Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro"

На правах рукописи

КАРАМЗИН Сергей Сергеевич

Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка т-укго

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

003490907

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор С.А. Васильев;

доктор биологических наук, Ю.Г. Каминский

Ведущее учреждение - Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится "¿О" О ■/ 2010 г. в час,

на заседании диссертационного совета Д001.042.02 в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Гематологический Научный Центр РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан "// " 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Основная задача системы свертывания крови - предотвратить кровопотерю при нарушении целостности сосудистого русла, «залепив» место повреждения плотным гемостатическим сгустком. Это достигается за счет локального перехода плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе места повреждения. Любое повреждение сосудистого русла приводит к тому, что кровь вступает в контакт со специальным трансмембранным белком — тканевым фактором и запускает систему ферментативных реакций свертывания, приводящую к формированию непроницаемого для жидкости гемостатического сгустка. Система реакций свертывания состоит из нескольких десятков белков, взаимодействующих друг с другом во множестве реакций. Такое устройство системы необходимо для эффективного управления процессом образования фибринового сгустка. В норме сгусток фиксированного размера формируется только в месте повреждения, и свертывание крови не затрагивает другие области кровотока. Теоретические работы по модульной декомпозиции данной системы позволяют выделить три основные фазы процесса свертывания: фазу активации, фазу пространственного роста и фазу торможения роста сгустка. При этом в каждой фазе существенную роль играют разные биохимические реакции, а сами фазы выделены как во времени, сменяя друг друга, так и в пространстве, происходя в разных частях сгустка. Представления о фазах процесса свертывания и роли различных белков и реакций в каждой из фаз сформировались в основном в результате работ по математическому моделированию данной системы и лишь частично подтверждены экспериментально. Эффективным методом экспериментальной проверки гипотезы о многофазности процесса свертывания, который позволил бы получить количественные характеристики этих фаз, может служить метод исследования пространственной динамики свертывания ¡п-укго. Сущность метода заключается в локальной активации свертывания и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком слое неперемешиваемой плазмы крови. Однако качественной технической реализации данного экспериментального метода до сих пор предложено не было. Созданные ранее экспериментальные системы имели ряд существенных недостатков, приводящих к большим погрешностям при измерении параметров пространственной динамики свертывания. А использование культуры клеток (фибробластов) в качестве активатора свертывания делало метод трудоемким и снижало воспроизводимость результатов измерения.

Задача дифференцировки и количественной оценки фаз процесса свертывания становится особенно актуальной в свете представлений о том, что различные патологии по-разному влияют на активность отдельных компонент системы свертывания, приводя к выраженным изменениям в различных фазах процесса. Нарушения в механизмах свертывания клинически проявляются либо кровотечением, либо тромбозом, либо одновременно обоими этими явлениями и являются одной из ведущих причин смертности в мире. Во многом это обусловлено тем, что существующие методы диагностики нарушений свертывания далеки от совершенства. В основе большинства из них лежит принцип определения времени полного свертывания образца крови или плазмы при добавлении вещества-активатора и его полном перемешивании в пробирке. Однако в организме сгусток пространственно образуется не во всем объеме крови, а строго локально - только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При этом диффузия факторов свертывания играет важную роль в процессе пространственного роста сгустка и его локализации. Основным недостатком существующих методов является то, что они плохо отражают реальное состояние гемостаза ¡плауо и мало чувствительны к гиперкоагуляционным состояниям системы свертывания. Эти методы не позволяют учесть пространственную неоднородность процесса свертывания: разделить фазы инициации, пространственного роста и остановки роста сгустка и тем более провести их количественную оценку.

Цель работы:

Экспериментальное исследование пространственной динамики роста фибринового сгустка т-укго в условиях, близких к условиям свертывания крови ¡п-уК'О, и создание измерительного прибора для количественной оценки основных фаз процесса свертывания крови в норме и патологии.

Задачи исследования:

1. Разработать и создать измерительный прибор, способный регистрировать и количественно оценивать пространственную динамику свертывания плазмы крови т-укго.

2. Проверить теоретические представления о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка.

3. Определить границы основных количественных характеристик фаз пространственного роста фибринового сгустка у здоровых лиц и показать чувствительность прибора к гипо- и гиперкоагуляционным состояниям в случае различных нарушений в системе гемостаза.

4

Научная новизна.

Разработан и создан новый измерительный прибор, позволяющий исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка в плазме крови in-vit.ro. Получено экспериментальное подтверждение существования основных фаз процесса свертывания и предложены способы их численной оценки. Показана высокая чувствительность прибора как к гипо-, так и гиперкоагуляционным состояниям, возникающим при различных патологиях (гемофилии, сепсис, онкологические заболевания). Показана возможность измерения прибором не только пространственных особенностей формирования конечного продукта работы системы свертывания - фибринового сгустка, но и возможность одновременного исследования кинетики образования главного фермента этой системы - тромбина, а также измерения эндогенного тромбинового потенциала - основного параметра, вычисляемого в тесте генерации тромбина.

Научно-практическое значение. ,

Разработанный прибор позволяет регистрировать нарушения в плазменной системе гемостаза, недоступные для существующих ныне подходов, и служит важным дополнением к существующим методам диагностики. Возможность ¡п-уИго измерять все пространственно-динамические параметры образования фибринового сгустка в плазме конкретного человека — плотность сгустка, скорость его роста и др. - предоставило в руки врача инструмент огромной предсказательной силы. Использование данных приборов в клинической практике позволит коренным образом улучшить качество диагностики нарушений гемостаза и снизить смертность и инвалидность среди населения. Кроме того, прибор позволяет т-укго изучать влияние лекарственных препаратов на систему свертывания в условиях, близких к физиологическим условиям, предоставляя важную информацию о механизмах их действия. Применение флуорогенных субстратов позволяет получать детальную информацию о пространственной кинетике отдельных факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и тем самым верифицировать математические реакционно-диффузные модели процесса свертывания.

Положения, выносимые на защиту:

1. Проведено экспериментальное исследование пространственной динамики свертывания плазмы крови ¡п-укго в условиях, близких к условиям свертывания крови ¡плауо. Подтверждена гипотеза о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка. Получены количественные характеристики фаз.

2. Сформулированы технические требования к прибору, позволяющему проводить диагностику нарушений свертывания при различных патологиях. Созданы опытные образцы приборов.

3. Показана высокая информативность результатов измерения параметров пространственной динамики свертывания при различных патологиях гемостаза и чувствительность прибора как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям.

4. Прибор позволяет исследовать пространственную кинетику образования тромбина в процессе роста фибринового сгустка, а также измерять эндогенный тромбиновый потенциал исследуемого образца плазмы.

Апробация работы состоялась 09 ноября 2009 г. на заседании проблемной комиссии № 6 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на 4th International Symposium on Computation Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Method Resources (Москва, сентябрь 2007), на международной конференции Modeling of Blood Diseases (Lyon, Франция, ноябрь 2007), на 1-м Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, Декабрь 2008), на 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Wien, Австрия, февраль 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 тезисов в сборниках трудов 7 конференций и 1 статья. Подано 2 патентных заявки на изобретения РФ. Получено положительное заключение о выдаче патентов от 02.11.2009 и 03.12.2009.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов исследования, главы 3 — описания результатов исследования и главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 148 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Ф.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Используемые реактивы: СаС12 (Sigma, США); NaCl, цитрат Na (Реахим, Россия); 10% раствор молочной кислоты; флуорогенный пептидный субстрат ВОС-Ile-Gly-Arg-AMC, где ВОС - t-N-бутоксикарбонил, АМС - остаток 4-метил-7-аминокумарина (Институт биологической и медицинской химии РАМН); 4-метил-7-аминокумарин - АМС (Sigma, США); ингибитор фактора ХПа - ингибитор трипсина из зерен кукурузы (CTI) (Институт белка РАН, Пущино).

Доноры крови: 1) Плазма крови нормальных доноров, у которых не было болезней свертывания крови. В работе использовано 10 образцов плазмы отдельных доноров и 9 пулов плазмы, состоящих из трех или шести доноров. Кровь забирали на Станции Переливания Крови (СПК) ГНЦ РАМН. 2) Плазма крови 7 больных тяжелой формой гемофилии А с коагуляционной активностью ф. VIII < 1 %. Плазму крови получали из диспансерного научно-методического отделения по гемофилии и медицинской генетике ГНЦ РАМН. 6 больных не получали ф. VIII в течение 3 суток, затем им вводился препарат Гемоктин (ф. VIII) в дозе 50 МЕ/кг, один больной не получал ф. VIII в течение 5 суток, затем ему вводился Гемоктин в дозе 20 МЕ/кг. У больных бралась кровь на исследование через 0.5, 1, 3, 6, 24 и 48 часов после введения препарата. 3) Плазма крови 12 иммунокомпрометированных больных в состоянии сепсиса и септического шока, находящихся в отделении анестезиологии и реанимации ГНЦ РАМН. Троим больным проводилась инфузия концентрата антитромбина III до повышения его активности в плазме выше 120%. В первый день - болюсная инфузия 3000-7000 ME в течение 30 минут. Затем - круглосуточная непрерывная инфузия 5000-6000 ME в течение 96 часов. Двоим больным проводилась инфузия концентрата активированного протеина С со скоростью введения 24 мкг/кг/час в течение 96 часов. 4) Плазма крови одного больного множественной миеломой получена в отделении химиотерапии гемобластозов ГНЦ.

Получение плазмы крови: кровь доноров и пациентов заготавливали на 3.8 % цитратном буфере (рН 5.5), соотношение кровь: цитрат составляло 9:1. После предварительного отделения эритроцитов центрифугированием в течение 15 минут при 1600g плазму центрифугировали 5 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. Сразу после приготовления рН в плазме стабилизировали на уровне 7.2 - 7.4 путем инкубации в течение часа при 37°С с молочной кислотой (14 мкл 10% молочной кислоты на 1 мл плазмы) в условиях контакта с атмосферным воздухом. Для предотвращения контактной активации в плазму добавляли CTI в конечной концентрации 0.2 мг/мл. Чтобы обеспечить в плазме конечную концентрацию свободных ионов кальция, равную физиологической, в начале исследования

7

проводили рекальцификацию образца (20 мкл 1 M раствора хлорида кальция на 1 мл плазмы). Для изучения двумерной кинетики образования тромбина использовался флуорогенный субстрат BOC-Ile-Gly-Arg-AMC. Концентрация субстрата в плазме составляла 400 мМ. Плазму с субстратом перед экспериментом инкубировали в течение 10 минут при 37°С.

Метод измерения: в качестве метода исследования процесса пространственного роста фибринового сгустка был выбран метод пространственной динамики свертывания, разработанный в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН под руководством профессора Ф.И. Атауллаханова. Сущность метода заключается в локальной активации свертывания и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы крови с добавленным ингибитором контактной активации свертывания.

Измерительная кювета: детали кюветы вырезались методом лазерной резки из листов полистирола общего назначения без легирующих добавок (ингибиторов ультрафиолетового излучения) толщиной 1 мм. Детали кюветы соединялись между собой и проклеивались по периметру клеем на основе дихлорэтилена с добавками полистироловой стружки.

Активатор свертывания: в качестве активатора свертывания выступает тонкая пленка с иммобилизованным тканевым фактором (ТФ). ТФ иммобилизован на пластиковую поверхность, предварительно активированную с помощью полиэтиленимина, химическим методом через глутаровый альдегид. Метод иммобилизации ТФ на пластиковую поверхность был разработан в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН O.A. Фадеевой.

Измерительный прибор: для поддержания необходимой температуры во время проведения измерения в качестве нагревателей водяного термостата использовались резисторы СВЧ постоянные непроволочные для полосковых линий PI-3-25 (ЗАО «Реом», Россия). Для контроля температуры - цифровой датчик температуры ADT7301 («Analog Devices», США). Освещение кюветы осуществлялось через вклеенное в переднюю стенку термостата стекло С VI Melles Griot PW-1512-UV («CVI», США) светодиодными сборками. Использовались две красных (OTLH-0040-RD) и одна ультрафиолетовая (УФ) (OTLH-0480-UV) сборки («Optotech», США). Для разделения спектров возбуждения и излучения AMC использовалась система оптических фильтров (FF01 -425/527/615-25 и FF01 -370/36-25, Semrock, США). Рассеянное сгустком излучение или излучение флуоресценции фокусировалось макрообъективом Canon МР-Е 65 Í2.8 1-5х macro foto («Canon», Япония) на высокочувствительный 16-битный ПЗС датчик цифровой фотокамеры Alta U9000

8

(«Apogee», США) или фотокамеры Meade DSI III Pro («Meade», США), в зависимости от модификации прибора. Для регулировки яркости и режима работы светодиодов, а также управления нагревом термостата использовались две специально разработанные платы управления, центральными компонентами которых были микропроцессоры ATtiny 2313 («Atmel», США) и MSP430 («Texas Instruments», США). Питание электронных компонентов прибора осуществлялось от блока питания RS-24-50 (выходное постоянное напряжение 24 В; мощность 50 Вт; производитель «MeanWell», Тайвань).

Программное обеспечение: для получения фотографий растущего фибринового сгустка и вычисления параметров пространственной динамики роста использовалась программа Thrombolmager (ЗАО «АСТ», Россия, Москва) и Maxim DL 4.62 (Diffraction Limited, Канада). Процедуры восстановления сигнала тромбина из сигнала флуоресценции АМС реализованы в программной среде MathCAD 12 (Parametric Technology Corporation, США). Наложение цветовых карт и создание видео роста сгустка производилось в программе VirtualDub 1.8.6. (свободно-распространяемое программное обеспечение, автор Avery Lee).

Результаты

Стандартная лабораторная посуда мало пригодна для исследования параметров пространственной динамики свертывания плазмы, т.к. не позволяет создать оптимальные условия для протекания процесса и его регистрации. В работе была разработана специальная измерительная кювета, выполненная в виде вертикальной тонкостенной емкости с герметичным каналом (рис. 1).

Г4"' /

! f4 k s*-Вставка с

¿Sfi ! j! fc. 1 ji §S> I i; | L P V ^ активатором i. на торце

+ î ~ 1-Я' U-Кювета ЁШчГ

ixi. ц| ! VvN ъу-Активатор Щ/—Плазма

Составные детали кюветы Кювета Активатор Сборка

Рис. 1. Кювета для проведения исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови (размеры в мм). Составные детали кюветы складываются между собой и проклеиваются по периметру клеем на основе дихлорэтилена. В получившуюся кювету с помощью лабораторной микропипетки заливается 50 мкп рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазмы. Затем в кювету вставляется вставка, на торце которой закреплен активатор свертывания. Свертывание начинается не во всем объеме кюветы, а на одной поверхности. От этой поверхности и начинает расти фибриновой сгусток.

Материал кюветы - слабопрокоагулянтный полистирол, оптически прозрачный в нескольких диапазонах длин волн, чтобы иметь возможность регистрировать не только светорассеяние от растущего сгустка, но и работать с флуорогенными субстратами к тромбину. Толщина кюветы позволяет менее чем за минуту прогреть образец до температуры 37°С в термостате. Для проведения исследования в кювету заливается образец плазмы и помещается вставка, на торце которой закреплен активатор (ТФ), запускающий процесс свертывания.

Для регистрации процесса пространственного свертывания, протекающего в кювете, был разработан и создан измерительный прибор, структурная схема которого представлена на рис. 2.

Туе, = 37,0 °С Ттек= 36,9 °С • !,

Блок

термостатирования

Блок управления

Рис. 2. Структурно-функциональная схема прибора для измерения пространственной динамики свертывания плазмы крови. 1 - электронный термостат; 2 - камера термостата с жидкостью; 3 - держатель кюветы; 4 - кювета; 5 - измерительный канал кюветы; 6 - исследуемый образец плазмы; 7 - вставка; 8 -активатор свертывания; 9 - прозрачное стеклянное окно термостата; 10 - красный светодиод; 11 - УФ светодиод; 12 - УФ светофильтр; 13 - мультидиапазонный фильтр; 14 - цифровая фотокамера; 15 -макрообъектив; 16 - компьютер; 17- блок управления освещением.

Прибор работает следующим образом. За счет работы водяного термостата температура прозрачной жидкости в термостатируемой камере поддерживается на заданном уровне, и жидкость равномерно обогревает кювету, в которую помещают исследуемый образец плазмы. После того, как температура по всему объему плазмы установится одинаковой и конвекционные потоки в плазме прекратятся, в нее медленно (чтобы не создать паразитных потоков) погружают вставку таким образом, чтобы активатор свертывания, нанесенный на торец этой вставки, коснулся

поверхности плазмы. Одновременно с этим включают цифровую фотокамеру, в которую через прозрачное окно и объектив начинают поступать изображения растущего у торца вставки фибринового сгустка. Эти оцифрованные изображения поступают в память компьютера для дальнейшей обработки. Блок управления позволяет осуществлять регулировку яркости светодиодов, а также управляет моментом их включения, позволяя синхронизировать его с открытием затвора камеры. Такой режим работы светодиодов обеспечивает минимальное время засветки плазмы, сводя к минимуму ее локальный нагрев и тем самым уменьшая паразитные конвекционные потоки, возникающие за счет этого локального разогрева. Поочередное включение красного и УФ светодиодов позволяет регистрировать как пространственную динамику роста фибринового сгустка, так и флуоресценцию AMC - флуорогенного остатка, образующегося после расщепления субстрата тромбином. При облучении образца плазмы УФ излучением происходит возбуждение молекул AMC и последующая флуоресценция в синем диапазоне длин волн, сигнал которой служит основой для вычисления двумерного распределения тромбина. Мультидиапазонный светофильтр с окнами прозрачности в красном и синем диапазоне позволяет отделить сигнал светорассеяния и флуоресценции от рассеянного и отраженного УФ излучения и прочих фоновых засветок. На рис. 3 показана область кюветы, в которой происходит рост фибринового сгустка, и набор фотографий светорассеяния, передаваемых фотокамерой в компьютер для вычисления параметров пространственной динамики свертывания.

Вставка с — активатором на торце

Кювета

Активатор (ТФ)

Плазма -крови

Рис. 3. Одноканальная измерительная кювета и серия последовательных фотографий процесса роста фибринового сгустка в рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазме крови с добавленным ингибитором контактной активации СТ1.

Измерительная кювета

Фотографии растущего фибринового сгустка

Активатор —^ 0 мин \ Я

18 мин ....

Сгусток II

Плазма 36 мин

На всех кадрах проводится специальная линия перпендикулярно активатору, называемая репером (рис. 4А). Вдоль репера строится распределение яркости пикселей. Набор кривых яркости вдоль репера для всех фотографий называется графиком профилей светорассеяния (рис. 4Б). Из него видно, что процесс роста сгустка является суперпозицией двух процессов: распространения фронта полимеризации фибрина в пространстве и увеличения плотности сгустка.

2

Расстояние от аетиватора, м

Рис. 4. А. Проведение репера. Б. Профили роста фибринового сгустка. В. График зависимости размера

сгустка от времени.

Из графика профилей светорассеяния строится зависимость размера сгустка от времени и вычисляются основные параметры пространственной динамики свертывания. Такие параметры, как задержка свертывания с момента активации Т|а8 и начальная скорость роста сгустка Ущ характеризуют начальную фазу активации свертывания. Стационарная скорость роста У5Ш характеризует фазу пространственного роста сгустка. Наличие спонтанных сгустков вдали от активатора свидетельствует о наличии прокоагулянтного материала в образце. Амплитуда сигнала светорассеяния пропорциональна плотности образовавшегося сгустка. Следует отметить, что постановка стандартных гомогенных коагулогических тестов, в которых активация свертывания происходит одновременно во всем объеме исследуемого образца, позволяет регистрировать

лишь один параметр - время полного свертывания, отражающий начальную стадию активации свертывания и близкий по своему физическому смыслу ко времени задержки свертывания (Т^ в методе пространсвенной динамики роста сгустка.

В результате статистической обработки результатов измерений пространсвенной динамики свертывания у здоровых лиц были определены границы основных количественных характеристик фаз (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики аппроксимирующих нормальных распределений параметров пространственного роста сгустка и диапазон значений нормы для здоровых лиц

Параметр Среднее значение М Стандартное отклонение о Нижняя граница нормы М-2о Верхняя граница нормы М + 2ст

Tlaa, МИН 1.8 0.7 0.4 3.2

V|„¡,, мкм/мин 36 6.5 23 49

Vstat, МКМ/МИН 23 3.6 15.8 30.2

Для оценки диагностического потенциала прибора были проведены исследования пространсвенной динамики свертывания в случае различных патологий, вызывающих серьезные нарушения в системе гемостаза.

В работах лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН, опубликованных ранее, было показано, что факторы внутреннего пути свертывания отвечают за фазу пространственного роста сгустка, и при гемофилиях нарушения в этой фазе будут наиболее выражены. Совместно с диспансерным научно-методическим отделением по гемофилии ГНЦ РАМН были начаты работы по исследованию пространственной динамики свертывания у больных тяжелой формой гемофилии А при заместительной терапии фактором VIII. На рис. 5 представлен скрининг состояния системы свертывания у одного такого больного (Гемоктин, дозировка 20 МЕ/кг).

А Б В Г Д Е Ж

Рис. 5. Мониторинг состояния системы свертывания методом измерения пространственной динамики роста сгустка у больного тяжелой формой гемофилии А (ф. VIII < 1%). Слева: вертикальные колонки слева направо: а. Состояние до введения фактора VIII (препарат не вводился 5 дней). б. 30 мин после введения. в. 1 час после введения. Г. 3 часа. д. 6 часов. е. 24 часа. Ж. 48 часов. Горизонтальные ряды - время с момента активации свертывания в измерительной кювете. Справа: стационарная скорость роста сгустка.

Видны сильные изменения в системе свертывания в течение нескольких часов после введения препарата и постепенный возврат системы к исходному состоянию в течение последующих двух суток. График изменения стационарной скорости роста сгустка показывает гиперкоагуляционное состояние системы в первые шесть часов после введения препарата (рис. 5), в то время как тест АЧТВ показывает гипокоагуляцию в течение всего времени мониторинга (рис. 6).

ваян!

з 2А чеса чатов

Время после введения фактора УШ

До 30 мин 1 чз1

Время после введения фактора VIII

Рис. 6. Изменение АЧТВ (слева) и активности фактора VIII в плазме крови (справа) в течение первых двух суток после введения концентрата ф. VIII (Гемоктин, 20 МЕ/кг).

Результаты измерения пространственной динамики свертывания у группы из 6 больных тяжелой формой гемофилии А, получавших Гемоктин в дозе 50 МЕ/кг (достижение активности ф.УШ в плазме крови 90-120%), демонстрируют схожее поведение: гиперкоагуляционное состояние плазмы в первые часы после введения и возврат системы в исходное состояние в последующие двое суток. Механизмы, лежащие в основе этого явления, требуют дальнейшего пристального изучения, однако можно предположить, что такое поведение системы указывает на ее адаптацию к низкому уровню фактора VIII путем снижения порога по активации системы. В исследовании наблюдается хорошая корреляция между активностью ф.УШ и стационарной скоростью роста сгустка (R=0.96), что говорит о перспективности использования разработанного прибора в качестве средства контроля лекарственной терапии при гемофилиях. При этом открывается возможность индивидуального подбора дозировки и периодичности введения препарата, основанного на индивидуальных особенностях фармакокинетики у конкретного пациента. Получаемая в исследовании информация позволяет судить об общем гемостатическом потенциале системы, в то время как определение активности ф.УШ позволяет оценить активность лишь одного, безусловно важного, но не единственного участника системы ферментативных реакций свертывания. Прибор открывает новые возможности в области тестирования новых препаратов для коррекции нарушений свертывания при гемофилиях.

Нарушения свертывания крови является непременным спутником сепсиса. Развитие воспалительного ответа сопровождается сильной активацией системы свертывания, часто приводящей к возникновению синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Для того, чтобы проверить чувствительность метода к гиперкоагуляционным состояниям, совместно с отделением анестезиологии и реанимации ГНЦ РАМН было проведено исследование пространственной динамики свертывания у больных в септическом шоке, часть из которых получали терапию ингибиторами свертывания (АТШ, АПС). Прибор оказался чувствительным к эффектам назначения и отмены АТШ. Пример скрининга системы свертывания у больного в состоянии септического шока, которому проводили инфузию АТШ представлен на рис. 7.

дни набд: 12 4 5 6 9

—•—Стационарная спорость роста стустка эффект отмены

Гил ер

эффект назначения

140

!< 120 м

1 100

О

О.

80

о в ' ' Л * в 6 7 а а 10 11 12 13 14 1» 16 1/ 1Б 19 .о 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

д™ ДНИ

Рис. 7. Мониторинг состояния системы свертывания у больного в септическом шоке при инфузии АТШ. Выборочные кадры исследования пространственной динамики свертывания (вверху). Динамика стационарной скорости роста сгустка (слева внизу). Плазменный уровень АТШ (справа внизу).

Из графиков на рис. 7 видно, что до назначения препарата отмечается увеличенная стационарная скорость роста сгустка. Значение скорости заметно снижается сразу после назначения АТШ, однако затем происходит ее постепенное увеличение, несмотря на нормальный уровень АТШ в крови. Сразу после отмены препарата отмечается резкое возрастание стационарной скорости роста сгустка.

Прибор хорошо определяет состояние гиперкоагуляции, в том числе и в тех случаях, когда это состояние не диагностируется другими методами. На рис. 8 представлена динамика стационарной скорости роста сгустка и основных коагулогических показателей у больного, поступившего в отделение реанимации в состоянии септического шока, которому начали инфузию АПС. Метод показывает развитие гиперкоагуляционного состояния, характеризующегося увеличением стационарной скорости роста сгустка и образованием спонтанных сгустков вдали от активатора. Тромбоз левой подключичной вены явился клинической манифестацией данного состояния (5-ый день исследования). Следует отметить, что показатели других лабораторных методов диагностики оставались в пределах допустимых границ нормы, или же показывали гипокоагуляцию. Эффект начатой терапии низкомолекулярным гепарином немедленно сказался на значениях стационарной скорости роста сгустка.

Рис. 8. Мониторинг состояния системы свертывания у больного в септическом шоке при инфузии АПС. Представлены графики динамики стационарной скорости роста сгустка, активированного частичного тромбопластинового времени и двух основных параметров тромбоэластограммы (R и угол alfa).

Метод пространственной динамики свертывания оказался чувствительным к особенностям протекания воспалительного процесса у больных с сепсисом. Так, развитие полирезистентной инфекции у больного, изначально поступившего в отделение в состоянии септического шока, приводит к повторному септическому шоку через 10 дней после купирования первичного шока. В отличие от показателей

стандартных методов диагностики (коагулограмма, тромбоэластограмма), остававшихся в пределах допустимых значений нормы, динамика стационарной скорости роста сгустка отчетливо указывала на развитие гиперкоагуляционного состояния, предшествующего второму септическому шоку.

Существующие методы диагностики почти не отражают гиперкоагуляционные состояния, возникающие при онкологических заболеваниях и проводимой химиотерапии. Способность прибора регистрировать спонтанное образование сгустков вдали от активатора открывает возможности более детального исследования причин гиперкоагуляции в таких случаях. Характерный пример исследования пространственной динамики свертывания у больного множественной миеломой приведен на рис. 9.

Коагулограмма

0 Ш!Н щ ШШШШШШШШ

1 2 мм

ннмшшя 8 мин

т ^яро* -Щр $ * *

12 шш 14 мин 26 мин

llllll в i'V — ■ ШШ

Показатель Значение Норма

АЧТВ [сек.] 25 30-38

ПТ индекс [%] 121 70-130

Тромбиновое время [сек] 16 12-19

Фибриноген [г/л] 2.7 1,8-3,5

MHO 0.89

Тромбоэластограмма

Показатель Значение Норма

R [мин] 10,1 9-27

К [мин] 3,7 2-9

Угол [град.] 45,4 22-68

МА [мм] 52,8 44-64

Рис. 9. Мониторинг состояния системы свертывания у больного множественной миеломой. Представлена картина пространственной динамики свертывания и параметры коагулограммы и тромбоэластограммы.

В данном случае гиперкоагуляция проявляется не только увеличением скорости роста сгустка, но и образованием спонтанных фибриновых сгустков вдали от активатора. Учитывая то, что путь контактной активации свертывания в измерительной системе заблокирован СТ1, активатором свертывания может служить собственный прокоагулянтный материал плазмы крови - микровизикулы с ТФ, обломки клеточных мембран, поврежденных при химиотерапии. Ни один из существующих методов диагностики нарушений свертывания не учитывает пространственные особенности активации системы. Поэтому причина гиперкоагуляции (собственный прокоагулянтный материал в образце плазмы) будет скрыта за эффектом сильной гомогенной активации свертывания при перемешивании образца с веществом-активатором, и свертывание в этих методах будет протекать лишь немного быстрее.

Расстояние от активатора, мм

■ \ 5 min

10 min

20 min

30 min

40 min

LA: ■ * ц 50 min

м 60 min

- "Hi ч'/^VvA-v/ \ ! Vr v ■ \ i ' ' 70 min

_ пи ;

Л V. \ \ : Ч:

:1\ ...................... —1-Г~ 1 • I

Исследование пространственной кинетики образования тромбина.

Тромбин - важнейший фермент системы свертывания. Его концентрация и распределение в пространстве определяет конечные физические свойства

фибринового сгустка. Разработанный прибор позволяет проводить

экспериментальное наблюдение за пространственной кинетикой образования тромбина с использованием флуорогенного субстрата. Концентрация тромбина определяется косвенно по интенсивности флуоресценции AMC - продукта, образующегося в результате расщепления тромбином синтетического субстрата. Взаимодействие тромбина и субстрата описывается кинетикой Михаэлиса-Ментен. При освещении AMC светом с длиной волны 380 нм флуоресценция наблюдается на длине волны 440 нм. Интенсивность флуоресценции AMC пропорциональна его концентрации в рабочем диапазоне. Восстановление сигнала тромбина из сигнала флуоресценции AMC требует решения обратной задачи. Наличие любых шумов в сигнале AMC приводит к серьезным погрешностям при восстановлении сигнала тромбина. Учет влияния многих факторов, влияющих на сигнал тромбина, и выбор оптимального метода восстановления сигнала является сложной научной задачей. Ее решением в настоящей момент занимается сотрудница лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН Н.М. Дашкевич. Однако качественная картина двумерной кинетики образования тромбина, полученная с использованием таких распространенных методов фильтрации сигналов как сплайн-апроксимация или низкочастотная фильтрация, позволяет наблюдать быстрый рост концентрации тромбина вблизи активатора и его диффузию от места наработки с последующим образованием фронта распространяющейся волны тромбина вглубь плазмы (рис. 10). Расстояние, на которое распространяется фронт тромбина, соответствует размеру фибринового сгустка. Полученные данные позволяют по-

18

0 12 3 4

Расстояние от активатора, мм

Рис. 10. Фронт распространяющегося тромбина определяет пространственный рост и структуру сгустка: при активации свертывания происходит взрывное образование тромбина у поверхности активатора, а затем формирование фронта волны, распространяющейся вглубь плазмы.

новому взглянуть на так называемый «гомогенный парадокс», заключающийся в том, что в системе с полным перемешиванием (диагностический метод эндогенного тромбинового потенциала) основная генерация тромбина начинается уже после образования фибринового сгустка. Такое поведение может объясняться тем, что в физиологических условиях данная генерация необходима для поддержания распространяющегося фронта волны тромбина, обеспечивающего формирование фибринового сгустка вдали от места повреждения сосудистой стенки. Возникновение такого фронта в гомогенной системе невозможно, однако механизмы, ответственные за его поддержание, продолжают функционировать.

Внешний вид и технические характеристики прибора.

Внешний вид прибора для измерения пространственной динамики роста фибринового сгустка и кинетики образования тромбина представлен на рис. 11, а его основные технические характеристики приведены в таблице 2.

Рис. 11. Внешний вид прибора для измерения пространственной динамики свертывания.

Таблица 2. Основные технические характеристики прибора.

Измеряемые параметры • Время задержки роста сгустка • Начальная скорость роста сгустка • Стационарная скорость роста сгустка • Плотность сгустка • Наличие спонтанных сгустков • Видеофильм роста сгустка • Сигнал флуоресценции AMC

Материал для исследования Свободная от тромбоцитов плазма крови

Производительность прибора 2 анализа/час (одноканальная кювета) 4 анализа/час (многоканальная кювета)

Время полного анализа одного образца 30 мин.

Объем плазмы крови, требуемой для анализа 50 мкл.

Температура проведения исследования 30°С -45°С (точность ± 0.50°С)

Перспективы применения прибора.

Благодаря одинаково хорошей чувствительности прибора как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям, а также возможности выявлять изменения в плазменном звене системы гемостаза раньше стандартных коагулогических тестов, можно предположить, что прибор найдет широкое применение в качестве средства контроля состояния плазменного звена в случае серьезных операционных вмешательств, особенно связанных с установкой стентов и искусственных имплантатов, при терапии гемофилий, онкологических заболеваний, тяжелой инфекции и сепсиса, а также в случае, когда имеется подозрение на гиперкоагуляционное состояние (например, после инсульта). Открытость экспериментальной системы позволяет искусственно моделировать различные ситуации, например, наблюдать за эффектами новых лекарственных препаратов при проведении предклинических испытаний, а также открывает широкие возможности для верификации реакционно-диффузных математических моделей свертывания. Например, прибор позволяет проводить исследования порогового поведения системы свертывания при активации свертывания различными плотностями тканевого фактора. Использование флуорогенных субстратов позволяет исследовать пространственную кинетику факторов в процессе роста фибринового сгустка, получая дополнительную информацию о механизмах работы системы свертывания.

Выводы.

1. Разработанный прибор позволяет регистрировать пространственную динамику свертывания плазмы крови ¡п-у^го в условиях, близких к условиям ¡п-уК'о, и исследовать двумерную кинетику образования тромбина в процессе роста фибринового сгустка.

2. Процесс свертывания крови состоит из нескольких фаз, выделенных во времени и в пространстве. Получены количественные характеристики фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка.

3. Прибор обладает чувствительностью как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям системы свертывания, возникающим при различных патологиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А., Карамзин С.С., Сарбаш В.И. Кювета для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов. Заявка №2008144908 о выдаче патента РФ на изобретение. Положительное заключение о выдаче патента от 02.11.2009.

2. Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А., Карамзин С.С., Сарбаш В.И. Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов. Заявка №2008144909 о выдаче патента РФ на изобретение. Положительное заключение о выдаче патента от 03.12.2009.

3. S.S. Karamzin, F.I. Ataullakhanov. Dielectric Spectrometry of Clot Formation. Abstracts of International Workshop «Modeling of Blood Diseases», Lyon, France, November 5-8, 2007, p. 17.

4. Balandina A.N., Karamzin S.S. Spatial dynamics of thrombin generation in plasma. Abstracts of Fourth international symposium on «Computation methods in toxicology and pharmacology integrating method resources» (CMTPI), Moscow, Russia, September 1 -5, 2007, p. 81.

5. Karamzin S. A new device for diagnostics of blood coagulation disorders based on measuring the spatial dynamics of clot formation. Hamostaseologie 1, 2009, p.A25.

6. Карамзин C.C., Фадеева O.A., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов докладов научно-технологических секций на «1-м Международном Форуме по Нанотехнологиям», Москва, Россия, Декабрь 3-5, 2008, т.2, стр.366-368

7. Фадеева О.А., Карамзин С.С., Синауридзе Е.И., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов на 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, Март 16-20, 2009, стр. 130-131.

8. Фадеева О.А., Карамзин С.С., Синауридзе Е.И., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Иммобилизация тромбопластина для изучения пространственной динамики тромбообразования. Сборник тезисов на «2-м Международном Форуме по Нанотехнологиям», Москва, Россия, Октябрь 6-8, 2009, стр. 821823.

9. Фадеева O.A., Карамзин С.С.а Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Иммобилизация тромбопластина для изучения пространственной динамики тромбообразования. Сборник тезисов на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Россия, 28 сентября - 2 октября 2009, стр. 180-181.

Ю.Шибеко A.M., Карамзин С.С.Л Бутылин A.A., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Обзор современных представлений о влиянии скорости течения на процесс плазменного свертывания крови. Биологические мембраны, 2009, 26 (6), стр. 443-450.

Подписано в печать:

07.12.2009

Заказ № 3221 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карамзин, Сергей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Система свертывания крови.

1.1.1. Общее представление о системе гемостаза человека.

1.1.2. Плазменное звено системы гемостаза.

1.1.2.1. Активация системы свертывания.

1.1.2.2. Пространственный рост гемостатического сгустка.

1.1.2.3. Торможение роста и локализация сгустка.

1.1.2.4. Влияние диффузии на свертывание.

1.1.2.5. Роль тромбина в регуляции процесса свертывания.

1.1.2.6. Влияние потока на плазменное звено системы гемостаза.

1.2. Нарушения системы свертывания крови.

1.2.1. Гемофилии.

1.2.2. Гиперкоагуляционные состояния.

1.2.2.1. Гиперкоагуляционные состояния при инфекции и сепсисе.

1.2.2.2. Злокачественные заболевания.

1.2.3. ДВС синдром.

1.3. Методы лабораторной диагностики нарушений плазменного звена системы гемостаза.

1.3.1. Физическая основа современных методов диагностики.

1.3.2. Скриннинговые коагуляционные тесты.

1.3.3. Тесты активации свертывания.

1.3.4. Тесты комплексной оценки состояния гемостаза.

1.3.4.1. Тромбоэластография.

1.3.4.2. Тест генерации тромбина.

1.3.5. Сравнение существующих методов диагностики.

1.3.6. Метод пространственной динамики свертывания крови.

1.4. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Доноры крови.

2.3. Получение плазмы крови.

2.4. Рекальцификация плазмы.

2.5. Метод измерения.

2.6. Активатор свертывания.

2.7.Измерительная кювета.

2.8. Измерительный прибор.

2.9. Программное обеспечение.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Прибор для исследования пространственной динамики свертывания.

3.1.1. Измерительная кювета.

3.1.2. Активатор свертывания.

3.1.3. Структурно-функциональная схема прибора для исследования пространственной динамики свертывания.

3.1.4. Основные узлы и блоки измерительного прибора.

3.1.4.1. Блок термостатирования.

3.1.4.2. Блок освещения.

3.1.4.3. Блок регистрации.

3.1.4.4. Блок управления.

3.1.4.5. Внутренняя компоновка прибора.

3.2. Обработка результатов и вычисление количественных характеристик фаз.

3.2.1. Пространственная динамика роста фибринового сгустка.

3.2.2. Двумерная кинетика образования тромбина.

3.3. Выходные характеристики прибора и протоколы проведения исследования.

3.3.1. Внешний вид и технические характеристики прибора.

3.3.2. Протокол измерения пространственной динамики роста фибринового сгустка

3.3.3. Протокол исследования кинетики генерации тромбина.

3.3.4. Измерение эндогенного тромбинового потенциала.

3.4. Измерение параметров пространственной динамики свертывания у здоровых доноров.

3.5. Примеры измерения пространственной динамики свертывания в случае различных патологий.

3.5.1. Пространственная динамика свертывания плазмы у больных тяжелой формой гемофилии А.

3.5.2. Пространственная динамика свертывания при сепсисе.

3.5.3. Пространственная динамика свертывания при онкологических заболеваниях и химиотерапии.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Фазы процесса пространственного роста сгустка.

4.2. Применение прибора в клинической практике.

4.3. Применение прибора в научно-исследовательской работе.

4.4. Перспективы развития.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование биофизических аспектов пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro"

Основная задача системы свертывания крови - предотвратить кровопотерю при нарушении целостности сосудистого русла, «залепив» место повреждения плотным гемостатическим сгустком. Это достигается за счет локального перехода плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе места повреждения. Любое повреждение сосудистого русла приводит к тому, что кровь вступает в контакт со специальным трансмембранным белком — тканевым фактором, и запускает систему ферментативных реакций свертывания, приводящую к формированию непроницаемого для жидкости гемостатического сгустка. Система реакций свертывания состоит из нескольких десятков белков, взаимодействующих друг с другом во множестве реакций. Такое устройство системы необходимо для эффективного управления процессом образования фибринового сгустка. В норме сгусток фиксированного размера формируется только в месте повреждения, и свертывание крови не затрагивает другие области кровотока. Теоретические работы по модульной декомпозиции данной системы позволяют выделить три основные фазы процесса свертывания: фазу активации, фазу пространственного роста и фазу торможения роста сгустка. При этом в каждой фазе существенную роль играют разные биохимические реакции, а сами фазы выделены как во времени, сменяя друг друга, так и в пространстве, происходя в разных частях сгустка. Представления о фазах процесса свертывания и роли различных белков и реакций в каждой из фаз сформировались в основном в результате работ по математическому моделированию данной системы и лишь частично подтверждены экспериментально. Эффективным методом экспериментальной проверки гипотезы о многофазности процесса свертывания, который позволил бы получить количественные характеристики этих фаз, может служить метод исследования пространственной динамики свертывания in-vitro. Сущность метода заключается в локальной активации свертывания и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком . слое неперемешиваемой плазмы крови. Однако качественной технической реализации данного экспериментального метода до сих пор предложено не было. Созданные ранее экспериментальные системы имели ряд существенных недостатков, приводящих к большим погрешностям при измерении параметров пространственной динамики свертывания. А использование культуры клеток (фибробластов) в качестве активатора свертывания делало метод трудоемким и снижало воспроизводимость результатов измерения.

Задача дифференцировки и количественной оценки фаз процесса свертывания становится особенно актуальной в свете представлений о том, что различные патологии по-разному влияют на активность отдельных компонент системы свертывания, приводя к выраженным изменениям в различных фазах процесса. Нарушения в механизмах свертывания клинически проявляются либо кровотечением, либо тромбозом, либо одновременно обоими этими явлениями и являются одной из ведущих причин смертности в мире. Во многом это обусловлено тем, что существующие методы диагностики нарушений свертывания далеки от совершенства. В основе большинства из них лежит принцип определения времени полного свертывания образца крови или плазмы при добавлении вещества-активатора и его полном перемешивании в пробирке. Однако в организме сгусток пространственно образуется не во всем объеме крови, а строго локально — только в небольшой зоне повреждения стенки кровеносного сосуда. При этом диффузия факторов свертывания играет важную роль в процессе пространственного роста сгустка и его локализации. Основным недостатком существующих методов является то, что они плохо отражают реальное состояние гемостаза in-vivo и мало чувствительны к гиперкоагуляционным состояниям системы свертывания. Эти методы не позволяет учесть пространственную неоднородность процесса свертывания: разделить фазы инициации, пространственного роста и остановки роста сгустка и тем более провести их количественную оценку.

Цель работы: экспериментальное исследование пространственной динамики роста фибринового сгустка in-vitro в условиях, близких к условиям свертывания крови in-vivo, и создание измерительного прибора для количественной оценки основных фаз процесса свертывания крови в норме и патологии.

Задачи исследования:

1. Разработать и создать измерительный прибор, способный регистрировать и количественно оценивать пространственную динамику свертывания плазмы крови in-vitro.

2. Проверить теоретические представления о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка.

3. Определить границы основных количественных характеристик фаз пространственного роста фибринового сгустка у здоровых лиц и показать чувствительность прибора к гипо- и гиперкоагуляционным состояниям в случае различных нарушений в системе гемостаза.

Научная новизна:

Разработан и создан новый измерительный прибор, позволяющий исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка в плазме крови in-vitro (заявки №2008144908, №2008144909 о выдаче патента РФ на изобретение - положительное заключение о выдаче патентов от 02.11.2009 и 03.12.2009). Получено экспериментальное подтверждение существования основных фаз процесса свертывания и предложены способы их численной оценки. Показана высокая чувствительность прибора как к гипо-. так и гиперкоагуляционным состояниям, возникающим при различных патологиях (гемофилии, сепсис, онкологические заболевания). Показана возможность измерения прибором не только пространственных особенностей формирования конечного продукта работы системы свертывания - фибринового сгустка, но и возможность одновременного исследования кинетики образования главного фермента этой системы - тромбина, определяющего конечные физические свойства сгустка. Прибор также позволяет проводить измерение кривой генерации тромбина в гомогенной постановке и вычислять эндогенный тромбиновый потенциал — основной параметр, вычисляемый в диагностическом тесте генерации тромбина, получающем широкое распространение в лабораторной диагностике нарушений гемостаза.

Научно-практическое значение:

Разработанный прибор позволяет регистрировать нарушения в плазменной системе гемостаза, недоступные для существующих ныне подходов, и служит важным дополнением к существующим методам диагностики. Возможность in-vitro измерять все пространственно-динамические параметры образования фибринового сгустка в плазме конкретного человека - плотность сгустка, скорость его роста и др. — предоставило в руки врача инструмент огромной предсказательной силы. Использование данных приборов в клинической практике позволит коренным образом улучшить качество диагностики нарушений гемостаза и снизить смертность и инвалидность среди населения. Кроме того, прибор позволяет in-vitro изучать влияние лекарственных препаратов на систему свертывания в условиях близких к физиологическим условиям, предоставляя важную информацию о механизмах их действия. Применение флуорогенных субстратов позволяет получать детальную информацию о> пространственной кинетике отдельных факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка (тромбина) и тем самым верифицировать математические реакционно-диффузные модели процесса свертывания.

Положения, выносимые на защиту:

1. Проведено экспериментальное исследование пространственной динамики свертывания плазмы крови in-vitro в условиях, близких к условиям свертывания крови in-vivo. Подтверждена гипотеза о существовании фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка. Получены количественные характеристики фаз.

2. Сформулированы технические требования к прибору, позволяющему проводить диагностику нарушений свертывания при различных патологиях. Созданы опытные образцы приборов.

3. Показана высокая информативность результатов измерения параметров пространственной динамики свертывания при различных патологиях гемостаза и чувствительность прибора как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям.

4. Прибор позволяет исследовать пространственную кинетику образования тромбина в процессе роста фибринового сгустка, а также измерять эндогенного тромбиновый потенциал исследуемого образца плазмы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Карамзин, Сергей Сергеевич

Выводы

1) Разработанный прибор позволяет регистрировать пространственную динамику свертывания плазмы крови in-vitro в условиях близких к условиям in-vivo и исследовать двумерную кинетику образования тромбина в процессе роста фибринового сгустка.

2) Процесс свертывания крови состоит из нескольких фаз, выделенных во времени и в пространстве. Получены количественные характеристики фазы активации и фазы пространственного роста фибринового сгустка.

3) Прибор обладает чувствительностью как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным состояниям системы свертывания, возникающим при различных патологиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карамзин, Сергей Сергеевич, Москва

1. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 1996.

2. Perry D, Pasi KJ. Hemostasis and thrombosis protocols. Totowa, N.J: Humana Press, 1999.

3. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ. Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: Lippincott Company, 1994.

4. Dempfle CE, Knoebl P. Blood coagulation and inflammation in critical illness the importance of the protein С pathway. Bremen u.a.: UNI-MED Vei l, 2008.

5. Долгов BB, Свирин ПВ. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. Москва: ООО «Издательство «Триада», 2005.

6. Шиффман ФДж. Патофизиология крови. СПб: Бином, 2000.

7. Victor W.M.van Hinsbergh. The endothelium: vascular control of haemostasis. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 2001; 95: 198-201.

8. Becker BF, ITeindl B, Kupatt C. Zahler S. Endothelial function and hemostasis. Z Kardiol 2000; 89: 160-167.

9. Alan D.Michelson. Plateletes, second edition. Elsevier, 2007.

10. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88: 186-193.

11. Smith RD, Owen WG. Platelet responses to compound interactions with thrombin. Biochemistry 1999; 38: 8936-8947.

12. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc ) 2002; 67: 3-12.

13. DeLoughery TG. Hemostasis and thrombosis. Georgetown, Tex: Landes Bioscience, 2004.

14. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227: 113-129.

15. Bajzar L. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and an antifibrinolytic pathway. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000; 20: 2511-2518.

16. Butenas S, Branda RF, van't Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost 2001; 86: 660-667.

17. Mann KG, Brummel K, Butenas S. What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003; 1: 1504-1514.

18. Nesheim M. Thrombin and fibrinolysis, est 2003; 124: 33S-39S.

19. Shrivastava S, McVey GH, Dorling A. The Interface Between Coagulation and Immunity. American Journal of Transplantation 2007; 7: 499-506.

20. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis, ont Biosci 2006; 11: 59-80.

21. Ryan J, Geczy C. Coagulation and the expression of cell-mediated immunity, munol Cell Biol 1987; 65 (Pt 2): 127-139.

22. Colman RW, Schmaier AH. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, pro fibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes. Blood 1997; 90: 3819-3843.

23. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1(1): 50-62.

24. Баркаган ЗС, Момот АП, Тараненко ИА, Шойхет ЯП. Основы пролонгированной профилактики и терапии тромбоэмболий. Москва: "Ньюдиамед", 2003.

25. Котельников MB. Ведение больных с венозными тромбоэмболиями. Москва: 2006.

26. Балуда ВП, Балуда MB, Деянов ИИ, Тлепшуков ИЛ. Физиология системы гемостаза. Москва: 1995.

27. Mann KG. Biochemistry and Physiology of Blood Coagulation. Thromb Haemost 1999; 82: 165-174.

28. Andrews DA. Low PS. Role of red blood cells in thrombosis. Curr Opin Hematol 1999; 6: 76-82.

29. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation. Biol Chem 1976; 251: 5233-5236.

30. Moyer MP, Tracy RP, Tracy PB, van't Veer C. Sparks CE, Mann KG. Plasma lipoproteins support prothrombinase and other procoagulant enzymatic complexes. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; 18: 458-465.

31. Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. Biol Chem 1985; 260: 2119-2124.

32. Jespersen J, Bertina RM, Haverkate F. Laboratory techniques in thrombosis a manual. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999.

33. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 453468.

34. Атауллаханов ФИ, Лобанова EC, Морозова OJI, Шноль ЭЭ, Ермакова ЕА, Бутылин АА, Занкнн АН. Сложные режимы распространения возбуждения и самоорганизации в модели свертывания крови. Успехи физических наук 2007; 177: 87-104.

35. I-Ioffman М, Monroe DM. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 958-965.

36. Hoffman M, Monroe DM. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematol Oncol Clin North Am 2007; 21: 1 -11.

37. Mackman N. Role of Tissue Factor in Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Development. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2004; 24.

38. Wiiger MT, Prydz H. The changing faces of tissue factor biology. Thromb Haemost 2007; 98: 38-42.

39. Girard TG, Nicholson NS. The role of tissue factor/factor Vila in the pathophysiology of acute thrombotic formation. Current Opinion in Pharmacology 2001; 1: 159-163.

40. Furie В, Furie ВС. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest 2005; 115: 3355-3362.

41. Revak SD, Cochrane CG, Bouma BN, Griffin JH. Surface and fluid phase activities of two forms of activated Hageman factor produced during contact activation of plasma. Exp Med 1978; 147: 719-729.

42. Owen CA, Nichols WL, Bowie EJW. A history of blood coagulation. Rochester, Minn: Mayo Foundation for Medical Education and Research, 2001.

43. Renne T, Nieswandt B, Gailani D. The intrinsic pathway of coagulation is essential for thrombus stability in mice, ood Cells Mol Dis 2006; 36: 148-151.

44. Пантелеев MA, Котова ЯН, Токарев AA, Атауллаханов ФИ. Механизмы регуляции свёртывания крови. Терапевтический архив 2008; 7: 88-91.

45. Brummel К, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100: 148-152.

46. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35: 1904-1910.

47. Monkovic DD, Tracy PB. Activation of human factor V by factor Xa and thrombin. Biochemistry 1990; 29: 1118-1128.

48. Hill-Eubanks DC, Lollar P. von Willebrand factor is a cofactor for thrombin-catalyzed cleavage of the factor VIII light chain. Biol Chcm 1990; 265: 17854-17858.

49. Gailani D, Broze GJ. Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation, ience 1991; 253: 909-912.

50. Gailani D, Ho D, Sun MF, Cheng Q, Walsh PN. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential. Blood 2001; 97:3117-3122.

51. Butenas S, van't Veer C, Mann KG. "Normal" thrombin generation. Blood 1999; 94: 2169-2178.

52. Hoffman M, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995; 86: 1794-1801.

53. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

54. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2004; In press.

55. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 4557.

56. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

57. Zarnitsina VI, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results. Thromb Res 1996; 84: 333-344.

58. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции (часть 2). Клиническая онкогематология 2008; 1(2): 174-181.

59. Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, Bajaj SP. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost 2001; 86: 959-972.

60. Walker FJ, Fay PJ. Regulation of blood coagulation by the protein С system. SEB J 1992; 6: 2561-2567.

61. Kastrup CJ, Shen F, Runyon MK, Ismagilov RF. Characterization of the Threshold Response of Initiation of Blood Clotting to Stimulus Patch Size. Biophys J 2007; 93: 2969-2977.

62. Shen F, Kastrup С J, Liu Y, Ismagilov RF. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2035-2041.

63. Turitto VT, Iiall CL. Mechanical factors affecting hemostasis and thrombosis. Thromb Res 1998; 92: S25-S31.

64. Caro CG, Pedley IJ, Seed WA. Cardiovascular physiology. In: Guylon AC (editor). Mechanics of Circulation. London: Medical and Technical Publishers, 1974.l'T

65. Weiss HJ, Turitto VT, Baumgartner HR. Role of shear rate and platelets in promoting fibrin formation on rabbit subendothelium. Studies utilizing patients with quantitative and qualitative platelet defects. J Clin Invest 1986; 78: 1072-1082.

66. Воробьев АИ. Рациональная фармакотерапия заболеваний системы крови. Москва: Литтера, 2009.

67. Протоколы ведения больных: болезнь Виллебранда (ГОСТ Р 52600.1-2008) Гемофилия (ГОСТ Р 52600.3-2008). Москва: НЫОДИАМЕД, 2009.

68. Ованесов MB, Красоткина ЮВ, Абушинова KB, Лопатина ЕГ, Коротина НГ. Независимо от пути инициации свертывания при гемофилии нарушена пространственная динамика роста сгуска. Тромбоз, гемостаз и реология 2002; 1: 8791.

69. Атауллаханов ФИ, Воробьев АИ, Бутылин АА, Синауридзе ЕИ, Ованесов MB. Почему дефициты факторов внутреннего пути свертывания приводят к гемофилии. Проблемы гематологии и переливания крови 2003; 1: 7-13.

70. Андреев ЮН. Многоликая гемофилия. Москва: НЫОДИАМЕД, 2006.

71. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA, Schein RM, Sibbald WJ. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis, est 1992; 101: 1644-1655.

72. Schouten M, Wiersinga WJ, Levi M, van der Poll T. Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis. Journal of Leukocyte Biology 2008; 83.

73. Esmon CT, Fukudome K, Mather T, Bode W, Regan L, Steams-Kurosawa D, Kurosawa S. Inflammation, sepsis, and coagulation. Haematalogica 1999; 84: 254-259.

74. McGilvray ID, Rotstein OD. Role of the Coagulation System in the Local and Systemic Inflammatory Response. World J Surg 1998; 22: 186.

75. Levi M, Opal SM. Coagulation abnormalities in critically ill patients. Critical Care 2006; 10.

76. Zeerleder S, Hack E. Wuillemin WA. Disseminated Intravascular Coagulation in Sepsis, est 2005; 128:2864-2875.

77. Carey MJ, Rodgers GM. Disseminated Intravascular Coagulation: Clinical and Laboratory Aspects. American Journal of Hematology 1998; 59: 73.

78. Amaral A, Opal SM, Vincent J-L. Coagulation in sepsis. Intensive Care Med 2004; 30: 1032-1040.

79. Esmon CT. Role of Coagulation Inhibitors in Inflammation. Thromb Haemost 2001; 86: 51-56.

80. Mammen EF. Antithrombin III and sepsis. Intensive Care Me 1998; 24: 649-650.

81. Stief TW, Ijagha O, Weiste B, Herzum I, Renz H. Max M. Analysis of hemostasis alterations in sepsis. Blood Coagulation and Fibrinolysis 2007; 18: 179-186.

82. Letai A, Kuter DJ. Cancer, Coagulation, and Anticoagulation. The Oncologist 1999; 4: 443-449.

83. Zwicker JI, Furie В, Furie ВС. Cancer-associated thrombosis. Critical Reviews in Oncology/Hematology 2007; 62: 126-136.

84. Баркаган ЗС, Шилова АН, Ходоренко CA. Аититромботическая профилактика и терапия в онкологии. Бюллетень сибирской медицины 2003; 3: 9-18.

85. Ruiz MA, Marugan I, Estelles A, Navarro 1, Espana F, Alberola V, Juan LS, Aznar J, Garcia-Conde J. The influence of chemotherapy on plasma coagulation and fibrinolytic system in lung cancer patients. Cancer 1989; 63: 643-648.

86. Баркаган ЗС. Патогенез, диагностика и принципы терапии ДВС синдрома. Materia Medica 1997; 1: 5-14.

87. Васильев СА, Воробьев API, Городецкий ВМ. Протокол диагностики и лечения острого ДВС синдрома. Проблемы гематологии и переливания крови 1999; 3: 4044.

88. Баркаган ЗС, Момот АП. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Москва: Ныодиамед, 2001.

89. Sterling T.Bennett, Christopher M.Lehman, George M.Rodgers. Laboratory hemostasis a practical guide for pathologists. New York: Springer, 2007.

90. BORN GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature 1962; 194: 927-929.

91. Deutsch HF. PHOTOELECTRIC STUDY OF SOME FACTORS RELATED TO BLOOD CLOTTING. J Clin Invest 1946; 25: 37-44.

92. Kita R, Takahashi A, Kaibara M, Kubota K. Formation of fibrin gel in fibrinogen-thrombin system: static and dynamic light scattering study. Biomacromolecules 2002; 3: 1013-1020.

93. Gogstad GO, Dahl KH, Christophersen A, Bjerke A. Turbidimetric determination of prothrombin time by clotting in a centrifugal analyzer. Clin Chem 1986; 32: 1857-1862.

94. Connelly J A, Buckler MJ. The continuous measurement of resistivity and permittivity of human blood plasma during coagulation. Med Biol Eng 1975; 13: 523-530.

95. Theiss W, Ulmer A. Comparative and direct measurement of the electrical impedance in blood coagulation (author's transl). Thromb Res 1978; 13: 751-765.

96. Ur A. Changes in the electrical impedance of blood during coagulation. Nature 1970; 226: 269-270.

97. Evans PA, Hawkins K, Lawrence M, Williams RL, Barrow MS, Thirumalai N, Williams PR. Rheometry and associated techniques for blood coagulation studies. Med Eng Phys 2008; 30: 671-679.

98. Luddington RJ. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol 2005; 27: 81-90.

99. Wohner N. Role of cellular elements in thrombus formation and dissolution. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2008; 6: 224-228.

100. Goldsmith HL, Bell DN, Braovac S, Steinberg A, Mcintosh F. Physical and chemical effects of red cells in the shear-induced aggregation of human platelets. Biophys J 1995; 69: 1584-1595.

101. Dubois C, Panicot-Dubois L, Gainor JF, Furie ВС, Furie B. Thrombin-initiated platelet activation in vivo is vWF independent during thrombus formation in a laser injury model. J Clin Invest 2007; 117: 953-960.

102. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, Furie ВС, Furie B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat Med 2002; 8: 1175-1181.

103. Cardinal DC, Flower RJ. The electronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood. J Pharmacol Methods 1980; 3: 135-158.

104. Balan C, Balut C, Gheorghe L, Gheorghe C, Gheorghiu E, Ursu G. Experimental determination of blood permittivity and conductivity in simple shear flow. Clin Hemorheol Microcirc 2004; 30: 359-364.

105. Beving H, Eriksson LE, Davey CL, Kell DB. Dielectric properties of human blood and erythrocytes at radio frequencies (0.2-10 MHz); dependence on cell volume fraction and medium composition. Eur Biophys J 1994; 23: 207-215.

106. HASCHEMEYER AE. A POLAR INTERMEDIATE IN THE CONVERSION OF FIBRINOGEN TO FIBRIN MONOMER. Biochemistry 1963; 2: 851-858.

107. Ignacio Tinoco Jr. The Conversion of Fibrinogen to Fibrin. XVI. Electrical Birefringence of Fibrinogen and Activated Fibrinogen. Journal of the American Chemical Society 1955; 77 : 3476-3480.

108. Cady P. Dufour SW, Shaw J, Kraeger SJ. Electrical impedance measurements: rapid method for detecting and monitoring microorganisms. J Clin Microbiol 1978; 7: 265-272.

109. Gomes HLLRBARSPCML. A microelectrode impedance method to measure interaction of cells. Sensors Proceedings of IEEE 2004; 1011-1013.

110. Wheeler TG, Goldschmidt MC. Determination of bacterial cell concentrations by electrical measurements. J Clin Microbiol 1975; 1: 25-29.

111. Toth O, Calatzis A, Penz S, Losonczy H, Siess W. Multiple electrode aggregometry: a new device to measure platelet aggregation in whole blood. Thromb Haemost 2006; 96: 781-788.

112. Mackie IJ, Jones R, Machin SJ. Platelet impedance aggregation in whole blood and its inhibition by antiplatelet drugs. J Clin Pathol 1984; 37: 874-878.

113. Гуревич ВС, Михайлова ИА, Иванов ВИ, Казённова НИ. Адгезия тромбоцитов в цельной крови к коллагену: простой и быстрый количественный метод исследования. Лабораторные новости Дальнего Востока 1999; 2.

114. Russell D. Cerebral microemboli and cognitive impairment. J Neurol Sci 2002; 203-204: 211-214.

115. Ringelstein EB, Droste DW, Babikian VL. Evans DH, Grosset DG, Kaps M, Markus HS, Russell D, Siebler M. Consensus on microembolus detection by TCD. International Consensus Group on Microembolus Detection. Stroke 1998; 29: 725-729.

116. Markus HS, Harrison MJ. Microembolic signal detection using ultrasound. Stroke 1995; 26: 1517-1519.

117. SaloojaN, Perry DJ. Thrombelastography. Blood Coagul Fibrinolysis 2001; 12: 327-337.

118. Ройтберг ГЕ, Струтынский AB. Лабораторная и инструментальная диагностика внутренних органов. Москва: Бином, 2003.

119. Hemker HC, A1 Died R, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance . Curr Opin Hematol 2004; 11: 170-175.

120. Kuhlen R. Controversies in Intensive Care Medicine. MWV Medizinisch Wissenschaffliche Verlagsgesellschaft OHG, 2008.

121. Mosesson MV. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost 2005; 3: 1894-1904.

122. Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. British Journal of Haematology 2005; 129: 307-321.

123. Hartert H. Blutgerinnung studien mit der thromboelastographie, einen Neuen Untersuchingsverfahren. Klin Wochenschr 1948; 26: 577-583.

124. Wolberg AS, Campbell RA. Thrombin Generation, Fibrin Clot Formation and Hemostasis. Transfus Apher Sci 2008; 38: 15-23.

125. Hemker HC, Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

126. Hemker НС, A1 Dieri R, De Smedt E, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96: 553-561.

127. Hemker НС, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Begum S. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb Haemost 2000; 83: 589591.

128. A1 Dieri R, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF, Beguin S, Hemker HC. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88: 576-582.

129. Dargaud Y, Trzeciak MC, Bordet JC, Ninet J, Negrier C. Use of calibrated automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the prothrombotic phenotype. Thromb Haemost 2006; 96: 562-567.

130. Козинец ГИ, Макаров В А. Исследование системы крови в клинической практике. Москва: Триада-Х, 1997.

131. Faxalv L, Tengvall Р, Lindahl TL. Imaging of blood plasma coagulation and its propagation at surfaces. Biomed Mater Res A 2007.

132. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY. Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV. Ataullakhanov FI. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97: 425-434.

133. Ataullakhanov FI, Krasotkina JV, Sarbash VI, Volkova RI, Sinauridse EI, Kondratovich AY. Spatio-temporal dynamics of blood coagulation and pattern formation. An experimental study. Int J Bifurcation and Chaos 2002; 1969-1983.

134. Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2002; 1569: 86-104.

135. Sinauridze EI, Volkova RI, Krasotkina JV, Sarbash VI, Ataullakhanov FI. Dynamics of clot growth induced by thrombin diYusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 607-616.

136. Шулутко EM, Ованесов MB, Атауллаханов ФИ. Факторы риска катетер-ассоциированных тромбозов центральных вен. Проблемы гематологии и переливания крови 2002; 1: 102.

137. Копылов КГ, Плющ ОП, Лопатина ЕГ. Северова ТВ, Атауллаханов ФИ, Пантелеев МА. Дромашнее лечение концентратом фактора VIII больных гемофилией А. Проблемы гематологии и переливания крови 2003; 2: 5-11.144.145.146.147.148.

138. Campbell RA, Overmyer КА, Bagnell CR. Wolberg AS. Cellular Procoagulant Activity Dictates Clot Structure and Stability as a Function о Г Distance From the Cell Surface. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28: 2247-2254.

139. Ataullakhanov FI, Zarnitsina VI, Pokhilko AV, Lobanov AI, Morozova OL. Spatio-temporal dynamics of blood coagulation and pattern formation. A theoretical approach. Int J Bifurcation and Chaos 2002; 12: 1985-2002.

140. Атауллаханов ФИ, Зарницина ВИ, Кондратович АЮ, Лобанова ЕС, Сарбаш ВИ. Особый класс автоволн автоволны с остановкой - определяют пространственную динамику свертывания крови. Успехи физических наук 2002; 172: 671-690.

141. Krasotkina JV, Sinauridse El, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of fibrin formation and spreading of active thrombin entering non-recalcifed plasma by diffusion. Biochim Biophys Acta 2000; 1474: 337-345.

142. Negrier C, Dargaud Y, Bordet JC. Basic aspects of bypassing agents. Haemophilia 2006;12: 48-53.