Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности пространственной динамики тромбообразования в кровотоке

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности пространственной динамики тромбообразования в кровотоке"

005007874

АВИЛОВ ОЛЕГ ЭРНЕСТОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ДИНАМИКИ ТРОМБООБРАЗОВАНИЯ В КРОВОТОКЕ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? 5 РНЗ 2012

Чебоксары 2012

005007874

Работа выполнена в научно исследовательской лаборатории биотехнологии и экспериментальной биологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева»

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Димитриев Алексей Димитриевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова»

Защита диссертации состоится «17» февраля 2012 года в 15.00 часов на заседании объединенного совета ДМ 212.300.03 при ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева» (428000, г.Чебоксары, ул. К. Маркса, 38, ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева», http://www.chgpu.edu.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева»

Григорьев Станислав Георгиевич

Чебоксарский кооперативный институт (филиал) АНО ВПО ЦС РФ «Российский

университет кооперации»

доктор биологических наук, профессор Козлов Вадим Авенирович ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева»

Автореферат разослан «,/£» января 2012 г.

Ученый секретарь объединенного совета д-ор биол. наук, професс!

|. В. Алексеев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повреждение кровеносных сосудов приводит к контакту субэндотелиальных структур (коллагеновые волокна, фибробласты, гладкомышечные клетки) с кровью. При этом происходит формирование сгустка, закрывающего место повреждения с целью предотвращения потери крови. Образование тромба является сложным пространственно-временным процессом, который происходит в условиях потока крови и начинается на поверхности поврежденного сосуда, углубляясь далее в сосудистое пространство. В последние годы как зарубежные, так и отечественные исследователи обращают особое внимание изучению биохимических реакций, ответственных за начало образования тромба, увеличение его размеров, а также физических процессов (диффузия, ток крови и др.), которые влияют на динамику формирования тромба. Одновременно актуальной остается проблема, связанная с диагностикой патологии системы свертывания крови. В настоящее время уже существуют экспериментальные модели, позволяющие регистрировать образование тромба как in vivo посредством регистрации изображений в живых организмах (A. Celi, G. Merrill-Skoloff, 2003; А. М. Shibeko, О. Е. Avilov, Е. S. Lobanova et al., 2006; Sh. Falatti, P. Gross, 2008), так и in vitro путем моделирования роста кровяного сгустка в искусственной среде (V. Balasubramanian, Е. Grabowski, 2007; О. Э. Авилов и соавт., 2011).

Анализ литературных источников показывает, что подавляющее большинство опубликованных учеными работ посвящено исследованию роста тромбоцитарного сгустка и эффектов системы свертывания крови, связанных с агрегацией тромбоцитов. Однако с учетом того факта, что в организме основным инициатором гемостаза в настоящее время признан исключительно внешний путь свертывания in vitro, поэтому моделирование роста фибринового сгустка обязательно должно включать данный способ активации, а именно посредством тканевого фактора. Кроме того, использование тромбоцитарного звена сильно искажает результаты, которые можно получить на начальной стадии инициирования механизмов свертывания крови. Отсюда разумным упрощением постановки

экспериментов будет исследование образования сгустка в потоке плазмы при ненасыщенности тромбоцитами крови. Следовательно, и наблюдаться должен тромб в системе, позволяющей запечатлевать его формирование в пространстве (И. А. Горяинова и со-авт., 2005; И. Н. Медведев и соавт., 2006; А. N. Balandina et al., 2008; А. М. Shibeko, 2009; О. Е. Avilov, 2010).

По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире на сегодняшний день живет до 600 тыс. человек, страдающих гемофилией разных форм и степени тяжести (Ю. А. Жулев, 2011). Поэтому научно обоснованный подход понимания пространственных процессов свертывания крови, способствующий патогенетически эффективному лечению гемофилии, является актуальной проблемой современной биологии и медицины.

В этой связи целью нашей работы является экспериментальное изучение пространственной динамики формирования фибри-нового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Исходя из поставленной цели исследований, для решения были выдвинуты следующие задачи:

1. Определить пространственную динамику тромбообразова-ния в кровотоке разных доноров.

2. Изучить зависимость характера формирования фибриново-го сгустка от биофизических показателей крови (насыщенность или ненасыщенность тромбоцитами, замороженная или незамороженная плазма и скорость ее движения).

3. Исследовать влияние потока плазмы крови на физические характеристики тромба (скорость роста и угол переднего фронта, конфигурация и толщина, кинетика светорассеивания).

4. Разработать экспериментальную систему для моделирования формирования тромба in vitro и метод диагностики нарушений гемостаза in vivo.

Научная новизна. Впервые выявлены особенности пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Установлена зависимость скорости роста, угла переднего фронта, формы, толщины и кинетики светорассеивания, определяющих физические характеристики тромба, от кровотока.

Показана корреляция биофизических параметров крови с особенностями тромбообразования в ее плазме.

Впервые использован метод темного поля для регистрации формирования тромба в потоке плазмы и определен биологический эффект использования препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания крови при гемофилии.

Экспериментально доказано положительное влияние замораживания плазмы страдающих гемофилией доноров на рост фибри-нового сгустка и его физические характеристики, а также зависимость от обработки синтетическим красителем.

Разработана экспериментальная система, позволяющая моделировать тромбообразование и предложен метод диагностики нарушений системы свертывания крови.

Новизна полученных научных положений, выводов и рекомендаций поддержана проектом ОАО «РОСНАНО» (Госрегистрация в реестре проектов № 687).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты диссертационных исследований имеют фундаментальный характер и дополняют современную теорию о механизмах пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови.

Разработан биофизический прибор для диагностики патологий системы свертывания крови доноров.

Реализация результатов исследований. Научные положения, разработки и практические рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.

Апробация работы. Основные научные положения, выводы и практические рекомендации диссертационной работы доложены на Международных («Modeling of Blood Deceases» в University Claude Bernard Lyon 1 (France, Lyon, 2007); XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Switzerland, Geneve, 2007), «Математическая биология и биоинформатика» (Россия, Пущино, 2006), «Биология - наука 21 века» (Россия, Пущино, 2007)) конференциях, а также расширенном заседании НИЛ биотехнологии и экспериментальной биологии ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева» (Чебоксары, 2011).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Физиологические механизмы образования тромба в потоке плазмы у нормальных и страдающих гемофилией доноров определяются биофизическими параметрами крови.

2. Существуют корреляционные отношения между кровотоком и скоростью роста, углом переднего фронта, конфигурацией, толщиной, кинетикой светорассеивания фибринового сгустка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях согласно перечню ВАК России.

Структура и объём диссертации. Работа включает следующие разделы: введение (5 е.), обзор литературы (32), собственные исследования (40), обсуждение результатов исследований (30), выводы (1), практические рекомендации (1), список литературы (12) и приложения (10 е.).

Диссертация изложена на 112 страницах компьютерного исполнения, содержит 2 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 107 источников, в том числе 96 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация, материал и методы исследований. Работу выполняли в течение 2006-2011 гг. в научно-исследовательской лаборатории кафедры биофизики Физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова и научно-исследовательской лаборатории биотехнологии и экспериментальной биологии ФГБОУ ВПО

Схема исследований

Объект ^зучения

Плазменное звено системы свертывания крови у 120 чел._

I

Условия экспериментов

Плазма крови нормальных и страдающих гемофилией доноров

Показатели Значение

Доноры (нормальные и больные гемофилией) 120 чел.

Температурный режим исследований +37° С

Диапазон скорости кровотока 0-2500 мин"1

Диапазон ширины сосудистого канала 1-12 мм

Уровень рН в плазме крови 7,2-7,4

Активатор свертывания Культура фибробластов легких человека

Внедрение научных положений в:

учебный и клинико-диагностический процессы

ФГБОУВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева» Чебоксарского политехнического института (филиала) ФГБОУ ВПО «МГОУ им. В. С. Черномырдина» ОАО «Роснано»

Динамика формирования фибринового сгустка

Рис. 1. Метод темного поля для регистрации тромбообразования в кровотоке

«Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева».

Проведены исследования образцов плазмы крови у 120 доноров, из которых 24 страдали гемофилией (схема). Образцы плазмы получены с добровольного согласия доноров на станции переливания крови «ГНЦ РАМН».

Перед началом экспериментов плазму подвергали ре-кальцификации. Образование фибринового сгустка инициировали искусственно выращенным на мягкой подложке слоем клеток - фибробластами. Поверхность фибробластов покрыта белком тканевого фактора, который при контакте с плазмой провоцирует свертывание крови.

Пленку с фибробластами крепили с внутренней стороны сосудистого канала, не изменяя при этом его конфигурации. Для внутренних поверхностей был выбран полистирол, как один из наиболее биологически инертных материалов. Для уменьшения эффекта контактной активации полистироловые компоненты камеры использовали однократно. Силиконовую прокладку изготавливали из коммерчески доступного силикона (Dow Corning).

Исследования проводили с применением следующих методов:

1. Физиологических - исследование образцов плазмы крови. Для каждого образца количество повторений составляло не менее 4 и было проведено около 500 экспериментов. Для их проведения плазму готовили из крови, взятой на антикоагулянте (3,8% раствор цитрата Na, pH 5,5) стандартным образом на станции переливания крови. Регистрацию формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови проводили методом темного поля (рис. 1).

2. Биохимических - рекальцификация плазмы крови, при которой концентрация ионов Са2+ доводится до физиологических значений при помощи раствора СаСЬ, приготовленного на основе буфера (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, pH 7,4). Для уменьшения эффекта предактивации плазмы вследствие её контакта с искусственными поверхностями в препарат плазмы

крови добавляли CTI (корн-трипсин ингибитор) в конечной концентрации 0,2 мг/мл. Рекальцификацию плазмы проводили в потоке при помощи Т-образного смесителя из полиэтилена высокого давления (Fisher Scientific) (Е. С. Северин, 2004).

3. Биофизических - исследование физических характеристик тромба (скорость роста и угол переднего фронта, конфигурация и толщина, кинетика светорассеивания) общепринятыми в биофизике методами (В. Ф. Антонов, 2003).

4. Математических - проведение математической обработки полученных экспериментальных данных с использованием программных пакетов статистического анализа «Microsoft Excel-2010» и «Statistica for Windows».

2.2. Исследование пространственной динамики формирование тромба в потоке плазмы крови

2.2.1. Влияние скорости потока плазмы на формирование фибринового сгустка. Для любого градиента скоростей из рассмотренного в работе диапазона (0-2500 мин" ) характерным являлось формирование у тромба «хвоста», образующегося за счет сносимых в них по потоку активных факторов свертывания. При этом длина сгустка была более чем в 15 раз больше линейных размеров места повреждения.

При небольших скоростях (до 200 мин"1) наблюдался эффект роста сгустка против потока. При увеличении скорости потока геометрия сгустка значительно менялась: сгусток становился плотнее и тоньше, передний фронт принимал клиновидную форму вместо округлой.

Экспериментально были установлены различные степени формирования сгустка:

1. Сгусток покрывает место повреждения, с образованием

хвостовой части ниже по потоку.

2. Сгусток покрывает только место повреждения без образования хвостовой части ниже по потоку.

3. Сгусток частично покрывает место повреждения.

и

4. Сгусток не покрывает место повреждения, однако хвостовая часть ниже по потоку образуется.

При проведении экспериментов варьировалась скорость потока - скорость сдвига при этом составляла от 0 до 3000 с-1, поперечные размеры канала 1x1 мм, длина канала 87 мм. При обработке - измерялись следующие параметры:

1. Время задержки свертывания — в мин, время от начала эксперимента до начала роста сгустка, т.е. время, когда эксперимент уже идет - но формирования сгустка не наблюдается.

2. Скорость роста сгустка в середине активатора, в мкм\мин.

3. Угол переднего фронта сгустка — в градусах, измеренный на 40-й минуте эксперимента.

4. Максимальная толщина сгустка — в мм от границы канала, измеренная на 40-й минуте эксперимента. При этом также анализировалось местоположение максимальной толщины, которое измерялось в мм вниз по потоку от начала активатора.

Ранее не наблюдавшаяся особенность растущего в потоке сгустка состоит в том, что интенсивность светорассеяния оказывается выше вблизи монослоя с фибробластами (около 200 отн. ед.), по сравнению с его хвостовой частью (около 130-150 отн. ед.), что позволяет говорить о пространственно-неоднородной структуре фибринового сгустка.

2.2.2. Исследование зависимости времени задержки формирования фибринового сгустка от скорости потока плазмы. На рис. 2 показана зависимость времени задержки от скорости сдвига (сплошные точки на графике): видно, что поток сильно ингибирует процессы полимеризации, что приводит к нелинейному ответу системы свертывания.

Скорость движения, 1/мин

Рис. 2. Зависимость времени задержки тромбообразования от скорости кровотока

Данные результаты получены для свободной от тромбоцитов плазмы. Весь массив экспериментальных данных можно условно разделить на два участка. На первом из них (от 0 до 700 мин ) - в пределах погрешности измерений роста времени задержки не происходит (все значения укладываются в диапазон 0-12 мин).

На втором, таком же по диапазону скоростей (от 700 до 1400 мин"1) система свертывания постепенно перестает сопротивляться потоку, что приводит к нелинейному росту времени

задержки в 7 раз.

Следует отметить, что данное нелинейное поведение системы свертывания описано впервые. При скоростях потока более 500-700 мин"1 время задержки представляет собой временно промежуток между началом эксперимента и инициацией свертывания. При временах задержки более 60 минут по физиологическим соображениям считаем, что свертывания в

данном случае не начинается совсем (так как более 1 часа после начала эксперимента не начиналось формирование сгустка). Нетрудно видеть, что полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с теоретическими расчетами, выполненными А. М. Шибеко в ГНЦ РАМН (сплошная линия на графике).

При добавлении активированного фактора VII, система свертывания крови теряет чувствительность к потоку, что выражается в исчезновении нелинейного ответа времени задержки при увеличении скорости потока в исследуемом диапазоне скоростей сдвига (0-2500 мин"1). Данный факт хорошо согласуется не только с современными представлениями, но и с результатами численных расчетов (пунктирная линия на графике).

Было показано, в плазме богатой тромбоцитами также отсутствует нелинейный ответ системы свертывания в исследуемом диапазоне скоростей, что позволяет говорить о подтверждении гипотезы об активирующих свойствах фосфоли-пидных поверхностей тромбоцитов.

2.2.3. Исследование зависимости интенсивности роста фибринового сгустка от скорости потока плазмы. Увеличение скорости потока также оказывает драматическое влияние и на скорость роста сгустка в середине активатора перпендикулярно стенке канала вглубь сосуда. На рис. 3 приведена зависимость скорости роста от скорости сдвига. Согласно полученным данным, давление потока оказывает ингибирующее влияние на каскадный процесс полимеризации приводит к резкому (более чем на порядок) падению скорости роста сгустка, что позволяет говорить о влиянии гидродинамического фактора (а именно скорости потока) на скорость работы каскада биохимических реакции, что для системы свертывания также является новым свойством, описанным впервые. Следует отметить, что при этом резко падает только скорость роста вглубь канала, а активатор, имитирующий место повреждения по-прежнему целиком закрывается сгустком при начале роста.

3" 20*

O

l'j

V

250 500 750 1000 1250 1500 1750 Скорость движения, 1/мин

Рис. 2. Зависимость интенсивности роста тромба от скорости кровотока

Следует отметить, что при добавлении активированного фактора VII, а также при проведении экспериментов с бедной тромбоцитами плазмой наблюдалось увеличение начальной скорости роста сгустка в начале процесса формирования.

Однако, скорость роста сгустка в течении эксперимента практически не отличалась от значений для свободной от тромбоцитов плазмы, что позволяет говорить о влиянии фактора VII и тромбоцитов на начальный этап формирования сгустка.

2.2.4. Исследование зависимости угла переднего фронта фибринового сгустка от скорости потока плазмы. На рис. 4 приведена зависимость угла переднего фронта сгустка от скорости потока. Гиперболическое характер снижения параметров говорит о том, что при увеличении скорости потока нелинейно увеличивается количество сносимых ниже по потоку от активатора активных факторов

2 зо-

•>Л

с юс

—I—

500

750

1000

1250

Скорость движения, 1/мин

Рис. 4. Зависимость угла переднего фронта тромба от скорости кровотока

свертывания, что приводит к снижению скорости работы всего каскада свертывания - т.е. сгусток станбвиться тоньше, более плоским, в результате чего нелинейно уменьшается угол его переднего фронта.

Следует отметить, что при увеличении скорости потока форма сгустка и, следовательно, угол переднего фронта, значительно изменяются. При малых скоростях сдвига (10-150 мин"1) граница сгустка имеет округлую форму, что приводит к значениям угла переднего фронта выше 20°. При увеличении скорости потока граница тромба принимает прямолинейные очертания, сгусток становится плоским, что приводит к уменьшению значений угла переднего фронта до 3-5°.

При добавлении активированного фактора VII, а также для бедной тромбоцитами плазмы форма сгустка на высоких скоростях незначительно отличается от формы для свободной от тромбоцитов плазмы крови, что приводит к увеличению переднего фронта сгустка с 3-5° до 6-8°.

2.2.5. Исследование зависимости толщины фибриново-го сгустка от скорости потока плазмы. На рис. 5 приведена зависимость максимальной толщины сгустка от скорости сдвига, измеренная на 40-й мин эксперимента. При увеличении скорости сдвига максимальная толщина сгустка нелинейно уменьшается, что является следствием сопротивления сгустка потоку. Отметим, что при росте сгустка фактическая ширина канала уменьшается (за счет формирования сгустка), что приводит к изменению геометрии канала и увеличении линейной скорости, и, следовательно, скорости сдвига, в области формирования сгустка, что оказывает дополнительное подавляющее воздействие на процесс роста тромба.

Весь массив экспериментальных данных можно поделить на два участка. На первом из них (от 0 до 300 мин' ) максимальная толщина сгустка падает в 10-12 раз с 2.75 мм до 0.25 мм. На втором участке (от 300 до 1700 мин"1) максимальная толщина сгустка остается неизменной и составляет

3,0-

2,5-

5

I 1.5-

% • . • — »•

0,0

—1-г-1-'-1-■-Г—

500 750 1000 1250 Скорость движения, 1/мин

о

250

1500 1750

Рис. 5. Зависимость толщины тромба от скорости кровотока

0,05 мм до 0,25 мм, что позволяет говорить о достижении порога по толщине формирования сгустка, тем не менее достаточного для покрытия места повреждения и предотвращения кровопотери.

2.2.6. Исследование кинетики светорассеяния в приак-тиваторной области. При скоростях сдвига более 700 мин была обнаружена ранее не описанная кинетика светорассеяния в приактиваторной области сгустка. Типичное поведение зависимости кинетики светорассеяния от времени приведено на рис. 6. Конечной стадией формирования фибринового сгустка является полимеризованная сеть фибриновых волокон, которые эффективно препятствуют проникновению через место повреждения не только клеток крови, но и плазмы. Фиб-риновая сеть является оптически непрозрачной, и хорошо рассеивает падающий на неё свет, что позволяет её детектировать оптическим методом. Ранее было показано, что интенсивность

Рис. 6. Динамика кинетики светорассеяния в приактиваторной области

рассеянного света линейно зависит от плотности и количества фибриновых волокон в сети.

В зависимости кинетики светорассеяния от времени роста сгустка можно выделить два участка. На первом из них наблюдается быстрый рост сигнала, характерный для образования сети фибриновых волокон, характеризующийся ростом сгустка вглубь канала. На втором - длительный линейный рост уровня сигнала светорассеяния уже внутри сформировавшегося сгустка, который позволяет говорить о том, что активные факторы свертывания за счет диффузии попадают внутрь сгустка, приводя к дальнейшему уплотнению его структуры, которое регистрируется посредством равномерного линейного роста уровня сигнала светорассеяния в приактиваторной области.

Таким образом, показано, что начиная со скоростей сдвига более 1500 мин"1, время задержки свертывания теряет свой физиологический смысл, скорость роста тромба, угол переднего фронта максимальная толщина тромба резко падают, и можно говорить об эффекте «выключения» свертывания потоком.

Однако на практике у людей в норме не наблюдается таких явных задержек при локализации кровопотери, и возникает вопрос о возможном механизме, поддерживающем работоспособность системы свертывания. В нашей работе показано, что поведение системы свертывания при добавлении активированного фактора VII в свободную от тромбоцитов плазму и бедной тромбоцитами плазмы (без каких-либо добавок) схожее, и приводит к сильному увеличению тромбогенной активности. Данный факт позволяет говорить о том, что поверхность тромбоцитов является сильным катализатором активации группы факторов свертывания, отвечающих за инициацию процесса формирования сгустка. Предположительный механизм такого поведения системы заключается в том, что фосфолипидная поверхность тромбоцитов является катализатором при активации белков каскада системы свертывания, что приводит к ускорению процессов полимеризации и

уменьшении времени задержки свертывания при скоростях сдвига более 700 мин"1.

Подобный эффект был обнаружен при использовании замороженной плазмы. После получения свободной от тромбоцитов плазмы перед проведением эксперимента её предварительно замораживали до температуры —80 °С. Непосредственно перед экспериментом она проходила процедуру мягкой разморозки при +37 °С. Оказалось, что как качественно, так и количественно поведение системы свертывания бедной тромбоцитами, но не замороженной, и свободной от тромбоцитов, но замороженной плазмы в пределах погрешности измерения одинаковы. Данный факт также ранее не описан в литературе, и может говорить о положительном эффекте трансфузионных процедур для людей, страдающих гемофилией, их же собственной плазмой, прошедшей процедуру заморозки\разморозки для стабилизации тромбообразования и предотвращения внутренних кровотечений.

3. ВЫВОДЫ

1. Выявлены физиолого-биохимические механизмы пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы при насыщенной и ненасыщенной тромбоцитами крови у нормальных и страдающих гемофилией доноров in vivo и in vitro.

2. Установлены два типа поведения зависимости времени задержки тромбообразования от скорости кровотока: линейный рост - скорость движения в диапазоне от 0 до 700 мин*1; нелинейный рост - скорость движения от 701 до 1400. При скорости движения потока плазмы более 1400 мин"1 время задержки формирования тромба теряет физиологическое значение.

3. Показана нелинейная зависимость угла переднего фронта растущего фибринового сгустка и интенсивности его роста вглубь сосудистого канала от скорости кровотока, которые в

диапазоне от 0 до 250 мин"1 уменьшаются в 8-10 раз (Р<0,001), что свидетельствует о сопротивлении тромба потоку плазмы.

4. Доказано, что если у нормальных и страдающих гемофилией доноров время задержки тромбообразования было одинаковым, то у последних отмечены понижение интенсивности роста фибринового сгустка и кинетики светорассеива-ния в приактиваторной области, подтверждающее нарушение пространственной динамики формирования тромба у больных гемофилией..

5. Разработаны научно-обоснованная система, позволяющая моделировать образование фибринового сгустка in vitro, а также математический метод для регистрации биофизических показателей крови, физических характеристик тромба и их статистической обработки.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментальные разработки диссертационных исследований являются научной базой по созданию серийной версии биофизического прибора для диагностики нарушений системы свертывания крови (проект ОАО«РОСНАНО» -Госрегистрация в реестре проектов № 687).

2. Научные положения, выводы и рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Avilov, О. Е. Mathematical Modeling of Fibrin Clot Formation in the Presence of Blood Flow / О. E. Avilov, A. M.

Shibeko, E. S. Lobanova et al. 11 1st International Conference «Mathematical Biology and Bioinformatics». - Russia, Puschino, 2006. - P. 55-56.

2. Avilov, О. E. Blood Flow Suppresses Feedback Activation of Extrinsic Tenase by Factor Xa and Prevents Clotting / О. E. Avilov, A. M. Shibeko, M. A. Panteleev et al. // XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. - Switzerland, Geneve, 2007. - P. 25-27.

3. Авилов, О. Э. Экспериментальное исследование пространственной динамики роста в потоке / О. Э. Авилов, Е. С. Лобанова, М. А. Пантелеев и соавт. // XI Междунар. конф. молодых ученых «Биология - наука 21 века». - Пущино, 2007. -С.73-76.

4. Avilov, О. Е., Experimental research of the thrombus formation in the flow / О. E. Avilov, E. S. Lobanova, M. A. Panteleev et al. // Conference on Problems of Modeling of Blood Diseases. -France, Lyon : Universite Lyon I, 2009. - P. 15-16.

5. Авилов, О. Э. Инновационный подход исследования полимеризации открывает новые свойства системы свертывания / О. Э. Авилов // Вестник московского университета. -М.: МГУ им. М. В. Ломоносова, 2010. - №5. - С. 70-75.*

6. Avilov, О. Е. Innovative Experimental Methods Open New Properties of Blood Coagulation / О. E. Avilov // Moscow University Bulletin. - Moscow : Lomonosov Moscow State University, 2010. - vol.65. - P. 407-411.*

7. Авилов, О. Э. Экспериментальное исследование пространственной динамики свертывания тромба в потоке плазмы крови / О. Э. Авилов, С. Г. Григорьев // Вестник ЧГПУ им. И. Я. Яковлева. - Чебоксары: Чуваш, гос. пед. ун-т, 2011. - №2 (70). - Ч. 1. - С. 3-8 *

* - публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых ВАК России для докторских и кандидатских диссертаций

Подписано к печати 30.12.2011 г. Бумага писчая. Печать

оперативная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №i5o.

Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева»

428000, г.Чебоксары, ул.К.Маркса, 38

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Авилов, Олег Эрнестович, Чебоксары

61 12-3/498

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЧУВАШСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И. Я. ЯКОВЛЕВА»

ОСОБЕННОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ДИНАМИКИ ТРОМБООБРАЗОВАНИЯ В КРОВОТОКЕ

На правах рукописи

АВИЛОВ ОЛЕГ ЭРНЕСТОВИЧ

03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, С. Г. Григорьев

Чебоксары 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ СПЕЦИАЛЬНЫХ ТЕРМИНОВ,

УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СИМВОЛОВ............................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................11

1.1. Современные представления о коагуляционном звене гемостаза................11

1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний пути активации......................................................................................................................................................11

1.1.2. Петли положительной обратной связи. Образование сгустка.............15

1.1.3. Фибринолиз................................................................................................................................................22

1.2. Гемофилии А, В, С....................................................................................................................................25

1.2.1. Гемофилия - природа заболевания, его виды и типы..........................................25

1.2.2. Возможные механизмы нарушения свертывания при гемофилиях.... 29

1.3. Анализ существующих направлений работ. Экспериментальные модели..........................................................................................................................................................................33

1.4. Постановка задачи....................................................................................................................................43

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................46

2.1. Материалы и методы исследований..........................................................................................46

2.1.1. Материалы............................... ..................................................................................46

2.1.2. Доноры крови........................................................................................................................................47

2.1.3. Получение плазмы крови............................................................................................................48

2.1.4. Стабилизация молочной кислотой. Процесс дегазации................................48

2.1.5. Рекальцификация плазмы............................................................................................................49

2.1.6. Культура фибробластов..............................................................................................................50

2.1.7. Схема исследования........................... ..................................................................51

2.2. Экспериментальная система..........................................................................................................52

2.2.1. Конструкция проточной камеры..........................................................................................52

2.2.2. Экспериментальная установка................................................................................................55

2.2.3. Проблема контактной активации.................... ................................................55

2.2.4. Рекальцифицикация в потоке..................................................................................................57

2.2.5. Проблема дегазации........................................................................................................................57

2.2.6. Крепление активатора................................................................57

2.2.7. Программный комплекс обработки экспериментальных данных.... 59 2.3. Результаты собственных исследований..............................................................................62

2.3.1. Влияние потока на форму тромба....................................................................................62

2.3.1.1. Особенности формы тромба................................................................................................62

2.3.1.2. Эффект роста тромба против потока..........................................................................64

2.3 Л .3. Эффект формирования сгустка без покрытия активатора......................65

2.3.2. Влияние потока на процесс формирования тромба..........................................66

2.3.2.1. Динамика формирования тромба в потоке плазмы крови....................66

2.3.2.2. Зависимость времени задержки от скорости потока плазмы крови.. 69

2.3.2.3. Зависимость скорости роста сгустка от скорости потока плазмы крови................................................................................................................................................................................75

2.3.2.4. Зависимость угла переднего фронта фибринового сгустка от скорости потока плазмы крови..............................................................................................................78

2.3.2.5. Зависимость толщины сгустка от скорости потока плазмы крови... 79

2.3.2.6. Особенности кинетики светорассеяния......................................................................81

2.3.2.7. Особенности формирования сгустка плазмы доноров страдающих гемофилией А........................................................................................................................................................84

2.3.2.8. Зависимость времени задержки от линейного размера активатора.. 88

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................88

4. ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................94

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................................95

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................96

7. ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................108

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ СПЕЦИАЛЬНЫХ ТЕРМИНОВ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СИМВОЛОВ

АПС - активированный протеин С

АТIII - антитромбин III

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ВМК - кининоген с высокой молекулярной массой

ГК-П - гепарин кофактор II

КТИ - ингибитор трипсина из зерен кукурузы

(ингибитор фактора ХПа) МЕ - международная единица активности

ПАШ - ингибитор активатора плазмииогена 1 ПАШ - ингибитор активатора плазминогена 2

ПВДФ

ПЗС

ПЭТ

ПС

Ш

СБТИ ТАФИ

ТВ

тПА

ТФ

ТФПИ ФС фП фПа

фУ

дифтор поливинилиден прибор с зарядовой связью полиэтилентерефталат протеин С протеин Б

ингибитор трипсина из соевых бобов активируемый тромбином ингибитор фибринолиза

тромбиновое время

тканевой активатор плазминогена

тканевой фактор

ингибитор пути тканевого фактора фосфатидилсерин фактор II, протромбин активный фактор II, тромбин фактор V

фУП - фактор VII

фУШ - фактор VIII

фУ1П:С - коагуляционная активность фактора VIII

ф1Х - фактор IX

ф1Х:С - коагуляционная активность фактора IX

фХ - фактор X

фХ1 - фактор XI

фХП - фактор XII

фХШ - фактор XIII

AMC - 4-метил-7-аминокумарин

С1-И - С1-ингибитор

rVIIa - рекомбинантный фактор Vila

52 - В ОС-Ala-Pro-Arg-AMC (í-jV-бутоксикарбонил-

аланил-пролил-аргинил-7-амино-4-метилкумарин)

53 - BOC-Ile-Gly-Arg-AMC а2-М - а2-макроглобулин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Повреждение кровеносных сосудов приводит к контакту субэндотелиальных структур (коллагеновые волокна, фибробласты, гладкомышечные клетки) с кровью. При этом происходит формирование сгустка, закрывающего место повреждения с целью предотвращения потери крови.

Образование тромба является сложным пространственно-временным процессом, который происходит в условиях потока крови и начинается на поверхности поврежденного сосуда, углубляясь далее в сосудистое пространство. Нарушения свертывания - неконтролируемые кровоточивость или тромбообразование - сопровождают большинство патологических процессов с летальным исходом. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире на сегодняшний день живет до 600 тыс. человек, страдающих гемофилией разных форм и степени тяжести [105]. Поэтому научно обоснованный подход понимания пространственных процессов свертывания крови, способствующий патогенетически эффективному лечению гемофилии, является актуальной проблемой современной биологии и медицины.

В последние годы как зарубежные, так и отечественные исследователи обращают особое внимание изучению биохимических реакций, ответственных за начало образования тромба, увеличение его размеров, а также физических процессов (диффузия, ток крови и др.), которые влияют на динамику формирования тромба. Одновременно актуальной остается проблема, связанная с диагностикой патологии системы свертывания крови. В настоящее время уже существуют экспериментальные модели, позволяющие регистрировать образование тромба как in vivo посредством регистрации изображений в живых организмах [39, 30, 12, 40], так и in vitro путем моделирования роста кровяного сгустка в искусственной среде [99, 18, 62].

Среди методов исследования можно выделить три направления: исследование системы свертывания в гомогенной среде (с перемешиванием), в

системах без перемешивания и в системах с наличием потока. Несмотря на то, что последний подход является самым приближённым к условиям in vivo (так как в живом организме практически всегда присутствует ток крови), его изучению уделяется крайне мало внимания.

Анализ литературных источников показывает, что подавляющее большинство опубликованных учеными работ посвящено исследованию роста тромбоцитарного сгустка и эффектов системы свертывания крови, связанных с агрегацией тромбоцитов. Однако с учетом того факта, что в организме основным инициатором гемостаза в настоящее время признан исключительно внешний путь свертывания. Поэтому моделирование роста фибринового сгустка обязательно должно включать данный способ активации, а именно посредством использования тканевого фактора. Кроме того, тромбоцитарное звено сильно искажает результаты, которые можно получить на начальной стадии инициирования механизмов свертывания крови. В работах проф. Атауллаханова Ф.И. и Гурия Г.Т. [10, 7, 8] была выдвинута гипотеза, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом. Следовательно, рост фибринового сгустка является пространственно-неоднородным процессом. Отсюда разумным упрощением постановки экспериментов будет исследование образования сгустка в потоке рекальцифицированной плазмы свободной от тромбоцитов. Следовательно, и наблюдаться должен тромб в системе, позволяющей запечатлевать его формирование в пространстве [6, 9, 87, 13, 37].

В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. в этом случае активатор не локализован, а распределен во всем объеме, поэтому происходит образование множественных сгустков, и свертывание охватывает изучаемый образец плазмы целиком. В настоящее время практически отсутствуют постановки экспериментов, позволяющие измерять рост фибринового сгустка в потоке плазмы in vitro. Поэтому в качестве объекта изучения роли пространства в динамике формирования сгустка была выбрана модель коагуляции, которая с одной стороны упрощена

(сгусток растет в потоке рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазмы крови человека, приведенной в контакт с поверхностью активатора (монослой фибробластов)), но с другой стороны именно в такой постановке пространственный аспект свертывания проявляется наиболее сильно.

В этой связи целыо нашей работы является экспериментальное изучение пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Исходя из поставленной цели исследований, для решения были выдвинуты следующие задачи:

1. Определить пространственную динамику тромбообразования в кровотоке разных доноров.

2. Изучить зависимость характера формирования фибринового сгустка от биофизических показателей крови (насыщенность или ненасыщенность тромбоцитами, замороженная или незамороженная плазма и скорость ее движения).

3. Исследовать влияние потока плазмы крови на физические характеристики тромба (скорость роста и угол переднего фронта, конфигурация и толщина, кинетика светорассеивания).

4. Разработать экспериментальную систему для моделирования формирования тромба in vitro и метод диагностики нарушений гемостаза in vivo.

Научная иовизна. Впервые выявлены особенности пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.

Установлена зависимость скорости роста, угла переднего фронта, формы, толщины и кинетики светорассеивания, определяющих физические характеристики тромба, от кровотока.

Показана корреляция биофизических параметров крови с особенностями тромбообразования в ее плазме.

Впервые использован метод темного поля для регистрации формирования тромба в потоке плазмы и определен биологический эффект использования препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания крови при гемофилии.

Экспериментально доказано положительное влияние замораживания плазмы страдающих гемофилией доноров на рост фибринового сгустка и его физические характеристики, а также зависимость от обработки синтетическим красителем.

Разработана экспериментальная система, позволяющая моделировать тромбообразование и предложен метод диагностики нарушений системы свертывания крови.

Новизна полученных научных положений, выводов и рекомендаций поддержана проектом ОАО «РОСНАНО» (Госрегистрация в реестре проектов № 687).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты диссертационных исследований имеют фундаментальный характер и дополняют современную теорию о механизмах пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови.

Разработан биофизический прибор для диагностики патологий системы свертывания крови доноров.

Реализация результатов исследований. Научные положения, разработки и практические рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.

Апробация работы. Основные научные положения, выводы и практические рекомендации диссертационной работы доложены на

Международных («Modeling of Blood Deceases» в University Claude Bernard Lyon 1 (France, Lyon, 2007); XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Switzerland, Geneve, 2007), «Математическая биология и биоинформатика» (Россия, Пущино, 2006), «Биология - наука 21 века» (Россия, Пущино, 2007)) конференциях, а также расширенном заседании НИЛ биотехнологии и экспериментальной биологии ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева» (Чебоксары, 2011).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Физиологические механизмы образования тромба в потоке плазмы у нормальных и страдающих гемофилией доноров определяются биофизическими параметрами крови.

2. Существуют корреляционные отношения между кровотоком и скоростью роста, углом переднего фронта, конфигурацией, толщиной, кинетикой светорассеивания фибринового сгустка.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях согласно перечню ВАК России.

Структура и объём диссертации. Работа включает следующие разделы: введение (5 е.), обзор литературы (35 е.), собственные исследования (43 е.), обсуждение результатов исследований (4 е.), выводы (1 е.), практические рекомендации (1 е.), список литературы (11 с.) и приложения (13 е.).

Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного исполнения, содержит 2 таблицы и 36 рисунков. Список литературы включает 107 источников, в том числе 96 зарубежных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представление о коагуляционном звене гемостаза

1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний

пути активации

Контактная активация Чужеродная поверхность

XII .

•-¡-¡Хна

Внешний путь Повреждение сосуда

тт

VII У»аГ

;т>- Са" УНа

^ЗиПРЛСЕ.

Активация

Внутренний путь

XI

; у"* ■

' - - • Х1а

IX

1Ха ;

Г [. К я << 1

1Ха Са" УШа

\ >

\ N ,

\ ! г'Л , ..............

Ь-' Ь\ —рСа РС

Ха

и !

* * & Ь

НЙОНЕШЙР" у /у? =

/ 4&у

А , ,

■ . рномошше

Хв Сз" уа

Т! /■А

, Протромбин 4 „ Тромбин

Ч>и6риноген> Фибрин

«Полимеризация

Элонгация ■ Остановка

Рис. 1. Схема каскада системы свертывания. На схеме приведены три стадии работы каскада свертывания: активация (по внешнему и внутреннему пути), элонгация (красные стрелки - петли положительной обратной связи) и остановка (синие стрелки - петли отрицательной обратной связи терминации). Тонкие коричневые стрелки - петли протеолетических реакций. Прямоугольниками показаны Са2+ зависимые элементы каскада -протромбиназа, внутренняя и внешняя теназы

Процесс гемостаза инициируется повреждением эндотелия сосуда и заканчивается образованием тромба, останавливающего кровопотерю [1]. В системе свертывания выделяют три звена - тромбоцитарное, плазменное и сосудистое. Тромбоцитарное звено обеспечивает адгезию и агрегацию тромбоцитов и формирование тромбоцитарной части сгустка, плазменное звено - свертывание плазмы крови и формирование сгустка в месте повреждения.

Свернувшаяся плазма представляет собой частично нерастворимые полимеры фибрина. Его предшественник, фибриноген, находится в плазме в растворимом виде, и появляется в результате каскада реакций, составляющих системы свертывания. В состав данного каскада входят 13 факторов свертывания, из которых семь активируются до сериновых протеаз (фактор