазмы больных гемофилией А.......................58

3.3.4 Стабилизация рН плазмы.........................................................................................................58

3.3.5 Ингибирование контактной активации................................................................................59

3.3.6 Подбор пациентов для исследования взаимодействия лекарственных препаратов.....59

3.3.7 Протокол исследования взаимодействия лекарственных препаратов............................60

3.4 Методы исследования свертывания плазмы крови.................................................................................61

3.4.1 Стандартные тесты: АЧТВ и определение уровня фактора VIII.......................................61

3.4.2 Рост сгустка в пространстве (Тромбодинамика)................................................................62

3.5 Схема и устройство прибора Тромбоимаджер.........................................................................................62

3.5.1 Конструкция кюветы...............................................................................................................62

3.5.2 Схема и принцип работы прибора Тромбоимаджер.............................................................63

3.5.3 Получение изображений...........................................................................................................64

3.5.4 Обработка экспериментальных кадров................................................................................64

3.6 Статистическая обработка результатов....................................................................................................65

3.7 Математическая модель свертывания....................................................................................................65

4 РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................................................67

4.1 Планирование эксперимента...................................................................................................................67

4.1.1 Выбор реактивов.......................................................................................................................67

4.1.2 Описание параметров, характеризующих пространственный роста сгустка..............67

4.1.3 Предварительная оценка влияния TFPI: компьютерное моделирование...........................68

4.2 Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров: эксперименты in vitro...............................................70

4.2.1 Влияние плотности ТФ на эффект от ингибирования TFPI................................................70

4.3 Влияние ВАХ499 на свертывание в плазме с дефицитом TFPI.................................................................71

4.3.1 Ингибирование TFPI в плазме здоровых доноров...................................................................72

4.3.1.1 Дозозависимости при активации низкой плотностью тканевого фактора.................................74

4.3.1.2 Эффект ВАХ499 при активации средней плотностью тканевого фактора..................................75

4.4 Изучение эффектов от ингибирования TFPI в плазме больных гемофилией А..........................................77

4.4.1 Характеристика исследуемых больных гемофилией А........................................................77

4.4.2 Ингибирование TFPI в плазме больных гемофилией А...........................................................77

4.4.2.1 Статистическое сравнение эффективности ВАХ499 и Novoseven в ускорении

свертывания плазмы больных гемофилией А..............................................................................80

4.5 Совместное влияние TFPI и фУШ на пространственное свертывание плазмы крови................................82

4.5.1 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII (компьютерное моделирование).............................................................................................82

4.5.2 Исследование взаимодействия ВАХ499 и концентратов фактора VIII (эксперимент)............................................................................................................................83

4.6 Ингибирование TFPI в плазме с дефицитом ф1Х (компьютерное моделирование).................................90

5 ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................................................91

5.1 Границы действия TFPI............................................................................................................................91

5.2 Снижение плотности фибринового сгустка из-за TFPI.............................................................................92

5.3 Порог по активации и TFPI......................................................................................................................92

5.4 Эффективность ингибирования TFPI в гемофилии и норме.....................................................................93

5.5 Фактор VIII и ингибитор TFPI. Совместное действие и его механизм.......................................................93

5.6 Клиническое значение.............................................................................................................................94

5.7 Исключение. Второй тип больных гемофилией А....................................................................................95

5.8 Другие формы гемофилии и ингибиторы TFPI.........................................................................................95

5.9 Сравнение эффектов от rVIIa и ингибирования TFPI.................................................................................96

5.10 Недостатки экспериментальной модели.................................................................................................97

5.11 Экспериментальные ошибки....................................................................................................................98

5.12 Согласие эффективных концентраций ВАХ499 с другими работами.......................................................98

5.13 Специфичность ВАХ499...........................................................................................................................98

5.14 ВАХ499 как лекарство и инструмент исследования роли TFPI.................................................................99

6 ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................100

7 БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................................................101

8 ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................102

8.1 Контрольные эксперименты..................................................................................................................102

9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................103

10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................104

1 Введение

Задачей системы гемостаза у человека является предотвращение потери крови при нарушении целостности кровеносной системы. Плазменное звено свертывания -одна из важных составляющих этой системы, задачей которого является формирование геля в месте повреждения для предотвращения просачивания жидкости. В свертывании плазмы крови участвует более 30 белков, которые взаимодействуют друг с другом, образуя огромную сеть биохимических реакций. Такая сложная система требует соответствующей регуляции. Это приводит к тому, что даже небольшие нарушения в деликатном балансе про- и антикоагулянтных реакций могут приводить к тяжелым последствиям для организма: тромбозам и кровотечениям.

Относительно недавно была высказана новая идея, как улучшить свертывание в гемофилии: инактивировать ингибитор, регулирующий запуск реакций свертывания крови (TFPI). В последнее время появились работы, посвященные разработке ингибиторов к TFPI и их тестированию. В общем, данные подтверждают их положительный эффект на гемостаз в случае гипокоагуляции. Однако эксперименты in vivo описывают слишком общие эффекты TFPI на свертывание и не способны четко выделить закономерности процессов в связи со многими неопределенностями экспериментальных условий. Все исследования in vitro проводились в гомогенных экспериментах, которые принимают во внимание активности белков свертывания, но не учитывают процессы диффузии. Однако in vivo свертывание активируется на поверхности с тканевым фактором (ТФ), а пространственный рост сгустка происходит во многом за счет диффузии активных факторов. Как было ранее показано, в таких условиях роль некоторых белков в гемостазе может поменяться. Таким образом, пока нет данных о роли TFPI в пространственной динамике свертывания. Не ясно подавляет ли TFPI пространственный рост сгустка и способно ли ингибирование TFPI его улучшить. В свете активного развития идеи ингибирования TFPI у больных гемофилиями полезно было бы знать последствия такой терапии. Для этого требуется понимать механизм, степень

влияния TFPI и условия, при которых ингибиторы TFPI будут оказывать положительное действие на пространственный рост сгустка. На сегодняшний день этот аспект остается не изученным. Кроме того, не известно, как будут взаимодействовать лекарственные препараты ингибиторов TFPI и концентрата фактора VIII при одновременном назначении больному гемофилией А.

Для того чтобы разобраться в этих вопросах в данной работе использовали пространственно-неоднородную экспериментальную модель свертывания (тест Тромбодинамики). Ее ключевая особенность состоит в том, что свертывание плазмы крови запускается поверхностью с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ) и затем распространяется в объем плазмы. Наблюдение за ростом фибринового сгустка производили оптически по светорассеянию методом темного поля. Эта экспериментальная модель имитирует свертывание in vivo, так как учитывает и биохимические реакции системы гемостаза, и процессы диффузии. Ранее данная экспериментальная модель использовалась в работах по изучению нарушений свертывания в гемофилиях А и Б [1-3] и при других дефицитах факторов свертывания [4,5]. Более того, метод показал чувствительность к прокоагулянтным изменениям в плазме, при добавлении тромбоцитарных микровезикул [6] и рекомбинантного активированного фактора VII (rVlla) [7].

Для выбора условий эксперимента, предсказания поведения системы гемостаза и выяснения механизмов влияния TFPI на пространственный рост сгустка в данной работе было проведено математическое моделирование.

Задачи исследования:

i'»

iyv"'' <v. i/и . Ч' » \ , « *,\«t' uvf . V «ч;H' 7 Щ

3. Сравнить действие ингибитора TFPI и рекомбинантного фактора Vila (rVlla) на пространственное формирование сгустка в плазме больных гемофилией А.

Информация о работе

Парунов, Леонид Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Роль ингибитора пути тканевого фактора в пространственном формировании фибринового сгустка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы