Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс

Шибеко, Алексей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс"

На правах рукописи

00348

ШИБЕКО Алексей Михайлович

Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 Г) г\ц Т ^П']

Москва 2009

003481249

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

профессор А.И. Лобанов;

доктор физико-математических наук, В.Н. Буравцев

Ведущее учреждение - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится " " КО&ЬрА 2009 г. в ^ час, на заседании диссертационного совета Д001.042.02 в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан " " 02009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основная функция свертывания крови - остановка кровотечения при нарушении целостности сосудистого русла, вызываемого как внешним повреждением, так и различными внутренними микротравмами, постоянно возникающими в организме. Система свертывания крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, однако большая ее часть является регуляторной, управляющей для главной реакции свертывания - образования фибрина и его полимеризации. Именно эта реакция превращает кровь в гель, закрывающий место повреждения и останавливающий кровопотерю. Смысл существования всей остальной системы свертывания в том, чтобы этот переход был осуществлен при строго определенных условиях и строго определенным образом: при наличии сильного активирующего сигнала, в месте повреждения, не распространяясь за его пределы, образуя плотный сгусток, быстро затыкая дыру. При этом не нужно забывать, что система свертывания функционирует в довольно сложных условиях: вязкая кровь течет по сосуду, в котором на стенке имеется область, активирующая свертывание. В зоне, граничащей с ней, происходят начальные реакции свертывания, активируются ферменты, которые с диффузией и переносом потоком проникают в соседние области. Появляется сгусток, практически непроницаемый для потока; сгусток изменяет форму течения жидкости. Как будет вести себя система свертывания в таких условиях? Какие факторы будут управлять образованием сгустка? Что будет решать - произойдет остановка кровотечения или нет? Данная работа - попытка ответить на эти вопросы, основанная на компьютерном моделировании, подкрепленном in vitro экспериментами. В силу большой сложности и многоступенчатости системы свертывания, эта работа ограничена исследованиями фазы начального появления сгустка.

На текущий момент имеется ряд работ, посвященных математическому моделированию свертывания крови в потоке. В них показано, что поток ухудшает образование сгустка: при сильном потоке свертывание может не начаться. Однако, использованные в части работ феноменологические и редуцированные модели свертывания не позволяют сделать заключений о том, какие механизмы в системе свертывания крови обеспечивают ее чувствительность к потоку. В других работах используются детальные, но не верифицированные модели свертывания, и не проводится исследования функций различных реакций системы свертывания крови.

В данной работе был применен новый подход в использовании математического моделирования для исследования сложных биохимических систем. За основу была взята детальная модель свертывания плазмы крови, разработанная в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН. Данная модель описывала реакционно-диффузионную систему, в которой свертывание активировалось при контакте с поврежденной поверхностью сосуда. Эта модель давала количественное согласие с множеством in vitro экспериментов. Она была модифицирована, чтобы описывать образование сгустка в условиях потока. После этого исправленная модель использовалась как инструмент исследования системы свертывания.

Использование математической модели позволяло проводить такие численные эксперименты, которые в принципе невозможно провести in vitro, как, например, отключение переноса потоком отдельных факторов свертывания, или изменение скорости определенных реакций, в которых участвует фермент. Такой подход позволял выяснять роль отдельных реакций в формировании нужного ответа системы, находить механизмы, регулирующие проведение свертывания в различных условиях.

Цель работы: изучить механизмы, определяющие влияние потока плазмы крови на начальные этапы образования фибринового сгустка.

Задачи исследования:

1. Основываясь на детальной реакционно-диффузионной модели свертывания крови, разработать двумерную модель свертывания, учитывающую поток, изменяемый образующимся сгустком.

2. Детально разобрать процесс формирования сгустка (полимеризации фибрина); построить его in vitro модель и провести ее экспериментальную верификацию; выяснить, в каких режимах может протекать полимеризация фибрина.

3. Используя данные о режимах полимеризации фибрина, исследовать первоначальное образование сгустка в условиях потока, выяснить механизмы, отвечающие за регуляцию данного процесса.

4. Предложить схему проведения in vitro экспериментов для верификации гипотезы о механизме, определяющем чувствительность плазменной системы свертывания крови к скорости потока плазмы крови.

агрегация с образованием оптически плотных фибрилл. Для верификации модели была проведена серия in vitro экспериментов. С помощью модели предсказано существование порога в образовании сгустка, выраженного в том, что ненулевые количества активированного фибрина в присутствии фибриногена не образуют сгустка. Был предложен механизм, отвечающий за подобное поведение системы полимеризации фибрина: обратимое формирование комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина задерживает рост последних и не позволяет им образовывать сгусток в течение времени расчета. Во второй части работы разработана оригинальная двумерная детальная модель свертывания в потоке, учитывающая, что образующийся сгусток является непроницаемым для потока и тем самым меняет его форму. С помощью этой модели было исследовано влияние потока на свертывание плазмы крови; было продемонстрировано, что поток может увеличивать время инициации свертывания, причем зависимость времени инициации свертывания от сдвиговой скорости потока имеет нелинейный характер, что подтверждается экспериментальными данными. Было выяснено, что ингибирующее действие потока связано с переносом активного фактора Ха и тромбина, и предложена гипотеза, что это может быть связано с ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы фактором Ха (вызванным уменьшением концентрации фактора Ха из-за его переноса потоком). Предложен ряд экспериментов по проверке этой гипотезы.

Научно-практическое значение. Полученные результаты, свидетельствующие о наличии порога при полимеризации фибрина, могут иметь значение для клинических и биохимических исследований, связанных со свертыванием крови, его патологиями и методами их лечения. Построенная модель полимеризации фибрина может стать частью большой модели свертывания, учитывающей не только плазменное свертывание, но и тромбоцитарное. Разработанная модель свертывания плазмы крови в потоке может быть использована для анализа механизмов действия препаратов, влияющих на свертывание, в условиях, приближенных к физиологическим. Открытый с ее помощью эффект влияния потока на протекание некоторых реакций свертывания может быть важен при разработке новых лекарственных средств, стратегий их использования.

Положения, выносимые на защиту:

1. Построена детальная in virio модель полимеризации фибрина, проведена ее экспериментальная верификация.

2. С помощью разработанной модели полимеризации фибрина предсказано пороговое поведение образования фибринового сгустка.

3. Разработана детальная двумерная модель свертывания плазмы крови в потоке, учитывающая влияние образующегося сгустка на форму течения.

4. Показано, что эффект ингибирования свертывания потоком вызывается вымыванием активного фактора Ха и связанным с этим ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы - комплекса, инициирующего свертывание.

Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на первой международной конференции "Математическая Биология и Биоинформатика" (Пущино, октябрь 2006), на XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Geneva, Швейцария, июль 2007), на 11th International School-Conference of young scientists in Puschino (Пущино, октябрь 2007), на международной конференции Modeling of Blood Diseases (Lyon, Франция, ноябрь 2007), на 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Wein, Австрия, февраль 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 тезисов в сборниках трудов 9 конференций и 1 статья.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 —■ описания экспериментальных и теоретических результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов, двух приложений (состоящих из уравнений разработанных моделей) и библиографического указателя, включающего 116 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Исследование полимеризации фибрина.

Модель полимеризации фибрина, разработанная в данной работе, представляла собой систему дифференциальных уравнений, переменными которой были концентрации фибриногена и его производных, тромбина и антитромбина III. Модель обладала следующими особенностями:

1) Активация фибриногена происходит в 2 этапа;

2) Мономеры фибрина собираются в олигомеры;

3) Олигомеры N-ro порядка переходят в протофибриллы, которые латерально агрегируют, образуя фибриллы, или присоединяются к уже существующим;

4) Фибриноген и полуактивированный фибрин обратимо образуют комплексы со всеми олигомерами.

Система обыкновенных дифференциальных уравнений решалась методом Эйлера.

Реагенты: БСА (бычий сывороточный альбумин) был приобретен в Sigma (St. Louis, МО, USA). РРАСК (Фен-Про-Арг-хлорометил кетон) был приобретен в Calbiochem (Darmstadt, Germany).

Белки: В экспериментах использовался бычий фибриноген (Sigma, St. Louis, МО, USA), очищенный диализом. Его концентрация определялась при помощи спектрофотометра AMINCO DW-2a по коэффициенту экстинкции А°с™'= 1.523. Человеческий а-тромбин был приобретен в Haematologic Technologies (Essex Junction, VT, USA). Активность тромбина определялась титровкой активных сайтов с помощью РРАСК.

Эксперименты проводились в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах. После активации фибриногена тромбином (конечная концентрация 0.5 нМ) при помощи ридера Thermo Multiskan Ascent регистрировалась кинетика изменения оптической плотности раствора на длине волны 405 нм. Измерения проходили при температуре 37°С, перед этим образцы инкубировались при данной температуре в течение 7 минут.

Исследование воздействия потока на систему свертывания.

Модель свертывания плазмы крови в условиях потока состояла из дифференциальных уравнений в частных производных, описывающих изменение концентрации реагента со временем из-за его диффузии, переноса потоком и участия в химических реакциях. Конечным итогом реакций описываемой системы был фибриновый сгусток, непроницаемый для потока. Этот сгусток изменял форму течения в моделируемой области. Для нахождения новой формы потока решались уравнения Навье-Стокса. Полученные с их помощью значения скоростей использовались в уравнениях типа реакция-диффузия-конвекция, в которых и определялись концентрации веществ.

Моделирование проводилось в двумерной области размером 1000 на 6000 мкм. Жидкость считалась вязкой и несжимаемой. Левая граница области представляла собой приток, правая - отток. Верхняя и нижняя границы области представляли собой физические границы, на которых выполнялись условия прилипания, т.е. на них скорость жидкости равнялась нулю. На входе и выходе было условие постоянства давления. Уравнения Навье-Стокса решались численно, методом

Кобелькова. Этот метод предполагает использование трех не совпадающих друг с другом сеток для вычисления двух компонент скорости и давления.

Уравнения типа реакция-диффузия-конвекция, описывающие изменение концентрации реагентов, решались при помощи метода переменных направлений.

При расчетах были использованы следующие допущения, касающиеся процесса образования фибринового сгустка и его взаимодействия с потоком. Во-первых, скорость полимеризации фибрина считалась достаточно высокой для того, чтобы пренебречь сносом фибрина потоком. Т.е., сгусток оставался там, где он образовывался. Во-вторых, проницаемость фибринового сгустка для потока зависела от концентрации фибрина. Если она была ниже некоторого значения (точки гелеобразования, значение этой величины было выбрано равным 450 нМ), то проницаемость была равна 1 (сгусток полностью проницаем для потока), и она уменьшалась до 0 (сгусток полностью непроницаем для потока), когда концентрация фибрина превосходила критическое значение.

В расчетах было необходимо сопрягать меняющееся поле скоростей с изменяющимся распределением реагентов. Связать изменения в поле скоростей с изменением концентраций реагентов можно используя квазистационарный подход, учитывающий тот факт, что скорость установления стационарного потока жидкости много больше скорости роста сгустка. Это позволило решать уравнения Навье-Стокса независимо от уравнений, описывающих изменение концентраций химических реагентов. При решении уравнений Навье-Стокса методом разнесенных сеток, вся область была разбита на ячейки. Как только концентрация фибрина в ячейке превосходила критическую, ячейка становилась непроницаемой для потока. Когда число заполненных ячеек превосходило п (в расчетах использовалось п=25), решались уравнения Навье-Стокса с новыми условиями (в заполненных ячейках скорость потока равна 0). Полученные значения скоростей использовались в уравнениях для расчета концентраций реагентов.

Для определения реакций, ответственных за регуляцию свертывания потоком, был введен параметр, характеризующий длину фазы инициации свертывания. Лагтайм был определен как временной интервал между контактом плазмы с тканевым фактором и моментом, когда сгусток закрывает более половины активатора. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока, измеренная при нормальных условиях, позволила отслеживать изменения, вызываемые различными переменами в системе. Для количественного описания зависимости лагтайма от сдвиговой скорости потока были введены коэффициенты С*_] (общее ингибирование

свертывания потоком в интервале сдвиговых скоростей i-j) и R' (нелинейность этого ингибирования).

Результаты

Моделирование полимеризации фибрина.

В серии экспериментов in vitro фибриноген активировался тромбином. Концентрация тромбина была одинаковой (0,5 нМ), а концентрация фибриногена варьировалась в диапазоне 0,5 мкМ-70 мкМ (Рис. 1А.). После добавления тромбина начиналось образование сгустка, которое регистрировалось по изменению оптической плотности на длине волны 405 нм. Для количественной характеристики кинетики оптической плотности были введены два параметра: лагфаза и максимальная оптическая плотность в конце эксперимента (на 40-й минуте) (Рис. 1Г, нормировано на максимальное значение для серии экспериментов).

40 35

х30 S

2 25

5 20 •ея 15 с:

10 5 0

Эксперимент (п=3) -Модельный расчет

0 10 20 30 40 50 60 70 Начальная концентрация фибриногена, мкМ

Эксперимент (п«3) - Модельный расчет

10 20 30 40 50 60 70

Начальная концентрация фибриногена, мкМ

Рис. 1. Кинетика оптической плотности фибринового сгустка при разных начальных концентрациях фибриногена (эксперимент и модельный расчет)(А и Б). Концентрация тромбина 0.5нМ. (В) Зависимость лагфазы от начальной концентрации фибриногена (эксперимент и модельный расчет). (Г) Зависимость финальной оптической плотности (нормировано на максимальное значение для серии экспериментов) от начальной концентрации фибриногена (эксперимент и модельный расчет).

Если на Рис. 1. проследить, как изменяется вид кривой светорассеяния при увеличении начальной концентрации фибриногена, то можно увидеть, что сначала

лагфаза практически не меняется, но, начиная с концентрации 9 мкМ, она увеличивается, и дальше, чем больше фибриногена имеется в начале, тем длиннее лагфаза. Конечный уровень сигнала растет по мере увеличения концентрации фибриногена, однако в случаях с большой концентрацией фибриногена (кривые 1-4) он не успевает выйти на стационар. Для кривых 1-2, из-за большой лагфазы, его уровень оказывается даже ниже, чем для кривой 3. Зависимость максимальной оптической плотности в конце эксперимента (на 40-й минуте) (Рис. 1Г, нормированные значения) от начальной концентрации фибриногена демонстрирует, что сгусток образуется в любом случае, правда при больших концентрациях фибриногена его образование замедлено (это видно и на Рис.1 А, где рост оптической плотности при больших концентрациях фибриногена начинается заметно позже).

В модельных расчетах зависимость времени появления сгустка от начальной концентрации фибриногена также имеет минимум. Результаты моделирования представлены на Рис. 1Б, В, Г. Можно наблюдать очень хорошее согласие теории с экспериментальными данными.

В использованной выше экспериментальной системе фибриноген активируется тромбином в постоянной концентрации. Однако в организме активные факторы, к которым принадлежит тромбин, быстро удаляются при помощи ингибиторов.

Трехкомпонентная система, состоящая из фибриногена, тромбина и антитромбина III, обеспечивает быстрое расходование активатора и является лучшим приближением к процессам in vivo, чем рассмотренная ранее двухкомпонентная система. Ее исследование проводилось при помощи математического моделирования.

Концентрация фибриногена была физиологической (8600 нМ), как и антитромбина III (3500 нМ). Концентрация тромбина варьировалась в диапазоне 0,120 нМ. В данном случае тромбин успевал произвести только определенное количество фибрина, и дальше его полимеризация шла в присутствии фибриногена. Зависимость сигнала в конце численного эксперимента от концентрации тромбина представлена на Рис. 2А. Эта зависимость имеет s-образный вид. При концентрации тромбина меньше 1 нМ сгусток не образуется. Полимеризация небольшого количества фибрина в присутствии большого количества фибриногена за время эксперимента не происходит. Зависимость величины, обратной лагфазе (Рис. 2Б), стремится к нулю при ненулевых концентрациях тромбина.

« 1.0

* 0,6 5

I 0,4.

» 0,0

5 10 15 20

На, нМ

10 15

Па, нМ

Рис.2. Результаты моделирования трехкомпонентной системы (концентрация фибриногена 8600нМ, концентрация АТШ 3500нМ). (А) Зависимость финального сигнала от концентрации тромбина (отнормировано на максимальное значение для серии экспериментов). (Б) Зависимость величины, обратной лагфазе от концентрации тромбина.

Было показано, что за появление порога в полимеризации фибрина отвечают промежуточные комплексы фибриногена с олигомерами фибрина, а двустадийность активации фибриногена необходима для появления полуактивированного фибрина и, соответственно, усиления эффекта (Рис.3). Линия (1) - контроль; линия (2) -система без образования комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина; линия (3) - система, в которой активация фибриногена проходила в один шаг. В рассмотренных случаях зависимость обратной лагфазы от концентрации тромбина качественно практически не отличается от этой зависимости в контроле (Рис. ЗА). Они стремятся к нулю при ненулевых концентрациях тромбина, хотя эти концентрации сильно меньше, чем в контроле. Однако в зависимости финального сгустка от концентрации тромбина исчезает участок, на котором он не образуется (Рис. ЗБ). Но так ведет себя система полимеризации при плазменной концентрации фибриногена (8600 нМ). Увеличение этой концентрации в 4 раза (см. врезку на Рис.ЗБ, концентрация фибриногена 34400 нМ), приведет к тому, что больше фибриногена будет образовывать комплексы с фибрином, усиливая связанный с этим эффект. В системе без образования комплексов фибриногена с олигомерами фибрина порог отсутствует (нет участка, где при ненулевых концентрациях тромбина не образовывался бы сгусток), а в системе с одностадийной активацией фибриногена порог есть.

Д (1) Контроль

6,0

(1) Контроль ____- <3> 300, (2) Запрет на образование комплексов

5.5 5,0' т 4,5'

я" 3.5

(1)

1,0

0,5' 0,0

10 15

На, нМ

10 15

На, нМ

Рмс.З. Исследование влияния различных компонентов системы полимеризации фибрина на зависимости лагфазы и финального сигнала от начальной концентрации тромбина. Концентрация фибриногена 8600 нМ, концентрация АТШ 3500 нМ. (А) Зависимость лагфазы от концентрации тромбина. (Б) Зависимость максимального фибрина от концентрации тромбина (норма, запрещено образование комплексов фибрин-фибриноген, одностадийная активация фибрина). Во вставке представлена та же зависимость в случае начальной концентрации фибриногена 34400 нМ (концентрация АТШ 3500 нМ). (линия (1) - контроль; линия (2) - запрещено образование комплексов фибрин-фибриноген; линия (3) - одностадийная активация фибрина).

Моделирование роста сгустка в потоке.

Была проведена серия численных экспериментов по формированию фибринового сгустка при разных сдвиговых скоростях потока. На Рис. 4А представлена зависимость лагтайма (временной интервал между началом свертывания и моментом, когда сгусток закрывает более половины активатора) от сдвиговой скорости потока. Она может быть аппроксимирована экспоненциальной функцией у = а + Ъ-е", где а = 1.54 + 0.73, 6 = 2.86 + 0.32, с = 0.129 + 0.004. Здесь у — ЭТО лагтайм, ах — сдвиговая скорость потока. При небольших сдвиговых скоростях (013 с'1) лагтайм медленно увеличивался по мере увеличения скорости сдвига от 2.5 минут для неподвижной плазмы до 10-20 минут. Однако этот рост становится очень быстрым при больших сдвиговых скоростях, и при 28 с'1 лагтайм достигает 100-120 минут. Основываясь на полученных данных (представленных на Рис. 4А), можно сказать, что:

1) свертывание ингибируется потоком;

2) это ингибирование имеет сильно нелинейный характер, т.е. система свертывания может сопротивляться ингибирующему воздействию потока в определенном диапазоне его скоростей, но эффективно выключается на больших сдвиговых скоростях потока.

(1) Концентрация желирования фибрина = 380 нМ

(2) Концентрация желирования фибрина = 450 НМ

(3) Концентрация желирования фибрина = 760 НМ

(1) Плотный сгусток на 450 нМ фибрина Б

(2) Плотный сгусток на 3800 нМ фибрина

(3) Плотный сгусток на 7600 нМ фибрина.

140

(1)

О-

О 5 10 15 20 25 30

Сдвиговая скорость потока, с'1

0 5 10 15 20 25 30

Сдвиговая скорость потока, с*1

Рис. 4. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока при разных параметрах гелеобразования фибприа. (А) На зависимость лагтайма количественно, но не качественно влияет концентрация, при которой фибрин образует гель (точка гелеобразования). В большинстве расчетов была использована величина 450 нМ (линия 2). Здесь показано, что увеличение этого значения до 760 нМ (линия 3) уменьшает диапазон скоростей, на которых свертывание может противостоять подавлению потоком, но общий эффект потока не меняется. Уменьшение значения точки гелеобразования до 380 нМ (линия 1) увеличивает этот диапазон. (Е) Лагтайм не зависит от выбора концентрации, при которой фибрин формирует плотный сгусток. Далее везде было использовано значение 3800 нМ. Как показано на этом рисунке, изменение этого значения не оказывает никакого эффекта.

Большинство параметров модели основано на экспериментальных данных. Однако, в данном исследовании было сделано два допущения, не проверенных экспериментально. Это концентрация фибрина, при которой он переходит в гель (точка гелеобразования), и концентрация фибрина, определяющая, что сгусток стал плотным, т.е. определяющая лагтайм. Для оценки влияния этих параметров на полученный результат были проведены расчеты при разных значениях их величин.

Увеличение концентрации точки гелеобразования ведет к увеличению влияния потока на систему свертывания и наоборот. Но эти изменения носят количественный характер, не качественный. Главный эффект, состоящий в том, что свертывание может противостоять потоку в определенном диапазоне скоростей и подавляется более быстрым потоком, остается (Рис. 4А). Более того, значение концентрации фибрина, при которой сгусток становится плотным, не влияет на наблюдаемый эффект вообще (Рис. 4Б). Наиболее вероятное объяснение этому состоит в том, что когда сгусток закрывает от потока часть активатора, реакции свертывания внутри сгустка протекают быстро, минимально задерживая полное превращение фибриногена в фибрин.

Все описанные выше численные эксперименты были проведены при одном и том же размере активатора в 1000 ц. Очевидно, что ш vivo размер области повреждения может сильно варьировать, поэтому необходимо было проверить, как скажется изменение размера активатора на обнаруженной нами зависимости лагтайма от скорости потока. Была проведена серия расчетов при постоянной скорости потока (17 с'1) и разных размерах активатора (Рис. 5). Увеличение длины активатора вело к уменьшению лагтайма и наоборот. Зависимость была гиперболической, что следует

из ее линейности в полуобратных координатах (Рис. 5, вставка). При данном значении скорости сдвига свертывание фактически отсутствовало для длины активатора меньше 500 р.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Размер активатора, 10"6м

Рис. 5. Зависимость лагтайма от размера активатора. Все численные эксперименты были проведены при сдвиговой скорости потока 17 с'. На вставке показана зависимость лагтайма в полуобратных координатах.

В качестве нулевого приближения для определения критических элементов механизма, ответственного за влияние потока на свертывание, были проведены численные эксперименты, в которых отдельные факторы свертывания не переносились потоком. Этот подход позволил отдельным факторам свертывания игнорировать поток, тем самым показывая относительный вклад конвекции каждого из них в свертывание. Линия (2) на Рис. 6А показывает зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в in silico экспериментах с отключенной конвекцией всех факторов предшественников (т.е. факторов II, V, VII, VIII, IX, X, XI, фибриногена). Можно видеть, что конвекция этих факторов никоим образом не влияет на начальную фазу свертывания.

И совсем другая картина наблюдается в случае, когда отключена конвекция всех активных форм (т.е. факторов На, Va, Vila, Villa, IXa, Xa, XIa) (линия (3) на Рис. 6А). В этих условиях во всем рассмотренном диапазоне скоростей потока сгусток формировался точно такой же, как в неподвижной плазме. Ни лагтайм (Рис. 6А), ни форма сгустка не зависели от сдвиговой скорости потока. Система стала абсолютно нечувствительной к потоку. Таким образом, именно унос активных факторов изменяет поведение системы свертывания в условиях потока.

Дальнейший анализ, проведенный по аналогии, выявил, какие именно из активных форм ответственны за наблюдаемый эффект. Отключение конвекции

факторов Па и Ха дает такой же эффект, как и отключение конвекции всех активных форм (линия (5) на Рис. 6А). Когда была отключена конвекция всех активных форм, кроме факторов На и Ха (т.е. Va, Vila, Villa, IXa, XIa) (линия (4) на Рис. 6А), влияние потока на систему свертывания уменьшилось примерно в 2.6 раза (С*_15=0.39), а чувствительность системы к изменению скорости потока уменьшилась в 1.6 раза (Л' =0.63). Расчеты были сделаны для активатора размером 500 ц.

120

100

3 80

с; 40

(1) Контроль

(2) Все предшественники не переносятся потоком

(3) Все активные формы не перекосятся потоком

(4) Все активные формы, кроме На и Ха,/Ч2)

не переносятся потоком Илч

(5} Факторы На и Ха не переносятся потоком

120

100

j 80

5 60

% 40 с;

20 0

(1) Контроль

(2) Фактор Ха не активирует внешнюю тенаэу

(3) Фактор Па не участвует в реакциях,кроме

активации фибрина

/12) /(1)

5 10 15 20 25 Сдвиговая скорость потока, с'1

5 10 15 20 25 Сдвиговая скорость потока, с'

Рис. 6. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока определяется активацией фактора VII фактором Ха. (А) Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в диапазоне скоростей 0-28 с"'. Линия 1 -контроль; линия 2 - все предшественники (факторы II, V, VII, VIII, IX, X, XI, фибриноген) не переносятся потоком; линия 3 - все активные формы (факторы Ila, Va, Vila, Villa, IXa, Xa, XIa) не переносятся потоком; линия 4 - все активные формы, кроме факторов Па и Ха, не переносятся потоком; линия 5 - факторы На и Ха не переносятся потоком. Как видно из этих кривых, зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в основном определяется переносом факторов Па и Ха. (Б) Зависимость лагтайма от скорости потока при выключении различных реакций. Линия 1 - контроль; линия 2 - фактор Ха не активирует внешнюю теназу; линия 3 - фактор Па не участвует в реакциях, кроме активации фибриногена. Можно видеть, что активация фактором Ха комплекса VII-TF играет критическую роль в формировании нелинейного ответа системы свертывания на поток.

После того, как были выявлены факторы, чей перенос потоком является ключевым в регуляции поведения системы свертывания в условиях потока, реакции, в которых эти факторы участвуют, исключались из системы свертывания. Реакции активации фибриногена тромбином и протромбина фактором Ха являются критическими компонентами системы свертывания (без них фибриновый сгусток не будет образовываться), и их выключение не рассматривалось. Остальные реакции, участниками которых являются Па и Ха - это петли положительной обратной связи активации факторов V, VII, VIII, XI тромбином и активации комплекса VII-TF фактором Ха. Оказалось, что "выключение" всех петлей положительной обратной связи, в которых участвует тромбин, умеренно увеличило с,!у и практически не поменяло Д'(линия (3) на Рис. 6Б, Таблица 1). Таким образом, хотя система немного лучше подавлялась потоком, ее чувствительность к изменению скорости потока

осталась на том же уровне (Я'=1.12). И совсем другая картина наблюдается в случае отключения реакции активации комплекса VII-TF фактором Ха (линия (2) на Рис. 6Б): система стала в 3 раза менее чувствительной к изменению скорости потока (Л'=0.33), но подавлялась потоком в 7.7 раз лучше.

Проверка полученного в модельных расчетах переключения системы потоком может быть осуществлена при помощи следующих экспериментов.

Добавление 10 нМ фактора Vila (т.е. увеличение его концентрации до уровня плазменной концентрации его предшественника - фактора VII) в модели очень значительно укорачивает лагтайм (подавление потоком уменьшилось в 14 раз, Cos_24=0.07) и уменьшает чувствительность к изменению скорости в 4 раза (Д'=0.25) (Рис. 7). То, что чувствительность к изменению скорости потока в плазме, где фактор VII уже существенно активирован, должна быть очень низкой, будет важным подтверждением основных выводов об устройстве механизма регуляции свертывания потоком: именно петля положительной обратной связи активации фактора VII регулирует зависимость времени появления сгустка от сдвиговой скорости потока. В этом эксперименте начальное отношение активного фактора Vila к неактивному фактору VII будет 1:1, так что Vi всех комплексов фактора VII/VIIa с TF будет внешней теназой (вместо 1%, как в нормальной плазме). Это может быть интерпретировано как увеличение скорости активации внешней теназы петлей обратной связи, что позволяет системе существенно пренебречь действием потока.

(1) Контроль 120-1 (2) добавление 5 нМ TFPI

(3) добавление 10нМ фактора Vila 100- (4) добавление 6800nM ATill

'(1)

7 14 21

Сдвиговая скорость потока, с

-1

Рис, 7. Зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока определяется активацией фактора VII, ингибированпем посредством TFPI и ATIII. Показана зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока в нормальной плазме (линия 1), и в плазме с добавками фактора Vila, TFPI, ATIII. Добавление фактора Vila приводит к драматическому уменьшению лагтайма, а его зависимость от сдвиговой скорости потока становится линейной (линия 3). Добавление TFPI сдвигает область выключения свертывания к более низким скоростям потока (линия 2). Добавление ATIII немного увеличивает лагтайм (линия 4) в сравнении с контролем. Эти результаты показывают, что активация фактора VII и ингибирование внешней теназы TFPI являются контролирующим механизмом, определяющим поведение свертывания в потоке.

С другой стороны, добавление 5 нМ TFPI (3-х кратное увеличение по сравнению с контролем), должно привести и к значительному увеличению подавления потоком (С*_|2=5.55) (Рис. 7), и к существенному увеличению чувствительности системы к изменению скорости потока (Л'=4.5). Добавление TFPI будет оказывать малый эффект при отсутствии потока, как и добавление фактора Vila. Увеличение TFPI приведет к улучшению ингибирования петли обратной связи активации внешней теназы, что сделает систему более чувствительной как к изменению скорости потока, так и к подавлению потоком. Можно предположить, что концентрация TFPI является определяющим фактором для диапазона скоростей потока, в котором свертывание может образовывать сгусток.

Как возможный контроль, добавка 6800 нМ антитромбина III (3-х кратное увеличение по сравнению с контролем) должно вызвать только умеренное увеличение подавления свертывания потоком (С0124=1.38), существенно меньше, чем в случае добавки TFPI (Рис. 7), и практически не должно изменить чувствительность системы к изменению скорости потока (Я'=1.22). Таким образом, влияние

антитромбина III на начальные фазы свертывания в потоке должно быть весьма умеренным.

Таблица 1. Влияние возмущения системы на чувствительность к потоку

Условия С?-, Ч, с' R'

Контроль, точка гелеобразования 380 нМ 0.76 0-28 0.81

Контроль, точка гелеобразования 760 нМ 2.72 0-20 2.05

Контроль, плотный сгусток на 450 нМ 0.97 0-28 1

фибрина

Контроль, плотный сгусток на 7600нМ 1.02 0-28 1.01

фибрина

Контроль 1 0-28 1

Контроль (размер активатора 500 ц) 3.351 0-15 2.1'

Предшественники не переносятся потоком 1.03 0-28 1

Активные формы не переносятся потоком 0 0-28 -

Активные формы, кроме Па и Ха, не 0.392 0-15 0.632

переносятся потоком

Факторы Па и Ха переносятся потоком 0.01 0-28 -

Нет реакции активации VII-TF фактором 7.73 0-12 0.33

Ха

Нет реакций активации фактором Па 1.72 0-12 1.12

факторов V, VII, VIII, XI

Добавление 5 нМ TFPI 5.55 0-12 4.5

Добавление 6800 нМ ATIII 1.38 0-24 1.22

Добавление 10 нМ Vila 0.07 0-24 0.25

Таблица 1 показывает, как изменения в системе свертывания меняют длину периода запуска свертывания в условиях потока. Два коэффициента представляют собой два разных типа воздействия потока на систему свертывания. показывает,

1 Коэффициент рассчитан по отношению к контролю при размерах активатора 1000 ц

2 Коэффициент рассчитан по отношению к контролю при размерах активатора 500 ц.

насколько сильнее система свертывания подавляется потоком (в диапазоне сдвиговых скоростей от \ с'1 до] с"1), чем в контроле (С,1>1 или С,^.<1). В каждом случае зависимость лагтайма от сдвиговой скорости потока была аппроксимирована (там, где это было возможно) экспоненциальной функцией вида у = у0+А-е*''. Параметр Л' показывает, стала ли система более чувствительной к изменению скорости потока, чем в контроле (Я'>1 или Л'<1).

Выводы.

1. Разработана оригинальная детальная in vitro модель полимеризации фибрина, описывающая все основные этапы этого процесса, и проведена ее экспериментальная верификация.

2. С помощью модели было обнаружено пороговое поведение системы полимеризации фибрина: образование фибринового сгустка в присутствии фибриногена не происходит при низких концентрациях фибрина.

3. Показано, что формирование комплексов фибриногена с олигомерами фибрина ведет к задержке появления сгустка, а при малых количествах фибрина - к тому, что сгусток не образуется.

4. Разработана детальная модель свертывания плазмы крови в потоке, учитывающая изменения скоростей тока жидкости (плазмы крови), вызываемые растущим сгустком. С ее помощью продемонстрировано, что поток может регулировать временной интервал запуска свертывания крови, осуществляя отток фактора Ха и тем самым влияя на дополнительную активацию внешней теназы - комплекса, активирующего свертывание.

5. Предложена схема проведения in vitro экспериментов для верификации гипотезы о механизме, определяющем чувствительность плазменной системы свертывания крови к скорости потока плазмы крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Panteleev М.А., Ovanesov M.V., Shibeko A.M., Tokarev A.A., Sinauridze E.I., and Ataullakhanov F.I.. Computer simulation study of blood coagulation control. Mathematical models and methods in biology and medicine. Bedlewo,Poland, 2005 p. 12.

2. Shibeko A.M., Lobanova E.S., Panteleev M.A., Avilov O.E., Gusev A.V., Shnol E.E., Ataullakhanov F.I. "Mathematical Modeling of Fibrin Clot Formation in the Presence of Blood Flow", 1st International Conference "Mathematical Biology and Bioinformatics", Puschino, Russia, 9-15 October 2006. pp. 55-56

3. Баландина A.H., Пантелеев M.A., Ованесов M.B., Шибеко A.M., Разработка установки для исследования пространственной динамики генерации тромбина при свертывании крови. Труды VI ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 24-27 ноября 2006 г. стр. 7-9

4. Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Сарбаш В.И., Шибеко A.M., Атауллаханов Ф.И., Разработка установки для исследования пространственной динамики генерации тромбина. III всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, Россия, 1-3 февраля 2007, стр. 17-18

5. Balandina A.N., Kireev D.A., Panteleev М.А., Shmirev 1.1., Shibeko A.M., Ataullakhanov F.I. Threshold behavior of the blood clotting system activated by the tissue factor Abstracts of XXIst Congress of the international society on thrombosis haemostasis., Geneva, Switzerland, July 6-12 2007.

6. Баландина A.H., Ованесов M.B., Шибеко A.M., Пантелеев M.A., Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Пространственная динамика генерации тромбина в плазме крови. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология Наука XXI века". Пущино, Россия, 29 октября - 2 ноября 2007, стр 231.

7. Баландина А.Н., Киреев Д.А., Пантелеев М.А., Шмырев И.И., Шибеко A.M., Атауллаханов Ф.И. Пороговое поведение системы свертывания крови при активации различной плотностью тканевого фактора. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология Наука XXI века". Пущино, Россия, 29 октября - 2 ноября 2007, стр 69.

8. Balandina A.N., Panteleev М.А., Kireev D.A., Shibeko A.M., Lipets E.N., Shmirev 1.1., Ataullakhanov F.I. Application of a New Method of Biochemical Systems Reduction: Regulatory Functions of Positive Feedbacks in Blood Clot-ting Abstracts of II International confercncc "Mathematical biology and bioinformatics", Pushchino, Russia, September 7 - 13, 2008, pp. 56 - 57.

9. Shibeko A.M., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Blood Flow Suppresses Feedback Activation of Extrinsic Tenase by Factor Xa and Prevents Clotting (theoretical research), Modeling of Blood Diseases, France, Lyon, 5.11.2007 - 8.11.2007. p. 18.

10. Shibeko A.M., Panteleev M.A., Ataullakhanov F.I. Binding of fibrinogen to fibrin as a regulator of fibrin polymerization initiation, Modeling of Blood Diseases, France, Lyon, 5.11.2007-8.11.2007. p. 19.

11. Shibeko A. M., Avilov О. E., Panteleev M. A., Lobanova E. S., Ataullakhanov F. I. Blood Flow Suppresses Feedback Activation of Extrinsic Tenase by Factor Xa and Prevents Clotting, XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Switzerland, Geneva 06.07.2007 - 12.07.2007.

12. Шибеко A.M., Пантелеев M.A., Атауллаханов Ф.И. Реакция связывания фибрина с фибриногеном как регулятор начальной стадии полимеризации фибрина. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология Наука XXI века". Пущино, Россия, 29 октября - 2 ноября 2007. стр. 63.

13. Shibeko A.M. Blood Flow controls Coagulation Onset via the positive Feedback of Factor VII activation by Factor Xa, 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research. 4-7 February 2009, Wein, Osterreich.

14. Panteleev M.A., Ovanesov M.V., Kireev D.A., Shibeko A.M., Sinauridze E.I., Ananyeva N.M., Butylin A.A., Saenko E.L., Ataullakhanov F.I. "Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein С Pathways". Biophysical Journal, V 90, March 2006 pp. 1489-1500.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шибеко, Алексей Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Гемостаз. Общие сведения.

1.2. Плазменное свертывание крови.

1.2.1. Структура химических реакций.

1.2.2. Факторы свертывания.

1.2.3. Полимеризация фибрина и образование сгустка.

1.2.4. Каскад свертывания. Внешний и внутренний пути активации.

1.2.5. Ускорение работы каскада: мембранно-зависимые реакции и петли положительной обратной связи.

1.2.6. Ингибиторы свертывания.

1.2.7. Тромбоциты в плазменном свертывании.

1.3. Методы исследования системы свертывания крови.

1.3.1. Экспериментальные модели исследования гемостаза. Введение.

1.3.2. Экспериментальные исследования гемостаза в потоке.

1.3.3. Математическое моделирование свертывания крови. Введение.

1.3.4. Феноменологические модели свертывания крови.

1.3.5. Количественные модели свертывания крови.

1.3.6. Моделирование свертывания в потоке.

1.3.7. Моделирование полимеризации фибрина.

1.4. Постановка задачи.

Глава 2. Методы.

2.1. Математическое моделирование полимеризации фибрина.

2.1.1.Построение модели.

2.1.2. Интерпретация данных светорассеяния.

2.1.3. Методы численного решения уравнений.

2.2. Материалы и методы эксперимента по полимеризации фибрина.

2.2.1. Материалы.

2.2.2. Обработка эксперимента.

2.3. Математическая модель свертывания плазмы крови в условиях потока.

2.3.1. Методы численного решения уравнений Навье-Стокса.

2.3.2. Методы численного решения уравнений типа реакция-диффузия-конвекция

2.3.3. Постановка модельного эксперимента.

2.3.5. Образование фибринового сгустка.

2.3.6. Описание программы, использованной для расчетов.

2.3.7. Описание влияния потока на систему свертывания.

2.3.8. Оценка погрешности результатов расчетов.

Глава 3. Результаты.

3.1. Результаты моделирования полимеризации фибрина.

3.1.1. Исследование поведения двухкомпонентной системы (фибриноген, тромбин).

3.1.2. Пороговое поведение системы полимеризации фибрина.

3.2. Результаты моделирования роста сгустка в потоке.

3.2.1.Эффект потока на формирование фибринового сгустка.

3.2.2. Зависимость влияния потока на свертывание от параметров фибринового сгустка.

3.2.3. Зависимость влияния потока на свертывание от размера активатора.

3.2.4. Чувствительность к потоку реакции активации фактора VII фактором Ха.

3.2.5. Регуляция потоком производства внешней теназы.

3.2.6. Возможные экспериментальные проверки результатов, полученных при моделировании.

Глава 4 Обсуждение результатов.

4.1. Результаты моделирования полимеризации фибрина.

4.2. Результаты моделирования свертывания плазмы крови в потоке.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс"

Основная функция свертывания крови — остановка кровотечения при нарушении целостности сосудистого русла, вызываемого как внешним повреждением, так и различными внутренними микротравмами, постоянно возникающими в организме. Система свертывания крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, однако большая ее часть является регуляторной, управляющей для главной реакции свертывания — образования фибрина и его полимеризации. Именно эта реакция превращает кровь в гель, закрывающий место повреждения и останавливающий кровопотерю. Смысл существования всей остальной системы свертывания в том, чтобы этот переход был осуществлен при строго определенных условиях и строго определенным образом: при наличии сильного активирующего сигнала, в месте повреждения, не распространяясь за его пределы, образуя плотный сгусток, быстро закрывая повреждение. При этом не нужно забывать, что система свертывания функционирует в довольно сложных условиях: вязкая кровь течет по сосуду, в котором на стенке имеется область, активирующая свертывание. В зоне, граничащей с ней, происходят начальные реакции свертывания, активируются ферменты, которые с диффузией и переносом потоком проникают в соседние области. Появляется сгусток, практически непроницаемый для потока, который меняет профиль его скоростей. Как будет вести себя система свертывания в таких условиях? Какие факторы будут управлять образованием сгустка? Что будет решать — произойдет остановка кровотечения или нет? Данная работа - попытка ответить на эти вопросы, основанная на компьютерном моделировании, подкрепленном in vitro экспериментами. В силу большой сложности и многоступенчатости системы свертывания, эта работа ограничена исследованиями фазы начального появления сгустка.

В данной работе был применен новый подход в использовании математического моделирования для исследования сложных биохимических систем. За основу была взята детальная модель свертывания плазмы крови[1], разработанная в лаборатории физической биохимии системы крови ГТГЦ РАМН. Данная модель описывала реакционно-диффузную систему, в которой свертывание активировалось по внешнему пути. Эта модель давала количественное согласие с множеством in vitro экспериментов. Она была модифицирована, чтобы описывать образование сгустка в условиях потока. После этого исправленная модель использовалась как инструмент исследования системы свертывания.

Использование математической модели позволяло проводить такие численные эксперименты, которые в принципе невозможно провести in vitro, как, например, отключение переноса потоком отдельных факторов свертывания, или изменение скорости протекания определенных реакций, в которых участвует фермент. Такой подход позволял выяснять роль отдельных реакций в формировании нужного ответа системы, находить механизмы, регулирующие проведение свертывания в различных условиях.

Задачи исследования:

Научная новизна. В первой части работы построена новая математическая модель полимеризации фибрина, в которой учтены двухступенчатая активация фибриногена; образование комплексов фибрина с фибриногеном и частично активированным фибрином; формирование протофибрилл и их латеральная агрегация с образованием оптически плотных фибрилл. Для верификации модели была проведена серия in vitro экспериментов. С помощью модели предсказано существование порога в образовании сгустка, выраженного в том, что ненулевые количества активированного фибрина в присутствии фибриногена не образуют сгустка. Был предложен механизм, отвечающий за подобное поведение системы полимеризации фибрина: обратимое формирование комплексов фибриногена и полуактивированного фибрина с олигомерами фибрина задерживает рост последних и не позволяет им образовывать сгусток в течение времени расчета. Во второй части работы разработана оригинальная двумерная детальная модель свертывания в потоке, учитывающая, что образующийся сгусток является непроницаемым для потока и тем самым меняет его форму. С помощью этой модели было исследовано влияние потока на свертывание плазмы крови; было продемонстрировано, что поток может увеличивать время инициации свертывания, причем зависимость времени инициации свертывания от сдвиговой скорости потока имеет нелинейный характер, что подтверждается экспериментальными данными. Было выяснено, что ингибирующее действие потока связано с уносом активного фактора Ха и тромбина, и предложена гипотеза, что это может быть связано с ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы фактором Ха (вызванным уменьшением концентрации фактора Ха из-за его сноса потоком). Предложен ряд экспериментов по проверке этой гипотезы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Построена детальная т тНо модель полимеризации фибрина, проведена ее экспериментальная верификация.

4. Показано, что эффект ингибирования свертывания потоком вызывается вымыванием активного фактора Ха и связанным с этим ослаблением и полным выключением петли положительной обратной связи активации внешней теназы — комплекса, инициирующего свертывание.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шибеко, Алексей Михайлович

Выводы.

3. Показано, что формирование комплексов фибриногена с олигомерами фибрина ведет к задержке появления сгустка, а при малых количествах фибрина — к тому, что сгусток не образуется.

4. Разработана детальная модель свертывания плазмы крови в потоке, учитывающая изменения скоростей тока жидкости (плазмы крови), вызываемые растущим сгустком. С ее помощью продемонстрировано, что поток может регулировать временной интервал запуска свертывания крови, осуществляя отток фактора Ха и тем самым влияя на дополнительную активацию внешней теназы — комплекса, активирующего свертывание.

Благодарности

Я бы хотел выразить искреннюю благодарность коллегам, чья помощь и поддержка сделали возможным выполнение этой работы. Я хочу поблагодарить сотрудников лаборатории физической биохимии системы крови и ЦТП ФХФ РАН: Анну Баландину, Андрея Александровича Бутылина, Кирилла Жуденкова, Бориса Ефимовича Мовшева, Сергея Карамзина, Михаила Александровича Пантелеева, Леонида Парунова, Елену Ивановну Синауридзе, Алексея Токарева.

За помощь в реализации алгоритмов решения уравнений я хочу поблагодарить Эммануила Эльевича Шноля.

Особая благодарность моему научному руководителю, Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, за его помощь и поддержку, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шибеко, Алексей Михайлович, Москва

1. Colman RW. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

2. Schenone M, Furie ВС, Furie B. The blood coagulation cascade. Curr Opin Hematol 2004; 11: 272-277.

3. Шмидт P, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 1996.

4. Falati S, Gross Р, Merrill-Skoloff G, Furie ВС, Furie В. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med 2002; 8: 1175-1181.

5. Beltrami E, Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math Biosci 2001; 172: 1-13.

6. Lowe GD. Virchow's triad revisited: abnormal flow. Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33: 455-457.

7. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: Lippincott Company, 1994.

8. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 3-12.

9. Балуда ВП, Балуда MB, Деянов ИИ, Тлепшуков ИЛ. Физиология системы гемостаза. Москва: 1995.

10. Doolittle RF. The molecular biology of fibrin. In: Stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW, Majerus PW, Varmus H (editors). The molecular basis of blood diseases. Philadelphia: W.B. Saunders, 1994; 701-723.

11. Cohen C, Weisel JW, Phillips GN, Jr., Stauffacher CV, Fillers JP, Daub E. The structure of fibrinogen and fibrin: I. Electron microscopy and X-ray crystallography of fibrinogen. Ann N YAcad Sci 1983; 408: 194-213.

12. Weisel JW, Stauffacher CV, Bullitt E, Cohen C. A model for fibrinogen: domains and sequence. Science 1985; 230: 1388-1391.

13. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen—fibrin transition in blood coagulation. Nature 1978; 275: 501-505.

14. Higgins DL, Lewis SD, Shafer JA. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin. J Biol Chem 1983; 258: 92769282.

15. Di SE, Nagaswami C, Weisel JW, Di CE. CI- regulates the structure of the fibrin clot. Biophys J1998; 75: 1973-1979.

16. Wolberg AS. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Rev 2007; 21: 131142.

17. Freyssinet JM, Torbet J, Hudry-Clergeon G, Maret G. Fibrinogen and fibrin structure and fibrin formation measured by using magnetic orientation. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 1616-1620.

18. Smith GF. Fibrinogen-fibrin conversion. The mechanism of fibrin-polymer formation in solution. Biochem J1980; 185: 1-11.

19. Chtcheglova LA, Vogel M, Gruber HJ, Dietler G, Haeberli A. Kinetics of the interaction of desAABB-fibrin monomer with immobilized fibrinogen. Biopolymers 2006; 83: 69-82.

20. Lawson JH, Kalafatis M, Stram S, Mann KG. A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study. J Biol Chem 1994; 269: 23357-23366.

21. Sorensen, E. N. Computational simulation of platelet transport, activation, and deposition. 2002. University of Pittsburgh.

22. Ref Type: Thesis/Dissertation

23. Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-3843.

24. Rosing J, Tans G, Govers-Riemslag JW, Zwaal RF, Hemker HC. The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J Biol Chem 1980; 255: 274-283.

25. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemosl 2002; 88: 186-193.

26. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation. J Biol Chem 1976; 251: 5233-5236.

27. Gailani D, Ho D, Sun MF, Cheng Q, Walsh PN. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential. Blood 2001; 97: 3117-3122.

28. Gailani D, Broze GJ, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-912.

29. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35: 1904-1910.

30. Rao LV, Rapaport SI, Bajaj SP. Activation of human factor VII in the initiation of tissue factor-dependent coagulation. Blood 1986; 68: 685-691.

31. Rao LV, Rapaport SI. Activation of factor VII bound to tissue factor: a key early step in the tissue factor pathway of blood coagulation. Proc Natl Acad Sci U SA 1988; 85: 66876691.

32. Rao LV, Williams T, Rapaport SI. Studies of the activation of factor VII bound to tissue factor. Blood 1996; 87: 3738-3748.

33. Семенов BB, Ханин MA. Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика 1990; 35: 139-141.

34. Ellis V, Scully М, MacGregor I, Kakkar V. Inhibition of human factor Xa by various plasma protease inhibitors. Biochim Biophys Acta 1982; 701: 24-31.

35. Ellis V, Scully MF, Kakkar VV. Inhibition of prothrombinase complex by plasma proteinase inhibitors. Biochemistry 1984; 23: 5882-5887.

36. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost 2001; 86: 959-972.

37. Walker FJ, Fay PJ. Regulation of blood coagulation by the protein С system. FASEBJ1992; 6: 2561-2567.

38. Dahlback B, Stenflo J. The protein С anticoagulant system. In: Stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW, Majerus PW, Varmus H (editors). The molecular basis of blood diseases. Philadelphia: W.B. Saunders, 1994; 599-627.

39. Tracy PB, Nesheim ME, Mann KG. Coordinate binding of factor Va and factor Xa to the unstimulated platelet. J Biol Chem 1981; 256: 743-751.

40. Hemker HC, Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

41. Weiss HJ, Turitto VT, Baumgartner HR. Role of shear rate and platelets in promoting fibrin formation on rabbit subendothelium. Studies utilizing patients with quantitative and qualitative platelet defects. J Clin Invest 1986; 78: 1072-1082.

42. Tonda R, Galan AM, Mazzara R, White JG, Ordinas A, Escolar G. Platelet membrane fragments enhance the procoagulant effect of recombinant factor Vila in studies with circulating human blood under conditions of experimental thrombocytopenia.

43. Semin Hematol 2004; 41: 157-162.

44. Shen F, Kastrup CJ, Liu Y, Ismagilov RF. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2035-2041.

45. Katoh S, Matsubara I, Sada E. Effect of shear rate on activation rate of factor X. Ann BiomedEng 1978; 6: 60-67.

46. Andree HA, Contino PB, Repke D, Gentry R, Nemerson Y. Transport rate limited catalysis onmacroscopic surfaces: the activation of factor X in a continuous flow enzyme reactor. Biochemistry 1994; 33: 4368-4374.

47. Hathcock JJ, Rusinova E, Gentry RD, Andree H, Nemerson Y. Phospholipid regulates the activation of factor X by tissue factor/factor Vila (TF/VTIa) via substrate and product interactions. Biochemistry 2005; 44: 8187-8197.

48. Hathcock J, Rusinova E, Vaananen H, Nemerson Y. Lipid-bound factor Xa regulates tissue factor activity. Biochemistry 2007; 46: 6134-6140.

49. Levine SN. Enzyme Amplifier Kinetics. Science 1966; 152: 651-653.

50. MACFARLANE RG. AN ENZYME CASCADE IN THE BLOOD CLOTTING MECHANISM, AND ITS FUNCTION AS A BIOCHEMICAL AMPLIFIER: Nature 1964; 202: 498-499.

51. DAVIE EW, RATNOFF OD. WATERFALL SEQUENCE FOR INTRINSIC BLOOD CLOTTING. Science 1964; 145: 1310-1312.

52. Khanin MA, Semenov W. A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J TheorBiol 1989; 136: 127-134.

53. Образцов ИФ, Ханин MB, Горбатюк ИА. Математическая модель кинетики активации факторов VII и X системььгемокоагуляции. Дот Акад Наук 1992; 326: 558-561.

54. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Кинетика активации внутреннего пути гемокоагуляции: пороговый эффект. Докл Акад Наук 1996; 349: 560-562.

55. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Пороговые эффекты в кинетике активации контактной системы гемокоагуляции. Докл Акад Наук 1999; 367: 130-132.

56. Jesty J, Beltrami E, Willems G. Mathematical analysis of a proteolytic positive-feedback loop: dependence of lag time and enzyme yields on the initial conditions and kinetic parameters. Biochemistry 1993; 32: 6266-6274.

57. Beltrami E, Jesty J. Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation.

58. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 8744-8748.

59. Hirayama H, Yoshii K, Ojima H, Kawai N, Gotoh S, Fukuyama Y. Linear systems analysis of blood clotting system. IEICE Trans Fundamentals 1995; E78-A: 14191431.

60. Jones КС, Mann KG. A model for the tissue factor pathway to thrombin. II. A mathematical simulation. J Biol Chem 1994; 269: 23367-23373.

61. Hockin MF, Jones КС, Everse SJ, Mann KG. A model for the stoichiometric regulation of blood coagulation. J Biol Chem 2002; 277: 18322-18333.

62. Bungay SD, Gentry PA, Gentry RD. A mathematical model of lipid-mediated thrombin generation. Math Med Biol 2003; 20: 105-129.

63. Khanin MA, Leytin VL, Popov AP. A mathematical model of the kinetics of platelets and plasma hemostasis system interaction. Thromb Res 1991; 64: 659666.

64. Kuharsky AL, Fogelson AL. Surface-mediated control of blood coagulation: the role of binding site densities and platelet deposition. BiophysJ2001; 80: 10501074.

65. Xu CQ, Zeng YJ, Gregersen H. Dynamic model of the role of platelets in the blood coagulation system. Med Eng Phys 2002; 24: 587-593.

66. Атауллаханов ФИ, Гурия ГТ, Сафрошкина АИ. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель. Биофизика 1994; 39: 97-106.

67. Атауллаханов ФИ, Молчанова ДА, Похилко АВ. Симуляционная модель свертывания крови. Биофизика 1995; 40: 434-442.

68. Zarnitsina VI, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. A mathematical model for the spatiotemporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results. Thromb Res 1996; 84: 333-344.

69. Zarnitsina VI, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. A mathematical model for the spatiotemporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. I. The model description. Thromb Res 1996; 84: 225-236.

70. Zarnitsina VI, Ataullakhanov FI, Lobanov AI, Morozova OL. Dynamics of spatially nonuniform patterning in the model of blood coagulation. Chaos 2001; 11: 57-70.

71. Lobanova ES, Ataullakhanov FI. Unstable trigger waves induce various intricate dynamic regimes in a reaction-diffusion system of blood clotting. Phys Rev Lett 2003; 91: 138301.

72. Ataullakhanov FI, Zarnitsina VI, Kondratovich AYu, Lobanova ES, Sarbash VI. A new class of stopping self-sustained waves: a factor determining the spatial dynamics of blood coagulation. Uspekhi Fizicheskikh Nauk 2002; 45: 619-636.

73. Lobanova ES, Ataullakhanov FI. Running pulses of complex shape in a reaction-diffusion model. Phys Rev Lett 2004; 93: 098303.

74. Похилко AB, Атауллаханов ФИ. Пространственная динамика свертывания крови. Математическая модель. Биол мембраны 2002; 19: 221-234.i

75. Xu Z, Chen N, Kamocka MM, Rosen ED, Alber M. A multiscale model of thrombus development. JR Soc Interface 2008; 5: 705-722.

76. Anand M, Rajagopal К, Rajagopal KR. A Model Incorporating some of the Mechanical and Biochemical Factors Underlying Clot Formation and Dissolution in Flowing Blood. Computational and Mathematical Methods in Medicine 2003; 5: 183218.

77. Fogelson AL, Tania N. Coagulation under flow: the influence of flow-mediated transport on the initiation and inhibition of coagulation. Pathophysiol Haemost Thromb 2005; 34: 91-108.

78. Ermakova EA, Panteleev MA, Shnol EE. Blood coagulation and propagation of autowaves in flow. Pathophysiol Haemost Thromb 2005; 34: 135-142.

79. Anand M, Rajagopal KR. A shear-thinning viscoelastic model for describing the flow of blood. International Journal of Cardiovascular Medicine and Science 2004; 4: 59-68.

80. Лобанов АИ, Старожилова TK, Гурия ГТ. Численное исследование процессов структурообразования при свертывании крови. Математическое моделирование 1997;9: 83-95.

81. Чуличков АЛ, Николаев АВ, Лобанов АИ, Гурия ГТ. Пороговая активация свертывания крови и рост тромба в условиях кровотока. Математическое моделирование 2000; 12: 75-96.

82. Гузеватых АП, Лобанов АИ; Гурия ГТ. Активация внутрисосудистого тромбообразования вследствие развития стеноза. Математическое моделирование 2000; 12: 39-60.

83. Guy RD, Fogelson AL, Keener Л1. Fibrin gel formation in a shear flow. Math Med Biol 2007; 24: 111-130.

84. Naski MC, Shafer JA. A kinetic model for the alpha-thrombin-catalyzed conversion of plasma levels of fibrinogen to fibrin in the presence of antithrombin 1П. J Biol Chem 1991; 266: 13003-13010.

85. Weisel JW, Nagaswami C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophys J1992; 63: 111-128.

86. Marx G. Simulating fibrin clotting time. Med Biol Eng Comput 2006; 44: 79-85.

87. Lewis SD, Shields PP, Shafer JA. Characterization of the kinetic pathway for liberation of fibrinopeptides during assembly of fibrin. J Biol Chem 1985; 260: 10192-10199.

88. Janmey PA, Erdile L, Bale MD, Ferry ID. Kinetics of fibrin oligomer formation observed by electron microscopy. Biochemistry 1983; 22: 4336-4340.

89. Hantgan RR, Hermans J. Assembly of fibrin. A light scattering study. J Biol Chem 1979; 254: 11272-11281.

90. Carr ME, Jr., Hermans J. Size and density of fibrin fibers from turbidity.

91. Macromolecules 1978; 11: 46-50.

92. Campbell RA, Overmyer KA, Bagnell CR, Wolberg AS. Cellular procoagulant activity dictates clot structure and stability as a function of distance from the cell surface.

93. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2247-2254.

94. Бахвалов НС, Жидков НП, Кобельков ГМ. Численные методы. БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003.

95. Mihalyi Е. Physicochemical studies of bovine fibrinogen. IV. Ultraviolet absorption and its relation to the structure of the molecule. Biochemistry 1968; 7: 208-223.

96. Кобельков ГМ. О численных методах решения уравнений Навье-Стокса в переменных скорость-давление. In: Марчук ГИ (editor). Вычислительные процессы и системы. Москва: Наука, 1991.

97. Самарский АА, Николаев ЕС. Методы решения сеточных уравнений. Москва: Наука, 1978.

98. Самарский АА. Введение в численные методы. Москва: Наука, 1987.

99. Марчук ГИ. Методы вычислительной математики. Москва: Наука, 1980.

100. Кирьянов ДВ, Кирьянова ЕН. Вычислительная физика. Москва: Полибук Мультимедиа, 2006.

101. Diamond SL, Anand S. Inner clot diffusion and permeation during fibrinolysis. Biophys J 1993; 65: 2622-2643.

102. Бэтчелор Дж. Введение в динамику жидкости. Москва: Мир, 1973.

103. Валландер СВ. Лекции по гидроаэромеханике. Ленинград: Издательство Лениградского Университета, 1978.

104. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 4557.

105. Reganon E, Vila V, Aznar J. Gelation of fibrinogen in plasma. A kinetic study by turbidity measurement. Haemostasis 1984; 14: 170-178.

106. Panteleev MA, Zarnitsina VI, Ataullakhanov FI. Tissue factor pathway inhibitor: a possible mechanism of action. EurJBiochem 2002; 269: 2016-2031.

107. Baumgartner HR. The role of blood flow in platelet adhesion, fibrin deposition, and formation of mural thrombi. Microvasc Res 1973; 5: 167-179.

108. Brogan GX, Jr. Bench to bedside: pathophysiology of acute coronary syndromes and implications for therapy. AcadEmerg Med 2002; 9: 1029-1044.

109. Runyon MK, Johnson-Kerner BL, Kastrup CJ, Van Ha TG, Ismagilov RF. Propagation of blood clotting in the complex biochemical network of hemostasis is described by a simple mechanism. J Am Chem Soc 2007; 129: 7014-7015.

Информация о работе

Шибеко, Алексей Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы