Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности развития фибринового сгустка в плазме крови IN VITRO

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности развития фибринового сгустка в плазме крови IN VITRO"

На правах рукописи

НАВДАЕВ Алексей Вадимович

ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ФИБРИНОВОГО СГУСТКА В ПЛАЗМЕ КРОВИ IN VITRO.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена в группе инженерной иммунологии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ МП РФ.

Научный руководитель: к.б.н. Домогатский С.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Атауллаханов Ф.И.

кандидат биологических наук Добровольский А.Б.

Ведущая организация - Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится " 1997г. в 1100 час. на

заседании диссертационного совета К 074.22.02 при Институте экспериментальной кардиологии РКНПК МЗМП РФ (121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК МЗМП РФ.

Автореферат разослан " ^ " 1997г.

Ученый секретарь диссетационного совета^)

¡енгерова Т.И.

Актуальность проблемы: Процесс активации факторов свертывания ассоциируется с поврежденной поверхностью сосуда. Образование тромба, способного остановить кровотечение из крупного кровеносного сосуда, происходит за несколько минут. Толщина тромба измеряется миллиметрами. Распространение факторов свертывания на такие расстояния за счет диффузии не обеспечивает необходимой скорости нарастания фибриновой массы, так как концентрация факторов быстро убывает с удалением от активирующей поверхности.

Существует гипотеза о том, что активированные на поврежденной поверхности факторы свертывания проникают в кровоток и, за счет положительных обратных связей, вызывают активацию каскада гемокоагуляции (Атауллаханов, Гурия, 1994). При этом в данной зоне происходит скачкообразное увеличение концентрации активированных факторов и преодоление концентрационного барьера, необходимого для образования фибрина. Далее процесс переходит в зону, еще более удаленную от поверхности поврежденного сосуда. Таким образом возникает активационная волна, которая распространяется в просвет сосуда значительно быстрее фронта диффундирующих факторов свертывания и может обеспечить необходимую скорость роста фибринового сгустка.

В этой же гипотезе рассматривается вопрос об остановке роста сгустка. Предполагается, что вслед за волной активации возникает волна ингибирования, которая через некоторое время обгоняет первую. При этом происходит инактивация факторов свертывания и остановка фибринообразования.

Альтернативные гипотезы предполагают, что остановка роста фибринового сгустка происходит благодаря вымыванию факторов свертывания с поверхности сгустка потоком крови (Davie et al. 1991). На первое место в процессе остановки фибринообразования выдвигаются антикоагулянты плазмы крови (Pabinger, Schneider 1996), или их сочетание с фибшголизом (Vermylen et al. 1986).

Для того, чтобы определить, имеет ли место автокаталитическое распространение волны активации и ее последующая остановка или эти процессы определяются вымыванием факторов свертывания, необходимо проведение экспериментов по изучению роста фибринового сгустка в плазме крови в отсутствии ее перемешивания

Цели и задачи исследования:Цель нашей работы заключалась в изучении пространственного развития фибринового сгустка при локальной активации свертывания в плазме крови in vitro. В настоящей работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1) создать экспериментальную модель, позволяющую визуально регистрировать момент начала фибринообразования и процесс роста фибринового сгустка in vitro.

2) Исследовать особенности активации свертывающей системы фрагментом деэндотелизованного кровеносного сосуда и скорость роста образующегося фибринового сгустка. Определить возможность самопроизвольной остановки роста фибринового сгустка и участие протеина С в этом процессе.

3) Исследовать . влияние различных концентраций антитромбина III в образце исследуемой плазмы крови на процессы активации, развития и остановки роста фибринового сгустка.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе экспериментов была отработана модельная система для наблюдения роста фибринового сгустка в плазме крови в отсутствие перемешивания. Эта модельная система позволяет в стандартных условиях, с минимальными затратами плазмы крови и фрагмента кровеносного сосуда в качестве активатора свертывания, исследовать процесс развития фибринового сгустка in vitro и влияние отдельных компонентов свертывающей и антикоагулянтной систем крови на этот процесс.

Разработаны иммуно-ферментные тест системы для количественного определения фибриногена и антитромбина III в плазме крови.

Обнаружено наличие нескольких стадий в процессе развития фибринового сгустка: медленная активация свертывающей системы, стадия быстрого роста фибринового сгустка, замедление скорости роста сгустка до полной остановки.

Установлено, что коллаген стенки сосуда не является активатором гемокоагуляциошшй системы.

Обнаружено, что снижение концентрации протеина С в образце плазмы крови приводит к устранению эффекта самопроизвольной остановки роста фибринового сгустка.

Исследовано влияние концентрации антитромбина III в образце используемой плазмы крови на процесс фибринообразования ri скорость роста сгустка.

Изучено влияние различных доз гепарина в используемой плазме крови на процесс развития фибринового сгустка.

Полученые данные вносят вклад в понимание механизмов развития фибринового сгустка, роли антитромбина III и протеина С в регуляции деятельности свертывающей системы крови и могут быть использованы для дальнейшего изучения принципов регуляции фибринообразования.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на XIV Международном Конгрессе по тромбозам (Montpellier, France 1996), опубликовано 5 научных работ. Работа была апробирована на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация сострит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа содержит 125 страниц машинописного текста, 14 рисунков.

Список литературы включает 136 источников.

Материалы и методы. Плазму крови, бедную тромбоцитами, получали из цельной крови здоровых доноров, стабилизированной цитратом Иа (13мМ), путем повторного центрифугирования при 1500§ и 300(^ по 20 мин. каждое. Объединенная плазма от 5-ти доноров хранилась при -70° С в пробирках по 2 мл. Перед началом эксперимента в размороженную плазму добавляли раствор СаС12 2М до до конечной концентрации СаС12 в плазме 15 мМ. В качестве активатора свертывающей системы плазмы крови использовали фрагмент брюшной аорты человека, лишенный эндотелия и отмьггый в Тт-буфере (50мМ, рН 7.4). Степень отмывки аорты от растворимых факторов активации свертывания проверяли по способности отмывочного буфера инициировать фибринообразование в плазме крови. Фрагмент аорты ( 0.2 см2) и рекальцифицированная плазма крови помещались в приспособление, позволяющее визуально наблюдать развитие фибринового сгустка. Приспособление представляет из себя разъемную кювету, из прозрачного материала, не вызывающего активацию свертывания (метилметакрилат, обработанный раствором альбумина человека). На передней стенке кюветы нанесена масштабная линейка, позволяющая определять размеры образующихся фибриновых сгустков. В месте контакта рекальцифицированной ^плазмы и фрагмента аорты происходила активация свертывающей системы и образование фибрина. Фибриновый гель обнаруживался в виде помутнения на фоне прозрачной плазмы. Результаты эксперимента регистрировались с помощью продолжающейся фотосъемки, при 3-х кратном увеличении. Обработку данных производили используя увеличенные фотоотпечатки.

Для устранения конвективных потоков в плазме крови, помещенной в кювету. формировали в плазме агарозный гель (0.2%). Использовали агарозу с температурой полимеризации 36° С (Ника). Расплавленную агарозу добавляли в плазму, прогретую до 38° С и переносили смесь в кювету. Агарозный гель образовывался за 10-15 секунд. Эксперименты проводили при

температуре 36° С. С целью разрушения коллагеновых структур в составе фрагмента аорты, обрабатывали фрагмент раствором коллагеназы (200 Ед/мл). Обработку вели в течении ночи при 4° С. Для удаления остатков фермента и лизированного коллагена отмывали обработанный фрагмент аорты в Tris-HCL буфере pH 7.4. В работе были такж.е использованы моноклональные антитела к 1-У типам коллагена человека и поликлональные антитела кролика к I, II, III и IV-V коллагена человека. Все антитела были получены в группе инженерной иммунологии ИЭК КНЦ. Для обработки фрагмента аорты использовали раствор антител 100 мкг/мл в Tris-HCl буфере pH 7.4. Обработку фрагмента аорты раствором антител вели в течении ночи при 4° С. Реконструированные фибриллярные коллагены человека получали диализом кислого раствора высокоочшденных мономерных коллагенов человека в нейтральный буфер. Адсорбцию коллагенов (мономерных и фибриллярных) на полистироловую поверхность, осуществляли высушиванием раствора коллагена в лунках микроплашек для иммуноферментного анализа. Концентрацию антитромбина III в плазме крови снижали с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбенте, содержащем аффинно очищенные поликлонадьные антитела к антитромбину III человека. Антитела иммобилизовали на BrCN-Sepharose 4В (Pharmacia, Швеция) по рекомендуемой фирменной методике. Концентрацию антйтромбина III в плазме крови измеряли при помощи разработанной; нами иммуноферментной тест-системы. Плазму крови с различной концентрацией антитромбина III получали смешиванием нативной и истощенной на аффинном сорбенте плазмы. Концентрацию протеина С в плазме крови снижали хроматографией на аффинном иммуносорбенте, содержащем моноклональные антитела к протеину С человека. Содержание протеина С в плазме крови определяли используя специфический хромогенный субстрат S-2366(Kabi,Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активация коагуляционной системы в плазме крови на различных поверхностях.

Для сравнения скорости фибринообразования при активации внутренней или внешней систем свертывания использовали в качестве активатора: 1 - осколки стекла, 2 -фрагмент артериального кровеносного сосуда с поврежденным эндотелием. Было обнаружено, что стеклянный капилляр и фрагмент кровеносного сосуда активируют свертывающую систему, в результате чего на их поверхностях образуется фибрин, который наблюдался в виде мутного геля на фоне прозрачной плазмы. Способность стекла и фрагмента кровеносного сосуда активировать фибринообразование в условиях нашего эксперимента значительно различалась. Начало

фибринообразования приходились на 3-4-ю минуты и 8-12-ю минуты для фрагмента кровеносного сосуда и стекла соответственно. Далее на поверхности фрагмента кровеносного сосуда происходил быстрый рост фибринового сгустка, равномерный по всем направлениям. На поверхности стекла рост фибринового сгустка происходил медленно и неравномерно. Через 20 мин. после., контакта плазмы и активатора размеры фибриновых сгустков были: около 1 мм на поверхности фрагмента кровеносного сосуда и менее 0.5 мм на поверхности стекла. Исходя из результатов данного предварительного эксперимента мы выбрали для дальнейших работ фрагмент артериального сосуда в качестве активатора свертывания.

Определяли механизм активации свертывающей системы фрагментом аорты. На первом этапе выясняли возможность участия коллагена стенки сосуда в контактной активации свертывающей системы. Не было обнаружено различий в фибринообразовании ,-на поверхности обработанного и необработанного коллагеназой фрагментов кровеносного сосуда. Начало фибринообразования, скорость роста фибринового сгустка и его размеры были одинаковы в обоих случаях. Для дальнейшей проверки использовали моно- и шшшгональные

антитела к колагену человека различных типов. Не было обнаружено различий в способности активировать фибринообразование между фрагментами сосуда обработанного и не обработанного антителами к коллагену человека (как моно, так и поликлональными). С целью дальнейшей проверки способности коллагена активировать фибринообразование в плазме крови, лишенной тромбоцитов, использовали высокоочищенные препараты коллагена человека I-III типов, адсорбированные на полистироловую поверхность. Обнаружили, что в лунках с адсорбированными коллагенами, как и в лунках без коллагенов, процесс фибринообразования не наблюдается в течении 30 мин. и более. На основании полученных результатов сделали вывод о том, что коллаген, входящий в состав сосудистой стенки не принимает участия в активации коагуляционной системы плазмы крови. Эти результаты подтверждают литературные данные, согласно которым коллаген не активирует свертывание крови в отсутствии тромбоцитов.

Для определения роли жирорастворимых компонентов в составе фрагмента сосуда в инициации процессов свертывания отмывали фрагмент сосуда в ацетоне. Использовали водно-ацетоновые смеси различной насыщенности (10%,30%,50%,70% и 100% концентрация ацетона). Фрагмент артериального сосуда площадью 0.2 см2 отмывали в ацетоновом растворе 20 мин. Обнаружили, что способность фрагмента сосуда, обработанного ацетоновым раствором, инициировать фибринообразование снижается обратно пропорционально концентрации ацетона в используемом для отмывки растворе. Полное подавление способности фрагмента сосуда активировать свертывание в плазме наблюдалось при обработке фрагмента 0.5 мл 70% ацетона. Однако, • при увеличении объема ацетонового растворителя подавление активирующей способности фрагмента наблюдалось и при более низких концентрациях ацетона (30% раствор ацетона при объеме раствора 5 мл). Из известных активаторов, содержащих в своем составе жирорастворимые компоненты, в составе аорты может присутствовать

тромбопласган. Свертывание плазмы на поверхности фрагмента аорты, по всей видимости, определяется присутствием этого компонента.

Развитие фибринового сгустка в плазме крови, бедной тромбоцитами.

Устройство для наблюдения роста фибринового сгустка при отсутствии протока жидкости использовали для определения момента начала фибринообразования и скорости роста фибринового сгустка. Через 3,5 минуты после контакта плазмы с фрагментом аорты в месте их контакта появлялось помутнение, что служило первым признаком начала образования фибринового геля. Помутнение одновременно и равномерно обнаруживалось вокруг всего фрагмент^ аорты. На 5-й минуте после контакта плазмы крови с фрагментом аорты отчетливо наблюдался слой полупрозрачного фибринового геля на поверхности фрагмента. В последующие за началом фибринообразования 12-15 минут происходило равномерное увеличение толщины фибринового слоя от поверхности фрагмента аорты вглубь плазмы. Остальная плазма, находящаяся в микрокювете, в течении всего эксперимента (40 минут) оставалась несвернувшейся. После 15-ти минутного периода быстрого роста фибринового сгустка наблюдалось снижение, скорости роста. В последующие 10 минут фибриновый сгусток незначительно увеличивал свои размеры. Через 25-30 минут после начала эксперимента рост фибринового сгустка прекращался, и в период от 30 до 40 минут эксперимента в микрокювете не происходило каких-либо видимых изменений. За все время роста фибринового сгустка (20-25 минут) его размеры достигали 1,1-1,3 мм. Причем, более 80% линейного прироста происходило за 15 минут. Толщина фибринового слоя была одинакова во всех направлениях от поверхности фрагмента сосуда вглубь плазмы. .

Условно процесс развития фибринового сгустка можно разделить на три стадии: 1-период активации факторов свертывания, не сопровождающийся образованием фибринового геля (первые 4 мин. эксперимента), 2- период быстрого роста

фибринового сгустка (последующие 15 минут эксперимента), 3-период замедления скорости роста сгустка до полной остановки. Для определения влияния размеров активирующей поверхности на параметры фибринообразования использовали фрагмент сосуда площадью 0,4 см2. Все остальные параметры эксперимента оставались без изменений. При этом было обнаружено, что время начала фибринообразования и конечные линейные размеры фибринового сгустка оставались такими же, что и при использовании фрагмента аорты размером 0,2 см2. Скорость роста сгустка в обоих случаях оставалась одинаковой. С целью подтверждения отсутствия конвекции в плазме с сформированным в ней агарозным гелем наблюдали процесс диффузии гемоглобина в 0,2% агарозном геле. Пористый полипропилен, пропитанный раствором гемоглобина (100 мг/мл) помещали в микрогаовету. В предварительных экспериментах было установлено, что регистрируемая визуально концентрация гемоглобина составляет около 3 мг/мл или 3% от начальной концентрации гемоглобина в месте внесения. Наблюдалось равномерное продвижение окрашенного фронта гемоглобина вглубь агарозного геля, что могло свидетельствовать об отсутствии конвективных потоков жидкости в областях, прилегающих к помещенному в микроюовету полипропилену. Процесс диффузии гемоглобина регистрировался с помощью фотосъемки в течении 40 мин. Диффузионный характер распространения гемоглобина был подтвержден теоретическими расчетами. Расстояние, на которое может переместиться фронт диффундирующих молекул было расчитанно:

где х - расстояние проходимое фронтом диффундирующих молекул, й- коэффициент диффузии молекулы, 1- время дифузии. Коэффициент диффузии для молекулы гемоглобина приняли равным 4.2 хЮ"11 пА-1. Обнаружили высокую степень совпадения теоретически расчитанной скорости продвижения фронта при диффузии молекул массой 70 Юа и реально наблюдаемой диффузии гемоглобина б агарозном геле. При этом скорость роста фибринового сгустка, наблюдаемая в наших экспериментах почти

на порядок превосходила скорость диффузии макромолекул в антиконвективной среде (рис.1).

Размер (мьф

Дкм! (мин)

Рис.1. Сравнение скорости роста фибринового сгустка и диффузии гемоглобина в антиконвекционной среде. А - рост фибринового сгустка в плазме крови, В - диффузия гемоглобина, С - теоретически расчитанная скорость продвижения диффузионного фронта макромолекул с массой 70Юа Кроме того, скорость роста фибринового сгустка на протяжении 15 мин. оставалась практически неизменной, в то время как скорость диффузионного распространения непрерывно снижалась.

Развитие фибринового сгустка в присутствии тромбоцитов.

Для определения влияния тромбоцитов на динамику развития фибринообразования использовали плазму крови, богатую тромбоцитами. Техника постановки эксперимента несколько отличалась от предыдущих серий опытов. В данной серии экспериментов использовали плазму без внесения агарозы. Для сравнения результатов фибринообразования в бедной (РРР) и богатой (РКР) тромбоцитами плазмы, эксперименты с использованием обоих типов плазмы проводили параллельно.

Было обнаружено, что образование сгустка на поверхности фрагмента аорты начинается одновременно в РРР и РЛР (на 4-й

минуте после контакта плазмы с фрагментом аорты). Далее следовал период быстрого роста фибринового сгустка в обоих типах плазмы. В РЛР рост фибринового сгустка происходил на 20-40% быстрее, чем в РРР.

В РЯР более интенсивное фибринообразование не давало возможности проследить конечные этапы развития сгустка в нашем эксперименте.

На рис.2 изображены графики роста сгустков в РРР и Р11Р.

Размер (мм) •

Рис.2 Развитие фибриновых сгустков в плазме крови в присутствии и отсутствии тромбоцитов. А - рост сгустка в отсутствии тромбоцитов В - рост сгустка в присутствии тромбоцитов

Влияние гепарина на рост фибринового сгустка в плазме крови.

Введение экзогенного нефракционированного гепарина в образец используемой в эксперименте плазмы вызывало снижение скорости роста фибринового сгустка. При этом время начала фибринообразования заметным образом не изменялось. Скорость роста фибринового сгустка снижалась обратно пропорционально концентрации добавленного в плазму гепарина. При концентрации гепарина в плазме 1 Ед/мл фибринообразование

полностью подавлялось. При использовании концентраций гепарина от 0,05 до 0,2 Ед/мд плазмы рост фибринового сгустка происходил равномерно». Не наблюдалось остановки роста сгустка в случае использования концентраций гепарина в плазме от 0.05 Ед/мл до 0.2 Ед/мл(рис.З).

йзмр(мм)

Рис.3. Развитие фибриновых сгустков в плазме крови в присутствии гепарина. А- нативная плазма В - плазма с гепарином 0,05 Ед/мл С - плазма с гепарином 0,1 Ед/мл D -плазма с гепарином 0,2 Ед/мл

Рост ФИБРИНОВОГО СГУСТКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ АНГИТРОМБИНА III.

С целью определения роли антитромбина III (ATIII) в процессе остановки роста фибринового сгустка изучали фибринообразование в плазме с различными концентрациями ATIII. ATIII удаляли из плазмы используя аффинный иммуносорбент с антителами к ATIII человека, иммобилизованными на BrCN-Sepharose. Концентрацию ATIII измеряли с помощью иммуноферментного анализа. После однократного пропускания 1мл плазмы через 0,5 мл аффинного сорбента концентрация ATIII снижалась более чем на 95% от начальной. Для получения образца, содержащего 80% ATIII от начальной концентрации, смешивали 750 мкл нативной и 250 мкл

истощенной на иммуносорбенте плазмы. В качестве контроля параллельно проводили эксперимент с нативной плазмой. Не было обнаружено никаких различий в процессах фибринообразования, происходящих в нативной плазме и плазме, содержащей 80% АТШ от начального уровня(рис.4).

Проводили дальнейшее снижение уровня АТШ в образце используемой плазмы. Наблюдали фибринообразование в плазме, содержащей 60% АТШ от начальной концентрации. Техника эксперимента не изменялась. В качестве контроля параллельно проводили эксперимент с нативной плазмой. Обнаружили, что время начала фибринообразования в обоих образцах плазмы одинаково и составляет 3,5-4 мин. после контакта плазмы с фрагментом аорты. Рост фибриновых сгустков на поверхности фрагмента аорты проходил с одинаковой скоростью в обоих образцах плазмы. Однако в образце со сниженной до 60% от нормы концентрацией- АТШ на 10-12 мин. от начала эксперимента начиналось спонтанное образование фибриновых сгустков в объеме плазмы. Эти сгустки не были ассоциированы с поверхностью фрагмента аорты и обнаруживались по всему объему микрокюветы 'Далее происходил одновременный рост фибриновых сгустков на поверхности фрагмента аорты и в объеме микрокюветы. Эксперимент удавалось проводить до 25-30 мин. Далее фибриновые сгустки заполняли собой большую часть объема микрокюветы ' и не давали возможности наблюдать развитие сгустка на поверхности фрагмента аорты. При этом было отмечено, что фибриновые сгустки не сливаются друг с другом и между ними остается тонкая прозрачная граница. В интервале времени :от 0 до 30 мин. эксперимента фибринообразование на поверхности фрагмента аорты не отличалось в нативной-" и обедненной по АТШ плазме(рис.4). Исследовали фибринообразование в плазме, содержащей 40% АТШ от исходного уровня. В качестве контроля наблюдали рост фибринового сгустка в нативной плазме. Было обнаружено, что время начала фибринообразования не различалось при использовании нативной плазмы и плазмы, содержащей 40%

АТШ и приходилось на 3,5-4 мин. после контакта плазмы с фрагментом аорты. На 7-8-й мин. после начала эксперимента в

Размгр (мм)

Время (мин)

ч

Рис.4. Развитие фибриновых сгустков в плазме крови с различной концентрацией антотромбина III. А - нативная плазма крови В - плазма крови с 80% содержанием АТШ от начального уровня С - плазма крови с 60% содержанием АТШ от начального уровня

плазме, содержащей 40% АТШ от начальной концентрации, начиналось многоцентровое фибринообразование, не связанное с поверхностью активатора. Количество спонтанно образующихся в объеме плазмы микросгустков значительно превышало таковое при 60% насыщении ATIII. Рост фибринового сгустка на поверхности фрагмента аорты удавалось проследить в течении 1012 мин. Далее спонтанно образующиеся в плазме микросгустки заполняли весь объем кюветы. Как и в случае использования плазмы с 60% содержанием АТШ не происходило слияния микросгустков и между ними наблюдались отчетливые границы. Сравнение размеров фибриновых сгустков, образующихся на поверхности фрагмента аорты, в контрольной и обедненной по АТШ плазме показало-, что в течение 15 мин. эксперимента различий не наблюдается (рис.5). Следующий эксперимент

проводили с использованием плазмы, содержащей не более 5% АТШ от начальной концентрации. В данном эксперименте рост фибринового сгустка на поверхности фрагмета аорты обнаружить не удалось. Весь объем плазмы сворачивался в течении короткого времени (менее 10 мин.). Многоцентрового фибринообразования в данном случае не" наблюдалось. Проверяли возможность активации плазмы при контакте с иммуносорбентом. Пропускали

Размер (мм)

Рис.5. Развитие фибриновых сгустков в плазме крови с различной концентрацией антитромбина III. А - нативная плазма

В - плазма с 40% содержанием АТШ от начальной концентрации С - плазма с 5% содержанием АТШ от начальной концентрации плюс гепарин (1 Ед/мл)

1мл плазмы через 0,5 мл сорбента с иммобилизованными иммуноглобулинами козы. Исследовали фибринообразование в нативной и пропущенной через сорбент плазме. Не обнаруживалось различий в фибринообразовании при использовании нативной и контактировавшей с сорбентом плазмами. В плазме, пропущенной через сорбент не обнаруживалось спонтанного фибринообразования, не ассоциированного с поверхностью фрагмента аорты.

В плазму с содержанием АТШ 5% от нормы добавили нефракционированный гепарин (1Ед/мл). Проверили возможность фибринообразования в полученной смеси на поверхности фрагмента аорты. В отличие от плазмы с 5% от нормы уровнем АТИГ не содержащей гепарина, в плазме с добавленным гепарином наблюдалось фибринообразование на поверхности фрагмента аорты. В течении 40 мин. эксперимента не было обнаружено спонтанного фибринообразования в объеме плазмы. Время начала фибринообразования, скорость роста и время остановки роста фибринового сгустка в плазме с 5% содержанием АТШ + 1Ед/мл гепарина были такие же, как в нативной плазме (рис.5).

Рост фибринового сгустка в плазме с низким уровнем протеина С.

Концентрацию протеина С в плазме снижали его адсорбцией на аффинном иммуносорбенте с иммобилизованными моноклональными антителами к протеину С. По результатам анализов установили, что однократное пропускание 1 мл плазмы через колонку с 200 мкл сорбента, содержащего антитела к протеину С, не приводит к снижению концентрации АТШ и фибриногена. Амидолитическая активность протеина С, обнаруживаемая в плазме по реакции с хромогенным субстратом до хроматографии, практически полностью исчезает после ее проведения. В элюате с сорбента, содержащего антитела к протеину С, обнаруживается высокая амидолитическая активность по отношению к специфическому для протеина С субстрату. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что хроматография плазмы на сорбенте, содержащем моноклональные антитела к протеину С приводит к адсорбции протеина С, не истощая при этом АТШ. Изучали процесс развития фибринового сгустка в плазме с низким уровнем протеина С. Было обнаружено, что процесс фибринообразования начинается на 4-й минуте после контакта плазмы с фрагментом аорты. В течении последующих 10-15 минут рост фибринового

сгустка на поверхности фрагмента аорты происходил так же, как в контрольной плазме с нормальным уровнем протеина С. Не наблюдалось спонтанного образования фибриновых сгустков в объеме плазмы, как в случае снижения уровня ATIII. После 15-й минуты от начала эксперимента развитие фибриновых сгустков в плазме с нормальным и низким уровнем протеина С происходило по-разному. В плазме с нормальным уровнем протеина С фибриновый сгусток замедлял скорость роста. В плазме с низкой концентрацией протеина С фибриновый сгусток продолжал свой рост с прежней скоростью (около 60 мкм/мин). После 25-й мин. эксперимента фибриновый сгусток в плазме с нормальным уровнем протеина С практически полностью останавливал свой рост. В плазме с низким уровнем протеина С рост фибринового сгустка продолжался стрежней скоростью. Через 40 минут после начала эксперимента размеры фибриновых сгустков на поверхности фрагмента аорты составляли: 1,1-1,3 мм в плазме с нормальным уровнем протеина С; 1,8-2 мм в плазме с низким содержанием протеина С. Таким образом удаление протеина С из плазмы не влияло ría время начала фибринообразования и скорость роста фибринового сгустка. Однако при удалении из плазмы протеина С не'происходит остановки роста фибринового сгустка (рис.6).

Проводили эксперимент, в котором использовалась плазма крови с низкой концентрацией протеина С и 60% содержанием от нормы ATIII. Фибринообразование в плазме с пониженным содержание антикоагулянтов, как и в нативной плазме, начиналось на 4-й минуте после контакта плазмы с фрагментом аорты. Далее сгусток рос с одинаковой скоростью в нативной плазме и плазме с пониженным уровнем антикоагулянтов. На 10-й минуте в плазме с низким уровнем протеина С и ATIII происходило образование фибриновых сгустков, не ассоциированных с поверхностью фрагмента аорты. Через 25 минут после начала * эксперимента весь объем плазмы в микрокювете оказывался заполненным спонтанно образующимися фибриновыми сгустками.

Размер (мм)

Врсш (мин)

Рис.6. Развитие фибриновых сгустков в плазме крови с различным содержанием протеина С. А - нативная плазма В - плазма с низким содержанием протеина С

В целом картина повторяла результаты экспериментов с плазмой, в которой снижали' только уровень АТШ. Однако в экспериментах с использованием плазмы с пониженным уровнем АТШ фибриновые сгустки не сливались друг с другом и между ними оставались отчетливые границы. При одновременном удалении из плазмы протеина С и снижении уровня АТШ границы между спонтанно образующимися фибриновыми сгустками не наблюдалось и весь объем плазмы оказывался заполненным однородным фибриновым гелем.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая изучать процесс роста фибринового сгустка в плазме крови in vitro. Модель обладает следующими отличительными особенностями:

а) Развитие фибринового сгустка происходит в среде с подавленной конвекцией, что устраняет искажения, вносимые размыванием активированных факторов свертывания потоками плазмы.

б) Имеется возможность визуально регистрировать развитие фибринового сгустка.

в) Имеется возможность регистрировать время начала фибринообразования и скорость роста фибринового сгустка.

2. В используемой системе фрагмент деэндотелизованного кровеносного сосуда эффективно осуществляет активацию свертывающей системы в плазме крови в отсутствии тромбоцитов. При этом коллаген, входящий в состав стенки сосуда не принимает участия в процессе активации свертывания.

3. Обнаружено три стадии в развитии фибринового сгустка:

а) этап активации свертывающей системы и образование первых микроколичеств фибрина на поверхности активатора (фрагмента аорты).

б) этап быстрого роста фибринового сгустка от поверхности активатора вглубь плазмы.

в) этап замедления скорости роста фибринового сгустка, вплоть до полной остановки роста.

Снижение концентрации протеина С в образце плазмы устраняет эффект самопроизвольной остановки роста фибринового сгустка.

4. Определено, что в используемой модельной системе скорость роста фибринового сгустка значительно превосходит скорость распространения фронта диффундирующих макромолекул в антиконвекционной среде.

5. В используемой системе время начала фибринообразования при активации свертывающей системы в плазме крови фрагментом аорты не зависало от наличия или отсутствия в плазме тромбоцитов.

6. Исследовано влияние различных доз нефракционированного гепарина на активацию свертывания и рост фибринового сгустка в плазме крови. Концентрация

гепарина 1 Ед/мл плазмы полностью подавляет фибринообразование. При более низких концентрациях гепарина (от 0 до 0.2 Ед/мл плазмы) фибринообразование происходит. Время начала фибринообразования в диапазоне концентраций добавленного гепарина от 0 до 0.2 Ед/мл плазмы не изменяется. Скорость роста фибринового сгустка находится в обратной зависимости от концентрации гепарина в плазме.

7. Установлено, что в используемой системе антитромбин III не шрает значимой роли в процессе роста и остановки роста фибринового сгустка. Обнаружено, что снижение уровня антитромбина III в образце используемой плазмы крови ведет к спонтанному мультицентровому фибринообразованию в объеме плазмы, не ассоциированному с поверхностью активатора (фрагмента аорты).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. M.Y.Matveyev, A.V.Navdayev, and S.P.Domogatsky // Characterization of monoclonal antibodies prepared by immunization with clotted blood plasma. 1994.-p.62.- 3rd German-Russian Workshop Biotechnology.- Berlin, Germany, Oktober 3-5.

2. A.V.Navdayev, S.P.Domogatsky // Antithrombin III does not participate in restriction of fibrin clot growth, but suppresses spontaneous clotting of blood plasma in vitro. Haemostasis.- 1996.-26(Suppl 3), N abstract 514. 14th International Congress on Thrombosis, Montpellier, France.

3. A.B. Навдаев, С.П. Домогатский// Визуализация • фибринообразования в плазме крови in vitro. Особенности инициации и развития фибринового сгустка. 1997- Деп. в ВИНИТИ, № 167В - В97

4. А.В. Навдаев, С.П. Домогатский// Визуализация фибринообразования в плазме крови in vitro. Влияние антикоагулянтов на инициацию и развитие фибринового сгустка. 1997- Деп. в ВИНИТИ, № 1679 - В97

5. А.В. Навдаев, С.П. Домогатский// Визуализация роста фибринового сгустка. Клин. лаб. диагност. - 1997. ( в печати ).