Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах

Пантелеев, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах"

На правах рукописи

ПАНТЕЛЕЕВ Михаил Александрович

Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах

03.00.02 - биофизика

I I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

профессор Б.Н. Гольдштейн;

доктор биологических наук, М.А. Ажигирова

Ведущее учреждение - физический факультет Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Защита состоится " " ¿г^лг^ 2005 г. в -^к.ср час. на заседании диссертационного совета Д001.045.02 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " " ¡^л^тл. 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

кЗкЪХ,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Свертывание крови является одним из элементов системы гемостаза, функция которой заключается в предотвращении потери крови при повреждении сосудистой системы. Нарушение целостности стенки сосуда приводит к активации свертывания, сложного процесса, в который вовлечено свыше пятидесяти белков, а также клетки крови и сосудистой стенки. В результате этого процесса происходят локальный переход крови из жидкого в гелеобразное состояние и остановка кровотечения благодаря сформированному сгустку. Любой сдвиг в деликатном балансе свертывания крайне опасен для организма, угрожая либо повышенной кровоточивостью, либо тромбозом, что делает изучение свертывания одной из приоритетных задач биохимии, биофизики и медицины.

Исследования, проводившиеся на протяжении последних десятилетий, привели к качественному изменению уровня знаний о свертывании крови. В настоящий момент можно довольно уверенно утверждать, что устройство этой системы сравнительно хорошо известно: в последний раз новые белки в свертывании были открыты в конце 80-х годов XX века, а последние реакции обнаружены в начале 90-х. Несмотря на напряженную работу тысяч лабораторий во всем мире, за последние пятнадцать лет новых участников в каскаде свертывания обнаружено не было. Однако, знание устройства системы не означает понимания ее функционирования и далеко не всегда помогает определить правильный способ скорректировать то или иное нарушение. Именно поэтому все больше и больше работ в последние годы посвящается изучению экспериментальных in vitro, in vivo и ex vivo моделей свертывания с целью понять, как оно функционирует и как на него воздействовать.

В силу сложности этой системы, обусловленной огромным количеством белковых и клеточных участников, наличием диффузии и потока крови, математические модели являются крайне перспективным методом исследования функционирования гемостаза. Однако, существующие на настоящий момент математические модели большей частью не сравнивались с экспериментом и не включают многих существенных реакций. Многие принципы устройства опубликованных моделей устарели и нуждаются в уточнении, или даже были признаны неправильными.

РОС. н 'MiKí<>íА ТЬНАЯ ЬПЫХ 01 Елл <1 Петербург

цельной крови активируется тканевым фактором (ТФ) и регистрируется изменение активности тромбина со временем. Второй моделируемой системой была разработанная в нашей лаборатории методика по исследованию пространственного формирования фибринового сгустка в тонком, не перемешиваемом слое рекальцифицированной плазмы при активации свертывания монослоем клеток, экспрессирующих ТФ. Первая модель была выбрана из-за того, что она является одним из самых эффективных и популярных методов, применяющихся как для фундаментальных исследований свертывания, так и для клинической диагностики. Чувствительность этой модели к различным изменениям в системе свертывания может быть исследована с помощью метода коэффициентов контроля в варианте, адаптированном для нестационарных систем. Вторая же экспериментальная постановка наиболее воспроизводимо и точно отображает пространственные аспекты свертывания, столь существенные in vivo, позволяя изучать роль диффузии различных факторов в формировании сгустка. В частности, эта постановка позволяет проанализировать вклад различных реакций в пространственное формирование фибринового сгустка.

В качестве наиболее актуального приложения модели было исследовано влияние на свертывание рекомбинантного активированного фактора VII и тромбомодулина. Первое из этих веществ успешно используется в терапии гемофилий и других геморрагических заболеваний свертывания (коммерческое название NovoSevei/l<>, Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), в то время как растворимый тромбомодулин (Solulin) сейчас предлагается использовать для лечения тромбозов. Однако, механизм действия обоих препаратов не вполне ясен, и прояснение его способно внести вклад в стратегию терапии, использующей эти препараты.

Цель работы: Разработка количественной математической модели свертывания крови для решения биохимических и клинических задач.

Задачи исследования:

1. Построить количественную математическую модель каскада свертывания крови и сравнить ее с существующими экспериментальными данными по динамике свертывания.

2. Провести сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям констант реакций и концентраций факторов свертывания крови.

3. Проанализировать роль внешнего и внутреннего пути свертывания в пространственной динамике роста фибринового сгустка.

4. Использовать предложенную математическую модель для анализа механизмов действия препаратов рекомбинантного фактора Vila (NovoSeven) и рекомбинантного растворимого тромбомодулина (Solulin).

Научная новизна. Предложен механизм действия ингибитора пути тканевого фактора, позволяющий объяснить ранее необъясненные наблюдения. Экспериментально показано, что фактор Villa связывает фактор X и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой. Построена новая оригинальная математическая модель свертывания крови, отвечающая современным биохимическим представлениям и успешно описывающая большой набор экспериментальных данных из литературы. В этой модели учтены такие важные реакции, как активация факторов X и IX активированным фактором VII в присутствии активированных тромбоцитов, тромбоцит-зависимая активация фактора XI тромбином, секреция тромбоцитов, регуляция комплекса внешней теназы и активированного фактора X ингибитором пути тканевого фактора, и многие другие, которые отсутствуют в ранее опубликованных моделях свертывания. С помощью модели проведен анализ чувствительности и информативности теста генерации тромбина и показано существование только двух независимых параметров. Показан неизвестный ранее различный механизм работы внутреннего и внешнего путей в фазе распространения свертывания: установлено, что активированный фактор X производится внутренней теназой, тогда как фактор IX активируется по внешнему пути и распространяется в пространстве путем диффузии. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментально. Обнаружено, что вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого действия препарата NovoSeven в нормализацию свертывания в плазме больных гемофилией зависит от условий эксперимента, однако физиологическое формирование сгустка определяется преимущественно ТФ-независимым механизмом.

Научно-практическое значение. Полученные -результаты по кинетике и регуляции реакций, катализируемых внутренней и внешней теназами могут иметь значение для клинических и биохимических исследований свертывания. Построенная модель может быть использована в качестве инструмента для планирования и анализа экспериментов по биохимии свертывания крови, а также для исследования механизмов действия препаратов, воздействующих на свертывание. Результатом исследования модели является вклад в понимание регуляции системы свертывания и механизмов действия препаратов, направленных на коррекцию гемостаза, что может как иметь значение для экспериментальных исследований свертывания, так и дать базу для терапевтической стратегии при использовании этих препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Показано экспериментально, что фактор Villa связывает фактор X на фосфолипидных мембранах и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой.

2. Построена оригинальная математическая модель свертывания крови, активированного по внешнему пути, количественно описывающая процесс свертывания как в гомогенной, так и в пространственной экспериментальных постановках.

3. Доказано, что пространственный рост сгустка определяется выработкой активированного фактора X внутренней теназой, однако активированный фактор IX производится преимущественно по внешнему пути.

4. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментом.

Апробация работы состоялась 6 декабря 2005 г. на заседании проблемной комиссии "Криоконсервирование клеток крови и костного мозга. Биохимия и биофизика крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, октябрь 2001 г.), на международной конференции "Параллельные вычисления и задачи управления" (Москва, май 2001 г.), на Ш-м Съезде биофизиков России (Воронеж, июнь 2004 г.), на VII-й Всероссийской конференции "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза" (Москва, март 2002 г.), на 1-м Всероссийском съезде гематологов (Москва, апрель 2002 г.), на 3rd Annual Conference on Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (Salt Lake City, США, апрель 2002 г.), на Vth International Congress on Mathematical Modeling (Дубна, октябрь 2002 г), на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, ноябрь 2002 г.), на 1-й Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, февраль 2003 г.), на XlXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Birmingem, Англия, июль 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 тезисов в сборниках трудов 10 конференций и 5 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания построения модели, главы 4 — описание экспериментальных результатов, главы 5 — описания теоретических результатов, и главы шестой — обсуждения

результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 178 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.).

Материалы и методы исследований.

Подходы, использованные для описания ферментативных реакций. Модель свертывания, разработанная в данной работе, представляла собой систему дифференциальных уравнений, переменными которой были концентрации факторов свертывания, ингибиторов и активированных тромбоцитов. Многосубстратные реакции описывались с помощью уравнения

субстрата, к'ш и 1СМ — каталитическая константа и константа Михаэлиса активации этого субстрата, соответственно. Для описания взаимодействия факторов свертывания с тромбоцитами был использован метод, предложенный в {^еяке'т & а1., 1984). В этом подходе используется концепция "тонкой оболочки", в которой происходит катализ в мембранно-зависимой реакции. Использование такой модели, позволяет вывести уравнения для мембранно-зависимых реакций свертывания.

Для системы уравнений "реакция-диффузия" граничные условия для взаимодействия белков с поверхностями были получены на основе идеализации, предполагающей существование бесконечно тонкого слоя белков на поверхности. Для большинства факторов были использованы условия отсутствия потока через границу. В случае же, когда происходила реакция между факторами :т активирующей поверхности и факторами в объеме, использовались "активные" граничные условия. Например, пусть некий фактор А в растворе необратимо связывается с фактором В на активирующих клетках (левая граница расчетного отрезка). Пусть длина отрезка есть х0, концентрация фактора А есть [А], его коэффициент диффузии есть Д поверхностная плотность фактора В есть ав, константа скорости связывания ка. Тогда граничное условие для А будет:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

(1)

где [£°] — полная концентрация фермента, ] — полная концентрация /-того

ох ,.0 О

Численный метод и его программная реализация. Численное интегрирование системы обыкновенных дифференциальных уравнений для модели свертывания в системе с перемешиванием производилось вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга порядка 2(3) (Hairer et al., 1987). Численная схема была реализована с помощью программы, написанной на Watcom C/C++ 10.0. Задача интегрирования системы уравнений в частных производных рассматривалась на отрезке прямой длиной L=3 мм, разбитом на 200 точек и решалась с помощью того же метода.

Реагенты. Хромогенный субстрат S-2765 для фактора Ха был приобретен в Diapharma (West Chester, ОН). Бычий сывороточный альбумин (БСА) и Фен-Про-Арг-хлорометил кетон (РРАСК) были приобретены в Sigma (St. Louis, МО), фосфатидилсерин (ФС) из бычьего мозга и фосфатидилхолин (ФХ) из яичного желтка были приобретены в Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Все прочие реагенты были не менее, чем аналитического уровня чистоты.

Белки. Человеческий фактор 1Ха и фактор с заингибированным активным сайтом IXa-EGR были приобретены в Haematologic Technologies (Essex Junction, VT). Человеческие факторы X и Xa были приобретены в Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). Человеческий a-тромбин был приобретен в Sigma. Активность тромбина определялась титровкой активных сайтов с помощью РРАСК. Человеческий фактор VIII был очищен из терапевтического концентрата (Antihemophilic Factor, human, American Red Cross, Rockville, MD) по методу (Saenko et al, 1996). Активность фактора VIII (4000 ед/мг) определялась одношаговым клоттинговым тестом; активность 1 ед/мл считалась эквивалентной концентрации 0.7 нМ активного кофактора. Белки хранились при -80°С в аликвотах 5-10 мкл и размораживались непосредственно перед использованием Факторы VIII, IXa-EGR, X были помечены флуоресцеином с использованием FluoReporter® F!uorescein-FX Protein Labeling Kit (Molecular Probes, Eugene, OR). Степень мечеиия определялась по поглощению при 280 и 494 нм.

Фосфолипидные везикулы. ФС и ФХ смешивались в хлороформе в молярной пропорции 25:75 (если не указано иное) и высушивались под азотом на протяжении 30 мин. Для экспериментов по связыванию добавлялась липофильный флуоресцентный краситель DiíC16(3) (Molecular Probes) в этиловом спирте в концентрации 0.2 моль %. Затем липиды ресуспендировались в 150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, pH 7.4 (буфер А) на вортексе в течение 30 мин. Полностью гидратированные образцы подвергались экструзии путем 11 экструзионных циклов через мембраны с размером пор 0.1 или 0.8 мкм с использованием мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) нагретого до ~70°С. Липосомы хранились при +4°С и использовались в течение 4 дней после изготовления. Для экспериментов по

связыванию и кинетике, использовались везикулы размером 0 8 мкм и 0.1 мкм, соответственно, если не указано иное.

Эксперименты по связыванию факторов свертывания с фосфолипидными везикулами. Меченные флуоресцеином факторы свертывания инкубировались с фосфолипидными везикулами в 150 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 1 мМ MgCI2, 0.4 мМ NaH2P04, 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфониевой кислоты (HEPES), 5 мМ глюкозы, 0.5% БСА (буфер Б) в присутствии СаС12 (2.5 мМ) при 37°С на протяжении 15 мин, если не указано иное. Контрольные эксперименты подтвердили, что этот период был достаточен для достижения насыщения. При исследовании связывания фактора Villa, фактор VIII активировался тромбином (1 нМ) на протяжении 1 мин перед инкубированием с везикулами, и затем тромбин ингибировался добавлением РРАСК в концентрации 1 мкМ. Образцы быстро разводились в 10 раз буфером Б, содержащим 2.5 мМ СаСЬ, и немедленно подвергались анализу на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) на протяжении 10 с. Везикулы идентифицировались по флуоресценции DiIC16(3) в канале FL2. Примерно 1000 РЬ2-положительных событий регистрировалось в каждом эксперименте. Связанный фактор определялся по флуоресценции везикул в канале FL1. Интенсивность флуоресценции пересчитывалась в среднее число молекул на везикулу с использованием калибровочной кривой, приготовленной по Quantum Fluorescent Microbead Standard for fluorescein (Sigma). Контрольные эксперименты подтвердили, что за время разведения образца и анализа диссоциация белка с везикул не превышает 5%.

Все эксперименты проводились не менее чем трижды, если не указано иное, и репрезентативные эксперименты показаны на рисунках. Для определения равновесных констант связывания и констант активации фактора X соответствующие кривые для независимых экспериментов аппроксимировались стандартной гиперболой с использованием нелинейного метода наименьших квадратов. Чтобы определить количество вновь сформированных дополнительных сайтов связывания, например, сайтов, предоставленных для фактора 1Ха фактором VIII, мы вычитали кривую связывания для фактора 1Ха из кривой связывания для фактора 1Ха в присутствии фактора VIII. Этот мсюд не принимает во внимание возможной конкуренции между 1Ха и VIII за сайты связывания на фосфолипидах. Чтобы избежать вызванных этим погрешностей, мы использовали только ту часть кривых связывания, где вычтенное связывание фактора 1Ха не превосходило полученного специфичного связывания.

Эксперименты по активации фактора X. Эксперименты проводились в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах (Falcon®, Becton Dickinson,

Franklin Lakes, NJ). Фосфолипиды, факюры IXa и VIII инкубировались в буфере Б в различных комбинациях в присутствии 2.5 мМ СаС12 при 37°С После активации фактора VIII тромбином (конечная концентрация 1 нМ) на протяжении 1 минуты, реакция запускалась добавлением фактора X. Реакция останавливалась спустя ? мин добавлением F.DTA в буфере А (конечная концентрация 10 мМ). Наработанный фактор Ха определялся по скорости расщепления хромогенною субстрата S-2765 (конечная концентрация 0.3 мМ) Скорость гидролиза субстрата определялась по поглощению при 405 нм с использованием микропланшетного ридера Tecan GENios Pro (Tecan U.S., Durham, NC) в кинетическом режиме и пересчитывалась в концентрацию фактора Ха с использованием калибровочной кривой, приготовленной с помощью стандартного раствора фактора Ха. Контрольные эксперименты показали, что вклад тромбина, использовавшегося для активации фактора VIII, в гидролиз S-2765 был пренебрежимо мал (данные не показаны)

Результаты

Построение математической модели свертывания крови. Чтобы разработать биохимически адекватную модель, мы исиользовали метод постепенного усложнения моделируемой системы. Сначала моделировались простые системы из нескольких ферментов свертывания. Затем мы провели моделирование все более сложных систем очищенных белков, используя данные экспериментальных пабот (Lawson et aï, 1994, van't Veer et al, 1997). Диапазон констант модели был ограничен теми значениями, что были определены в экспериментах. Сравнивая усложняющиеся модели с эксперименюм и стремясь к успешному описанию, мы пришли к модели свертывания в нельной крови. Наконец, корректность полученной модели была успешно подтверждена подтверждена тем, что большой набор экспериментальных данных по генерации тромбина и тромбообразованию описывался количественно при одном, полученном исходно, наборе параметров.

При построении модели возникли проблемы, связанные с недостаточной изученностью двух реакций свертывания, что затрудняло их моделирование: 1) ингибирования внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора (TFPI); 2) активации фактора X внутренней теназой.

Время (мин)

10 12 Н

Рис. 1. Механизм действия ингибитора пути тканевого фактора. (Л) Два варианта гипотетической реакции ингибирования фермент-субстратного комплекса X-Vlla-ТФ (ES) при участии Xa-TFPI (PI) Обозначения I, TFPl; Р, фактор Xa, S, фактор X, Е, Vlla-ТФ (Б) Теоретическое описание эксперимента по ингибированию активации фактора X Показаны кривые активации 170 нМ фактора X комплексом 128 пМ Vlla-ТФ в присутствии 2 4 нМ TFPI преинкубированного с фактором Ха в концентрации (сверху вниз) 0, 0 25. 0 5, 1 нМ Экспериментальные данные взяты из (Baugh et al, 1998) Теоретические кривые проведены путем численного интегрирования системы уравнений, соответствующей панели А, нижнему варианту

Свободный TFPI связывает Vila медленно по сравнению с фактором Ха, но комплекс Xa-TFPI хорошо связывает VIIa-ТФ. Поэтому изначально был предложен двухшаговый механизм действия: TFPI связывает Ха, затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-ТФ, полностью ингибируя его активность. Недавно было показано (Baugh et al, 1998), что этот общепринятый механизм не может объяснить экспериментальные данные по кинетике ингибирования комплекса VIIa-ТФ. Для объяснения этого противоречия авторы предположили, что основным путем ингибирования является ингибирование фермент-продуктного комплекса Ха-VIIa-ТФ при участии TFPI. Однако, предложенная схема детально исследована не была. Поэтому мы исследовали механизм ингибирования активации фактора X при участии TFPI. Были построены модели каждой из схем, и проведено описание экспериментов Анализ системы показал, что существующие эксперименты могут быть успешно описаны (Рис. 1Б), только если дополнить схему (Baugh et al, 1998) реакцией ингибирования фермент-субстратного комплекса (Рис. 1А). Построенная модель ингибирования была включена в модель каскада свертывания.

Экспериментальное исследование механизма действия внутренней теназы. На настоящий момент не существует математических моделей комплекса внутренней теназы, что связано с неясностью механизма ее сборки. Ввиду того, что в модель каскада свертывания было необходимо вставить уравнение для этого комплекса, мы

провели дополнительные экспериментальные исследования по изучению механизма сборки внутренней теназы.

Рис. 2. Совместное связывание компонентов внутренней теназы с фосфолилидными везикулами.

Факторы свертывания в указанных концентрациях инкубировались с фосфолипидными везикулами (5 мкМ) при 37°С на протяжении 15 мин (А) Связывание фактора VIII в отсутствие других факторов (а) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (о), 100 нМ фактора X (д), обоих факторов IXa-EGR и X (V), ипи при активации 1 нМ тромбина (■) Сплошные линии показывают аппроксимацию экспериментальных данных стандартной гиперболической функцией (Б) Связывание IXa-EGR в отсутствие других факторов (о) или в присутствии 10 нМ фактора VIII (о), 100 нМ фактора X (Д), или же обоих факторов VIII и X (V) Вложенная панель показывает специфическое связывание IXa в присутствии других факторов (В) Связывание фактора X в отсутствие других факторов (п) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (о), 10 нМ фактора VIII (Д), факторов IXa-EGR и VIII (V), 10 нМ фактора Villa (А), или обоих факторов IXa-EGR и Villa (▼)

Чтобы изучить взаимодействие компонентов фактор Х-активирующего комплекса на фосфолипидной мембране, мы исследовали связывания меченных флуоресцеином факторов VIII, Villa, IXa-EGR и X (в различных комбинациях с немеченными факторами) с фосфолипидными везикулами, используя проточную цитометрию. Характерные кривые связывания представлены на Рис. 2. Фактор VIII связывался с 32700±5000 сайтами на везикулу с наблюдаемой Kd=76±23 нМ, активный кофактор имел близкие параметры. Связывание фактора VIII не менялось в присутствии небольших концентраций факторов IXa-EGR и X. Напротив, как очевидно из кривых связывания, аффинность фактора IXa-EGR значительно возрастала в присутствии факторов VIII и X, хотя максимальное связывание уменьшалось. Кривые связывания для IXa-EGR в присутствии фактора VIII или X не могли быть аппроксимированы односайтовой моделью связывания. По этой причине, для характеризации фактор VIII- или Х-зависимого связывания фактора IXa-EGR, мы вычитали связывание IXa-EGR в отсутствие факторов VIII или X из полного связывания, как описано в "Материалах и Методах". Аппроксимация показала, что факторы VIII и X индуцируют 1810±370 и 541 ±67 высокоаффинных сайтов для IXa, соответственно, а их комбинация индуцирует 4410±580 сайтов. Связывание фактора X не зависело от IXa-EGR, тогда как VIII и Villa увеличивали как аффинность, так и максимальное связывание. Фактор VIII (Villa) в

концентрации 10 нМ индуцировал 12630±690 (11700±3300) высокоаффинных сайтов для фактора X с Kd 14±4 нМ (16.0±0.4 нМ).

Рис. 3. Корреляция между формированием комплекса Vllla-X и скоростью активации фактора X. (А) Кинетика активации фактора X фактором 1Ха (100 пМ) в присутствии и в отсутствие фактора Villa в указанных концентрациях и фосфолилидных везикул (0 8 мкм, 10 мкМ) Фактор X присутствовал в концентрации 0 125 (■), 025 (а), 05 (•), 1 (о), 2 (А), 4 ( ), 8 ( ), 16 (V), 32 (♦), 64 (О), 128 (Ч 256 (< ) нМ (Б) Скорость активации фактора X, показанная на панели А, изображена как функция концентрации специфически связанного фактора X, полученного в параллельных экспериментах вычитанием фактор Villa-независимого связывания из полного связывания фактора X Фактор Villa присутствовал в концентрации 0 5 (■), 1 (□), 2 (•), 4 (о), 8 (4), 16 (Л), 32 (Т) нМ (В) Значения наблюдаемой константы Михаэлиса для активации фактора X внутренней теназой (30 пМ IXa, 10 мкМ фосфолипидов) построены как функция концентрации фактора Villa Средние значения (±SE) представлены для четырех экспериментов Вложенная панель показывает типичный эксперимент по активации фактора X при различных концентрациях фактора VIII.

Чтобы определить, является ли формирование комплекса Vllla-X значимым для активации фактора X, мы выполнили эксперименте по параллельной активации и связыванию фактора X в идентичных условиях (Рис. ЗА, Б), титруя концентрации факторов Villa и X. Скорость активации фактора X показана как функция концентрации фактора VIII, либо как функция величины фактор VIIIa-зависимого связывания фактора X. Обнаруженная корреляция между этими двумя параметрами предполагает, что формирование комплекса VIIIa-Х существенно для активации фактора X. Примечательно, фактор Villa в этих экспериментах присутствовал в большом избытке по сравнению с фактором IXa (0.1 пМ) и по сравнению с константой этого взаимодействия, равной 0.07 нМ. Таким образом, эти результаты не могут быть объяснены простым увеличением концентрации комплекса IXa-Villa, так как фактор IXa должен быть насыщен фактором Villa при всех рассмотренных концентрациях. Чтобы далее исследовать роль комплекса VIIIa-Х в активации фактора X, мы определили Км этой реакции как функцию концентрации фактора Villa (Рис. ЗВ). Была получена линейная зависимость, с наклоном 1.00±0.12 нМ на 1 нМ фактора Villa и внутренней Км (пересечение линии с осью ординат), равной 8.0±1.5 нМ. Эти данные подтверждают то предположение, что комплекс VIIIa-Х регулирует сборку фактор Х-активирующего комплекса. Действительно, такая

регуляция означает, что Км реакции эквивалентна Kj формирования комплекса. Тогда стехиометрия 1:1 приведет к уравнению: ^наблюдаемая )= А",/(внутрен11яя)+[УП1а]. Это должно дать наклон, равный единице, а Kj=8 нМ согласуется с этим уравнением и с наблюдаемой аффинностью взаимодействия VIIIa-X.

Подводя итог, результаты данного исследования проясняют роль комплекса VJIIa-X в сборке фактор Х-активирующего комплекса. Ранее, фактору Villa приписывались две фундаментальные функции в активации фактора X: увеличение каталитической константы реакции и увеличение количества фермента на мембране. Наши данные показывают, что, в дополнение к этим функциям, факгор Villa выполняет функцию увеличения концентрации фосфолипид-связанного субстрата. Полученные данные позволили построить математическую модель внутренней теназы, которая затем была использована при построении модели каскада свертывания

Описание модели. Модель, разработанная в данной работе, была предназначена для описания свертывания в плазме или цельной крови при активации по внешнему пути, при физиологической температуре и ионном составе (37°С, рН 7.2-7.4, 2 мМ Са++, 150 мМ NaCl), с характерными временами от минуты до нескольких часов. Модель для описания гомогенного свертывания включала 28 обыкновенных дифференциальных уравнений. Характерный вид уравнения модели показан ниже на примере уравнения для фактора Ха:

dt к*"*" " v " +

- (С ■[АТ-Ш] + к?"и \аЛ4 [а,АТ\ +С • [/>С/]0)■ [л«' ]-

- кУ -[AT-IUllxa-Va']- [к? \Ха' J-[TFPl]-к?'"[.Xa-TFPI])

где слева стоит скорость изменения концентрации факт ора Ха во времени, а справа стоят скорости его производства и ингибировакия в различных реакциях свертывания.

Просфансгвенный вариант модели представлял собой систему дифференциальных уравнений в частных производных, получающуюся из гомогенной системы путем добавления диффузионных членов и граничных условий. Модель, по существу, является двухфазной: для тех реагентов, которые находятся на мембранах активирующих клеток (ТФ, VIIa-ТФ, VII- ТФ), решались обыкновенные

дифференциальные уравнения для поверхностной плотности молекул. Для всех прочих реагентов решались уравнения в частных производных для объемных концентраций. 'Эти две фазы были связаны с помощью граничных условий.

Из принципиальных допущений модели важно отме1ить, что только тромбоциты, тромбоцитарные микровезикулы и липопротеины рассматривались как поставщики прокоагулянтных мембран в модели; вкладом остальных поверхностей в плазме пренебрегалось. Среди веществ, секретируемых тромбоцитами, в модель были включены только фактор V и протеаза нексин 2 Активация тромбоцитов, экспозиция прокоагулянтной поверхности, секреция, связывание факторов свертывания считались быстрыми событиями. Активация тромбоцитов иными активаторами, нежели тромбин, не учитывалась, так как коллаген отсутствовал в моделируемых экспериментах, а прочие физиологические активаторы не стимулируют значительной секреции и появления прокоагулянтных мембран в отсутствие межклеточных контактов.

Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания. Первым шагом в исследовании модели был выбор репрезентативных характеристических параметров для количественного анализа. Для теста генерации тромбина/фибрина существует несколько таких параметров, предложенных разными группами- время свертывания (определялось как время расщепления половины фибриногена в плазме), максимальная скорость производства тромбина, тромбиновый потенциал (площадь под кривой генерации тромбина), лаг-период генерации тромбина (время для достижения 10 нМ тромбина), время достижения максимальной концентрации тромбина, максимальная концентрация тромбина. Чтобы проверить их независимость и чувствительность, использовался корреляционный анализ. Концентрации факторов свертывания и констант по очереди изменяли до 10% или 200% от нормы, и регистрировали изменения всех шести показателей. Полученный набор данных был использован для расчета коэффициентов корреляции (Таблица 1). Они позволили разделить все параметры на две группы: 1) Л', Л, Гх; 2) Р"\ Па™*. В пределах 1рупп, наблюдалась положительная корреляция (11=0.74-0.98), в то время как корреляции между параметрами различных групп не наблюдалось (11=-0.24-(-0.45)).

Таблица 1. Матрица корреляции для показателей генерации тромбина

i'ag ^max v™» plla //amax

^clot 0.98 0.93 -0.24 -0.32 -0.34

0.95 -0.34 -0.41 -0.45

-0.41 -0.33 -0.44

ymax 0.74 0.93

plla 0.92

Анализ механизма терапевтического действия препарата NovoSeven. В настоящий момент в литературе существует противоречие, касающееся механизма терапевтического действия рекомбинантного фактора Vila (препарат NovoSeven). В 10 время как одни исследователи утверждают, что он корректирует свертывание, связываясь с ТФ и вытесняя фактор VII (Butenas et al, 2002), другие считают, что фактор Vila активирует факторы X, IX по ТФ-независимому пути на мембранах активированных тромбоцитов {Monroe et al, 1997). Мы использовали математическую модель, чтобы проанализировать эту проблему. На Рис. 4 показана теоретическая зависимость времени свертывания и максимума тромбина от концентрации добавленного фактора Vila, при этом в одной из серий расчетов ТФ-независимый механизм был отключен. Видно, что модель предсказывает два принципиально разных варианта: если эти реакции не работают, то при увеличении Vila выше 10 нМ никакого увеличения максимума тромбина пет (панель Г), а если работают, то есть (панель Д). Эксперименты, выполненные М.В. Ованесовым (панель К), показали, что справедливо второе предположение, и ТФ-независимые реакции вносят значительный вклад в генерацию тромбина.

Сравнительный аналш вкладов внутреннего и внешнего пути свертывания в пространственную динамику формирования фибринового сгустка. Ранее было показано, чю пространственная фаза роста фибринового сгустка определяется внутренней теназой (Ovanesov et al., 2002). В настоящей работе мы проанализировали эти результаты с помощью модели, а также предприняли следующий шаг. Внутренняя теназа, которая производит фактор Ха, состоит из факторов 1Ха и Villa. Фактор 1Ха может производиться либо внешней теназой, либо фактором Х1а, который активируется тромбином через петлю обратной связи. Мы предприняли попытку различить вклады этих реакций в пространственной фазе роста сгустка, используя математическую модель.

Фжгор Vtto (hM)

\ —i

• a ■ о ■ -о *

} 100

Фактор Vile (нМ)

Фактор Vila (нМ)

Рис. 4 Зависимость генерации тромбина от добавления фактора Vila в плазму больного гемофилией А Панели А-В показывают зависимость времени свертывания панели Г-Е показывают зависимость максимума тромбина На панелях А, Г показаны теоретические кривые, ТФ-независимый механизм отключен На панелях Б Д показаны теоретические кривые для цельной крови, ТФ-независимый механизм присутствует Концентрация ТФ составляет 0 (■), 1 (•), 10 (А), 30 (У), 60 (♦), 100 (-4) лМ На панелях В, Е показаны эксперименты по генерации тромбина в бедной тромбоцитами плазме (М В Ованесов, 2004) Концентрация ТФ 0 (л) 0 5 (А), 1 5 (о), 4 3 (•), 13 (п), 118 (■) пМ Показаны среднее значение и ошибка среднего для двух экспериментов

Зависимости размера сгустка от времени (Рис. 5А,Б) и скорости от концентрации фактора VIII (Рис. 5В) показываю! хорошее согласование модели и эксперимента (скорость рассчитывалась как угол наклона графика на участка 10-35 мин, прямая проводилась методом наименьших квадратов). С помощью модели, был проанализирован механизм наблюдавшегося эффекта нарушения пространственного формирования сгустка. Мы отдельно построили зависимости от времени и координаты для фактора Ха, произведенного внешней теназой (Рис. 5Г), внутренней теназой (Рис. 5Д), и обеими (Рис. 5Е). В то время, как сделанный внешней теназой фактор Ха расположен вблизи от активатора и быстро ингибируется (Рис. 5Г), сделанный внутренней теназой фактор распространяется вдаль от активатора и определяет формирование сгустка (Рис. 5Д).

Чтобы определить относительный вклад внешней теназы и фактора Х1а в формирование фактора 1Ха, были проведены исследования в плазме, дефицитной по фактору XI. Эксперименты и расчеты производились в полной аналогии с экспериментами в плазме, дефицитной по фактору VIII, с тем исключением, что для активации использовались макрофаги вместо фибробластов с тем, чтобы подчеркнуть вклад внутреннего пути.

Рис. 5 Вклад внутреннего и внешнего пути в формирование фактора Ха в плазме (Л, 6) Размер сгустка как функция времени в плазме больного гемофилией А, восполненной нормальной плазмой, при активации монослоем фибробластов, эксперимент (А) и расчеты (Б) Содержание нормальной плазмы было 0, 1, 5, 10, 20, 40, 100% (снизу вверх) Плотность фибробластов в расчете была 1000 клеток/мм2 (в) Скорость роста сгустка как функция концентрации фактора VIII, для эксперимента (символы) средние значения и ошибки среднего даны для п=4 экспериментов Сплошная линия показывает результаты расчетов (Г-Е) Теоретические профили фактора Ха, выработанного внешней теназой (Г), внутренней теназой (Д, или обеими (Е) в нормальной плазме Экспериментальные данные взяты из (Ованесов, 2002)

Рис. 6А-В показывает согласование модели и эксперимента. Не только фаза инициации, но и фаза распространения свертывания практически не отличается в норме и в отсутствие фактора XI. Только после 25-30 мин, на расстоянии ~0.7 мм от активатора, появляется разница (в отсутствие фактора VIII она возникает после 5-10 мин и на расстоянии -0.3 мм). Тем не менее, на этих поздних стадиях в отсутствие фактора XI возникает замедление. По аналогии с Рис. 6, панели Г-Е на Рис. 6 разделяют вклад внешней теназы и фактора Х1а в производство фактора 1Ха в норме. Видно, что в противоположность фактору Ха, фактор 1Ха, в основном производится внешней теназой (ср. Рис. 6Д и Е) и доставляется в плазму диффузией. С большой вероятностью, эту разницу можно объяснить низкой скоростью ингибирования фактора 1Ха в плазме, которая позволяет эффективную диффузию. На последующих стадиях далеко от активатора фактор ГХа производится фактором Х1а (Рис. 6Д).

В качестве дополнительной проверки, были проведены расчеты с уменьшение коэффициента диффузии фактора 1Ха в 100 раз, что привело к ухудшению формирования сгустка в пространстве, почти как в гемофилии (прерывистая линия на Рис. 6Б). Напротив, 100-кратное уменьшение коэффициента диффузии фактора Ха не изменило скорости роста, и даже ускорило фазу инициации (сплошная линия).

Анализ профилей фактора Ха (не показаны) предполагает, что это обусловлено ускорением накопления фактора Ха около активатора при нарушенной диффузии.

Рис. 6 Роль активации фактора XI тромбином в пространственной динамике свертывания (А, Б) Размер сгустка как функция времени в плазме нормальной (о) фактор Xl-дефицитной (о), фактор Vlll-дефицитной (Д) эксперимент (А) и расчеты (Б) Сплошная и преоывистая линия на панели Б показывают расчеты по росту сгустка в нормальной плазме, где коэффициент диффузии фактора Ха или фактора 1Ха, соответственно уменьшен в 100 раз Активация в эксперименте выполнялась макрофагами, в модели фибробластами с плотностью 250 клеток/мм2 (В) Скорость роста сгустка вдали от активатора (на 30-40 мин) как функция концентрации фактора XI, для эксперимента (символы) средние значения и ошибки среднего даны для л=2-4 экспериментов Сплошная линия показывает результаты расчетов (Г■£) Теоретические профили фактора |Ха, выработанного внешней теназой (Г), фактором Xla (Д), или обоими (Е) в нормальной плазме Эксперименты выполнены М В Ованесовым (2004)

Исследование влияния тромбомодулина на остановку роста фибринового сгустка. В любых исследованных условиях, формирование сгустка в пространстве в нашей экспериментальной модели не прекращалось на протяжении всего эксперимента. Если мы считаем, что рассматриваемая экспериментальная система (и примыкающая к ней математическая модель) представляет собой модель свертывания в организме, то это кажется не вполне физиологичным, так как из общих соображений очевидно, что сгусгок in vivo должен быть локализован. Одним из наиболее важных элементов гемостаза, отсутствующих в данной экспериментальной постановке, являются эндотелиальные клетки, экспрессирующие антикоагулянты, в т.ч. тромбомодулин. Чтобы имитировать эффект эндотелия, мы провели расчеты с добавлением тромбомодулина в систему (от 100 до 3 нМ), и обнаружили, что это действительно ведет к остановке роста сгустка на расстоянии 0.2-1 мм от активатора (Рис. 7). На основании этих расчетов в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН были проведены эксперименты,

результаты которых совпали с предсказаниями модели (Рис. 7Б). Рис. 7А показывает, что при средних концентрациях (10 нМ), тромбомодулин не влияет на инициацию свертывания, но останавливает его неограниченное распространение.

Рис. 7. Рост сгустка и регуляция его размера тромбомодулином. (А) Расчетный размер сгустка от времени при свертывании в нормальной плазме с добавлением тромбомодулина в концентрации 0 (-з), 10 ('■) 100 (А) нМ (Б) Окончательный размер сгустка как функция концентрации тромбомодулина расчет (сплошная линия) и эксперименты (символы о, о, д означают опыты с 3 разными донорами Эксперименты выполнены Д А Киреевым (2003)

1. 11редложен механизм регуляции внешнего пути свертывания крови ингибитором пути тканевого фактора, объясняющий ранее необъясненные экспериментальные данные.

2. Показано экспериментально, что фактор Villa связывает фактор X на фосфолипидных мембранах и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой.

3. Построена оригинальная математическая модель свертывания крови, активированного по внешнему пути, количественно описывающая процесс свертывания как в гомогенной, так и в пространственной экспериментальных постановках.

4. Проанализирована чувствительность и независимость параметров теста генерации тромбина и показано существование только двух полностью независимых типов параметров.

5. Оценен вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого механизмов действия препарата NovoSeven в нормализацию генерации тромбина в плазме больных i емофилией и показано, что при физиологических условиях главным является вклад ТФ-независимого механизма. Представлено теоретическое обоснование терапевтической эффективности гипердоз препарата NovoSeven.

6. Доказано, что пространственный рост сгустка определяется выработкой активированного фактора X внутренней теназой, однако активированный фактор IX производится преимущественно по внешнему пути.

ВЫВОДЫ

7. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лобанова Е.С., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Пространственная динамика роста сгустка в условиях кровотока. III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня, 2004 (Труды..., т. I, стр. 352-353).

2. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Морозова O.JL, Лобанов А.И., Ованесов М.В., Коротина Н.Г., Лобанова Е.С., Атауллаханов Ф.И.. Математическое моделирование пространственно-временной динамики свертывания крови, Труды чежд конф "Параллельные вычисления и задачи управления", Москва 2001; секция 6: стр. 54-78.

3. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Атауллаханов Ф.И. Регуляция начальной стадии свертывания крови ингибитором пути тканевого фактора. Конф. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 24-26 октября 2001 г. (Труды ..., стр. 87-88).

4. Пантелеев М.А.. Регуляция начальной стадии свертывания ингибитором пути тканевого фактора, Тромбоз, гемостаз и реология 2002; (1): стр. 94-97.

5. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Атауллаханов Ф.И.. Математическая модель для тестов активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и разбавленного тромбопластинового времени (РТВ). VII национальная конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза", Москва, 27-29 марта 2002 г. (Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, 2002, Приложение 1, стр. 9899).

6. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Атауллаханов Ф.И.. Математическое моделирование пространственной динамики свертывания крови. I Всероссийский съезд гематологов. Москва, 16-18 апреля 2002 г. (Проблемы гематологии и переливания крови, 2002 г., н. 1, стр. 67).

7. Пантелеев М.А., Саенко Е.Л., Атауллаханов Ф.И. Кинетика активации фактора Ха мембранно-связанным комплексом факторов 1Ха и Villa. Конф. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г. (Труды ..., стр. 108-109).

8. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Атауллаханов Ф.И.. Математическая модель пространственной динамики свертывания крови. 1-я Всероссийская Конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 5-6 февраля 2003 г. (Труды ..., стр. 71).

9. Самойлов A.M., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Зависимость интенсивности светорассеяния фибринового сгустка от концентрации фибриногена в плазме крови. Конф. "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г. (Труды ..., стр. 124).

10. Токарев А.А., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Редукция математической модели свертывания крови. III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня, 2004 (Труды... т. I, стр. 384-386)

11. Ovanesov M.V., Ananyeva N.M., Panteleev М.А., Ataullakhanov F.I., Saenko E.L. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J. Thromb Haemost 2005; 3(2): 321-331.

12. Panteleev M.A., Zarnitsina V.I. , Ataullakhanov F.I. Tissue factor pathway inhibitor: a possible mechanism of action, Eur. J Biochem 2002; 269(8): 2016-2031.

13. Panteleev M.A.,.Zarnitsina V.I, Ataullakhanov F.I.. A possible mechanism of action of tissue factor pathway inhibitor. The 3rd Annual Conference on Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, Salt-Lake-City, Utah, April 6-8, 2002 (Proceedings of •■■> P-98).

14. Panteleev M.A., Zarnitsina V.I., Ataullakhanov F.I. Mathematical model of blood coagulation. The V International Congress on Mathematical Modeling, Dubna, Moscow Region, September 30-0ctober 6, 2002 (Proceedings of.... p. 218).

15 Panteleev M.A., Ovanesov M V., Ataullakhanov F.I. The mechanism of action of high-dose factor Vila in preventing bleeding in hemophilia. Computational simulation studies. XIX Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Birmingem, UK, July 12-18, 2003 (the abstract: Journal of Thrombosis and Haemostasis 2003; Supplement 1: P. 1618).

16. Panteleev M.A., Saenko E.L., Ananyeva N.M.. Ataullakhanov FI. Kinetics of factor X activation by the membrane-bound complex of factor IXa and factor Villa. Biochem. J. 2004; 381(3): 779-794.

17. Panteleev M.A., Saenko E.L., Ataullakhanov F.I. Kinetics of factor X activation by membrane-bound complex of factor IXa and factor Villa. XIX Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Birmingem, UK, July 12-18, 2003 (the abstract: Journal of Thrombosis and Haemostasis 2003; Supplement 1: P.1066).

ООП МГУ. Заказ 56-100-05

РНБ Русский фонд

2005-4 45432

- i ,

I V I i Í \ ? i /

1 яоч

2 2 ДПР 2005 .

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пантелеев, Михаил Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современные представления о системе свертывания крови.

1.1.1 Структура и функционирование системы гемостаза человека.

1.1.2 Тромбоцитарное звено гемостаза.

1.1.3 Плазменное звено гемостаза.

1.1.4 Роль сосудистой стенки в гемостазе.

1.2 Экспериментальные модели свертывания крови.

1.3 Математические модели свертывания крови.

1.3.1 Качественные и феноменологические модели.

1.3.2 Количественные и механизменные модели.

1.3.3 Учет диффузии и кровотока в моделях свертывания.

1.4 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.

2.1 Подходы, использованные для описания ферментативных реакций.

2.1.1 Общая структура модели.

2.1.2 Кинетика многосубстратных реакций с избытком фермента над субстратом.

2.1.3 Математическое описание взаимодействия факторов свертывания с мембранами тромбоцитов.

2.1.4 Вывод граничных условий для факторов, взаимодействующих с поверхностью.

2.2 Численный метод и его программная реализация.

2.3 Расчет коэффициентов корреляции и контроля.

2.5 Экспериментальные методы и материалы исследования.

2.5.1 Материалы.

2.5.2 Эксперименты по связыванию факторов свертывания с фосфолипидными везикулами.

2.5.3 Эксперименты по активации фактора X.

ГЛАВА 3. ПОСТРОЕНИЕ МОДЕЛИ.

3.1 Построение моделей отдельных реакций системы свертывания.

3.1.1 Ингибирование внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора.

3.1.2 Активация фактора X внутренней теназой.

3.2 Построение математической модели системы свертывания крови.

3.2.1 Допущения и условия применимости гомогенной модели.

3.2.2 Допущения и условия применимости пространственной модели.

3.2.3 Построение модели и сравнение с экспериментом.■.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ВНУТРЕННЕЙ ТЕНАЗЫ.

4.1 Связывание факторов VIII, VIIIa, IXa и X с фосфолипидными везикулами.

4.2 Роль комплекса VIIIa-X в активации фактора X внутренней теназой.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛИ.

5.1 Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания.

5.2 Анализ пороговых свойств системы свертывания.

5.3 Анализ механизма терапевтического действия препарата NovoSeven.

5.4 Сравнительный анализ вкладов внутреннего и внешнего пути свертывания в пространственную динамику формирования фибринового сгустка.

5.5 Исследование эффекта тромбомодулина на остановку роста фибринового сгустка.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах"

Свертывание крови является одним из элементов системы гемостаза, функция которой заключается в предотвращении потери крови при повреждении сосудистой системы. Нарушение целостности стенки сосуда приводит к активации свертывания, сложнейшего процесса, в который вовлечено свыше пятидесяти белков, а также клетки крови и сосудистой стенки. Этот процесс приводит к локальному переходу крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе повреждения и остановке кровотечения благодаря сформированному сгустку. Любой сдвиг в деликатном балансе свертывания крайне опасен для организма, угрожая либо повышенной кровоточивостью, либо тромбозом, что делает изучение свертывания одной из приоритетных задач биохимии, биофизики и медицины.

Исследования, проводившиеся на протяжении последних десятилетий, привели к качественному изменению представлений о свертывании крови. В настоящий момент можно довольно уверенно утверждать, что устройство этой системы сравнительно хорошо известно: в последний раз новые белки в свертывании были открыты в конце 80-х годов XX века, а последние реакции обнаружены в начале 90-х. Несмотря на напряженную работу тысяч лабораторий во всем мире, за последние десять лет новых участников в каскаде свертывания ф обнаружено не было. Однако, знание устройства системы не означает понимания ее функционирования и далеко не всегда помогает определить правильный способ скорректировать то или иное нарушение. Именно поэтому все больше и больше работ в последние годы посвящается изучению разнообразных экспериментальных in vitro, in vivo и ex vivo моделей свертывания с целью понять, как оно функционирует и как можно на него воздействовать.

В силу сложности этой системы, обусловленной огромным количеством белковых и клеточных участников, наличием диффузии и потока крови, математические модели являются крайне перспективным методом исследования функционирования гсмостаза. Однако, существующие на настоящий момент математические модели большей частью не сравнивались с экспериментом и не включают многих существенных реакций. Далее, многие принципы устройства опубликованных моделей сильно устарели и сейчас нуждаются в уточнении, или даже были признаны неправильными.

Целью настоящей работы было построение новой количественной модели свертывания крови, способной успешно описать экспериментальные данные, и ее применение для изучения регуляции системы свертывания. В качестве объекта моделирования были выбраны две экспериментальные модели гемостаза. Первой моделью был тест генерации тромбина, в котором свертывание в плазме или в цельной крови активируется тканевым фактором (ТФ) и регистрируется изменение активности тромбина со временем. Второй моделируемой системой была разработанная в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН методика по исследованию пространственного формирования фибринового сгустка в тонком, неперемешиваемом слое рекальцифицированной плазмы при активации свертывания монослоем клеток, экспрессирующих ТФ. Первая модель была выбрана из-за того, что она является одним из самых эффективных и популярных методов, применяющихся как для фундаментальных исследований свертывания, так и для клинической диагностики. Чувствительность этой модели к различным изменениям в системе свертывания может быть исследована с помощью метода коэффициентов контроля в варианте, адаптированном для нестационарных систем. Вторая же экспериментальная постановка наиболее воспроизводимо и точно отображает пространственные аспекты свертывания, столь существенные in vivo, позволяя изучать роли как различных реакций, так и диффузии различных факторов в формирование сгустка.

В качестве наиболее актуального приложения модели было исследовано влияние на свертывание рекомбинантного активированного фактора VII и тромбомодулина. Первое из этих веществ успешно используется в терапии гемофилий и других геморрагических заболеваний свертывания (коммерческое название NovoSeven®, Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), в то время как растворимый тромбомодулин (Solulin) сейчас предлагается использовать для лечения тромбозов. Однако, механизм действия обоих препаратов не вполне ясен, и прояснение его способно внести вклад в стратегию терапии, использующей эти препараты.

Задачи исследования:

Научная новизна. Предложен механизм действия ингибитора пути тканевого фактора, позволяющий объяснить ранее необъясненные наблюдения. Экспериментально показано, что фактор Villa связывает фактор X и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой. Построена новая оригинальная математическая модель свертывания крови, отвечающая современным биохимическим представлениям и успешно описывающая большой набор экспериментальных данных из литературы. В этой модели учтены такие важные реакции, как активация факторов X и IX активированным фактором VII в присутствии активированных тромбоцитов, тромбоцит-зависимая активация фактора XI тромбином, секреция тромбоцитов, регуляция комплекса внешней теназы и активированного фактора X ингибитором пути тканевого фактора, и многие другие, которые отсутствуют в ранее опубликованных моделях свертывания. С помощью модели проведен анализ чувствительности и информативности теста генерации тромбина. Показан неизвестный ранее различный механизм работы внутреннего и внешнего путей в фазе распространения свертывания: установлено, что активированный фактор X производится внутренней теназой, тогда как фактор IX активируется по внешнему пути и распространяется в пространстве путем диффузии. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментально. Обнаружено, что вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого действия препарата NovoSeven в нормализацию свертывания в плазме больных гемофилией зависит от условий эксперимента, однако физиологическое формирование сгустка определяется преимущественно ТФ-независимым механизмом.

Научно-практическое значение. Полученные результаты по кинетике и регуляции реакций, катализируемых внутренней и внешней теназами могут иметь значение для клинических и биохимических исследований свертывания. Построенная модель может быть использована в качестве инструмента для планирования и анализа экспериментов по биохимии свертывания крови, а также для исследования механизмов действия препаратов, воздействующих на свертывание. Результатом исследования модели является вклад в понимание регуляции системы свертывания и механизмов . действия препаратов, направленных на коррекцию гемостаза, что может как иметь значение для экспериментальных исследований свертывания, так и дать базу для терапевтической стратегии при использовании этих препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пантелеев, Михаил Александрович

Выводы

1. Предложен механизм регуляции внешнего пути свертывания крови ингибитором пути тканевого фактора, объясняющий ранее необъясненные экспериментальные данные.

5. Оценен вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого механизмов действия препарата NovoSeven в нормализацию генерации тромбина в плазме больных гемофилией и показано, что при физиологических условиях главным является вклад ТФ-независимого механизма. Представлено теоретическое обоснование терапевтической эффективности гипердоз препарата NovoSeven.

Благодарности

Эта работа была бы невозможна без помощи и поддержки со стороны моих коллег, которым я хотел бы выразить свою глубокую и искреннюю признательность. Я хочу поблагодарить коллектив лаборатории физической биохимии системы крови, в особенности группы свертывания: Андрея Александровича Бутылина, Веронику Игоревну Зарницину, Василия Ивановича Сарбаша, Елену Ивановну Синауридзе, Александру Валерьевну Похилко; сотрудников гемофилического центра ГНЦ РАМН: Елену Геннадьевну Лопатину и руководителя гемофилического центра Ольгу Павловну Плющ; сотрудников лаборатории Дж. Холланда, Американский Красный Крест: Евгения Львовича Саенко, Наталью Михайловну Ананьеву, Николаса Греко, Джеймса Куртца и Андрея Сарафанова. Я хотел бы особо поблагодарить Михаила Ованесова, Дмитрия Киреева и Людмилу Ивановну Ульянову за работу по экспериментальной проверке предсказаний математической модели, а также Екатерину Лобанову, Николая Пешкова, Алексея Токарева и Алексея Шибеко, которые использовали построенную модель в своих исследованиях, за выявленные при этом недочеты. Для меня большое удовольствие поблагодарить моего научного руководителя, Фазоила Иноятовича Атауллаханова, за его постоянное внимание, помощь и поддержку, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пантелеев, Михаил Александрович, Москва

1. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 1996.

2. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: Lippincott Company, 1994.

3. Butenas S, Branda RF, van't Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost 2001; 86: 660-667.

4. Mann KG, Brummel K, Butenas S. What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003;1: 1504-1514.

5. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 3-12.

6. Балуда ВП, Балуда MB, Деянов ИИ, Тлепшуков ИЛ. Физиология системы гемостаза. Москва: 1995.

7. Heemskerk JW, Bevers ЕМ, Lindhout Т. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88: 186-193.

8. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227: 113-129.

9. Smith RD, Owen WG. Platelet responses to compound interactions with thrombin. Biochemistry 1999; 38: 8936-8947.

10. Bajzar L. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and an antifibrinolytic pathway. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000; 20: 2511-2518.

11. Solum NO. Procoagulant expression in platelets and defects leading to clinical disorders. Arterioscler Thromb Vase Biol 1999; 19: 2841-2846.

12. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim Biophys Acta 1998; 1376: 433-453.

13. Gilbert GE, Sims PJ, Wiedmer T, Furie B, Furie ВС, Shattil SJ. Platelet-derived microparticles express high affinity receptors for factor VIII. J Biol Chem 1991; 266: 17261-17268.

14. Bouchard BA, Tracy PB. Platelet regulation of thrombin generation in cardiovascular disease. Ital Heart J 2001; 2: 819-823.

15. Monroe DM, Hoffman M, Oliver JA, Roberts HR. Platelet activity of high-dose factor Vila is independent of tissue factor. Br J Haematol 1997; 99: 542-547. Hedner U. Recombinant factor Vila (NovoSeven) as a hemostatic agent. Dis Mori 2003; 49: 39-48.

16. Brummel K, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100: 148-152.

17. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35: 1904-1910.

18. Nesheim ME, Tracy RP, Mann KG. "Clotspeed," a mathematical simulation of the functional properties of prothrombinase. J Biol Chem 1984; 259: 1447-1453.3134,35,36,37,38,3940,4144

19. Fay PJ. Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action. Blood Rev 2004; 18: 1-15.

20. Moyer MP, Tracy RP, Tracy PB, van't Veer C, Sparks CE, Mann KG. Plasma lipoproteins support prothrombinase and other procoagulant enzymatic complexes. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; 18: 458-465.

21. Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. J Biol Chem 1985; 260: 2119-2124. Andrews DA, Low PS. Role of red blood cells in thrombosis. Curr Opin Hematol 1999; 6: 76-82.

22. Gailani D, Broze GJ, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-912.

23. Gailani D, Ho D, Sun MF, Cheng Q, Walsh PN. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential. Blood 2001; 97: 31173122.

24. Solymoss S, Tucker MM, Tracy PB. Kinetics of inactivation of membrane-bound factor Va by activated protein C. Protein S modulates factor Xa protection. J Biol Chem 1988; 263: 14884-14890.

25. Heeb MJ, Mesters RM, Tans G, Rosing J, Griffin JH. Binding of protein S to factor Va associated with inhibition of prothrombinase that is independent of activated protein C. J Biol Chem 1993; 268: 2872-2877.4548,49.50,51,52,53,54,55,56

Информация о работе

Пантелеев, Михаил Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы